Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика необычных структурных элементов в составе малых РНК и кРНК мыши

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика необычных структурных элементов в составе малых РНК и кРНК мыши"

•Л (íi , i

АКАЛЕШЗЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ КОЛЕКУЛЯРНОВ БИОЛОГИИ Ш1 В. А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

на права: рукописи

пуияпкип Глеб Павлович

УЛК 377.113

ХАРАКТЕРИСТИКА НЕОБЫЧНЫЕ СТРУКТУРНЫ! ЭЛЕНЕНТОВ В СОСТАВЕ

шиш рнк п нрнк топ

(оз.оо.оз молекулярная бпологпя)

АВТОРЕФЕРАТ дпссерташш на соискание ученой степени кандидата биологических наук

иосква 1991 г.

Работа выполнена в институте нолекулягноа Биологии ин. в.А.энгельгардта ан ссср

научные руководителя:

доктор биологических наук.профессор,акаденик АН ссср г.П.Георгиев доктор биологических наук л.А.КРанеров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-коргеспонлент ан ссср

б.в.ильин

доктор биологических наук Е.н.добгов

ведувее учеревдение: институт биологии развития им. н.к. Кольцова АН ссср

специализированного совета л 002.79.01 при институте нолекулярноа Биологии вн. в.А.энгельгардта АН СССР (117984 носква ул. Вавилова 32).

с диссертацией нохно ознакомиться в библиотеке института нолекулярноа биологии ин. в.А.энгельгардта АН ссср

запита

1991

кандидат хинических наук

Ученый секретарь спепиализв

J

i Актуальность пробленн. в эукариотической клетке процесс

—синтеза рнк с матрицы лнк (транскрипция) осуществляется тремя различными Ферментами - РНК-полинегазами I. И и III. структура генов и рнк с них синтезирующихся обладает рядом уникальных черт, свойственных каждону классу.

наличие кэпа - особой структуры, блокирующей 5'-кошевой нуклеотил. - до .последнего времени считалось уникальным свойствон рнк. синтезирующихся рнк-полимеразой II. однако когда было показано, что иб-рнк. транскрибирующаяся рнк-полимеразои IiI. имеет кэп (Epstein et ai.. 1980; Singh and Reddy. 1989). эта РНК стала единственным исключением из правила. по которому кэпированию подвергаются только рнк генов класса 11. Учитывая этот Факт, исследования других рнк генов класса ill на наличие кэпов представляют безусловный интерес.

настоящая работа возникла, из попытки подтвердить, что в клетках нышей сушеетйуют длинные поли(А)'-РНК, синтезирующиеся PHK-полимеразой iii. при исследовании РНК были выявлены необычные структуры - X. у и z. структура и биологические характеристики этих эленентов были не ясны, и необходимо было провести их изучение.

цель работы, в диссертационной работе были исследованы необычные структурные элементы, выявленные в составе налых РНК и нРНК клеток мыши - X, гиг. изучалась хиническая структура этих эленентов, их биологические свойства и распространение.

научная новизна, показано, что структуры y и z представляют собой 51-ФосФат-цитидин-2'.3'-ииклофосфат и 5'-ФосФат-уридин-2',3'-циклоФосФат, соответственно, предполагается, что такие структуры образуются при действии специфических рнказ на молекулы нрнк на первых ступенях их деградации в клетке.

структура, обозначенная х. оказалась группой, специфически блокирующей 5'-конец поли(А)-содержащей В2-РНК,

транскрибирующейся рнк-полимеразой ш. мы обнаружили, что структура X аналогична группе, найденной у U6-PHK. в 1989 г. smgh and Redd/ показали, что блокирующей группой в U6-PHK является метил. поиск других рнк, транскрибирующихся рнк-полимер£130й ill, показал, что блокирование 5'-конца нетильнои. группой характерно для неполиаденилированных молекул вг-рнк. а также для 7SK-PHK. последнее открытие опровергло данные о том. что 7SK-PHK -имеет на 5'-конце свободную триФосФатную группу (Reddy et ai., 1984).

проведенное исследование подтверждает, что не существует строгих границ, разделяющих гены классов II и III. копированию подвергаются три рнк, транскрибирующиеся рнк-полимеразой III, U6, 7SK и В2. таким образом копирование вошло в ряд свойств, считавшихся характерными для транскриптов рнк-полинеразы II, но выявляющихся при исследованиях последних лет у рнк класса III. все это позволяет по новому взглянуть на сходства и различия генов разных классов эукариотической клетки.

Апробация работы, результаты исследования были представлены на конкурсе молодых ученых института молекулярной биологии АН ссср в 1990 году, а также на двухстороннем синпозиуне ссср-фрг в Иркутске в 1989 году, 11-он международном симпозиуме "Функции ядра" в Суздале в 1989 году, двухстороннем симпозиуме СССР-Великобритания по регуляции транскрипции в носкве в 1990 году и на го-ом съезде Европейских биохимических обществ (ЕЕВЭ) в Будапеште в 1990 году.

структура и объем работы, диссертация состоит из введения, обзора литературы, нетодическои и экспериментальной частей и выводов.

результаты и обсуждение изучение структур у и г. настоящая работа возникла, из попытки подтвердить, что в клетках мышей существуют длинные.поли(а)*-рнк, синтезирующиеся рнк-полинеразоя iii. при исследовании рнк были выявлены необычные структуры - х. гиг (Рис. 1). структура и биологические характеристики этих элементов были не ясны, и необходимо было провести их изучение. Анализ материала пятен г и г, включал различные Ферментативные и-химические обработки и хроматографии, так при действии щелочной ФосФатазы было выявлено, что такая обработка приводит к изменению хроматограФической подвижности У и ъ как на пластинах с пэи-целлюлозои, так и на пластинах с целлюлозой, это указывает на присутствие свободных фосфатных групп в составе исследуемых структур. поскольку после деФосФорелирования наряду с пятном радиоактивности,

А

В

О

рА р7тв

О

2 о

РС • рС 0

О • о X

\ 10 @ У р"

1 2 X

• —*■

Рис. 1. схенатическое изображение положения структур х. г и г пр1 двунернои тонкослойной хроматографии на пэи-целлюлозе (А) 1 целлюлозе (В). На схене (А) показана часть хронатогранны.

соответствующему свободному фосфату, мы наблюдали появление нового пятна, то естественно было предположить наличие более чем одного ФосФата в составе исследуемых структур. Этот или эти недеФосФорелированные ФосФатные остатки располагались очевидно в у и ъ таким образом, что были нечувствительны к обработке ФосФатазой, другини словами, они располагались каким-то необычный образом или были блокированы. новые пятна после обработки ФосФатазой г и г совпадали с питидин-2',3'-циклоФосФатом и уридин-а•,з'-циклоФосФатом, соответственно.

при обработке рнказоя а мы получили новое расположение пятен, одно из них совпадало с 3', 5' -штшиндифосфатом ( в случае У), а другое с з'.5■-уридиндифосфатом ( в случае с 21. известно, что рнказа а способна расшеплять нуклеозипциклоФосФаты. суммируя полученные результаты, мы пришли к выводу, что т и г представляют собой 51-ФосФат-цитидин-2',3'-циклофосфат и 5'-фосфат-уридин-2',3'-циклофосфат соответственно, мы предполагаем, что такие структуры' образуются при действии специфических рнказ на молекулы мрнк на первых ступенях их деградации в клетке, известно, что при действии РНКаз" на 3'-конце РНК образуется нуклеозид-г*,3'-циклофосфат, который позднее при повторной взаимодействии с' РНКазой превращается в остаток нуклеозид-з'-ФосФата.

2. структура х входит в состав вг-РНК. характерным свойством материала X, поногаюшим идентифицировать это пятно на хроматограммах, является его устойчивость к щелочной фосфатазе. Обработка ФосФатазой

предварительно растепленной нуклеазой р1 поли(А)+-рнк, синтезирующейся рнк-полимеразой III. не приводила к исчезновению пятна х. тогда как пятна ррр(3 и ррра после такой обработки пропадали (Рис. 2. а и В).

материал х выявляется в составе В2-РНК. выделенной гибридизацией меченной шшил) * -рнк. синтезированной рнк-полимеразои III. с ва-лнк. иммобилизованной на Фильтре (Рис. г с. о. отношение радиоактивности пятен X и ррр0 было выше в В2-рнк, чем в исходной поли(А)*-рнк. синтезирующейся рнк-полинеразой III и составляло 1:1. Аналогичный опыт с В1 рнк. выделенной гибридизацией с клоном В1-рнк из поли(А)*-рнк . синтезированной РНК-полииеразой III, не выявил в ее составе материала х (Рис. г е. п.

известно, что кроме хорошо изученных полиаденилированных в2-рнк существуют в клетке и неполиаденилированные молекулы в2-рнк. в отличие от полиаденилированных нолекул в2-рнк, варьирующих в размере от 200 до 400 нуклеотидов, поли(А)"-в2-рнк представлена четырьмя дискретными видами рнк определенной длины (95, 120, 160 и 180 нуклеотидов). ны показали с поношью Фингерпринтинга значительное сходство всех четырех видов поли(А)" в2-рнк (на Фингерпринтах в2 рнк меньших размеров не появляется новых пятен при сравнении с фингерпринтами в2 рнк больших размеров), а также на существование высокой гомологии между лоли(А)" и поли(А)4 В2 рнк.

фосфатаза

полиА пол III РНК

В1 РНК

ох . о

/РРР6

в

х

В2 РНК О О

ФрррС

с о-

ррр° р

Рис. 2. хроматография на пэи-целлюлозе продуктов растепления нуклеазоя Р1 поли(АГ-рнк (а,В), вг- (с.э) и В1-рнк(Е.п. в каждой случае, половина натериала, обработанного нуклеазоя Р1, подвергалась дальнейшей обработке щелочной ФосФатазой (В.о.Г). в .каждой случае показана лишь часть хроматограммы

А

Е

1

после выделения по стандартной схене рнк из клеток асиитной карциномы эрлиха и аффинной хроматографии на поли(и)-сефарозе низкомолекулярную поли(А)"-рнк гибридизовали с зондом в2-днк клона Мм14 и разделяли с помощью электрофореза на полиакриланидном геле (рис. 3). элюированные зоны поли(А)"-B2-PHK обрабатывали нуклеазой Pi и наносили на пластины с пэи-целлюлозой. проводили двумерную хроматографию. этот анализ продемонстрировал наличие структуры х в составе всех четырех типов неполиаденилированной B2-PHK. соотношение величин радиоактивности X и pppg заметно не отличалось от того же соотношения для полиаденилированной В2-РНК и равнялось 1:1.

з. структура х образуется при транскрипции В2-РНК т vitro. ны решили проверить способность образования структуры х в B2-PHK. транскрибирушейся в бесклеточном экстракте sioo, выделенном из клеток асцитной карциномы эрлиха. пользуясь методом выделения. предложенный well et al. (1979). мы получили транскрипционный экстракт, успешно синтезирующий B2-PHK, а также другие рнк гомологичные и негомологичные системе транскрипции, полученной из мышиных клеток, генов, транскрибирующиеся рнк-ПОЛИМеРазОЙ III (5S, 4.5S, VA, ТРНК).

В2-РНК, синтезированную экстрактом sioo. наносили на полиакриламидный гель, проводили электрофорез, В2-РНК элшровали и обрабатывали нуклеазой Pi. затем продукты расшепления нуклеазой Pi хроматографировали на пластинах с пэи-целлюлозой. часть материала после обработки нуклеазой pi дополнительно переваривали

1С. з. хроматография на пэи-целлюлозе продуктов растепления пслеазой Р1 поли(А)" вг-рнк. слева показан радиоавтограф >лиакриламидного геля, в которой проводили разделение вг-РНК. 1франи указаны размеры РНК в нуклеотидах.

I

Рис. 4. электрофорегранма (А) и хронатограФия (В.С) на пэи-

пеллюлозе продуктов растепления нуклеазой Р1 В2-РНК,

синтезированной в бесклеточнои экстракте экю. (С) дополнительная обработка шелочноя ФосФатазой.

мелочной ФосФатазои и потом провопили хроматографию - как было показано, структура X устойчива к обработке щелочной ФосФатазой, в отличие от нуклеозипмоно-, ли- и трифосфатов, также образующихся в результате обработки нуклеазой PI. такая обработка помогала пополнительно идентифицировать структуру x (Рис. 4).

При проведении описанного эксперимента было продемонстрировано появление структуры x у В2-РНК при транскрипции в бесклеточной системе, таким образон, полученные результаты свидетельствуют о наличии структуры х в составе транскриптов В2-эленента.

4. структура х входит в состав 7SK-PHK и аналогична метальной группе, блокирующей 5'-конец U6-PHK.

придя к заключению о сушествованиии кэп-подобной структуры в в2-рнк. ны заинтересовались, не содержат ли аналогичных структур и другие транскрипты рнк-полимеразы т. оказалось, что в 1980 г. Epstein et al. описали подобную структуру на 5'-конце U6-PHK. которая. как было выяснено позднее. транскрибируется РНК полимеразой III (KunKel et al.. 1986; Reddy et al,. 1987). однако до саного последнего времени природа блокирующей группы не была установлена. только в недавно вышедшей статье. в которой принимали участие эти же исследователи (Sineh et al.. 1989) было показано, что эта структура является метальной группой снз. ны использовали иные хронатограФические нетоды. чем те, которые приненяли Epstein et al. (1980). чтобы установить идентичность кэп-подобных структур в B2-PHK и иб-рнк было необходимо

Рис. 5. электроФоретическое разделение в г/-ном полиакриламил.ном геле (А) низкомолекулярных поли(А)~-рнк. синтезированных в клетках асаитнои карциномы эрлиха в присутствии 40 мкг/мл альФа-аманитина и С32Рз ортофосфата, и хроматография на пэи-целлюлозе (В) продуктов расшепления нуклеазои Р1 этих рнк. (С) -то же. что и (В) с дополнительной обработкой щелочной ФосФатазой.

исследовать их однини и тени же нетодани. кроне того, мы попытались наяти структуру х в других рнк. транскрибирующихся рнк-полинеразой ш. на рис.5 показаны хронатогранны продуктов гидролиза низконолекулярных поли(А)"-рнк. синтезированных рнк-полинеразоя III в клетках аспитноя каишноны эрлиха, пятно х наблюдалось в составе двух рнк: ие-рнк и 7sk-phk. все остальные исследованные нани рнк содержали лишь pppg и, как правило, ррра.

для точной идентификации tsk-phk было проведено Фингерпринтирование (Barren, 1971; rnrdon and Koie. 1987). 7sk-phk элюировали из полиакриланидного геля и обрабатывали согласно нетодике. затеи проводили электрофорез на аиетилиеллюлозе в первой направлении и гомохронатоггаФию на пэи-целлюлозе во втором направлении. полученный Фингерпринт 7sk-phk соответствовал литературным данный (Redd/ et ai., 1984).

используя технику, описанную sineh et ai. (1990). мы синтезировали СН3-0-Р. При двунерноя тонкослойной хронатогр'афии на целлюлозе химически синтезированный СН3-0-Р располагался в тон же самом месте что и л», полученный из В2-. 7SK-. или ие-рнк (рис.б), таким образом. В2-. ие- и 7SK-PHK содержат на 5'-конце одну и ту же структуру - CH3PPPG. эти хронатографические данные точно согласуются с результатами sineh et ai. (1990) по хронатографии на целлюлозе СН3-0-Р (синтезированного и полученного из ие-РНК).

в

> щ

.0 ^

0)

«с

•370

V

»»

*

•;..Ри н3с-о-р

"ро

"рС

к

Рис. 6. хроматография на целлюлозе нативного (А) и растепленного пирофосфатазой (В) материала X, а также химически синтезированного СН3-0-Р (С).

5. Обшие принципы кэпигования u6-. 7SK- и В2-рнк.

в настояшея работе мы обнаружили. что в отличие от подавляющего большинства рнк, транскрибируюпихся рнк-полинеразоя ш. В2 - и 7SK-PHK клеток ныши содержат на з*-концах особую кэп-подобную структуру xpppg. судя по хронатограФическин свойстван. блокирушая ганма-фосфат группа х имеет ненуклеотидную природу. Обнаруженная нага структура оказалась идентичной кэпу. описаннону Epstein et al. (1980) для нолекул иб-рнк. Ранее полагали, что иб-рнк синтезируется рнк-полинеразоя II. поскольку тот или иноя тип кэпов характерен для всех рнк. сшггезирухпихся рнк-полинеразоя Ii (Banerjee, 1980; Busch et al., 1983) наличие у U6-phk блокированного 5'-конца не вызывал удивления, однако позднее было доказано, что U6-PHK синтезируется рнк-полинеразои Iii (Runkel et al.. 1986; Reddr et al.. 1987) для транскриптов которой характерно наличие на 3'-конце неблокированной трифосфатноя Группы, такин образом. U6-PHK стала первый, а В2- и 7SK-PHK - двуня другими исключениями из этого правила.

в случае вг-рнк как полиаденилированные, так и неполиаденилированные транскрипты несгг на 5'-конце блокирующую группу х, при это кэпы наблюдаются как среди более тяжелых (180 нуклеотидов) так и более легких (160. 120, 93 нуклеотидов) поли(А)"-B2-PHK. в будушен. возножно. будут наядены и другие кэпированные транскрипты рнк-полимеразы iIi. что более вероятно в случае минорных рнк.

нужно отнетить, что в работе Reddy et ai. (1984). посвяшенноя Фингерпринтированию 7SK-PHK. сообщено о наличии свободной трифосфатной группы (pfpG) на 5'-конце этой рнк. по нашш данным лишь половина молекул 7SK-PHK имеет такой 5'-конец, остальные кэпированы. ны полагаен. что эти авторы могли не занетить на Фингерпгинтах пятна, соответствующего кэпированному 3'-концу, также не исключено, что различия в результатах связаны с тен. что мы использовали другой вид клеток и нетили рнк в течение меньшего времени.

недавно, сингх и Рэдди (Singh and Beddy. 1989) показали, что группой, блокирующей ганма-ФосФат в иб-рнк является нетил. т.е. кэп в этой РНК имеет структуру сНзррро. продемонстрированная нами идентичность кэпов В2-РНК. 7SK-PHK и иб-рнк свидетельствует о той что В2- и 7SK-PHK имеют на 5'-конце ту же структуру, неханизм реакции метилирования гаина-ФосФата на 5*-конце РНК и значение такой модификации остаются неизученными. Можно предположить, что кэп затшает РНК от действия экзонуклеаз и тен санын увеличивает время жизни РНК в клетке, однако наши предварительные данные свидетельствуют о тон. что вреня жизни копированных и некэпированных молекул В2-РНК приблизительно одинаково.

Твердо установлено, что us-рнк участвует в сплайсинге нрнк (Brow and Guthrie, 1969), тогда как функция 7SK-PHK остается неизвестной. Хотя эти две рнк не гомологичны друг другу, их объединяет характер транскрипции, как правило, промотор рнк-полинеразы in расположен внутри гена, лишь гены ие-рнк и 7SK-PHK не инеют внутреннего промотора: их промотор расположен в 5'-

ie

Фланкирующей последовательности (Das et al.. 1988; Hurphy et ai., 1987). возможно, что способность к копированию какин-то обраэон связана с этим свойством генов ив- и 7SK-PHK. однако такой характер транскрипции не может быть основный, что определяет способность транскриптов рнк-полинеразы iiI к копированию, как ны показали. вг-PHK копируется, однако известно (Krayev et al., i960), что В2-эленент обладает внутригеннын пронотором.

недавно smeh et al. (1990) показали, что для копирования U6-PHK необходима и достаточна последовательность ее первых 25 нуклеотидов. этот участок состоит из шпильки длиной 19 нуклеотидов и следушея за ней последовательности auauac. нарушение структуры шпильки и динуклеотидные замены в последовательности auauac резко снижали эффективность копирования иб-РНК в бесклеточной системе или полностью предотвращали его. интересно, что в B2-PHK и 7SK-PHK имеются гексануклеотиды. отличающиеся от последовательности auauac в иб-РНК только однин нуклеотидон: auauaa (в В2-рню и cuauac (в 7SK-РНК). в обоих случаях оти гексануклеотиды расположены на большой расстоянии от 5■-конца рнк (в В2-РНК - 154 нуклеотида. в.7SK-PHK 189 нуклеотидов).

согласно существующим моделям вторичной структуры В2-РНК (Тиллиб и соавт. 1986) и 7SK-PHK (Reddy et al., 1987) 5'-кониы отих РНК так же. как 5'-конец ие-рнк (Epstein et al.. i960>. вовлечены в образование шпилечных структур и при этом во всех трех случаях первый нуклеотид цепи РНК оказывается расположенным рядон с гексануклеотидон a/guauac/a (рис. 7). следует также

рис. 7. схемы вторичных структур в2-рнк. ие-рнк и 7SK-PHK. темным прямоугольником обозначена последовательность (A/G>UAUA(C/A)

отнетить. что ни в одной из трех РНК этот гексануклеотид не вовлечен (согласно ноделян) во вторичные структуры. можно предположить, что все эти обшие черты ив-. В2- и 7SK-PHK как раз и определяют их способность к копированию.

проведенное исследование подтверждает, что не существует строгих границ, разделяющих гены классов пи ш. кэпированию подвергаются три РНК. транскрибирующиеся рнк-полинеразой III. U6. 7SK и В2. такин образом кэпирование вошло в ряд свойств, считавшихся характерными для транскриптов рнк-полинеразы II. но зыявляшихся при исследованиях последних лет у РНК класса III. Все это позволяет по новону взглянуть на сходства и различия генов разных классов эукариотическои клетки.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена кэп-структура в составе полиаденилигованноя В2-рнк. транскрибирующейся рнк-полинеразой iii. с ретропозона В2 мыши. такая же кэп-структура выявлена в неполиаленилированных молекулах В2 РНК длиной 93. 120. 160 и 180 нуклеотидов-.

г. показано образование кэп-структуры при транскрипции В2 РНК в бесклеточноя систене. полученноя из клеток ныни аспитноя карциномы эрлиха. 3. показано, что кэп-структура из В2-РНК идентична нетильноя . группе блокирующей 5'-конец иб-рнк и представляет собоя

структуру ch3pppg.

4. при изучении различных низконолекулярных рнк, транскрибирушихся рнк-полимерезой in. такая же кэп-структура была выявлена в 7SK РНК. за исключением В2. иб и 1ST. другие рнк этого класса содержат на 5'-коние свободную трифосфатную группу.

5. идентифицированы э'-ФосФат-питшшн-г'.з'-циклоФосФат и 5'-

ФосФат-утидин-г•.3'-циклофосфат как продукты растепления поли(А)* РНК клеток асцитноя карциномы эрлиха нуклеазоя Pl. предполагается, что такие структуры образуются при действии специфических рнказ на нолекулы нрнк на первых ступенях их деградации в клетке.

список работ опубликованных us mis диссертации:

.1. ШУНЯЦКИЯ г.П.. ТИЛЛИб С.В.. Кранегов Д.А. 1990. В2-РНК и 7SK-рнк, транскрипты РНК-полинегазы ш. имеют на 5'-конце кэп-ПОДОбНУЮ СТРУКТУРУ. НОЛ. биология. 24:1686-1694.

2. ТИЛЛИб C.B.. ШУНЯЦКИЯ Г.П.. ГРИГОРЯН Н.С.. Крамеров Д.А. 1985.

низконолекулярная поли(А)-содержащая вг-РНК. тезисы докладов V всесоюзного биохйнического съезда, т.1. стр. не

3. вахитов в.А.. гииаловф.р.. шумяикий г.п. 1989. нуклеотидные

последовательности генов генов 5S ррнк полиплоидных видов пшеницы и их диких сородичей, мол. биология. 23:431-440.

4. Kramerov.D.A.. ShuroyatsKY.G.P.. svetlov.v.v. 19В9. New struc-

tural elements of poly(A)-contamine RNA of mouse cells. Abstracts of lith Nuclear workshop, suzdai. p. lie.