Основные повторяющиеся элементы генома мыши

Крамеров, Дмитрий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Основные повторяющиеся элементы генома мыши
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Основные повторяющиеся элементы генома мыши"

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ' АН С С С Р

На правах рукописи КРАМЕРОВ Дмитрий Александрович

УДК 547.963.3" ОСНОВНЫЕ ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ЭЛЕМЕНТЫ ГЕНОМА МЫШИ

03.00.03 -Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1987

Работа выполнена в Институте молекулярной биологин А Н С С С Р

Официальные оппоненты;

чл,-корр. АН СССР, доктор химических наук

А.А.БОГДАНОВ чл,-корр. ВАСХНИЛ, доктор биологических наук

Г.И.ШОНЕНКО доктор биологичооких наук,.профессор

Л.Л.КИСЕЛЕВ

Ведущая организация - Институт цитологии и генетики СО АН СССР

^Запита состоится " "_198 г в_чао

на заседании Специализированного совета в Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу 117984, Москва ул, Вавилова, 32

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии '

Автореферат разослан " " ; _198 г

Ученый секретарь Йпециализированного совета кандидат химических наук

А.М.Крицын

"iL.:'-Актуальность проблемы. Повторяющиеся последовательности геномной ДНК эукариот открыты Бриттеном и Коном в 1968 г. Они были выявлены как фракция, способная к более быстрой ренатурации, чем остальная геномная ДНК.В. последующее десятилетие ряд исследовательских групп, работая с суммарными или слабо фракционированными препаратами повторяющая последовательностей ДНК (повторов), установил следующие основные факты. I. Повторы обычно составляют 20-70$ . ДНК любого эукариотического организма. 2. Число.копий в геноме варь-ируетдля разных семейств повторов от I02 до 10б. 3, Наряду с тандем-но организованными повторами (сателлитная ДНК) в большом количестве встречаются рассеянные по геному повторяющиеся последовательности. У разных аукариот среднее расстояние между повторами заметно отличается (от 1000 до .15000 п.н.). 5. У подавлявшего большинства видов имеются как длинные (2-10хЮ3 п.н.), так и короткие (100-400 п.н.) повторы, б. Последовательности, гомологичные повторам, присутствуют в составе гетерогенной ядерной РНК и мРНК.

Были выдвинуты гипотезы, согласно которым повторы являются ре-гуляторными элементами, контролирующими транскрипцию или процессинг молекул про-мРНК (Georgiev,I969i Britten, Davidson,1969; Davideon, Britten, 1979 ). В 70-е годы эти гипотезы о структуре генов эукариот и регуляции их экспрессии были наиболее признанными. Это делало изучение коротких повторяющихся последовательностей ДНК актуальной проблемой молекулярной биологии эукариот.

Кроме того, незадолго до начала выполнения настоящей работы, были клонированы некоторые повторяющиеся последовательности Droso-phila melanogaster (Tchurikov et al.t 1970, Pinnegan et «1. 1978)» Все они оказались длинными (5-7 тыс.п.н.) рассеяными по геному в количестве 20-100 копий повторами. Неожиданно было обнаружено, что у мух разных линий некоторые копии этих последовательностей имеют различную локализацию в геноме ( Ananiev et ai.,1978 ). Таким образом, было установлено, что эти повторы дрозофилы представляют собой мобильные генетические элементы. Их с^али обозначать как мобильные диспергированные гены (!1ДГ). Уже в то время было предположено, что МДГ, подобно инсерционным последовательностям и транспозонам бактерий, способны при интеграции внутрь гена или рядом с ним влиять на его работу. Все это делало важным и актуальным вопрос о том, не яв~

ляю'х'ся ли мобильными генетическими элементами и повторы в ДНК млеко-пи таючщх.

Наконец, имеется еще один аспект, делающий работу актуальной. Б 1972 г. Рысков и др., а также Джелмнек и Дарнелл описали длинные двуспиральные участки в составе гетерогенной яде.рной РНК (гяРНК) клеток мыши и человека. (Препараты таких участков выделяли как материал устойчивый к действию РНК-аз А и Я). Были получены свидетельства в пользу того, что эти структуры представляют собой "шпильки" и транскрибируются с повторяющихся последовательностей ДНК. В молекулах мРНК длинные двуспиральные участки не обнаруживались, хотя детектировались последовательности, гомологичные им (Рысков и др.,1975). Делались предположения относительно участия длинных шпилечных структур в процессинге молекул про-мРНК. В 1977 г. Крамеров и др. разделили длинные двуспиральные участки гяРНК клеток мыши на две фракции (А и В), характеризующиеся разными размерами. Длина двуспиральной РНК типа А (дсРНК-А) была равной 300-1000 п.н. Длина двуспиральной РНК типа В (дсРНК-В) - 100-150 п.н. Опытами по перекрестной гибридизации было продемонстрировано, что два типа дву-спирадьных участков состоят из разных нуклеохидных последовательностей. Кроме того, оказалось, что, если двуспиральные участки типа В действительно являются шпилечными структурами в составе высокомолекулярной гяРНК, то двуспиральные участки типа А представляют собой межмолекулярные дуплексы. В то же время выяснилось, что оба типа доРНК транскрибируются с повторяющихся последовательностей ДНК. Хотя, как уназывалось,ужа выдвигались некоторые предположения относительно функции длинных "шпилек" в молекулах про-мРНК, их природа, как и природа двуспиральных структур типа а, оставалась по сути совершенно неясной. Поэтому вопрос о том, что же собой представляют последовательности, образующие эти необычные структуры в молекулах гяРНК, весьма актуален.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение природы повторяющихся последовательностей генома мыши, гомолс гичных двуспиральным участкам гяРНК. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи. I). Клонировать последовательности ДНК мыши, гибридизующиеся с дсРНК-А и -В. 2). Определить первичные структуры этих последовательностей, если они не обладают слишком большой протяженностью. 3). Выяснить некоторые ас-

пекты эволюции этих последовательностей ДНК на примере ряда видов млекопитающих. 4). Установить,как распределены их транскрипты между, различными фракциями клеточных РНК. Определить размеры транскриптов.

В ходе изучения транскриптов была обнаружена необычная низкомолекулярная РНК, в связи с чем возникли новые задачи: установление ее структуры, характера синтеза, ассоциации с белками.

Научная новизна и практическая ценность работы» При выполнении настоящей работы получен целый ряд новых и приоритетных научных данных.

С помощью клонирования в .клетках Е..Со11 геномной ДНК мыли были идентифицированы две гомологичные доРНК-В высокоповторяющиеся последовательности, обозначенные В1 и В2 (1979 г). Таким образом, впервые были клонированы повторяющиеся последовательности, рассея- . ные по геному позвоночного животного. Они же оказались первыми идентифицированными короткими повторами ДНК; Была определена нуклеотид-ная последовательность обоих повторов (1980 г и 1982 г), чуо позволило обнаружить ряд интересных структурно-функциональных черт, характерных для них. В частности были получены свидетельства в пользу того, что они являются мобильными генетическими элементами. Последовательности В1 и В2, наряду с последовательностью А1и из генома человека ( Ре1л1г%ег е* а1., 1981), стали первыми известными представителями большого класса мобильных элементов, обозначаемых в настоящее время как регропозоны.

Обнаружено, что,помимо высокомолекулярных РНК (мРНК и про-мРНК), последовательности В1 и В2 выявляются в составе низкомолекулярных поли(А)-содеряащих ШК (1982 г). Они были обозначены как В1 и В2РНК. Вторая значительно более богато представлен . в клетках. Показано, что В2ГОК входит в состав РНП-частиц и что ее содержание в опухолевых клетках обычно значительно выше, чем в нормальных. Получены доказательства того, что эта РНК транскрибируется РНК-полимеразой Ш ' с кногочисленных копий последовательности В2 (1984, 1985 г).В2РНК является первым примером транокрипта, синтезирующегося РНК-полимеразой I, и в то же время подвергающегося полиаденилированиго. Кроме того, ранее вообще не были известны какие-либо низкомолекулярные полиаденилированные РНК,

Обнаружено, что трифосфатн'ая группа на 5 -конце некоторой части иолекул В2РНК блокирована какой-то структурой, совершенно отличной о! тех, которые встречаются в кэпах, характерных для транскриптов

РНК-полимеразы Л. Впервые установлено, что синтез заметной доли по-« ли(А)-содержащих РНК (в том числе и высокомолекулярных) устойчив к действию <*~аыанитина, что свидетельствует в пользу их синтеза РНК-полимеразоЙ Ш (1984 г).- Эти данные существенно меняют сложившие^ ся представления о типах РНК, синтезирующихся в клеточном ядра. Настоящая работа является одной из первых, посвященных сравнительному анализу клонированных повторов ДНК организмов разных видов (1980, 1986 г). С помощью гибрадизационных методов было установлено, что гомологи ВХ- и В2-повторов мыши детектируются в геномах представите-! лей подотряда мышеобразных грызунов, но не других млекопитающих. Исключение составляют приматы, для которых характерен гомолог В1-пов-тора. Обнаружено, что степень сходства BI-повторов у разных видов грызунов монет совершенно не соответствовать их таксономической близости.

Наконец, в настоящей работе были клонированы две повторяющиеся последовательности геномной ДНК мыши, гомологичные доРНК-А (1981 г). Как было показано, эти последовательности, обозначенные AI- и А2--элементаии, имеют большие размеры - около ? тыс.п.н. Оказалось, что они идентичны последовательностям генома мыши, клонированным приблизительно в тот же период другими авторами. AI соответствует ИАЧ-элементу, кодирующему интрацистернальные А-частицы ( One et ах., 1980, Ku££ et al,., igai ), А2 соответствует MIFI -повтору ( Brown, Dover,1981), ИЛИ BamHJ-повтору ( Panning, 1983), ИЛИ LI -элементу ( Voliva et al..,1984).Нами для этих длинных повторов генома мыши впервые показано следующее. В клетках транскрибируются обе цепи ДНК Я- и А2-элементов, Однако, транскрипты одной из цепей ДНК преобладают над транскриптами другой (асимметрия особенно выражена в случае AI-элемента). Транскрипты обоих элементов сильно варьируют по размеру. Набор транскриптов AI-элемента,может существенно отличаться в клетках разных опухолей. Транскрипты А2-элемента локализуются практически только в ядрах клеток (1984 г). Результаты работы легли в основу нового направления исследований, которое состоит в изучении рётропозонов и их транскриптов. Это направление в настоящее время интенсивно развивается целым рядом лабораторий. Некоторые из главных выводов работы приводятся в монографиях, служащих • в качестве учебных пособий при прохождении курса молекулярной биологии.

Апробация работы. Ряд результатов диссертации вошел в цикл работ "Мобильные гены тавотных", удостоенный Государственной премии СССР за 1983 год. Кроме того, отдельные части настоящей работы были представлены на международных и всесоюзных форумах, в частности, на хыг и ХЫГГ Симпозиумах по количественной биологии (Колд Спринг Харбор, 1980 и 1982 )", на ХЛ Конгрессе ФЕБО (Москаа, 198*0, на Х1У Европейском симпозиуме по опухолевым Вирусам (Варна, 1982), на У1 двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ по структуре генома (Ленинград,1985), на УП и УИ Всесоюзных симпозиумах по структуре и функции клеточного ядра (Харьков, 1980; Пущино, 1984) на У Биохимическом съезде (Киев, 1985),

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, раздела Материалы и методы, раздела Результаты, раздела Обсуждение результатов, Выводов и Списка литературы (444 ра-» бот). Работа изложена на 31? страницах, -включая 63 страницы с иллюстрациями, которые состоят из 61 рисунка и б таблиц,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСЛДЕНИЕ

I. Клонирований и свойства последовательностей ДНК мыши, гомологичных дсРНК-В

1.1. Клонирование

Для клонирования последовательностей ДНК, гомологичных дсРНК-В, был использован банк клонов клеток Е-Со11, несущих случайные фрагменты геномной ДНК мыши в составе плазмиды рШ 322. (Такие фрагменты были получены при совместной обработке суммарной ДНК мыши рестрик-тазами ЕсоШи Н1паш). Клетки 110 случайно выбранных клонов были объединены в группы по пять клонов в каждой. Плазмидная ДНК каждой из групп клонов была выделена и после иммобилизации на нитроцеллюлез-ных фильтрах гибридизована с денатурированной [3Н] -дсРНК-В клеток асцитной карциномы Эрдиха. Оказало&ь, что ДНК всех групп клонов, за исключением одной, способны гибридизоваться с дсРНК-В. Шесть таких групп, которые продемонстрировали наиболвиую величину гибридизации, были отобраны и ДНК каждого из 30 индивидуальных клонов были тем же способом проверены на гибридиэуемость с дсРНК-В. ДНК 15 клонов оказалась способной к гибридизации. При такой схема поиска кло-

нов нельзя точно определить частоту встречаемости клонов, содержащих последовательности, гомологичные дсРНК-В; но, очевидно, эта величина должна быть равной 20-5055. Таким образом, последовательности, гомологичные дсРНК-В ояань часто встречаются в геноме мыши.

1.2. Два вида.последовательностей, богато представленных в популяции молекул дсРНК-В

Для выяснения вопроса о том, какой процент молекул дсРНК-В гомологичен ДНК каждого из клонов, проводили гибридизацию денатурированной [Зн] -дсРНК-В с большим избытком плазмидной ДНК, иммобилизованной на фильтре. Оказалось, что значительный процент молекул дсРНК-В гибридизуется с ДНК каждого из клонов.По этому признаку.14 изучавшихся клонов могут быть разделены на 4 группы (а-аблица 1).ДНК клонов I группы связывают 39-45$, П группы - 31%, I группы -23-24$ и 1У группы - 11-16% последовательностей дсРНК-В. Столь высокая степень гибридизации дсРНК-В говорит о тон, что содержание некоторых видов последовательностей в популяции молекул дсРНК-В весьма значительно .

Далее возникает вопрос о сходстве и различии между последовательностями дсРНК-В, гибридизующимися с ДНК разных клонов. Так как сумма процентов гибридизации дсРНК-В с разными клонами значительно превосходит 100$, кажется вероятным, что многие из них содержат одинаковые последовательности ДНК, гомологичные дсРНК-В. Для проверки этого дсРНК после гибридизации с ДНК клонов Мм35 (Б. группа) или Мм14 (1У группа) злюировали с фильтров и использовали для повторной гибридизации с ДНК разных клонов. Оказалось, что повторная гибридизация успешно протекает при использовании ДНК одних клонов, но не происходит вовсе в случае других клонов (рис.1). При регибридиза-ции с ДНК исходных клонов с фильтрами связывалось 55-70% материала РНК; эта величина может характеризовать эффективность гибридизации в использованных условиях. Близкие к этим значениям величины связывания дсРНК, предварительно -гибридизовавшайся с ДНК клона Ым35, были получены с ДНК клонов Ым34 Мм4, Ум31. Это означает, что все они содержат последовательность одного типа, гибридизуюшуюся с дсРНК-В, которую-мы назвали В1. Клоны Мм3,4,31 и 35 относятся к I и П груп-< -пам, а это означает, что последовательность В1 составляет,по крайней мере, 30$ популяции дсРНК-В. Если же учесть, что эффективность гибридизации достигает лишь 55-70%, то содержание последовательно-

сти В1 в препаратах дсРНК-В может быть оценено в 40-50%. С ДНК четырех других клонов (Мм15,75,67,89) дсРНК-В1 гибридизовалась приблизительно на 40%. Это хорошо' коррелирует с более низким связыванием тотальной дсРНК-В с ДНК-этих клонов. Вероятно, что ДНК каждого из четырех перечисленных клонов содержит лишь часть последовательности В1, ДНК еще трех клонов (Мм14,61,63) совсем не гибридизовалась с дсРНК-В1. Видимо, эти клоны содержат другие последовательности, гомологичные дсРНК-В.

В опыте по гибридизации дсРНК, связывающейся р ДНК клона Мм14, было обнаружено, что эта РНК эффективно гибридизуется как с ДНК клона Мм14, так и с ДНК клонов МмЗ.и.61, а также в несколько меньшей степени - с ДНК клона МмбЗ (рис.1).

Таблица 1. Процент гибридизации дсРНК-В с ДНК клонов, иммобилизованной на фильтрах

Номер клона \ 1 I" .......... . ! 3 4 12 ! | | 1- \ 31 I 35 73 "1- ! 15 1 75 87 ! 1 1- ! II I 14. 61 63 Е9

Гибридизация,$ | ! 45 39 41 I [ ! ! 31 1 31 31 1 23 I 24 24 1 1 ! 16 1 14 16 1211-

Группа клонов | ... .............. ... 1 1 ! I \ 1........ _ 1 I !...... п ! 1 I.. 1 Ш 1 1 I 1 1_____ 1У '

ДСР1ЧС

ТО

[ДНК клатОЩ (ДНК к пана ¿Г7Ц

щрт (НАЛ) кекцтт)

Гибридизация С ДНК раямчх кланов < *

Л7Гг_

1!. 3 К II 15 75" 17 69 11 61 63

Номер клопа*

т з 61 63 л 13

>ис. I. Идентификация последовательностей В1 и В2. Схема иллюотри-)ует ход опыта по получению дсРНК, гибридизуютцейся с ДНК Мм35 и Мм14, I результаты ее повторной гибридизации о ДНК других клонов. Высота ¡толбиков отражает процент гибридизации РНК.

Таким образом, ДНК всех этих клонов содержит одну и ту же последовательность, гомологичную дсРНК-Б. Она была обозначена, как пос ледовательность В2. Можно заключить, что дсРНК-В2 является вторым богато представленным видом•дсРНК,* составляющим по крайней мера 15$ молекул дсРНК-В, или, с учетом 50-70$-ной эффективности гибридизации эта величина может быть оценена в 20-30$. Итак, в сумме последовательности В1 и В2 должны составлять 60-80$ всех молекул дсРНК-В. Как и следовало ожидать, дсРНК-В2 не гибридизовалась с ДНК клонов Мм31,35,89, несущих последовательности В1. В то же время ДНК МмЗ, относящаяся к группе клонов наиболее эффективно связывающих суммарную дсРНК-В, содержит последовательности как В1, так и В2 (рис.1). По-видимому, все клоны I группы.содержат оба основных вида последовательностей гомологичных дсРНК-В. Таким образом, имеется неплохое соответствие между тем, в какую группу входит данный клон (см. таблицу I) и видом последовательности, присутствующим в нем. Клоны I группы содержат последовательности В1 и В2, П группы - В1, 1 группы- часть последовательности В1, 1У - последовательность В2. Однако имеются исключения: клон Мм89, отнесенный к 1У группе, судя по гиб-_ ридизации, содержит часть последовательности В1,

Основной вывод, который можно сделать из описанных опытов, состоит в том, что большинство длинных шпилечных участков молекул гяРНК представлено всего лишь двумя видами 'последовательностей. Это хорошо согласуется с ранними косвенными данными (Крамеров, 1977) о невысокой "сложности" популяции молекул дсРИК-В, которые были получаны при изучении кинетики ренатурации этих молркул.

Некоторые характеристики последовательностей В1 и В2, установленные с помощью гибридизациоммх огДгтов

Уже из данных о высокой частоте встречаемости клонов, содержа-' тих последовательности, гомологичные дсРНК-В, следовало: В1 и В2 присутствуют в геноме мыши в очень большом количествз-порядка сотен тысяч копий. Для проверки этого была проведена гибридизация меченной методом "ник-трансляции.'.' суммарной ДНК мыши с иммобилизованной на фильтрах ДНК клонов, содержащих последовательности В1 или В2. (Для более точного определения доли, последовательностей ДНК, образующих дуплексы фильтры после гибридизации обрабатывали нуклеазой ет, ■которая разрушает одноцепочечные участки). Оказалось, что практически одинаковый процент последовательностей геномной ДНК мшш гибрпди-

зуется с ДНК В1- и В2-содержавдх клонов. Эта величина равна 0,5/5. Позже (см. главу 2) были определены размеры последовательностей В1 и В2: они оказались равными, соответственно, 130 и 1Б0 п.н. Вместе эти данные позволили оценить число копий последовательностей В1.и и В2 в геноме мыши. Оно равно, соответственно, 1,2х105 и 0,8х105. Таким образом, ВХ и.В2 являются высокоповторяющимися последовательностями генома мыши.

Далее было определено содержание последовательностей В1 и В2 во фракции пзлиндромной ДНК мьшш. Для этого меченую дробленую палиндромную ДНК гибридизовали на фильтрах с ДНК клонов. 2,5-37» ДНК фракции палиндромов связывалось как с клонированной последовательностью В1, так и В2. Таким образом, фракция палиндромов в 5-6 раз обогащена последовательностями В1 и В2. По нашим данным палиндромы составляют 5% всей ДНК мыши. Отсюда можно определить, что 0,125-0,15% суммарной ДНК мыши соответствует последовательностям В1, образующим палин-дромные структуры. То есть только 1/4-1/3 всех копий последовательности. В1 образуют палиндромы, тогда как остальные не способны к этому. То же самое относится и к последовательности В2. Наконец, было определено содержание последовательностей, гомологичных В1 и В2, в составе молекул про-мРНК. Для этого печенную 1ш тяжелую ( >25») гяРНК гибридизовали на фильтрах с ДНК кланов. РНК для этих, опытов дробили инкубацией в щелочи (максиму!,I распределения - 120н.) для предупреждения быстрой ренатурации длинных шпилечных структур. Оказалось, что 1,5% материала молекул про-мРНК гиб-ридизуется с ДНК В1-содержащих клонов и 0,6%- с ДНК В2-содеркацих клонов. Таким образом, последовательности В1 и В2 весьма богато представлены в составе молекул про-мРНК. Также важно отметить, что, как следует ив этих данных, общее содержание в про-мРНК последовательностей В1 и В2 в 4 раза выше содержания в этих молекулах длинных шпилечных структур (дсРНК-В составляет 0,5% материала про-мРНК; Крамеров, 1977). Следовательно, лишь часть (около 1/4) всех последовательностей В1 и В2 образуют в про--лРНК протяженные двуспираль-ныз структуры.

2. Первичная структура последовательностей В1 и В2

Клонирование фрагментов ДНК мыши, содержащих повторяющиеся последовательности, гомологичные дсРНК-В, открыло путь для выяснения первичной структуры этих последовательностей. Для этой работы были

использованы два В1-содержащих (Мм31,35) и три ВЕ-содержащих (Мы14, 61 и 98Р ) клона. На первом этапе работы было выяснено, на каком участке каждого из клонов локализуется последовательность, гомологичная дсРНК-В. Для этого сначала были построены рестрикционные карты клонированных фрагментов ДНК (в основном использовались рестриктазы, узнающие специфические тетрануклеотиды), а затем ';блот"-гибридиза-цией с -дсРНК-В было выяснено, какие из субфрагментов ДНК со-

держат интересующие последовательности. Это позволило с довольно высокой точностью локализовать последовательности В1 и В2 в пределах клонированных фрагментов (размеры фрагментов составляли 0,6-2,3 тыс. п.н.). Кроме того "блот"-гибридизация позволила выяснить, что в од- -ном из клонов (Мм35) содержится две копии последовательности В1, расположенных на расстоянии I тыс.п.н. и имеющих одинаковую ориентацию. В четырех других клонах было лишь по одной копии последовательности В1 или В2.

На втором этапе работы было проведено секвенирование тех участков клонированных фрагментов ДНК, в которых были выявлены последовательности, гибридизуюпшеся с дсРНК-В. Секвенирование осуществляли . по методу Максама и Гильберта (1977). В результате была определена первичная структура трех копий В1 и такого же числа копий В2-после-довательности. Сами повторяющиеся элементы были идентифицированы как гомологичные участки, выявляемые при сравнении нуклеотидных последовательностей ДНК разных клонов. Хотя копии повторяющихся последовательностей оказались высокогомологичнымк, они не были совершенно идентичны. Копии отличались заменами и делениями отдельных пар нуклеотидов, которые довольно равномерно разбросаны по их длине. Отличия затрагивали Ъ% п.н, в последовательности В1, Копии последовательности В2 отличались друг от друга 6-10% п.н. На рис.2-и 3 представлены усредненные нуклеотидные последовательности, соответственно, В1 и В2-элемеьтов. Усредненные последовательности составлялись таким образом, '"то в каждом положении проставлялся тот из четырех нуклеотидов, который присутствовал хотя бы в двух из трех секвенированных копиях.-.

В В1-элементе можно выделить две части: собственно последовательность В1, имеющую длину 130 п.н., и вариабилышй по длине и структуре А--богатий район (рис.2). Во всех трех копиях в состав этого района входят тандешше повторы последовательности типа А2_зС2_2> причем обь'йя длина этих тандемных повторов варьирует в разных копиях

OHI SY40

. EGSCNHASTSg

BI—

. frggCTOtAGTgQ) OHI BK GWTOAGAOOCgg

JCOT8GCAT0GTGGTGaAT0CCrTrAATCGCAGGACTCaoaA0GGAGA(idCA5 a qCGG-PAGGCUSG OGCACGGCGGOAGGAITUGGGIJOAA.- ggASGGASASQQAQ

4r59PHR GGCGG-PAGGCIJGGOGCACGG(X?GOAGGAirUGGGIJGAA.-1 7sli РНК gCQGGGC--GGtf-0C^CffilCTGflAGUCCCAggACtrCG'

_~ О

|GGGCTCGAMN6gi J} OHI SV40r CGA@CC-gCCTGg BI GCG3ATTTCT3AGTTCOAgOCOAgCGfS§TCTTOAeAeTOAeiTCOAg3AOAeCCAegGO 4,5ePHK AGGGAUGAO-GAGaUCGAGGGCAGGCnGGGCUACACAinmmm 78b ИЖ GAGGAjJGOЩвАЯЦGO-AG^CAGCCUGGGCAACAUAG----«.................

I89H.

BI TAGAGAOAGAAACCGTGTOTC0ES 7sb РНК ------GGAOACCCCGUCUGWA

ИшЭ1 AAAAAMCCAAACCAAACCAAACAAAAAACCGASACAACAAATCAAATGGTGIA...

Ит35(а) АААААСААААСАААААОАААСАААСАААСАААСАААСАССААААААААААААОАААОв AAAOCAAAAOjqAA...

йтэ5(%) AAAAAAAOAAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAGGAACCAAGGAAAGAAAQAAACAAAC AAAAAAAOAACAAAAAAAgAAAACTTCTCTCTSOAACAGGTgOAgACCATTTTAAAAA дд. AAAAAAA...

Зис. 2(A). Нуклеотидная последовательность BI-элеиента, получения путем усреднения, данных по трем секвенированным копиям. Положе-1ие вариабильного А-богатого района показало прямоугольником.Стрел-га изображают прямые фланкирующие повторы. Нуклеотиды 4,5 » РНК Harada, Koto, 1980 ), 7 sL РНК (EL et all., 1982) И участка ДНК ИЗ (бласти начала репликации вирусов SV40 и BK ( Reddy et el», 1978, rang, Wu,i979), гомологичные нуклеотидам последовательности BI, юдчеркнуты. Треугольником отмечено положение не представленного ia рис. 189-нуклаотидного участка 7 зЬРНК, который не обладает го-¡ологией с В1-элеменмм,В рамках даны усредненные последовательно-!ТИ.Двух блоков промотора рнк-полимераэы Ж ( Fowlkeg, Shenk, 1980).. Б). Нуклеотидная последовательность вариабильного А-богатого рай->на трех копий BI-элемента. Стрелкой подчеркнут прямой фланкирую-дай повтор в клоне Мм31.

_„ KfGGGNNAGTGGl

B2---Г " ' *>gGGGffrgGTGAGATGGCTftÁGCGflGTAAGAGCACCflGA(:TGCTOTTfi

4,5аРНЙ GGUCGA-OAf^UGSCTCAGCGGOTU-AfjrCUAGOGCtAAAnAJlOA

|gGC№TCGAWiCC)

вг QMGaTOCTOACIlCAJUXWc£amCIUAlUlGGa:№CTOACAAOCA'CCOGTMGGil 4,58РНЕГ CÜAUAA---QAGUÜGGGUlJCCGAGGA-OCAGGQCUGUCGUU-OCAOOAGaUUUtf

Вг GATCTOACGCCCTCTTgtaGAGIGTCTGAGGACAGCTAGAGIGlAQTTAOAIATAATA

вг ААТАААТАААТААЛТАААТСТтаСТ)АААААААА(АААААА)|

Рис. 3. Нуклеотидная последовательность В2-элемента, полученная путей усреднения данных по трем секвенированным копиям. Стрелки изображают прямые фланкирующие повторы. Участки 4,5a.PHKI (Ro-Choi et ai., 1972), гомологичные В2-элементу, подчеркнуты тоикой линией. . Потенциальные сигналы полиаденилирования подчеркнуты толстой линией. Усредненные последовательности двух блоков промотора РНК-полиме* разы Ш даны в рамках.

от 31 до 69 п.н. В случае одной из копий за последовательностями типа ¿2-8^1-2 следУег участок, представляющий собой.десятикратное тандемноз повторение пентануклеотида АААА& (рис.2). В2-элеыент также несет на своем конце A-богатый район, но он значительно более консервативен по длине и структура, чем А-богатый район BI-элемента. Он состоит из закономерно расположенных тандем-ных повторов типа Aj_3T, за которыми следует последовательность ТСТ3^ и олиго(А)-сегыент длиной 8-14 н. (рис. 3). Размер трех копий В2-элемента варьирует от 190 до 205 nfH. Эти.вариации полностью обусловлены различиями в длине A-богатого района. Анализ секвенированных последовательностей привел к обнаружению того факта, что все три копии В2-элемента и одна из копий BI-элемента фланкированы прямыми короткими повторами (рис. 2 и 3). Все эти . повторы негомологичны друг другу и, таким образом, не входят в состав самих BI- и В2- элементов. Фланкирующие повторы отличаются по длине:, для трех копий В2 их размеры составляли II, 15 и 16 п.н., а

гз .

для копии В1 из клона Мм31- 14 п.н. Вероятно, что такие фланкирующие повторы имеются и в случае двух других копий-В1-элемента, но из-за очень большой протяженности А-богатых районов соответствующие участки не были секвенированы. Известно, что транспозоны бактерий и мобильные диспергированные гены дрозофилы ( Со1оа, мШег, 1980? Сапэти1г в.1., 1980Г Кульгускин и др., 1982) фланкированы прямыми короткими повторами, которые возникают в результате дупликации участка хромосомной ДНК при интеграции в него мобильного генетического элемента. Обнаружение прямых повторов, фланкирующих копии последовательности В2 и, по-крайней мере, одну из секвенированных ко-. пий последовательности В1, позволило предположить, что эти две повторяющиеся последовательности генома мыши яеляются мобильными элементами.

Как видно из рис. 2 и 3, последовательности В1 и В2 не обладают структурой палиндромов и следовательно при транскрипции их одиночных копий не могут образовываться длинные шпилечные структуры. По-,этому можно сделать вывод, что такие шпилечные структуры в молекулах гяРНК могут возникать только при транскр-пции пар противоположно ориентированных и близко расположенных В1- или В2-элементов.

Следующий этап работы состоял в сравнении первичных структур В1- и В2-элементов с различными другими известными последовательностями ДНК и РНК. Как видно из рис. 2,протяженные гомологии обнаруживаются между последовательностью В1 и мышиной ядерной 4,5а РНК, Эта РНК гомологична И на всем своем протяжении за исключением 3 --конца и 16-ти нуклеотидного участка во внутреннем районе. Два участка длиной 14 и 19 н. имеют 100^-ную гомологию. Еще одна низкойолеку-лярная И1К обладает значительными гомологиями с последовательностью В1 - это 7вЦ>НК (рис 2). Первые 73 нуклеотида последовательности. В1 имеют 85%-ную гомологию с началом 7эЬРНК. Следующие 9 нуклеоти-дов В1 полностью гомологичны участку РНК, расположенному недалеко от ее 3 -конца. В то же время вся центральная часть.РНК длиной 189н. не имеет никакого сходства с последовательностью В1. Для последовательности В2 также была выявлена гомология с низкомолекулярной РНК, хотя и менее выраженная. Из рис. 3 видно, что участок В2 с 3-его по 32-ой нуклеотид обладает 85?£-кой гомологией с 5 -концевым районом 4,5в РНК I..Гомология наблюдается и с некоторыми другими участками этой РНК. (4,5»РНК1 следует отличать от упоминавшейся выше 4,5эРЙС - это совершенно, разные РНК).

Кажется весьма вероятным, что в эволюции В1-элемент и гены, кодирующие 4,5 РНК и ад РНК, произошли от одних и тех же предковых последовательностей. То же самое можно предположить и в отношении В2~эт мента и генов, кодирующих 4,5эРНК1.

Известно, что перечисленные РНК синтезируются РНК-полимеразой Ш. Об. наружение протяженных гомологий между этими РНК и последовательностями В1 и В2 позволило предположить, что последние тоже способны транскрибироваться РНК-полимеразой ш. Если это так, то в структуре В1 и В2 должны выявляться черты характерные для генов, транскрибирующихся этой РНК-полимеразой. Структурно-функциональным анализом таких генов, в п^вую очередь генов тРНК, показано, что промотор РНК-, -полимеразы Ш находится внутри генов и состоит из двух блоков»

Эти блоки имеют определенную локализацию внутри гена: 1-ый блок длиной II п.н, располагается на расстоянии 8-12 п.н. от начала гена, 2-й блок длиной 12 п.н. находится на расстоянии 35-60 п.н. от 1-го блока. Блоки в разных генах неидентичны, однако могут быть выведены их усредненные нуклеотидные последовательности ( Ро«1кев, эьепк, 1980} Лащ et в1., 1981).

Из рис. 2 и 3 видно, что в соответствующих местах последовательностей В1 и В2 имеются участки весьма сходные с усредненными нуклеотид-ными последовательностями двух блоков промотора РНК - полимеразы 1. Таким образом, эти структурные данные косвенно указывают на то, что В1- и В2-алементы могут транскрибироваться РНК-полимеразой Ш.-В последовательности В1 были найдены два участка длиной по 14 п.н., которые оказались высоко гомологичны двум перекрывающимся участкам из области начала репликации ДНК двух паповавирусов -зу40 и ВК (рис. 2). Это послужило основой для предположения о возможном участии копий последовательности В1 в инициации репликации ДНК в клетках мыши. В последовательности В2 присутствует другая интересная структура - это гексануклеотид ААТААА. Несколько таких гексануклео-тидов содержится в А-бо^атом районе' каждой копии последовательности В2 (рис. 3). Известно, что гексануклеотид ААУААА содержится практически во всех полиаденилиров'анных мРНК на раостоянии 20-25 нуклео-тидов от поли(А)-сегмента. Он необходим для полиаденилирования мРНК. Можно предположить, что. РНК,на 3 -конце которых располагается в определенной ориентации последовательность В2, будет подвергаться полиаденилированию.

3. РНК, гибридиаующиеся с последовательностями В1 и В2

Для изучения распределения В1- и В2- содержащих молекул РНК по размеру был проведен "блот"-анализ различных фракций РНК, выделенное из клеток асцитной карциномы Эрлиха и печени мышей. РНК подвергали электрофорезу в вгарозном геле, переносили на фильтр, гйбриди-¡овали с меченой ДНК клонов, содержащих последовательность Б1(Мм31) 1яи В2(Мм14) и наконец проводили радиоавтографию фильтра. В таблице ! суммированы результаты такого анализа РНК. Удобнее отдельно рас-¡матривать гибридизацию в зонах высоко- и низкомолекулярных РНК.

Таблица 2. Результаты "блот"-гибридизации различных препаратов РНК с мечеными ДНК В1- и В2- содержащих клонов

Зона шектрофо-юграммы Зонд РНК карциномы Эрлиха . Поли(А)+РНК печени

Ядерна поли(А)+ я поли(А)" цитоплаз кая юли(А)+ латичес-поли(А)" ядерная цитош тичес полк- соы- ная 1аз мате я неполисом-ная

)ысоко-юлекуляр-[ая >600 н. В1 ++++ ++++ ++ ++++ ++ ++

В2 ++++ ++++ + ++++ ++' ++ (2т.п.н.)

1ИЗК0- юлекуляр- 1ая <600 н. В1 (4.5*РНК) + (7/РНК) -

В2 ++ ++++ ++-

[исло знаков (+) характеризует уровень гибридизации. В тех случаях, ;огда гибридизация выявляла полосу, указаны длина или обозначение ЙК, ответственной за это.

Сначала коротко остановимся на высокомолекулярных РНК. Судя :о результатам этих опытов, последовательности В1 и В2 очень бога-о представлены ;:ак в поли(А)+, так и в поли(А)" ядерных РНК. Раз-:эр таких В1- и В2- содержащих РНК лежит в диапазоне от одной до ескольких десятков тысяч нуклеотидов. Последовательности В1 и В2 адежно выявляются в цитоплазматической поли(А)+РНК, в том числе и полисомной мРИК. Однако, в цитоплазме В1- и В2- содержащих высоко-

молекулярных РНК намного меныае, чем в ядре. Эти цитоплазматические РНК меньше по размеру, чей ядерные: от 600 до 6000 н. Лишь в одной из фракций - в.полисоыной ^оли(А)+ШК клеток печени выявляется дискретная полоса. Она наблюдается при гибридизации с В2-зондоы. Разме этой В2-содержащей РНК около 2 тыс.п. Очевидно, она представляет собой иРНК.

Полученные результаты были интерпретированы следующим образом, (рио, 4),

в? рнк

ч V

ИРНК » МЕН*

I ¡У//////////Л ЦУА штт

Рис, Схема, иллюстрирующая образование различных В2-содержащих транскриптов: про-иРНК. иРНК, В2РНК. Она поясняет почему молекулы про-ыРНК содержат больше последовательностей В2, чем молекулы мРНК (это же объяснение справедливо и для В1-содержащих про-иРНК и мРНК). Показано два гипотетических гена, состоящих из 4 и 2 экзонов. Заштрихованы последовательности, кодирующие белок. ПолП и полИ-соотвег-ственно, РНК-полимераза Е и I.

Видимо, В1- и В2-элементы довольно часто встречаются в составе генов, кодирующих белки. Поэтому они богато представлены в молекулах высокомолекулярных ядерных РНК. Внутри генов В1- и В2-элементы, вероятно, локализуются преимущественно в интронах и заметно реже в нв-транслируемых частях экзонов. Вследствие этого поли(А)+ РНК цитоплазмы (мРНК) содержа"! значительно меньше последовательностей В1 и В2, чем ядерные РНК (про-мРНК). Такая интерпретация получила.подтверждение в работах последнего времени, в которых последовательности _ В1 и В2 были обнаружены в интронах и 3 -нетранслинуемых районах нескольких клонированных генов, кодирующих белки ( ¿тт® et а1., 1962» Мопаоп et а1., 1982} Вг1сквХ1 et а1., 1983» ЗсЬиЬ е* а1., 198?)* В частности в работе.А.П.Рыскова, П.Л.Иванова, Г.П.Георгиева и автора диссертации (НувКоу ег а1., 1983) была клонирована и частично секвенирована . упомянутая выше мРНК клеток печени длиной 2 тыс.н. Было показано, что она действительно содержит последовательность В2, локализованную в 3 -нетранслируемом районе. В этой мРНК, а также в мРНК антигенов гистосовместимости Н2-1/1 и Н2-Б<1 (Кгеаэ ег а1.,1984) последовательность В2 расположена непосредственно перед поли(А)-сег-мектом и поэтому довольно уверенно можно утверждать, что в этих мРНК сигналом полиаденилировакия служат гексануклеотиды ААШАА, входящие в состав последовательности В2.

Вернемся к результатам, представленным в таблице 2. Выяснилооь, что последовательности В1 и В2 способны гибридизоваться не только . с высоко-, но и низкомолекулярными РНК. Так, при гибридизации ядерной и цитоплазматической поли(А)~РНК с В1-зондом выявляются полосы, соответственно, 4,5эРНК и 7аьРНК. Этот результат хорошо согласуется с тем, что, как было указано выше, нуклеотидные последовательности этих малых РНК и Б1-элемента обладают протяженными гомологиями. Неожиданным оказался факт очень интенсивной гибридизации В2~зонда с поли(А)+РНК из цитоплазмы клеток.карциномы Эрлиха в зоне миграции молекул размером от 200 до 400 н. На радиоавтографе эта гибридизация выглядит как довольно широкое яркой пятно, интенсивность которого спадает по мере увеличения размеров молекул. При использовании В1-зонда также наблюдается гибридизация в этой зоне, но она несравненно слабей. Было предположено, что в цитоплазме клеток карциномы Врлиха имеются поли(А)-содержащие малые РНК, гомологичные последовательностям В1 и В2. Они были обозначены, соответственно, как

В1 РНК и В2 РНК.

Как вгдно из таблицы 2, В2РНК присутствует и в ядрах клеток карциномы, но в значительно меньшем количестве, чем в цитоплазме. Эта РНК в сравнительно небольшом количестве выявляется в "неполисомной" фракции цитоплазмам ческой РНК клеток печени, но она не обнаруживается в полисомах и в ядрах этих клеток. В1РНК не удавалось наблюдать ни в одной из фракций, кроме цитоплазматической РНК клеток карциномы, Низкое содержание в клетках В1РНК заставило нас отказаться от дальнейшего ее изучения, что позволило сконцентрировать усилия на исследовании В2РНК.

4. Биосинтез В2РНК -

Так как последовательности В2 в большом количестве встречаются в молекулах про-мРНК и, очевидно, в основном в интронах, то можно было бы предположить, что В2РНК образуется как побочный продукт сплайсинга молекул про-мРНК. Выщепившиеся интронные участки РНК могли бы подвергаться дальнейшему процессингу и в результате давать . молекулы В2РНК. Альтернативно В2РНК могла бы синтезироваться независимо от В2-содержащих про-мРНК. При этом, скорей всего, она должна образовываться путем транскрипции копий В2-элементов РНК-полиме-разой Ш, Это предположение основывается на описанной выше гомологии участков последовательности В2 с нуклеотидной последовательностью промотора РНК-полиыеразы Ш.

Для выяснения того, какая из этих гипотез верна, были использованы два основных подхода. Первый состоял в изучении чувствительности синтеза В2РНК к облучению клеток ультрафиолетовыми светом. Известно, что синтез РНК на длинных транскрипционных единицах более чувствителен к облучению ультрафиолетом, чем синтез на коротких единицах. Клетки карциномы Эрлиха облучали ультрафиолетовым светом (254 нм), метили Н752Р0^ и выделяли из них поли(А)+РНК. После электрофореза РНК в агарозном геле проводили так называемую контактную гибридизацию с ДНК В2-содержащего клона. В результате такой гибридизации на электрофореграмме выявляются все новосинтезированные В2-содержащие РНК. Оказалось, -.что при дозах облучения, полностью прекращавших образование всех высокомолекулярных РНК, синтез В2РНК почти не снижался. Эти данные свидетельствуют против того, что В2РНК образуется из молекул про-мРНК.

Другой подход к выяснению пути биосинтеза В2РНК основывался на свойстве <*-аманитина в определенных концентрациях ингибиро-вать РНКтполимеразу В (она синтезирует про-мРНК), но не РНК-поли-меразу Ш. Клетки карциномы Эрлиха инкубировали в течение 5 часов в присутствии 20 мкг/мл <*-аианитина (или без него) и затем еще 2 часа после добавления н|^РО^. Выделенные поли(А)+РНК подверга--ли электрофорезу в агарозном геле и последующей контактной гибридизации для выявления меченых В2-содержащих РНК. Оказалось, что

<*-аманитин в использовавшейся концентрации совершенно не по- . давляет синтеза В2РНК клетками. В то же время синтез низкомолекулярных ядерных РНК 01, 02 и и? которые, как известно, транскрибируются РНК-полимеразойЯ.в данном опыте ингибировался под действием °<-аманитина практически полностью. Таким образом, В2РНК не синтезируется РНК-полимеразой П. А так как хорошо из- _ вестно, что молекулы про-мРНК образуются путем транскрипции РНК--полимеразой П, то эти данные свидетельствуют против образования В2РНК из молекул про-мРНК. Итак, эта низкомолекулярная РНК синтезируется РНК-полимеразой Ш при транскрипции копий В2-элеиента. Независимость синтеза В2РНК и В2-содержащих про-мРНК иллюстрирует схема на рис. 4.

5. Структура В2РНК

Хотя В2РНН эффективно гибридизуется с клонированными копиями В2-элемента, до сих пор у нас не было строгих доказательств того, что В2РНК идентична по своей первичной структуре последовательности В2. Как обсуждалось выше последовательность В1, обладающая лишь частичной гомологией с 4,5 в и 7в1РНК, способна . достаточно эффективно гибридизоваться с этими двумя малыми РНК. Это служит примером того, что низкомолекулярные РНК, явно не транскрибирующиеся с копий данной повторяющейся последовательности, способны с ней гибридизоваться. Для получения доказательств того, что В2РНК действительно образуется при транскрипции копий В2-элемента, была поставлена задача определения первичной структуры «олекул В2РНК. Для этого было проведено клонирование молекул ДНК, комплементарных В2РНК.

кДНК синтезировали с помощью обратной транскриптазы, используя в качестве затравки олиго( <3® ), а в качестве матрицы-цито-плазматическую низкомолекулярную поли(А)+РНК клеток карциномы Эрлиха. После клонирования двухцепочечной кДНК в плазмиде р№222 гибридизацией на колониях с ДНК-вставкой Мм14 были отобраны клоны, которые несут последовательности, соответствующие В2РНК. Была определена первичная структура ДНК 10 таких клонов.

Клонированные кДНК заметно отличались друг от друга по длине,, но все обладали.высокой гомологией с усредненной геномной последовательностью В2. Девять из десяти клонов содержали неполную, лишенную начала, последовательность В2. (Отсутствие того или иного по длине участка, соответствующего 5 -концу РНК, - обычный дефект клонированных кДНК^ Присутствующие в кДНК последователь^ ности В2 не содержали внутренних делеций и вставок. В то же вре-ия эти последовательности в разных клонах не были идентичными -- они отличались друг от друга заменами 3-10$ нуклеотидов, что соответствует уровню отличий между геномными копиями В2. Наконец, усредненная последовательность кДНК отличалась от усредненной геномной последовательности В2, представленной на рис, 3, только' тремя нуклеотидами. Таким образом, можно сделать вывод о практически полной гомологии В2РНК и В2-элемента.

Все клонированные кДНК содержали на своем конце поли(А)-сег-мент.

В специальном эксперименте было доказано, что з'-конец В2РНК картируется точно на первом нуклеотиде В2-элемента. Меченный по 5 -концу фрагмент ДНК, полученный с помощью рестриктаз и соответствующий определенному внутреннему участку клонированной последовательности В2, был денатурирован, оттожен с цитоплазматической поли(А)+РНК клеток карциномы Эрлиха и-использован в качестве затравки для обратной транскрипции. Точное измерение размера продукта обратной транскрипции позволило установить, что начало всех молекул В2РНК совпадает с началом последовательности В2.

Его длина варьировала от 10 до 52 нуклзотидов, а в среднем составляла 33 нуклеотида. Это значительно больше размера олиго(А)-сегмента в геномных копиях В2, который варьирует от 8 до 14 ну-клеотидов. Это послужило, указанием на посттранскрипционное происхождение поли(А)-сегмента в В2РНК. В большинстве кДНК, так же. как и в геномных копиях В2, непосредственно перед поли(А)-сегмен-том располагалась последовательность ТСТ^ (см. рис.3 и 5). ОаИ1 et а1., (1983) показали, что пентануклеотид ТСТТТ выполняет функции терминатора транскрипции РНК-поликеразы Е в гене, кодирующем лейциновую тРНК у ксенопуса.

Судя по всему, последовательность.ТСТ5_5 и при синтезе В2РНК играет роль терминатора (рис. 5Л). В одном из клонов вместо ТСТ3_5 присутствует последовательность ТТТТ. Она, очевидно, также может выполнять функцию терминации транскрипции при синтезе В2РНК, так как известно, что во всех генах, кодирующих 5* РНК и большинство тРНК такую функцию выполняют олиго(Т)-сегмзнты.

-..В одном из клонов конец кДНК имел существенно иную структуру: ТСТ»АаААТМАТАААТАААаАСГАСТОАААаТСТТААОАОААТТСТАаТТТА22. То есть в этом клоне за последними нуклеотидами последовательности В2 (подчеркнуты) следует дополнительная последовательность длиной 49 н., заканчивающаяся тринуклеотидом ТТТ, и только после этого идет поли(А)-сегмент. Интересно, что в данном клоне вместо терминатора ТСТ^^ присутствует последовательность ТСТТ, Она, очевидно, не способна терминировать транскрипцию, поскольку две такие последовательности присутствуют во внутренних районах В2-- элемента, но как показывает структура В2РНК, транснрипцию не останавливают. Таким образом, та копия В2-элемента, с которой транскрибировалась соответствующая этому клону молекула В2РНК, не содержит полноценного терминатора.

Как следствие этого транскрипция продолжилась за пределы В2--элемента и терминировалась, видимо, на случайно расположённом олиго(Т)-участке. Обнаружение такой кДНК свидетельствует о том, что определенный процент молекул В2РНК содержит на своих З'-кон-цах дополнительны® нуклеотидные последовательности, образование которых обусловлено дефектностью'терминатора в соответствующих копиях В2-элемента.

Рио.5Б иллюстрирует образование таких удлиненных молекул В2РНК. Их существованием, видимо, объясняется гетерогенность по длине молекул В2РНК.

ТСТ3_, . В1 | у«-«

-аа^М Ш ^

В2рнк[Щ~

А.

поли£\)

В1

ТСТ, т>4

т щ

е.

§ -¡¡ШШ

Рис.5. Схема, иллюстрирующая образование обычных (А) и удлиненных. (Б) молекул В2РНК. Заштрихованы участки промотора РНК-поли-меразы Ш. Толстыми стрелками обозначены прямые фланкирующие повторы. Тонкие линии-последовательности, окружающие В2-эле~ мент.

Как указывалось выше, анализ клонированных кДНК, соответствующих В2РНК, показал, что. они содержат длинные (до 52 н.) поли(А)-сег-менты. Так как олиго(йт ), служащая затравйой при обратной транскрипции, случайным образом связывается с поли(А)-сегментами РНК, размеры этих сегментов в кДНК могут оказаться меньшими, чем в РНК. Чтобы точнее определить размеры поли(А)-сегаента и строго доказать его 3 -концевую локализацию в молекулах В2РНК, был проведен следу-

дающий опыт. Поли(А)1>НК цитоплазмы клеток карциномы с^константой седиментации менее 122 метили по з'-концам с помощью Р—рСр и PHK--лигазы. Затем гибридизацией с ДНК В2-содержащего клона, которая была иммобилизована на фильтре, выделяли В2РНК..Эту РНК обрабатывали РНК-азами А и Tj и выделяли поли(А)-сегменты на лоли(и )-сефароэе. Этот материал подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле и радиоавтографии.,Оказалось, что размеры поли(А)-сегментов В2РНК варьируют от 15 до 150 нуклеотидов, а максимум распределения находит-' ся в области 80 нуклеотидов. Очень сходная картина наблпдалась в случае поли(А)-сегментов, выделенных из тяжелой (>12э) цитоплаз-матической поли(А)+РНК (мРНК).

Хорошо известно, что поли(А)-сегменты в мРНК имеют посттранскрипционное происхождение. Поэтому сходство в распределении-по размерам поли(А)-сегмснтов в молекулах мРНК и В2РНК указывает на такое ке происхождение поли(А) в В2РНК. Средний размер поли(А)-сегментов в В2РНК.значительно выше, чем размер таких сегментов в геномных копиях В2. Таким образом, кажется очень вероятны!«, что сегменты по-ли(А) на 3 -концах молекул В2РНК образуются уже после транскрипции- путем нематричного синтеза. Схема на рис. 5 иллюстрирует это. Способность молекул В2РНК подвергаться полиаденилированип, очевидно, связана с наличием в А-богатом районе В2-элеызнта гексаяуклвотидов ААТААА (рис.3), которые, как известно, служат сигналами полиадени-лирования почти во всех генах, кодирующих мРНК.

Итак, В2РНК обладает необычным сочетанием свойств: с одной стороны - она, как и ряд других низкоыолекулярных РНК, синтезируется РНК-полимеразой И, с другой стороны - она подвергается полиаденили-ровакию, как мРНК.

6, Высокомолекулярные поли(А)"|"РНК«синтезирующиесЯ в присутствии ос-аманитина

При проведении опыгов по изучению влияния с*-аманитина на синтез, клетками В2РНК (см. главу 4) было сделано неожиданное наблюдение. В условиях, когда о<-аманмтин полностью ингибировал синтез таких транскриптов РНК-полимеразы Й, как UI,U2 и «3 РНК, сохранялся синтез заметной части поли(А)+РНК, в том числе высокомолекулярной. Позднее подобные опыты были наоднократно повторены. Они подтвердили вывод об устойчивости синтеза некоторой части высокомолекулярной поли(А)+РНК к действию о<-аманитина. На рис.6 показан результат ти-

личного опыта. В этой опыте иечевие клеток проводили в присутствии этидий бромида (1мкг/ил), который является мощный ингибитором синтеза иитохондриалышх мИ1К. Это было необходимо по той причине, что в митохондриях, как известно,, синтез мРНК осуществляется РНК-полимера-зой нечувствительной к действию сА-аманитина. Клетки карциномы Эрли-ха инкубировали в течение 5 часов в присутствии 20 икг/мл ос-аиани-тина (или без него) и затем еще 2 часа после добавления Н^ РО^. Двукратной хромотографией на поли(0 )-сефарозе выделяли поли(А)+РНК и подвергали ее седиментации в градиенте концентрации сахарозы, приготовленном на диыетилсульфо^сиде (такой градиент использовался для предотвращения агрегации РНК).

Как видно из рис.6, значительная часть (25%) всей клеточной.по-ли(А)+РНК продолжает синтезироваться в присутствии <*-аманитина. Наибольшее количество такой РНК приходится на низкомолекулярную фракцию} по мере увеличения размеров молекул количество такого материала снижается.

Рис. 6. Седиментация в сахарозном градиенте поли(А)+РНК, синтезированной клетками карциномы Эрлиха в присутствии (I) или отсутствии (2) в среде о<-амани-тина (20 мкг/мл).

В легкой (Л) фракции (размер молекул до 500 н.) поли(А)+РНК, .ешь тезирующаяся в присутствии аманитина, составляет 60$ от контроля. В , средней.(С) фракции (500-1800 н.) - 20$, в тяжелой (Т) фракции (более 1800 н.) - 7$. Таким образом, этот опыт указывает на существование в клетках не только-низко-, но и высокомолекулярных поли(А)+РНК, синтезирующихся не РНК-полимеразой П, а, скорей всего, РНК-полимеразоШ,

Для демонстрации того, что поли(А)+РНК, синтезирующиеся в присутствии ы-аманитина, обладают и другими чертами характерными для транокриптов РНК-полимеразы Ш, была исследована структура 5 -концов молекул этой РНК. Известно, что у всех исследованных до настоящего времени РНК, транскрибирующихся РНК-полимеразой Ш, на 5 -конце находится трансформированный нуклеотид (исключение составляют монофосфо-рилированныо 5 -концы молекул тРНК и 5*РНК, которые образуются путем процессинга). Напротив, 5 -концы всех известных транокриптов РНК-полимеразы П представляют собой нэпы. На основании этого можно предсказать, что, если высокомолекулярные поли(Л)+РНК, синтезирующиеся в присутствии о<-аыанитина, будут нести на 5 -концах трифосфатные группы, а не кэпы, то они должны были быть транскрибированы РНК-полимеразой Ш, а не П. Если же в таких РНК обнаруживаются кэпы, то это указывает на то, что они синтезировались в присутствии о<-аманитина из-за неполноты ингибирования РНК-полимерази П.

Для проведения этого исследования РНК каждой из трех фракций (Л, С и Т),.выделенных в ходе вышеописанного опыта, переваривали нукле-азой Pl. Гидролизаты подвергали двумерной тонкослойной хроматографии на ПЭЙ-целлюлезе (Lycan, Daima, 1983 ) с последующей радиоавтографией. Во всех трех фракциях четко выявлялись пятна ррро и рррА,. хотя их яркость и уменьшалась при переходе от фракция Л к фракции Т. Количество этих 5 -концевых нуклеозидтрифосфатов практически не за-висило от того,обрабатывались ли клетки о<-аманитином или нот. В то же время пятна, соответствуют!- : кзпам ( ТпйрррАш и 7mspppGa )» выявлялись только в РНК фракции С и Т, выделенных из контрольных клеток. То есть <*-аманитин полностью подавляв синтез кэп-содержащих РНК (транокриптов РНК-полимеразн Л). Таким образом, полученные результаты подтверждают сделанное выше предположение о том,что высокомолекулярная поли(А)+РНК синтезирующаяся в клетках в присутствии °<-ама-яитина, транскрибируется РНК-полимеразой Ш.

Природа таких высокомолекулярных РНК пока остается неясной. Кажется весьма вероятным, что по крайней мере часть из них является продуктами транскрипции копий В2-элемента, лишенных терминатора РНК-поли-

меразы Ш (см, рио.5Б). Но в отличив от описанной в предыдущей главе иолекулы В2РНК, содержащей на 3 -конце добавочных 49 нуклеотидов, у этих молекул дополнительная последовательность может быть значитель** но более длинной. Возможно,, что свой вклад в образование высокомоле-*' кулярных поли(А)+РНК, синтезирующихся в присутствии ог-аманитина, могут вносить и копии BI-элемента, а также встречающиеся в ДНК млекопитающих промоторы РНК-полимеразы I, которые не входят в состав каких-либо повторяющихся последовательностей или генов низкомолекулярных РНК (Carlson, Нова, 1983, 1984).

Нельзя исключить, что наиболее длинные поли(А)+РНК, синтезирующиеся в присутствии °<-аманитина, транскрибируются какой-то пока неизвестной РНК-полимераз«"

7. Необычная структура 5*-конца некоторых молекул В2РНК

_ I

При проведении вышеописанного опыта по изучению структуры 5 -концов поли(А)+РНК, синтезирующихся в присутствии ot-аманитина, помимо пятен, соответствующих pppG и рррА, было обнаружено еще одно пятно, локализованное на хроматограмме в области расположения трифосфорили-• рованных нуклеозидов (рис.7). Это пятно было наиболее ярким в РНК фракции 1 и почти не различимым в РНК фракции Т. Количество этого материала практически не зависило от присутствия о<-аманитина при синтезе .РНК клетками. Это свидетельствовало о том, что структура, соответствующая этому пятну, входит в состав транскриптов РНК-полимеразы Ш. В специальном опыте было продемонстрировано, что материал этого пятна, обозначенного как X, присутствует в составе молекул В2РНК. Для этого низкомолекулярную [ р] -поли(А)+РНК из клеток карциномы гибридизовали на фильтре с ДНК В2-содержащего клона; связавшуюся с фильтром РНК (20$) элюировали, обрабатывали нуклеазой PI и подвергали двумерной хроматографии на ПЭИ-целлюлезе. Радиоавтография пластинки выявила картину очень сходную с той, которая наблюдалась в случае суммарной поли(А)+РНК фракции Л (рис.7). То есть для молекул В2РНК свойственны не только расположенные на 5 -концах трифосфолированные пурины (причем pppG' сильно преобладает над рррА), но и Х-структура.

Были предприняты попытки изучения природы Х-структуры. Оказалось, что материал пятна X совершенно не чувствителен к действию.щелочной. фосфотазы. Это означает, что Х-структура не является ни ди~, ни три-фосфорилированныи нуклеозидом, но может обладать структурой подобной кэпу, поскольку в кэпе фосфатные остатки блокированы с двух

сторон нуклеозидами и поэтому недоступны действию фермента. В то хе. время обычные кзпы, свойственные транскриптам РНК-полимеразы П, хро-матографируются на ПЭИ-целлюлезе совершенно иным образом нежели Х-структура (рис.7). Следовательно, если Х-структура и является капом, то - это необычный к§п.

1т6грррАт ънСрррб'т

хАт

т'А

З^г Х

т^х.

О А

тЪх * п?ёх

хйя

тЩпЯС , хтЯ

о *

Ос

Об и°*й л

у > I/р

Рис.7

РиаВ

Рис. 7. Схема, показывающая результат двумерной хроматографии . г,, на ПЭИ-целлюлезе гидролизата поли(А)+РНК длиной менее 500 н.

Рис. 8. Схема, показывающая результат двумерной хроматографии на немодифицированной целлюлезе меченого материала Х-струнтуры, обработанного кислой пирофосфатазой табака. Заштрихованы пятна, обнаруживаемые при радиоавтографии. Маркерами служили рв, рА,рС,ри,,.,

р7 по . Положение остальных нуклеотидов дано согласно Сильбер-клангу и др. (1979). . ....

Для проверки предположения о том, что Х-структура имеет сход- ' ство с кэпами, была изучена ее чувствительность к кислой пирофосфа-' тазе табака (этот фермент расщепляет все лирофосфатные связи в. нук-; леозид-содержащих молекулах; например кэп 7пСрррАш будет расщеплен на р7тй, рАт и р). Материал Х-структуры, элюированный с хрома-тограгмы, обрабатывали кислой пирофосфатазой и снова подвергали двумерной хроматографии на ПЭИ-целлюлезе с последующей радиоавтогра- ,, фией. Оказалось, что Х-структура чувствительна к действию этого фермента: на хроиатограмме можно было наблюдать вместо исходного пятна X два новых, одно из которых соответствовало по положению ортофос-

фату (р), а другое не совпадало ни с одним из четырех обычных иукле-озид-монофосфатов. Таким образом, обнаружение чувствительности материала пятна X к кислой пирофосфатазе табака подтвердило, что он обладает кэп-подобной структурой.

Было предположено, что второй из продуктов расщепления является ка--ким-то модифицированным нунлеотидом. Для выяснения этого вопроса материал пятна X, переваренный кислой пирофосфатазой, подвергали двумерной хроматографии на пластинках иемодифицированной целлюлезы с последующей радиоавтографией (рис.8). Как и ожидалось, одно из пя-„ тен (I) соответствовало по положению ортофосфату, а другое не только не совпадало ни с одним из модифицированных нуклеотидов, но вообще локализовалось вдалеке от той области.на хроматограммв, где располагаются нуклеотиды. Как видно из рис.8, это пятно (Я) находится вблизи от пятна орюфосфата, мигрирующего во втором направлении . с фронтом растворителя. Такой результат приводит к мысли, что в составе Х-структуры имеется какой-то еще неизвестный нуклеотид или, что кажется более вероятным - группа ненуклеогидной природы. Полученные данные были интерпретировании следующим образом: X имеет структуру хрррв, где х-неидентифицированный компонент, скоре'; всего, ненук-лвотидной природы, а $ -первый (мажорный) нуклеотид в цепи РНК. Пока из-за недостатка радиоактивности нам не удалось выявить на хро-матограммах третий - предполагаемый продукт расщепления Х-структуры, а именно б. Это, видимо, связано с низкой удельной радиоактивностью о(-фосфата по сравнению с или ¿'-фосфатами. Несмотря на отсутствие третьего пятна ка хроматограммах, нам кажется, что описанные свойства Х-структуры делают маловероятными существенно иные интерпретации ее строения.

Таким образом, получается, что транскрипты РНК-полимеразы ПГ тоже могут содержать кэп-подобные структуры, хотя, видимо, совершенно иной природы, чем транскрипты РНК-полимеразы С. Наши данные указывают на то, что 5 -концы более чем 30% молекул В2РНК, а также других поли(А)+транскриптов полимеразы I, блокированы группой х.

8. Распределение и состояние В2РНК в цитоплазме

Хорошо известно, что молекулы про-мРНК и мРНК входят в состав рибонуклеопротепдных частиц (РНП-частиц). То же относится к многочисленным низкоыолекулярным РНК. Однако, все же имеются исключения. Так, пс.-двляющее большинство молекул тРНК не входит в состав РНП-

частиц (Альжанова и др. 1982). В связи с этим было интересно выяснить относится ли В2РНК к группе малых РНК, ассоциированных с белками или нет.

Цель первого опыта состояла в том, чтобы установить, седиментирует ли В2РНК при фракционировании цитоплазматического экстракта быстрей, чем при фракционировании чистой, депротеиниэированяой поли(А)+РНК. Для этого экстракт цитоплазмы клеток карциномы Эрлиха центрифугировали (20000 об/мин, 40 ч) в градиенте концентрации сахарозы (7-25%), из каждой фракции градиента (всего их было 12) выделяли поли(А)+РНК, подвергали электрофорезу в агарозном геле, переносили на фильтр и выявляли В2РНК во фракциях градиента посредством гибридизации о меченым В2-зондом и последующей радиоавтографии. В контрольном опыте предварительно из цитоплазматического экстракта выделяли поли(А)+ РНК, денатурировали ее и центрифугировали в том же градиенте концентрации сахарозы. После этого во фракциях определяли наличие В2РИК, как в основном опыте. Оказалось, что при фракционировании цитоплазматического экстракта В2РНК седиментирует в области 10-20 в,тогда как при фракционировании поли(А)+РНК - в области менее 10а» Кроме того, в специальном опыте было показано, что при обработке экстракта додецилсульфатом натрия (ДСН) и протеиназой К В2РНК начинает се-диментировать медленнее 10 ».Из этих опытов можно заключить, что В2РНК входит в состав частиц, характеризующихся константой седииен-тации 10-20в,которые скорей всего имеют рибонуклеопротеидную природу.

Для подтверждения этого был проведен следующий эксперимент. Клетки карциномы облучали УФ-светом (254 нм, Ю5 эрг/мм2) для того, чтобы ковалентно сиить РНК с белками в РНП частицах, выделяли цитоплаэма-тический экстракт, его центрифугировали в сахарозном градиенте и собирали материал седиментирующий в зоне 10-20а» Далее из него хро-. матографиай на олиго(4т)-целлюлезе выделяли поли(А)-содержашй материал. Его подверАди центрифугированию в градиенте плотности сульфата цезия и из каждой фракции градиента, используя обработку протеиназой К, выделяли РНК. Далее после электрофореза РНК и "блот"-ги-бридизации с В2-ЗОНДОМ определяли характер распределения В2РНК вдоль градиента. Оказалось, что приблизительно половина всей В2РНК выявляется в зоне с плотностью 1,40-1,44 г/см3, характерной для РНП. Остальная В2РНЯ выявлялась в зоне с плотностью 1,62 г/си3, что характерно для РНК, не связанной с белками. Присутствие некоторого

количества В2РНК в зоне свободной РНК, очевидно, - результат неабсолютной эффективности сшивания РНК с белком в РНП-частицах. (В контрольной части этого эксперимента, проведенной на информосомах и полисомах, было показано, что около 40% молекул мРНК также оказывается Н8 сшитыми с белками). Таким образом, можно заключить:молекулы В2РНК входят в состав РНП-частгц.

При проведении первого из описанных в этой главе опытов было замечено, что некоторая часть В2РНК при центрифугировании в составе цито-плазматического экстракта выявляется в материале, собирающимся на дне пробирки. Константа седиментации этого материала - более 22а» Было предположено, что В2РНК присутствует во фракциях информосом и полисом. Для проверки этого цитоплазматический экстракт центрифугировали в градиенте концентрации сахарозы (10-40%) в таких условиях. (20000 об/мин, 19 ч), чтобы на дно пробирки осаждались только полисомы. Зто позволило получить следующие франции: малые РНП (<25е-, ), "легкие" (25-80в ) и"тяжелые" (80-150») информосомы и полисомы (>1508,). Из этих фракций выделяли поли(А)+РНК,' подвергали электрофорезу и выявляли В2РНК гибридизацией с соответствующим зондом. Оказалось, что 55$ В2РНК седиментирует в зоне малых РНП, 20% и 14%т

- соответственно, в зонах "легких" и "тяжелых" информосом и 11% -

- во фракции полисом.

В .специальном опыте было проверено действительно ли В2РНК, седи-ментирующая во фракции полисом, входит в их состав. Оказалось, что быстроседиментирующие частицы, содержащие В2РНК, не чувствительны к ЗДТА. Эти данные послужили свидетельством того, что В2РНК не связана с полисомами. Возможно, присутствие небольших ае количеств во фракции полисом обусловлено некоторым загрязнением этой фракции информосомами;

Обнаружение В2РНК в составе тяжелых цитоплазматических Hin-частиц (скорей всего информосом) поставило вопрос о характере связи между низкомолекулярной РНК и РНП-частицой. Можно сделать два предположения: связь В2РНК осуществляется (I) через белок или (2) непосредственно за счет взаимодействия с высокомолекулярной РНК, входящей в состав РНП-частицы. Для выяснения характера связи был проведен следующий опыт. Клетки метили в течение суток P^cJ -гидролизами белка, получали цитоплазматический экстракт и центрифугированием в сахарозном градиенте выделяли РНП-частицы с константой седи--иенгации более 30 е. Этот материал обрабатывали додоцилсульфатом натрия (1,8%) и протеиназой К до исчезновения кислотонерастворимой

радиоактивности белка. Затем материал снова фракционировали в сахарозном градиенте (в тех же условиях что использовались в первом описанном.в этой главе опыте). Из каждой фракции градиента выделяли поли(А)+РНК и затем изучали распределение В2РНК вдоль градиента "блот"-гибридизацией с В2-зондом.

Оказалось, что лишь относительно небольшая часть молекул В2РНК седиментирует в свободном состоянии (медленнее 10а), большая же часть обнаруживается в зоне седиментации, характерной для мРНК (10- 22а). Это позволяет предполагать, что после переваривания белков В2РНК остается связанной с молекулами иРНК. Как следует из ряда проведенных нами опытов, в клетках карциномы Эрлиха очень мало молекул . способных в стандартных условиях гибридизоваться с последпзательно-етью В2. Таким образом, становится ясным, что В2РНК, скорей всего, ассоциированиа с высокомолекулярной РНК не за счет длинных, а за счет коротких комплементарных участков.

Известно, что многие низ поколекулярные РНК ассоциированы с молекулами м.РНК или про-мРНК. Например, часть молекул РНК длиной 393 н., выделяемой из плеток сердца эмбрионов курицы, ассоциирована с мРНК тяжелых цепей-.миозина ( Khandekar et al., 1984). Вероятно, это существенно для регуляции трансляции этой мРНК. 4,5а.РНК клеток грызунов находят ассоциированной с высокомолекулярными поли(А)+РНК ядра и цитоплазмы (Jelinek, Leinwand, 1978). Обсуждается участие 4,5®РНК в транспорте молекул мРНК из ядра в цитоплазму ( Leinwand et al. 1982). По аналогии с подобными примерами можно предположить, что В2РНК участвует в регуляции трансляции или транспорта каких-то определенных видов мРНК.

9. Тканевая специфичность содержания Ь2РНК

Как было показано выше (см. таблицу 2), в клетках карциномы Эр-, лиха В2РНК выявляется в значительно большое количествах, чем в клетках печени. Возникает вопрос - отличаются ли по содержанию В2РНК различные другие нормальные и опухолевые клетки. Была проведена "блот"-гибридизация В2-зонда с поли(А)+РНК цитоплазмы клеток различных органов и перевиваемых опухолей мышей. Высокое содержание В2РНК наблюдалось в шеста из восьми видов опухолей (карциномы Зрли-ха и Льюиса, плазмоцитома ;.!СРС21, лимфома 4210, карцинома сои- 5 и гепатома 22). В карциноме Са755 В2РНК выявлялась в умеренном коли-

чествё. В клетках адено-карциномы толстого^ кишечника при ис'пользо-вавшейся экспозиции она не детектировалась вовсе. В умеренных количествах В2РНК выявлялась в клетках трех органов: мозг, почки и семенники. При использовавшейся экспозиции В2РНК не обнаруживалась в клетках селезенки, легких, сердца и печени. Таким образом, клетки разных видов могут сильно отличаться по содержанию В2РНК. (По нашим оценкам содержание этой РНК в клетках карциномы Эрлиха в 10-20. раз выше, чем в клетках печени). Полученные результаты свидетельствуют, э пользу того, что в .целом опухолевые клеит содержат больше В2РНК, чем нормальные ткани. Наиболее убедительно это следует из данных по сопоставлению содержания В2РНК в клетках опухоли и в их нормальных предшественниках. Так было показано, что в клетках гепатомы эта РНК содержится в значительно больших количествах, чем в клетках печени. Высокое содержание В2РНК в опухолевых клетках по сравнению с нормальными, видимо, не является следствием интенсивной пролиферации первых по сравнению со вторыми. 8то следует из того, что, как нами было показано, в клетках регенерирующей после частичной гепатэктомии печени.содержание В2РНК не превышает такового в клетках нативной печени.

По-видимому, существует какой-то особый механизм, активирующий образование В2РНК после опухолевой трансформации. Включение этого механизма, возможно, оказывается недостаточным для обеспечения интенсивной экспрессии В2РНК, если в исходных клетках, подвергшихся трансформации, синтез этой РНК был глубоко репрессирован неким иным механизмом. Таким способом можно попытаться объяснить, почему в некоторых опухолях В2РНК все не присутствует лишь в небольших количествах.

Полученные данные свидетельствуют о существенных различиях в содержание В2РНК в органах мышей. Видимо, существует какая-то регуля-торная система, обеспечивающая различие в содержание В2РНК в нормальных тканях. Скорей всего регуляция происходит на уровне транскрипции. Полученные результаты указывают на возможную ткане-специ-фичноеть функции В2РНК.

10. Сравнительный анализ повторяющихся.последовательностей В1 и В2 в геномах организмов разных видов

Для изучения вопроса о том, ДНК каких групп организмов содержит-повторяющиеся последовательности,гомологичные В1- и В2-элементам

генома мыши, был использован метод "дот"-гибридизации. Одинаковые ко-кличества ДНК, выделенных из различных объектов, наносили в виде пятен на нитроцеллюлезный фильтр и проводили гибридизацию с BI- или В2-30НД0М. Чтобы детектировать и низкогомологичние последовательности, гибридизацию проводили в "мягких" условиях - при 55°. С целью хотя бы качественно оценить гомологию гибридизующихся ДНК, фильтр после отмывки при 55° и радиоавтографии,отмывали при 65° и снова радио-автографировали.

При низкотемпературной отмывке фильтров (55°) в той или иной степени гибридизация наблюдалась со всеми использовавшимися эукариотичес-киыи ДНК (вплоть до дрожжей; всего 27 видов). Это указывает на существование в ДНК большинства эукариот участков, обладающих некоторой гомологией с мышиными элементами BI и В2. Однако, при более жестких условиях отмывки фильтров (65°) гибридизация наблюдалась лишь с ДНК представителей подотряда мышеобразных грызунов (домовая мышь, лесна^ мышь-аподемус, крыса, полевка обыкновенная, хомячки золотистый, серый, крысовидный, хомяк обыкновенный, слепушонка восточная). Таким образом, у представителей двух других подотрядов грызунов (морская свинка, суслик), также как и у представителей других отрядов млекопитающих (зайцеобразные, рукокрылые, хищные, парнокопытные, насекомоядные, китообразные, ластоногие), в ДНК отсутствуют повторяющиеся последовательности высокогомологичныз BI- и В2-злементам генома мыши. Из этого правила имеется одно исключение: ДНК приматов (человек, зеленая мартышка) весьма эффективно связывала BI-зонд даже после жесткой отмывки.

Накопившиеся к настоящему времени данные по клонированию повторяющихся -•последовательностей ДНК различных эукариот согласуются о полу-.ченнымя нами результатами гибридизации. Так, последовательности BI и В2 были выявлены клонированием в ДНК китайского хомячка (Наупев, Jelinek, 1981) И крысы (Page et al., I98I5 Alonso et al., 1983). В то же время короткие повторы полученные клонированием из ДНК других млекопитающих (например, кролик, бык, коза) не имеют протяженных топологий с BI- и В2-элакентами мыши, хотя обладают сходным с ними пяаном строения. Исключение составляет А1и-эле),:ент ДНК приматов ( Deiniger et al.,1981). В геноме человека он представлен 3-5x10^ копий. Его длина - 300 n.H.Alu -элемент содержит протяженные участки, обладающие 90$-ной гомологией с BI-злементом. Несколь-

ко упрощая картину, можно сказать, что он представляет собой дилер BI-элемента. Очевидно, что в наших опытах гибридизация BI-зонда с ДНК человека и мартышки обусловлена присутствием в них копий Alu-элемента. Таким образом, подлинные гомологи BI- и В2-элементов генома домовой мыши имеются лишь в ДНК мышеобразных грызунов; кроме того гомолог BI-элемента характерен для ДНК приматов. Продемонстрированное нами отсутствие BI-элемента у представителей других подотрядов грызунов и .отрядов млекопитающих указывает на то, что возникновение BI- и Alu -элементов - два независимых эволюционных события. Целью следующего эксперимента было выяснение степени сходства BI- и В2-элементов у разных видов грызунов. BI- и В2-зонды (меченные по концу соответствующие реотриктные фрагменты клонов Мм31 и Мм61) гиб-ридизовали при 55°с иммобилизованной на фильтре ДНК того или иного . грызуна. После отмывки фильтра при 55° определяли температуру плавления (Тпл) гибрида путем ступенчатого поднятия температуры и измерения высвобождающейся в раствор (2x3.sc ) радиоактивности. (Эти данные приведены в таблице 3.) Вычитая из Тпл гибрида зонда с геномной ДНК домовой мыши Тдл гибрида зонда с ДНК данного грызуна, определяли величину л Тпл. Известно, что снижение Тпд на 1° обусловлено ошибками спаривания приблизительно I% пар нуклеотидов. Используя это соотношение, определяли,каким процентом нуклео!гидов BI- и В2-элементы данного грызуна отличаются от соответствующих элементов домовой мыши. Эти величины также представлены в таблице 3, Как можно видеть, у более таксономически удаленных от домовой мыши видов В2--элемент менее схож с мышиным В2-элементом, чем у более близких к ней видов. Иная, несколько неожиданная,картина наблюдается в случае BI-элемента. По результатам данного гибридизационного теста В1-зле-менты весьма далеких от домовой мыши видов грызунов (полевка, хомяки) очень схожи с BI-элементом домовой мыши. В то же время В1-эле-мент крысы (она входит с мышью в одно семейство) отличается от BI--элемента мыши 8,5/5-ми п.н. Таким образом, имеются примеры явного несоответствия между таксономической близостью грызунов и степенью сходства их BI-элементов. Другими словами, к этой последовательности ДНК не применима гипотеза "молекулярных часов". Возможно, что в эволюции BI-элемента заметную роль играет генная конверсия. Можно предположить, что в ходе эволюции крысы большинство копий BI-элемента конвергировало к некой иной копии (версии) элемента, нежели в случае мыши, полевки или хомяков. В следствие этого, в среднем, копии BI-элемента крысы оказались менее сходными с мышиными,

Таблица 3. Температура плавления (Тпл) гибридов геномных ДНК грызунов с клонированными

последовательностями В1 и В2

Источник ДНК BI B2

Классификация тпл' °c ! ¿Тпл ' 'или. з.в.,% V.°C дТпл ' или з.н.,%

Подотряд мышеобразные Семейство мышиные Мышь домовая (Mus muscuius) Мышь лесная (Apodemut ¿llvaticu?) Крыса (ka.ttu$ norvégiens) 81,5 79,0 73,0 2,5 S,5 79,5 78,0 77,0 1,5 2,5

Семейство хомя-ковые Подсемейство полевки Полевка обыкновенная (Micratu? arva li?) Слепушонка восточная (Elkbiup taneze') 81,5 77,0 0 4,5 75,5 76,0 4,0 4,5

■ - Подсемейство настоящие хомяки Хомячок золотистый (HeSacricetus aura,tus) Хомячок серый (CriceteluSmigrât or'ш s') Хомяк., обыкновенный (Cricetus cricetug) 81,5 81,0 79,0 0 0,5 2>5 73,0 7,5

дТпл = Тпл гибрида с ДНК домовой мыши - Т^ гибрида с ДНК данного грызуна.

з.н. - замены нуклеотидов в последовательностях В1 и 32 данного грызуна по сравнению с последовательностями мыаи.(Другие объяснения в тексте).

чем копии того же элемента хомяков и полевки. О конверсии коротких псвторяюиихся последовательностей пока можно говорить только как о гипотезе. В то же время полученные результаты могут быть объяснены именно с помощью этой гипотезы, "ледовательно эти данные могут рассматриваться как свидетельство в пользу существования конверсии повторяющихся последовательностей ДНК типа В1-элемента.

II. Последовательности ДНК, гомологичные дсРНК-А II.I. Клонирование и идентификация

Последняя часть настоящей работы посвящена выяснению природы последовательностей ДНК мыши, гомологичных дсРНК-А. Исследование было начато с клонирования таких последовательностей. Был получен банк Hiad и _ фрагментов геномной ДНК мыши, клонированных в плазмиде PBR322. . Затеи проводилась гибридизация на колониях с дсРНК-А. Гибридизационный сигнал давало около 2% всех колоний. Для . дальнейшего анализа были взяты три клона (Мм21,22,25), которые, относились к клонам, наиболее аффективно связывающим дсРНК-А. Были составлены рестрикционные карты ДНК этих клонов (рис.9) и установлено, какие участки ДНК клонов гибрндиэуются с дсРНК-А (на рис, они под- -черкнуты пунктирными линиями). Оказалось, что эти участки имеют большую протяженность: от 4,2 тыс.п.н. в клоне Мм25 до 6,7 тыс.п.н. в клоне 21. ДНК клонов Мм21 и Им25 были способны к гибридизации друг-с другом, но не с ДНК Им22, Последоватольность ДНК клона Мм22, спо-s собнал к гибридизации с дсРНК-А, была обозначена как AI. Гибридизу-v. гсщуася с дсРНК последоватольность ДНК двух других клонов стали обозначать - А2.

Вскоре после получения описанных результатов появились сообщения -( Оло et al.,1980; Kuff et el.,1981) о клонировании последователь- . ностей ДНК, кодирующих инрацистернальные А-частицы (ЙАЧ). Эти ретро-? вирусо-подобнке частицы в больших количествах обнаруживаются в клетках опухолей и ранних эмбрионов мышей. Сравнение карт такого ИАЧ--элеиента генома мыши и последовательности AI (рис.9) обнаружило их большое сходство. Это позволило предположить, что клонированная последовательность является копией ЙЛЧ-элемгнта. Хотя в нашем клоне отсутствовало по одному из сайтов Hind И и EeoR I, а также два сайта Psti, это не цогло быть существенным аргументом против сделанного предположения, поскольку уже было известно, что разные копии ИАЧ--элемента несколько отличаются друг от друга по наличию тех или иных сайтов рестрикции.

1,1 ,1 1 ,t, п

" t"!"Hi Mm22

ГГ1 "¿¡ши"*'

-AI

Mm25 U

ЛМт2

ЛМгг.а-

Lm.mLijTLJ-I

Рис,9, Карты AI- и A2-cодержащих клонов. Указаны размеры фрагментов в тыо.п.н. Гибридизу-ющиеся о доРНК-А фрагменты клонов Мм21,22,25.подчеркнуты пунктирной линией. Фрагменты, использовавшиеся как аонды в опытах по . f ,Т IIГ MiFi.BamHi»-«oj- перекрестной гибридизации А2-со-держаодх клонов, отмечены фигурными скобками. Гибридизующиеся фрагменты показаны в виде одина- • ково заштрихованных прямоуголь-I_I мт4з ников. Карта ИАЧ-элемента составлена комбинированием карт, приведенных в работах Оно и др. (1980) и Каффа и др.(1981). Длинные концевые повторы показаны на карте ИАЧ-элемента, как черные прямоугольники. ;

Карта mifi ( Baa HI)-повтора дана согласно Брауну и Довер (1981) и Миньер-Ротиваль и др.(1982).в-ватн1, Bg-BgLll, E-EooRi, H-Hindill, P-PstI, I-XbaX.

Предположение об идентичности последовательности AI и ИАЧ-элемента было подтверждено в ряде опытов. Во-первых, число копий в генома последовательности AI оказалось равным 1000, что хорошо соответствует числу копий в геноме мыши ИАЧ-алемента. Во-вторых, набор полос, выявляемых при "блот"-гибридиэации геномной ДНК мыши с мечеными фрагментами последовательности AI, был идентичен набору полос, который характерен для ИАЧ-элемента. В - третьих,РНК,выдели-. емая из ИАЧ, гибридизовалась с последовательность!) AI. Таким образом, несомненно, что клонированная нами последовательность ДНК, гомологичная дсРНК-А, является копией ИАЧ-элемента.

Известно, что при обработке геномной ДНК мыши рестриктазой ecori на электрофореграммах помимо, гетерогенного по размеру материала, наблюдается дискретная полоса, соответствующая размеру -1,35 тыс.п.н. При обработке ДНК мыши рестриктазой BamHI на фоне гетерогенного материала обнаруживается полоса, соответствующая размеру - 4,3 тыс.п.н. При изучении последовательности А2 "блот"-гиб-ридизацией оказалось, что именно с материалом этих полос связывают-

ся EcoRi/jiiud I- фрагменты длиной 0,62 тыс.п.н. (клон Мм21) и 0,72 тыс.п.н. (клон Мм25). В тот период, когда были получены эти результаты, появились сообщения (Brown, Dover, 1981; Meimier -Hotival et a!,,1982) о картировании фрагментов, образующих видимые на электрофореграммах полосы при обработке ДНК мыши EcoBl и BamHl. Авторы работ пришли к выводу, что эти фрагменты предотавля-ют собой части какого-то длинного повторяющегося элемента, 10-20.. тыс. копий которого рассеяны по всему геному мыши. Этот повторяющийся элемент был обозначен как mifi или ВааЩ-повтор. Оказалось, что ecohi -фрагмент длиной 1,35 тыс.п.н. является частью BamHl -фрагмента длиной 4,3 тыс.п.н. (рис.9). Сопоставление карты hefi--повтора с картами клонов Мы25 и Мм21 выявило их идентичность. (При этом два клона-содержали взаимнодополняющие части mifi -повтора). Таким образом, стало.ясно, что последовательность А2 представляет собой mifi -повтор.

Так как границы и размеры всего повторяющегося элемента еще не были известны, мы попытались их установить. Для большей надежности данных были клонированы дополнительные копии последовательности А2. Клоны отбирали путем гибридизации с фрагментами ДНК ранее клонированных копий, как из плазмидного банка, так и банка, полученного на основе фага Ä ,

С помощью перекрестной гибридизации рестрикционных фрагментов было проанализировано в сумме 5 клонов. Оказалось, что один из.них . (^Мм8) характеризуется протяженными внутренними делециями, структуру другого (Мм21) можно объяснить, если предположить, что был проклонирован участок, в котором стыковались две тандемные копии повторяющегося элемента (рио.9). Зато три других клона (Мм25, Мм43 и АЫм2) хорошо соответствовали друг другу по структуре и были пригодны для установления границ и размера повторяющейся.последовательности А2. Этот вопрос решался более подробным картированием соответствующих районов клонов Мм25 и 43 с использованием растрикссазы Hiafl и блох-гибридизацией с тотальной ДНК мыши. Это. позволило с определенной точностью установить,где начинается повторяющаяся последовательность. Границы последовательности А2 от-.. мечены.на рио.9 (на карте клона АИм2). Размер повторяющегося элемента оказался равным 6,2 тыс.п.н. Кроме того, гибридизационные ■опыты продемонстрировали.отсутствие гомологии между двумя концами последовательности А2, то есть этот элемент генома мыши лишен . длинных концевых повторов. Это говорит о том, что он имеет сущест-

венно другую структурную организацию, чем ИАЧ-элеыент или мобильные диспергированные гены дрозофилы. Сходные выводы относительно структуры этого повторяющегося элемента были сделаны и другими авторами (Panning, 1983). В самое последнее время был достигнут большой прогресс в изучении его структуры (Loeb et al.,I986). 8а ним закрепилось название М-элемент.

II.2. Изучение транскриптов ИАЧ/А1- и Е1/А2-элементов

Обнаруженная в настоящей работе гомология ИАЧ- и £1-елеиентов с молекулами дсРНК-А служит свидетельством того, что обе цепи ДНК этих длинных повторяющихся, элементов генома мыши подвергаются транскрипции. Чтобы подтвердить существование в клетках цепей РНК, гомологичных каждой' йз цепей ДНК ИАЧ- и Ы-элементов, был проведен опыт по гибридизации РНК с разделенными цепями ДНК. Цепи фрагментов ДНК клонированных ИАЧ- иEI-элементов разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили на фильтр и гибридизовали о меченой денатурированной дсРНК-А или ядерной поли(А)+РНК клеток карциномы Эрлиха. Радиоавтография показала, что две цепи ДНК каждого из элементов, как и ожидалось, одинаково связывали метку.в случае дсРНК. Поли(А)+РНК таете гибридизовалась.с обеими цепями ДНК EI -элемента, но с одной из цепей связывалось'в 2 раза больше РНК, чем-с другой. Этот результат наглядно демонстрирует, что в клетках про* исходит,транскрипция обеих цепей L I-элембнта, хотя и наблюдается некоторая асимметричность такой транскрипции. К сожалению, в случае ЙАЧ-элемента нам удалось детектировать гибридизацию поли(А)+ РНК лишь с одной из цепей ДНК. Так как гибридизации дсРНК-А ясно продемонстрировала существование РНК, гомологичной второй цепи ДНК, то следует думать, что в клетках транскрибируются обе цепи -ДНК ИАЧ-элемента, но транскрипция одной из" цепей происходит значительно интенсивней, чем другой (по крайней мере в 10 раз).

Таким образом, .дсРНК-А сильно обогащена по сравнению с полч(А)'+ РНК минорной цепью. Вероятней всего, доРНК-А образуется из комплементарных транскриптов в процессе экстракции ядерной РНК. При этом, возможно, весь минорный транйкршй отжигается с мажорным, тогда-как последний остается по преимуществу одиоцепочечным. и при выделении дсРНК полностью разрушается. В результате дсРНК-А оказывается обогащенной минорной цепью.

В случае ИАЧ-элеыента транскрипция второй цепи, видимо, объяс-I няетоя недавно открытой способностью длинных.концевых повторов -этого элемента инициировать транскрипцию в направлении.противоположном транскрипции основной РНК (Ного*1Лг е*. в1., 1984). Механизц симметричной транскрипции Ч-элемента неясен, но можно предположить, что в этом случае играет определенную роль пассивная транс-. крипция в составе других транскрибционных единиц по разному ориентированных копий этого элемента.

Последний из описываемых опытов направлен на изучение размеров транскриптов ИАЧ- и Ы-элементов. Поли(А)+РНК клеток карциномы Эр-лиха и плазмоцитомы М0РС21 подвергали электрофорезу в агарозном геле , переносили ее на фильтр и проводили гибридизацию с пятью различными мечеными фрагментами ИАЧ-элемента (фрагменты получали обработкой ДНК клона Мм22 рестриказами ЕсоШ и Вапнх), радиоавтография выявила ряд полоо. Некоторые полосы наблюдалиоь при гибридизации лишь с некоторыми фрагментами. Это свидетельствовало о том,-что тренскрипты отличаются друг от друга наличием или отсутствием я них некоторых участков ИАЧ-элемвнта. В клетках карциномы Эрлиха было обнаружено три транскрипта, размеры которых были оценены как 6,0} 6,8 и 9,5 тыс.н. Более сложный набор ИАЧ-специфических РНК выявлен в клетках.плазмоцитомы," их размеры были таковы: 3,0; 5,3} 6,8$ 7,8} 9,5 тыо.н. Таким образом, в разных клетках могут образовываться разные виды транскриптов ИАЧ-элемента. Наиболее вероятным кажется, что существование разных транскриптов ИАЧ-элемента обусловлено наличием в геноме мыши различных вариан- . тов этого элемента. К настоящему времени описано 5 основных вариантов ИАЧ-элемента (тойоте, ю.вгг„ 1986). 75% всех копий приходит- . оя на копии типа I, имеющие длину 7,2 гыо.п.н.(судя по всему, именно втот вариант был клонирован нами). Около и% составляют копии типа I, характеризующиеся делецией длиной 1,9 тыс.п.н., которая локализуется внутри Ввпшх -фрагмента (2,2 тыс.п.н.). Остальное прихо-дитоя на три варианта (А,В и С) копий типа П, которым свойственны как еще более протяженные делеции 5 том ке районе, так и вставка небольшой специфической последовательности. Неожиданно оказалось, что большинство выявленных нами транскриптов не удается соотнести с этими вариантами ИАЧ-элемента - не совпадал либо размер, либо . . набор образующих их последовательностей, либо то и другое вместе.

Исключение составляет транскрипт длинной 3,0 тыс.н., который мог бы образоваться яа копиях ИАЧ-элемента типа ПС (это наименее часто представленный из известных вариантов ИАЧ-элемента). Интересно, что транскрипт, размер которого был оценен нами приблизительно в 9,5 тыс.н., существенно превосходит по длине наиболее длинный из известных вариантов ИАЧ-элемента. Можно предположить, что большинство транснриптов ИАЧ-элемента, выявляемых в клетках карциномы а плазмацитомы,- транскрибируются с каких-то минорных еще не идентифицированных вариантов ИАЧ-элзкента.

Аналогичный анализ транскриптов Ы-элемента был проведен о использованием поли(А)+РНК из ядер и цитоплазмы клеток плазмоцитомы M0PC2I и печени мышей. В качестве гнбридизанионного зонда использовался BamHi/EcoRi - фрагмент длиной 2,6 тыс.п.н, клона Мм25. Оказалось, что M -специфические транскрипты очень гетерогенны по размеру (непрерывный спектр от 1,5 до более, чем 20 тыс.н.) и локализованы только в ядре (это справедливо для обоих видов изучав- , шихся клеток). Чем не объясняется высокая гетерогенность транскриптов 11 -элемента по длине? Очевидно, это связано с большой ва-риабилыгостью копий самого Ы-элеиента. Согласно данным ряда авторов (Panning, I983iVoliva et al., 1934), a также нашим собственным данным (не приведены), имеется заметная вариабильность копий 11 -элемента в отношении присутствия отдельных сайтов рестрикции, а главное в отношении размеров самих копий. По-видимому, значительно чаще копий Ы -элемента, несущих дзлеции во внутренних районах (например, клон Мм'8, рис.9), встречаются копии, представленные лишь правой (согласно рис.9) частью элемента. Такие лишенные промотора копии (он, как полагают, расположен на левом конце элемента) обнаруживаются в геноме мыши в значительно большем числе, чем полноразмерные копии 1,1 -элег,акта. Скорей всего, такие укороченные копии Н| способны к самостоятельной транскрипции. Однако они могли бы транскрибироваться в составе колекул про-мРНК, будучи локализованными в интронах. Такая транскрипция может хорошо объяснить существование очзнь длинных (более 7 тыс.н.) 11-специфичес-ких транскриптов. Короткие РНК (менее б тыс.н.) могли бы образовываться или путей процессннга или при транскрипции коротких копий, которые не лисены собственного промотора. Скорей всего, только РНК размером 6-7 тыс.н. можно интерпретировать как продукты самостоятельной транскрипции полноразнерных копий 11 -элемента.

... . 42 12. О природа повторяющихся элементов ДНК

Как указывалось выше, до конца 70-х годов доминировали гипотезы, согласно которым рассеянные "по геному повторы представляют собой регуляторные элементы, контролирующие транскрипцию или про-цессинг про-мРНК. В 1980 г. была выдвинута гипотеза об "эгоистической" природе многих последовательностей ДНК эукариот, в первую очередь повторяющихся ( Doolittle, Sapienzat Orgel, Crick )»Еыло предположено, что такие последовательности ДНК не имеют никакого . значения в физиологии клеток и организма в целом, не имеют фенотип пического проявления. Их отношение к клетке можно даже охарактеризовать как паразитическое. Некоторые из результатов настоящей работы следует рассматривать как указания в-пользу этой гипотезы. Так, отдельные структурные черты BI- и В2-элементов сближают их с определенной категорией псевдогенов. Например, некоторые псевдогены малых ядерных РНК UI.D2, из несут на своем конце олиго(А)--участок, а сами псевдогены фланкированы короткими прямыми повторами (van Aredell et al., 1981). To ке относится к неинронирован-йым псевдогенам тех генов, которые кодируют белки, например, с<--Глобин (Nishioka et al., 1980). Все исследователи сходятся во Мнении, что псевдогены не имеют фенотипического' проявления. Таким Ьбразом, сходство некоторых черт структуры повторяющихся элементов и псевдогенов указывает на "эгоистическую" природу этих элементов.

Как свидетельство :>? пользу такой точки зрения можно рассматривать и определенную вариабильность структуры копий повторяющихся элементов. Далее, как следует из данних настоящей работы, BI- и В2-элементы отсутствуют в геномах большинства млекопитающих: как таковые они имеются только у представителей подотряда мышеобразных грызунов. То же относится к ALu -элементу, свойственному лишь ДНК Приматов. ЙАЧ-элемент также имеет узкий круг распространения ( Ьи-б4егв, Ruft, 1981). Все это может служить аргументом против наливши у этих повторяющих элементов физиологических функций. Гипотеза "эгоистической" ДНК, отвергая наличие таких функций у повторяющихся элементов, допускает, что они играют важную роль как эндогенные факторы мутагенеза. Такая точка зрения основывается на '¡^гочисленных данных о способности мобильных элементов дрозофилы рдздеать мутации при интеграции внутрь генов или рядом с ними.

Как показано в настоящей работе, копии BI- и В2-злементов фланки-г рованы короткими прямыми повторами. То же самое продемонстрировано другими авторами для ИАЧ- и Ы-элементов. Это послужило свидетельством того, что данные повторяющиеся последовательности генома мыши являются мобильными элементами. Такая точка зрения нашла подтверждения. Было показано, что копия элемента, присутствующая в данном месте генома одной линии мышей может отсутствовать в другой линии (Kominami et al.,1983! King at al., 1986 ). Таким образом, будучи мобильными, повторяющиеся элементы мыши, видимо, тоже способны вызывать мутации при интеграции в гены или рядом с ними..

Хотя все рассматриваемые в настоящей работе повторяющиеся элементы являются мобильными, лишь один из них (ИАЧ-злемент) по структуре сходен с мобильными диспергированными генами дрозофилы (последние образуют класс мобильных элементов, обозначаемый как ретро-транспозони). Три других элемента не содержат длинных концевых повторов. По нашим данным BI- и В2-злементы несут на своем конце . А-богатый участок. Тоже показано для П-элемента ( Voliva et al.,

1984). На этом основании, несмотря на существенные различия между короткими и длинными элементами, для BI-, В2- и Ы-элементов. предполагают общий механизм возникновения и интеграции в геном новых копий. Эти и им подобные элементы стали обозначать ретропозо-нами .( Hogera, 1985). Полагают ( Jagadeeswaran et al., 1981 jHogers, -

1985), что полиаденилированные транскрипты таких повторяющихся элементов с некоторой вероятностью подвергаются в клетке обратной транскрипции (причем реакция начинается на поли(А)-сегмента), образовавшиеся кДНК оказываются всгроеными в места случайных (обычно со сдвигом) разрывов хромосомной ДНК. При заполнении бреший в цепях ДНК образуются новые интегрированные копии элементов, фланкированные прямыми короткими повторами.

Каково происхождение мобильных повторяющихся элементов генома мыши? Как било показано выше, BI-элемент - обладает значительной гомологией с 7 sLPHK. Это же справедливо для Alu-элеыента ДНК приматов. Было предположено (tlilu, Tachudi, 1984), что BI- и Alu-элементы возникли путем обратной транскрипции молекул 7 aLPHK, лишенных внутреннего 189-нуклеотидного участка в результате действия каких-то эндонуклеаз и РНК-лигаз. Недавно было замечено ( Sakamoto,Okad*, 1985), что 60-нуклеотидный учасюк на переднем конца В2-элемента

обладает 70$-гомологией с тРНК™ ? Предполагается, что В2-элемент возник путем рекомбинации гена этой тРНК с какими-то последова- . тельностями ДНК,в результате чего возник элемент, быстро распространившийся по геному путем ретропозиции. ИАЧ-элемент, вероятней всего, по своему происхождению - эндогенный ретровлрус, совершенно потерявший способность к заражению клеток. В силу каких-то структурных особенностей этот провирус чрезвычайно широко распространился по геному мыши и стал его неотъемлемой частью. Ъ 1-эле-мент, несмотря па существенное несходство с ИАЧ-элементом, также возможно, произошел от ретровирусов. Дело в том, что секвенирова -ние ^-элемента выявило в нем две открытые рамки считывания, одна из которых, судя по предсказываемой аминокислотной последователь-., ности, может кодировать обратную транскриптазу ( Loeb et ai., 1986). Но, очевидно, что в этом случае геном ретровируса мог быть только очень далеким предком повторяющегося элемента.

Хотя рассматриваемые повторяющиеся последовательности ДНК несомненно являются мобильными элементами и в отношении их гипотеза "эгоистической" ДНК выглядит довольно убедительно, не следует игнорировать данные, указывающие (правда, весьма косвенно) на возможности существования у них физиологических функций. Среди таких данных можно назвать следующие. Как указывалось в главе'2, В2-элемент обладает 14-нуклеотидной гомологией с областью начала репликации . вирусов SV 40 и ВК. Это же справедливо для Alu-элемента человека. Недавно было продемонстрировано, что плазмида, несущая, Alu -элемент, способна автономно реплицироваться, будучи введенной в клетки зеленой мартышки (Johnson, Jelinek, 1986). Таким образом, возможно, что копии а1хь- и BI-элементов выполняют в клетках роль точек начала репликации. Как обсуждалось в главе 3, в некоторых -(видимо, очень немногочисленных) видах мРНК в качестве сигнала по-лиаденилирования используется соответствующий участок последовательности В2. Таким образом, В2-элемент может служить для генов как бы носителем потенциальных сигналов полиаденилирования. Кроме того, как показано в настоящей работе, часть молекул В2РНК (транскриптов этого элемента), видимо, присутствует в информосо-мах и ассоциирована с мРНК. Это наводит на мысль о роли В2РНК в транспорте или контроле трансляции некоторых видов мРНК. Наконец, как было недавно обнаружено, ген, кодирующий белок клеточной поверхности, который называют фактором связывания иммуноглобулина Е,.

обладает очень протяженными и высокими гомологиями с ИАЧ-элемен-том ( тоЬ et ах., 1985; хтег е* а!,, 1986). Предполагается, что этот ген образовался из ИАД-злемента. Не исключено, что его вообще можно считать одним из редких вариантов ИАЧ-элемента. , Таким образом, вопрос о том, обладают ли повторяющиеся элементы ДНК физиологическими функциями или это - чисто "эгоистическая" ДНК нельзя считать решенным. На наш взгляд весьма вероятной представляется компромиссная гипотеза: лишь некоторые, возможно, немногочисленные копии повторяющихся элементов выполняют физиологические функции, в то время как остальные нефункциональны из-за имеющихся в их структуре дефектов, и поэтому являются "эгоистической" ДНК.

ВЫВОДЫ'

1. Клонированы последовательности ДНК мыши, гомологичные шпилечным умеренно длинным двуспиральньш участкам гетерогенной ядерной РНК (дсРНК-В). Показано, что существует два вида таких последовательностей BI и В2. По 100000 копий каждой из них рассеяно по геному мыши. Видимо, лишь небольшая часть всех копий этих коротких повторяющихся элементов образует в геноме пары близко расположенных и противоположно ориентированных последовательностей. При транскрипции именно таких копий BI- и В2-эленентов, очевидно, образуются шпилечные структуры, соответствующие дсРНК-В.

2. Определена нуклеотидная последовательность нескольких ко-

BI- и В2-элементов. Это позволило заключить:

1). копии одного элемента отличаются друг от друга заменами 4-10 процентов нуклеотидных пар;

2). на конце как BI-, так и В2-элемента имеется А-богатый район; в случае BI-элемеита он очень вариабилен по длине, его структура отвечает формуле iСj_gA2_g)5_i2' сгРУктУРа та~ кого района в В2-эламекте более консервативна

ТСТ3-5А8-15''

3) протяженность консервативной части BI-элемента - 130 п.н.; средняя длина В2-элемента - 190 п.н.;

4) копии обоих элементов фланкированы прямыми повторами длиной Пт16п.н., что~указивает на их принадлежность к мобильным генетическим элемента:.:;

5) в BI-элементе имеются два участка, обладающих высокой го-

гомологией o последовательностью из области начала репликации ДНК вирусов группы папова; (выдвинуто предположение о способности копий BI-элемента функционировать в качестве ..начал репликации геномной ДНК){

6) в обоих элементах на определенном расстоянии от начала имеются два участка, сходных по структуре с двумя блоками про-

..мотора РНК-полимеразы Ш}

7) протяженные участки BI-элеыеита обладают высокой гомологией с 7 si и 4,5spHK{ то же относится к В2-элементу и 4,5а-РНК1; сделано предположение об общности происхождения этих элементов ДНК мыши и генов, кодирующих данные низко. молекулярные РНК.

3. Показано, что BI- и В2- последовательности богато представлены в тяжелой ядерной РНК. Зачетно меньше их в молекулах мРНК, выделенных из цитоплазмы. Это объясняется тем, что в составе генов BI- и В2~элементы чаще.встречаются в интронах и реже - в З'-негранслируемых районах.

4. Обнаружено, что BI- и В2-последовательности присутствуют -не только в составе молекул мРНК и, про-мРНК, но и в низкомолекулярных поли(А)-содержащих РНК, обозначенных как BI и В2РНК. Они гетерогенны по размеру: от 200 до 400 нуклеотидбв. Обе РНК преимущественно локализуются в цитоплазме. Содержание в клетках В2РНК-значителько выше, чем BIPHK. Клетки разных органов заметно отличаются по содержанию В2РНК. Обычно клетки опухолей характеризуются значительно более высоким содержанием В2РНК, чем клетки нормальных тканей.

5. В2РНК входит в состав рибонуклеопротеидных частиц: большая часть молекул находится в легких частицах (Ю-20в ), меньшая - в более тяжелых частицах, видимо, информосомах. В последних В2РНК. ассоциирована с молекулами мРНК, вероятно, за счет коротких комплементарных участков. Предполагается возможное участие В2РНК в регуляции транспорта пли трансляции некоторых видов мРНК.

6. Показано, что В2РНК образуется при транскрипции многочис-^ ленных копий В2-элемента РНК-полимеразой Ш и последующем полиаде-нилировании 3 -концов молекул РНК.

Кроме того обнаружено, что в клетках карциномы Эрлиха РНК-полимв-раза I синтезирует высокомолекулярные поли(А)-содержащив РНК.

По крайней мера, некоторые из них, видимо, начинают транскрибироваться на копиях В2-элемента, причем таких, которые лишены нормального терминатора транскрипции - ГС(Т)з_д. Показано, что на з'-концах молекул поли(А)-содержащих РНК, транскрибирующихся РНК--полимеразой Ш (в том числе и В2РНК), присутствуют как свободные трифосфатные группы (ррро и рррА), так и блокированные -хррр® (х-неидентифицированная структура).

7. Повторяющиеся последовательности, гомологичные BI- и В2- ' элементам генома мыши, обнаруживаются в ДНК представителей под- . отряда мышеобразных грызунов, но не выявляются в ДНК других гры- . зунов и представителей различных отрядов млекопитающих. Исключение составляют приматы, в ДНК которых имеется гомолог BI-элемента - повторяющаяся последовательность Alu. Полученные данные указывают на то, что возникновение последовательностей BI и Alur-два независимых эволюционных события.

Использование метода измерения температур плавления гибридов дозволило заключить, что степень сходства BI-злементов (но не В2) разных грызунов.далеко не всегда коррелирует с таксономической близостью видов. Возможно, это связано с явлением конверсии последовательностей ДНК.

8. Клонированы две последовательности ДНК мыши, гомологичные особо длинным двуспиральным участкам гетерогенной ядерной РНК (дсРНК-А). Эти последовательности, обозначенные как AI и А2, представляют собой длинные (около 7 тыс. пар нуклеотидов) рассеяные

по геному умеренно повторяющиеся элементы. АХ-последоьательность идентична элементу генома мыши, кодирующему интрацистернальные А-частицы (ИАЧ). А2-последовательность соответствует главному длинному повтору ДНК мыши -ь1-злементу.

Показано, что в клетках происходит транскрипция обеих цепей ДНК обоих элементов. Однако, одна из цепей транскрибируется интенсив-.. ней другой; асимметрия транскрипции сильнее выражена в случае ИАЧ--элемента. Транскрипты EI-элемента выявляются только в клеточном ядре. Оба элемента характеризуются сложным набором транскриптов, сильно различающихся по размеру. Описаны ткане -специфические варианты транскриптов ЙАЧ-элемента,

9. Все четыре клонированные повторяющиеся последовательности генома мши (А1,А2,В1,В2) относятся к мобильным генетическим элементам, копии которых появляются в новых местах генома, видимо, благодаря обратной транскрипции соответствую®« т ВНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крамзров Д.А., Григорян A.A., Рысков А.П., Георгиев Г.П. Клонирование в клетках Е„со11 фрагментов ДНК мыши, гомологичных двум основным видам длинных шпилечных участков про-мРНК, Молекулярная биология, 1980, т.14, №3, с.650-660. .

2. Крамеров Д.А., Краев A.C., Скрябин К.Г., Рысков А.П. Первичная структура высокоповторяющийся последовательности ДНК . мыши, гомологичной.двуспиральным участкам про-мРНК. Докл.АНСССР, 1980, т.252, №1, с.241-244.

3. Крамеров Д.А., Ломидзе Н.В, "Парадоксальная" эволюция индивидуальной транскрибирующейся повторяющейся последовательности ДНК (BI) генома мли. Докл. АНСССР, 1980 т.255, с.1005-1009.

4. Крамеров Д.А., Краев A.C., Скрябин К.Г., Рысков A.ni Изучение методом клонирования высокоповторяющихся последователь-* ностей ДНК мыши, гомологичных двуспиральным структурам про-мРНК. Тезисы докладов УП Всесоюзного симпозиума "Структура и функция клеточного ядра"..Харьков, 1980, с.В9.

5.Крамеров Д.А., Ломидзе Н.В. Эволюции повторяющейся последовательности BI у.грызунов. Там же., с.90..

6. Георгиев Г.П., Ильин Ю.В., Рысков А.П., Кр&меров Д.А. Мобильные диспергированные генетические элементы эукариот и их возможное отношение к канцерогенезу. Генетика 1981, т,17, №2, о. 222-231.

7. Крамеров Д.А., Леках И.В., Самарина О.П., Рысков А.П.

¡Ядерные и цитоплавматические ГНК, гибридизующиеся с повторяющимися последовательностями BI и В2 генома мыши. Молекулярная биология,.1983, 1й6, т.17, с.1162-1170. .

8. Ыаркушева Т.В., Крамеров Д.А., Краев A.C., Скрябин К.Г., Рысков А.П. Последовательность нуклеотидов повторяющегося элемента В2 генома мыши. Молекулярная биология, 1983, т.17, №6, с.1272-- 1279, . . ... ...

9. Иванов П.Л., Рысков А.П., Крамеров Д.А., Георгиев Г.П. Первичная структура повторяющегося элемента В2 и прилежащих последовательностей в клонированной мРНК, активно транскрибирующейся в.клетках печени мышей. Докл. АНСССР, 1983, т.269, №1, о.227--230.

10. Крамеров Д.А. Организация генома и единиц транскрипции у -высших ■ организмов. Итоги науки и техники, сер. Биологическая хи-

иия, М.БЙНИТИ, 1982, т.16, 4-56. , .

11. Георгиев Г.П., Ильин Ю.В., Крамеров Д.А. Подвижные элементы в.геномах зукариот. Успехи биологической химики. 1984, к.25,

з. 180-199.

12. Букринский М.Й., Крамеров Д.А. Повторяющиеся последовательности семейства А2 генома мыши: размер и особенности транскрипции. 5окл..АНСССР, 1984, т.278, tel, с.231-233.

13. Букринский М.И., Крамеров Д.А. Особенности транскрипции генов интрацистернаиьных А-частиц. Вопросы вирусологии 1984, :.29,.№3, с,345-349,

14,.Тиллиб C.B., Крамеров Д.А. Малая цитоплазматическая [оли(А)+РНК, гомологичная повторяющейся последовательности В2 ге^ юна мыши, входит в состав риоопуклеопротеидов. Молекулярная био-[огия.1984, т.18, Кй, с.1639-1650,

15. Леках И.В., Крамеров Д.А., Маркушева Т.В., Рысков А.П., еоргиев Г.П. Биосинтез малой цитоплазматической поли(А)+РНК, го-ологичной повторяющейся последовательности В2 генома мыши, осу-ествляется РНК-пояимеразой Ш. Докл. АЙСССР, 1984, т.277, №4,

. I006-1008,

16. Крамеров Д.А., Тиллиб C.B., Леках И.В.,Низкомолекулярная оли(А)+РНК, гомологичная последовательности В2 генома мыши, езиеы докладов УШ Всесоюзного симпозиума "Структура и функция неточного ядра", Пущино, 1984, с.215.

17. Григорян U.C., Крамеров Д.А., Тульчинский E.Ei., Ревазова Е.С уканидин Е.М, Повышенный уровень транскрипции генов интрацистер-1льных A-частиц и В2-элементов в опухолях мышей. Молекулярная юлогия, 1984, т.19, К? с.340-34?.

18. Ломидзе Н.В., Крамеров Д.А., Рысков А,П. Сравнительный-¡ализ BI- и В2-подобных повторяющихся последовательностей в ДНК шличных органиков. Молекулярная биология, 1986, т.20,-№3,

, 761-765, , .

19. Тиллиб C.B., Крамеров Д.А., Рысков А.П., Георгиев Г.П. :руктура малой полиаденилированной В2РНК. Молекулярная биология '86, т.20, !Й6, с.1593-1603.

20.. Kramerov D.Ä., Grigoryan A.A., Ryakov A.I>., Georgiev G.F. ng double-stranded sequences of nuclear pre-mRHA (daRHA-B) consist

a few highly abundent classes of sequences: evidence from OTA oning. Hucl.Acids Rea» 1979, v.6, p.697-713.

21» Krayev A.S., Kramerov D.A., Skryabin K»G., Ryakov A.P.r Bayev A.A., Georgiev G.P, The nucleotide sequence of the ubiquitous repetitive DHA sequence BI complementary to the most abundant clasa o£ mouse fold-back RHA. Huol. Voids, Res-. 1980, t8, p.I20I-I2I5.

22. Qeorgiev G'.P.., Ilyin X.V., Ryakov A.P., Kramerov D.A,. Mobile dispersed genetic elements and their possible relation to canserogenesis» Mol.Biol.Reports, 1980, v. 6, p. 249-254.

23. Georgiev G»P., Ilyin Y.V., Chmeliauskalte T.G., Ryskoy A.P., Kramerov? D.A., Skriabin K.G., KTayevr A.S., Lukanidin E.M., Grigo-ryan M.S. Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 1981, v.45, p. 641- 654.

24. Krayev A.S,, Mariruaheva> T • V»,. Kramerov 17.A., Ryskov A»F.r Skriabin K.G., Bayev A.A., Qeorgiev G'.P,. Ubiqitous transposem-lik« BI and B2 off the mouse genome: B2 sequencing. Bucl.Asids Res. 1982', v. 10, 7461-7475.

25. Kramerov D.A., Lekakh I.V., Samarina O.P., Ryakov A.P. The sequences homologous to major interspersed repeats BI and B2 of mouse genome are present in mRHA and small poly(A)+RHA. Huol,Acids Res» 1982 vIO, p. 7477-7491.

26. Kramerov D.A., Bukrinsky U.I., Ryskov A.P. On the structure and transcription of intracisternal A-partice genes and another pravirus-like repeat of the mouse genome. Abstracts of the I4th meeting of the European tumor virus, group, Varna, 1982, p. 17.

27. Georgiev G.P», Kramerov D.A., Ryskov A.P., Skriabin K.G'., Lukanidin E.M. Dispersed repetitive sequences in euckaryatio genomes and their possible biological significance. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1983, v. 46, p.II09-II2I.

28,. Ryskov A .P.» Ivanov P.I., Kramerov IT.A., Georgiev (E.P. Mouse ubiqutous B2 repeat iffl polysomal and cytoplasmic polyfAj^RHJIt unideractional orientatio» and J -end localization. Kucl.. Acids Rea. 1983, v, II, p. 654I-655T.

29. Kramerov D.A.» Tilliib S.V., Eekakh I.V. 3tnaoll cytoplasmic poly (A)+RHA homologous to the repeated saquencs B2 of the mouse genome. Abstracts «It I6th fSBS meeting. Uoskow» 1984» p. 260.

30. Kramarov DJt-t Tillib S.V., Lekakh I.V., Ryskov A.P., Georgiev O.P, Biosynthesis and cytoplasmic distribution of small poly(A)-containing B2RHA. Bioohim. Biophya.Acta. 1985, v. 924, p. 85-98»

31. Kram&rav D.A., Bukrinaky M,I., Hyakov A.P. DBA sequence homologous to long double-atranded RNA, Transcription of intaacister— nal A-partide genes and major long repeat of the mouse genome» Biochim. Biophya^Actai, 1985. v.. 826, p. 20-29.

32» Krameraw D.A., Tillib S.V., Byaiov A.P., Gaorgiev G.P.. Nucleotide sequence o£ amall polyadanylated B2 RNA. BU0l.Acid9.Rea. 1985* W 13, p. 6423-6437.

33. Qrigoryan H.3., Kramerov O.A., Tulchinaky EJI.* Revaacrva B.S. Lutanidin B.M. Activation off putative tranapositiott itttarmaddata formation: in tumor cellar EMBO J. 1985, v. 4, p. 2209-2215.

Информация о работе

Крамеров, Дмитрий Александрович
доктора биологических наук
Москва, 1987
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Основные повторяющиеся элементы генома мыши ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Основные повторяющиеся элементы генома мыши"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Основные повторяющиеся элементы генома мыши
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология