Неканонические комплексы РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами

Зенкин, Николай Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Неканонические комплексы РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Неканонические комплексы РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами"

На правах рукописи

Неканонические комплексы РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ БЕСПЛАТНЫЙ ЭКЗЕМПЛЯР

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Отдела молекулярной генетики клетки Института молекулярной генетики РАН (Москва), а также в Институте им. Ваксмана Университета Ратгерс (Waksman Institute, Rutgers University, USA).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

В.Г. Никифоров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

А. С. Миронов А. И. Калмыкова

Ведущая организация:

Научно-исследовательский Белозерского, МГУ

институт физико-химической биологии им. А.Н.

Защита состоится «_»_2004 г. в_на заседании диссертационного

совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ Генетика».

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

/ В.И. Щербакова

Актуальность темы. Инициация транскрипции является наиболее сложно регулируемым процессом транскрипционного цикла. Несмотря на опубликование кристаллической структуры холофермента РНК-полимсразы (Vassylyev et. al., 2002), инициация остается наименее изученным этапом транскрипции. Одними из наиболее важных вопросов, на которые не получено ответов, являются вопросы о функциях CJ-субъединицы и механизме перехода от инициации транскрипции к элонгации.

Известно, что необходима для узнавания и плавления промоторов,

также считается, что диссоциирует из комплекса с РНК-полимеразой

после синтеза РНК длиной 7-11 нуклеотидов. Однако в последнее время начали появляться данные о неизвестных прежде свойствах Например, было

показано, что при переходе от инициации к элонгации может не

диссоциировать, оставаясь связанной с элонгационным - комплексом (Bar-Nahum and Nudler, 2001, Mukhopadhyay et al., 2001). С другой стороны, из структурных данных видно, что может принимать непосредственное участие в абортивном

синтезе (Vassylyev et al., 2002). Эта информация свидетельствует о гораздо более сложной. роли, которую играет в инициации транскрипции и переходе к элонгации.

Кроме того, не до конца изучен механизм перехода от инициации к элонгации, однако понятно, что этот процесс зависит от разных факторов. Так, при переходе к элонгации в ходе синтеза РНК-праймера на геноме фага М13, РНК-полимераза по непонятным причинам останавливается, переходя в арестованное состояние. Было показано, что при переходе к элонгации на lacUV5 промоторе происходит образование паузы транскрипции с формированием необычного комплекса, содержащего а-субъединицу (Brodolin et al., 2004). Изучение таких необычных комплексов поможет углубить наше понимание процесса перехода к элонгации.

Помимо чисто научного, изучение инициации транскрипции несет в себе и практический интерес. Понимание механизма инициации транскрипции и его регуляции можно применить к управлению экспрессией отдельных интересующих генов, а также к разработке антибиотиков, специфичных к данному виду, или даже к конкретному гену. Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение роли о-субъединицы в инициации транскрипции и при переходе от инициации к элонгации. В задачи данного исследования входило:

1. Изучить механизм возникновения паузы транскрипции при переходе от инициации

к элонгации на lacUV5 промоторе.

РОСПАЦи0Нллии~ БИБЛИОТЕКА I С.Пет*р5ург _ ОЭ 2001/акт/,-у2|

2. Изучить роль а70-субъединицы в синтезе РНК-полимеразой E.coli праймера для инициации репликации генома бактериофага М13.

3. Изучить механизм формирования праймера для репликации генома бактериофага М13.

Научная новизна н практическая ценность. В работе исследованы новые, неизвестные прежде функции а-субъединицы. Изучен механизм возникновения паузы транскрипции при переходе от инициации к элонгации на промоторе lacUV5. Показано, что за возникновение паузы ответственны взаимодействия с нематричной цепью ДНК СТ70-субъединицы, не диссоциировавшей из комплекса с РНК-полимеразой после ухода с промотора. Предложен новый механизм регуляции транскрипции с помощью а-зависимых пауз, возникающих при переходе к элонгации.

Подробно изучен механизм инициации репликации бактерофага М13 клеточной РНК-полимеразой. Показано, что в этой системе не участвует - в

узнавании промотора, осуществляемом полностью корферментом, но необходима для перехода от абортивной инициации к элонгации. Предложенный в работе механизм действия может являться общим для инициации с бактериальных

промоторов. Показано, что образование праймера определенной длины происходит в результате формирования необычного премирующего комплекса, возникающего из-за нерасплетания РНК-ДНК гибрида позади полимеразы. Сравнение известных данных с данными, полученными в этой работе, указывает на возможность использования описанного механизма другими бактериофагами, а также эписомами бактерий.

В работе получена система, в которой удалось отделить начало синтеза РНК от а-зависимого узнавания и плавления промотора, что предоставляет широкие возможности для исследования механизма инициации транскрипции, минуя ее начальные стадии. Полученная система может использоваться в тестировании активности мутантных РНК-полимераз, дефектных в узнавании или открывании промотора, а также при выяснении механизма действия транскрипционных факторов и антибиотиков, влияющих на инициацию.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 178 страницах машинописного текста и содержит 34 рисунка. Библиография включает в себя 190 названий.

Результаты и обсуждение

Данная работа состоит из трех частей. Первая часть посвящена изучению механизма возникновения паузы транскрипции при переходе от инициации к элонгации на lacUVS промоторе. Во второй части рассмотрена роль С70-Субъедикицы в инициации транскрипции на беспромоторной ДНК. В последнем разделе изучен механизм синтеза праймера для ДНК репликации бактериофага М13 клеточной РНК-полимеразой. 1. Изучение механизма возникновения паузы транскрипции при переходе от инициации к элонгации на промоторе lacUVS.

1.1. Введение.

Основной - о-субъединицей в клетке является а70, направляющая транскрипцию с

промоторов гомеостатических генов. а70 обладает хорошо выраженной доменной

организацией с четким разделением функций между доменами. Считается, что о -субъединица диссоциирует из комплекса с РНК-полимеразой после синтеза РНК длиной 7-11 нуклеотидов, однако появились данные, указывающие на то, что при переходе от инициации к элонгации может не диссоциировать, оставаясь связанной с

элонгационным комплексом (Bar-Nahum, Nudler, 2001, Mukhopadhyay et al., 2001). Наиболее интересные результаты были получены при функциональном исследовании транскрипционных комплексов, полученных при синтезе с Яри- промотора Я. фага (Ring et al., 1996). Было показано, что о70-субъединица, недиссоциировавшая при переходе к элонгации, вызывает паузу транскрипции, специфически взаимодействуя с начальнотранскрибируемой областью. При исследовании транскрипции с lacUV5 промотора в нашей лаборатории была обнаружена пауза транскрипции в положении +17 (Brodolin et al., 2004). При анализе комплекса, находящегося в состоянии паузы, было показано, что он содержит В моей работе была поставлена задача

изучить молекулярный механизм возникновения паузы транскрипции при переходе от инициации к элонгации с lacUVS промотора.

1.2. Комплекс в состояния паузы является элонгационным, сдвинутым назад (backtracked).

При анализе кинетики однораундовой транскрипции in vitro на фрагменте ДНК, содержащем lacUVS промотор, было обнаружено, что наряду с ожидаемым 50 нуклеотидным полноразмерным продуктом формируется 17-нуклеотидный продукт. Этот интермедиат накапливается в течении 2 мин., после чего медленно исчезает, удлиняясь до полноразмерного продукта (Рис. 1 А, дорожки 1-4). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что 17-нуклеотидный интермедиат возникает в результате паузы транскрипции, и

Рас. 1. Возниквомям паузы транскрипции в положения +17 при синтезе с htcUVS промотора. (А)

Кинетика транскрипции in vitro на фрагменте ДНК, содержащем ¡acUVS промотор, в присутствии Gre В фактора (5-8), гепарина (9-12) или в их отсутствие (1-4). Алнквоты отбирались через промежутки времени от начала синтеза, обозначенные на рисунке. Продукты реакций были разделены в денатурирующем 20% ПЛАТ. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены абортивные продукты (ал.), полноразмерный продукт, соответствующий синтезу до конца ДНК-фрагмента (л.п.), и 17-иуклеотидиый интермезиат, возникающий в результате паузы транскрипции. (В) Комплексы в состоянии паузы из реакции, соответствующей дорожке 3 панели А, полученные с использованием РНК-пол и меразы. иммобилизовано^ на Ni-NTA-агарозе, отмыты от присутствовавших в реакционной смеси нуклеоткдов, палноразмерных РНК, оставшихся оромогорных комплексов и проинкубированы в отсутствие или в присутствии Gre В фактора. Обозначены продукт, возникающий в результате паузы (+17) и продукт его расщепления Gre В фактором. Продукты реакций разделены в денатурирующем 20% ПААГ. Представлен радиоавтограф геля.

комплекс в состоянии паузы является элонгационным. Бродолиным было показано, что комплекс в состоянии паузы устойчив к действию 1 М КС), что также является характеристической чертой элонгационного комплекса. При проведении транскрипции в присутствии фактора GreB, стимулирующего эндонуклеолитическое расщепление РНК в сдвинутых назад (backtracked) комплексах, наблюдалось исчезновение 17-нуклеотидного интермедиата через минуту после его появления (Рис. 1А, дорожки 5-8). Одновременно происходило накопление более мелких продуктов. Было предположено, что РНК в комплексе в состоянии паузы подвергается расщеплению под действием GreB фактора, то есть комплекс находится в сдвинутом назад (backtracked) состоянии. Действительно, при инкубировании комплексов в состоянии паузы, изолированных на Ni-NTA-агарозе, с GreB фактором, 17-нуклеотидная РНК количественно расщепляется до 13-нуклеотидной (Рис. 1В). Это подтверждает, что комплекс в состоянии паузы является элонгационным и сдвинутым назад (backtracked) с активным центром РНКП, находящемся в положении +13. В этом случае GreB фактор выступает как супрессор паузы, возвращая РНКП в состояние, предшествующее паузе, и, тем самым увеличивая вероятность ее прохождения. 13. Пауза транскрипции в положении +17 возникает благодаря специфическому взаимодействию о^-субмдиннцы' ДНК.

Бродолиным было показано, что под действием полианиона гепарина субъединица диссоциирует из комплекса, находящегося в состоянии паузы (Brodolin et al., 2004). Оказалось, что при проведении транскрипции с lacUV5 промотора в

присутствии гепарина, пауза транскрипции в положении +17 отсутствует (Рис. 1А, дорожки 9-12). Это дало основания предполагать, что лауза в положении +17 является зависимой от а?0-.субъединнцы.

А А(+б мут)

А *

«удлиненный» -10 элемент -ТС - ТАТААТ последовательность в районе СТСТСС^АТТСТСАССССАТААС

47 шшюаа 1и промотора

А(+5 мут) ■

матрица ДТ +6 мут

пл.-*

+17-»

Май (ЙДивД!

штрш» ДТ +< мут

пшк» ИК.|+м[+17 ВК^И« [*17

1 2 3 4 5 <

12343*78

Гас. 2. Специфическое взаимодействие « чуСыямны с начально-транскрибируемой областью 1ас1!У5 вромотора. (А) Сравнение нуклеотидных последовательностей канонического удлиненного -10 вромоторного элемента с начальиогтранскрнбируемой областью 1асЦУ5 промотора. Идентичные положения отмечены серым. Показаны замены в мутангных матрицах +5 мут и +6 мут, стрелкой отмечен старт транскрипции с 1асИУ5 промотора. (В) Кинетика транскрипции ¡п \itro, как описано выше (подпись к Рис. 1А, дорожки 1-4), с использованием фрагмента ДНК с последовательностью дикого типа (ДТ) и матрицы с заменой в +6 положении (+6 мут на панели А). Продукты реакций разделены в денатурирующем 20% полиакриламидиом геле. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены абортивные продукты (а.п.Х полноразмерный продукт, соответствующий синтезу до конца ДНК-фрагмента (пл.), и 17-нуклеотидный шпермедиат, возникающий в результате паузы транскрипции. (С) Открытые промоториые комплексы (ПКо) и изолированные на КкЫТА-агарозе комплексы в состоянии паузы (ТЭК17) и искуствеино остановленные в положении -1-16 (ТЭК 16) комплексы, полученные на радиоактивно меченых матрицах ДГ и +6 мут, были подвергнуты сшивке формальдегидом. Сшитые комплексы разделены в денатурирующем 5% ПЛАТ. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены сшитые комплексы ДНК с Р'- и о^-субъеднницами.

При рассмотрении последовательности ДНК в начальнотранскрибируемой области 1исиУ5 промотора била обнаружена последовательность, напоминающая удлиненный -10 район бактериальных промоторов (Рис. 2А). Было сделано предположение о том, что район 2 взаимодействующий с -10 районом промотора при инициации

транскрипции, может устанавливать контакты с этой последовательностью, вызывая тем самым паузу транскрипции. Такой тип паузы транскрипции был показан ранее в

лаборатории Робертса (Roberts) при транскрипции с Аря- промотора бактериофага X (Ring et а!, 1996). Чтобы проверить это предположение, тимидин в положении +6, соответствующий абсолютно консервативному и необходимому для узнавания тимидину -7 в бактериальных промоторах, был заменен на аденозин (Рис. 2А). Транскрипция на этой мутантной матрице (+6мут) проходила без возникновения паузы в положении +17 (Рис. 2В). Таким образом, изменение нуклеотидной последовательности в области, с которой потенциально может взаимодействовать приводит к

исчезновению паузы. Это подтверждает предположение о том, что пауза транскрипции в положении +17 возникает из-за специфического узнавания последовательности в начальнотранскрибируемой области, напоминающей мотив -10 промотора.

Наличие ДНК-белковых контактов в элонгационном комплексе в состоянии паузы можно идентифицировать с помощью ДНК-белковой химической сшивки (Brodolin et al., 2004). Если комплекс РНКП с ДНК обработать формальдегидом, то ДНК химически пришьется к тому району белка, с которым она находится в близком контакте (ДНК-белковая сшивка формальдегидом характеризуется малым расстоянием между реагирующими группами в ДНК и белке (порядка 2А)).

Так как РНКП не останавливается в положении +17 на +6мут матрице, чтобы провести формальдегидную сшивку на этой матрице, РНК-полимераза была искусственно остановлена в положении +16 в условиях ограниченной комбинации нуклеотидов, полученные комплексы были проанализированы. В качестве контроля использовалась сшивка, проведенная в открытых комплексах, сформированных на обеих матрицах. Как видно, в открытых комплексах, сформированных на мутантной матрице и матрице дикого типа, сшивка идентична (дорожки 1 и 4). Как ожидалось, сшивка в элонгационном комплексе с РНК, длиной 17 нуклеотидов (ТЭК 17) происходит только в случае использования матрицы дикого типа, так как на +6мут матрице паузы в положении +17 не происходит (сравните дорожки 3 и 6). Оказалось, что в случае мутантной по +6 тимидину матрицы, сшивки с не происходит и в искуственно остановленном

ТЭК16 (сравните дорожки 2 и 5), что говорит о том, что плотный контакт а70-субъединицы с ДНК отсутствует. Таким образом, взаимодействие а70-субъединицы с нематричной цепью ДНК на +6мут матрице нарушено, что подтверждает, что пауза транскрипции в положении +17 происходит из-за специфического взаимодействия субъединицы с последовательностью нематричной цепи, напоминающей -10 элемент промоторов.

Как видно из Рис. 2С, в остановленном комплексе ТЭК 16 на матрице +6мут сшивка ДНК с гораздо более интенсивна, нежели в таком же комплексе на

матрице дикого типа (дорожки 2 и 5). Это указывает на то, что ТЭК16, в котором отсутствуют специфические контакты с ДНК, на +6мут, находится в

другой конформации, нежели ТЭК16, образованный на матрице дикого типа.

Полученные результаты не позволяют ответить на вопрос, остается ли субъединица связанной с РНК-полимеразой в ТЭК 16 на +6мут матрице, лишь теряя контакты с ДНК, или же в отсутствие взаимодействия с начально-транскрибируемой последовательностью диссоциирует из комплекса. Недавно в

лаборатории Хокчайлд (Hochschild) с использованием флюоресцентных методов было показано, что на мутантых lac UV5 матрицах, на которых пауза в положении +17 не возникает, искусственно остановленные комплексы не содержат (Nickels

et al., 2004). Значит, в отсутствие специфических контактов с начально-транскрибируемой областью диссоциирует из комплекса с РНК-полимеразой при переходе

от инициации к элонгации. Таким образом, последовательность начальнотранскрибирумой области lac промотора не только вызывает паузу транскрипции, взаимодействуя с но и предотвращает собственно

высвобождение из комплекса с РНК-полимеразой при переходе от инициации к элонгации.

Роль, которую играет в возникновении паузы транскрипции в

начально-транскрибируемой области lac оперона, является впервые показанной для бактериальных генов возможной функциональной ролью в элонгации. В

лаборатории Робертса была описана похожая пауза в начальнотранскрибируемой области фага (Ring et al., 1996). Это может свидетельствовать о существовании универсального механизма регуляции транскрипции с помощью ст70-зависимых пауз. Недавно в лаборатории Хокчайлд (Hochschild) пауза, изученная в настоящей работе in vitro была продемонстрирована in vivo (Nickels et al., 2004). Таким образом, эта пауза может быть одним из пунктов регуляции транскрипции с lac промотора. Такая пауза должна оказывать негативный эффект на транскрипцию генов данного оперона и, соответственно, можно предполагать существование механизма ее преодоления. Как показано в моей работе, фактор GrcB может выступать в качестве регулятора на этом этапе, супрессируя паузу. В этом случае GreB, вызывая расщепление РНК в сдвинутом назад комплексе в состоянии паузы, возвращает полимеразу в состояние, когда пауза транскрипции еще не достигнута, а так как существует часть комплексов, которая

«проскакивает) паузу, GreB может повышать вероятность прохода последовательности, вызывающей паузу, без остановки на ней. Исчезновение паузы транскрипции при действии гепарина указывает на возможную регуляцию ее какими-либо клеточными олигосахаридами, однако по принципиально другому механизму, нежели GreB фактор, вызывая диссоциацию из элонгационного комплекса и тем самым

предотвращая паузу транскрипции. Можно также предположить существование таких зависимых пауз и соответственно такого механизма регуляции и у других генов. Эта гипотеза подтверждается наличием А/Т богатых участков, напоминающих -10 мотив промотора, в начально-транскрибируемых областях некоторых бактериальных генов (Ozoline et al., 1999).

1.4. Положениеформальдегидиой сшивки а^-субъедниицынаДНК.

В моей работе было идентифицировано место сшивки на ДНК.

Им оказался гуанозин в положении +3 на нематричной цепи ДНК (Рис. 2А). При замене

этого гуанозина на аденозин пауза транскрипции в положении +17 на мутантной матрице

Рис. 17. Картирование места формальдегид ной пришивки о^-субмдявицы на ДНК в комплексе, находящемся в состояния паузы. (А) Кинетика транскрипции т vitro, как описано выше (подпись к Рис. 1А, дорожки MX с использованием фрагмента ДНК с последовательностью дикого типа (ДТ) и матрицы с заменой в +5 положении (+5 мут, см. Рис. 5А). Продукты реакций были разделены в денатурирующем 20% полиакрил амидном геле. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены абортивные продукты (а. п.), полноразмерный продукт, соответствующий синтезу до конца ДНК-фрагмента (пл.), и 17-нуклеотидный янтермедиат, возникающий а результате паузы транскрипции. (В) Формалвдегидная сшивка комплексов в состоянии паузы на матрицах ДТ и +5 мут. Реакции были проведены с использованием РНКП, иммобилизованной на Ni-NTA-агарозе, и радиоактивно меченых матриц ДГ и +5мут. Комплексы в состоанин паузы, полученные в реакции, соответствующей дорожкам 3 я 7 панели А, были изолированы путем промывами* реакционных смесей 1М КО or присутствовавших в реакционной смеси нуклеотндов, полноразмерных РНК и оставшихся промоторных комплексов, и была проведена ДНК-белковая сшивка формальдегидом. Сшитые комплексы разделены в 5% ПЛАТ в денатурирующих условиях. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены сшитые комплексы ДНК с Р'- и а^-субъединицам и.

(+5мут) полностью сохранялась (Рис. ЗА), однако, пришивка аТО-суб1единицы в ТЭК 17 формальдегидом пропадала (Рис. ЗВ). Таким образом, аТО-Субъединица пришивается формальдегидом к гуанозину в положении +5. Замена этого гуанозина не влияет на возникновение паузы, по-видимому, потому, что соответствующее положение в

промоторе, -8, принимает минорное участие в узнавании -10 последовательности о -субъединицей.

Бродолиным было картировано место сшивки в о70-субъедннице, оказавшееся в районе 2.4, ответственном за узнавание мотива -10 промоторов. Так как ДНК-белковая сшивка формальдегидом характеризуется малым расстоянием между реагирующими группами в ДНК и белке (порядка 2А), эти данные подтверждают, что район 2 о70-субъединицы контактирует с последовательностью, вызывающей паузу, в ТЭК 16/17. 1.5. Детерминанты взаимодействия о^-субъедиввцы с корферментом в элонгациояном комплексе.

Район 2 а необходим для возникновения паузы, так как он устанавливает контакты с начально-транскрибируемой областью. Чтобы проверить, не важны ли другие домены а70-субьединицы для связывания с элонгационным комплексом, были получены делеционные мутанты а7°-субъединицы (Басе, неопубликованные данные). Мутантные белки представляли собой различные комбинации консервативных районов 1.1, 1.2-2.4, 3.1-4.1 и 42 (Рис. 4А). Эти белки неактивны или обладают очень слабой активностью в инициации транскрипции с промоторов -35/-10 класса, будучи использованы с корферментом (Campbell et al., 2002; Severinova et aU 1996), поэтому их активность в связывании с корферментом была проверена по способности ингибировать инициацию транскрипции холоферментом дикого типа с промотора lacUV.

А. Рамш

1Л L2-L4 XHI 44

О" С

С с D С Е

Рис. 4. Роль районов о^-субъедиияиы при связывании с элоягацноиным комплексом в состоянии паузы. (А) Схема использованных в работе депецнонных мутантов о^-субьединицы. Прямоугольниками обозначены консервативные районы, содержащиеся в мугагтных белках. (В) Комплексы, остановленные в отсутствие СТР в положении +16 на радиоактивно-меченой ДНК, были иммобилизованы на МьМТА-агароэе и отмыты от промоторных комплексов. оп-субъединица была удалена ш комплексов с помощью гепарина. К полученным комплексам не было добавлено ничего (дорожка 1), была добавлена о^-субъсдииица (дорожка 2) или фрагменты о-субъединицы, описанные в панели А (дорожки 3-7), и была проведена ДНК-белковая сшивка формальдегидом. Сшитые комплексы разделены в денатурирующем 5% ПААГ. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены сшитые комплексы ДНК с Р'-субьединицей и фрагментами а70-субъелитощы.

Остановленные комплексы, ТЭК 16, были обработаны гепарином для удаления а70-субъединицы, связанной с ними (БгоёоНп е1 а1., 2004). Гепарин затем был отмыт 1М №01.

К комплексам, лишенным таким образом О70Ч;у6ъедиНИЦЫ, были добавлены мутантные белки и проведена сшивка формальдегидом (Рис. 4В). Как и ожидалось, аТО-субъединица дикого типа связывалась с комплексом, о чем свидетельствует появление сшивки с ДНК. Что же касается мутантных о-субъединиц, оказалось, что в комплексе с полимеразой находятся лишь те укороченные а-субъединицы, у которых наряду с районом 12-2.4 имеется консервативный район 1.1 (Рис. 4В, дорожки 2, 5, 6). Таким образом, взаимодействия районов 1.1-2.4 а70-субъединицы с корферментом являются необходимым и достаточным условием (при использованной точности картирования) нахождения е2 в элонгационном комплексе. В опубликованной структуре холофермента (Vassylyev et а1., 2002) район 1.1 отсутствует, и функция этого района остается

невыясненной. Полученные в этой работе данные указывают на возможную роль района 1.1, которую он может играть при переходе от инициации к элонгации.

Опираясь на модель инициации и перехода к элонгации, основанную на недавно опубликованных рентгеноструктурных данных, можно предположить, что район 1.1, будучи вытесненным из ДНК-связывающего канала при взаимодействии холофермента с ДНК, меняет место связывания на поверхности корфермента. При переходе к элонгации вытеснение района 3.2 из главного канала и дестабилизация связывания района 4.2 с "заслонкой" растущей цепью РНК оставляют только контакты района 2 и района 1 с корферментом. По-видимому, взаимодействия только района 2 и кора недостаточно для удержания с70, и круциальным является взаимодействие с кором района 1.1. Эта гипотеза согласуется с предположением, что связывание отдельных доменов с РНКП достаточно слабо, и лишь одновременное взаимодействие их с полимеразой приводит к прочному присоединению

Итак, о70 потенциально может связываться с полимеразой по ходу элонгации и уменьшать среднюю скорость транскрипции, взаимодействуя с нематричной цепью, то есть являться фактором элонгации. К аналогичному выводу пришли авторы работы (Mooney and Landick, 2003), в которой было показано, что ковалентное присоединение -субъединицы к РНКП приводит к возникновению пауз в ходе транскрипции химерным ферментом на участках, напоминающих -10 элемент промотора.

2. Изучение роли а70-субъединицы в синтезе РНК-полимеразой E.coli праймера для репликации генома бактериофага М13.

2.1. Введение.

Геномом бактериофага М13 является одноцепочечная кольцевая ДНК. При попадании в клетку эта ДНК специфически узнается клеточной РНК-полимеразой,

которая синтезирует 18-20 нуклеотидную РНК (пРНК). Эта РНК служит праймером для ДНК-полимеразы III, которая и осуществляет репликацию одноцепочечного генома с получением двуцепочечной формы (Geider, Kornberg, 1974). В присутствии SSB холофермент РНК-полимеразы специфически узнает участок одноцепочечной ДНК, называемый участком начала репликации минус цепи (УНР) (Tabak et, al., 1974). Последовательность УНР содержит два палиндромных повтора, которые могут образовать две несовершенных шпильки. Расположенные параллельно, эти шпильки образуют подобие фрагмента двуцепочечной ДНК (Рис. 5, фрагмент 1). Так как синтез праймерной РНК (пРНК) полностью зависит от аТО-Субт>единицы (Kaguni, Komberg, 1982), было предположено, что псевдо-двуцепочечный фрагмент может работать как бактериальный промотор (Higashitani et al., 1996). И действительно, на этом фрагменте, в положениях -10 и -35 относительно старта транскрипции пРНК, были обнаружены последовательности, слабо напоминающие промоторные консенсусные элементы.

В моей работе была поставлена задача изучить роль в синтезе

РНК- праймера для репликации одноцепочечного генома фага М13.

22. Предполагаемые -10 и -35 районы УНР пе играют роли в узнавании.

Для того, чтобы определить детерминанты специфического узнавания УНР РНК-полимеразой, было решено найти минимальный фрагмент одноцепочечного генома М13, на котором может быть осуществлен синтез пРНК. Фрагмент 1, с которого было начато это исследование, - 128 нуклеотидный фрагмент, соответствующий положениям 56245751 одноцепочечного генома М13, содержащий обе пары инвертированных повторов (Рис. 5). Как было упомянуто, предполагается что узнавание этого фрагмента происходит

аналогично узнаванию бактериального промотора (Higashitani Ы а1., 1996). На Рис. 6А, дорожка 2 видно, что холофермент РНКП синтезирует 18 нуклеотидную праймерную РНК (пРНК). Чтобы проверить роль предполагаемого -35 элемента УНР в синтезе пРНК, была удалена левая шпилька УНР, содержащая -35 область и проверена способность 50 нуклеотидного фрагмента служить матрицей для синтеза пРНК (фрагмент 2, Рис. 5).

1 2 i

ff* -к -к -1+

-Ш1Г.-И.1 -1 +

кар + i "1 t

с»

¡.жГНК

ÉML

ВНННивй

113 4)171

» »" *

ílf

12 3 4 3

Fue. 6. Роль -10 и -35 районов и о-субъедмннцы в i узнавании УНР. (А)

Транскрипция т v¡tro на фрагментах УНР (см. Рис. 5) корферментом (дорожки I, 3, 5 и 7) и холофермеитом (дорожки 2, 4, 6 и 8). ' Продукты реакций разделены в денатурирующем 20% ПЛАТ. Представлен радиоавтограф геля. (В) Защита радиоактивно «. меченого фрагмента 1 корферментом (дорожка 4) и холофермеитом (дорожка S) от расщепления ДНКазой 1. Дорожка 2 -контроль без ДНКазы I, дорожка 3 - без РНК-полимеразы, дорожка 1 - А+Г реакция фрагмента I по Максам-Гилберт. Черными стрелками обозначены позиции, защищаемые РНК-полимеразой. Продукты расщспленкя разделены в денатурирующем 10% ПААГ. Представлен радиоавтограф геля.

Холофермент синтезировал пРНК на этом фрагменте, что указывает на то, что -35 район предполагаемого промотора не важен для узнавания УНР и синтеза пРНК (Рис. 6А, дорожка 4). Еще более удивительным оказался факт, что удаление области, содержащей предполагаемый промоторный элемент -10 (фрагмент 3, Рис. 5), не привело к изменениям в транскрипции (Рис. 6А, дорожка б). Дальнейший анализ привел к получению минимального, длиной в 33 нуклеотида, фрагмента УНР, способного поддерживать синтез пРНК (Рис. 20). Укорочение минимального 33-нуклеотидного фрагмента с 5'- или 3'-конца хотя бы на один нуклеотид приводило к полному исчезновению синтеза праймера. Таким образом, -10 и -35 области не играют роли в узнавании УНР, и узнавание происходит по какому-то иному механизму, нежели узнавание промоторов. 2 3 . о^-субыяшивця необходима для синтеза пРНК, во не нужна для узнавания УНР.

Эффективный синтез на матрицах, у которых полностью отсутствуют промоторные элементы, заставляет задаться вопросом, является ли синтез на этих матрицах о^-зависимым, или корфермент сам способен синтезировать пРНК на коротких фрагментах УНР? Сравнение нечетных и четных дорожек на Рис. 6А показывает, что синтез пРНК на фрагментах 1, 2 и 3 строго зависит от присутствия Для

синтеза пРНК на минимальном фрагменте ап также была необходима (дорожки 7 и 8).

Полученные результаты можно объяснить двумя причинами: либо а70-субъединица участвует в узнавании УНР, либо она играет роль в самом синтезе пРНК. Способность корфермента связывать УНР была изучена в эксперименте по защите ДНК УНР от расщепления ДНКазой I. В этом эксперименте комплексы были сформированы в стехиометрическом соотношении РНК-полимеразы и фрагмента 1 УНР. Корфермент и холофермент обнаружили близкие степени защиты фрагмента 1 УНР от расщепления (Рис. 6В, дорожки 4,5). Таким образом, корфермент взаимодействует с УНР, но неактивен в синтезе пРНК, в свою очередь, а70-субъедииица становится важна только на стадии синтеза, не играя роли в узнавании УНР. Эта ситуация необычна, так как считалось, что необходима лишь для узнавания промотора и формирования промоторного комплекса и не участвует в синтезе РНК. 2.4. а-субъединица важна на стадии синтеза трннуклеотида.

Отсутствие синтеза пРНК корферментом можно объяснить его неспособностью либо синтезировать первую фосфодиэфирную связь, либо удлинять абортивные продукты. Разделение продуктов транскрипции на УНР в высокопроцентном геле показало, что кори холофермент синтезируют сравнимые количества двунуклеотидного абортивного продукта pppApG, однако только холофермент способен синтезировать полноразмерную пРНК (Рис. 7А). Холофермент синтезировал также небольшие количества тринуклеотидного абортивного продукта, который отсутствовал в реакционной смеси с корферментом. Таким образом, кор не может синтезировать пРНК, потому что не может удлинить абортивные продукты далее второго нуклеотида. С использованием мутантных матриц и разных комбинаций нуклеотидов было показано, что синтез динуклеотида корферментом происходит высокоспецифично. Было также показано, что корфермент может узнавать и специфически инициировать синтез динуклеотида не только на коротком фрагменте генома, содержащем УНР, но также и на целой геномной ДИК М13 в присутствии SSB.

Итак, корфермент специфически узнает УНР и способен начать абортивный синтез, однако не может перейти к элонгации. Какова же может быть роль позволяющая холоферменту перейти от абортивной инициации к элонгации? Одна из возможностей - это то, что а70-субъединица понижает Km для входящего нуклеотида. Однако, даже в присутствии высоких концентраций нуклеотидов корфермент не был способен к синтезу полноразмерпой пРНК. Другой вариант - стабилизировать

связывание коротких абортивных транскриптов в ходе ранней стадии синтеза пРНК, позволяя им удлиняться далее второго нуклеотида. Чтобы проверить это предположение, реакция была инициирована с динуклеотида (ApG), соответствующего тому, который

мотут синтезировать и корн, и холоферменты, или с тринуклеотида (АрОрО), который может синтезировать только холофермент. Как видно из Рис. 7В, кор приобретает способность синтезировать пРНК только когда в качестве затравки используется тринуклеотид (дорожка 3). Таким образом, о70-субьединица перестает быть полностью необходимой в синтезе пРНК после формирования второй фосфодиэфирной связи.

Рас. 7. (ЛчуОиашпш важна на стадии синтеза тринуклеотида. (А) Продукта транскрипции in vitro на фрагменте 2 УНР корферментом (дорожка 2) и холоферменгом (дорожка 3), разделенные в 33% денатурирующем ПЛАТ. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены пРНК и различные абортивные продукты. (В) Транскрипция in vitro на фрагменте 2 УНР корферментом (дорожки 1, 3) и холоферменгом (дорожки 2,4) в присутствии затравок ApG (дорожки 1, 2) и ApGpG (дорожки 3,4). Продукты реакций разделены в денатурирующем 20% ПЛАТ. Представлен радиоавтограф геля. Обозначена пРНК.

В моей работе описанное действие а-субъединицы было продемонстрировано и для некоторых других членов о^-семейства, os, ов, аи. То есть, можно заключить, что с-субъединицы а70 семейства пронимают активное участие в синтезе РНК на стадии абортивного синтеза, взаимодействуя с олигонуклеотидами в активном центре РНК-полнмеразы.

Структурный и функциональный анализы указывают на то, что район 3.2 а70-субъединицы в холоферменте находится вблизи каталитического центра и может контактировать с 5'-концом коротких транскриптов (Severinov et al., 1994, Murakami et al, 2002, Vassylyev et al., 2002). Такое взаимодействие могло бы стабилизировать связывание коротких абортивных транскриптов, делая тем самым возможным их удлинение. Оказалось, что холофермент, реконструированный с использованием мутантной а-субъедипицы (A3), у которой отсутствовал район 32 (аминокислоты 507-519) был неактивен в синтезе пРНК, однако мог осуществлять синтез динуклеотида на УНР, а также был активен на стандартном промоторе. Таким образом, можно заключить, что район 3.2 необходимым для синтеза пРНК, по-видимому,

взаимодействуя с новосинтезированным динуклеотидом и стабилизируя его связывание для дальнейшего удлинения.

Данные о стабилизации связывания коротких транскриптов районом 32 а70-субъединицы находятся в противоречии с предполагаемой ролью этого района в абортивной инициации, ролью препятствия, вызывающего диссоциацию абортивных продуктов. Возможным объяснением может быть то, что именно связывание транскриптов а^-субъединицей, стабилизирующее короткие транскрипты, приводит к диссоциации более длинных РНК с ДНК матрицы, движущейся относительно 32 района в ходе синтеза.

Рве. 8. Роль корфермента • ушваннн УНР. Представлен радиоавтограф 20% жшиакриламидноп» геля, в котором разделены продукты абортивного синтеза РНК-полимервзой дикого типа (дт, дорожки ] и 5) н мутангной полимеразой, несущей крупную делецию в канале, связывающем передний дуплекс ДНК (Д1149-1190, дорожки 2-4) на фрагменте I (дорожки 1-3) и промоторе Al фага Т7 (дорожки 4 и 5). В случае Т7А1 промотора использовалась динуклеотидная затравка. Обозначены различные абортивные продукты.

2.5. Место связывания шпилька УНР в корферменте.

Из полученных в этой работе результатов следует, что корфермент специфически узнает УНР без помощи ато-субъединицы. Скорее всего, место связывания УНР находится в той части канала РНК-полимеразы, где связывается передний дуплекс ДНК при нормальной транскрипции. Фермент, несущий большую делению в Р'-су&ьединице, в районе этого канала был активен на стандартном промоторе, но не

транскрибировал с УНР (Рис. 8, дорожки 2-4), что указывает на то, что этот район канала участвует в узнавании УНР или в поддержании стабильности комплекса. В синтезе на УНР были неактивны как кор-, так и холофермент, что подчеркивает важность корфермента в узнавании УНР. Полученный результат нашел подтверждение in vivo. Клетки ELcoli, ген гроС которых несет указанную делецию (Д1149-1190), оказались непермиссивны для фага М13. Итак, связывание УНР осуществляется в той части канала, которая в норме занимается передним дуплексом ДНК, и не зависит от На структурной модели домен отсутствующий в полимеразе

находится в непосредственной близости от переднего дуплекса ДНК, что подтверждает гипотезу о том, что этот домен участвует в узнавании или стабилизации комплекса с УНР в процессе репликации фага М13.

«мри фршмап! [ Т7А1

юр дт | Даш-иад |дт

<г» + 1- +

ужлеотад-»

гшюта-* уклиутжж—♦

1 2 3 4 5

Структуру УНР можно назвать ДНК-аптамером к корферменту РНК-полимеразы, отобранному фагом в ходе его эволюции. УНР бактериофагов fl, fd, Ke обладают очень высокой степенью гомологии с УНР М13 (около 95% идентичности), что говорит о том, что УНР этих фагов также могут узнаваться корферментом. Аналогичные по структуре УНР обнаружены у некоторых бактериальных эписом, в частности F-фактора, использующих РНКП для праймирования репликации. По-видимому, в этих случаях может использоваться такой же механизм узнавания РНК-полимеразой УНР.

Показанная в работе способность корфермента узнавать ДНК без участия а-субъединицы, по-видимому, означает, что кор может сам «чувствовать» ДНК. Это могло бы объяснить неравномерное движение полимеразы при синтезе, паузы и аресты транскрипции. Это гипотеза находит подтверждение в недавно вышедшей работе из лаборатории Ландика (Landick), в которой показано, что часть канала, связывающая передний дуплекс ДНК, играет роль в регуляции на всех стадиях транскрипционного цикла (Ederth et al, 2002).

3. Изучение механизма формирования РНК-праймера для репликации одноцепочечного генома бактериофага М13. 3.1. Введение.

Длина пРНК составляет 18-20 нуклеотидов, однако, что именно является причиной остановки РНК-палимеразы по достижении этой длины, непонятно. Для узнавания пРНК ДНК-полимеразой III ее З'-конец должен быть экспонирован и спарен с матричной цепью ДНК. Одако тройной комплекс ДНК-РНК-РНКП, удовлетворяющий этим требованиям, пе существует ни на одной из стадий транскрипционного цикла. Таким образом, как пРНК может служить праймером для ДНК-полимеразой Ш, неизвестно.

В моей работе была поставлена задача изучить причину остановки РНК-палимеразы в ходе перехода к элонгации при синтезе пРНК, а также попытаться понять, каким образом транскрипт может служить праймером для ДНК-полимеразы. 32. После остановки синтеза РНК-полимераза продолжает быть связанной с РНК н ДНК, образуя необычный элонгационный комплекс

Следующим этапом моей работы было выяснение причины остановки РНК-полимеразы после синтеза 18-20 нуклеотидной пРНК. Известно, что остановка транскрипции может осуществляться либо при терминации транскрипции, в ходе которой происходит распад комплекса полимераза-ДНК-РНК, либо при возникновении паузы транскрипции, когда РНК-полимераза по той или иной причине останавливается, но не диссоциирует из комплекса с ДНК и РНК. В последующих экспериментах использовался фрагмент 2 УНР.

11]Щ) I )»ииики

Ряс. 9. Характеристика комплекса, образующегося при синтезе пРНК. (А) Гель-фнльтраши реакционной смеси синтеза пРНК в отсутствие и в присутствии РНКазы Н. Представлены профили апюции. Фракции проанализированы на ецнктишиторе (верхняя панель), на СДС-ПААГ окраской серебром (вторая сверху панель) и на денатурирующем мочевинном 20% ПААГ радиоавтографией (две нижние панели). Черной вертикальной стрелкой обозначено время элюции пРНК в реакционной смеси, подвергнутой фенольной экстракции. Справа обозначены субьеднннцы РНКП, пРНК, абортивные продукты и продукты расщепления РНКазой Н. (В) Комплексы, полученные при синтезе 20-иуклеотидной (20мер, дорожки 1-5), 27-нуклеотцдноб (27иер, дорожки 6-10) РНК на Т7А1 промоторе и пРНК на УНР были иммобилизованы на № ЭТА-агарозе и отмыты от нуклеотидов и оставшихся промоторных комплексов. После этого в реакционные смеси были добавлены нуклеозндгрифосфаты (ЫТРХ Сге В фактор, пирофосфат (РР1) или РНКазаН. Продукты реакций разделены в денатурирующем 20% ПААГ. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены пРНК, 20- и 27-нуклеотцдные РНК, а также продукт, образующийся при синтезе до конца матрицы.

Чтобы проверить остается ли РНК-полимераза связанной с ДНК УНР и пРНК по окончании синтеза, реакционная смесь была нанесена на гель-фильтраиионную колонку и фракции были проанализированы на сцннтилляторе и с помощью денатурирующего электрофореза. Как видно из Рис. 9А, полимераза и пРНК элюировались вместе, тогда как пРНК из реакционных смесей, подвергнутых фенольной экстракции, выходила гораздо позже (показано черной стрелкой). Исходя из того, что пРНК в конце концов должна служить праймером, то есть должна быть спарена с ДНК, а полученный результат допускает возможность того, что ДНК матрица диссоциировала из комплекса, реакционная смесь после синтеза была обработана РНКазой Н. При обработке реакционных смесей РНКазой Н перед нанесением на гель-фильтрационную колонку пРНК, выходящая вместе с РНКП, деградировала, указывая на то, что она находится в дуплексе с ДНК. Итак, РНК, ДНК и РНК-полимераза остаются вместе по окончании

синтеза пРНК, образуя комплекс, который можно назвать праймосомой, так как он служит в праймировании репликации.

Для установления природы комплекса, образующегося при синтезе пРНК, он был сравнен с подробно описанными в литературе активным (с 20-нуклеотидной РНК) и сдвинутым назад (backtracked) (с 27-нуклеотидной РНК) элонгационными комплексами, полученными при синтезе с А1 промотора фага Т7 (Рис. 9В). Оказалось, что комплекс, образованный после синтеза пРНК (дорожки 11-15), функционально не похож ни на активный (дорожки 1-5), ни на сдвинутый назад (backtracked) (дорожки 6-10) элонгационные комплексы, так как РНК в нем не подвержена пирофосфоролизу, расщеплению GreB фактором, и не может быть удлинена при добавлении нуклеотидов. Наиболее удивительным свойством праймирующего комплекса является чувствительность пРНК к РНКазе Н. В нормальных элонгационных комплексах РНК устойчива к РНКазеН (Рис. 9В, дорожки 5 и 10), так как в районе РНК-ДНК гибрида она полностью закрыта РНК-полимеразой, а на других участках она находится в одноцепочечной форме. Следовательно, нуклеиново-кислотный остов в праймирующем комплексе имеет совершенно другую геометрию, нежели в известных элонгационных комплексах. При обработке комплекса экзонуклеазой III (Ехо Ш), щепящей РНК в дуплексе с ДНК, но, в отличие от РНКазы Н, экзонуклеотически с З'-конца, пРНК также деградировала. Таким образом, З'-конец пРНК в комплексе на УНР экспонирован, то есть комплекс является сдвинутым назад, но, в отличие от нормального сдвинутого назад (backtracked) комплекса, З'-конец РНК остается спарен с матричной цепью ДНК.

Таким образом, остановку транскрипции при синтезе пРНК нельзя отнести ни к терминации, ни к паузе транскрипции по известному механизму. После окончания синтеза пРНК формируется необычный комплекс, содержащий пРНК, ДНК и РНК-полимеразу, имеющий геометрию отличную от злонгационного комплекса. В праймирующем комплексе З'-конец РНК спарен с матричной ДНК и экспонирован, то есть, тем самым выполнены требования к комплексу, который может праймировать репликацию. 33. Причина остановки РНКП и образования необычного праймнрующего комплекса при синтезе пРНК.

Что же вызывает такое странное поведение РНК-полимеразы?

Рас. 10. Роль РНК-ДНК габрцла 5'-гонютой области пРНК > остановке транскрипции. (А) Продукты транскрипции In vitro на фрагменте 2 УНР к присутствии ATP, СТР, UTP и СТР (дорожка I) или ГГР (дорожка 2). Продукты реакций разделены в денатурирующем 20% ПААГ. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены пРНК и продукт, образующийся при синтезе до конца матрицы (пл.). (В) Комплексы, содержащие 14-иуклеотидные РНК, получены > с использованием РНКП, иммобилизованной на Ni-NTA агарозе, в присутствии СрА, СТР, UTP н GTP (дорожки 4-6) или ГГР (дорожки 1-3). Транскрипция производилась на мугаггном фрагменте 2 УНР, на котором можно получить 14-нуклеотцдную РНК при синтезе в отсутствие АТР. Полученные комплексы были отмыты транскрипционным б)фером, после чего к ним были добавлены пирофосфат (дорожки 2 и 5) или РНКаза Н (дорожки 3 и 6). Продукты реакций разделены в деютурирующем 20% ПААГ. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены 14-нуклеотадиые РНК.

Из структуры УНР видно (Рис. 5), что задний край транскрипционого пузыря при удлинении РНК дальше 8 нуклеогидов, фактически отсутствует, а в положениях 2, 3, 4 пРНК находятся гуанозины, стабилизирующие гибрид. Это заставляет предположить, что, возможно, нерасплетание РНК-ДНК гибрида позади полимеразы и приводит к возникновению необычного элонгациониого комплекса. Чтобы. проверить это предположение, в реакцию синтеза лРНК вместо гуанозин S'-трифосфата был добавлен инозин 5'-трифосфат, образующий с цитозином всего две Уотсон-Криковских связи. Оказалось, что при этом остановки транскрипции после синтеза 18-20 нуклеотидов не происходит, напротив, синтез продолжается до конца матрицы (Рис. 10А). Аналогичный эффект был получен на мутантной матрице, в которой цитозины в положениях+2, + 3, +4 относительно старта транскрипции были заменены на аденозины, что приводило к встраиванию трех уридинов вместо гуанозинов в начале пРНК. Эти результаты показывают, что остановка транскрипции при синтезе лРНК происходит только в случае «сильного» РНК-ДНК гибрида в 5*-области лРНК, что подтверждает гипотезу о том, что нерасплетание РНК-ДНК гибрида в процессе синтеза (или восстановлении по окончании синтеза) является причиной прекращения транскрипции.

Вероятно, прочитывание до конца матрицы в присутствии инозина происходит из-за образования нормального элонгационного комплекса после удлинения РНК дальше 7 нуклеотидов. Чтобы доказать это, были сравнены искуственно остановленные комплексы, содержащие 14-нуклеотидные РНК, полученные в присутствии GTP и 1ТР. Оказалось, что

РНК в комплексе, полученная в присутствии инозина, устойчива к обработке РНКазойН, но подвержена пирофосфоролизу (Рис. 10В, дорожки 1-З) что говорит о том, что этот комплекс является нормальным элонгаиионным комплексом. В то же время 14-нуклеотидный комплекс с РНК, содержащей GMP, является неактивным в реакции шфофосфоролиза и подвержен расщеплению РНКазой Н, то есть напоминает премирующий комплекс с 18-нуклеотидной РНК (Рис. 10В, дорожки 4-6, Рис. 11В, дорожки 13-16).

Чтобы напрямую продемонстрировать, что 5'-конец РНК остается спаренным с ДНК-матрицей, транскрипция была инициирована с динуклеотида СрА, модифицированного по S'-концу химической группой, способной пришиваться к ДНК. Комплексы были остановлены в положениях +7, +10, +12 и +14 в условиях неполного набора нуклеотидов в присутствии GTP или ПР. Как видно из Рис. НА, дорожки 1, 2, 9, 10 в элонгационном комплексе, содержащем 7 нуклеотидную РНК, 5'-конец находится в контакте с ДНК, как в комплексе, содержащем GMP, так и IMP. При удлинении РНКдо 10 нуклеотидов в 1МР-комплексе, как и ожидалось, 5'-конец РНК теряет контакт с ДНК, о чем можно судить по исчезновению РНК-ДНК сшивки (дорожки 11 и 12). Однако, в GMP-комплексе сшивка РНК с ДНК остается, что свидетельствует о спаренности 5'-конца РНК с ДНК (дорожки 3 и 4). При удлинении РНК далее, до 12 и 14 нуклеотидов, в 1МР-комплексах сшивка не появлялась, однако в GMP-комллексах оставалась, причем эффективность сшивки не уменьшалась. Таким образом, усиленный G:C парами РНК-ДНКгибрид не расплетается позади РНКП при синтезе пРНКнаУНР фага М13.

Итак, остановка транскрипции на УНР после синтеза 18-20 нуклеотидов происходит из-за нерасплетания РНК-ДНК гибрида позади РНК-полимеразы. Каким образом это приводит к образованию необычного праймирующего комплекса, не совсем ясно, однако возможно следующее объяснение. В районе переднего и заднего краев транскрипционного пузыря ДНК испытывает сильные изломы в сторону от РНК-полимеразы (Korzheva et aL, 2000). В свою очередь, РНК-ДНК гибрид, представленный А-формой двойной спирали, устойчив к изгибам и представляет собой «палочку», находящуюся между ДНК изломами и спрятанную внутри полимсразы. Поддержание определенной длины РНК-ДНК гибрида обусловлено некоторыми белковыми структурами, дестабилизирующими гибрид и направляющими 5'-конец РНК в специальный канал (Westover et аЦ 2004). Матричная же цепь ДНК уводится от РНК восстанавливающимся задним дуплексом ДНК. При отсутствии заднего дуплекса ДНК только белковых взаимодействий может быть недостаточно для расплетания РНК-ДНК гибрида, что, в свою очередь, должно приводить к возникновению удлиненного гибрида.

Нерасплетание РНК-ДНК гибрида, по-видимому, приводит к стерическому столкновению задней части гибрида с близлежащими доменами РНКП. При дальнейшем удлинении РНК напряжение в элонгационном комплексе нарастает, что в конце концов приводит к перестройке элонгационного комплекса в необычную праймосому.

NbBBI

CTF т

+7 +14 ♦U »14 « ♦14 Ш +14

- + - + • + - + -+ - + - + • +

—7 *

■мвк «жр 11т,

ИГР

PFI

РНКиаН

■FHK{ - - т -

М-»-» ---

-14»,

1 1 4 5 4 J I 9 14111213141514

Рис. 11. 5'-конщ РНК в ходе синтеза встает спареиным с матричной ДНК. Комплексы, содержащие 7-, 10-, 12- и 14-нуклеотидные РНК получены с использованием РНКП, иммобилизованной на Ni-NTA агарозе, в присутствии GTP (дорожки 1-Х) или ITP (дорожки 9-16). Транскрипция производилась на мутантных фрагментах 2 УНР, на которых можно получить соответствующие РНК при синтезе в отсутствие АТР. Инициировалась транскрипция с динушеотнда, несущего группу, способную в присутствии боргидрцда химически пришиваться к близлежащей ДНК. Полученные комплексы были отмыты транскрипционным буфером, после чего к ним был (четные дорожки) или не был (нечетные дорожки) добавлен боргидрид. Продукты реакций разделены в денатурирующем 20% ПЛАТ. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены РНК продукты и сшитые РНК-ДНК комплексы. (В) Комплексы, содержащие 7-, 10-, 12- и 14-нуклеотноные РНК получены с использованием РНКП, иммобилизованной на Ni-NTA агарозе, на мутантных фрагментах 2 УНР, на которых можно получить соответствующие РНК при синтезе в отсутствие АТР. Инициировалась транскрипция с динуклеотхда СрА. Полученные комплексы были отмыты транскрипционным буфером, после чего к ним были добавлены нуклеотнлы (дорожки 2, б, 10, 14), пирофосфаг (дорожки 3, 7, II, 15) или РНКаза Н (дорожки 4, 8, 12, 16). Продукты реакций разделены в денатурирующем 20% ПЛАТ. Представлен радиоавтограф геля. Обозначены РНК исходных комплексов и пРНК.

Гипотеза о нарастании напряжения, приводящего в конце концов к разрушению элонгационного комплекса, предсказывает постепенное изменение равновесия между комплексом, способным удлиняться далее и комплексом, напоминающим комплекс с пРНК. При синтезе полноразмерной пРНК это равновесие полностью сдвинуто к неактивному комплексу (Рис. 9В). Чтобы проверить эту гипотезу, искусственно остановленные комплексы были проверены на способность к удлинению в присутствии нуклеотидов, к пирофосфоролизу и на чувствительность РНК в этих комплексах к РНКазе Н (Рис. 11В). Как видно, комплексы с 7-нуклеотидной и 10-нуклеотидной РНК полностью соответствуют элонгационным, так как могут быть удлинены в присутствии нуклеотидов,

практически количественно подвержены пирофосфоролизу, и РНК в этих комплексах не расщепляется под действием РНКазы Н (Рис, 11В, дорожки 1-8). 14-нуклеотидный комлекс, как говорилось, напоминает комплекс с полноразмерной пРНК, так как лишь незначительная часть комплексов способна продолжить синтез, или осуществить пирофосфоролиз, РНК при этом расщепляется под действием РНКазы Н (Рис. 11В, дорожки 13-16). Это свидетельствует о том, что в комплексах с 14-нуклеотидной РНК равновесие уже сдвинуто в сторону неактивных комплексов. Удивительным поведением обладает 12-нуклеотидный коплекс: тогда как РНК может быть удлинена в присутствии нуклеотидов и расщеплена в присутствии пирофосфата, она уже подвержена расщеплению РНКазой Н (Рис. 11В, дорожки 9-12). На основе этого эксперимента нельзя сказать, является ли 12-нуклеотидный комплекс промежуточным по свойствам или же существует равновесие между двумя разными комплексами, активным и неактивным, однако существенно не сдвинутое в ту или иную сторону. Так или иначе, это подтверждает гипотезу о постепенном изменении свойств комплекса с удлинением РНК.

Строго определенная длина РНК-ДНК гибрида довольно давно считается условием стабильности элонгационного комплекса, однако полагается, что именно длина не менее 7 нуклеотидов является определяющим фактором. В настоящей работе продемонстрировано, что удлинение гибрида также приводит к дестабилизации комплекса, указывая на то, что стабильность элонгационного комплекса определяется не только термодинамической стабильностью РНК-ДНК гибрида, но и геометрией нуклеиновых кислот в элонгационном комплексе, в данном случае при переходе от инициации к элонгации.

Полученные данные косвенно свидетельствуют о важности заднего дуплекса ДНК в поддержании правильной геометрии задней части транскрипционного пузыря. Можно предположить, что расплетание РНК-ДНК дуплекса обусловлено не только белковыми структурами, отводящими РНК в РНК-выводящий канал, но и задним дуплексом ДНК, уводящим матричную цепь в противоположном направлении.

Результаты настоящей работы свидетельствуют, что З'-конец РНК в премирующем комплексе на УНР фага М13 спарен с матричной ДНК и экспонирован из РНК-полимеразы. Таким образом, требования к олигонуклеотиду, необходимые для того, чтобы он служил праймером для ДНК репликации, в этой системе выполнены. Остается неясным, может ли ДНК-полимераза Ш узнать пРНК в комплексе с РНК-полимеразой, или же РНК-полимераза должна быть активно вытеснена из праймосомы.

Изученный в этой работе механизм синтеза РНК-праймера для репликации одноцепочечной ДНК бактериофага М13, возможно, является общим для некоторых

эписом и бактериофагов, имеющих в цикле размножения одноцепочечную форму ДНК (например, фактор конъюгации Б). Аналогичные по структуре УНР описаны для множества плазмид, в том числе и для фактора Б. Описанный механизм остановки транскрипции при синтезе пРНК может также использоваться при транскрипции на двуцепочечной ДНК. Например, известно, что РНК II, синтезирующаяся при инициации репликации плазмиды Со1Е1, специфически взаимодействуя с нематричной цепью ДНК в районе УНР репликации, предотвращает схлопывание заднего края транскрипционного пузыря, возможно, обуславливая этим остановку транскрипции.

Выводы.

1. а70 -субъединица остается связанной с корферментом при переходе от инициации к элонгации на 1аеи¥5 промоторе благодаря специфическому взаимодействию района 2 с последовательностью нематричной цепи начально-транскрибируемой области, что приводит к возникновению паузы транскрипции в положении +17.

2.Присутствие района 1.1 необходимо для связывания а70-субъединицы с корферментом в элонгационном комплексе в области последовательности, вызывающей паузу транскрипции.

3.Узнавание участка начала репликации минус цепи бактериофага М13 является независимым от а70-Субьединицы и осуществляется корферментом РНК-полимеразы за счет взаимодействия правой шпильки участка начала репликации с каналом корфермента, ответственным за связывание переднего дуплекса ДНК.

4. Корферментспособен специфически инициировать абортивный синтез динуклеотида на участке начала репликации М13. Для образования тринуклеотида необходим район 3.2

Дальнейшее удлинение тринуклеотида является независимым от

субъединицы.

5. Остановка транскрипции при синтезе пРНК на участке начала репликации минус цепи бактериофага М13 происходит из-за нерасплетания РНК-ДНК гибрида позади РНК-полимеразы, что приводит к образованию необычного праймируюшего комплекса, содержащего РНК-полимеразу, ДНК матрицу и праймерную РНК, 3*-конец которой спарен с матричной ДНК и экспонирован.

Список опубликованных работ

Zenkin N. Severinov К. (2004). The role of RNA polymerase a subunit in promoter-independent initiation oftranscription. Proc Natl Acad Sci U S A 101,4396-4400

Brodolin K., Zenkin N., Mustaev A., Mamaeva D., Heumann H. (2004). cr70 subunit of RNA polymerase induces /aeUV5 promoter-proximal pausing oftranscription. Nat Struct Mol Biol 11, 551-7

Adelman K., Yuzenkova J., La Porta A., Zenkin N., Lee J., Lis J., Borukhov S., Wang M., Severinov K. (2004). Molecular mechanism of transcription inhibition by antibiotic Microcin J25. Mol Cell 14, 753-62

№ 1682*

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 13.09.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 968. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зенкин, Николай Сергеевич

Оглавление.

Актуальность темы.

Цель работы и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность.

Структура и объём работы.

1. Обзор литературы.

1.1 Промоторы.

1.2 а-субъединицы.

1.3 Структура холофермента.

1.4 Функции доменов а-субъединицы.

1.4.1. Район 1.

1.4.2. Район 2.

1.4.3. Районы 2.5 и 3.

1.4.4. Район 4.

1.5 Детерминанты узнавания ДНК РНК-полимеразой.

1.5.1. Матрицы с одноцепочечными поли-dC 3'-концами (tailed template).

Гетеродуплексные матрицы (bubble).

Промоторы с дефектами в двойной спирали.

Одноцепочечные ДНК олигонуклеотиды.

Естественные гетеродуплексные промоторные элементы: участки начала репликации {УHP) некоторых плазмид и нитчатых бактериофагов.

1.6 Абортивная инициация.

1.7 Путь от узнавания промотора до ухода в элонгацию - структурная модель

1.8 Диссоциация а-субъединицы.

1.9 Бесфакторная регуляция транскрипции.

1.10 Влияние конформации ДНК на силу промотора.

1.11 Взаимовлияние промоторов.

2. Материалы и методы.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Бактериальные среды.

2.3. Электрофорез.

2.4. Компетентные клетки и трансформация бактерий.

2.5 Коньюгация бактерий.

2.6 Заражение клеток бактериофагом М13.

2.6 Белки.

2.8 Приготовление а -субъединицы и фрагментов а-субъединицы.

2.9. Приготовление РНК-полимеразы из клеток.

2.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.11. Направленный ПЦР-мутагенез.

2.12. Транскрипция in vitro.

2.12.1. Транскрипция с lacUVS промотора.

2.12.2. Транскрипция с Т7А1 промотора.

2.12.3. Транскрипция на УНР М13.

2.13 ДНК-белковая сшивка формальдегидом.

2.14 Футпринтинг ДНКазой 1.

2.15 Аффинное мечение РНКП.

2.16 ДНК-белковая и белок-белковая сшивки в элонгационных комплексах.

2.17 Расщепление РНК гидроксильными радикалами.

2.18 Гель-фильтрация реакционных смесей после синтеза пРНК.

3. Результаты и обсуждение.

3.1 Изучение механизма воникновения паузы транскрипции при переходе от инициации к элонгации на промоторе lacUVS.

3.1.1. Введение.

3.1.2. Комплекс в состоянии паузы является элонгационным, сдвинутым назад (backtracked).

3.1.3. Пауза транскрипции в положении +17- явление, зависящее от а -субъединицы.

3.1.4. Пауза транскрипции в положении +17 возникает благодаря специфическому взаимодействию а70-субъединицы с ДНК.

3.1.5. Положение формальдегидной сшивки а70-субъединицы на ДНК.

3.1.6. Последовательность района 2 а-субъединицы важна для образования паузы.

3.1.6. Детерминанты взаимодействия ст70-субъединицы с корферментом в элонгационном комплексе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Неканонические комплексы РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами"

3.2.2. Роль SSB в узнавании УНР.112

3.2.3. Предполагаемые -10 и -35 районы УНР не играют роли в узнавании.114

3.2.4. а -субъединица необходима для синтеза пРНК, но не нужна для узнавания УНР.116

3.2.5. ст70-субъединица важна на стадии синтеза тринуклеотида.118

3.2.6. Роль района 3.2 <т70-субъединицы в транскрипции пРНК.124

3.2.7. Функция в синтезе пРНК является общей для а-факторов а70-семейства.125

3.2.8. Место связывания шпильки УНР в корферменте.127

3.2.9. Заключение.129

3.3 Изучение механизма формирования РНК-праймера для репликации одно цепочечного генома бактериофага М13.132

3.3.1. Введение.132

3.3.2. После остановки синтеза РНК-полимераза продолжает быть связанной с РНК и ДНК, образуя необычный элонгационный комплекс. .132

3.3.3. Причина образования необычного элонгационного комплекса при синтезе пРНК.137

3.3.4. Расположение РНК-ДНК гибрида в РНК-полимеразе.147

3.3.5. Заключение.149

Выводы.151

Список сокращений.152

Список литературы.153

Список опубликованных работ.177

Актуальность темы.

Инициация транскрипции является наиболее сложно регулируемым процессом транскрипционного цикла. Несмотря на опубликование кристаллической структуры холофермента РНК-полимеразы (Vassylyev et al., 2002), инициация остается наименее изученным этапом транскрипции. Одними из наиболее важных вопросов, на которые не получено ответов, являются вопросы о функциях а-субъединицы и механизме перехода от инициации транскрипции к элонгации.

Известно, что а-субъединица необходима для узнавания и плавления промоторов, также считается, что а-субъединица диссоциирует из комплекса с РНК-полимеразой после синтеза РНК длиной 7-11 нуклеотидов. Однако, в последнее время начали появляться данные о неизвестных прежде свойствах ст-субъединицы. Например, было показано, что при переходе от инициации к элонгации а-субъединица может не диссоциировать, оставаясь связанной с элонгационным комплексом (Bar-Nahum and Nudler, 2001, Mukhopadhyay et al., 2001). С другой стороны, из структурных данных видно, что а-субъединица может принимать непосредственное участие в абортивном синтезе (Vassylyev et al., 2002). Эта информация свидетельствует о гораздо более сложной роли, которую играет а-субъединица в инициации транскрипции и переходе к элонгации.

Цель работы и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение роли а-субъединицы в инициации транскрипции и при переходе от инициации к элонгации. В задачи данного исследования входило:

1) Изучить механизм возникновения паузы транскрипции при переходе от инициации к элонгации на lacUVS промоторе.

2) Изучить роль <т70-субъединицы в синтезе РНК-полимеразой E.coli праймера для инициации репликации генома бактериофага М13.

3) Изучить механизм формирования праймера для репликации генома бактериофага М13.

Научная новизна и практическая ценность. ф В работе исследованы новые, неизвестные прежде функции ст-субъединицы.

Изучен механизм возникновения паузы транскрипции при переходе от инициации к элонгации на промоторе lacUV5. Показано, что за возникновение паузы ответственны взаимодействия с нематричной цепью ДНК ст -субъединицы, не диссоциировавшей из комплекса с РНК-полимеразой после ухода с промотора. Предложен новый механизм регуляции транскрипции с помощью ст-зависимых пауз, возникающих при переходе к элонгации.

Подробно изучен механизм инициации репликации бактерофага М13 клеточной РНК-полимеразой. Показано, что в этой системе а70-субъединица не участвует в узнавании промотора, осуществляемом полностью корферментом, но необходима для перехода от абортивной инициации к элонгации. Предложенный в ^ работе механизм действия ст70-субъединицы может являться общим для инициации с бактериальных промоторов. Показано, что образование праймера определенной длины происходит в результате формирования необычного праймирующего комплекса, возникающего из-за нерасплетания РНК-ДНК гибрида позади полимеразы. Сравнение известных данных с данными, полученными в этой работе, указывает на возможность использования описанного механизма другими бактериофагами, а также эписомами бактерий.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 176 страницах машинописного текста и содержит 34 рисунка. Библиография включает в себя 190 названий.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Зенкин, Николай Сергеевич

Выводы.

1. а70 -субъединица остается связанной с корферментом при переходе от инициации к элонгации на lacUV5 промоторе благодаря специфическому взаимодействию района 2 с последовательностью нематричной цепи начальнотранскрибируемой области, что приводит к возникновению паузы транскрипции в положении +17.

ЧЛ

2. Присутствие района 1.1 необходимо для связывания а -субъединицы с корферментом в элонгационном комплексе в области последовательности, вызывающей паузу транскрипции.

3. Узнавание участка начала репликации минус цепи бактериофага Ml3 является независимым от ст70-субъединицы и осуществляется корферментом РНК-полимеразы за счет взаимодействия правой шпильки участка начала репликации с каналом корфермента, ответственным за связывание переднего дуплекса ДНК.

4. Корфермент способен специфически инициировать абортивный синтез динуклеотида на участке начала репликации М13. Для образования тринуклеотида

70 необходим район 3.2 а -субъединицы. Дальнейшее удлинение тринуклеотида является независимым от ст70-субъединицы.

5. Остановка транскрипции при синтезе пРНК на участке начала репликации минус цепи бактериофага М13 происходит из-за нерасплетания РНК-ДНК гибрида позади РНК-полимеразы, что приводит к образованию необычного праймирующего комплекса, содержащего РНК-полимеразу, ДНК матрицу и праймерную РНК, 3'-конец которой спарен с матричной ДНК и экспонирован.

33.5. Заключение.

Строго определенная длина РНК-ДНК гибрида довольно давно считается ® условием стабильности элонгационного комплекса, однако полагается, что именно длина не менее 7 нуклеотидов является определяющим фактором. В настоящей работе продемонстрировано, что удлинение гибрида также приводит к дестабилизации комплекса, указывая на то, что стабильность элонгационного комплекса определяется не только термодинамической стабильностью РНК-ДНК гибрида, но и геометрией нуклеиновых кислот в элонгационном комплексе, в данном случае при переходе от инициации к элонгации.

Полученные данные косвенно свидетельствуют о важности заднего дуплекса ДНК в поддержании правильной геометрии задней части транскрипционного пузыря. Можно предположить, что расплетание РНК-ДНК дуплекса обусловлено не только белковыми структурами, отводящими РНК в РНКвыводящий канал, но и задним дуплексом ДНК, уводящим матричную цепь в противоположном направлении.

Результаты настоящей работы свидетельствуют, что 3'-конец РНК в праймирующем комплексе на УНР фага М13 спарен с матричной ДНК и экспонирован из РНК-полимеразы. Таким образом, требования к олигонуклеотиду, необходимые для того, чтобы он служил праймером для ДНК репликации, в этой системе выполнены. Остается неясным, может ли ДНК-полимераза Ш узнать пРНК в комплексе с РНК-полимеразой, или же РНК полимераза должна быть активно вытеснена из праймосомы.

Изученный в этой работе механизм синтеза РНК-праймера для репликации одноцепочечной ДНК бактериофага М13, возможно, является общим для некоторых эписом и бактериофагов, имеющих в цикле размножения одноцепочечную форму ДНК (например, фактор конъюгации F). Аналогичные по структуре УНР описаны для множества плазмид, в том числе и для фактора F. Описанный механизм остановки транскрипции при синтезе пРНК может также использоваться при транскрипции на двуцепочечной ДНК. Например, известно, что РНК П, синтезирующаяся при инициации репликации плазмиды ColEl, специфически взаимодействуя с нематричной цепью ДНК в районе участка начала репликации, предотвращает схлопывание заднего края транскрипционного пузыря, возможно, обуславливая этим остановку транскрипции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зенкин, Николай Сергеевич, Москва

1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Баев А.А., Скрябин К.Г. (ред.), М.: Мир

2. Aiyar, S. Е., Gourse, R. L., and Ross, W. (1998). Upstream A-tracts increase bacterial promoter activity through interactions with the RNA polymerase alpha subunit. Proc Natl Acad Sci U S A 95,14652-14657.

3. Aiyar, S. E., Helmann, J. D., and deHaseth, P. L. (1994). A mismatch bubble in double-stranded DNA suffices to direct precise transcription initiation by Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem 269,13179-13184.

4. Arthur, Т. M., and Burgess, R. R. (1998). Localization of a sigma70 binding site on the N terminus of the Escherichia coli RNA polymerase beta' subunit J Biol Chem 273,3138131387.

5. Ayers, D. G., Auble, D. Т., and deHaseth, P. L. (1989). Promoter recognition by Escherichia coli RNA polymerase. Role of the spacer DNA in functional complex formation. J Mol Biol 207,749-756.

6. Bartlett, M. S., Thomm, M., and Geiduschek, E. P. (2000). The orientation of DNA in anarchaeal transcription initiation complex. Nat Struct Biol 7,782-785.

7. Bentley, S. D., Chater, K. F., Cerdeno-Tarraga, A. M., Challis, G. L., Thomson, N. R.,

8. James, K. D., Harris, D. E., Quail, M. A., Kieser, H., Harper, D., et al (2002). Completegenome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3 (2). Nature 417,141.147.

9. Bracco, L., Kotlarz, D., Kolb, A., Diekmann, S., and Buc, H. (1989). Synthetic curved DNA sequences can act as transcriptional activators in Escherichia coli. Embo J 8,42894296.

10. Breslauer, K. J., Frank, R., Blocker, H., and Marky, L. A. (1986). Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A 83,3746-3750.

11. Brodolin К., Zenkin N., Mustaev A., Mamaeva D., Heumann H. (2004). ст70 subunit of RNA polymerase induces lacUV5 promoter-proximal pausing of transcription. Nat Struct Mol Biol // (in press)

12. Buck, M., Gallegos, M. Т., Studhohne, D. J., Guo, Y., and Gralla, J. D. (2000). The bacterial enhancer-dependent sigma(54) (sigma(N)) transcription factor. J Bacteriol 182, 4129-4136.

13. Burgess, R. R., Travers, A. A., Dunn, J. J., and Bautz, E. K. (1969). Factor stimulating transcription by RNA polymerase. Nature 221,43-46.

14. Burns, H., and Minchin, S. (1994). Thermal energy requirement for strand separation during transcription initiation: the effect of supercoiling and extended protein DNA contacts. Nucleic Acids Res 22,3840-3845.

15. Bushnell, D. A., Westover, K. D., Davis, R. E., and Kornberg, R. D. (2004). Structural basis of transcription: an RNA polymerase II-TFIIB cocrystal at 4.5 Angstroms. Science 303,983-988.

16. Callaci, S., Heyduk, E., and Heyduk, T. (1999). Core RNA polymerase from E. coli induces a major change in the domain arrangement of the sigma 70 subunit. Mol Cell 3, 229-238.

17. Caramori, Т., and Galizzi, A. (1998). The UP element of the promoter for the flagellin gene, hag, stimulates transcription from both SigD- and SigA-dependent promoters in Bacillus subtilis. Mol Gen Genet 258, 385-388.

18. Carpousis, A. J., and Gralla, J. D. (1980). Cycling of ribonucleic acid polymerase to• produce oligonucleotides during initiation in vitro at the lac UV5 promoter. Biochemistry 19,3245-3253.

19. Daube, S. S., Hart, C. R., and von Hippel, P. H. (1994). Coupling of RNA displacement and intrinsic termination in transcription from synthetic RNA.DNA bubble duplex constructs. Proc Natl Acad Sci U S A 91,9539-9543.

20. Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., and Bujard, H. (1986). Promoters of Escherichiacoli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. Embo J 5,2987-2994.

21. Dombroski, A. J. (1997). Recognition of the -10 promoter sequence by a partialpolypeptide of sigma70 in vitro. J Biol Chem 272,3487-3494.

22. Dombroski, A. J., Walter, W. A., Record, M. Т., Jr., Siegele, D. A., and Gross, C. A.1992). Polypeptides containing highly conserved regions of transcription initiation factorsigma 70 exhibit specificity of binding to promoter DNA. Cell 70, 501-512.

23. Drew, H. R., Weeks, J. R., and Travers, A. A. (1985). Negative supercoiling inducesspontaneous unwinding of a bacterial promoter. Embo J 4,1025-1032.

24. Dvir, A. (2002). Promoter escape by RNA polymerase П. Biochim Biophys Acta 1577,208.223.

25. Ellinger, Т., Behnke, D., Bujard, H., and Gralla, J. D. (1994). Stalling of Escherichia coli RNA polymerase in the +6 to +12 region in vivo is associated with tight binding to consensus promoter elements. J Mol Biol 239,455-465.

26. Elliott, Т., and Geiduschek, E. P. (1984). Defining a bacteriophage T4 late promoter: absence of a "-35" region. Cell 36,211-219.

27. Erickson, J. W., and Gross, C. A. (1989). Identification of the sigma E subunit of Escherichia coli RNA polymerase: a second alternate sigma factor involved in high-temperature gene expression. Genes Dev 3,1462-1471.

28. Fang, M., and Wu, H. Y. (1998). A promoter relay mechanism for sequential gene activation. J Bacteriol 180,626-633.

29. Fraser, С. M., Gocayne, J. D., White, O., Adams, M. D., Clayton, R. A., Fleischmann, R.• D., Bult, C. J., Kerlavage, A. R., Sutton, G., Kelley, J. M., and et al. (1995). The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science 270,397-403.

30. Gnatt, A. L., Cramer, P., Fu, J., Bushnell, D. A., and Kornberg, R. D. (2001). Structural basis of transcription: an RNA polymerase П elongation complex at 3.3 A resolution. Science 292, 1876-1882.

31. Gross, С., Lonetto, M., and Losick, R. (1998a). Bacterial sigma factors. In• Transcriptional Regulation (Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. 126-176.

32. Gross, C. A., Chan, C., Dombroski, A., Gruber, Т., Sharp, M., Tupy, J., and Young, B. (1998b). The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63,141-155.

33. Guo, Y., and Gralla, J. D. (1998). Promoter opening via a DNA fork junction binding• activity. Proc Natl Acad Sci U S A 95,11655-11660.

34. Hansen, U. M., and McClure, W. R. (1980). Role of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase in initiation. П. Release of sigma from ternary complexes. J Biol Chem 255,9564-9570.

35. Harley, С. В., and Reynolds, R, P. (1987). Analysis of E. coli promoter sequences. Nucleic Acids Res 15,2343-2361.

36. Hawley, D. К., and McClure, W. R. (1983). Compilation and analysis of Escherichia colipromoter DNA sequences. Nucleic Acids Res 11,2237-2255.

37. Heldwein, E. E., and Brennan, R. G. (2001). Crystal structure of the transcriptionactivator BmrR bound to DNA and a drug. Nature 409,378-382.

38. Helmann, J. D., and Chamberlin, M. J. (1988). Structure and function of bacterial sigmafactors. Annu Rev Biochem 57,839-872.

39. Helmann, J. D., and deHaseth, P. L. (1999). Protein-nucleic acid interactions during open complex formation investigated by systematic alteration of the protein and DNA binding partners. Biochemistry 38,5959-5967.

40. Hsu, L. M., Vo, N. V., and Chamberlin, M. J. (1995). Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB stimulate promoter escape and gene expression in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 92,11588-11592.

41. Jensen, P. R., and Hammer, K. (1998). The sequence of spacers between the consensus sequences modulates the strength of prokaryotic promoters. Appl Environ Microbiol 64, 82-87.

42. Kabata, H., Kurosawa, O., Arai, I., Washizu, M., Margarson, S. A., Glass, R. E., and Shimamoto, N. (1993). Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science 262, 1561-1563.

43. Kadesch, T. R., and Chamberlin, M. J. (1982). Studies of in vitro transcription by calf thymus RNA polymerase П using a novel duplex DNA template. J Biol Chem 257,52865295.

44. Kaguni, J. M., and Kornberg, A. (1982). The rho subunit of RNA polymeraseholoenzyme confers specificity in priming M13 viral DNA replication. J Biol Chem 257, 5437-5443.

45. Kammerer, W., Deuschle, U., Gentz, R., and Bujard, H. (1986). Functional dissection of Escherichia coli promoters: information in the transcribed region is involved in late steps of the overall process. Embo J 5,2995-3000.

46. Krummel, В., and Chamberlin, M. J. (1989). RNA chain initiation by Escherichia coli• RNA polymerase. Structural transitions of the enzyme in early ternary complexes. Biochemistry 28,7829-7842.

47. Krummel, В., and Chamberlin, M. J. (1992). Structural analysis of ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase. Deoxyribonuclease I footprinting of defined complexes. J Mol Biol 225,239-250.

48. Kulbachinskiy, A., Mustaev, A., Goldfaib, A., and Nikiforov, V. (1999). Interaction with free beta1 subunit unmasks DNA-binding domain of RNA polymerase sigma subunit. FEBS Lett 454,71-74.

49. McClure, W. R. (1985). Mechanism and control of transcription initiation in prokaryotes. Annu Rev Biochem 54,171-204.

50. McMahan, S. A., and Burgess, R. R. (1999). Mapping protease susceptibility sites on the

51. Merrick, M. J. (1993). In a class of its own—the RNA polymerase sigma factor sigma 54• (sigma N). Mol Microbiol 10,903-909.

52. Mollegaard, N. E., Buchardt, O., Egholm, M., and Nielsen, P. E. (1994). Peptide nucleic acid.DNA strand displacement loops as artificial transcription promoters. Proc Natl Acad Sci U S A 91,3892-3895.

53. Mooney, R., Landick, R. (2003) Tethering Sigma 70 to RNAP reveals high in vivo activity of sigma factors and sigma 70 dependent pausing at promoter-distal locations. Genes Dev 17,2839-51

54. Mulligan, M. E., Brosius, J., and McClure, W. R. (1985). Characterization in vitro of the effect of spacer length on the activity of Escherichia coli RNA polymerase at the TAC promoter. J Biol Chem 260,3529-3538.

55. Mulligan, M. E., Hawley, D. K., Entriken, R., and McClure, W. R. (1984). Escherichia coli promoter sequences predict in vitro RNA polymerase selectivity. Nucleic Acids Res 12,789-800.

56. Murakami, K. S., and Darst, S. A. (2003). Bacterial RNA polymerases: the wholo story. Curr Opin Struct Biol 13,31-39.

57. Murakami, K. S., Masuda, S., Campbell, E. A., Muzzin, O., and Darst, S. A. (2002a). Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science 296,1285-1290.

58. Nasim, M, Eperon, I., Wilkins, В., Brammar, W. (2004). The activity of a single-stranded promoter of plasmid Collb-P9 depends on its secondary structure. Mol Microbiol 53,405-417

59. Nickels, В., Mukhopadhyay, J., Garrity, S., Ebright, R., Hochschild, A. (2004). The sigma 70 subunit of RNA polymerase mediates a promoter-proximal pause at the lac promoter. Nat Struct Mol Biol 11,544-50

60. Nitta, Т., Nagamitsu, H., Murata, M., Izu, H., and Yamada, M. (2000). Function of the sigma(E) regulon in dead-cell lysis in stationary-phase Escherichia coli. J Bacteriol 182, 5231-5237.

61. Nudler, E., Avetissova, E., Markovtsov, V., and Goldfarb, A. (1996). Transcription processivity: protein-DNA interactions holding together the elongation complex. Science 273,211-217.

62. Ozoline, O., Deev, A., Arkhipova, M., Chasov, V., Travers, A. (1999). Proximal transcribed regions of bacterial promoters have non-random distribution of A/T tracts. Nicleic Acids Res 27, А16Ъ-4П4

63. Ricchetti, M., Metzger, W., and Heumann, H. (1988). One-dimensional diffusion of Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase: a mechanism to facilitate promoter location. 1988 55,4610-4614.

64. Schickor, P., Metzger, W., Werel, W., Lederer, H., and Heumann, H. (1990). Topography of intermediates in transcription initiation of E.coli. EMBO J 9,2215-2220.

65. Schnetz, К., and Wang, J. C. (1996). Silencing of the Escherichia coli bgl promoter: effects of template supercoiling and cell extracts on promoter activity in vitro. Nucleic Acids Res 24,2422-2428.

66. Sentenac, A. (1985). Eukaryotic RNA polymerases. CRC Crit Rev Biochem 18,31-90.

67. Severinov, K., and Darst, S. A. (1997). A mutant RNA polymerase that forms unusualopen promoter complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 13481-13486.

68. Severinov, K., Mustaev, A., Severinova, E., Kozlov, M., Darst, S. A., and Goldfarb, A.1995). The beta subunit Rif-cluster I is only angstroms away from the active center of

69. Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem 270,29428-29432.

70. Severinova, E., Severinov, K., Fenyo, D., Marr, M., Brody, E. N., Roberts, J. W., Chait,

71. В. Т., and Darst, S. A. (1996). Domain organization of the Escherichia coli RNApolymerase sigma 70 subunit. J Mol Biol 263,637-647.

72. Sharp, M. M., Chan, C. L., Lu, C. Z., Marr, M. Т., Nechaev, S., Merritt, E. W.,

73. Severinov, K., Roberts, J. W., and Gross, C. A. (1999). The interface of sigma with core

74. RNA polymerase is extensive, conserved, and functionally specialized. Genes Dev 13,3015-3026.

75. Singer, P., and Wu, W. (1987). Promoter search by Escherichia coli RNA polymerase on a circular DNA template. J Biol Chem 262,14178-14189.

76. Singer, P. Т., and Wu, C. W. (1988). Kinetics of promoter search by Escherichia coli RNA polymerase. Effects of monovalent and divalent cations and temperature. J Biol Chem 263,4208-4214.

77. Sluder, A. E., Price, D. H., and Greenleaf, A. L. (1988). Elongation by Drosophila RNA polymerase П. Transcription of З'-extended DNA templates. J Biol Chem 263,99179925.

78. Steitz, T. A. (2004). The structural basis of the transition from initiation to elongation phases of transcription, as well as translocation and strand separation, by T7 RNA polymerase. Curr Opin Struct Biol 14,4-9.

79. Straney, R., Krah, R., and Menzel, R. (1994). Mutations in the -10 TATAAT sequence of the gyrA promoter affect both promoter strength and sensitivity to DNA supercoiling. J Bacterid 176,5999-6006.

80. Straus, D. В., Walter, W. A., and Gross, C. A. (1987). The heat shock response of E. coli Ш' is regulated by changes in the concentration of sigma 32. Nature 329,348-351.

81. Tabak, H. F., Griffith, J., Geider, K., Schaller, H., and Kornberg, A. (1974). Initiation of deoxyribonucleic acid synthesis. VII. A unique location of the gap in the Ml 3 replicative duplex synthesized in vitro. J Biol Chem 249,3049-3054.

82. Voskuil, M. L, and Chambliss, G. H. (2002). The TRTGn motif stabilizes the transcription initiation open complex. J Mol Biol 322, 521-532.

83. Vuthoori, S., Bowers, C. W., McCracken, A., Dombroski, A. J., and Hinton, D. M.2001). Domain 1.1 of the sigma(70) subunit of Escherichia coli RNA polymerase modulates the formation of stable polymerase/promoter complexes. J Mol Biol 309,561572.

84. Zhang, G., Campbell, E. A., Minakhin, L., Richter, C., Severinov, K., and Darst, S. A. (1999). Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell 98,811-824.

85. Список опубликованных работ

86. Zenkin N., Severinov К. (2004). The role of RNA polymerase о subunit in promoter-independent initiation of transcription. Proc Natl Acad Sci U S A101,4396-4400

87. Brodolin K., Zenkin N., Mustaev A., Mamaeva D., Heumann H. (2004). o70 subunit of RNA polymerase induces lac\TV5 promoter-proximal pausing of transcription. Nat Struct Mol Biol 11,551-7

88. Adelman K., Yuzenkova J., La Porta A., Zenkin N., Lee J., Lis J., Borukhov S., Wang M., Severinov K. (2004). Molecular mechanism of transcription inhibition by antibiotic Microcin J25. Mol Cell 14,753-62

89. Zenkin N., Severinov K. o70-dependent synthesis of primer for M13 DNA replication on promoter-less DNA. FASEB summer research conference «Mechanism and regulation of # prokaryotic transcription»; June 21-26,2003. Saxtons River, Vermont1. Благодарности

Информация о работе

Зенкин, Николай Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Неканонические комплексы РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы