Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности"

003470069

АМЕРХАНОВА Аделаида Михайловна

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ-СИНБИОТИКОВ И

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 4 2Й9

003470069

АМЕРХАНОВА Аделаида Михайловна

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ-СИНБИОТИКОВ И

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный консультант:

доктор биологических наук

профессор Алешкин Владимир Андрианович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Бондаренко Виктор Михайлович

Осипова Ирина Григорьевна Лахтин Владимир Михайлович

Ведущая организация:

Российский Государственный медицинский университет

им. Н.И.Пирогова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится « ^ » 2009 г. в_час.

на заседании диссертационного Совета Д 208.046.01 в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автореферат разослан « > 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук у^^/^С.Ю. Комбарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время становится реальностью нависшая над планетой угроза глобального экологического кризиса, существование в условиях которого приводит к развитию нарушений микробной экологии человека, сопровождающихся возникновением иммунодефицитных состояний, нарушением метаболических процессов и аллергизацией макроорганизма.

Наиболее восприимчивым к этим воздействиям является микробиоценоз кишечника, который реагирует на неблагоприятные факторы задолго до клинических проявлений снижением уровня индигенной микрофлоры и возрастанием содержания условно-патогенных микроорганизмов, т.е. состоянием дисбаланса микрофлоры - дисбиозом ( Куваева И.Б., 1991; ПинегинБ.В., 1984; Воробьев A.A., 1997; Шендеров Б.А, 1998; Коршунов В.М., 2000; Eckburg Р.В., 2005; Бондаренко В.М., 2007). Дисбиотические состояния широко распространены, имеют тяжелые последствия для здоровья, поэтому препараты для коррекции нарушенной микробиоты занимают одно из ведущих мест в комплексной терапии и профилактике заболеваний, при которых регистрируется дисбиоз. Ведущее место среди них принадлежит препаратам на основе микроорганизмов - представителей нормофлоры, что обусловлено их многофункциональным воздействием, включая нормализацию микробиоценоза, иммунного и метаболитного статуса организма, процессов электролитного обмена и т.д. (Поспелова В.В., 2000; Онищенко Г.Г., 2002; Воробьев A.A., 2004; Грачева Н.М., 2004; Мазанкова Л.И., 2004; Новокшенов A.A., Учайкин В.Ф., 2004; Кафарская Л.И., 2005; Осипова И.Г., 2006; Парфенов А.И., 2006; Бондаренко В.М., 2007; Феклисова Л.В., 2007; Лахтин В.М., 2008; Callaway T.R., 2008; Fotiadis C.I., 2008; FrancavillaR., 2008; Myllyoma E., 2008).

В связи с широкой распространенностью дисбиотических состояний важное научное и прикладное значение имеет установление закономерностей, связанных с процессами формирования и стабилизации нормобиоценоза, причин, вызывающих его нарушения. Вместе с тем, в настоящее время наши представления об индигенной микрофлоре в полной мере не отражают как всего многообразия отношений внутри микробного сообщества биотопа, так и его взаимосвязей с макроорганизмом.

Так, рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен учитывать такое явление, как аутогенная сукцессия - последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише (Сукачев В.Н., 1964; Бигон М., Харпер Дж., 1989; Рыбальченко О.В., 2008). В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного - устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии (Разумовский С.М., 1999). Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающего с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального

фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен (Гончарова Г.И., 1982; Козлова Э.П., 1986; Леванова Л.Л., 2003; Rambaud J.C. et al., 2006; Лахтин В.М., 2008).

Важно отметить при этом, что вмешательство неблагоприятных внешних факторов, таких как отсутствие грудного вскармливания, эндогенные инфекции, неблагоприятная экология и пр. могут нарушить естественный ход развития микробиоценоза (Соколова К.Я., 1999; Мухина Ю.Г., 2005; Кафар-ская Л.И., 2006; Smehilova, 2008). Становление микробиоценоза ЖКТ в младенческом возрасте во многом определяет физиологический и иммунный статус организма в будущем, поэтому нарушения в ходе этого процесса требуют коррекции. Конструирование препаратов, представляющих собой ассоциации доминирующих микроорганизмов, которые максимально приближены по составу к естественному микробиоценозу ЖКТ человека в определенный возрастной период, является обоснованным подходом к решению данной актуальной проблемы.

Усиление эффекта применяемых средств можно прогнозировать также от сочетанного использования рационально подобранного состава пробиоти-ческих микроорганизмов, пребиотиков и функционально активных ингредиентов, дефицит которых является следствием дисбиоза (Gibson G.R., 1995; Тутельян В.А., 2002; Лахтин В.М., 2008; Шендеров Б.А., 2008). Такие препараты относятся к группе синбиотиков (Collins M.D., 1999). Данное перспективное направление также открыто для дальнейших исследований.

Таким образом, выбор темы настоящего исследования определяется актуальностью разработки высокоэффективных средств нового поколения для коррекции микроэкологических нарушений у детей и взрослых.

Цель исследования

Научное обоснование, биотехнологическая разработка и клинико-лабо-раторное подтверждение эффективности новых подходов к коррекции дис-биотических нарушений ЖКТ с помощью препаратов-синбиотиков на основе консорциумов бифидобактерий, комплементарных микробиоценозу различных возрастных групп людей, лактобацилл, пребиотиков и функционально значимых ингредиентов, дефицит которых возникает при дисбиозе.

Задачи исследования

1. Изучить биологические, культуральные, физиолого-биохимические и молекулярно-генетические характеристики штаммов бифидобактерий, оценить их производственную перспективность и отобрать виды, которые относятся к основным представителям бифидофлоры ЖКТ человека.

2. Разработать условия совместного культивирования биомассы бифидобактерий, имеющей многовидовой состав.

3. Оптимизировать методы обезвоживания биомассы бифидобактерий и лактобацилл - распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя и сушки-гранулятора в псевдоожиженном слое.

4. Изучить пребиотические и технологические свойства различных растворимых пищевых волокон и оценить перспективность их включения в состав препаратов-синбиотиков.

5. Разработать рецептуру, технологическую документацию, изготовить экспериментально-производственные серии препаратов-синбиотиков. Оценить микробиологические, санитарно-гигиенические характеристики, сохранность всех компонентов препаратов при хранения. Осуществить их санитарно-гигиеническую экспертизу и государственную регистрацию на Федеральном уровне.

6. Изучить эффективность и безопасность разработанных препаратов при использовании в практике профилактической и восстановительной медицины у людей, относящихся к различным возрастным категориям людей.

Научная новизна

Впервые предложен алгоритм рецептуростроения препаратов нормофло-ры, основанный на принципе видового доминирования бифидобактерий в ЖКТ у различных возрастных групп людей (Патенты РФ 2180348, 2180914, 2180915). Разработаны биотехнологические приемы конструирования препаратов-синбиотиков нового поколения «Бифидум-Мульти» и «Нормоспект-рум» на основе консорциумов бифидобактерий, лактобацилл и ингредиентов, обладающих иммуностимулирующим, метаболическим и пребиотическим действием.

Теоретическая значимость

Выявленная в научных исследованиях смена видового состава бифидо-флоры в процессе онтогенеза явилась теоретическим обоснованием нового подхода к конструированию и применению средств коррекции дисбиотичес-ких нарушений ЖКТ - использованию консорциумов микроорганизмов нор-мофлоры, видовой состав которых моделирует сукцессионные ряды, меняющиеся в течение жизни человека. Это обеспечивает их комплементарность микробиоценозам ЖКТ конкретных возрастных групп пациентов и обеспечивает высокую эффективность при применении.

Практическая значимость

Разработаны и внедрены в практику новые оригинальные препараты-син-биотики, высокоэффективные при коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ и дифференцированно подобранные для различных возрастных групп людей. Разработаны новые биотехнологические приемы совместного культивирования консорциумов бифидобактерий. Разработаны методы распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя и сушки-гранулятора в псевдоожиженном слое для получения препаратов с высоким содержанием пробиотических микроорганизмов, длительно сохраняющих жизнеспособность. Подтверждена пребиотическая активность ингредиентов - источников пищевых волокон (порошок клубней топинамбура, цикория, яблочного пектина) и показана их технологическая значимость для увеличения сроков и температурного диапазона хранения препаратов.

Проведенные исследования и разработанные на их основе рецептурный состав, санитарно-гигиенические документы и производственные регламенты позволили обеспечить прохождение процедуры независимой экспертизы продукции и документации и государственной регистрации Федеральной

службой Роспотребнадзора с внесением в Государственный реестр биологически активных добавок к пище:

1. «Бифидум-Мульти-1» для детей от рождения до 3-х лет -СЭЗ № 7.99.03.919.Б.000085.10.05.

2. «Бифидум-Мульти-2» для детей от 3-х до 12-ти лет -СЭЗ № 7.99.03.919.Б.000086.10.05.

3. «Бифидум-Мульти-3» для взрослых -

СЭЗ № 77.99.03.919.Б.000087.10.05 (ТУ 9197-003-38989935-03, изменения к ТУ 9197-003-38989935-03 № 1).

4. « Нормоспектрум® для детей » -СГР № 77.99.23.3.У. 10079.9.05.

5. «Нормоспектрум® для взрослых и детей старше 14-ти лет» -СГР № 77.99.23.3.У. 10080.9.05 - ( ТУ 9197-004-38989935-05).

Впервые организовано производство и начат серийный выпуск перечисленных препаратов на предприятии биотехнологического профиля «Амфита».

Внедрение в практику

Разработанные препараты были использованы с профилактической целью, при включении в комплексную схему терапии ряда заболеваний и для реабилитации пациентов в следующих учреждениях:

1. «Бифидум-Мульти-1» в ГУ « Федеральное агентство высокотехнологичной медицинской помощи Научный Центр Акушерства, гинекологии и перинатологии» с целью профилактики эндогенных и экзогенных инфекций у новорожденных группы риска.

2. «Бифидум-Мульти-1» в условиях детской консультации для профилактики микроэкологических и функциональных нарушений ЖКТ у детей первых 18 месяцев жизни.

3. «Бифидум-Мульти-1» в условиях стационара НИИ детской гастроэнтерологии (г. Нижний Новгород) у детей с нарушениями пищеварения и микрофлоры кишечника.

4. «Бифидум-Мульти-1,2,3» в аллергологическом Центре КНИИЭМ (г. Казань) у детей с аллергодерматозами.

5. «Бифидум-Мульти-2» и «Нормоспектрум для детей» для профилактики острых респираторных заболеваний у часто болеющих детей, посещающих детские дошкольные учреждения.

6. «Бифидум-Мульти-1,2,3» в отделениях детских и взрослых инфекций клинической инфекционной больницы № 1 (г. Москва) для восстановления микрофлоры и функционального состояния ЖКТ у детей и взрослых пациентов с дисбактериозами, возникшими на фоне различных заболеваний.

7. «Нормоспектрум для детей» и «Нормоспектрум для взрослых» в отделениях детских и взрослых инфекций клинической инфекционной больницы № 1 (г. Москва) для восстановления микроэкологии и функционального состояния ЖКТ у детей и взрослых пациентов с дисбактериозами, возникшими на фоне различных заболеваний.

8. «Бифидум-Мульти-1,2» в Оренбургской государственной медицинской академии в комплексной схеме пробиотикотерипии неспецифических вульвовагинитов у девочек.

9. «Нормоспектрум для взрослых» в Федеральном агентстве «НИИ иммунологии» в комплексном лечении аллергических заболеваний (г. Москва).

10. «Нормоспектрум для взрослых» на кафедре гастроэнтерологии ФГУ «УНМЦ» Управления делами Президента РФ в комплексной терапии функциональных заболеваний кишечника (синдром раздраженного кишечника, функциональный запор) с синдромом дисбактериоза.

11. «Нормоспектрум для взрослых» в клинической онкологической больнице № 62 (г. Москва ) для профилактики ГГСИ у больных, оперированных по поводу колоректального рака и в комплексной терапии больных злокачественными лимфопролиферативными заболеваниями.

12. «Нормоспектрум для взрослых» в Астраханской государственной медицинской академии в комплексной схеме терапии язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, гастродуоденита.

Анализ результатов данных исследований приведен в клинических отзывах, актах внедрения, актах клинических наблюдений.

Награды за разработку и внедрение

Получены: знак РОСТЕСТ ГОССТАНДАРТА РОССИИ - За высокое качество с правом маркировки продукции «ЗНАКОМ КАЧЕСТВА «ВСЕ ЛУЧШЕЕ ЗДОРОВЬЮ»; золотая медаль ВВЦ, 2002 г.; золотая медаль им. И.И. Мечникова Российской Академии естесственных наук «За практический вклад в укрепление здоровья нации» - 2003 г.; серебряная медаль III Московского международного салона инноваций в области биотехнологии - 2003 г.; серебряная медаль Всероссийского научно-промышленного форума «Россия-единая - 2003»; золотая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии - 2004 г.; бронзовая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии, 2006 г.; золотая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии, 2008 г.; медаль Международного фонда биотехнологий им. академика И.Н. Блохиной за участие в конкурсе «Биотехнологические проекты для повышения качества жизни человека».

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 1 от 24 января 2008 г.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: Международная научно-практическая конференция «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002), Всероссийский симпозиум «Современные аспекты здорового образа жизни» (Москва, 2003), Всероссийский форум «Великие реки» в рамках конкурса «Биотехнологические проекты для повышения качества жизни человека» (Нижний Новгород, 2003), Международная конференция «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, 2003), 7-й Международный Конгресс «Здоровое питание» (Москва, 2003), Международная научно-практическая конференция «Проби-отики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004), 6-я Международная ас-

7

самблея «Новые медицинские технологии» (Москва, 2006), Международный конгресс «Новые технологии в детском питании» (Москва, 2006), Международный научно-практический конгресс «Человек в экстремальных условиях: здоровье, надежность и реабилитация» (Москва, 2006), Международный симпозиум «Иммунобиологические препараты в педиатрии» (Москва, 2006), Всероссийская конференция детских инфекционистов (Санкт-Петербург, 2006), Международный конгресс «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические проблемы» (Санкт-Петербург, 2007), Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2008, 2009), Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009).

Положения, выносимые на защиту

1. Отбор видов бифидобактерий по признаку доминирования в микробиоценозе ЖКТ различных возрастных групп людей представляет собой новый концептуальный подход к конструированию препаратов для коррекции микрофлоры кишечника.

2. Устойчивые консорциумы - продукт совместного культивирования симбиотической ассоциации технологичных и высокоэффективных видов бифидобактерий являются основой для получения препаратов нового поколения.

3. Распылительная сушка при низкой температуре теплоносителя и сушка-гранулирование в псевдоожиженном слое перспективны для получения высокоактивных препаратов нормофлоры длительного хранения в широком диапазоне температур.

4. Новый концептуальный подход в разработке и принципе рецепту-ростроения оригинальных препаратов-синбиотиков «Бифидум-мульти» и «Нормоспектрум».

5. Преимущества по клинико-лабораторным показателям синбиотиков «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» при использовании в профилактической и восстановительной медицине у разных возрастных групп пациентов по сравнению с аналогичными препаратами моновидового состава.

Публикации

Основное содержание работы отражено в 64 научных публикациях: в статьях, в том числе, в рекомендованных ВАК РФ - 8, в других изданиях - 45, в патентах на изобретение -11.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы из 340 наименований, в том числе, 172 зарубежных и 168 отечественных работ. Диссертация изложена на 280 страницах основного текста, содержит 31 рисунок и 79 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы, объем проведенных исследований

Исследования проведены в 2000-2008 гг. в лаборатории биологии бифи-добактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского в рамках НИР (Per. номер 01.2.006 08847).

Объектами исследований служили: более 300 культур бифидобактерий и лактобацилл, в т.ч.: из международных коллекций - 13; из отечественных коллекций - 40. В ходе работы было выделено и идентифицировано 270 культур бифидобактерий и лактобацилл, из них 40 идентифицировано до вида, 230 - до рода.

Исследования проводились как традиционными методиками, разработанными в лаборатории биологии бифидобактерий (Гончарова Г.И., 1968; Лянная А.М., 1981), так и с помощью модифицированных и новых методов исследования (Жиленкова О.Г., 2004; Воронина О.Л., 2008).

Для исследования антибиотикочувствительности был применен модифицированный диско-диффузионный метод на основе МУК 4.2.1890-04 «Методические рекомендации по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» и рекомендаций Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов, NCCL, 2002 г., США. Использовали диски с антибиотиками производства НИИ ЭМ (Россия, Санкт-Петербург).

Таксономию изолятов устанавливали по морфологическим, культураль-ным, физиологическим и ферментативным свойствам. Для изучения спектра биохимической активности культур применялись коммерческие тест-системы: API-20CHL и API-50CHL (bioMerieux, Франция) и АНАЭРОтест 23 (PLIDA-Lachema diagnostica s.r.o., Чехия).

Видовая идентификация бифидобактерий проводилась молекулярно-био-логическими методами, разработанными группой исследователей под руководством к.б.н. Ворониной О. Л. и к.б.н. Лунина В.Г. (ИНБИ РАН им. А.Н. Баха, ВНИИСБ РАСХН).

Параметры распылительной сушки при низкой температуре теплоносителя изучали на полупромышленной установке «Мобильный Минор», модернизированной для целей данной работы сотрудниками ОАО Биохиммаш к.т.н. Астафьевым Е.И. и к.т.н. Коноваловым Н.А.

Изучение параметров сушки в псевдоожиженном слое проводилось на лабораторной установке, сконструированной сотрудниками ЦКБ «Боеприпасы» к.т.н. Шереметом А.П. и к.т.н. Островским В.Г.

В ходе исследований было изготовлено 143 образца биомассы, высушенной распылительным методом и 117 образцов биомассы, обезвоженной сушкой-гранулированием в псевдоожиженном слое. 112 образцов биомассы в качестве контрольной было высушено сублимационным методом.

Для изучения динамики культивирования - как монокультур, так и культур многовидового состава - произведено 360 образцов КЖ на средах различного состава. В работе применяли стандартные лабораторные и производственные питательные среды, используемые для культивирования, селекции и контроля бифидобактерий и лактобацилл и разработанные нами оригинальные среды на основе растительного сырья (Патент РФ № 2214454).

Содержание жизнеспособных микроорганизмов в образцах определяли методом посева и последующего инкубирования десятикратных разведений КЖ и образцов сухой биомассы и готовых препаратов в полужидких средах.

В ходе подготовки к экспертизе и государственной регистрации изготовлено 36 экспериментально-производственных серий препаратов, изучены их санитарно-гигиенические, микробиологические и технологические параметры, определены сроки и условия хранения.

Исследования в области экспериментальной медицины, представленные в работе, проводились на следующих группах пациентов:

- больные в стационарах инфекционного и гастроэнтерологического профиля - 125 человек в возрасте старше 18-ти лет;

- дети от 4 до 6 лет в детских дошкольных учреждениях - 98 человек;

- дети от 3 месяцев до 14 лет в стационарах гастроэнтерологического и инфекционного профиля - 164 человека;

- новорожденные в отделении перинатологии - 61 человек;

- онкологические больные - 200 человек.

Проведение клинических исследований и анализ полученных результатов осуществлялись на базе КИБ № 1 г. Москвы совместно с сотрудниками клинического отдела МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского под руководством д.м.н., заслуженного деятеля науки, профессора Грачевой Н.М.; на базе обсервационного детского отделения ГУ НЦ АГиП РАМН совместно с зав. отделением. д.м.н., профессором Пономаревой Л.П., к.м.н. Бондарь O.E., зав. лабораторией микробиологии, д.м.н., профессором Анкирской A.C.; в детских дошкольных учреждениях под руководством зав. отделением детских инфекций МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, д.м.н., профессором Фекли-совой JI.B. и к.м.н. Мескиной Е.Р.; на базе хирургического стационара 62-й клинической онкологической больницы совместно с руководителем кабинета клинической фармакологии, д.м.н., профессором Митрохиным С.Д.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием методов вариационной и описательной статистики; для оценки достоверности различий между показателями использовали t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение и отбор производственно-перспективных видов бифидобактерий

Задачей данного раздела работы был отбор штаммов бифидобактерий по признаку видового доминирования в микробиоценозе различных возрастных групп людей. Согласно данным исследований 1960-1980 гг., основными представителями бифидофлоры ЖКТ человека являются В. bifidum, B.longum, В. infantis, В. breve, В. adolescentis (Reuter G., 1963), видовое присутствие и долевое участие которых, вместе с тем, меняется в процессе онтогенеза (Рис. 1).

Виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп; вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. inf antis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста (Biavati В., 1984; Козлова Э.П., 1986), при этом вид В. inf antis данные иссле-

дователи относили к преобладающему, а значит, наиболее значимому для организма в этот возрастной период.

Исследования, проведенные в последнее десятилетие, благодаря открытию высокочувствительных молекулярно-биологических методов, существенно расширили знания в области видового разнообразия бифидобактерий (Satokari R.M., 2000; Reuter G., 2001; Ефимов Б.А., 2005; Шкопоров А.Н., 2007 и др.). Открыто уже 43 вида бифидобактерий (Okamoto М., 2008), но состав видов, являющихся доминантными в ЖКТ человека, по данным ряда авторов (Matsuki Т., 2004; Бондаренко В.М., 2007) не меняется. При этом, результаты ряда исследований приводят к заключению о влиянии неблагоприятной экологии, отсутствия грудного вскармливания и широкого применения заменителей грудного молока в развитых странах на процесс онтогенеза в младенческий период, в том числе, на становление нормофлоры ЖКТ.

Взрослые люди

А

□ 12% аЮ%

I

- . ■■■BhhBShI

щ В. parvulorum и Другие 1 В. bifid um —

_ - ш В. breve В. longum

4- ■ ■ • В. infantis В. adolescentis

Рис. 1. Видовой состав бифидофлоры у людей разных возрастных групп

Так, в ряде европейских странах у обследованных детей отмечалось полное отсутствие вида B.infantis. На этом фоне у детей республики Гана, где в силу экономических причин дети находятся только на грудном вскармливании, бифидобактерии этого вида выделялись в 72% (Young S.L., 2004).

У искусственно вскармливаемых младенцев отмечается пролиферация видов B.adolescentis и B.animalis, нехарактерных для детей этого возраста (Козлова Э.П., 1986; Mah K.W., 2007; Smehilova М., 2008), т.е. идет формированию другого сукцессионного ряда. Таким образом, закономерное формирование микробиоценоза ЖКТ младенца определяется присутствием доминантных видов бифидобактерий (Ventura М., 2007). В связи с представленными данными совершенно очевидно, что для выполнения поставленной задачи - конструирования препаратов, предназначенных для разных возрастных групп людей, видовой спектр бифидобактерий должен быть представ-

11

лен доминантными видами бифидобактерий В. bifidum, В. longum, В. infantis, В. breve, В. adolescentis, как наиболее физиологичными для организма человека в разные периоды жизни. С этой целью были отобраны штаммы, относящиеся к вышеперечисленным видам; для сравнения использовали типовые штаммы из международных коллекций.

Для выбора высокоэффективных и технологичных культур были изучены их морфологические, физиолого-биохимические, культуральные, антагонистические свойства, определен спектр чувствительности к 15 антибиотикам, относящимся к 7 группам антибактериальных препаратов, определена безвредность на лабораторных животных. В результате проведенных исследований отобрано 11 производственно-перспективных штаммов.

Предварительная видовая идентификация в наших исследованиях основывалась на микробиологических и биохимических тестах. Однако неоднозначность результатов, трудоемкость данных методов стимулировали поиск иных подходов для решения поставленных задач.

Анализ литературы показал, что типирование на основе секвенирования одной и более мишеней в геноме бифидобактерий позволяет провести видовую идентификацию штаммов и дифференцировать виды (Новикова H.A., Соколова К.Я., 2004; Шкопоров, 2006; Бондаренко В.М., 2006; Gill S.R., 2006; KazuyoshiN., 2008; NambaK., 2008 и др.). В настоящей работе видовую принадлежность штаммов определяли на основе амплификации и секвенирования фрагментов двух генов: 16S рибосомальной РНК (16S) и трансальдола-зы (tal). Результаты представлены в Табл. 1.

Таблица 1

Видовая идентификация выборки коллекционных штаммов бифидобактерий

№ Штамм бифидобактерий Видовая идентификация по:

Фенотипичес-ким признакам Гену 16S рРНК Гену tal

1. ГКНМ: ГО-13 В. adolescentis В. adolescentis В. adolescentis

2. ГКНМ: Г 75-13 В. adolescentis В. longum/ infantis В. longum

3. ГКНМ: МС-42 В. adolescentis В. longum./ infantis В. breve

4. ГКНМ: 40 В. adolescentis В. adolescentis В. animalis

5. ГКНМ: 536 В. bifidum В. bifidum bifidum

6. ГКНМ: 791 В. bifidum В. bifidum bifidum

7. ГКНМ: 35 В. bifidum. В. bifidum В.breve

8. ГКНМ: JIBA-3 В. bifidum В. bifidum В.breve

9. ГКНМ: 1 В. bifidum В. bifidum В. bifidum clone 1

B. breve clone 2

10. ГКНМ:79-119 В.breve В. breve B.breve

11. ГКНМ:79-88 В. breve В. breve B. breve

12. ГКНМ: 23 В. breve В. breve B. animalis

13. ГКНМ: 73-15 В. infantis В. longum/infantis B. infantis

14. ГКНМ: 11-45 В. infantis В. longum/infantis B. infantis

15. ГКНМ: 302-87 В. infantis В. longum/infantis B. animalis

16. ГКНМ: В379М В. longum. В. longum/inf antis B. longum

17. ГКНМ: 46 В. longum В. longum/infantis B. infantis

18. ГКНМ: Я-3 В. longum B. longum/infantis B. adolescentis

19. ГКНМ: 8 В. longum B. longum/infantis B. breve clone 1

B. animalis clone 2

* Полужирным шрифтом выделены штаммы, идентифицированные одинаково по результатам секвенирования и по фенотипическим признакам

Из данных, представленных в Табл. 1, видно, что различить виды В. longum и В. infantis позволяет только анализ второй мишени, фрагмента гена трансаль-долазы. Результаты генотипирования и фенотипической идентификации совпали для восьми штаммов. В таблице они выделены полужирным шрифтом.

Штаммы ГКНМ: Г75-13 и ГКНМ: 46 идентифицированы иначе, чем по фенотипическим признакам.

Штаммы ГКНМ: МС-42, ГКНМ: 40, ГКНМ: 35, ГКНМ: ЛВА-3, ГКНМ: 23, ГКНМ: 302-87 и ГКНМ: Я-3 оказались природными рекомбинантами. Штаммы ГКНМ: 1 и ГКНМ: 8 - генетически неоднородные.

Проведенный анализ позволяет сделать вывод, что генотипирование по фрагменту 16S рРНК не различает все виды бифидобактерий. Таким образом, предложенный подход - анализ штаммов бифидобактерий и по фрагменту гена трансальдолазы дает более полное представление об их видовых различиях.

Уточненные данные видовой принадлежности позволили провести отбор производственно-перспективных штаммов по признаку видового доминирования в микробиоценозе разных возрастных групп для дальнейших исследований в направлении конструирования ассоциаций бифидобактерий - как основы для препаратов целевого назначения.

2. Изучение динамики глубинного культивирования бифидобактерий в монокультурах и в составе смешанной культуры

2.1. Культивирование монокультур бифидобактерий

В настоящее время в промышленном масштабе производится биомасса только двух штаммов - видов В. bifidum 1, В. adolescentis МС-42. В связи с этим для решения поставленной задачи - создания устойчивых многовидовых консорциумов впервые предстояло изучить кинетику роста разных видов бифидобактерий - сначала в монокультурах, а затем подобрать условия для их совместного культивирования.

В настоящей экспериментальной работе в качестве модели были использованы следующие штаммы: Bifidobacterium bifidum 791, В. breve 79-119, B.infantis 73-15, В. longum В379М, В. adolescentis ГО-13. В качестве среды выращивания использовали ГМ-среду. Начальный рН среды культивирования составлял 6,7. Инокулят вносился в количестве 5% от общего объема сре-

ды. Пробы из ферментера отбирались с интервалом в один час на протяжении всего цикла культивирования и анализировали их по показателям оптичекой плотности, значению числа КОЕ/мл после культивирования, значение активной кислотности. На основании полученных данных рассчитывали удельную скорость роста ц, время генерации g по формулам (Ильницкая И.Ю., 1986):

^ -1ёХох 0,693 ------2,3 и g=-,

и ~ 'о Ц

где: Х( и 11 - концентрация биомассы (оптическая плотность культуры в начале и в конце отрезка времени); 2,3 - коэффициент перехода от десятичных логарифмов к натуральным. Показатели, характеризующие динамику процесса культивирования, представлены на Рис. 2, 3, 4 логарифмическими кривыми.

Рис. 2. Изменение числа КОЕ/мл бифидобактерий

—«—В. Ьгете 79-119 В.|опдит В379М В.ЫИс1ит 791

В.ЫА<*ит 791 —ж—В.айо1е8сепЫ8 7513

Рис. 3. Изменение оптической плотности КЭК

—♦—В. Ьгеиз 79-119 В.!опдит В379М В.ЬИШит 791

В.ЫМит 791 —ж— В.асМюсепНв 7513

Рис. 4. Изменение активной кислотности (рН)

Как видно из представленных данных, в заданных условиях культивирования отсутствовала лаг-фаза. Длительность экспоненциальной фазы составляла у различных культур от 6 до 12 часов. В течение этого времени происходил равномерный прирост биомассы, что подтверждалось наблюдающейся корреляцией нарастания оптической плотности, активной кислотности и числа КОЕ/лл бифидобактерий. При этом для каждой культуры в идентичных условиях была характерна своя динамика роста. Так, для каждого штамма было отмечено свое значение соотношения числа КОЕ/мл к оптической плотности, что связано с морфологическими и физиологическими особенностями каждого штамма.

Было также показано, что большое значение имеет возраст и количество посевного материала: оптимальным вариантом является засев культурой в период экспоненциальной фазы роста. Инокулят, взятый на стационарной фазе роста, задерживает адаптацию и развитие культуры. Интересно отметить, что пост-экспоненциальная фаза роста культуры имеет ступенчатый характер, что можно объяснить продукцией метаболитов, тормозящих рост культуры (Бандоян А.К., 1984; Вахитов Т.Я., 2000, 2006).

Таким образом, полученные нами данные культивирования различных штаммов бифидобактерий показали, что, каждый из них имеет свои особенности культивирования, которые проявляются, прежде всего, в длительности экспоненциальной фазы развития. Если процесс не подвергается искусственной регуляции, пределом развития популяции является содержание бифидобактерий в 1 мл не более lg 9 КОЕ/лел.

2.2. Изучение динамики культивирования бифидобактерий в составе многовидовой ассоциации

Решение данной задачи представляет большую важность как с технологической, так и с медико-биологической точек зрения.

С одной стороны, совместное культивирование существенно удешевляет и упрощает производственный процесс. С другой стороны, принцип консорциума пробиотических штаммов, оказывающих взаимное синергидное действие на этапах изготовления препарата и в условиях последующего персистиро-вания in vivo, должен быть приоритетным в создании микробных биопрепаратов. Правомочность такого подхода подтверждает высокая эффективность препарата «Ацилакт» на основе трех штаммов ацидофильных лактобацилл, сконструированный с учетом межвидового синергизма (Поспелова В.В., 1990).

В эксперименте были использованы те же штаммы бифидобактерий, что и в предыдущем исследовании. Культуры данных штаммов отличаются морфологией колоний, выросших на полужидкой среде, настолько, что была возможна их визуальная дифференциация в составе смешанной популяции. Для проведения совместного культивирования подбирали строго количественно соотношение посевного материала каждого из штаммов. Посев культур проводили поэтапно, с периодичностью в 1 час, регулируя рН культуральной жидкости перед засевом нового штамма. Очередность засева зависела от длительности экспоненциальной фазы роста каждого из штаммов: 1 час - В. longum В379М-, 2 час - В. breve 79-119; 3 час - B.infantis 73-15-, 4 час - В. bifidum 791;

5 час - В. adolescentis ГО-13. Процесс культивирования вели 12 часов при стандартных условиях.

Как видно из представленных на Рис. 5 данных эксперимента, при предложенной схеме внесения посевного материала не происходило взаимного ин-гибирования культур. Кроме того, у отдельных культур (В. breve, В. infantis, В. adolescentis) показатели числа КОЕ/мл были выше, чем при раздельном выращивании, что подтверждает синергидный эффект в консорциуме. Число КОЕ /мл бифидобактерий в консорциуме составило 5,6 х 109, т.е. сумму из числа КОЕ/мл каждой из пяти культур.

сп при совместно и культивирования при раздельном культивирования

Рис. 5. Сравнительные результаты совместного и раздельного культивирования бифидобактерий

Таким образом, исходя из полученных данных, алгоритмом к созданию консорциума бифидобактерий является совместное культивирование определенных штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них, на основании чего определяется временная точка засева питательной среды при поэтапном внесении инокулятов монокультур.

Еще одним преимуществом совместного выращивания явилась лучшая выживаемость в процессе хранения: в консорциуме отдельные виды сохранялись в жизнеспособном состоянии дольше (Рис. 6).

Рис. 6. Сравнительные данные числа КОЕ/мл бифидобактерий в консорциуме и в монокультурах после хранения в течение 15 дней

Полученные результаты говорят не только о возможности совместного культивирования различных видов бифидобактерий, но и синергидном эффекте и большей стабильности при хранении консорциума штаммов, что позволяет решить сложную биотехнологическую задачу получения многокомпонентных пробиотических препаратов, имеющих определенный состав и назначение.

3. Разработка новых производственных приемов обезвоживания биомассы

Используемый в настоящее время для этих целей сублимационный метод требует дорогостоящего оборудования, обладает низкой производительностью и большой энергоемкостью, что и определяет перспективность поисков ' альтернативных методов высушивания.

3.1. Отработка режима распылительного высушивания пробиотических микроорганизмов при низкой температуре теплоносителя

Распылительные сушилки широко применяются в пищевой промышленности, однако, применение для высушивания препаратов на основе вегетативных культур микроорганизмов до настоящего времени весьма ограничено. Это свя-I зано, по-видимому, с недостаточно полным изучением влияния повреждающих факторов при распылительном высушивании на выживаемость микроорганизмов и отсутствием конструктивного решения для эффективного ведения такого I процесса. Негативное воздействие на клетки микроорганизмов начинает проявляться при температурах, превышающих температуру их культивирования, а также при длительном температурном воздействии. Поэтому влияние на клетки микроорганизмов можно свести к минимуму, если поддерживать температуру ( на выходе из сушильной камеры, равную или близкую к 37° С при минимальной экспозиции. Помимо модернизации установки в направлении снижения и сокращения температурного воздействия, был изучен ряд параметров в сравни! тельном аспекте с сублимационным методом. Было показано, что на ход процесса сушки и качество полученных препаратов влияет такой фактор, как возраст культуры и ее морфологическое состояние (Рис. 7).

I-1 Число КОЕ э 1 г сухого препарата % выживших клеток

Рис. 7. Зависимость числа КОЕ/г в высушенных образцах от морфологического состояния культуры

Как видно на Рис. 7, пробы культуральной жидкости, полученные путем глубинного культивирования в ферментере в течение 5 и 7 часов, т.е. во время экспоненциальной фазы роста, высушивались с лучшими показателями числа жизнеспособных клеток и наименьшими потерями - 56,5% ± 3% и 53,6% ± 4% соответственно. Для культуры на третьем часу роста потери были существенными - 85,7% ± 5%. В стационарной фазе роста потери жизнеспособности были наибольшими и составили 90,2% ± 1%. Таким образом, культура в экспоненциальной фазе роста наиболее устойчива к механическим и температурным воздействиям в процессе сушки.

Было показано, что на качестве процесса сказывается и состав среды выращивания. Сравнительный анализ параметров готового продукта - биомассы, | выращенной на производственных и опытных средах, позволил разработать состав среды на основе водного экстракта топинамбура, которая при удовлетворительных показателях остаточной влажности (9,0%) обладала удовлетворительными ростовыми качествами и высушивалась распылительно с содер- | жанием жизнеспособных бифидобактерий ^КОЕ/г 2,4 х 109. I

Не менее важным этапом данного раздела явилось изучение выживаемое- I ти пробиотических микроорганизмов в готовом препарате в процессе дли- 1 тельного хранения. Поиск методов улучшения сохраняемости препаратов | распылительной сушки привел к заключению, что в препарат необходимо ввести модифицирующую добавку, снижающую уровень остаточной влаги и | улучшающую физико-механические свойства препарата (сыпучесть, гигрос- ^ копичность). Помимо улучшения сохраняемости микроорганизмов, такая добавка должна обладать также полезным действием на организм человека. I К таким ингредиентам можно отнести яблочный пектин. Пектины благотвор- I но влияют на процессы пищеварения, регулируют моторную функцию ЖКТ, | стимулируют рост нормофлоры, угнетают УПМ (Лазарева Е.Б., 2007). Моле- | кулы пектина способны связывать катионы поливалентных металлов (кадмия, цинка, свинца, кобальта, стронция и др.).

12

Длительность хранения, сут.

Рис. 8. Выживаемость бифидобактерий в смеси с пектином

Пектин добавлялся к сухой биомассе в соотношении 1:1. Поскольку влажность пектина не превышала 3,0%, результирующая влажность смеси био-

массы с пектином была около 6,0%. В смеси с пектином заметно улучшились механические свойства сухого препарата. Данные по хранению сухого препарата бифидобактерий распылительной сушки в смеси с пектином приведены в виде логарифмических кривых роста (Рис. 8).

Представленные данные иллюстрируют выживаемость бифидобактерий как при стандартных условиях (4-6° С), так и при комнатной температуре. Введение модифицирующей добавки в виде яблочного пектина позволило получить сухой препарат на основе бифидобактерий, устойчивый к хранению в широком интервале температур и с улучшенными физико-механическими свойствами.

Таким образом, благодаря биотехнологическим приемам, разработанным в рамках данного исследования, показана перспективность использования метода распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя для производства пробиотических препаратов.

3.2. Разработка методических подходов к высушиванию пробиотических микроорганизмов на сушильной установке в псевдоожиженном слое

Перспективным методом высушивания пробиотических микроорганизмов является конверсионная технология сушки-гранулирования в псевдоожиженном слое. Четкое конструктивное разделение зоны подачи горячего воздуха и рабочей зоны продукта, находящегося в псевдоожиженном слое, практически исключает перегрев биомассы при установившемся режиме (Островский В.Г., 2002). Суспензия культуральной жидкости, распыляемая форсунками в псевдоожиженном слое, в виде мелких капель осаждается на частицы носителя и высыхает на них.

В данном фрагменте работы проведено изучение ряда производственных питательных сред на пригодность использования для производства сухого препарата по данной технологии: в сравнительных экспериментальных исследованиях ряда производственных сред показано, что наиболее перспективной является кукурузно-лактозная среда.

Для снижения воздействия различных повреждающих факторов, связанных с диспергированием культуральной жидкости, резкими колебаниями давления при входе в распыляющее устройство и при выходе из него, увеличением концентрации электролитов и токсичных веществ в окружающей клетку среде, были подобраны вещества для снижения влияния этих факторов - стабилизирующих рН, изменяющих физико-химические и реологические свойства жидкой субстанции, обладающих антиоксидантным действием, т.е. защитные среды.

Важной технологической составляющей данного раздела явилось изучение возможности использования различных вариантов носителей для нанесения на них жидкой культуры бифидобактерий. Особенное внимание представляло растительное сырье с высоким содержанием ФОС; к ним можно отнести клубни топинамбура, цикория и сою. К5К штамма В. ЫЩит 791 наносилась на порошок сои, топинамбура и цикория (для сравнения использовалась лактоза). Полученные данные представлены на Рис. 9.

Как видно на Рис. 9, все партии готового сухого препарата удовлетворяют предъявляемым требованиям к препаратам по количественному содержанию

пробиотических микроорганизмов. Наилучшие результаты получены в пробе, где в качестве носителя использовался порошок из клубней топинамбура, а также порошком цикория - субстратами, содержащими биогенный инулин. Таким образом, метод высушивания биомассы пробиотических микроорганизмов в псевдоожиженном слое является перспективным технологическим приемом: путем напыления биомассы бифидобактерий на функционально значимые ингредиенты возможно получение готовых форм препаратов-син-биотиков. Готовый продукт имеет вид мелких, равномерных гранул, которые можно использовать как самостоятельную форму препарата, а также полуфабрикат для изготовления капсул и таблеток.

I сз число КОЕ Я 1 ГДУЯРГО прягдватд —4t выживших WWTQ« I

Рис. 9. Результаты высушивания биомассы бифидобактерий в псевдоожиженом слое на различных носителях

4. Изучение пребиотических и биотехнологических свойств топинамбура, цикория и смолы акации

Больший интерес при разработке препаратов-синбиотиков представляют ФОС - растворимые пищевые волокна, сочетающие комплекс технологических свойств со способностью оказывать позитивное влияние на ряд физиологических функций организма: нормализацию микробиоты, усвоение минералов, снижение уровня глюкозы (Gibson G.R., 1995; Van den Heuvel E., 1999; Caers.W., 2004; Шендеров Б.А., 2008).

Основными источниками ФОС являются топинамбур и цикорий - природные кладовые инулина - органического вещества из группы полисахаридов, полимера D-фруктозы, молекула которого состоит из 30-36 остатков фруктозы в фуранозной форме. Олигофруктоза содержит до 10 молекул фруктозы.

Смола акации - это также растворимое волокно, с химической точки зрения представляющее собой полисахарид с молекулярным весом более 200 000 дальтон, состоящий главным образом из арабиногалактана и глюкуроновой кислоты.

Задачей данного раздела явилось сравнительное изучение перспективности этих веществ для включения в состав препаратов-синбиотиков.

Из порошка топинамбура готовили водный экстракт в качестве углеводной основы питательной среды для культивирования бифидобактерий. В данном питательном субстрате определяли состав редуцирующих Сахаров. В инули-

новом компоненте преобладали фракции со степенью полимеризации фруктозы 5-14, т.е. смесь инулина и олигофруктозы. В качестве среды контроля использовали субстрат того же состава, но вместо фильтрата топинамбура в качестве источника углеводов добавляли лактозу. Обе среды стерилизовали и параллельно засевали культурой штамма В.Ый(1ит 791. Сравнительные результаты показателей, характеризующих процесс культивирования на средах, в состав которых входят разные углеводы, представлены на Рис. 10 в виде Графиков 1,2.

Сравнение логарифмических кривых роста показывает, что при выращивании на среде с топинамбуром ярко выражена и значительно удлиняется лаг-фаза и, в общей сложности, время культивирования увеличивается на 2-3 часа. При этом конечный выход биомассы бифидобактерий остается на том же уровне, что и при культивировании на среде с лактозой. Динамика потребления редуцирующих Сахаров на среде с топинамбуром подтверждает, что бифидобактерии обладают ферментной системой бета-фруктозидаз, позволяющей им расщеплять инулин, что и объясняет его пребиотический эффект. Как наглядно демонстрирует График 1 на Рис. 10, после того, как происходит заметное нарастание биомассы бифидобактерий, наблюдается скачок на кривой, что должно свидетельствовать, на наш взгляд, об активном усвоении инулина.

Динамика роста штамма В. ЫПйит 791 (источник углевода топинамбур)

График 1

оптическая плотность

редуцирую и*1е сахара

холониеобразуощге

10 11 12 13

Время культивирования, час

2 1,9

,

£ М I 1:3--

§ 13

1 2 8 Ц

5 1 й М 8 0,8

0,4

8:2 ч

Динамика роста штамма 8. ЫНЬит 791 (источник углевода лактоза)

График 2

12 3 4 Время культивирования, час

— оптическая плотность редуцируюи^е сахара рН

колониеобразуюиле единицы

Рис. 10. Сравнительные результаты культивирования бифидобактерий на субстратах, содержащих разные источники углеводов

Сравнение микроскопических препаратов из культур, выращенных на разных средах, показало, что при выращивании на среде с топинамбуром культура более однородна по морфологии; не отмечалось тенденций к агрегации и образованию скоплений клеток. Результаты вискозиметрии также показали, что КЖ этой среды обладает меньшей вязкостью.

Эти данные позволяют думать о возможном получении менее гигроскопичного сухого препарата и увеличении сроков его хранения, что получило подтверждение в наших исследованиях: результаты сравнительного анализа образцов биомассы после сублимационной сушки показали, что наилучшие показатели по числу КОЕ/г жизнеспособных бифидобактерий и остаточной влажности были в образцах, выращенных на среде, содержащей экстракт топинамбура (Рис. 11). Таким образом, топинамбур является ценным и перспективным сырьем для производства препаратов пробиотического назначения, и как источник ФОС, и как технологическая добавка.

Lg

10 Гs

■ в

■ 7

9 ■ ■6

■ Б

в ■ ■з

■ 2

■ 1

Среда на топинамбур« Среда на лактозе Молоко

|l 1 Число КОЕ а 1 г evxere oCnasna ""Остаточная влажность I

Рис. 11. Показатели выживаемости бифидобактерий после высушивания

Было проведено сравнительное изучение влияния растворимых пищевых волокон на скорость накопления и конечный выход биомассы, а также сохранность пробиотических микроорганизмов при хранения.

В наших исследованиях использовался комплексный продукт (инулин с олигофруктозой) бельгийской фирмы ORAFTI, полученный путем водной экстракции из клубней цикория (торговая марка Raftilosa Sinergy) и коммерческий продукт из смолы акации (торговая марка Fibregum) в виде порошка.

Изучение влияния растворимых волокон на динамику роста и накопления биомассы пробиотических культур проводили на модели штаммов В. bifidum 791, В. longurn В379М, L. plantarum 8-РА-З, внося добавки Fibregum и Raf tilosa Sinergy в разных концентрациях в среды выращивания. После засева испытуемыми культурами и инкубации определяли число КОЕ/жд КЖ (Рис. 12).

Как показали наши эксперименты, добавление в среду выращивания растворимых пищевых волокон Fibregum и Raftilosa Sinergy стимулирует рост бифидобактерий и лактобацилл. Выход биомассы бифидобактерий при этом увеличивается в 5-6 раза. На лактобациллы (штамм L. plantarum 8-РА-З)

РЬЬгеёит и Да/Шова Бтегёу оказывали более выраженный стимулирующий эффект, увеличивая выход биомассы не менее, чем на порядок.

Lg КОЕ

- контроль ___._.инулин ф ИЬрегам

Рис. 12. Влияние растворимых пищевых волокон на динамику роста L.plantarum 8-РА-З

Интересно отметить увеличение длительности экспоненциальной фазы роста на среде с добавлением Raftilosa Sinergy. Это можно объяснить различиями в углеводном составе опытных и контрольной сред и включением в метаболический процесс разных групп ферментов, как уже отмечалось в эксперименте с топинамбуром. Молекула Fibregum представляет собой однородный по составу полисахарид в соединении с более разнородными гликопротеинами.

Было изучено влияние добавок Raftilosa Sinergy и Fibregum на сохранность сухой биомассы бифидобактерий. Исходное число КОЕ/г бифидобакте-рий составляло 3,0 х 108.

В условиях пониженной температуры (4-60° С) к концу 60 дней исходную концентрацию бифидобактерий сохранили все образцы.

LgKOE

Г контроль_—фибрегам_инулин 1

Рис. 13. Результаты определения выживаемости бифидобактерий в препаратах с различными добавками при температуре 22-24° С

При хранении проб при t = 22-24° С, как показывает Рис. 13, уже к концу второй недели в контрольных образцах и образцах с Р1Ьгеёит показатели

23

числа КОЕ/г снизились в два раза, а к концу срока хранения - в контрольном - на два порядка, с добавкой Fibregum - на порядок. При этом в пробах, содержащих Raftilosa Sinergy, число жизнеспособных бифидобактерий осталось неизменным в течение всего срока хранения. При хранении всех образцов при температуре 300° С каждую неделю активность микроорганизмов падала на один порядок

Проведенные исследования показали, что Raftilosa Sinergy, так же, как и порошок топинамбура и яблочный пектин оказывают стабилизирующее действие: в сочетании с ними препараты бактерий сохранялись дольше и проявляли устойчивость к температурным воздействиям в широком диапазоне температур. Наряду с этим, в смеси с Fibregum происходило быстрое отмирание клеток.

Таким образом, результаты исследований технологических параметров культивирования биомассы, разработка схемы культивирования консорциумов бифидобактерий, применение молекулярно-биологических методов для видовой идентификации и отбора штаммов, разработка режимов новых способов высушивания биомассы с целью ее консервации, изучение перспективных с позиций функциональной ценности для организма человека ингредиентов, послужили основанием к разработке оптимального состава пре-паратов-синбиотиков, предназначенных для различных возрастных групп людей.

5. Разработка рецептуры и технологической документации препаратов-синбиотиков

5.1. Серия «Бифидум-Мульти»

Основной задачей при конструировании биопрепаратов-синбиотиков «Бифидум-Мульти» было создание консорциумов бифидобактерий, которые доминируют в микробиоценозе ЖКТ различных возрастных групп людей и предопределяют функции нормальной микрофлоры. Исходя из алгоритма, разработанного в рамках данной работы, были созданы консорциумы для трех возрастных групп, как основы для серии препаратов:

1. Возрастная группа от рождения до 3 лет - «Бифидум-Мульти-1» -В. bifidum 1, В. bifidum 791, В. breve 79-119, В. breve 79-88, В. infantis 73-15, В. infantis 79-43, В. longum В379М.

2. Возрастная группа от 3 до 12 лет - «Бифидум-Мульти 2 » для детей от 3 до 14 лет» - В. bifidum 1, В. bifidum 791, В. breve 79-88, В. infantis 79-43, В. longum В379М, В. longum Я-3.

3. Возрастная группа от 12 лет и старше - «Бифидум-Мульти 3» -В. bifidum 791, В. bifidum JIBA-3, В. longum В379М, В. longum Я-3, В. adolescentis Г7513, В. adolescentis ГО-13.

Данные по изучению спектра биохимической активности, антибиотико-резистентности, антагонистических свойств, сроков сохранности свидетельствуют о том, что в консорциуму не только суммируется биологический потенциал отдельных штаммов, но и наблюдается синергидный эффект. Так, уровень антагонистической активности в консорциумах выше, чем у отдельных штаммов (Табл. 2).

Таблица 2

Зоны задержки роста тест-культур, мм

Объект исследования S. sonnei 5063 S. flexnery 170 Е. coli 157 S. aureus 209 Pr. Vulgar. 177

В. bifidum 1 15,0±2 17,2±3 14,5±1 27,1 ±2 16,8±4

В. bifidum 791 16,7±3 15,3+2 15,1±3 14,5±1 17,3±2

В. bifidum JIBA-3 16,2±2 16,9±1 15,5±2 13,8±1 16,0±3

В. breve 79-88 29,0±2 25,0±2 27±3 25±3 31±1

В. breve 79-119 30,5±1 27±2 29,5±2 30,1±1 28,4±1

В. infantis 79-43 11±1 12±1 16±2 12,5±2 16,5±2

В. infantis 7315 12,1+2 12±1 15,2±2 13,1±2 17,2±2

В. longum В379М 24,2±2 20,1±2 23,0±2 17,9±3 25,6±3

В. longum Я-3 21,3±3 19,8±1 24,2±2 19,0±1 27Д±2

В. adolescentes Г7513 23,2±2 25,5±3 27,2±2 27,5±2 25,7±1

В. adolescentes ГО-13 32,0±2 26,2±1 29,1±2 26,4±1 25,3±1

Консорциум от 0 до 3 лет 34±2 28,5±2 31±2 33,7±1 35±1

Консорциум от 3 до 12 лет 35,1±2 32,9±1 33,3±3 33,2±2 36,4±2

Консорциум для взрослых 35,5±1 36,2±2 34,8±2 35,7±1 35,6±1

Изучение биотехнологических и биологических свойств порошка из клубней топинамбура и яблочного пектина позволили выбрать эти вещества в качестве ингредиентов для включения в состав препаратов «Бифидум-Мульти-2» и «Бифидум-Мульти-3». В «Бифидум-Мульти-1» в качестве технологического и функционального ингредиента, рекомендуемого для детей младшего возраста, помимо биомассы бифидобактерий включен мальто-

25

декстрин. Он состоит из глюкозы, олигосахаридов и солодового сахара, является легко перевариваемой формой углевода; способствует выработке организмом инсулина и широко применяется и рекомендуется к применению детям младшего возраста, в том числе, в составе питательных смесей для детей грудного возраста (Мухина Ю.Г, 2006; Хавкин А.И, 2007).

Формы выпуска также предусматривали удобство приема для пациентов разных возрастных групп:

1) Бифидум-Мульти-1 — порошок, дозируется мерной ложечкой 0,6 г;

2) Бифидум -Мульти-2 - капсулы 0,25 г;

3) Бифидум-Мульти-3 - капсулы 0,4 г.

Высушивание биомассы производилась параллельно тремя способами -сублимационным, распылительным и в псевдоожиженном слое. Согласно разработанной рецептуре, были изготовлены экспериментально-производственные серии препаратов и заложены на хранение при 4+2° С с периодической проверкой жизнеспособности бифидобактерий (Рис. 14).

Ьц КОЕ

* Сублимационная

О Рапылитальная

д Псоедокипящий слой

Рис. 14. Показатели выживаемости бифидобактерий при хранении

Показано, что во всех образцах бифидобактерии сохранялись в жизнеспособном состоянии без потерь в течение 12 месяцев. Препараты, включающие биомассу, высушенную сублимационным и распылительным методами, сохраняли высокие показатели числа КОЕ/г бифидобактерий в течение 18 месяцев, в псевдоожиженном слое - в течение 1 года (при содержании в 1 г готовой продукции не менее ^8), что соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01. Таким образом, по сохранности биомасса распылительного высушивания не уступает высушенной сублимационно. Сроки хранения биомассы, высушенной сушкой-гранулированием в псевдоожиженном слое, также можно признать удовлетворительными.

5.2. Серия «Нормоспектрум®»

Одной из ведущих причин, приводящих к дефициту витаминов и минералов в организме, является нарушение микробной экологии человеческого организма, возникающее под влиянием целого ряда неблагоприятных факторов. Снижение уровня индигенной микрофлоры приводит к преимущественному размножению УПМ, конкурентному потреблению ими питательных субстратов, в том числе, витаминов и минералов, что еще более усугубляет состояние дисбиоза, с одной стороны, и приводит к дефициту 26

микронутриентов, с другой. Продукты метаболизма патогенных микроорганизмов меняют кислотно-электролитный баланс среды, нарушают проницаемость кишечной стенки, нарушают метаболизм. Без восстановления внутреннего гомеостаза не происходит полноценного усвоения витаминов и минералов. Установлено, что циркуляция в организме и участие в сложных биохимических процессах находится под регулирующим влиянием микрофлоры пищеварительного тракта (Eckburg Р.В., 2005; Шендеров Б.А., 2005, 2009). Микроорганизмы, присутствующие в кишечнике, оказывают прямое или опосредованное действие практически на все факторы, опрделя-ющие биоусвояемость поступающих в организм микронутриентов. В связи с этим целесообразно при дисбиотических состояниях использовать сочетан-но микронутриенты и пробиотические микроорганизмы. Пробиотическая микрофлора повышает биодоступность микронутриентов и снижает дефицит витаминов и минералов, что, в свою очередь, должно способствовать более эффективному восстановлению индигенной микрофлоры и метаболит-ного баланса в организме.

Для решения данной задачи была разработана серия синбиотиков «Нор-моспектрум» для разных возрастных групп людей. Их основой являются консорциумы бифидобактерий, комплементарные микробиоте ЖКТ различных возрастных групп людей и сконструированные в соответствии с алгоритмом, разработанным в ходе данной работы. В их состав были включены производственно значимые штаммы лактобацилл, витаминно-минеральный комплексом, инулином и олигофруктоза.

В качестве пробиотических составляющих были выбраны следующие штаммы бифидобактерий и лактобацилл из Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора:

«Нормоспектрум для детей» - живые культуры (не менее 500 млн КОЕ/г): В. bifidum 1, В. bifidum 791, В. longurn В379М, В. breve 79-88, В. infantis 79-43, L.plantarum 8-РА-З, L. acidophilus NK-1, L. casei KHM-12;

«Нормоспектрум для взрослых и детей старше 14 лет» - живые культуры, не менее 500 млн - В. bifidum 1, В. bifidum 791, В. longum В379М, В. longum Я-3, В. adolescentis ГО-13, L.plantarum 8-РА-З, L. acidophilus NK-1, L. acidophilus K3ui24, L. casei KHM-12.

В препарат был включен витаминно-минеральный комплекс:

- Витамин Е (токоферол),

- Витамин Bj (тиамин),

- Витамин В2 - рибофлавин,

- Витамин В6 - пиридоксин,

- Витамин В12 - кобаламин,

- Витамин Вс - фолиевая кислота,

- Витамин В5 - пантотеновая кислота,

- Витамин РР - ниацинамид,

- Витамин Н - биотин,

- Витамин С - аскорбиновая к-та,

- Цинк,

- Селен.

Содержание суточной дозы витаминно-минерального премикса, вводимой в препараты, составляет, в соответствии с рекомендациями Института Питания РАМН, 30-50% от суточной нормы потребления и зависит от возраста (СпиричевВ.Б., 2000; Коденцова В.М., 2006).

Формы выпуска также предусматривают удобство приема для пациентов разных возрастных групп:

- «Нормоспектрум для детей от 1 до 3 лет» - порошок, дозируется мерной ложечкой по 0,5 г;

- «Нормоспектрум для детей от 3 до 14 лет» - капсулы 0,25 г;

- «Нормоспектрум для взрослых и детей старше 14 лет» - капсулы -0,34г.

Были изготовлены, согласно рецептуре, экспериментально-производственные серии препаратов и заложены на хранение при 4±20° С с периодической проверкой жизнеспособности бифидобактерий и лактобацилл (Рис. 15 и 16).

Рис. 15. Показатели выживаемости бифидобактерий и лактобацилл в препарате «Нормоспектрум для детей»

Рис. 16. Показатели выживаемости бифидобактерий и лактобацилл в препарате «Нормоспектрум для взрослых и детей старше 14 лет»

Было установлено, что во всех образцах бифидобактерии и лактобациллы сохранялись в жизнеспособном состоянии без значимых потерь в течение 18 месяцев. 28

Исследования, проведенные в аккредитованных лабораториях, подтвердили соответствие разработанных продуктов требованиям основных нормативных документов - СанПин 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов» и СанПиН 2.3.2.1290-03 «Гигиенические требования к организации производства и оборота БАД » по показателям специфической активности, санитар-но-бактериологической и физико-химической безопасности.

Разработаны технические условия «ТУ 9197-003-38989935-03, БАД к пище «Еифидум-Мульти», «ТУ 91979197-005-38989935-05, БАД к пище «Нормоспектрум», технологические регламенты производства, проекты потребительских этикеток и рекомендации по применению. Разработанная документация и образцы продукции были представлены на экспертизу в Институт питания РАМН и Центр «Экспертиза» Роспотребнадзора. После получения положительного решения данная продукция зарегистрирована в Государственном реестре биологически активных добавок к пище, как средства для нормализации микрофлоры и функционального состояния ЗККТ - дополнительные источники пробиотических микроорганизмов; Нормоспектрум, кроме того, как источник витаминов, цинка и селена.

6. Использование разработанных препаратов-синбиотиков в различных областях профилактической и восстановительной медицины

Для оценки эффективности препаратов-синбиотиков и подтверждения заявленной концепции был проведен ряд исследований в различных областях профилактической и восстановительной медицины на базе клинических стационаров, в амбулаториях, в детских дошкольных учреждениях. В исследование были включены пациенты различных возрастных групп. Контрольные группы оставляли пациенты, принимавшие препараты моновидового состава.

Первоначально было проведено изучение эффективности и безопасности «Нормоспектрума для взрослых» и «Бифидум-Мульти-3» у взрослых с вторичными дисбиозами, возникшими на фоне острых и хронических заболеваний ЗККТ; исследования проводились на базе КИП № 1 г.Москвы.

Под наблюдением находилось 65 взрослых больных обоего пола, в том числе, две опытные группы: 25 пациентов принимали «Нормоспектрум для взрослых», 20 - «Бифидум-Мульти-3». 20 пациентов (контрольная группа) получали моновидовой препарат «Бифидумбактерин». Все препараты принимались 2-3 раза в день в течение 2-3 недель во время за 20-30 минут до еды.

У всех обследованных после курса принимаемых препаратов отмечались положительные сдвиги в состоянии микробиоценоза кишечника и купирование симптомов дисбактериоза. При этом в группах пациентов, принимавших «Нормоспектрум» и «Бифидум-Мульти-3», эти показатели были достоверно выше, чем в группе контроля, которым был назначен «Бифидумбактерин». Аллергических реакций не было отмечено, препараты хорошо переносились больными.

Клинико-лабораторные исследования подтвердили экспериментальные данные о преимуществах в антагонистической активности препаратов комплексного состава. Хорошая переносимость и отсутствие аллергических про-

явлений можно аргументировать повышенным содержанием гидролаз в консорциумах, что способствует более полному расщеплению белков и лучшему их усвоению.

Полученные результаты позволили расширить спектр исследований и возрастные границы обследуемых пациентов.

Так, результаты исследования БАД «Бифидум-Мульти-1» в перинатоло-гии с целью профилактики эндогенных и экзогенных инфекций показали, что у детей группы высокого инфекционного риска применение «Бифидум-Мульти-1» способствовало формированию микробиоценоза с более высоким содержанием основных представителей нормофлоры - бифидобактерий, лак-тобацилл, кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью и в более ранние сроки, чем это отмечалось после приема препарата «Бифидум-бактерин» {Рис. 1 7).

Бифидобактерии (109) Лактобактерии (109)

3 сутки 5-6 сутки

I основная группа □ контрольная группа

Л

3 сутки

5-6 сутки

В основная группа □ контрольная группа

Рис. 17. Число КОЕ/г бифидо- и лактобактерии в сравнительном аспекте

Более высокие показатели содержания бифидобактерий к 5-6 дню были отмечены у подавляющего большинства детей, получавших «Бифидум-Мульти-1» (75%), в то время как в группе контроля таких детей было 16,7%. Лактобациллы в основной группе также встречались в более высоких концентрациях, чем в контроле (на 3 сутки - Юб'2±0'4 КОЕ/г в основной группе и Ю4'6±0'3 КОЕ/г в контроле, на 5-6 сутки - Ю8,1*0,3 КОЕ/г в основной группе и Ю6'9*0,3 КОЕ/г в контроле). При этом число новорожденных основной группы, у которых выделялись лактобациллы, составляло 45,9%; в контрольной группе этот показатель составил 20,8%.

Колонизация кишечника условно патогенной флорой была менее выражена у новорожденных, получавших «Бифидум-Мульти-1» (Рис.18).

Как следствие этого, уменьшалась интоксикация, что проявлялось в более ранней нормализации показателей гемограммы. Перекрест в лейкоцитарной формуле в основной группе детей происходил раньше, реже отмечались аллергические проявления в виде неонатальной токсической эритемы.

Данное исследование показало, что применение БАД «Бифидум-Мульти-1» у новорожденных детей группы высокого перинатального инфекционного риска способствует более благоприятному протеканию периода адаптации, чем после применения однокомпонентного препарата «Бифидумбактерин», за счет раннего формирования микробиоценоза кишечника с высокими количественными показателями содержания основных представителей нормальной микрофлоры. 30

в основная о контрольная

Рис. 18. Колонизация кишечника условно патогенной флорой

Исследования, проведенные в стационаре гастроэнтерологического профиля, показали, что у детей в возрасте 2-18 месяцев, получавших «Бифидум-Мульти-1», клинические проявления нарушения пищеварения в виде срыги-ваний, метеоризма, кишечных колик, запора, нарушения характера стула, купировались на 2-7 дней раньше, чем у пациентов контрольной группы, получавших альтернативные бактерийные препараты (Рис. 19).

15/ X 1 10' 5' 0 ^ У ш пл. ¿от У

Рис. 19. Динамика клинических симптомов нарушений функции пищеварения у детей основной и контрольной групп (день терапии)

Положительная клиническая динамика способствовала повышению мас-со-ростовых показателей у детей основной группы. В среднем за период наблюдения прирост массы составил 435,0±65,-3 г, прирост роста - 0,57±0,12 см. Та же закономерность касалась повышения уровня гемоглобина и эритроцитов в крови.

Исследование микробного пейзажа толстой кишки так же выявило положительные изменения у обследованных детей (Рис. 20). Так, у детей на фоне приема «Бифидум-Мульти-1» отмечалось статистически значимое повышение содержание бифидобактерий (р < 0,05), также зарегистрировано уменьшение удельного веса условно-патогенной флоры.

Таким образом, сравнение клинико-лабораторных показателей основной и контрольной групп показало, что применение синбиотика «Бифидум-Муль-ти-1» способствовало существенно более раннему восстановлению функционального и микроэкологического статуса ЖКТ детей.

В отделении детских инфекций МИБ № 1 было проведено изучение корригирующего влияния синбиотика «Нормослектрум для детей» (всего 45 детей) на клинической состояние и микробиоценоз ЖКТ у детей с дисбактериозом кишечника, возникшем на фоне других заболеваний. Возрастной диапазон пациентов был от 1 до 14 лет. Группу контроля составляли дети, принимавшие «Бифидумбактерин» (46 детей). Все группы были сопоставимы по возрасту пациентов, тяжести заболевания, срокам начала лечения, а также по характеру дисбиотических нарушений.

80 60 40 20 0

l.fi

I I

В Jfi

UUU

ш)

12 3 4 5 6 7 8 9

| основная контрольная

1 Дефицит бифидобактерий 5 Лактозонегативн. кишечн. пал.

2 Стафилококки 6 Энтерококк

3 Гемолизир. кишечная пал. 7 Грибы рода Candida

4 1ас+. кишечн.палочка 8 Клебсиелла

9 Синегнойная палочка

Рис. 20. Характеристика микробного пейзажа толстой кишки у детей до и после приема «Бифидум-Мульти-1»

Клинические наблюдения за больными, получавшими «Нормоспектрум», позволили выявить его более выраженное положительное действие по сравнению с контрольной группой, которое проявлялось в более раннем уменьшении явлений желудочно-кишечного дискомфорта и нормализации стула (Рис. 21).

При наличии диарейного синдрома у детей к 3-4 дню от начала лечения уменьшалась кратность стула, улучшалась его консистенция, исчезали патологические примеси в фекалиях. У детей с функциональными запорами, начиная с 6-8 дня, стул становился регулярным. У части больных наблюдалось восстановление аппетита к 4,8±0,4 дню от начала терапии, уменьшение явлений метеоризма к 2,8±0,4 дню.

Изучение кишечной флоры в динамике показало, что после курса применения синбиотика «Нормоспектрум» у наблюдавшихся детей выявлено достоверное уменьшение доли пациентов с дисбактериозом кишечника II-III 32

степени с 82,5±7,9% до 32,5±7,4%, возрастанием числа детей с I степенью дисбактериоза с 75,0±6,0% до 52,5±7,8%. У 15,0±5,6% пациентов отмечалась нормализация показателей микрофлоры кишечника (разница показателей достоверна, р < 0,05).

нормализазация метеоризм"урчание" боли восстанов. Обложен- спазм стула кишечника в животе аппетита ность толстой

языка кишки

Е

основная

контрольная

Рис. 21. Функциональное состояние ЖКТ после приема препаратов

В контрольной группе применение «Бифидумбактерина» также сопровождалось улучшением состояния кишечной микрофлоры, что выражалось увеличением числа детей с дисбактериозом кишечника I степени с 4,3±4,2% до 26,0±9,1%) и уменьшением доли детей с дисбактериозами II степени с 95,7±4,2% до 65,2±9,9% (р < 0,05). Однако, в отличие от основной, у 26,1±9,1% детей контрольной группы сохранялись дисбиотические нарушения III степени.

Применение «Нормоспектрума» у большинства детей повышало содержание как бифидобактерий, так и лактобацилл, при этом выявлена более выраженная положительная динамика на фоне применения препарата в основной группе (Рис. 22, 23).

Параллельно росту содержания бифидобактерий в микрофлоре кишечника под влиянием «Нормоспектрума» наблюдался рост нормальных эшерихий (Рис. 24). Достоверно снижалось число детей с дефицитом кишечной палочки ниже 300 млн/г фекалий и повышалось число детей с их нормальным содержанием.

Существенным результатом применения «Нормоспектрума» явилась элиминация условно-патогенных бактерий, в том числе St. aureus и грибов, что согласуется с данными других авторов о достоверно более эффективном ингибировании роста клинических штаммов С. albicans препаратами, содержащими лектины бифидобактерий и лактобацилл, чем препаратами лактобацилл (Лахтин В.М., 2009).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

<107 10' 10» количество в 1а фекалий

10«

До приема

<10' 10' 10« 10«

количество в 1а феквпий

После приема

Рис. 22. Содержание бифидобактерий в фекалиях обследованных детей

во

<10= 105 10» 10'

количество в 1а фекалий

_До_щшет

<10» 10» 10» 10'

количество в 1а фекалий

После приема

Рис. 23. Содержание лактобадилл в фекалиях обследованных детей до и после приема препаратов

<1И млн 100-200ЫЛН 300-400или >400млн количество а 1а фекалий

До приема

<100 млн 100-200МЛН 300-400МЛН >400млн

количество в 1а фекалий

_После приема

Рис. 24. Содержание эшерихий в фекалиях обследованных детей

Обсеменённость УПМ и грибами под влиянием «Нормоспектрума» снизилась в 2,5 раза, в то время как в контрольной группе - в 1,7 раза (Рис. 25).

Таким образом, эффективность препарата «Нормоспектрум», проявляющееся в коррекции кишечную микрофлоры и нормализующем влиянии на функциональные расстройства со стороны ЖКТ, значительно превышает таковую при использовании препарата «Бифидумбактерин».

стафило- протеи клебсиел- цитробак- псведо- гемоли- грибы кокки лв тер ионада зирукнцие рода

зитрихии кандида

стафило- протеи клебсиел- цитробак- псеедо- мими- грибы кокки ла тер ионада зирующие рода

эшерихии кандида

основная

контрольная

Рис. 25. Обсемененность кишечника условно-патогенными бактериями и грибами в основной и контрольной группах (до и после приема препаратов)

Известно (Куваева И.Б., 1991; Коршунов В.М., 2000; Ефимов Е.И., Соколова К.Я., 2004; Дубровская М.И, 2006; Ezindam J., 2008; Bailey, 2009), что микрофлора кишечника выполняет главенствующую роль в формировании как системного иммунитета, так и иммунной системы, ассоциированной с лимфоидной тканью желудочно-кишечного тракта. Являясь самым значимым биотопом в макроорганизме и выполняя роль своеобразного биосорбента, он связан как с внешней средой, так и находится во взаимодействии со всеми остальными биотопами. Ведущая роль микрофлоры кишечника ска-

зывается на состоянии колонизационной резистентности других биотопов, в частности, ротоглотки. Поэтому при организации профилактических мероприятий по снижению заболеваемости, прежде всего, детской, острыми респираторными инфекциями различной этиологии напрашивается вывод о необходимости проведения обязательной коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта. С этой целью были использован синбиотик для детей данной возрастной группы «Бифидум-Мульти-2».

Исследования проводились в период повышенной сезонной респираторной заболеваемости в 3-х территориально не связанных детских садах. У всех детей одновременно были проведены бактериологические исследования ротоглотки и кишечника. Анализ состояния микрофлоры ротоглотки у детей показал, что оно коррелировало с показателями респираторной заболеваемости: если в анамнезе присутствовали сведения о перенесенных накануне ОРВИ, тонзиллите и пр., в микрофлоре ротоглотки этих детей обнаруживались дисбиотические изменения - золотистый стафилококк с интенсивным обсеменением (105-106), а также наличие ассоциаций микроорганизмов, несвойственных данному биотопу (эшерихий, клебсиелл, псевдомонад, грибов рода Candida) (Табл. 3).

Таблица 3

Частота обнаружения различных бактерий на слизистой ротоглотки

Бактерии Детский сад № 1 Детский сад № 2

JV = 39, Абс. (%) n = 39, Абс. (%)

Streptococcus spp., 39(100) 28 (96,6)

5-7 lg КОЕ/мл, 1(2,5) 1 (3,4)

в т.ч. в кол-ве 8 lg КОЕ/жл

Neisseria spp. 5-7 lg КОЕ/мл 39(100) 28 (96,6)

Staphylococcus spp., 12(30,8) 11 (37,9)

в т.ч. S. aureus 8 (20,5) 8(37,6)

5-6 lg KOE/лгл 3(7,6%) 3(10,3)

Е. coli - 3(10,3)

Klebsiella 1 (2,5) 1 (3,4)

P. aeruginosa - 2 (6,8)

Candida albicans - 1(3,4)

В Табл. 4 представлены показатели состояния микробиоты ЖКТ у наблюдавшихся детей, которые также носили дисбиотический характер.

Таким образом, нарушения в обоих биотопах носили количественный и качественный характер, проявлялись одновременно, но имея присущую каждому специфику. Однако, были отмечены также группы микроорганизмов, одновременно встречающиеся в обоих биотопах (Рис. 26).

Обследованные дети были разделены на две подгруппы. Одной из них назначали синбиотик «Бифидум-Мульти-2» в течение 14 дней. Вторая подгруппа, не получавшая препарат, служила группой сравнения. 36

Таблица 4.

Показатели микробиоты кишечника у наблюдавшихся детей

Бактерии Детский сад № 1 Детский сад № 2

п = 39, Абс. (%) п = 29, Абс. (%)

Bifidobacterium ниже 8 lg КОЕ/г 3(7,6) 2(6,8)

Lactobacillus ниже 6 Ig КОЕ/г 8(20,5) 4(13,8)

Общее количество

Е. coli ниже 7 lg КОЕ/г 7(17,9) 5(17,2)

Е. coli Lac * 10(25,6) 8(27,6)

Е. coli Hly+** 10(25,6) 11(37,9)

Грамотрицательные энтеробактерии 4(10,3) 2(6,8)

Staphylococcus spp., 9(23,1) 8(27,6)

в т.ч. S. aureus 7(17,9) 6(20,1)

Candida albicans 3(7,6) 3(10,3)

стафилококки грибы энтеробактерии

В ротоглотка □ фекалии □ совпадение

Рис. 26. Частота обнаружения стафилококков, грибов и энтеробактерий на биотопах ротоглотки и кишечника и частота совпадения выделенных культур

По окончании приема препарата в течение трех месяцев продолжалось наблюдение за детьми: регистрировались случаи заболеваемости ОРВИ, особенности клинических проявлений заболевания, частота возникновения осложнений, случаи назначения антибиотиков, а также учитывалось число дней, пропущенных ребенком из-за болезни.

Результаты сравнительного наблюдения за детьми, получавшими и не получавшими синбиотик «Бифидум-Мульти-2», наглядно свидетельствовали о существенно более низком уровне заболеваемости ОРВИ, облегченном их течении после курса приема препарата, в то время как в группе сравнения был зарегистрирован высокий уровень заболеваемости, зачастую с осложненным течением, отмечены интеркурентные заболевания. Период болезни

длился значительно дольше и, соответственно, было больше пропущено дней. На этом фоне сравнение результатов первичного и повторного бактериологического обследования группы детей, не принимавших «Бифидум-Мульти-2», показал отрицательную динамику в состоянии микрофлоры ротоглотки и кишечника.

Существенным результатом применения «Бифидум-Мулъти-2» явилось снижение уровня кишечной палочки с атипичными свойствами: в группе, принимавшей «Бифидум-Мульти-2» на 61,7% , в то время, как в контрольной группе этот показатель снизился только на 9,7% (р > 0,001).

Полученные результаты подтвердили тот факт, что состояние микрофлоры желудочно-кишечного тракта играет исключительно важную роль в защите от различных инфекций, а проведенное исследование показало, что применение синбиотика «Бифидум-Мульти-2», улучшающего состояние микрофлоры кишечника и ротоглотки, приводит к снижению уровня заболеваемости детей в детском коллективе.

Целью следующего исследования, проведенного на базе онкологической клинической больницы № 62 г. Москвы, был выбор наиболее рациональной и эффективной схемы предоперационной подготовки и послеоперационного ведения больных колоректальным раком, применение которой позволило бы достоверно снизить уровень госпитальных гнойно-септических инфекций у этой категории больных.

С этой целью был апробирован синбиотик « Нормоспектрум для взрослых ». В исследование были включены четыре группы сравнения: 1) пациенты получали стандартные предоперационную подготовку и ведение в послеоперационном периоде; 2) пациенты, принимавшие сорбент «Ирмалакс; 3) пациенты, получавшие сорбент в сочетании с «Бифидумбактерином»; 4) пациенты, получавшие сорбент в сочетании с «Нормоспектрумом».

Послеоперационный период у 59 (30%) пациентов из 200 наблюдаемых нами больных с колоректальным раком осложнился развитием той или иной нозологической формы ГГСИ.

Анализ частоты встречаемости случаев ГГСИ в каждой из сформированных нами группе больных, представлен на Рис. 27.

стандэртн ая (контрольная группа) СД+АБП+ +сорбент СД+АБП+сорбе-нт+Бифидумбак терин

СД+АБП+ +сорбент+ +нормоспект-

рум о 20 40 60

Рис. 27. Частота встречаемости случаев заболевания в зависимости от схемы профилактики

Г-

1-5«

г и

г и Г 1 ^-рг

Наиболее часто инфекционные осложнения в послеоперационном периоде встречались у больных из контрольной группы, которым проводилась лишь стандартная подготовка к операции - у 60%. Во второй группе, частота осложнений снизилась в два раза, в третьей — в три раза по сравнению с первой группой. Самая низкая частота встречаемости инфекционных осложнений в послеоперационном периоде больных с колоректальным раком была в четвертой группе, где применялся препарат - синбиотик «Нормоспектрум. Разница в частоте встречаемости инфекционных осложнений у пациентов из первой и четвертой опытной групп составляла 4,5 раза (р < 0,01).

Эффективность данной схемы обусловлена нормализацией микроэкологии толстой кишки, наступающей благодаря высокой эффективности биопрепарата «Нормоспектрум», входящего в данную схему. В «Нормоспектрум», помимо штаммов - представителей нормальной микрофлоры входит витаминно-мине-ральный комплекс, восполняющий их дефицит и активизирующий иммунную систему и нормализующий обмен веществ в организме больного.

Проводя коррекцию дисбактериоза, мы тем самым повышаем колонизационную резистентность организма пациента к эндогенной и экзогенной условно-патогенной микрофлоре - этиологическому агенту ГГСИ. В данном исследовании «Нормоспектрум» проявляет свойства статика и консерванта метаболизма толстого кишечника, что можно рассматривать как новое, важное направление экстремальной медицины.

Таким образом, «Нормоспектрум» является новым препаратом - синбио-тиком с широкими показаниями для профилактики и лечения госпитальных инфекций у онкологических больных. Это подтвердил и опыт применения «Нормоспектрума для взрослых» в лечении больных злокачественными лим-фопролиферативными заболеваниями. Его включение в схему стандартного химио-лучевого лечения больных из опытной группы оказало положительное влияние на динамику астеновегетативного, абдоминального болевого синдрома и симптомы поражения кишечника по сравнению с контрольной группой, что говорит о целесообразности его назначения больным с онкогема-тологической и другой онкологической патологией в ходе лечения - проведения лучевой и полихимиотерапии, а также целесообразно их использование в восстановительных программах этой значительной группы больных.

Подводя итог проведенной работе, можно констатировать, что клинические наблюдения за применением новых препаратов-синбиотиков «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» в различных областях профилактической и восстановительной медицины продемонстрировали их выраженную лечебно-профилактическую эффективность, оцениваемую по совокупности клинико-лабораторных показателей. Сопоставление с препаратами моновидового состава, составлявшими группы сравнения во всех проведенных клинических исследованиях, подтвердило неоспоримые преимущества выбранного подхода - применение для коррекции микроэкологических нарушений консорциумов микроорганизмов нормофлоры в сочетании с функционально значимыми ингредиентами - ФОС, пектином, витаминами и минералами. Особенно важно то, что препараты можно применять целенаправленно для разных возрастных групп людей, обеспечивая индивидуализацию подхода к коррекции микрофлоры и повышая ее эффективность.

выводы

1. Изучены технологические, пробиотические и молекулярно-биологи-ческие свойства бифидобактерий и произведен отбор промышленно-перспек-тивных штаммов, относящихся к видам, доминирующим в микробиоценозе ЖКТ человека.

2. Разработан метод совместного культивирования высокоэффективных и технологичных штаммов бифидобактерий разных видов с целью получения устойчивых консорциумов - основы для препаратов нового поколения. Показано, что в консорциуме не только суммируются количественные (число КОЕ/мл бифидобактерий) и качественные (индивидуальные свойства штаммов) показатели, но проявляется синергидный эффект, что подтверждалось усилением антагонистической активности и повышением устойчивости при хранении по сравнению с отдельными культурами.

3. Разработаны методические подходы, подобраны питательные и защитные среды, технологические добавки (порошок топинамбура, цикория, яблочный пектин), позволяющие использовать современные методы высушивания - распылительную сушку при низкой температуре теплоносителя и сушку-гранулирование в псевдоожиженном слое - для получения биомассы пробиотических микроорганизмов с высокой степенью жизнеспособности, устойчивости к длительному хранению в широком диапазоне температур.

4. Предложен новый концептуальный подход к конструированию и назначению препаратов нормофлоры целевого назначения пациентам разных возрастных групп, основанный на видах бифидобактерий, доминирующих в микробиоценозе этих возрастных категорий:

у детей от рождения до 3-х лет: В. infantis, В. breve, В. bifidum, В. longum,

у детей от 3 до 14 лет - В. breve, В. bifidum, В. longum,

у подростков и взрослых — В. bifidum, В. longum, В. adolescentis.

5. На основе предложенного принципа рецептуростроения и новых технологических приемов разработаны и зарегистрированы в Федеральном реестре Роспотребнадзора препараты-синбиотики нового поколения « Бифидум-Муль-ти» и «Нормоспектрум» для разных возрастных групп людей, сочетающие в себе устойчивые консорциумы бифидобактерий, лактобациллы и функциональные добавки, оказывающие метаболический, иммуностимулирующий и защитный эффект.

6. При использовании в различных областях профилактической и восстановительной медицины у пациентов, относящихся к разным возрастным группам: у новорожденных высокого риска развития эндо- и экзогенных инфекций (61 ребенок), детей с нарушениями пищеварения (26 детей), пациентов с вторичными дисбиозами после перенесенных заболеваний (68 детей и 65 взрослых), часто болеющих детей в детских дошкольных учреждени-40

ях (90 детей), онкобольных хирургического отделения с высоким риском развития инфекционных осложнений (200 больных) - была подтверждена высокая эффективность, безвредность синбиотиков «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум», а также доказано их преимущество по клиническим и лабораторным показателям перед аналогичными препаратами моновидового состава.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Журналы, рекомендованные ВАК РФ

1. Островский ВТ., Шеремет СЛ., Амерханова AM. Получение сухих гранулированных микробиологических препаратов по конверсионной технологии. // Конверсия в машиностроении, - 2003. - № 5. - С. 6-10.

2. Амерханова А.М., Лаврова АЛ., Дмитриева Г.В., Пырикова И А., Зубко-ва Е.С., Жиленкова ОТ., Кураленко АА. Опыт применения ВАД к пище «Би-фидумбактерин Мульти» в педиатрической практике // Вестник Российской АМН. - № 12. - 2005. - С. 30-32.

3. Амерханова А.М., Пономарева Л.П.,АнкирскаяА.С., Бондарь О.Е., Лису-нова С А., Фурсова С А., Жиленкова ОТ., Зубкова Е.С., Кураленко АА. Новые биопрепараты-синбиотики и их использование в неонаталогии с профилактической целью // Вопросы детской диетологии. - М., 2006. - Т. 4. - № 4. -С.66-69.

4. Карзанова М.В., Воронина ОЛ., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Сборник докладов Россельхозакадемии. - М., 2006. - № 5. - С. 9-12.

5. Амерханова AM..Алешкин В А., Грачева НМ„ Петрова М.С., Попова О. П., Зубкова Е.С., Жиленкова О.Г., Кураленко АА., Соловьева АЛ. Принципы конструирования препаратов-синбиотиков и оценка их клинической эффективности // Вестник Российской АМН. - 2006. - № 6. - С. 38-45.

6. Феклисова Л.В, Амерханова А.М., Жиленкова ОТ, Мескина Е.Р., Воропаева ЕАПожалостина Л.В., Зубкова Е.С., Кураленко АА., Моисеева К Д. Возможности применения синбиотиков для снижения заболеваемости часто болеющих детей, посещающих дошкольные учреждения // Вопросы практической педиатрии. - М., 2007. - Т. 2. - № 6. - С. 53-59.

7. Амерханова А.М., Алешкин В А., Митрохин С Д., Соколов АА., Жиленкова ОТ., Лисунова С А., Зубкова Е.С., Кураленко АА. Возможности использования препарата Нормоспектрум в профилактике госпитальных гнойно-септических осложнений у больных колоректальным раком // Инфекционные болезни. - М., 2007. - Т. 5. - № 1. - С. 3-6.

8. Воронина ОЛ., Кунда М.С., Субботина М.Е., Жиленкова ОТ., Амерханова AM., Афанасьев С.С., Алешкин ВА. Анализ видового разнообразия би-фидофлоры и влияние синбиотика «Бифидум-Мульти-1» на становление и развитие бифидобактерий у детей раннего возраста // Вопросы детской диетологии. - М., 2008. - Т. 6 - № 5. - С. 59-64.

Другие издания

9. Амерханова А.М., Алешкин В А. БАДы «Полибактерин» - новые препа-раты-пробиотики. //Материалы IV Международного симпозиума «Биологически активные добавки к пище: XXI век». - СПб., 2000. - С. 8-9.

10. Бандоян АЛ., Амерханова А.М., Алешкин В А. Новые подходы к конструированию препаратов-пробиотиков на основе бифидобактерий // Сборник статей «Проблемы инфекционных болезней». - М., 2000. - Ч. 2. - С. 284286.

11. Амерханова А.М., Алешкин В А., Шендеров Б А. Комплексные препа-раты-пробиотики, моделирующие микробиоценоз людей различных возрастных групп // Сборник трудов Европейского конгресса по астме. - М., 2001. -Т. 2.-№1.-С. 259-260.

12. Алешкин ВА., Амерханова AM., Бандоян АЛ., Бояркина Л А. Новые подходы к конструированию препаратов-пробиотиков // Сборник материалов IV Международной конференции «Пожилой больной. Качество жизни». - М., 2001. - Т. 7. - № 8. - С. 74-75.

13. Амерханова А.М., Бандоян А.К., Бояркина ЛА., Хачатрян Г.В. Использование топинамбура в составе препаратов и продуктов пробиотической направленности // Сборник материалов IV Международная конференция «Пожилой больной. Качество жизни». - М., 2001. - Т. 7. - № 8. - С. 75.

14. Амерханова А.М., Бандоян АЛ., Бояркина JIA., Зубкова Е.С., Коненков П.Ф., Гинс М.С., Кропова Ю.Г., Гинс В.К. Использование растительного сырья в составе препаратов и продуктов пробиотической направленности // Сборник материалов IV Международной научно-технической конференции «Пища, экология, человек». - М., 2001. - С. 75-76.

15. Зубкова Е.С., Амерханова А.М., Гинс В.К. Растение амарант - перспективное сырье для продуктов функционального питания // Сборник материалов международной конференции «Пробиотические микроорганизмы- состояние вопроса и перспективы использования». - М., 2002. -С.76-77.

16. Хачатрян Г.В., Амерханова AM., Бандоян АЛ. Поиск методических подходов к оптимизации глубинного культивирования бифидобактерий // Сборник материалов международной конференции «Пробиотические микроорганизмы - состояние вопроса и перспективы использования». - М., 2002. -С.69-70.

17. Амерханова A.M., Астафьев Е.И., Коновалов Н.А., Хачатрян Г.В., Бояркина JI.A., Хачатрян А.В., Зубкова Е.С. Разработка технологии получения сухой формы бифидумбактерина распылительным методом высушивания // Там же. - С. 67-68.

18. Алешкин ВА., Тихонова Н.Т., Амерханова AM., Левченко ТА. Новое направление бактериотерапии - комплексные препараты - пробиотики // Там же. - С. 47.

19. Амерханова А.М. Бифидобактерии - история вопроса, основные итоги изучения, перспективы использования (в аспекте деятельности лаборатории биологии бифидобактерий ГУ «МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского МЗ РФ») // Там же. - С. 6-8.

20. Амерханова AM. Комплексные фитопробиотики // Парафармацевти-ка. - 2002. - № 10. - С. 17-18.

21. Амерханова AM., Поспелова В.В., Манвелова МЛ. Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского - основоположник концепции бактериотерапии // Сборник «Новые лекарственные средства». - М., 2003. - № 7. - С. 3-8.

22. Грачева Н.М., Петрова М.С., Москалева Т.Н., Амерханова А.М., Соловьева А.И., Зубкова Е.С., Маркелова ВЛ., Звонарева C.B. Новые препараты «Бифидумбактерин-Мульти» в практике лечения дисбактериозов кишечника у детей // Материалы VII всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России». -М., 2003. - Т. 1. - С. 137-139.

23. Амерханова А.М., Грачева Н.М., Петрова М.С., Москалева Т.Н., Гав-рилов А.Ф., Аваков АЛ, Зубкова Е.С., Соловьева А.И. Дисбактериоз и индивидуализация коррекции микрофлоры // Сборник докладов симпозиума «Функциональное питание, пищевая безопасность и здоровье людей в условиях мегаполиса». - М., 2003. - С. 34-38.

24. Амерханова AM. Дифференцированный подход к возрастным группам больных - залог эффективного применения пробиотических средств // Новые лекарственные средства. - М., 2003. - № 7. - С. 9-12.

25. Алешкин ВЛ, Шендеров Б А., Афанасьев С.С., Амерханова AM., Поспелова В.В. Пробиотики и интерферон в поддержании здоровья населения // Сборник материалов международной конференции «Пробиотики, пребиоти-ки, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы». - М., 2004. - С. 3-5.

26. Галкина ЛЛ, Феклисова JI.B., Казакова С.П., Амерханова А.М., Ма-шаланчук ИЛ., Ермаков А.Ф. Результаты применения биологически активной добавки «Полибактерин» в комплексной терапии больных ангинами // Там же. - С. 62-63.

27. Мескина EJ1., Феклисова JI.B., Амерханова AM., Машаланчук ИЛ, Ермаков А.Ф., Волохович Т.Т. Динамика показателей микробиоценоза толстой кишки у детей с острыми кишечными инфекциями, получавшими новый поликомпонентный отечественный синбиотик //. Там же. - С. 70-71.

28. Алешкин ВЛ, Амерханова А.М., Грачева Н.М., Петрова М.С., Москалева Т.Н., Аваков АЛ, Гаврилов А.Ф., Зубкова Е.С., Соловьева А.И. Комбинированные пробиотические препараты - оптимизация профилактики дисбактериозов // Там же. - С. 84-85.

29. Лаврова А.Е., Дмитриева Г.В., Амерханова AM., Зубкова Е.С., Пыри-кова ИЛ. «Бифидумбактерин Мульти-1» - новый пробиотик для коррекции дисбиоза у детей // Сборник материалов V съезда научного общества гастроэнтерологов России. - М, 2005. - С. 427-438.

30. Мескина Е.Р., Амерханова А.М., Пожалостина JI.B., Жиленкова О.Г. Сопоставление результатов клинико-лабораторного изучения микробиоценоза ротоглотки детей с острой респираторной патологией. //Сборник научно-практических работ «Современные подходы к профилактике, диагностике и лечению детей в амбулаторных условиях». - М., 2006. - С. 104-112.

31. Феклисова JI.B., Амерханова AM., Мескина Е.Р., Жиленкова О.Г., Пожалостина JI.B. Состояние микробиоценоза кишечника у детей, посещаю-

щих дошкольные учреждения, и возможность коррекции нарушений при использовании синбиотика Бифидум-Мульти-2 // Сборник работ Всероссийской научно-практической конференции «Этапная реабилитация и профилактика инфекционных заболеваний у детей». - СПб., 2006. - С. 75.

32. Феклисова Л.В., Мескина Е.Р., Амерханова А.М., Жиленкова О.Г., Воропаева ЕЛ., Пожалостина Л.В., Моисеева К Д. и.др. Микробиоценоз слизистых оболочек ротоглотки и кишечника у детей, посещающих детские сады // Там же. - С. 76.

33. Амерханова А.М., Алешкин ВА., Грачева Н.М., Петрова М.С., Попова ОН. Принципы конструирования и оценка клинической эффективности нового синбиотика Нормоспектрум® // Практическая медицина. - Казань, 2006. - № 4(18). - С. 46-47.

34. Феклисова Л.В., Мескина Е.Р., Амерханова А.М., Жиленкова О.Г. Новые препараты-синбиотики для коррекции микрофлоры у детей разных возрастных групп // Ремедиум Приволжья. - Н. Новгород, 2006. - № 6. - С. 53.

35. Мескина Е.Р., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В., Жиленкова О.Г., Моисеева К Д. Состояние микрофлоры кишечника у детей, посещающих детское дошкольное учреждение // Сборник научно-практических работ / Под ред. Л.В. Феклисовой. - М., 2006. - С. 104-112.

36. Троицкая Н.Б., Феклисова Л.В., Савицкая НА., Амерханова А.М., Моисеева КД., Воропаева ЕА., Мескина Е.Р. Микробиологическая и терапевтическая коррекция при использовании пробиотиков в лечении больных острой респираторной патологией и у здоровых детей // Сборник материалов научно-практической конференции «Современные вопросы лечебной и практической медицины». - М., 2006. - С. 202-206.

37. Мескина Е.Р., Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Жиленкова О.Г., Пожалостина Л.В. Новые пути оптимальной коррекции микробиологических нарушений кишечника у детей // Сборник материалов III ежегодной Московской конференции «Гнойно-септические заболевания у детей с участием регионов России и стран СНГ». -М., 2007. - С. 107-108.

38. Мескина Е.Р., Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В. Оценка эффективности использования препаратов Бифидум-Мульти-1 и Би-фидум-Мульти-2 в комплексе реабилитационных мероприятий у детей с дис-биотическими нарушениями кишечника // Сборник тезисов докладов XIV Российского конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007. - С. 718.

39. Амерханова А.М., Алешкин ВА., Афанасьев С.С., Жиленкова О.Г., Ли-сунова CA., Зубкова Е.С., Кураленко АЛ. Роль пробиотических микроорганизмов в современных технологиях профилактической и восстановительной медицины и возможности повышения эффективности препаратов на их основе // Новые лекарственные средства. - М., 2007. - Вып. 4. - С. 4-7.

40. Алешкин ВА., Амерханова AM., Жиленкова ОТ., Лисунова С.С., Зубкова Е.С., Кураленко АЛ. Синбиотики и их роль в современных технологиях профилактической и восстановительной медицины // Клиническое питание. - СПб., 2007. - № 1-2. - С. А19.

41. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова AM. Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвениро-вания фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы // Там же. - С. А31.

42. Жиленкова О.Г., Лисунова С А., Амерханова А.М., Зубкова Е.С., Кура-ленко АА. Чувствительность к антибактериальным препаратам производственных штаммов бифидо- и лактобактерий // Там же. - С. А41.

43. Пономарева ЛЛ., Бондарь О.Е., Анкирская А.С., Амерханова АМ., Лисунова С А., Жиленкова ОТ. Применение бактерийного препарата «Бифидум-Мульти» у новорожденных группы высокого инфекционного риска // Там же. -С. А63.

44. Феклисова Л.В., Амерханова АМ., Мескина ET., Жиленкова ОТ, Зубкова Е.С., Кураленко АА., Пожалостина ЛЛ., Воропаева ЕА., Моисеева К Д. Состояние микрофлоры кишечника и ротоглотки у детей детских дошкольных учреждений, возможность коррекции синбиотиком Бифидум-Мульти-2// Там же.-С. 20-22.

45. Мескина Е.Р., Феклисова Л.В., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В. Лечебное питание, как фактор коррекции параметров микробиоценоза толстой кишки у детей с учетом его возрастных особенностей // Сборник материалов научно-практической конференции педиатров России «Фармакология и диетология в педиатрии». - М., 2007. - С. 113.

46. Мескина Е.Р., Феклисова Л.В., Амерханова АМ., Пожалостина Л.В. Эффективность коррекции нарушения микробиоценоза толстой кишки у детей с учетом его возрастных особенностей // Там же. - С. 114.

47. Пономарева Л.В., Анкирская А.С., Бондарь ОТ., Амерханова А.М., Лисунова СЛ., Фурсова СЛ., Жиленкова ОТ. Сравнительная оценка эффективности использования препаратов Бифидум-Мульти-1 и Бифидумбактерин с целью профилактики у новорожденных высокого перинатального риска по реализации внутриутробных инфекций // Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007. - С. 730.

48. Соколов АА., Митрохин СД., Минаев В.И., Забазный Н.П., Сергеев СЛ., Широкорад В.И., Сергеев В.П., Амерханова АМ., Афанасьев С .С., Алеш-кин ВА. Современные подходы к антибиотикопрофилактике госпитальных инфекций у больных, находящихся в отделениях хирургического профиля онкологического стационара // Методические указания № 24. - М., 2007. -26 с.

49. Пожалостина Л£., Амерханова АМ., Феклисова Л Л., Лиханская ЕЛ. Распространение криптоспоридий среди детей, посещающих дошкольные учреждения» //4 Международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». - СПб., 2008. - С. 135.

50. Мескина Е.Р., Амерханова А.М., Пожалостина Л.В., Воропаева ЕЛ., Жиленкова О.Г. Некоторые клинические аспекты состояния микробиологических биотопов ротоглотки и кишечника у организованных дошкольников.// Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию детского инфекционного отделения МОНИКИ. - М., 2008. - С. 200-207.

51. Aleshkin VA.,AmerhanovaA.M., Pospelova V.V.,Afanasiev S.S., Shenderov В A. History, present situation, and prospects of probiotic research conducted in the G.N.Gabrichevsky Institute for Epidemiology and Microbiology // Microbial ecology in Yealth and Disease. - 2008. - 20. - P. 113-115.

Патенты

52. Патент РФ № 2180915 «Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте до 3-х лет». Заявка № 2001111553 от 28.04.2001 г. Опубл. 27.03.2002 г.

53. Патент РФ № 2180348 «Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры детей в возрасте от 3-х до 12-ти лет». Заявка № 2001111552 от 28.04.2001 г. Опубл. 10.03.2002 г.

54. Патент РФ № 2180914 «Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры людей в возрасте от 12-ти лет и старше». Заявка № 2001111551 от 28.04.2001. Опубл. 27.03.2002 г.

55. Патент РФ № 2214454 «Питательная среда для культивирования бифидобактерий». Заявка № 2001135502 от 29.12.2001 г. Опубл. 20.10.2003 г.

56. Патент РФ № 2260042 Штамм Bifidobacterium bifidum 791-ИН, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Заявка № 2002128794 от 28.10.2002 г. Опубл. 28.10.2002 г.

57. Патент РФ № 2244745 «Штамм Bifidobacterium longum 379-ИН, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, заквасок, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств». Заявка № 2003106129 от 05.03.2003 г. Опубл. 05.03.2003 г.

58. Патент РФ № 2264451 «Биопрепарат «Бифистим от 3 месяцев до 3 лет» для профилактики и лечения дисбактериозов и инфекционных болезней желудочно-кишечного тракта у детей в возрасте от 3 месяцев до 3 лет, биологически активная добавка к пище «Бифистим от 3 месяцев до 3 лет» для профилактики дисбактериозов и восстановления микрофлоры желудочно-кишечного тракта после антибиотикотерапии и других неблагоприятных воздействий у детей в возрасте от 3 месяцев до 3 лет и консорциум бифидобактерий для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта у детей в возрасте от 3 месяцев до 3 лет. Заявка № 2003129798 от 08.10.2003. Опубл.20.11.2005 г.

59. Патент РФ № 2264452 «Биопрепарат «Бифистим от 3 до 12» для профилактики и лечения дисбактериозов и инфекционных болезней желудочно-кишечного тракта у детей в возрасте от 3 до 12 лет, биологически активная добавка к пище «Бифистим от 3 до 12» для профилактики дисбактериозов и восстановления микрофлоры желудочно-кишечного тракта после антибиоти-46

котерапии и других неблагоприятных воздействий у детей в возрасте от 3 до 12 лет и консорциум бифидобактерий для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта у детей в возрасте от 3 до 12 лет. Заявка № 2003129799 от 08.10.2003. Опубл.20.11.2005 г.

60. Патент РФ № 2264450 «Биопрепарат «Бифистим для взрослых» для профилактики и лечения дисбактериозов и инфекционных болезней желудочно-кишечного тракта у людей старше 12 лет, биологически активная добавка к пище «Бифистим для взрослых» для профилактики дисбактериозов и восстановления микрофлоры желудочно-кишечного тракта после антибио-тикотерапии и других неблагоприятных воздействий у людей старше 12 лет и консорциум бифидобактерий для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта у людей старше 12 лет. Заявка № 2003129797 от 08.10.2003. Опубл.20.11.2005 г.

61. Патент РФ № 2301828 «Штамм Bifidobacterium gallinarum ГБ, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к кормам, ферментированных и неферментированных кормов, предназначенных для профилактики и лечения кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственной птицы». Заявка № 2006101729 от 23.01.2006 г. Опубл. 27.06.2007 г.

62. Патент РФ № 2268929 «Штамм Bifidobacterium bifidum 79-26, используемый для получения кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Заявка № 2004128814 от 30.09.2004 г. Опубл. 27.01.2006 г.

63. Патент РФ № 2268930 «Штамм Bifidobacterium bifidum 79-50, используемый для получени кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Заявка № 2004128815 от 30.09.2004 г. Опубл. 27.01.2006 г.

64. Патент РФ № 2268931 «Штамм Bifidobacterium bifidum 79-37, используемый дл получения кисломолочных ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Заявка № 2004128816 от 30.09.2004 г. Опубл. 27.01.2006 г.

Список сокращений

БАД - биологически активная добавка к пище. БГКП - бактерии группы кишечных палочек.

БС - среда для культивирования бифидобактерий производства ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского - Государственная коллекция нормальной микрофлоры Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского. ГМ- среда - гидролизатно-молочная среда. ГГСИ - госпитальные гнойно-септические инфекции. НИИ прикладной микробиологии, г. Оболенск. ЖКТ - желудочно-кишечный тракт. КЖ - культуральная жидкость. КОЕ - колониеобразующая единица. Lac+ - лактозопозитивные штаммы. Lac— лактозонегативные штаммы.

Лаг-фаза - период между посевом культуры бактерий и началом ее размножения.

ЛЖК - летучие жирные кислоты. МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза. М — среднее.

от - стандартная ошибка среднего.

ОСМ - оптический стандарт мутности.

ПЦР - полимеразная цепная реакция.

РАМН - Российская академия медицинских наук.

р - критический уровень значимости.

' Т - градусы Тернера.

t - критерий Стьюдента.

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы. ФОС - фруктоолигосахариды.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Амерханова, Аделаида Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Роль микрофлоры ЖКТ в жизнеобеспечении человека и методы коррекции ее нарушений в свете современных знаний (обзор литературы). 19

1.1 .Качественный и количественный состав микрофлоры ЖКТ и функции, которые она выполняет. 19

1.2.Последствия нарушений микробиоты ЖКТ и способы ее коррекции. 34

1.3. Свойства бифидобактерий и процесс становления бифидофлоры ЖКТ в онтогенезе. 41

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 63

2.1. Материалы.

2.1.1. Штаммы микроорганизмов, используемые в работе. 63

2.1.2. Питательные среды. 66

2.2. Методы исследования. 68

2.2.1. Метод выделения чистой культуры бифидобактерий.68

2.2.2. Метод биохимической идентификации бифидобактерий.69

2.2.3. Молекулярно- генетическое типирование бифидобактерий.

2.2.4. Определение чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом.71

2.2.5. Определение антагонистической активности.

2.2.6. Определение безвредности бактериальных культур штаммов бифидобактерий и лактобацилл.73

2.2.7. Активация культуры при подготовке к культивированию.

2.2.8. Метод глубинного культивирования.74

2.2.9. Определение числа жизнеспособных бифидобактерий и лактобацилл методом конечных разведений. 75

2. 2.10. Количественное определение ацидофильных лактобацилл. 76

2.2.11. Контроль микробной культуры (препарата) на наличие посторонней микрофлоры. 77

2.2.12. Изучение морфологии клеток.

2.2.13. Определение активности кислотообразования.78

2.2.14. Сушка-гранулирование в псевдоожиженном слое (ПС). 79

2.2.15. Распылительная сушка с низкой температурой теплоносителя. 80

2.2.16. Статистические методы обработки материалов исследований. 82

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. Выделение, изучение и отбор производственно-перспективных штаммов.84

3.1. Изучение морфологических свойств.84

3.2.Изучение биохимических свойств.89

3.3 Идентификация молекулярно-биологическими методами. 96

3.4. Изучение чувствительности к антибиотикам.99

3.5. Изучение антагонистических свойств.

3.6.Изучение культуральных свойств.103

ГЛАВА 4. Изучение динамики глубинного культивирования бифидобактерий с целью их производственного использования.

4.1.Изучение динамики культивирования отдельных культур.107

4.2.Изучение динамики культивирования бифидобактерий в составе многовидовой ассоциации.111

4.3. Изучение пребиотических свойств растворимых пищевых волокон

4.3.1. Изучение пребиотических свойств топинамбура. 116

4.3.2. Изучение пребиотических свойств цикория и смолы акации.120

ГЛАВА 5. Разработка режимов новых методов обезвоживания бифидобактерий - распылительного высушивания при низкой температуре теплоноситеносителя и сушки-гранулирования в псевдоожиженном слое.

5.1. Изучение отдельных технологических параметров распылительной сушки при низкой температуре теплоносителя.125

5.1.1. Изучение влияния фазы развития культуры на качество целевого продукта.126

5.1.2. Изучение влияния состава питательной среды на качество целевого продукта.127

5.1.3. Оценка выживаемости бифидобактерий в сухих препаратах.130

5.1.4. Влияние пектина на результаты хранения препаратов.132

5.2. Разработка методических подходов к высушиванию пробиотических микроорганизмов сушкой-гранулирования в псевдоожиженном слое.135

5.2.1. Влияние состава среды на процесс сушки и качество конечного продукта .136

5.2.2. Влияние защитных сред на эффективность процесса сушки и качество конечного продукта.138

5.2.3. Сравнительное изучение влияния различных носителей на процесс сушки и качество конечного продукта.140

ГЛАВА 6. Разработка рецептуры и технологической документации препаратов- синбиотиков.

6.1. Серия биологически активных добавок к пище «Бифидум-Мульти».142

6.2.Серия биологически активных добавок к пище «Нормоспектрум®».153

ГЛАВА 7. Результаты изучения эффективности препаратов-синбиотиков — биологически активных добавок к пище «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» при использовании в профилактической и восстановительной медицине.

7.1. Изучение эффективности и безопасности «Нормоспектрум» и «Бифидум-Мульти-3» у взрослых с вторичными дисбиозами.165

7.2. Изучение корригирующего влияния на микрофлору ЖЕСТ детей синбиотиков «Бифидум-Мульти-1» и «Бифидум-Мульти-2».172

7.3. Изучение корригирующего влияния на микрофлору ЖКТ детей синбиотика «Нормоспектрум для детей».177

7.4. Результаты применения Б АД «Бифидум-Мульти-1» у детей первого года жизни с нарушениями микроэкологического и функционального состояния ЖКТ.187

7.5. Применение БАД «Бифидум-Мульти-2» и «Нормоспектрум для детей» в детских дошкольных учреждениях с целью профилактики заболеваемости у часто болеющих детей.191

7.6. Результаты профилактики эндогенных и экзогенных инфекций в неонатологии с применением «Бифидум-Мульти-1».203

7.7. Использование БАД «Нормоспектрум для взрослых» для профилактики госпитальных гнойно-септических осложнений у больных с колоректальным раком.214

Введение Диссертация по биологии, на тему "Научно-производственная разработка новых препаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности"

Актуальность проблемы

В настоящее время становится реальностью нависшая над планетой угроза глобального экологического кризиса, существование в условиях которого приводит к развитию нарушений микробной экологии человека, сопровождающихся возникновением иммунодефицитных состояний, нарушением метаболических процессов и аллергизацией макроорганизма.

Наиболее восприимчивым к этим воздействиям является микробиоценоз кишечника, который реагирует на неблагоприятные факторы задолго до клинических проявлений снижением уровня индигенной микрофлоры и возрастанием содержания условно-патогенных микроорганизмов, т.е. состоянием дисбаланса микрофлоры — дисбиозом ( Куваева И.Б., 1991, Пинегин Б.В., 1984, Воробьев A.A.,1997, Шендеров Б.А, 1998, Коршунов В.М., 2000, Eckburg Р.В., 2005, Бондаренко В.М., 2007). Дисбиотические состояния широко распространены, имеют тяжелые последствия для здоровья, поэтому препараты для коррекции нарушенной микробиоты занимают одно из ведущих мест в комплексной терапии и профилактике заболеваний, при которых регистрируется дисбиоз. Ведущее место среди них принадлежит препаратам на основе микроорганизмов — представителей нормофлоры, что обусловлено их многофункциональным воздействием, включая нормализацию микробиоценоза, иммунного и метаболитного статуса организма, процессов электролитного обмена и т.д. (Поспелова В.В., 2000, Онищенко Г.Г., 2002, Воробьев A.A., 2004, Грачева Н.М., 2004, Мазанкова JI.H., 2004, Новокшенов A.A., Учайкин В.Ф., 2004, Кафарская Л.И., 2005, Осипова И.Г., 2006, Парфенов А.И., 2006, Бондаренко В.М., 2007, Феклисова JI.B., 2007 г., Лахтин В.М., 2008, Callaway T.R, 2008, Fotiadis C.I, 2008, Francavilla R.,2008, Myllyoma E., 2008).

В связи с широкой распространенностью дисбиотических состояний важное научное и прикладное значение имеет установление закономерностей, связанных с процессами формирования и стабилизации нормобиоценоза, причин, вызывающих его нарушения. Вместе с тем, в настоящее время наши представления об индигенной микрофлоре в полной мере не отражают как всего многообразия отношений внутри микробного сообщества биотопа, так и его взаимосвязей с макроорганизмом.

Так, рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен учитывать такое явление, как аутогенная сукцессия — последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише (Сукачев В.Н., 1964, Бигон М., Харпер Дж., 1989, Рыбальченко О.В., 2008). В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного - устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии (Разумовский С.М., 1999). Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающего с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен (Гончарова Г.И., 1982; Козлова Э.П., 1986, Леванова Л.А., 2003, Rambaud J.C. et al., 2006, Лахтин В.М., 2008).

Важно отметить при этом, что вмешательство неблагоприятных внешних факторов, таких как отсутствие грудного вскармливания, эндогенные инфекции, неблагоприятная экология ^ пр. могут нарушить естественный ход развития микробиоценоза (Соколова К.Я., 1999, Мухина Ю.Г., 2005, Кафарская Л.И., 2006, Smehilova, 2008). Становление микробиоценоза ЖЕСТ в младенческом возрасте во многом определяет физиологический и иммунный статус организма в будущем, поэтому нарушения в ходе этого процесса требуют коррекции. Конструирование препаратов, представляющих собой ассоциации доминирующих микроорганизмов, которые максимально приближены по составу к естественному микробиоценозу ЖКТ человека в определенный возрастной период, является обоснованным подходом к решению данной актуальной проблемы.

Усиление эффекта применяемых средств можно прогнозировать также от сочетанного использования рационально подобранного состава пробиотических микроорганизмов, пребиотиков и функционально активных ингредиентов, дефицит которых является следствием дисбиоза (Gibson G.R., 1995, Тутельян В.А., 2002, Лахтин В.М., 2008, Шендеров Б.А., 2008). Такие препараты относятся к группе синбиотиков (Collins M.D., 1999). Данное перспективное направление также открыто для дальнейших исследований.

Таким образом, выбор темы настоящего исследования определяется актуальностью разработки высокоэффективных средств нового поколения для коррекции микроэкологических нарушений у детей и взрослых.

Цель исследования

Научное обоснование, биотехнологическая разработка и клинико-лабораторное подтверждение эффективности новых подходов к коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ с помощью препаратов-синбиотиков на основе консорциумов бифидобактерий, комплементарных микробиоценозу различных возрастных групп людей, лактобацилл, пребиотиков и функционально значимых ингредиентов, дефицит которых возникает при дисбиозе.

Задачи исследования:

1. Изучить биологические, культуральные, физиолого-биохимические и молекулярно-генетические характеристики штаммов бифидобактерий, оценить их производственную перспективность и отобрать виды, которые относятся к основным представителям бифидофлоры ЖКТ человека.

2. Разработать условия совместного культивирования биомассы бифидобактерий, имеющей многовидовой состав.

3. Оптимизировать методы обезвоживания биомассы бифидобактерий и лактобацилл - распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя и сушки-гранулятора в псевдоожиженном слое.

4. Изучить пребиотические и технологические свойства различных растворимых пищевых волокон и оценить перспективность их включения в состав препаратов-синбиотиков.

5. Разработать рецептуру, технологическую документацию, изготовить экспериментально-производственные серии препаратов-синбиотиков. Оценить микробиологические, санитарно-гигиенические характеристики, сохранность всех компонентов препаратов при хранения. Осуществить их санитарно-гигиеническую экспертизу и государственную регистрацию на Федеральном уровне.

6. Изучить эффективность и безопасность разработанных препаратов при использовании в практике профилактической и восстановительной медицины у людей, относящихся к различным возрастным категориям.

Научная новизна

Впервые предложен алгоритм рецептуростроения препаратов нормофлоры, основанный на принципе видового доминирования бифидобактерий в ЖКТ у различных возрастных групп людей (Патенты РФ 2180348, 2180914, 2180915). Разработаны биотехнологические приемы конструирования препаратов-синбиотиков нового поколения «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» на основе консорциумов бифидобактерий, лактобацилл и ингредиентов, обладающих иммуностимулирующим, метаболическим и пребиотическим действием.

Теоретическая значимость

Выявленная в научных исследованиях смена видового состава бифидо-флоры в процессе онтогенеза явилась теоретическим обоснованием нового подхода к конструированию и применению средств коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ - использованию консорциумов микроорганизмов нормофлоры, видовой состав которых моделирует сукцессионные ряды, меняющиеся в течение жизни человека. Это обеспечивает их комплементарность микробиоценозам ЖКТ конкретных возрастных групп пациентов и обеспечивает высокую эффективность при применении.

Практическая значимость

Разработаны и внедрены в практику новые оригинальные препараты-синбиотики, высокоэффективные при коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ и дифференцированно подобранные для различных возрастных групп людей. Разработаны новые биотехнологические приемы совместного культивирования консорциумов бифидобактерий. Разработаны методы распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя и сушки-гранулятора в псевдоожиженном слое для получения препаратов с высоким содержанием пробиотических микроорганизмов, длительно сохраняющих жизнеспособность. Подтверждена пребиотическая активность ингредиентов - источников пищевых волокон (порошок клубней топинамбура, цикория, яблочного пектина) и показана их технологическая значимость для увеличения сроков и температурного диапазона хранения препаратов.

Проведенные исследования и разработанные на их основе рецептурный состав, санитарно-гигиенические документы и производственные регламенты позволили обеспечить прохождение процедуры независимой экспертизы продукции и документации и государственной регистрации Федеральной службой Роспотребнадзора с внесением в Государственный реестр биологически активных добавок к пище:

1. «Бифидум-Мульти-1» для детей от рождения до 3-х лет -СЭЗ № 7.99.03.919.Б.000085.10.05.

2. «Бифидум-Мульти-2» для детей от 3-х до 12-ти лет -СЭЗ № 7.99.03.919.Б.000086.10.05.

3. «Бифидум-Мульти-3» для взрослых - СЭЗ № 77.99.03.919.Б.000087.10.05 ( ТУ 9197-003-38989935-03, изменения к ТУ 9197-003-38989935-03 № 1.

4. «Нормоспектрум ® для детей» - СГР № 77.99.23.3.У.10079.9.05

5. «Нормоспектрум® для взрослых и детей старше 14-ти лет»

- СГР № 77.99.23.3.У. 10080.9.05 - ( ТУ 9197-004-38989935-05)

Впервые организовано производство и начат серийный выпуск перечисленных препаратов на предприятии биотехнологического профиля «Амфита».

Внедрение в практику

Разработанные препараты используются с профилактической целью и для реабилитации пациентов в следующих учреждениях:

1. «Бифидум-Мульти-1» в ГУ « Федеральное агентство высокотехнологичной медицинской помощи Научный Центр Акушерства, гинекологии и перинатологии» с целью профилактики эндогенных и экзогенных инфекций у новорожденных детей группы риска.

2. «Бифидум-Мульти-1» в условиях детской консультации для профилактики микроэкологических и функциональных нарушений ЖКТ у детей первых 18 месяцев жизни.

3. «Бифидум-Мульти-1» в условиях стационара НИИ детской гастроэнтерологии (г. Нижний Новгород) у детей с нарушениями пищеварения и микрофлоры кишечника.

4. «Бифидум-Мульти-1,2,3» в аллергологическом Центре КНИИЭМ (г.Казань) у детей с аллергодерматозами.

5. «Бифидум-Мульти-2» и «Нормоспектрум для детей» для профилактики острых респираторных заболеваний у часто болеющих детей, посещающих детские дошкольные учреждения.

6. «Бифидум-Мульти-1,2,3» в отделениях детских и взрослых инфекций клинической инфекционной больницы № 1 (г. Москва) для восстановления микрофлоры и функционального состояния ЖКТ у детей и взрослых пациентов с дисбактериозами, возникшими на фоне различных заболеваний.

7. «Нормоспектрум для детей» и «Нормоспектрум для взрослых» в отделениях детских и взрослых инфекций клинической инфекционной больницы № 1 (г. Москва) для восстановления микроэкологии и функционального состояния ЖКТ у детей и взрослых пациентов с дисбактериозами, возникшими на фоне различных заболеваний.

8. «Бифидум-Мульти-1,2» в Оренбургской государственной медицинской академии в комплексной схеме восстановления микрофлоры у девочек с неспецифическими вульвовагинитами.

9. «Нормоспектрум для взрослых» в Федеральном агентстве «НИИ иммунологии» для коррекции дисбиотических нарушений у больных после перенесенных аллергических заболеваний (г. Москва).

10. «Нормоспектрум для взрослых» на кафедре гастроэнтерологии ФГУ «УНМЦ» Управления делами Президента РФ для коррекции микрофлоры ЖКТ у пациентов с функциональными заболеваниями кишечника (синдром раздраженного кишечника, функциональный запор) с синдромом дисбактериоза.

11. «Нормоспектрум для взрослых» в клинической онкологической больнице № 62 (г. Москва ) для профилактики ГГСИ у больных, оперированных по поводу колоректального рака.

12. «Нормоспектрум для взрослых» в Астраханской государственной медицинской академии для восстановления микрофлоты ЖКТ у больных язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, гастродуоденита после проведения специфической антихеликобактериальной терапии.

Анализ результатов данных исследований приведен в клинических отзывах, актах внедрения, актах клинических наблюдений.

Награды за разработку и внедрение:

Получены: знак РОСТЕСТ ГОССТАНДАРТА РОССИИ - За высокое качество с правом маркировки продукции «ЗНАКОМ КАЧЕСТВА «ВСЕ ЛУЧШЕЕ ЗДОРОВЬЮ»; золотая медаль ВВЦ, 2002 г.; золотая медаль им. И.И.Мечникова Российской Академии естесственных наук «За практический вклад в укрепление здоровья нации» - 2003 г.; серебряная медаль III Московского международного салона инноваций в области биотехнологии -2003 г.; серебряная медаль Всероссийского научно-промышленного форума «Россия-единая - 2003»; золотая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии - 2004 г.; бронзовая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии, 2006 г.; золотая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии, 2008 г.; медаль Международного фонда биотехнологий им. I академика И.Н.Блохиной за участие в конкурсе «Биотехнологические проекты для повышения качества жизни человека».

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 1 от 24 января 2008 г. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях:

• Международная научно-практическая конференция «Пробиотические микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования» (Москва, 2002);

Всероссийский симпозиум «Современные аспекты здорового образа жизни» (Москва, 2003);

Всероссийский форум «Великие реки» в рамках конкурса «Биотехнологические проекты для повышения качества жизни человека» (Нижний Новгород, 2003);

Международная конференция «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, 2003);

7-ой Международный Конгресс «Здоровое питание» (Москва, 2003); Международная научно-практическая конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004); 6-ая Международная ассамблея «Новые медицинские технологии» (Москва, 2006);

Международный конгресс «Новые технологии в детском питании» (Москва, 2006);

Международный научно-практический конгресс «Человек в экстремальных условиях: здоровье, надежность и реабилитация» (Москва, 2006);

Международный симпозиум «Иммунобиологические препараты в педиатрии» (Москва, 2006);

Всероссийская конференция детских инфекционистов (Санкт-Петербург, 2006);

Международный конгресс «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические проблемы» (Санкт-Петербург, 2007);

Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2007, 2008,2009);

• Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009).

Положения, выносимые на защиту

1. Отбор видов, бифидобактерий по признаку доминирования в микробиоценозе ЖКТ различных возрастных групп людей представляет собой новый концептуальный подход к конструированию препаратов для коррекции микрофлрры кишечника.

2. Устойчивые консорциумы — продукт совместного культивирования симбиотической ассоциации технологичных и высокоэффективных видов бифидобактерий являются основой для получения препаратов нового поколения.

3. Распылительная сушка при низкой температуре теплоносителя и сушка-гранулирование в псевдоожиженном слое перспективны для получения высокоактивных- препаратов на основе пробиотических микроорганизмов длительного хранения в широком диапазоне температур.

4. Новый.концептуальный подход в,разработке и принципе рецептуростроения оригинальных препаратов-синбиотиков «Бифидум-мульти» и «Нормоспектрум».

5. Преимущества по клинико-лабораторным показателям синбиотиков «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» при использовании в профилактической и восстановительной медицине у разных возрастных групп пациентов по сравнению с аналогичными препаратами моновидового состава.

Публикации

Основное содержание работы отражено в 64 научных публикациях: в статьях, в том числе, в рекомендованных ВАК РФ — 8, в других изданиях - 43, в патентах на изобретение — 12, в методических указаниях -1.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы из 416 наименований, в том числе, 208 зарубежных и 208 отечественных работ. Диссертация изложена на 280 страницах основного текста, содержит 31 рисунок и 79 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Амерханова, Аделаида Михайловна

247 ВЫВОДЫ

1. Изучены технологические, пробиотические и молекулярно-биологические свойства бифидобактерий и произведен отбор промышленно-перспективных штаммов, относящихся к видам, доминирующим в микробиоценозе ЖКТ человека.

2. Разработан метод совместного культивирования высокоэффективных и технологичных штаммов бифидобактерий разных видов с целью получения устойчивых консорциумов — основы для препаратов нового поколения. Показано, что в консорциуме не только суммируются количественные (число КОЕ/мл бифидобактерий) и качественные (индивидуальные свойства штаммов) показатели, но проявляется синергидный эффект, что подтверждалось усилением антагонистической активности и повышением устойчивости при хранении по сравнению с отдельными культурами.

3. Разработаны методические подходы, подобраны питательные и защитные среды, технологические добавки (порошок топинамбура, цикория, яблочный пектин), позволяющие использовать современные методы высушивания — распылительную сушку при низкой температуре теплоносителя и сушку-гранулирование в псевдоожиженном слое - для получения биомассы пробиотических микроорганизмов с высокой степенью жизнеспособности, устойчивости к длительному хранению в широком диапазоне температур.

4. Предложен новый концептуальный подход к конструированию и назначению препаратов нормофлоры целевого назначения пациентам разных возрастных групп, основанный на видах бифидобактерий, доминирующих в микробиоценозе этих возрастных категорий: у детей от рождения до 3-х лет: B.infantis, В.breve, B.bifidum, B.longum, у детей от 3 до 14 лет - В.breve, B.bifidum, B.longum, у подростков и взрослых - B.bifidum, B.longum, B.adolescentis.

5. На основе предложенного принципа рецептуростроения и новых технологических приемов разработаны и зарегистрированы в Федеральном реестре Роспотребнадзора препараты-синбиотики нового поколения «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» для разных возрастных групп людей, сочетающие в себе устойчивые консорциумы бифидобактерий, лактобациллы и функциональные добавки, оказывающие метаболический, иммуностимулирующий и защитный эффект.

6. При использовании в различных областях профилактической и восстановительной медицины у пациентов, относящихся к разным возрастным группам: у новорожденных высокого риска развития эндо- и экзогенных инфекций (61 ребенок), детей с нарушениями пищеварения (26 детей), детей с вторичными дисбиозами после перенесенных заболеваний (68 детей), часто болеющих детей в детских дошкольных учреждениях (90 детей), онкобольных хирургического отделения с высоким риском развития инфекционных осложнений (200 больных) — была подтверждена высокая эффективность, безвредность препаратов-синбиотиков «Бифидум-Мульти» и

Нормоспектрум», а также доказано их преимущество по клиническим и лабораторным показателям перед аналогичными препаратами моновидового состава.

Практические рекомендации

1. В течение жизни видовой состав бифидобактерий в микробиоценозе ЖКТ человека претерпевает изменения, связанные с физиологическими особенностями, гормональным статусом, пищевым рационом, которые также изменяются в различные жизненные периоды. Установлено, что для людей, относящихся к различным возрастным группам, характерны определенные виды бифидобактерий, которые чаще всего встречаются ассоциациями.

2. Учитывая то, что различные виды бифидобактерий обладают выраженными биологическими особенностями и выделяются ассоциациями из нескольких видов, коррекция дисбиотических нарушений должна производиться, с учетом данной закономерности, а назначаемые препараты содержать ассоциации пробиотических микроорганизмов тех видов, которые комплементарны микробиоценозу, пациента.

3. Для усиления, эффекта, помимо пробиотических микроорганизмов, в состав, препарата рекомендуется включать пребиотики, стимулирующие рост как индигенной, так и пробиотической микрофлоры, а также другие биологически активные функциональные ингредиенты, дефицит которых является следствием дисбактериоза. Это, прежде всего, витамины и минералы в рекомендуемых дозировках.

4. Биологически активные добавки к пище «Бифидум-Мульти-1», «Бифидум-Мульти-2» «Бифидум-Мульти-3», «Нормоспектрум для детей», «Нормоспектрум для взрослых» являются препаратами-синбиотиками нового поколения, сконструированные с учетом принципов, использованных в работе, и новых технологических приемов.

5. Налажен промышленный выпуск данных препаратов, что позволяет широко применять их в различных областях профилактической и восстановительной медицины.

6. Целесообразно использование БАД «Бифидум-Мульти-1» в неонатологии с целью профилактики эндогенных и экзогенных инфекций у детей группы высокого перинатального инфекционного риска с рождения до выписки (т.е. 5-6 дней), что позволяет эффективно формировать у них нормальную микрофлору кишечника, препятствует заселению УПМ.

7. Клинически здоровые дети в возрасте до 18 месяцев, находящиеся на искусственном или смешанном вскармливании, при детальном клинико-лабораторном осмотре часто обнаруживают проявления дисбиоза кишечника, который приводит к нарушению функционального состояния ЖКТ ребенка и замедляет его развитие. В таких случаях рекомендуется коррекция синбиотиком «Бифидум-Мульти-1», что способствует устранению дисбиотических нарушений, нормализации работы ЖКТ, улучшает массо-ростовые показатели и общее состояние здоровья детей.

7. Известно, что течение многих заболеваний осложняется дисбиотическими нарушениями ЖКТ. Применение серий БАД-синбиотиков «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» у пациентов всех возрастных групп при заболеваниях, сопровождающихся дисбактериозом кишечника: острых кишечных инфекциях, в том числе ротовирусной, аденовирусной инфекции, атопическом дерматите, функциональных расстройствах пищеварения (гастродуоденит, функциональные запоры, дискинезия желчевыводящих путей, панкреатопатия) - приводит к снижению степени дисбиотических нарушений, элиминирует УПМ, улучшает клинические показатели.

8. Микрофлора ЖКТ является самым значимым биотопом в макроорганизме и, выполняя ведущую роль, влияет на состояние колонизационной резистентности других биотопов, в частности, ротоглотки. Как показали исследования, проведенные в детских дошкольных учреждениях в рамках настоящей работы, уровень заболеваемости коррелирует с состоянием микробиоценозов ротоглотки и ЖКТ: при повышенном уровне заболеваемости, в особенности, при наличии осложненных форм, наблюдаются дисбиотические изменения в обоих биотопах. Поэтому при организации профилактических мероприятий по снижению детской заболеваемости острыми респираторными инфекциями различной этиологии рекомендуется проведение коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта с помощью препаратов нормофлоры. Применение с этой целью синбиотиков «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» способствует снижению уровня заболеваемости у детей. Особое значение это приобретает в организованных детских коллективах, где высок риск взаимного инфицирования.

9. В условиях онкологического стационара для снижения уровня госпитальных гнойно-септических инфекций у больных колоректальным раком наиболее рациональной и эффективной схемой предоперационной подготовки и послеоперационного ведения больных является применение синбиотика «Нормоспектрум» в сочетании с энтеросорбентом на фоне селективной деконтаминации и антибиотикопрофилактики.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Амерханова, Аделаида Михайловна, Москва

1. Авдеев В.Г. Пробиотики и пребиотики в лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта // Клинич. фармакология и терапия. 2006.- № 15(1).- С.36-40.

2. Агаджанян H.A., Труханов А.И., Шендеров Б.А.//Этюды об адаптации и путях сохранения здоровья.- М:Сирин.- 2002.-156 с.

3. Александрова Х.М. Изучение эффективности антагонистических препаратов в комплексной терапии кишечных инфекций у детей // Авторсф.дис. .канд. мед.наук.-Москва.- 1972.-15 с.

4. Александрович Н.Ж, Пирогова З.И. Нарушение микробного пейзажа человека и пути их коррекции // Клиническое питание.-2005. № 2.-С.43-46.

5. Алешукина A.B. Видовой состав лактобактерий, выделенных от людей с дисбактериозом кишечника //Матер.VIII съезда Всеросс.Общества эпидемиол., микробиол. и паразитологов.-М.-2002.-Т.1.-С. 127-128.

6. Анкирская A.C. Влияние эубиотиков на состав микробиоценоза влагалища у беременных, страдающих истрико-цервикалыюй недостаточностью

7. Медицинские аспекты микробной экологии: Сб.научн/гр. МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского. М.-1991.- С.204-209.

8. Анохин В.А., Тюрин Ю.А. Роль основных представителей анаэробной кишечной микрофлоры в норме и патологии // Казанский медицинский журнал. 2001.- Т.82.- №2.- С.149-151.

9. Ардатская М.Д., Минушкин O.II. и др. Способ определения микрофлоры влагалища и способ лечения заболеваний, сопровождающихся нарушениями микрофлоры влагалища // Патент РФ,- № 227-447.- приоритет от 09.07.2004.

10. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях //Л.:Медицина.-1962.-160 с.

11. Бандоян А.К. и др. Состав регуляторов автолиза бактерий //Микробиология.- 1984.-Т.53.-№6.-С.942-946.

12. П.Бархатова Т.В. Создание технологий синбиотических продуктов на основе растительных олигосахаридов // Автореф.дис.д-ратехнич.наук.-Ставрополь.- 2003.-48 с.

13. Белобородова II.В. Селективная деконтаминация в профилактике и лечении хирургической инфекции у новорожденных//Автореф. дис.канд.мед.наук.- М.-1983.-24 с.

14. Белова И.В. Конструирование нового многокомпонентного пробиотика и использование его в комплексной терапии хеликобактерассоциированных заболеваний // Автореф.дис. канд.мед.наук.-Н.Новгород.- 2005.-24 с.

15. Бигон М., Харпер Дж. Экология. Особи, популяции и сообщества: в 2-х томах.//М.:Мир.-1989.

16. Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве //Сб.научных трудов под редакцией Никитина Д.П.-М.-1986.-208 с.

17. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, методы выявления. // Журн.микробиол .-2003 .-№3 .-С .109-113.

18. Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г. Дисбактериозы // Л,- 1979.- 276 с.

19. Бовкун Г.Ф., Иванов И.Ю., Поспелова В.В., Алешкин В.А. и др. Биологическая характеристика и перспективы использования в составе пробиотиков нового штамма бифидобактерий // Вестник Российской АМН.-2006.-№3.- С.26-30.

20. Богданова Е.А., Несвижский Ю.В., Воробьев А.А., Брюхова М.В. Адгезивные свойства лактобацилл и эшерихий в различных отделах желудочно-кишечного тракта человека в норме и патологии // Всстник Российской АМН.-2006.-№1 .-С35-38.

21. Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией //Журн.микробиол. 2004.- №1,- С.84-92.

22. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. и клиническая гастроэнтерология.- 2004.-Т.З.- С. 83-87.

23. Бондаренко В.М. Прикладные аспекты молекулярной биологии бифидобактерий и лактобацилл //Журн. микробиол. -2006.-№2.- С.89-97.

24. Бондаренко В.М. Молекулярно-генетические и молекулярно-биологические исследования представителей родов Bifidobacterium и Lactobacillus // Вестник Российской АМН.-2006 №1.-С 18-23.

25. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лаборагорный синдром: современное состояние проблемы // М:ГЭОТАР. М,- 2007.- 389 с.

26. Бондаренко В.М. По поводу нового подхода к классификации фармакопейных лекарственных пробиотических препаратов, биологически активных добавок к пище и продуктов функционального питания // Фарматека.-2007.-Т.2.-№137.-С.62-64.

27. Бондаренко В.М. Роль условно-патогенных бактерий кишечника в полиорганной патологии человека // М.- 2007.-63 с.

28. Бондаренко В.М. Роль транслокации кишечной бактериальной аутофлоры и ее токсических биомолекул в патологии человека//Эксперимен. клин.гастроэнтерология,- 2007.-№5.-С.86-93.

29. Брудаетов Ю.А. Выживание бактерий при взаимодействии с эффекторными механизмами защиты хозяина// Автореф. дис. .докт.мед.наук.- 0ренбург.-2004.-43 с.

30. Булатова Е.М., Габрусская Т.В., Нетребко O.K. Питание и формирование здоровой кишечной микрофлоры у детей первых месяцев жизни // Педиатрия.-2007.-Т.86.-№3.-С.85-89.

31. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий.//М.: Медицина. — 1999.-366 с.

32. Бухарин О.В. и др. Характеристика изменений микробиоценоза у больных хроническим неспецифическим уретритом // Журнал.микробиол.- 2001 ,-№4.-С.86-89.

33. Валышев A.B., Елагина H.H., Кириллов В.А. Влияние бифидобактерий на антилизоцимную активность эптеробактерий // Журн. Микробиол.-2000.-№4. -С.77-79.

34. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М. Перспективы создания пробиотических препаратов на основе «чувства кворума» у бактерий // Журнал. микробиол.-2006.-№3.- С. 105113.

35. Вахитов Т.Я., Момот E.H., Толпаров Ю.Н. Динамика и функции окзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichia coli М-17// Журнал. Микробиол.-2005.-№1.-С.16-21.

36. Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю., Петров Л.Н., Королюк A.M. Изучение действия препарата аугостимуляторов роста Escherichia coli М-17 (препарат «Актофлор») на рос г чистых и смешанных культур бактерий //Журнал Микробиол.-2000.-№3.-С.20-24.

37. Вершинина А.Е., Колоджиева, Е.И.Ермоленко и др. Генетическая идентификация как способ выявления патогенных и симбионтных штаммов энтеробактерий // Журнал микробиол.-2006.-№ 5.-С.83-87.

38. Воеводин Д.А., Розанова Г.Н., Стенина М.А. Дисбактериоз и иммунопатологический процесс // Журнал Микробиол.-2005.-№2.-С.89.

39. Воеводин Д.А., Розанова Г.Н., Стенина М.А., Чередеев А.Н. Роль дисбактериоза в фомировании хронической инфекционной патологии у детей // Журнал Микробиол.-2001.-№6.-С.88-93.

40. Волосникова И.В. Холестерин-модифицирующая активность лакюбацилл in vitro.// Сб.трудов МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского. Проблемы медицинской биотехнологии и иммунологии инфекц. болезней. М.-1996.-Т.2.-С. 119-124.

41. Воробьев A.A., Абрамов H.A., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы актуальная проблема медицины // Вестник Российской АМН.-1997.-№3.-С.4-7.

42. Воробьев A.A., Гинцбург A.JI., Бондаренко В.М. Мир микробов // Вестник Российской АМН,-2000.-№11.-С.11-14.

43. Воробьев A.A., Бондаренко В.М., Лыкова Е.А. и др. Микроэкологические нарушения при клинической патологии и их коррекция бифидосодержащими нробиотиками //Вестник Российской АМН.- 2004,- №2.- С. 13-17.

44. Воробьев A.A., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А. и др. Анализ штаммовой общности пристеночных биотопов желудочно-кишечного тракта // Вестник Российской АМН,- 2004.- № 6.- С.15-18.

45. Воробьев A.A., Лыкова Е.А., Феклисова Л.В. и др. Использование больших доз пробиотика бифидумбактерин форте в лечении ОРВИ у детей: клинические и иммунобиологические результаты // Эпидемиология и инфекционные болезни.-2004.-№5.-С.43-46.

46. Воробьев A.A., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев M.JI. Особенности микробиоценоза пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс // Журн. микробиол.-2005.- №6.- С.3-7.

47. Ганина В.И. Научные и практические основы биотехнологии кисломолочных продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами //Автореф.дис. .д-ра технич.наук.-М.- 2001.- 48 с.

48. Герасимова Е.В., Несвижский Ю.В., Воробьев A.A., Богданов Е.А. Изучение фекального микробиоценоза человека при экспериментальном моделировании запора. // Вестник Российской АМН.-2006.-№1 .-С. 15-17.

49. Гинцбург А.Л., Ильина Т.С., Романова Ю.М. «Quorum Sensing» или социальное поведение бактерий // Журн. Микробиол.-2003 .-№ 5.- С.86-89.

50. Гланц С. Медико-биологическая статистика М,- Практика.-1999.-459 с.

51. Гриневич В.Г.и др. Пребиотики в лечении заболеваний внутренних органов //Российский медицинский журнал.- 2003.-№ 5,- С.53-56.

52. Глушанова H.A. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника//Автореф.дисс.докт.мед.наук.-Москва.-2005.-.24 с.

53. Глушанова ILA., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл в условиях совместного культививрования in vitro // Журнал микробиол 2005.-№2.- С.56-61.

54. Глушанова H.A., Н.Б. Вербицкая, Л.Н.Петров, А.И.Блинов, Б.А.Шендеров/ Исследование ауто-, изо- и гомоантагонизма пробиотических штаммов лактобацилл // Бюллетень ВСПЦ СО Российской АМН.- 2005.- Т.6 (44).- С. 138142.

55. Гончарова В.В. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни //Авюреф.дисс. . канд.биол.наук.-Москва. 1970.- 15 с.

56. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин//Автореф.дис. .д-ра биол.наук.-М.- 1982.-48 с.

57. Гончарова Г.И., Лянная A.M., Козлова Э.П., Семенова Л.П. Роль бифидофлоры в повышении устойчивости организма к инфекции //В сб. материалов международной конференции «Гнотобиология втеоретич. и практической медицине».- М,- 1987.- С.62.

58. Горелов A.B. Терапия острых кишечных инфекций у детей в современных условиях // Вопросы современной педиатрии.- 2004.- Т.З.-№4.- С.72-78.

59. Грачева Н.М. Дисбактериозы и суперинфекции, причины их возникновения, диагностика, лечение//Лечащий врач.- 1991.-№ 1.- С. 18-21.

60. Грачева Н.М., Бондарепко В.М. Пробиотические препараты в« терапии и профилактике дисбактериоза кишечника// Инфекц. болезни. -2004.- Т.2.- №2.-С.53-58.

61. Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий //Антибиотики и химиотерапия.- 2003.-Т.48-№10.-С.32-39.

62. Денисова И.В. Санитарно-гигеническая и микробиологическая характеристика новых пробиотических препаратов «Соя-бифидум» и «Соя-лактум».//Автореф.дисс. .кандид.мед.наук.- Оренбург.- 2006.- .23 с.

63. Денисова С.Н., Сидоров И.И. Клиническая эффективность смесей с пробиотиками<у детей с инфекционными заболеваниями// Вопросы детской диетологии.-2006.-Т.4.-№5.-С.31-34.

64. Дещекина М.Ф., Коршунов В.М., Демин В.Ф. и др. Изучение формирования микрофлоры кишечника у новорожденных детей при совместном'и раздельном пребывании с матерью. // Педиатрия.-1990.-№1 .-С. 13-17.

65. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов. // М.: Медицина. 1969.-152 с.

66. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А.Функциональное питание//М.:Грантъ.- 2002.-296 с.

67. Дубровская М.И., Мухина Ю.Г., Кафарская Л.И., Шумилов П.В. Современные представления о механизмах формирования иммунного ответа слизистой оболочки кишечника детей раннего возраста//Журн. Трудный пациент- 2006.- Т.4.-№6.-С.9-14.

68. Евелёва В.В., Саенко A.II., Гаджиев Э А. Пищевая молочная кислота // Пищевая промышленность. 1994. -№11.- С.29.

69. Ермоленко Е.И., Суворов А.Н., Воейкова A.B. Определение антагонистической активности лактобактерий // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы: Сб. материалов конф. Москва.-2004.-С.25-26.

70. Ефимов Б.А., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Современные методы оценки качественных и количественных показателей микрофлоры кишечника и влагалища // Журн.Микробиол.-2002.-№4.-С.72-78.

71. Ефимов Б.А. Микроэкология кишечника человека, коррекция микрофлоры при дисбиотических состояниях // Автореф.дис. .д-рамедиц.наук.-М.- 2005.-48 с.

72. Ефимов Е.И., Соколова К.Я. Диагностика и биокоррекция нарушений антиинфекционного гомеостаза в системе «мать-дитя» // Н.-Новг: НГМА 2004 - 378 с.

73. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Боидаренко В.М. Модуляция клеток иммунной системы лактобакгериями//Жури. Микробиол.-2004.-№6.-С.57-60.

74. Ильина Т.С., Романова A.JL, Гинцбург A.JI. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика.-2004.-№ 40 (11).- С. 1-12.

75. Калмыкова А.И., Селятинская В.Г., Пальчикова H.A., Бгагова Н.П. Клеточные и системные механизмы действия пробиотиков. // Новосибирск.-2007.-279 с.

76. Кардашова Е.В., TopcKafls Е.М., Абрамова C.B. Ингибиторы протеолитических ферментов, продуцируемые лактобациллами // Проблемы медиц. биотехн. и иммунол. инфекц. болезней.: Сб. тр. МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского.-М.-1996.-Т.2- С. 113-118.

77. Карпушина С.Г., Тюрин М.В., Иванов A.A., Митрохин С.Д., Лившиц В.А. Выделение, идентификация и некоторые биологические свойства бифидобактерий из кишечника человека // Биотехнология. 1998. - №2. - С.28-36.

78. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры // Русский медициискийокурнал.-2000.-Т.8.-№13-14.-С.572-575.

79. Кафарская Л.И. Современные подходы к профилактике и лечению гнойно- септических инфекций у плода и новорожденного// Автореф. дис. .д-ра мед.наук.-М.- 2002.- 45 с.

80. Кафарская Л.И., Инжеваткина С.М., Володин H.H., Ефимов Б.А. Терапевтический потенциал пробиотиков: оптимизация иммунного ответа и восстановление экосистемы кишечника //Вопросы детской диетологии.- 2005- Т.З.- №1.- С.72-95.

81. Кафарская Л.И, Володин Н.Н, Афанасьев С.С., Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А. Особенности микробной колонизации кишечника новорожденных и недоношенных детей в отделении реанимации и интенсивной терапии // Вестник Российской АМН.- 2006.- №1- С. 10-15.

82. Кафарская Л.И., Постникова Е.А., Донских Е.Д., Ефимов Б.А. Особенности становления микрофлоры у детей раннего возраста //Детские инфекции.- 2006.- Т.5.- №1.- С. 6-11.

83. Коденцова В.М., Вржесинская O.A., Спиричева Т.В. и др. Обеспеченность витаминами детей дошкольного и младшего школьного возраста из группы риска по возникновению нарушений минерализации костной ткани // Вопросы питания.-2002.-71 (3).- С.3-7.

84. Коденцова В.М., Вржесинская O.A. Вигаминно-минеральные комплексы: соотношение доза-эффект // Вопросы детской диетологии.-2006- Т.4.- №4.- С.21.

85. Козлова Э.П. Микрофлора кишечника новорожденных в норме и патологии и восстановление ее бифидумбактерином //Автореф. дис. .канд. мед.наук.-М.- 1978.-25 с.

86. Кондракова О.А., Бабин В.Н., Грубова Е.А. и др. Комплексная оценка микроэкологических и функциональных нарушений толстого кишечника для обеспечения этиотропной терапии // Пособие для врачей,- ГУ МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского.-М.-2003.-33 с.

87. Конь И.Я. и др. Современная схема вскармливания детей первого года жизни //Педиатрия.-1997.-№3.- С.61-66.

88. Конь И.Я. Пробиотики и кисломолочные продукты в питании детей раннего возраста // Лечащий врач.-2007,- № 1. с. 21-25/

89. Конь И.Я., Георгиева О.В., Абрамова Е.В. Пребиотики в продуктах детского питания: изучение эффективности каши, обогащенной иребиотиком, в питании детей, первого года жизни // Вопросы детской диетологии. 2008.-т.1.-Т.1.-№6.-С.66-70.

90. Конь И.Я., Тоболева М.А., Коростслева М.М. Витаминная недостаточность: причины и пути коррекции//Вопросы детской диетологии 2008.-т.6-№5.-С.74-76.

91. Коровина Н. А., Вяхирева 3. Н., Захарова И. Н., Заплатников А. Л. Профилактика и коррекция нарушений микробиоценоза кишечника у детей раннего возраста// М.- 1995.- 130 с.

92. Коршунова О.В., Кафарская Л.И., Ефимов Б.А. Применение биотерапевтических препаратов для коррекции микробного статуса у беременных женщин // Журнал Микробиол.-2000.-№5.-С. 69-72.

93. Коршунов В.М., Уртаева З.А., Смеянов В.В. и др. Изучение антагонистической активности бифидобактерий in vitro и in vivo с использованием гнотобиологической технологии // Журнал Микробиол.-1999.-№5.- С.72-77.

94. Коршунов В.М., Синицина Н.А., Гинодман Г.А., Пинегин Б.В. Коррекция микрофлоры кишечника при химиотерапевтических дисбактериозах с помощью аутоштаммов бифидобактерий и лактобацилл //Журн. микробиол.-1985.-№9.-С-20-25.

95. Коршунов В.М. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника // Вестник Российской АМН.-1996.-№2.-С.60-65.

96. Коршунов В.М., Володин Б.А., Ефимов Б.А. Дисбактериозы кишечника. // Детская больница.-2000.-№1.-С.66-74.

97. Коршунов В.М., Поташник Л.В., Ефимов Б.А. и др. Качественный состав нормальной микрофлоры кишечника у лиц различных возрастных групп// Журн.микробиол. 2001.- № 2.-С.57-61.

98. Критская И.В., Баснакьян И.А., Гиршович Е.С., Танирбергенов Т.Б. Разработка питательной среды для накопления биомассы Bifidobacterium bifidum в процессе непрерывного культивирования в биореакторе // Биотехнология.- 1996.-№5.- С.81-83.

99. Куваева И.Б. Микроэкологическая система в оценке эффективности биологическиактивных добавок и продуктов с пробиотическим действием //

100. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека,- Матер.Всерос.конфер. с междунар. участием.- М.-1999.-С. 18-20.

101. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей // М.:Медицина.-1991 .-С. 240.

102. Кузнецова Г.Г., Шевелева С.А. Пробиотикограмма новый подход к коррекции дисбиотических отклонений в микробиоценозе толстой кишки //Здоровое питание населения России: Матер. VII Всерос. Конгресса.-М.-2003.-С.270-273.

103. Лазарева Е.Б. Бактериофаги и пектины в коррекции нарушений микробиоцепозов при гнойно-воспалительных процессах//Автореф. дис. д-ра мед.наук.-М.- 2007.- 50 с.

104. Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Несвижский Ю.В., Поспелова В.В. и др. // Стратегические аспекты конструирования пробиогиков будущего.- Вестник Российской АМН.- 2008.- № 2.-С.33-44.

105. Лахтин. В.М., Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Несвижский Ю.В., Поспелова В.В. Общие свойства и принципы функционирования лекгинов в биосистемах // Вестник Российской АМН.-№3.-2008.-С.37-42.

106. Лахтин В.М., Алешкин В.А., Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Поспелова В.В., Шендеров Б.А. Лектины, адгезины и лектиноподобные вещества лактобацилл и бифидобактерий // Вестник Российской АМН,- 2006, № 1.- С.28-34.

107. Левапова Л.А. Микроэкология кишечника жителей Западной Сибири. Коррекция дисбиотических состояний//Автореф.дис. .докт.мед.наук.-М.-2003.-48 с.

108. Леванова Л.Л., Алешкин В.А., Воробьев А.Л., и др. Возрастные особенности микробиоценоза кишечника у жителей г.Кемерово // Журн. Микробиол.-2001 ,-№3.-С.72-75.

109. Ленцнер A.A., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. Лактофлора и колонизационная резистентность// Антибиотики и медиц. биотехнология.-1987.-Т.32.-№3.-С. 173-179.

110. Лизысо H.H., Шилов В.М. Современная концепция состава кишечной микрофлоры у здоровых взрослых людей//Журнал Микробиол.- 1979.-№2.-С.36-41.

111. Лизько H.H. Дисбактериозы экстремальных состояний // Антибиотики и медицинская биотехнология.-1987.-Т.32.-№3.- С. 184-186.

112. Литяева Л.А., Кононыхина ЕЛО. Применение биологически активной добавки с бифидобактериями у новорожденных детей группы риска // Медицинские аспекты микробной экологии: Сб.трудов МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского.-М.-1992.-Т.6.- С.82-86.

113. Лиходед В.Г., Каверина К.Г., Кошурко Л.И., Лобова Е.А. Микробиологическая характеристика дисбактериоза кишечника у детей и взрослых, проживающих в г.Москве // Жури. Микробиол.-1999.-№4.- С.65-67.

114. Лопатина Т.К., Бляхер М.С., Николаенко В.Н. и др. Иммуномодулирующее действие препаратов-эубиотиков //Вестник Российской АМН.-1997.-№3.-С.30-34.

115. Лыкова Е.А., Мурашева А.О., Бондаренко В.М. Нарушение микрофлоры кишечника и иммунитета у детей с аллергическими' дерматитами- и их коррекция // Росс.Педиатр.журнал.-2000.-№2.- С.88-91.

116. Лыкова Е.А., Бондаренко В.М.,'Парфенов.А.И.и др. Синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке: патогенез, клиническое значение и тактика терапии // Эксперим. Клин.гастроэнтерол.-2005.-№ 6.- С.51-57.

117. Лянная A.M., Гончарова Г.И., Высоцкий В.В1 Морфология бифидобактерий на. светооптическом и электронно-микроскопическом уровне и их биологические свойстваю // Журн. микробиол. 1979. - №6. - С.54-58.

118. Лянная A.M. Видовой состав коллекции бифидобактерий и их биологические свойства // Автореф. дис. .канд. биол.наук.-М.- 1981.- 24 с.

119. Мазанкова Л.Н., Лыкова Е.А. Пробиотики: Характеристика препаратов и выбор в педиатрической практике // Детские инфекции.-2004.-№1.-С.18-23.

120. Малкоч В., Бельмер C.B., Ардатская М.Д., Минушкин О.Н. Значение пребиотиков для функционирования кишечной микрофлоры // Вопросы детской диетологии.-2006.-Т4. -№1.- С.9-12.

121. Макарова С.Г., Боровик Т.Э., Ладодо К.С. и др. Состояние кишечного микробиоценоза у детей с атопическим дерматитом в зависимости от особенностей клинической картины и формы заболевания // Педиатрия.-1997. -№2. -С. 19-24.

122. Медицинские аспекты микробной экологии // Сб.трудов МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского под редакцией Шендерова Б.А,- М.-1994.-Т.1.-С.130.

123. Мельникова И.Ю., Горюнова М.М., Самсонова М.В. Восстановление микробиоценоза кишечника в1 комплексной терапии атопического дерматита у детей // Вопросы современной педиатрии.-2007.-№4.-С.1-11.

124. Мечников И.И. Этюды оптимизма (1907). М.- Наука.- 1988.

125. Мечников И.И. Молочные микробы и их значение для здоровья// Вестник знания.-1911,-№3.- С.231-240.

126. Михайлов И.Б., Корниенко Е.Л.Применение про- и пребиотиков при дис-биозе у детей. // Методическое пособие для врачей-педиатров.-СПб.-2004.- 18 с.

127. МУК 4.2.577-96. Методы микробиологического контроля продуктов детского лечебного питания и их компонентов //1988.'- М.- МЗ РФ.- 32 с.

128. Нахмансон Г.Л. Бифидобактерии, их. антагонистические свойства и значение для организма детей грудного возраста // Тезисы диссертации на соискание уч.степени канд. биол.наук,- Свердловск.-1946.- 7с.

129. Несвижский Ю.В. Изучение изменчивости кишечного микробиоценоза человека в норме и патологии // Вестник Российской AMН.-2003.-№1 .-С.49-53.

130. Нетребко O.K. Пробиотики и пребиотики в питании детей грудного возраста // Педиатрия.-2007.-Т.86.-№1.-С.80-87.

131. Николаева Т.Н., Бондаренко В.М., Николаева А.И., Зорина В.В.,

132. Коновалова Г.Н. Иммуномодулирующий эффект белковых фракций, полученных избифидобактерий // Журн. микробиол.-2004.- №2.- С.60-64.

133. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Бондаренко В.М. Иммуностимулирующая и антиканцерогенная активность нормальной1лактофлоры кишечника //Эксперим. и клинич. гастроэнтерология.-2004.- №4.-С.39-43.

134. Нисевич Н.И., Гаспарян М.О., Новокшенов А,А. К вопросу о дисбактериозе кишечника у детей // Педиатрия.-1999.-№ 1 .-С.98-102.

135. Новик Г.И., Высоцкий В.В., Богдановская Ж.Н. Ультраструктура клеток некоторых видов рода В1МоЬас1епит//Микробиология.-1994.-Т.63.-В.З.-С.515-521.

136. Новик Г.И., Высоцкий В.В. Архитектоника популяций бифидобактерий: субмикроскопический аспект когезии клеток Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium bifidum II Микробиология.-1996.-Т.65.-№1.-С.60-66.

137. Новик Г.И., Высоцкий В.В. Репродукция и дифференциация клеток в цикле развития популяций Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium bifidum!'/ Микробиология,-1996.-Т.65.- №3.-С.357-364.

138. Новик Г.И. Исследование структурно-функциональной организации бифидобактерий // Микробиология.- 1998.-Т.67.-№ 3.- С.376-383.

139. Новик Г.И., Астапович Н.И., Рябая Н.Е. Сохранение жизнеспособности и антагонистической активности бифидобактерий при субкультивировании //Микробиология,-1998.-Т.67.-№5.-С.631-642.

140. Новик Г.И., Самарцев A.A., Астапович Н.И. и др. Биологическая активность микроорганизмов-пробиотиков. // Прикладная биохимия и микробиология.-2006.-Т.42.-№2.-С.187-194.

141. Новик Г.И, Астапович Н.И., Рябая Н.Е. Продукция гидролаз и антибиотикорезистентность молочнокислых и бифидобактерий.// Прикладная биохимия и микробиология.- 2007.- Т. 43.- № 2.- С. 184-192.

142. Новокшенов A.A., Учайкин В.Ф., Соколов Н.В. и др. Биоценоз-сберегающая терапия кишечных инфекций у детей. // Русский медицинский журнал.-2004.-т.6.-№1.-С. 1-6.

143. Онищенко Г.Г., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Поспелова В.В. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии. // М.: ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ,- 2002.- 608 с.

144. Определитель бактерий Берджи. // под редакцией Дж. Хоулта с соавт. -изд.в 2-х томах.-М:Мир.-1997.-800 с.

145. Осипова И.Г. Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков // Дисс. .докт. биол.наук.-М.- 2006,- 285 с.

146. Осипов Г.А., Демина А.М.Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных процессах.// Вестник Российской АМН.- Т.13.-№2.-С.52-59.

147. Отраслевой стандарт 91 500.11.0004-2003.// «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» . 2003.- 70 с.

148. Панин А.Н., Малик Н.И., Малик Е.В. Иммунология и кишечная микрофлора.// М.-1998.-С.48.

149. Парфенов А.И., Ручкина И.Н., Осипов Г.А. Коррекция микрофлоры кишечника пробиотиками у больных антибиотико-ассоциированной диареи. //Справочник поликлинического врача.-2006.-№2.-С.З-6.

150. Петров JI.II., Бондаренко В.М, Вахитов Т.Я., Воробьев A.A. QS-системы у бактерий и перспективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов. // Вестник Российской АМН.- 2006.- №1.- С.38-45.

151. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека // М.:Медгиз.-1955.-435 с.

152. Пименов Е.В. и др. Современные представления о патогенезе инфекционных заболеваний // Вестник Российской АМН.-№ в.- 2003.-C.3-9.

153. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериоз кишечника1. М.-1984.-144 с.

154. Покровский В.И. Человек и микроорганизмы. Здоровье и болезнь // Вестник Российской АМН.-2001 .-№11 .-С.3-6.

155. Попкова С.М. Микробная экология человека в условиях техногенного прессинга промышленных городов Восточной Сибири // Автореф. дисс. .докт.биол.наук.-Иркугск.-2004.-46 с.

156. Поспелова В.В., Грачева U.M. и др. Эубиотики эффективные средства нормализации микрофлоры - и вклад МНИИЭМ в их разработку // Врач,- 1997.-№4,- С.30-31.

157. Поспелова В.В., Мапвелова М.А., Рахимова П.Г. и.др. Ацидофильные лактобакгерии и их значение в системе средств, регулирующих бактсриоцспоз// Медицинские аспекты микробной экологии. М.-1991.- С. 175-182.

158. Поспелова В.В., Рахимова П.Г., Ханипа Г.И., Халепева М.П. Биопрепараты, нормализующие микрофлору кишечника: итоги двадцатилетних исследований по проблеме // Антибиотики и колонизационная резистентноегь.-М.-1990.-С. 172-181.

159. Постникова ЕА., Пикина А.П., Кафарская Л.И., Ефимов Б.А. Изучение качественного и количественного состава микрофлоры кишечника здоровых детей в раннем возрасте // Журн. Микробиол.-2004.-№ 1 .-С.62-67.

160. Приворотский В.Ф. Логика построения корригирующих медикаментозных программ нарушенного микробиоценоза кишечника у детей // Русский медицинский журнал.-2005.-Т.13.-ЖЗ.-С.163-167.

161. Рыбальченко О.В., В.М.Бондаренко, Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микробиогы кишечника человека// С-Петербург.-2008.-С.109.

162. Руководство по лечебному питанию детей // Под редакцией Лододо К.С.- М.: Медицина. 2000.-384 с.

163. Рыбчук Ф.Н., Александрова В.А. Нарушения микробиоценоза у детей. Адекватная корригирующая терапия //Учебное пособие для врачей.-СПб.-2001.-С.13.

164. Савицкая К.И., Воробьев A.A., Швецова Е.Ф. Современные представления о роли и составе кишечной микрофлоры у здоровых взрослых людей // Вестник Российской АМН.-2002.-№2,- С.50-53.

165. Сафронова A.B., Сорвавачева Т.Н., Куркова В.И. и др. Сравнительная оценка влияния различных кисломолочных продуктов на кишечную микрофлору детей раннего возраста // Вопросы питания.- 2001.-№ 1.- С.22-24.

166. Семенихина В.Ф. Биология анаэробных молочнокислых палочек Lactobacillus bifîdiim.H Автореф. дисс. .канд.биол.наук.-Москва.-1967.-15 с.

167. Семенихина В.Ф. Кислотообразующая и антибиотическая активность бифидобактерий // Молочная промышленность. 1967. -№3. - С.17-20.

168. Семенихина В.Ф., Сундукова М.Б., Хорькова Е.А. Питательная срсда для накопления биомассы бифидобактерий // Молочн. Промышленность. 1985. - №9. - С. 16-17.

169. Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Карликанова СЛ., Шевелёва С.А., Карликанова Н.Р., Флуер Ф.С. Сухие питательные среды для микробиологического контроля // Молочная промышленность. 1999. -№3. - С. 14-15.

170. Семенова Л.П., Гончарова Г.И., Козлова Э.П. Применение сухого бифидумбактерина в комплексном лечение недоношенных и доношенных новорожденных детей // Методические рекомендации.-М.-1976.-12 с.

171. Симонова Е.В., Пономарева O.A. Роль нормальной микрофлоры в поддержании здоровья //Сибирский медицинский журнал.-2008.- № 8.-С.21-28.

172. Соколова К.Я., Соловьева И.В. // Дисбактериозы: теория и практика.-Н.Новгород.- 1999.198 с.

173. Созинов A.C. и др. Микрофлора кишечника у крыс в условиях хронического токсического поражения печени //Журнал микробиол.-2002.- №3.-С.60-63.

174. Спиричев В.Б. Сколько витаминов человеку надо// М.-2000.- 185 с.

175. Суворов А.Н. Дисбактериоз с позиций современной медицинской микробиологии // Актуальные проблемы дисбактериозов: Тез.докл.к конф.-Барнаул.-1997.-С.З-8.

176. Сукачев В.Н., Дылиса II.В. Лесной биогеоценоз // М.:Наука,-1964.-574 с.

177. ТУ 10-02-02-789-192-95. Среды питательные сухие для выращивания бифидобактерий и пропионовокислых бактерий.

178. Тутельян В.А., Попова Т.С. Новые стратегии в лечебном питании // М.: Медицина. -2002.-141 с.

179. Ткаченко Е.И. и др. Эрадикационная терапия, включающая пробиотики: консенсус эффективности и безопасности // Клиническое нитание.-2005.-№1 .-С. 14-20.

180. Украинцев С.Е., Нетребко O.K. Пищевые волокна и пребиотики // Вопросы детской диетотерапии.-2006.-Т.4.-№5.-С.26-30.

181. Урсова Н.И. Микробиоценоз открытых биологических систем организма в процессе адаптации к окружающей среде //Русский медицинский журнал.-2004.- Т.12.-№16.-С.957-959.

182. Хавкин А.И., Жихарева Н.С. Терапия антибиотик-ассоциированного дисбактериоза // Русский медицинский журнал.-2006.-Т.14.-№19.-С.З-7.

183. Хавкин А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет // Русский медицинский журнал.-2003.-№11(3).- С. 122-125.

184. Халенева М.П. Эффективность разных способов накопления и обезвоживания биомассы в производстве таблетированного бифидумбактерина.// Дисс. .канд.биол.наук.-Москва.-1984.-200 с.

185. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы // М.:ГЭОТАР-Медиа.- 2009.- 352 с.

186. Хмель И.А., Мелицкая А.З. Экспрессия Quorum sensing генов перспективная мишень для лекарств в отношении патогенности бактерий. //Молекулярная биология.- 2006.-Е.40.-№2.

187. Храмцов А.Г., Рябцева С.А., Уидокимов И.А. О применении лактулозы в продуктах детского, диетического и лечебного питания// Вопросы питания.-1997,- №2.-Сю25-26.

188. Хромова С.С., Кафарская Л.И., Ефимов Б.А. Иммунитет у детей: от рождения к колонизации кишечника. // Вопросы детской диетотерапии.-2006.-Т.4.-№1.-С.15-18.

189. Чешева В.В., Манвелова М.А. Антиопухолевое и иммуномодулирующее действие бифидобактерий // Медицинские аспекты микробной экологии: Сб. трудов МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского.-М.-1994.-С.82-86.

190. Шевелёва С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса // Вопросы питания. 1999. - №2. - С.32-39.

191. Шевелева С.А. Анализ микробиологического риска как основа для совершенствования системы оценки безопасности и контроля пищевых продуктов// Автореф. дис. .д-ра мед.наук.-М.- 2007.- 46 с.

192. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека // Рос.журн.гастроэнтерол., гепатологии, колопроктологии. — 1998.- № 1 С.61-64.

193. Шендеров Б.А. // Медицинская микробная экология и функциональное питании: В 3-х т. — М.:Грантъ- 1998-2001.- Т. 1-3. С. 286.-412.-286.

194. Шендеров Б.А. Базовые механизмы регуляции гомеостаза и их модуляция нутриентами //Клиническое питание.-2004.-№3.-С.14-19.

195. Шендеров Б.А. Микрофлора пищеварительного тракта — важнейший фактор поддержания микроэкологического гомеостаза хозяина // Клиническое питание.-2005.-№2.-С.2-5.

196. Шендеров Б.А. Функциональное питание при гипертонической болезни и хронической сердечной недостаточности //Лечащий врач.-№3.-2006.-С.14-17.

197. Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома //М.:ДеЛи принт.-2008. 317 с.

198. Шендеров Б.А. Молекулярный язык пробиотических микроорганизмов // Пищевые ингредиепты.-2009.-№ 1,- С48-49.

199. Шкопоров А.Н., Кафарская Л.И., Афанасьев С.С. и др. Молекулярно-генетический анализ видового и штаммового разнообразия бифидобактерий у детей раннего возраста // Вестник Российской АМН.- 2006.- №1.- С. 45-50.

200. Шкопоров А.И., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования // Вопросы практической педиатрии.- 2007,- 2 (5).- С.76-79.

201. Эрвольдер Т.М., Гудкова М.Я., Семенова Л.П., Гончарова Г.И. Совместное развитие бифидобактерий и молочнокислых микроорганизмов в молоке // Биологические и физико-химические исследования в маслоделии и сыроделии. Углич.-1986.-С.87-9Ь

202. Ярилин А.А. Основы иммунологии//М.-1999.- 720 с.

203. Яцык Г.В., Скворцова В.А., Боровик Т.Э., Лододо К.С. Функциональное состояние ЖКТ у новорожденных// Педиатрия.- 2001.-№3.-С.89-92.

204. Agarwal RK. Probiotics the health friendly gut bacteria // Indian Pediatr.-2008.- Dec.-45(I2).-P.953-4.

205. Adorns M.R., Hill C.I., Growth inhibition of food-borne pathogens by lactic and acetic acids and their mixtures// Int.J.Food Sci.Tecnol.- 1988.-Vol.23.-P.287.-292.

206. Alles M.S., Hautvast J.G., Nagengast F.M. et al. Fate of fructooligosaccharides in the human intestine// Brit.J.Nutr.- 1996.- Vol.76.-P211-221.

207. Amor K. Ben, E. E. Vaughan, W. M. de Vos. Advanced Molecular Tools for the Identification of Lactic Acid // Bacteria J. Nutr.- March.-N 1.- 2007/- V. 137(3).- P.741 S 747S.

208. Andersson Y., Asp N-G., Bruce A. et al. Health effects of probiotic and prebiotics. A literature reviev on human stadies // Scand. J. Nutr.- 2001.- Vol.45.- P.58-75.

209. Backhed F., Ding H., Wang T. ey al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage//Proc. Nat. Acad. Scienses.- 2004.-Vol.101.-Nol 1.-P. 15718-15723.

210. Bailey M. The mucosal immune system: Recent developments and future directions in the pig // Dev. Сотр. Immunol. 2009.-Vol.33(3).-P.375-83.

211. Begley, M., Hill, C., Gahan, C. G. M. Bile salt hydrolase activity in probiotics // Appl. Environ. Microbiol.-2006.- Vol.72.-P. 1729-1738.

212. Bengmark S. Immunonutrition: role of biosurfactants, fiber and probiotic bacteria. //Nitrition.-1998. -14 (7-8).-P.585-594.

213. Benno Y., Sawada K., MitsuokaT. The intestinal microflora of infants: composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants // Microbiol. Immunol. 1984.- 28.- P. 975-986.

214. Benno J., Mitsuoka T. Bifidobacteria and microflora // Development of intestinal microflora in human and animals. 1986,- V.5.-N 1,- P. 13-25.

215. Berg R.D. The indigenous gastrointestinal microflora // Trends Microbiol.- 1996.-No4.-P.430-435.

216. Biavati B, Castagnoli P, Crociani F, Trovatelli LD. Species of the Bifidobacterium in the feces of infants // Microbiologica. -1984,- No7(4).-P. 341-345.

217. Blumental A., Helbling J.The L(+), and D(-) lactic acid concentration in yoghurts of different fat content // Dairy Sci. Abstracts. 1974 - Vol. 36. - P. 331.

218. Bjorksten B, Sepp E, Julge K, Hoor T, Mikelsaar M. Allergy development and the intestinal microflora during the first year of life// J. Allergy Olin. Immunol.- 2001.-Vol. 108.- P.51620

219. Bjcprkstin B. Evidence of probiotics in prevention of allergy and asthma // Curr Drug Targets Inflamm Allergy.- 2005,- Vol.4.- P.599-604.

220. Brady L.J., Gallaher D.D.,Busta F.F. The role of probiotic cultures in the prevention of colon cancer // J.Nutr.- 2000,- Vol.l30.-P.410-414.

221. Brown AC, Valiere A. Probiotics and medical nutrition therapy // Nutr. Clin. Care.-2004.- Apr-Jun.- Vol.7(2).-P.56-68. Review.

222. Callaway TR, Edrington TS, Anderson RC, Harvey RB, Genovese KJ, Kennedy CN, Venn DW, Nisbet DJ. Probiotics, prebiotics and competitive exclusion for prophylaxis against bacterial disease //Anim. Health Res. Rev.- 2008.-Dec.-Vol.9(2).-P.217-225.

223. Camilleri M. Probiotics and irritable bowel syndrome: rationale, mechanisms, and efficacy //J. Clin. Gastroenterol.-2008,- Sep.-42.- Suppl 3 Pt 1 .-P. 123-125.

224. Carr F., Chill D. Maida N. The lactic acid bacteria: a literature survey //Cri.t Rev. Microbiol. 2002.-Vol.28(4).-P.281-370.

225. Cats A. et al. Effect of frequent consumption of a Lactobacillus casei-containing milk drink in Helicobacter pylori-colonized subjects//Aliment. Pharm. Ther.- 2003.-Vol.17.- P.429-435.

226. Challa A., Ramkishan Rao D., Chawa C.B., Shackleford. Bifidobacteria longum and lactulose suppress azoxymethane induced colonic aberrant crypt foci in rats // Carcinogenesis. - 1997. - Vol. 18.-P.517-521.

227. Chung T.C. et al. In vitro studies on reulerin synthesis by Lactobacillus reuteri // Microb.Ecol.Hcalth.Dis.-1989.-V.69 (suppl).-P. 137-144.

228. Cremonini F. et al. Effect of different probiotic preparation onanti-Helicobacter pylori therapy-related side effects: a parallel group, triple blind, placebo-controlled study // Amer. J. Gastroenterol.-2002.-V.- 97(11). P.2744—2749.

229. Dambekodi, P. C., and S. E. Gilliland. Incorporation of cholesterol into the cel-lular membrane of Bifidobacterium longum//J.Dairy Sci.-1998.-V.81.-P.1818-1824.

230. De Vos W.M. Teichic acid in lactobacilli: D-AIa makes the difference // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.- 2005,- V.102 (31).- P.10763-10764.

231. Diplock A.T., Aggctt P.J.,Ashwell M. et al. Scientific concepts of functional foods in Europe: Consensus document// Brit. J. Nutr.- 1999.- Vol.81 (Suppl.l).- P.S1-S27.

232. Donohue, D.C., Deighton, M., Ahokas, J.T., Salminen, S.// Toxicity of lactic acid bacteria. In: Salminen, S., von Wright, A. (Eds.), Lactic Acid Bacteria // Marsel Dekker Inc.- New York.- 1993.-P. 307-317.

233. Drisko J.A., Giles Ch. K., Bischoff B.J. Probiotics in health maintenance and disease prevention. // Alternative Medicine Review.- 2003,- V0I.8.-N0.2.- P.'143-155.

234. Eckburg P.B. et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. // Science.- 2005.-V.308.-P.1635-1638.

235. Edwards C.A., Parett A.M., Intestinal flora during the first months of life: new perspectives// Brit. J. Nutr.- 2002,- V0l.88.-N0 3 (suppl.).- P.S11-S18.

236. Engfcr M.B., Stahl B., Finke B., Sawatzki G. Daniel H. Human milk oligosacchairdes are resistant to enzymatic hydrolysis in the upper gastrointestinal tract// Am. J. Clin. Nutr .-2000.-Vol. 71.-P. 158996.

237. Ezendam J., de Klerk A., Gremmer E.R., van Loveren H. Effects of Bifidobacterium animalis administered during lactaion on allergic and autoimmune responses in rodents // Clinical and Experimental Immunology.- 2008,- Vol.154.-P.424- 455.

238. Fao/WHO Working group. Guidelines for the evaluation of probiotics in food // Report.- 2002.-London Ontario Canada. 11 p.

239. Fooks L. J., Fuller R., Gibson G. R. Prebiotics, probiotics and human gut microbiology // Inter. Dairy J. 1999, - Vol. 9. - No 1. - P. 53-61.

240. Fooks L.J., Gibson G.R. Probiotics as modulators of gut flora // Brit.J. Nutr.- 2002.- Vol.88.-No 3 (suppI).-P.S38-S.49.

241. Fotiadis C.I., Stoidis C.N., Spyropoulos B.G., Zografos E.D. Role of probiotics, prebiotics and synbiotics in chemoprevention for colorectal cancer //World J .Gastroenterol.- 2008.- No 14.-Vol. 14(42).- P6453- 6457.

242. Francavilla R. et al. Inhibition of Helicobacter pylori infection in humans by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 and effect on eradication therapy: a pilot study // Helicobacter. 2008. - Vol. 13(2).-P. 127-134.

243. Fuller R. Probiotics in man and animals // Journal of Applied Bacteriology. 1989. - Vol. 66. - P. 365-378.

244. Functional foods. Ed. By I. Goldberg// Chapman and Hall: NYio- 1994. 572 p.

245. Hadadli M. et al. Identification of cultivable Bifidobacterium species isolated from breast-fed infants feces in West-Algeria// African J.of Biotechnology.-2005.-Vol.4 (5).- P.422-430.

246. Hoier E. Use of probiotic starter cultures in dairy products // Food Austral. 1992. - Vol. 44. — No 9.-P. 418-420.

247. Gardiner G.E., Heinemann C., Baroja M.L. et al. Oral administration of probiotic combination L.rhamnosus GM-1 and L.fermentum Rc-14 for human intestinal applications// Int. Dairy J.- 2002.-Vol.12.- P. 191-196.

248. Chou C.C., Hou J.W. Growth of bifidobacteria in soymilk and their survival in the fermented soymilk drink during storage // Int. J. Food Microbiol. 2000. - Vol.56. - No 2-3. - P. 113-121.

249. Gibson G.Ri, Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: Introducing the concept of prebiotics// J.Nutr.-1995.-Vol. 125.-P. 1401-1412.

250. Gibson G.R, Roberfroid M.V. Dietary modulation of the human colonic microbiota: bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin// Gastroenterology.-1995.-Vol.108,-P.975-982.

251. Gill C.I.R., Rowland I.R. Diet and cancer: accessing the risk// Brit. J.Nutr.- 2002.- Vol.88.-No 3(suppl).- P.S73-S87. •

252. Gill C.I.R., Corfield A.P., Millar M.R., Russell G. Investigation of mucin-degrading activity of bowel flora in preterm and full term infants// Brit. J.Nutr.- 2002.- Vol.88.-No 3(suppl).- P.S 110-S111.

253. Gill S. R., Pop M., DeBoy R.T. et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome// Science 2006.- Vol. 312.- P. 1355-1359.

254. Gilliland S.E. Health and nutritional benefis from lactic acid bacteria // Fed.Eur. Microbiol.Soc.Microbial Rev.- 1991.- Vol.87.- P.175-200.

255. Gnoth M.J., Kunz C., Rudloff S. Human milk oligo saccharides are minimally digested in vitro. J Nutr 2000.-Vol.l 30.-P.3014-3020,- Harmsen et al.- 2000.

256. Gorbach.S.L. Fanction of normal human microflora // Scand.J.Infec.Diseases.-1986.-Vol.l 8-suppl. №49.- P. 17-30.

257. Gotteland M., Brunser O., Cruchet S. Systematic review: are probiotics useful in controlling gastric colonization by Helicobacter pylori // Alimentary Pharmacol. Ther. — 2006. — Vol. 23(8). — P. 1077-1086.

258. Gratz S., Mykkanen H., Ouwehand A.C., Juvonen R., Salminen S., El-Nezami II. Intestinal mucus alters the ability of probiotic bacteria to bind aflatoxin B1 in vitro //Appl. Environ. Microbiol.-2004,- Oct.-Vol.70 (10).- P.6306-6308.

259. Guarino A., Lo Vecchio A., Canani R.B. Probiotics as prevention and treatment for diarrhea.//Curr Opin Gastroenterol.- 2009.- Jan.-Vol.25(l).-P18-23.

260. Hoffman F.A. Development of probiotics as biologic drugs//Clin. Infec.t Dis.- 2008.- Feb 1.-Vol.46.- Suppl 2.-P.S125-S127.

261. Holzapfel W.H., Schillinger U. Introduction to pre- and probiotics.//Food Research International.-2002,- Vol.2002.- P. 109-116.

262. Hosel C.E., Altwin. J.E. The probiotic approach: an alternative treatment option in urology// Eur. Urol. 2005.-Vol.47.-P.288-296.

263. Howarth G.S. Inflammatory bowel disease, a dysregulated host-microbiota interaction: are probiotics a new therapeutic option// J.Gastr.Hepatol.-2008.- Dec.-Vol.3(12).-P. 1777-1779.

264. Hsieh M.H., Versalovic J. The human microbiome and probiotics: implications for pediatrics//Curr.Prob. Pediatr.Adolesc.Health.Care.-2008.- Nov-Dec.-No38(10).-)P.09-27.

265. Hsu C.A., Yu R.C., Chou C.C. Production of beta-galactosidase by

266. Bifidobacteria as influenced by various culture conditions//Int.J.Food Microbiol.-2005.-0ct.- Vol.5.-Nol04(2).-P. 197-206.

267. Huebner ES, Surawicz CM. Probiotics in the prevention and treatment of gastrointestinal infections// G astro entero. 1. CI in. North. Am.-2006 Jun.-Vol.35(2).- P.55-65.

268. Ha G.Y., Yang C.H., Kim H., Chong Y. Case of sepsis caused by Bifidobacterium longum. // J.Clin. Microbiol.- 1999.-Vol.37.-NA- P.1227-1228.

269. Hamilton-Miller J.M.T., Gibson G.R., Bruck W. Some insights into the derivation and early uses of the word «probiotic» // Brit. J.Nutr.- 2003.-Vol 1.- "No 4.-P. 169-176.

270. Hamilton-Miller J.M.T. Probiotics and prebiotics in the elderly// Post-grad.Med.J.-2004.-No 4.-P. 169-176.

271. Hamilton-Miller J.M. The role of probiotics in the treatement and prevention of Helicobacter pylori infection // Int. J. Antimicrob. Agents. 2003.-Vol. 22(4). - P.360-366.

272. Haskard C. A., H. S. El-Nezami, P. E. Kankaanpaa, S. Salminen, and J. T. Ahokas. Surface binding of aflatoxin B1 by lactic acid bacteria //Appl. Environ. Microbiol.- 2001,- Vol. 67.- P.3086-3091.

273. Hirayama K., Rafter J. The role of probiotic bacteria in cancer prevention// Microbes Infect.-2000.-Vol.2.- P.681-686.

274. Hopkins M.J., Sharp R., Macfarlane G.T. Age and disease related changes in interstinal bacterial populations assessed by cell culture, 16S rRNA abundance, and community cellular fatty acid profiles// Gut.-2001.-No 48.- P. 198-205.

275. Hsieh M.H, Versalovic J.The human« microbiome and probiotics: implications for pediatrics//Curr. Probl. Pediatr. Adolesc. Health Care.-2008.-Nov-Dec.-No.38(10).1. P.309-327.

276. Hsu C.A, Yu R.C, Chou C.C. Production of beta-galactosidase by Bifidobacteria as influenced by various culture conditions // Int. J. Food Microbiol.-2005.-0ct.- No. 15.-Vol. 104(2).-P. 197-206.

277. Hoffman FA. Development of probiotics as biologic drugs // Clin Infect Dis. -2008,- Feb. 1,-Vol.46.- Suppl 2.-P125-127.

278. Holzapfel W.H., Schillinger U. Introduction to pre- and probiotics //Food Research International.-2002.- Vol. 35.- P. 109-116.

279. Hosel, CE, Altwin. J.E. The probiotic approach: an alternative treatment option in urology //Eur Urol. -2005.-Vol.47.-P.288-296.

280. Howarth G.S. Inflammatory bowel disease, a dysregulated host-microbiota interaction: are probiotics a new therapeutic option // J. Gastroenterol. Hepatol. -2008.- Dec.-Vol.23(12).-P.1777-1779.

281. Isolauri E., Arvola T., Siitas Y., Salminen S. Probiotics in the management of atopic eczema //Clin Exp Allergy.- 2000.- V.30.- P.1604-1610.

282. Kailasapathy K., Chin J. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp // Immunol. Cell. Biol.- 2000.- Feb.-Vol.78(l).-P.80-88.

283. Kalliomaki M., Salminen S., Arvilommi H., Kero P., Koskinen P., Isolauri E. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebocontrolled trial//Lancet .-2001.- Apr.-Vol.7.-No.57(9262).-P. 10769.

284. Kalliomaki M., Salminen S., Poussa T., Isolauri E. Probiotics during the first 7 years of life: A cumulative risk reduction of eczema in a randomized, placebo-controlled trial // J. Allergy Clin. Immunol.-2007.- Vol.119.-P.1019-1021.

285. Kim G. B., Yi S. H, Lee B. H. Purification and characterisation of three different types of bile salt hydrolase from Bifidobacterium strains // J. Dairy Sci.- 2004,- Vol.87.-P.258-266.

286. Kim G. B., Brochet M., Lee B. H. Cloning and characterization of a bile salt hydrolase (bsh) from Bifidobacterium adolescentis // Biotechnol. Lett.-2005.- Vol.27.-P.817- 822.

287. Kim M.N. et al. The effect of probiotics on PPI-triple therapy for Helicobacter pylori eradication' // Helicobacter. 2008. - Vol. 13(4). - P.261-268.

288. Kim J.Y, Choi Y.O, Ji G.E. Effect of oral probiotics (Bifidobacterium lactis ADO 11 and Lactobacillus acidophilus AD031) administration on ovalbumin-induced food allergy mouse model //J. Microbiol. Biotec.- 2008.- Aug.-Vol.l8(8).-P. 1393-1400.

289. Klayraung S., Viernstein H., Okonogi S. Development of tablets containing probiotics: Effects of formulation and processing parameters on bacterial viability/Int. J. Pharm.- 2008.- Nov .-P.123-128.

290. Klaenhammer T.R. Probiotic bacteria: today and tomorrow // J.Nutr.- 2000,- No 130,- P.415S-416S.

291. Kligler B., Cohrssen A. Probiotic.//Am. Fam. Physician.- 2008.- Nov 1-V.78.- (9).-P.1073-1078.

292. Kneifel W., Bonaparte C., Casas I. Utilisation of prebiotic carbohydrates by strains of Lactobacillus reuteri // Brit. J. Nutr.- 2002.- Vol.88.-No 3(suppl).- P.S111-S112.

293. Ko E.J. ct al. Bifidobacterium bifidum exhibits a lipopolisaccharide-like mitogenic activity for murine B.lymfocytes // J.Dairy Sci.- 1999.- Vol.82.- No 9.-P.1869-1876.

294. Koenen M.E., Jeurissen S.H.M., Boersma W.J.A. Modulation of the immune response by probiotics in chicken// Brit. J.Nutr.-2002.- Vol.88.-No3 (suppl).- P.S120-S121.

295. Koletzko B., Aggett P.J., Bindels J.G., Bung P., Ferrd P., Gil A., Lentze M.J., Roberfroid M., Strobel S. Growth, development and differentiation: a functional food science approach//Br . Nutr.-Vol.998.-No. 80 (Suppl.l).-P. S5 -S45.

296. Kunz C., Rudloff S. Biological functions of oligosaccharides in human milk//Acta Paediatr. -1993.-Vol.82.-P. 90312.

297. Kozakova H., Rehakova Z., Kolinska J., Tlaskalova H. Effect of monoassociation with probiotic strain Bifidobacterium bifidum on enterocyte brush-border enzymes in gnotobiotic mice // Brit. J .Nutr.- 2002,- Vol.88.- No3 (suppl).- P.S113.

298. Lahtinen S.J., Boyle R.J., Kivivuori S. et al.// Prenatal probiotic administration can influence Bifidobacterium microbiota development in infants at high risk of allergy //J. Allergy Clin. Immunol.- 2009.- Jan 7.

299. Laiho K., Hoppu U., Ouwehand A.C. et al. Probiotics: on-going research on atopic individuals// Brit. J. Nutr. 2002.- Vol.88.-No3(suppl).- P. 169-182.

300. Larsen B. Vaginal flora in health and disease // CLIN.Obstet.Gynecol. 1993 - Vol.36 - No 1 — P.107-121.

301. Lee Y.-K., Puong K.-Y. Competition for adhesion between probiotics and human gastrointestinal pathogens in the presence of carbohydrate // Brit. J. Nutr.- 2002.- Vol.-88.- No3(suppl).- P.S101-S108.

302. Lee S.K., Kim V.B., Ji G.S. Note: purification of amylase secreted from Bifidobacterium adolescentis // J.Appl.Microbiol. -1997. -Vol.83 (3). -P.267-272.

303. Lenoir-Wijnkoop 1. The intestinal microflora. Understanding the simbiosis //red.-Mark Yjpkins.- Danonr Vitapole: John Libbey Eurotext.-2003.-48 P.

304. Lewis J.D.N, ct al. Development of an EL1SA to detect Lactobacillus casei Shirota in human stool samples //Brit.J.Nutr.-2002.-Vol.88.-N.3 (suppl).-P.Sl 13-S114.

305. Liong M. T., Shah N. P. Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of lactobacilli strains // J. Dairy Sci.-2005.- Vol.88.- P.55-66.

306. Liopis M., Antolvn M., Guarner F. et al. Mucosal colonisation with Lactobacillus casei mitigates barrier injury induced by exposure to trinitronbenzene sulphonic acid // Gut.- 2005.-V.54,-P. 955-959.

307. Lucas J. European union-funded research on probiotics, prebiotics and new foods // Dig Liver Dis.- 2002,- No 34 (suppl 2).- P.S98-S104.

308. Luckey T.D. Overview of gastrointestinal microecology // Diy. Nahrung. 1987 — Vol.31 - No 5-6 - P.234-239.

309. Luccy M., Fitzgerald G. Biotechnology of lactic acid bacteria: Pap. Inst. Symp. Dev. Field Food Biotechnol. Strathclyde, 27-28 June, 1996 // Food Sci. and Technol. Today. 1997. - Vol. 11. -No 4. - P. 230-233.

310. Macfarlane S., Steed H., Macfarlane G.T. Intestinal bacteria and inflammatory bowel disease //Crit Rev Clin Lab Sci.- 2009,- V.46(l).-P.25-54.

311. Mackie R.I., Sghir A., Gaskins H.R. Developmental microbal ecology of the neonatal gastrointestinal tract//Am.J.Clin. Nutr. 1999.-No 69 (suppl).- P. 1035S-1045S.

312. Marteau P., Seksik P., Jian R. Probiotics and intestinal health effect: a clinical perspective // Brit.J.Nutr.-2002.-Vol.88.-No 3 (suppl).- P430S-436S.

313. Masco L, Van Hoorde K, De Brandt E, Swings J, Huys G. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products. //J Antimicrob.Chemother. 2006 Jul;58(l):85-94. Epub 2006 May 12.

314. Mercenier. A., Pavan S., Pot B. Probiotics as biotherapeutic agents: present knowledge and future prospects//Curr. Pharm.- 2003.- Des. Vol.8.- P99-110.

315. Modler G.W., McKellar R.C., Yaguchi M. Bifidobacteria and bifidogenic factors//J.Inst.Can.ci Technol. Ailment.- I990.-Vol.23.-P.29-41.

316. Matsuki T. et al. Distribution of Bifidobacterium species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-targeted species-spesific primers.// Applied and Environmental Microbiology.- Oct. 1999.- P.4506-4512.

317. Matsuki T. et al. Developmeny of 16S rRNA- gene-targeted group-specific primers for the detection and identification of predominant bacteria in human feces// Appl.Environ.Microbiol.-2002.-68(11).-P. 5445-5451.

318. Matsuki T. et al. Use of 16S rRNA-gene-targeted group-specific primers for reai-time PCR analysis of predominant bacteria in human feses // Appl.Environ.Microbiol.-2004.-Vol. 70(12).-P. 7220-7228.

319. McCartney A.L. Application of molecular biological metods for studying probiotics and the gut flora // Brit. J.Nutr.- 2002.- Vol.88.- No 3(suppl).- P.S29-S-37.

320. McCracken V.J., Lorenz R.G. The gastrointestinal ecosystem: a precarious alliance among apithelium, immunity and microbiota// Cellular Microbiol.- 2001.- No 3(1).- P.1-11.

321. McFarland L.V., Surawicz C.M., Grccnberg R.N. et al. A randomized placebo-controiied trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile // JAMA.-1994,- Vol.271.- P.1913-1918.

322. Mercenier A., Pavan S., Pot B. Probiotics as biotherapeutic agents: present knowledge and future prospects// Curr. Pharm. Des.- 2003.- Vol. 8.-P.99-110.

323. Michail S.K., Stolfi A., Johnson.T., Onady G.M. Efficacy of probiotics in the treatment of pediatric atopic dermatitis: a meta-analysis of randomized controlled trials//Ann. Allergy Asthma Immunol. -2008.- Nov.-Vol. 101 (5).-P.508-516.

324. Mevissen-Verhage E.A.E., Marcelis J. H., De Vos M. N. et al. Bifidobacterium, Bacteroides and Clostridium spp. in fecal samples from breast fed and bottle-fed infants with and without iron supplement//J. Clin. Microbiol. 1987.-No.25.- P. 285-289.

325. Mikelsaar M., Zilmer M. Lactobacillus fermentum ME-3- an antimicrobial and antioxidative probiotic // Microbial. Ecology in Health and disease 2009.-P.1-27.

326. Michail S.K, Stolfi A., Johnson T., Onady G.M. Efficacy of probiotics in the treatment of pediatric atopic dermatitis: a meta-analysis of randomized controlled trials //Ann. Allergy Asthma Immunol. 2008.- Nov.l01(5).-P.508-516.

327. Misra A.K., Kuila R.K. Fntibacterial activity of Bifidobacterium strains grown in milk and synthetic media// Indian J. of Dairy Science. 1994.-Vol. 47.-No 6. - P.531-533.

328. Mitsuoka T., Hayakawa K., Kimura N. The fecal flora of man. II. Communication: the composition of bifidobacterium flora of different age groups// Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig.- A 1974.-Vol.226.- P.469-478.

329. Mitsuoka T. Intestinal Flora and Host //Asian.Med.J.-1989-V.31.-N7.-P.400-409.

330. Morley R., Abbott B.A., Lucas A. Infant feeding and maternal concerns about stool hardness//Child. care, health and development.- 1997,-Vol. 997.-No23.-P.475-478.

331. Moubareck C. et al. Antimicrobial susceptibility of bifidobacteria// J.of Antimicrobial Chemotherapy.-2005,- Vol.55.- P38-44.

332. Myllyluoma E. et al. Effects of anti-Helicobacter pylori treatment and probiotic supplementation on intestinal microbiot //Int J.Antimic.Agents. -2007.- Vol. 29(1). P.66-72.

333. Myllyluoma E. et al. Effect of multispecies probiotic combination on Helicobacter pylori infection in vitro // Clin. Vaccine Immunol. 2008. -Vol.9. - P. 1472-1482.

334. Majamaa H., Isolauri E. Probioties: a novel approach in the management of food allergy//J.Allergy Clin.Immunol.- 1997 Feb.-Vol.99(2).-P. 17985.

335. Newburg D.S., Neubauer S.H. Carbohydrates in milks: analysis, quantities, and significance//In: RG Jensen (ed): Handbook of milk composition. Academic Pressl995.-P. 273349 Orrhage & Nord.-1999.

336. Nakayama J. Peptide-mediated cell-cell communication in Gram-positive bacteria // The XVth International Symposium on Gnotobiology. June 20-24.-2005.-Tokio.-49 p.

337. Namba K., Hatano M. et al. Method of detecting Bifidobacterium infantis // United States Patent.- Prior Publication data 14.12.2006.- 22 p.

338. Okamoto M., Benno Y., Leung K.P. et al. Bifidobacterium tsurumiense sp. nov., from hamster dental plaque// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008.- Vol.58.- P. 144-148.

339. Orrhage K., Nord C.E. Bifidobacteria and lactobacilli in human health // Drugs Exp. Clin. Res. 2000. - Vol. 26. - No 3. - P. 95-111.

340. Ouwehand A.C., Kirjavainen P.V., Shortt C., Salminen S. Probiotics: mechanisms and estabished effect // Int. Daity Journal 1999. - Vol. 9. - No 1. - P. 43-52.

341. Orrhage K., Nord C.E. Factors controling the bacterial colonisation of the intestine in breastfed infants//Acta Paediatr.-l 999.- suppl 430.- P.4757 .

342. Pessi T., Sutas Y., Hurme M., Isolauri E. InterleukinlO generation in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus GG//Clin Exp. Allergy.- 2000.- Dcc.-Vol. 30(12).-P. 18048.

343. Perdigon G., Fuller R., Raya R. Lactic acid bacteria and their effect on the immunr system // Curr. Issue Intest. Microbiol.- 2001.- No 21 (1).- P.27-42.

344. Pcrcira D. I., G. R. Gibson. Effects of consumption of probiotics and prebiotics on serum lipid levels in humans// Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.- 2002.- Vol. 37.P.259-281.

345. Pereira D.I., Gibson G.R. Cholesterol assimilation by lactic acid bacteria and bifidobacteria isolated from the human gut// Appl. Entv. Microbiol.-2002.-Sept.- P.4689-4693.

346. Proposed Model: Mechanisms of Immunomodulation Induced by Probiotic Bacteria// Clin. Vaccine Immunol.- May 1.- 2007.- Vol.l4(5).-P.485 492.

347. Rafter J. Lactic bacteria and cancer: mechanistic perspective// Brit.J.Nutr.- 2002.- Vol.88.- No 3 (suppl).- P.S89-S94.

348. Rambaud. J.-C. Gut microflora. Digesstive physiology and pathology//Paris: John Libbey Eurotext.-2006.-250 p.

349. Raz I., Gollop N., Polak-Charcon S., Schwartz B. Isolation and charactcrisation of new putative probiotic bacteria from human colonic flora//Br. J. Nutr.-2007.- Apr.-Vol.97(4).- P.725-734.

350. Reid G., Devillard E. Probiotics for mother and child //J. Clin. Gastroenterol.- 2004.- Jul.-38(6 Suppl).-PS94-S 101.

351. Requrna T., Burton J., Matsuki T. at all. Identification, detection and enumeration of human Bifidobacterium species by PCR targeting the transaldolase gene //Applied and Environmental. Microbiology.-2002.-Vol.68.-№5.-P2420-2427.

352. Reuter G. Vergleichende Untersuchungen uber die Bifidus-Flora im Sfuglings- und Erwachsenensthul. Zentralbl. l-14//Bakt.Mikrob. Hyg. 1 Abt. Orig.-1963.- No 191.- P.486-507.

353. Reuter G. The "Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession//Current Issues in Intestinal Microbiol.-2001.- Vol.2(2).-P.43-53.

354. Saarela M., Matto J., Mattila-Sandholm T. Safety Aspects of Lactobacillus and Bifidobacterium Species Originating from Human Oro-gastrointestinal Tract or from Probiotic Products//Microbial Ecology in Health and Disease. 2002; 14: 233-240.

355. Sheth A.A., Garcia-Tsao G. Probiotics and liver disease//J.Clin. Gastroenterol.- 2008.- Jul.-Vol.42 (Suppl 2).-PS80-S84.

356. Shin M.S., Han S.K., Ji A.R., Kim K.S., Lee W.K. Isolation and characterization of bacteriocin-producing bacteria from the gastrointestinal tract of broiler chickens for probiotic use./J. Appl. Microbiol.- 2008,- Dec.-Vol. 105(6).-P.2203-2212.

357. Satokary R.M., Vaugiian. E.E. et al. Bifidobacterial diversity in human feces detected by genus-specific PCR denaturing gfadient gel electrophoresis // Applied and Environmental Microbiology.-Feb/2001.- P.504-513.

358. Smehilova M., Vilkova E., Nevoral J. Comparison of intestinal microflora in healthy infants and infants with allergic colitis//Folia Microbiol. (Praha).- 2008.-53(3).- P.255-258.

359. Stark P.L., Lee A. The microbial ecology of the large bowel of breastfed and formulafed infants during the first year of life//J.Med.Microbiol1982.- Vol.5(2).- P. 189203 Walker & Duffy, 1998.

360. Tamime A. Y., Marshall V. M. E., Robinson R. K. Microbiological and technological aspects of milks fermented by bifidobacteria//Journal ofDairy Research. 1995. - Vol. 62,- 151-187.

361. Tamime A. Y., Robinson R.K. Yoghurt: science and technology. Oxford, Rergamon press, 1985. New York. Toronto. XIII, 431 p.

362. Tanaka R. Effective use of bifidobacteria // Seikatsueisei. 1984. - Vol. 28. - p. 324-332.

363. Thompson J. P. Product total flora support. Question and answers //Iss.Interch. Inc., 1997.

364. Troiani C. Trends in the marketing of yoghurt//Dairy Scicn. Abst.-1995.-VoI.57.- №4. p. 2

365. Yuguchi Hiroya, Hiranatsu Akinori, Doi Karugoshi, Ida Chuichi. Huxore mukycan gokkaiho // Jap. J. Zootechn. Sci. - 1989. - Vol. 60. - №8. - p. 734-741.

366. Tannock G.W. Studies of the intestinal microflora: a prerequisite for the development of probiotics // Ins. D. J. 1998 - Vol. 8. - No5/6. - P. 527-533.

367. Tannock G.W. Molecular assessment of intestinal microflora// Am.J.Clin.Nutr.- 2001.-Vol.73 (suppl).-P.410-414.

368. Tannock G.W. New perception of the gut microbiota:implication for future research // Gastroenterol.Clin.North.Am.-2005.-No 34(3).-P.361-382.

369. Tissier H. Recherchers sur la flora intestinale normale et pathologique du nourisson// Thesis.-University of Paris.- Paris.- France.- 1900.

370. Tanaka R, Takayama H, Mortomi M, et al. Effects of administration of TOS and Bifidobacterium.breve 4006 on the human faecal //Bifid.Microflora.- 1983,-Vol. 2:1.-P.724.

371. Vinderola C.G., Mocchiutti P., Reinheimer J.A. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products.//J. Dairy Sci. -2002.- Apr.-Vol. 85(4).-P.721-729.

372. Vinderola G,. Matar. C., Palacios., J., Perdigon G. Mucosal immunomodulation by the nonbacterial fraction of milk fermented by Lactobacillus helveticus R389. International Journal of Food Microbiology.- 2007.-Vol.l 15.-P. 180-186.

373. Van den Heuvel E., Muys T. et al. Oligofructose stimulates calcium absorption in adolescents//Am.J.Clin.Nutr.-1999.-Vol.69.-P.544-548.

374. Ventura M., Meylan V., Zink R. Identification and tracing of Bifidobacterium species by use of enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences //Appl Environ Microbiol. 2003.- Vol.69.-P.4296—301.

375. Ventura M., Canchaya C., Tauch A. et al. Genomics of Actinobacteria: Tracing the Evolutionary History of an Ancient Phylum // Microbiology and Molecular Biology Review. 2007.- No71(3).-P.459-548.

376. Vilkova E., Nevoral J., Jencikova B. et al. J Microbiol Methods. Detection of infant faecal bifidobacteria by enzymatic methods// 2005.- Vol.60(3).-P. 365-373.

377. Vinderola CG, Mocchiutti P, Reinheimer JA. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products.//.!. Dairy Sci.- 2002 .-Apr.-Vol. 85(4).-P721-729.

378. Vinderola G., Matar C., Palacios J., Perdigon G. Mucosal immunomodulation by the nonbacterial fraction of milk fermented by Lactobacillus helveticus R389// International Journal of Food Microbiology.- 2007.-Vol.115.-P. 180-186.

379. Wagner R.D. Effects of microbiota on GI health: gnotobiotic research//Adv. Exp. Med. Biol. -2008.-Vol.635.-P.41-56.

380. Wagner R.D. Effects of microbiota on GI health: gnotobiotic research //Adv. Exp. Med. Biol. -2008,- Vol. 635,- P.41-56.

381. Watson D., Sleator R.D., Hill C., Gahan C.G. Enhancing bile tolerance improves survival and persistence of Bifidobacterium and Lactococcus in the murine gastrointestinal tract// BMC Microbiol. -2008.- Oct 9.-No 8.-P.176.

382. Wiggins R., Millar M.R., Soothill P.W., Corfield A.P. Enzyme activity of the vaginal microflora and its effect on the secreted cervical mucus barrier// Brit.J.Nutr.-2002.-Vol.88.-No3(suppl).-P.Sl 19-S120.

383. Xu J., Gordon J.I. Honor the symbionts // Proc.Nat.Acad.Scienses.-2003.-Vol.100.-No 18.-P.10452-10459.

384. Yang K., Sun S., Tian J. Probiotics and acute pancreatitis need a long way to go// Langenbecks Arch Surg. -2009,- Jan.- Vol. 394(1).- P.193-194.-Epub 2008 Oct 8.?■ Q< Ly,

385. Ya Т., Zhang Q., Chu F. et al. Immunological evaluation-of Lactobacillus casei Zhang: a newly isolated strain from koumiss in Inner Mongolia// BMC Immun.-2008.- Nov.-9.- P.68.

386. Yan F., Polk D. B. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells// J. Biol. Chem.- 2002,- Vol.277.- P.50959-50965.

387. Yaskari J., Kontula P., Siitoneri A. et.al. Oat betaglucan and xylan hy-drolysates as selecive substrates for Bifidobacterium and Lactobacillus strains// Appl. Microbiol. Biotechhnol. -1998. -49 (2). -P.175-181.

388. Ziegler R. G. A review of epidemiologic evidence that carotinoids reduse the risk of cancer // J. of Nutr. 1989. - Vol. 119. - p. 116-122.

389. Zeimer C. J., Gibson G. R. An overview of probiotics, prebiotics and synbiotics in the functional food concept: perspectives and future strategies // Inter. Dairy J. 1998. -Vol. 8. - №5/6. - p. 437-479.

390. Zpusob vyroby cerstvych syru: Пат. 277893 Чехия, МКИ5 A 23 С 19/08 // Husek V., Kolek D. -№827.90; Заявл. 20.02.90; Опубл. 28.4.93.

391. Xu J., Gordon J.I. Honor the symbionts// Proc.Nat.Acad. Scienses.-2003.- Vol.100.- No. 18,-P. 10452-10459.

392. Yoshita M., Fujita K., Sakata I.I. et al. Development of the normal intestinal flora and its clinical significance in infants and children// Bifidobacteria Microflora.-1991 .-Vol. 10.-PI 1-27.