Технология производства и оценка эффективности синбиотиков на основе бесклеточных пробиотиков метаболитного типа

Провоторова, Олеся Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Технология производства и оценка эффективности синбиотиков на основе бесклеточных пробиотиков метаболитного типа
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Технология производства и оценка эффективности синбиотиков на основе бесклеточных пробиотиков метаболитного типа"

На правах рукописи

Провоторова Олеся Владимировна

ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ СИНБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ БЕСКЛЕТОЧНЫХ ПРОБИОТИКОВ МЕТАБОЛИТНОГО ТИПА

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

14 МАР 2013

Щелково - 2013 г.

005050630

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель:

Неминущая Лариса Анатольевна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник Научный консультант:

Нежута Александр Александрович - кандидат технических наук, доктор биологических наук, старший научный сотрудник Официальные оппоненты:

Римарева Любовь Вячеславовна - доктор технических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН, Заслуженный деятель науки РФ, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии» Россельхозакадемии, заместитель директора по научной работе

Тихонов Игорь Владимирович - доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина», заведующий кафедрой биотехнологии Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО Московский государственный университет пищевых производств ОЛ

Защита состоится ы марта 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д.17, ВНИТИБП; тел./факс 8 (496) 567-32-61, e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии

Автореферат разослан февраля 2013г. и размещен на сайте ВНИТИБП

Россельхозакадемии www.vnitibp.ru и на официальном сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Фролов Юрий Дмитриевич

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. В настоящее время интенсивно развивается такое направление экобиотехнологии, как разработка и использование в практике пробиотиков, пребиотиков и синбиотиков (Kailasapathy К., 2000; Oggioni M.R., et al., 2003; Ouwe-hend A.C., 2003; Малик Н.И. с соавт., 2009; Субботин В.В., Данилевская Н.В., 2009; Панин А.Н. с соавт., 2011). Эти лечебно-профилактические и ростостимули-рующие экологически безопасные препараты (Ishibashi N., 2001; Егоров И.А. с соавт., 2011) способствуют снижению техногенной и микробиологической нагрузки на организм животного в условиях интенсивного современного промышленного животноводства и птицеводства (Федоров Ю. Н., 2005; Hong H.A., 2005; Смоленский В.И., 2007; Джавадов Э.Д., 2010; Kaminska M.V., 2010; Фисинин В.И., 2011).

В области пробиотических лечебных препаратов и пищевых продуктов активно разрабатываются бесклеточные пробиотики (метаболитного типа), которые по сравнению с клеточной формой более стабильны при хранении, не снижают свою биологическую активность при применении на фоне лечебного курса антибиотиков, не оказывают побочных действий на организм человека, в отличие от живых микроорганизмов, способных в ряде случаев вызывать и/или усиливать инфекционные и воспалительные процессы (Михайлова H.A. с соавт., 1998; Сорокина Ю.В., 2012). Культуральная жидкость (основа бесклеточной формы пробиотика) - побочный продукт в традиционной технологии производства бактерийных препаратов или концентратов. Его утилизация, как отхода производства, приводит к значительным экономическим потерям и загрязнению окружающей среды. Поэтому разработка и производство бесклеточных пробиотиков - один из этапов создания безотходного производства бактерийных препаратов. Для агропромышленного комплекса России это направление является инновационным (Волков М.Ю. с соавт., 2007; Красочко П.А. с соавт., 2009).

Синбиотики - научно обоснованный комплекс про- и пребиотиков (Бондаренко В.М., 2003; Earll A.M., 2006; Glebocka К., 2008; Фисинин В. И. с соавт., 2008; Ноздрин Г.А. с соавт., 2009) - при малых расходах (от 0,2 до 5 кг на тонну корма) физиологически активны, безопасны для животных, технологичны в производстве и применении (Грязнева Т. Н., 2005; Шендеров Б.А., 2005; Римарева JT.B. с соавт., 2008; Тихонов И.В., 2010; Воробьева Г.И. с соавт., 2010). Их можно производить по унифицированным малоотходным технологиям на гибких технологических линиях, тиражированных и размещенных в непосредственной близости к потребителю (Кантере В.М., 1991; Бирюков В.В., 2004; Самуйленко А.Я. с соавт., 2009).

Разработка таких технологий является одним из перспективных направлений развития биотехнологии для АПК РФ.

Во ВНИТИБП накоплен значительный опыт разработки состава и технологии производства синбиотических комплексов для птицеводства и коневодства (Не-минущая Л.А., 2011; Самуйленко АЛ. с соавт., 2012). Синбиотики необходимо разрабатывать с учетом специфики систем пищеварения, способов кормления и т.д. для каждого вида сельскохозяйственных животных.

В связи с вышеизложенным представляются актуальными исследования, направленные на разработку малоотходной технологии производства новых препаратов пробиотиков и пребиотиков и создание на их основе биологически активных комплексов (синбиотиков) для животноводства и птицеводства.

Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в разработке технологии производства бесклеточного пробиотика из лакто- и спорообразующих бактерий, пребиотика и биологически активной добавки из высшего лечебного гриба, создании на их основе новых синбиотиков и оценке их эффективности в АПК РФ (животноводстве и птицеводстве).

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- разработать технологию производства бесклеточного пробиотика на основе бактерий Lactobacillus plantarum и Bacillus subtilis и препаратов из концентрированных бактериальных масс пробиотических бактерий L. plantarum и В. subtilis;

- разработать технологию производства препаратов из высшего лечебного гриба (ВЛГ) Fusarium sambucinum (пребиотика и БАД);

- экспериментально обосновать возможность малоотходной технологии производства препаратов, входящих в состав синбиотиков;

- разработать аппаратурное оформление и методику расчета технологической линии изготовления препаратов;

- разработать режимы сублимационного высушивания концентрированной бактериальной массы пробиотических бактерий L. plantarum и В. subtilis;

- определить эффективные условия проведения распылительного высушивания биомассы гриба;

- изготовить опытные партии препаратов (бесклеточный пробиотик, пребио-тик и БАД) и провести их доклинические исследования;

- разработать рецептуры синбиотиков и исследовать их эффективность для крупного рогатого скота (КРС) и птицы.

Научная новизна работы. Научно обоснована и разработана технология производства новых препаратов (комплексный бесклеточный пробиотик, препараты из концентрированной бактериальной массы пробиотических бактерий, пребиотик и БАД из высшего лечебного гриба), обеспечивающая возможность осуществления малоотходного цикла.

Исследованы физико-химические и биологические свойства разработанных препаратов, установлены показатели и количественные характеристики их безопасности и активности. Обоснована целесообразность применения бесклеточной формы пробиотиков в зависимости от объекта (особенности строения желудочно-кишечного тракта различных видов животных), способа (выпаивание) и условий (на фоне антибиотикотерапии) их применения.

Определены параметры культивирования бактерий Ь. р1агиагит и состав питательной среды. Разработан режим сублимационного высушивания концентрированной бактериальной массы (КБМ) лактобактерий. Впервые для про- и пребио-тиков разработана методика расчета технологической линии их производства.

Разработана рецептура новых синбиотиков (бесклеточный пробиотик + пребиотик и бесклеточный пробиотик + БАД), показана возможность их использования в качестве биологически активных кормовых добавок.

Установлена эффективность применения синбиотиков для молодняка птицы и КРС, обусловленная защитой животных при стрессовых ситуациях (вакцинация, переход на другой вид корма и др.), повышением продуктивности, усвояемости кормов, нормализацией микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Подана заявка № 2013100187 от 10.01.2013 на выдачу патента РФ «Биологически активный комплекс на основе бесклеточного пробиотика, кормовая композиция, его содержащая, и способ кормления молодняка сельскохозяйственных животных и птицы».

Практическая значимость работы. Разработанная малоотходная технология производства новых препаратов апробирована и внедрена на опытном производстве ВНИТИБП. В доклинических исследованиях показана безопасность и эффективность опытных серий препаратов. С учетом требований Правил ОМР разработана и утверждена директором ВНИТИБП нормативная документация: на препараты - технологические регламенты и проекты стандартов организации (СТО); на синбиотики - проекты инструкций по применению.

Разработаны и предложены для практического использования в животноводстве и птицеводстве новые синбиотики, применение которых способствует повы-

шению продуктивности животных и птицы, обеспечению гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.

Экономический эффект от применения новых синбиотиков составил при выращивании бройлеров 7,862 тыс.руб. (в расчете на 1000 голов), при выращивании телят - 111,83 рубля на 1 теленка.

Результаты исследований положены в основу разработки четырех Методических положений, утвержденных Россельхозакадемией в установленном порядке: по обоснованию режимов сублимационного высушивания пробиотических препаратов; по расчету технологических линий производства пробиотических и симбио-тических препаратов; по применению компьютерной программы Microsoft Office VISIO 2010 для построения технологических схем; по применению пакета Microsoft Office EXCEL 2010 для построения сложных технологических графиков (на примере процесса сублимационного высушивания препаратов-пробиотиков).

Полученные экспериментальные данные использованы для обоснования разработанной во ВНИТИБП и одобренной Президиумом Россельхозакадемии (протокол №4 от 21.04.2011) «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации», а также в лекционном материале курсов повышения квалификации специалистов птицеводческих предприятий «Новые технологии и пути повышения эффективности производства мяса бройлеров» (ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии, г.Сергиев Посад, 2012г.).

Основные положения работы, выносимые на защиту:

- технология производства бесклеточного пробиотика из L. plantarum и В. subtilis, КЕМ пробиотических бактерий, препаратов из высшего лечебного гриба (пребиотика и БАД);

- аппаратурное оформление технологической линии производства препаратов в малоотходном цикле;

- режимы сублимационного высушивания КЕМ пробиотических бактерий и распылительного высушивания БАД;

- характеристика состава и показатели качества опытных партий препаратов (бесклеточный пробиотик, пребиотик и БАД);

- рецептуры синбиотиков на основе этих препаратов;

- эффективность синбиотиков для молодняка птицы и КРС.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работ проводились совместно с научными сотрудниками отдела обеспечения качества лекарственных средств (JIC) для животных, отдела технологии сушки биопрепаратов, отдела противобактерийных препаратов ВНИТИБП.

Апробация результатов работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены: в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий на Ученом совете и методической комиссии ВНИТИБП (2008-2012гг.); на Отделении ветеринарной медицины Россельхозакадемии (2011,2012 гг.); на семи Международных конференциях, проводившихся в Москве, Покрове, Щелково, Казани, Тюмени, Саратове (2008-2013 гг.).

Публикация научных исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 научных работ, в том числе 7 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, предложений для практики, списка литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей и 18 рисунками. Список использованной литературы содержит 182 источника, в том числе -52 иностранных авторов.

Благодарности. Автор выражает благодарность директору ВНИТИБП, академику РАСХН А.Я. Самуйленко; научному руководителю JI.A. Неминущей и научному консультанту A.A. Нежуте, а также за оказанную практическую и консультативную помощь сотрудникам ВНИТИБП Э.Ф. Токарик, Г.И. Воробьевой, Т.А. Скотниковой, А.И. Албулову, Е.П. Сапегиной, Е.Э. Школьникову, И.В. Павленко, A.A. Раевскому', Ю.Д. Фролову, Т.А. Авдеевой, В.Н. Егоровой, А.В.Захарову, сотрудникам ВНИТИП (г.Сергиев Посад) В.Г. Шолю, И.П. Салеевой, A.B. Иванову и Института экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» (Беларусь, г. Минск) П.А. Красочко.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 2008 - 2012 годах в отделе обеспечения качества лекарственных средств для животных ВНИТИБП в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ, задание 08.06.02 «Разработать молекулярно-биологические основы конструирования и технологии производства

лечебно-профилактических препаратов с использованием биологически активных веществ природного происхождения и микробиологического синтеза».

Часть исследований проводили на базе Государственного научно-исследовательского института синтеза белка, Всероссийского научно-исследовательского технологического института птицеводства, Института экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. Производственные испытания синбиотиков проводили на базе опытного хозяйства ФГУП «Загорское экспериментальное племенное хозяйство ВНИТИП» и сельскохозяйственного производственного кооператива «Острошицы» Лагойского района Минской области.

2.1. Материалы и методы

Основными объектами исследований служили: пробиотические бактерии L. plantarum, штамм 8РАЗ (ВКПМ № В-11007) и В. subtilis, штамм М-8 (ВКПМ № В-1948), высший лечебный гриб F.sambucinum, штамм MKF-2001-3 (ВКПМ №F-867); бесклеточный пробиотик (смесь культуральных жидкостей бактерий L. plantarum и В. subtilis); препараты в виде сухой КБМ пробиотических бактерий L. plantarum и В.subtilis; пребиотик (автолизат мицелия гриба F. sambucinum); БАД (сухая биомасса гриба F. sambucinum после автолиза); синбитиков (бесклеточный пробиотик + пребиотик и бесклеточный пробиотик + БАД).

Для характеристики химического состава пребиотика и БАД в аналитической лаборатории ГосНИИСинтезбелок определяли: массовую долю сухих веществ (по ГОСТ 28561-90); массовую долю золы (по ГОСТ 12572-67); массовую долю липи-дов (по ГОСТ 13496.15-97); общий белок (по ГОСТ 26889-86); общее содержание углеводов (по ГОСТ 26176-91); макро- и микроэлементы методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии (на приборе AAS-1N); органические кислоты методом хроматографии (на хроматографе Хьюлетт - Паккард, колонка - поли-сорб); витамины (флюорометрическим методом по ГОСТ 29138-91, 19139-91, 29140-91); состав и содержание аминокислот (на аминокислотном анализаторе Биотроник LC-7000).

Показатели безопасности и качества препаратов определяли: безопасность -на белых нелинейных мышах; антагонистическую активность пробиотика - по величине задержки роста патогенных микроорганизмов в опытах in vitro (Биргер М.О., 1982); количество жизнеспособных бактерий - высевом на среды MRS-4 и сусло-агар (по ГОСТ Р 54065-2010); контроль готовых препаратов - в соответствии с разработанными проектами стандартов организации (СТО).

Эффективность синбиотиков определяли при применении: телятам - по показателям сохранности, среднесуточного прироста живой массы, бактерицидной и лизоцимной активности крови; цыплятам-бройлерам - по показателям сохранности, среднесуточного прироста живой массы, затратам корма, европейскому индексу продуктивности и динамике роста живой массы птицы (Фисинин В.И. с соавт., 2008).

В работе использовано следующее технологическое оборудование: для культивирования микроорганизмов - термостат, шуттель-аппарат, установка АНКУМ-2М (V=10 дм3), оснащенная системами автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования (температура, рН, парциальное давление растворенного кислорода - рСЬ, расход воздуха на аэрацию, скорость вращения мешалки); для фильтрации культуральных жидкостей -установка «Сартокон-мини» («Владисарт», г. Владимир, мембраны «Ультрасарт» на основе полисульфона с порогом задержания 300 кДа), ультрафильтрационная установка УПЛ-0,6 с полными волокнами (материал мембраны - фенилон), размер пор - 0,22 мкм и нутч-фильтры; для сублимационного высушивания -лабораторное и промышленное холодильное и сублимационное оборудование «Reveo», NZ-280/75, S.MJ. «USIFROID», ТГ-50.5; для распылительного -установка «Niro Atomizer».

Статистическую обработку результатов (число повторов >3, достоверность 95%) проводили методами Кербера в модификации Ашмарина, наименьших квадратов. Для определения технологических и режимных параметров, влияющих на основные показатели качества готового продукта при сублимационном высушивании, использованы математические методы планирования эксперимента (Хартман К., 1977). Расчеты и построение технологических графиков осуществляли с помощью пакета Microsoft Office EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем - с помощью программы Microsoft Office VISIO 2010.

Алгоритм производства и применения синбиотиков (см. рис. 1) показывает, что в процессе изготовления новых препаратов не образуются побочные продукты (культуральные жидкости и бактериальные массы), утилизация которых приводит в традиционной технологии к значительным экономическим потерям и загрязнению окружающей среды. Предложенный нами алгоритм свидетельствует о малоотходном характере технологии и принципиальной возможности создания в перспективе безотходного производства пробиотиков, пребиотиков и БАД.

СИНБИОТИКИ (на основе бесклеточных пробиотиков)

ПРОБИОТИК

ПРЕБИОТИК И БАД

L. plantarum

КБМ

КЖ

В. subtilis

КБМ

КЖ

ДСП L. plantarum

L. plantarum ] В. subtilis

СИСТЕМА ПОСЕВНЫХ МАТЕРИАЛОВ

ПСП В. subtilis

БЕСКЛЕТОЧНЫИ ПРОБИОТИК _(жидкая форма)_

СИНБИОТИК №1 (ПРОБИОТИК + ПРЕБИОТИК)

Гриб Fusarium Sambucinum

j ПРЕБИОТИК i (автолизат БГ)

БАД (биомасса после автолизата)

СИНБИОТИК №2 (ПРОБИОТИК + БАД)

ПТИЦЕВОДСТВО КРУПНЫЙ РОГАТЫЙ СКОТ

- Выпаивание - При различных формах кормления

- Одновременно с антибиотиками - С учетом строения ЖКТ

КЖ - культуральная жидкость БАД - биологически активная добавка

КБМ - концентрат бактериальной массы БГ - биомасса гриба

ПСП - посевная серия пробиотика для реализации региональным биопредприятиям ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

Рис.1. Алгоритм производства и применения синбиотиков для АПК

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Технология изготовления препаратов.

2.2.1.1. Бесклсточпый пробиотик на основе L. Plantarum и В. subtilis, концентрированная бактериальная масса (КБМ) пробиотических бактерий.

Штаммы бактерий L. plantarum, штамм 8РАЗ (ВКПМ № В-11007) и В. subtilis, штамм М-8 (ВКПМ № В-1948), депонированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, в дополнение к паспортным данным характеризовали по величине антагонистической активности (АнтА) в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ (штаммы Е. coli К-88, К-99, А-20Е и сальмонелл S. typhimurium, S. dublin, S. gallinanim). Установлен выраженный антагонизм штаммов бактерий в отношении патогенных микроорганизмов (Биргер О.М., 1982), причем штамм В. subtilis обладал более высокой АнтА, чем лактобактерии: зона задержки роста эшерихий и сальмонелл - не менее 10 мм для L. plantarum и не менее 15 мм для В. subtilis.

Технологическая схема основных стадий производства препаратов приведена на рисунке 2 и состоит из следующих этапов: раздельное культивирование бактерий, отделение культуральной жидкости (КЖ) от бактериальной массы, смешивание КЖ, смешивание КБМ пробиотических бактерий с защитной средой (обезжиренное молоко (ОМ)) и последующее сублимационное высушивание.

Культивирование бактерий. Для культивирования бактерий L. plantarum, штамм 8РАЗ, согласно данных паспорта ВКПМ, применяется среда MRS, имеющая высокую стоимость. Нами проведены исследования и показана возможность замены среды MRS питательной средой на основе молочной сыворотки (MC), разработанной ранее во ВНИТИБП для культивирования L. acidophilus, штамм 1К: накопление клеток было одинаковым для обеих сред и составляло, в среднем, 5,ОхЮ9КОЕ/см3. Однако среда MC была в 3-4 раза дешевле.

Состав среды MC: сухая молочная сыворотка - ЗОг; (NH^SO,!- 5,0 г; КН2РО4 - 3,0 г; дрожжевой автолизат - 0,01 дм3; вода водопроводная - 1,0 дм3. Характеристика среды после стерилизации (0,5 атм 30 мин): редуцирующих веществ (РВ) — 1,6 %; NHL» - 0,9 г/дм3; Р205 - 0,5 г/дм3.

Культивирование бактерий в колбах (получение посевного материала) и в биореакторе проводили в питательной среде MC по режиму, разработанному ранее во ВНИТИБП для клеточных пробиотиков АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ.

Рис.2. Технологическая схема основных стадий изготовления бесклеточного пробиотика и сухих КБМ.

Посевной материал L. plantarum культивировали в термостате при температуре 31+0,5 °С в течение 70-72 ч (перемешивание каждые 12 ч), начальное значение рН - 7,0-7,2; B.subtilis - на качалке (п=200 об/мин) при температуре 37±1°С в течение 42-46 ч, начальное значение рН - 7,0-7,2. Состояние каждой культуры контролировали микроскопированием на отсутствие посторонней микрофлоры и соответствие культурально-морфологическим признакам; определяли накопление клеток - для L. acidophilus 5х109 КОЕ/см3, для В. subtilis 5х10шКОЕ/см3.

Посевные материалы использовали для культивирования бактерий в биореакторе (V=10 дм3). Режим культивирования L. plantarum в биореакторе: количество посевного материала - 8-10 % от объема питательной среды МС; температура -31-32°С, время - 20-24 ч; перемешивание в течение первых двух часов (по 15 мин/ч, п=180 об/мин); начальное значение рН - 7,0-7,2; при культивировании поддерживали рН на уровне 6,5-7,0 (6%-ной аммиачной водой). Конечная концентрация сухих веществ в биомассе - 10,0-12,0 г/дм3; концентрация Сахаров в среде - 0,2 %. Накопление лактобактерий - не менее 5x109 КОЕ/см3.

Режим культивирования В. subtilis в биореакторе: объем посевного материала - 5-6 %; температура - 37-38°С, время 42-48 ч; перемешивание мешалкой

(п=300 об/мин); аэрация (1 дм3 воздуха/1 дм3 среды/мин.); начальное значение рН 7,0-7,2; в процессе культивирования величина рН не регулировалась. Конечная концентрация сухих веществ в биомассе -15 г/дм3. Конечная концентрация бактерий не менее - 5хЮ10 КОЕ/см3, количество спор 40-50 %.

Получение готовой формы бесклеточного пробиотика. После культивирования клетки удаляли из бактериальных взвесей поэтапным фильтрованием: бакмассы концентрировали на лабораторной установке «Сартокон-мини» с мембранами «Ультрасарт» (средняя скорость концентрирования 0,20-0,22 дм 3/мин, производительность мембраны по дистиллированной воде от номинала после 5 циклов концентрирования G=90%); КЖ стерилизовали фильтрацией на ультрафильтрационной установке УПЛ - 0,6 (производительность по воде - 6-8 л/ч, максимальное давление - 0,2 МПа).

Затем в асептических условиях фильтраты КЖ смешивали в объемном соотношении 1:1 и расфасовывали в стеклянные или полиэтиленовые флаконы.

Получение готовой формы сухих КБМ пробиотических бактерий осуществляли методом сублимационного высушивания. Разработку режима высушивания проводили на модели концентрированной бакмассы лактобактерий, как более термолабильного объекта по сравнению с B.subtilis. В качестве защитной среды (ЗС) использовали обезжиренное молоко (ОМ). Определены физико-химические свойства биоматериала как объекта интенсивного обезвоживания из замороженного состояния с максимальным сохранением биологической активности: эвтектическая зона с верхней (Tg = - 30°С) и нижней (Т^ = - 37°С) границами, температура полного затвердевания раствора (Тпз= - 52°С).

В исследованиях использовали сублиматор S.M.J. «USIFROID» и холодильные камеры «Reveo», NZ-280/75, настроенные под условия эксперимента.

Для определения технологических и режимных параметров, влияющих на основные показатели качества готового продукта, были использованы математические методы планирования эксперимента и дважды реализован дробный факторный план типа «2п Р» (Хартман К., 1977), где п=6, Р=2. В качестве независимых контролируемых параметров были приняты основные технологические и режимные параметры замораживания и высушивания (величина фасовки, температуры сублимации и досушивания, скорости охлаждения на этапах первичной и вторичной кристаллизации, время досушивания). Значения уровней факторов принимали с учетом возможности реализации режимов замораживания и высушивания на современном промышленном оборудовании, параметров существующих производ-

ственных режимов, объемов фасования и данных предварительных экспериментов (Нежута A.A. с соавт., 2002).

Результаты статистической обработки методом наименьших квадратов позволили определить значимые параметры (для каждого из исследуемых показателей качества), выявить их влияние на исследуемые характеристики препарата, получить расчетные зависимости с 95%-ной надежностью значимости коэффициентов регрессии (при tKp„T=. 2,12).

Полученные зависимости затем были использованы при разработке режима высушивания препаратов на промышленной установке ТГ-50.5. В этом случае расчет длительности этапа сублимации проводили согласно «Методических положений по обоснованию режимов сублимационного высушивания пробиотиче-ских препаратов» по формуле:

г =к-ешыт',ч, (1)

при к (коэффициент, зависящий от состава стабилизатора) = 2,7 для ОМ; F (величина фасовки во флакон) = 2 см3; S (площадь испарения в единице посуды) = 4,48 см2; Тс (температура сублимации = -35±2°С (берется по модулю).

Расчетное время сублимации - 8 часов.

Расчет длительности этапа досушивания проводили по формуле, полученной при реализации планированного эксперимента:

у, = 1,93 + 0,24(^i) + 0.3(V"A- "')-0,32(Г'7~25)-0,2(^) (2)

2 0,6 5 3

где у!=2±0,2% (заданная величина уровня остаточной влажности); F=2cm3 (величина фасовки во флакон); ТД=25°С (температура досушивания); vIIK=l,6 °/мин.; т - время досушивания, час.

Расчетное время досушивания - 5 часов.

Режим замораживания-высушивания лактобактерий (фасовка по 2 см3 во флаконы емкостью 20 см3; защитная среда - ОМ) имел следующие параметры (см. рис. 3):

- материал замораживали в холодильной установке NZ-260/75 при Твозд. =(51 ±2) °С до достижения Тмат.= -50 °С и выдерживали в течение 5-6 ч;

- высушивание проводили в сублиматоре типа ТГ-50.5, контролируя с помощью датчиков температуру материала, плит, конденсатора и остаточное давление в камере. При достижении давления 80-90 мкм рт.ст. включали нагрев полок и выводили температуру материала на уровень минус 35-32 °С, поддерживая ее в тече-

ние 9-11 ч. Затем выводили температуру материала на заданный уровень (25±2°С) и поддерживали ее в течение 5-6 ч при давлении в камере не выше 90 мкм рт. ст.;

- общее время сушки составляет 24-26 ч;

- остаточная влажность материала после высушивания - 2,0+0,5%.

Разработанный режим замораживания-высушивания определяется составом ЗС, поэтому был использован также для высушивания КБМ В. зиЫШя.

Сухая КБМ пробиотических бактерий используется как полупродукт (в качестве посевного материала при производстве бесклеточного пробиотика), а также как готовый препарат (для применения на региональных биопредприятиях в качестве системы посевных серий). Это обеспечивает малоотходный цикл одновременного получения различных пробиотических препаратов из одного вида сырья.

2.2.1.2. Пребиотик и БАД из высшего лечебного гриба Р. ьатЪистит МКТ-2001-3.

Пребиотик представляет собой стерильный жидкий автолизат мицелия гриба (АМ), БАД - сухую биомассу гриба (БМ), полученную после отделения автолиза-та.

Технологическая схема основных стадий изготовления препаратов приведена на рисунке 4 и состоит из следующих этапов: культивирование гриба в питательной среде на основе молочной сыворотки, водный автолиз полученной биомассы в культуральной жидкости, отделение биомассы от фильтрата после автолиза, стерилизация фильтрата, высушивание биомассы.

Культивирование Р. затЬистит в колбах (получение посевного материала) и в биореакторе проводили в питательной среде (МС) по режиму, разработанному ранее во ВНИТИБП для препарата АВИСТИМ.

Посевной материал получали культивированием в колбах со средой МС при температуре 26±1 °С на качалке (п=160 об/мин). Время культивирования пассажей: первого - 96 ч, второго - 48 ч, третьего и последующих - 24 ч. Состояние культуры контролировали микроскопированием, определяли накопление биомассы -5-6 г/дм3 и использовали для культивирования в биореакторе при следующих параметрах: объем посевного материала - 2-4 %; температура - 27±2 °С; время -30-34 ч; перемешивание постоянное (п=120 об/мин); аэрация (1 дм3 воздуха/1 дм3 среды/мин.); остаточное давление 0,25 атм; начальное значение рН 5,5-6,0; процесс заканчивали при снижении рН до 4,1±0,5. Через 12 ч после начала процесса отбирали пробы каждые 3 ч для определения рН среды, концентрации биомассы, контроля состояния мицелия. Конечная концентрация биомассы - 10-12 г/дм3, содержание белка - 46-53 %.

Рис. 4. Технологическая схема основных стадий изготовления препаратов из высшего лечебного гриба К катЬистит МКР-2001-3.

Автолиз проводили при смешивании биомассы с водопроводной водой в соотношении 1:1, добавлении 0,001% этилового спирта, периодическом перемешивании и выдерживании смеси при температуре 45 °С в течение 12 ч.

Получение готовой формы пребиотика. Автолизат отделяли от биомассы фильтрацией на нутч-фильтрах (разрежение 0,05-0,07 МПа), подвергали стерилизующей фильтрации на ультрафильтрационной установке УПЛ - 0,6 (производительность по воде — 6-8 л/час, максимальное давление 0,2 МПа) и расфасовывали в стеклянные или полиэтиленовые флаконы.

Получение готовой формы БАД. Биомассу гриба после отделения автолизата сушили на распылительной сушилке Niro Atomizer.

Определены эффективные параметры проведения распылительного высушивания биомассы гриба (температуры на входе и выходе, мощность, скорость подачи материала), интервалы которых (см. табл. 1) выбраны с учетом многолетнего опыта распылительного высушивания материалов микробиологической природы, имеющих аналогичные физико-химические свойства (Егорова В.Н. с соавт., 1981).

Исходя из соображений экономической целесообразности (с учетом мощности и величины потерь) для достижения нормируемых показателей качества сухой биомассы (по содержанию общего белка и влажности) рекомендован следующий режим высушивания: Твх=140 °С; Твых=95 °С; ОВ - 4,8 %.

Таблица 1

Результаты исследования эффективных условий распылительного высушивания биомассы гриба (п=3; Р=95%)

№ опыта Параметры высушивания Потери, % Характеристика препарата

Твх» °с Твьи» °с Мощн., кВт Упод., л/ч Общий белок, % от асв (не менее 38) Остаточная влажность (ОВ), %

1 120 90-80 14 7 35 49,1 7,1

2 140 100-90 18 7 10 49,2 4,8

3 160 120-110 21,5 7 7 49,2 2,5

2.2.1.3. Аппаратурное оформление технологической линии производства препаратов. Аппаратурное оформление технологической линии получения препаратов в малоотходном цикле включало разработку технологической схемы основных стадий процесса производства препаратов (см. рис. 2,4), подбор необходимого оборудования и его характеристик, создание аппаратурной схемы производства препаратов (см. рис. 5,6).

По результатам, изложенным в разделе 2.2.1, в соответствии с требованиями разработанного во ВНИТИБП ГОСТ Р 54763-2011 «Средства лекарственные для ветеринарии. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, согласования и утверждения» разработаны технологические регламенты изготовления препаратов и методические положения по расчету технологических линий производства пробиотических и симбиотических препаратов.

Расчет технологических операций является одним из обязательных этапов разработки лабораторного технологического регламента.

Посевная сер«« нонтрачьт склад готовой продукции

пп —5 00

? г

□ 0 Ь=!

бесклеточный пробили* _^а контроль и

контроль и склад готовой продукции

Рис. 5. Аппаратурная схема изготовления бесклеточного пробиотика.

1 - термостат; 2, 12 - биореактор для культивирования бактерий; 3,13 - фильтр грубой очистки; 4, 14 - установка для ультрафильтрации; 5, 10, 17 - емкости для смешивания; 6, 15, 18 - установка для фасования; 7, 19 - низкотемпературный холодильник; 8, 20 - сублимационная установка; 9,16, 21 -устройство для этикети-рования; 11 - шутгель-аппарат; 22 - емкость для изготовления питательной среды (ПС); 23 - емкость для изготовления ЗС; 24, 25 - парогенератор.

Пребиотик на конроль И склад готовой продукции

Рис. 6. Аппаратурная схема производства пребиотика и БАД из гриба Б. ЗатЬистит

1 - термостат с качалкой; 2 - биореактор для культивирования гриба и автолиза биомассы; 3 - нутч-фильтр; 4 - установка для ультрафильтрации автолизата; 5,8 - устройство для фасования и укупоривания продукта; 6,9 - устройство для этикетирования продукта; 7 - распылительная сушилка; 10 - емкость для изготовления питательной среды; 11 - парогенератор.

Методика расчета технологической линии состоит из следующих разделов: выбор схемы технологического процесса производства препарата и ее обоснование; расчет материального потока основного процесса производства; выбор и расчет количества основного технологического оборудования.

Для проведения расчета материального потока устанавливаются следующие исходные данные: объем биореактора (Vs) м3; коэффициент заполнения (К,); оптическая концентрация микробных клеток в культуралыюй жидкости (ОК млрд/мл); вводимые добавки (Gg) л, %; потери полуфабрикатов по стадиям (Пп) л, %; выход полуфабрикатов по стадиям (В) л; объем препарата в одном флаконе или ампуле (Урасф) л; количество доз в одном флаконе или ампуле (а) доз. Расчет начинают с определения количества циклов культивирования, необходимого для выполнения годового (планового) задания по выпуску препарата.

Подобраны технико-экономические критерии выбора основного технологического оборудования, который проводится на основании его технических характеристик, технологических параметров и требований, предъявляемых к каждой стадии производства препаратов.

Для проведения расчета количества основного технологического оборудования учитываются следующие исходные данные: плановое задание по выпуску препарата на линии (N) тыс. доз; объем (V, м3) и коэффициент заполнения (К3) для емкостей; производительность машин и установок (W) м3/час; фл/час; время занятости оборудования (Т), час; фонд рабочего времени в году (Ф), час.

Расчет начинают с определения количества циклов культивирования, необходимого для выполнения планового задания по выпуску препарата.

2.2.2. Характеристика состава и показатели качества препаратов. На опытном производстве изготовлены опытные серии препаратов, исследован их состав, определены показатели качества и их нормируемые значения.

2.2.2.1. Бесклеточпый пробиотик. Определена (п=5, Р=95%) АнтА препарата в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ (зона задержки роста Е. coli, штаммы К-88, К-99, А-20Е - 16-20 мм, сальмонелл S. typhimurium, S. dublin, S. gallinarum - 18-24 мм) и микроорганизмов, выделенных в хозяйстве от больных послеродовыми эндометритами коров (зона задержки роста Staphylococcus epidermidis - 21,8 мм; Proteus vulgaris - 24,4 мм; E.coli - 17,7 мм; Staphylococcus

pyogenes - 19,5 мм; Staphylococcus aureus - 26,3 мм; Pseudomonas aeruginosa -22,5 мм), что свидетельствует о расширении спектра действия.

Показатели качества: внешний вид (прозрачная или опалесцирующая жидкость желто-коричневого цвета, допускается образование при хранении осадка из компонентов среды); запах (специфический, уксусной и молочной кислот); посторонние включения (не допускаются); количество жизнеспособных клеток, не более (1 х 105 в 1 см3); наличие посторонних микроорганизмов (не допускается); pH (4,0-5,0); антагонистическая активность (не менее 16 мм); безвредность (при введении белым мышам препарата в тест-дозе 0,25 мл внутрь не должна вызывать изменений общего состояния животных в течение 10 дней).

2.2.2.2. Пребиотик. Результаты сравнительного исследования (п=5, Р=95%) химического состава биомассы (БМ). автолизата мицелия (AM) и культуральной жидкости (КЖ) по показателям: общий анализ (сухие вещества, общий белок, жиры, углеводы), макро- и микроэлементы, аминокислоты, витамины (см. рис. 7,8.9,10) свидетельствуют о том, что автолизат мицелия и биомасса гриба более богаты по своему составу, чем культуральная жидкость.

AM и БМ содержат большой спектр аминокислот, в том числе и все незаменимые аминокислоты; полный набор микро- и макроэлементов в легкоусвояемой форме (в виде органических соединений и их комплексов), а так же комплекс витаминов. в том числе - группы В.

Рис. 7. Химический состав КЖ, AM, БМ. 20

Аминокислоты (% АСВ)

4,5--—

4---

3,5----

ев

□ кж

НАМ

□ БМ

# ** ^ ** ** ** ^ # ** » Показатели

125

Рис. 8. Содержание аминокислот в КЖ, АМ, БМ.

Макроэлементы

Натрий Кальций Магний

Рис. 9. Содержание макроэлементов в КЖ, АМ, БМ.

Микроэлементы

□ кж

ВАМ

□ БМ

Железо Медь Цинк Марганец Никель Кобальт Свинец Ртуть Мышьяк

Показатели

Рис. 10. Содержание микроэлементов в КЖ, АМ, БМ. 21

Показатели качества пребиотика: рН (6,6-7,0); массовая доля сухих веществ (не менее 5,8%); контаминация бактериальной и грибковой микрофлорой (не допускается); безвредность (при введении белым мышам в тест-дозе 0,25 мл внутрь препарат не должен вызывать изменений общего состояния животных в течение 10 дней).

2.2.2.3. Биологически активная добавка. Определен (п=5, Р=95%) химический состав БАД, % от абсолютно сухого вещества (асв): общий белок -49,2; углеводы - 24,9; липиды - 8,1; нуклеиновые кислоты - 3,9; зола - 8,0; влажность - 4,8%.

Качество добавки характеризовали по показателям: массовая доля сырого протеина (не менее 38% от асв); массовая доля белка по Барнштейну (не менее 28 % от асв); массовая доля липидов (не болееЮ % от асв); массовая доля углеводов (не более28 % от асв); массовая доля золы (не более12 % от асв); контаминация посторонней бактериальной и грибковой микрофлорой (не допускается); токсичность (не допускается); безвредность (однократное скармливание препарата в дозе 3% от суточной нормы корма не должно вызывать изменений общего состояния животных в течение 10 дней). Количественные значения показателей соответствовали требованиям, предъявляемым нормативной документацией к существующим кормовым добавкам, например, кормовым дрожжам (ГОСТ Р 20083-74).

Витамины

350 300 ■ 250 ■

150 100

Ю=1

л I ^ „

г ^

?«/ /

окж

ВАМ □ БМ

Л9" Л* Лг Л?

¡я -«Р Ж V . >6" Показатели

о,"

/У

Рис. 11. Содержание витаминов в КЖ, АМ, БМ.

Исследования, изложенные в разделе 2.2.2, использованы при разработке проектов стандартов организации на препараты. Результаты контроля опытных серий по всем показателям соответствовали установленным для них нормам, что свидетельствовало о воспроизводимости разработанной технологии.

2.2.3. Рецептуры синбиотиков и их эффективность для молодняка птицы и крупного рогатого скота.

2.2.3.1. Рецептуры синбиотиков. Синбиотик №1 включает бесклеточный пробиотик и пребиотик. Жидкая форма про- и пребиотика обеспечивает возможность их выпаивания с питьевой водой и/или другими жидкостями, которое является более технологичным способом по сравнению со скармливанием, а для новорожденных животных - единственно возможным.

Синбиотик №2 включает жидкий бесклеточный пробиотик и сухую БАД.

Синбиотики применяли молодпяку сельскохозяйственных животных и птице способом непосредственного внесения каждого препарата в корм или питьевую воду в дозах, зависящих от вида и возраста животных.

2.2.3.2. Эффективность синбиотика Ks1 для молодняка птицы и крупного рогатого скота. Эффективность применения синбиотика определяли при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Кобб-500» (по 105 голов в группе). Препараты применяли двукратно в 1-7 и 21-28 дни по 0,1 см3 каждого препарата на голову с питьевой водой. Показано (при Р=95 %), что по сравнению с контролем сохранность цыплят выше на 3,8%, затраты корма ниже на 3,8 %, европейский индекс продуктивности (ЕИП) выше на 25 единиц.

Исследовали эффективность синбиотика для телят (по 50 голов в группе) в первый, третий дни жизни и в день отъема: жидкие пробиотик и пребиотик выпаивали по 10,0 см3 каждого препарата на голову с молоком или молозивом. Использование синбиотика позволило увеличить (при Р = 95%) среднесуточный прирост живой массы на 160 г на голову и среднюю живую массу теленка в конце опыта (в возрасте 60 дней) на 10,6 кг.

2.2.3.3. Эффективность синбиотика N»2 для молодняка птицы и крупного рогатого скота. Исследовали влияние синбиотика на динамику увеличения живой массы птицы (2000 голов), вакцинированной против ньюкаслской болезни (НБ). Цыплятам-бройлерам (ремонтный молодняк) препараты задавали, начиная с суточного возраста ежедневно двумя циклами (в 1-7 и 21-28 дни), в дозах: пробиотик по 0,1 см3 наголову в сутки с питьевой водой, биологически активная до-

бавка - 1,5 % от суточного рациона корма. Применение синбиотика способствовало улучшению динамики увеличения живой массы птицы (при Р = 95 %) птицы.

Эффективность применения комплекса пробиотика и БАД исследовали на телятах (50 голов) при переводе с молочного питания на растительные корма. Препараты комплекса применяли в первый - третий дни перевода в дозах: пробиотика - по 5,0 см3 на голову с молоком, биологически активной добавки - 1,5 % от суточного рациона комбикорма. Использование комплекса позволило (при Р = 95%) дополнительно получить среднесуточный прирост живой массы 90-134 г, повысить бактерицидную активность сыворотки крови на 9,3 - 12,8%, лизоцимную активность на 1,1 - 1,7 мкг/мл.

Результаты, изложенные в разделе 2.2.3, использованы при разработке проектов инструкций по применению синбиотиков.

3. ВЫВОДЫ

1. Научно обоснована и разработана малоотходная технология производства новых пробиотиков и пребиотиков, основанная на получении двух препаратов в едином цикле культивирования - бесклеточного пробиотика и концентратов бактериальной массы (при культивировании бактерий L. plantarum и В. subtilis), пре-биотика и БАД (при культивировании высшего лечебного гриба F. sambucinum).

2. Установлено, что бесклеточный пробиотик обладает широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ и микроорганизмов, выделенных от больных послеродовыми эндометритами коров (зона задержки роста - не менее 16 и 18 мм соответственно).

3. Для культивирования бактерий L. plantarum, штамм 8РАЗ, показана возможность замены среды MRS питательной средой на основе молочной сыворотки: при одинаковом накоплении клеток стоимость среды МС в 3-4 раза ниже, чем среды MRS. Использование универсальной питательной среды на основе МС обеспечивает высокое накопление продукта: L. plantarum - не менее 5x10 КОЕ/см , В. subtilis - не менее 5хЮ10 КОЕ/см3, биомассы гриба 10-12 г/л.

4. Показано, что биологическая ценность пребиотика и биологически активной добавки обеспечивается содержанием большого спектра аминокислот, в том числе и всех незаменимых; полного набора микро- и макроэлементов в легкоусвояемой форме (в виде органических соединений и их комплексов), а так же комплекса витаминов, в том числе - группы В. Биологически активная добавка по показателям питательной ценности не уступает таким коммерческим кормовым добавкам, как кормовые дрожжи.

5. Разработаны эмпирические зависимости оценки показателей качества готового продукта (макровид, остаточная влажность, выживаемость после сушки) от режимных (температуры сублимации и досушивания, скорости охлаждения на этапах первичной и вторичной кристаллизации, время досушивания) и технологических (величина фасовки) параметров. Разработан промышленный режим сублимационного высушивания концентрированной бактериальной массы пробиотиче-ских бактерий.

6. Обоснованы эффективные условия распылительного высушивания биомассы гриба для изготовления БАД: Твх=140 °С; Твых=95 °С; ОВ - 4,8%.

7. Разработаны технологические и аппаратурные схемы процесса производства новых препаратов, впервые стандартизованные по требованиям ГОСТ Р 54763-2011 «Средства лекарственные для ветеринарии. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, согласования и утверждения», а также методика расчета технологической линии производства препаратов.

8. Опытные партии препаратов по показателям качества соответствовали требованиям, установленным СТО на препарат, что свидетельствует о воспроизводимости разработанной технологии.

9. Разработаны рецептуры синбиотиков и экспериментально подтверждена возможность их использования в качестве биологически активных кормовых добавок при выращивании молодняка птицы и крупного рогатого скота.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Для практического использования предложены следующие документы. Нормативная документация: Технологические регламенты производства препаратов, утвержденные директором ВНИТИБП 07.09.2012; Стандарты организации, утвержденные директором ВНИТИБП 03.09.2012 - на бесклеточный про-биотик (№ 9337-003-11734126-12), сухой концентрат бактериальной массы L. plan-tarum (№ 9337-004-11734126-12), сухой концентрат бактериальной массы В. subti-lis (№ 9337-005-11734126-12), пребиотик (№ 9291-006-11734126-12), биологически активную добавку (№9291-007-11734126-12); Инструкции по применению синбиотиков, утвержденные директором ВНИТИБП 07.10.2012.

Методические положения: по обоснованию режимов сублимационного высушивания пробиотических препаратов, утв. РАСХН 25.09.2012; по расчету технологических линий производства пробиотических и симбиотических препаратов, утв. РАСХН 22.10.2012; по применению компьютерной программы Microsoft

Office VISIO 2010 для построения технологических схем, утв. РАСХН 25.09.2012; по применению пакета Microsoft Office EXCEL 2010 для построения сложных технологических графиков (на примере процесса сублимационного высушивания препаратов-пробиотиков), утв. РАСХН 22.10.2012.

5. СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 5.1. Статьи в журналах, реферируемых ВАК.

1. Неминущая, JI.A. Использование статистических методов управления биотехнологическими процессами производства ветеринарных биопрепаратов / Л.А. Неминущая, О.В. Еремец, Т.А. Скотникова, Э.Ф. Токарик, АЛ. Самуйленко, В.М. Безгин, В.Е. Козлов, А.М. Ганяев // Ветеринарный врач. - 2010. - № 5. - С. 29-32.

2. Еремец, О.В. Проектный подход в обеспечении качества и безопасности лекарственных средств для животных / О.В. Еремец, М.А. Малышева, Л.А. Неминущая, Л.С. Люль-кова, Н.К. Еремец, Т.А. Скотникова // Ветеринария и кормление. - спецвыпуск. - 2011. -С. 60-61.

3. Самуйленко, А.Я. Нормативные и информационно-справочные документы по вопросам обеспечения безопасности и качества лекарственных средств для животных /

A.Я. Самуйленко, Т.А. Скотникова, Л.А. Неминущая, Н.К. Еремец, В.И. Еремец, Э.Ф. Токарик, И.В. Бобровская, Е.А. Шубина, О.В. Еремец // Известия Самарского научного центра РАН.-2011.-Т. 13, №5(3).-С. 181-184.

4. Канарская, З.А. Перспективные биотехнологии получения новых синбиотиков для сельскохозяйственных животных / З.А. Канарская, Л.А. Неминущая, Т.А. Скотникова, Е.И. Титова, О.В. Провоторова, Н.К. Еремец, И.В. Бобровская // Вестник Казанского технологического университета. - 2012. - №4. - С. 69-74.

5. Неминущая, Л.А. Новые биологически активные кормовые добавки: биотехнологические и химические аспекты производства, оценки качества и эффективность применения в птицеводстве / Л.А. Неминущая, Г.И. Воробьева, И.В. Бобровская, О.В. Провоторова,

B.И. Еремец // Бутлеровские сообщения. - 2012. - Т.29, №2. - С. 128-135.

6. Самуйленко, А.Я. Кормовые добавки на основе синбиотических комплексов - перспективы разработки и применения / А.Я. Самуйленко, Л.А. Неминущая, Е.И. Титова, Г.И. Воробьева, О.В. Провоторова, Е.О. Литвинова // Ветеринария и кормление. - 2012. - № 27. -С. 22-23.

7. Скотникова, Т.А. Проектный подход в создании инновационных биотехнологических препаратов / Т.А.Скотникова, Л.А. Неминущая, Н.К. Еремец, О.В. Провоторова, И.В. Бобровская, М.А. Малышева // Вестник Казанского технологического университета. -2012-№4.-С. 83-87.

5Л Публикации в других изданиях и материалы конференций

8. Еремец, Н.К. Проектный подход в системе целевых мероприятий по внедрению системы менеджмента качества на предприятиях АПК / Н.К. Еремец, Т.А. Скотникова, Л.А. Неминущая, Э.Ф. Токарик, И.В. Бобровская, О.В. Еремец, А.Я. Самуйленко // Научные исследования - основа модернизации сельскохозяйственного производства : мат. Междунар. научно-практич. конф. - Тюмень - 2011. - С. 27-29.

9. Еремец, Н.К. Обеспечение качества иммунологических препаратов для ветеринарии / Н.К. Еремец, АЛ. Самуйленко, Л.А. Неминущая, Т.А. Скотникова, Л.С. Люлькова, И.В. Бобровская, О.В. Провоторова, Е.А. Шубина // Фармацевтические и медицинские биотехнологии: мат. Междун. научно-практич. конф. - Москва. - 2012. - С. 292-293.

10. Провоторова, О.В. Оптимизация условий высушивания пре- и пробиотических препаратов / О.В. Провоторова // Пищевые технологии и биотехнология : мат. ХП Междун. конф. молодых ученых. - Казань. - 2012. - С.100.

11. Провоторова, O.B. Технологические о технические аспекты получения сухих форм пробиотиков и пребиотиков / О.В. Провоторова, JI.A. Неминущая, A.A. Нежута // Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине : мат. II конф. молодых ученых. - Покров. - 2012. - С. 149-153.

12. Провоторова, О.В. Технология получения синбиотических комплексов для ветеринарии в замкнутом цикле / О.В. Провоторова, JI.A. Неминущая, И.В. Бобровская, Н.К. Еремец // Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК : мат. Междун. научно-практич. конф. ВНИТИБП. - Щелково. -2012. - С. 376-382.

13. Сербис, Е.С. Разработка производства сублимированного препарата АВИЛАКТ -1 / Е.С. Сербис, О.В. Провоторова, A.A. Нежута, Л.А. Неминущая // Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК : мат. Междун. научно-практич. конф. ВНИТИБП. - Щелково. - 2012. - С. 382-386.

14. Нежута, A.A. Современные представления о технике и технологии сублимационной сушки биоматериалов / A.A. Нежута, Н.К. Еремец, И.В. Бобровская, О.В. Провоторова, Л.А. Неминущая // Экология и животный мир. - 2013 - № 2. - С. 47-50.

15. Бобровская, И.В. Биотехнологии новых пробиотиков и синбиотических комплексов для сельскохозяйственных животных и птицы / И.В. Бобровская, Л.А. Неминущая, Н.К. Еремец, О.В. Провоторова, C.B. Лихашерстова, В.И. Еремец, А.Я. Самуйленко // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве : мат. Международной научно-практической конференции. - Саратов. - 2013. - С. 8-10.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов

AM - автолизат мицелия гриба

АнтА - антагонистическая активность

асв - абсолютно сухое вещество

БАД - биологически активная добавка

БМ - биомасса гриба

ВЛГ- высший лечебный гриб

ДИ - доклинические исследования

ЕИП - европейский индекс продуктивности

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ЗР - задержка роста

ЗС - защитная среда

КБМ - концентрированная бактериальная масса

КЖ - культуральная жидкость

КОЕ - колониеобразующие единицы

КРС - крупный рогатый скот

ЛС - лекарственные средства

MC - молочная сыворотка

НБ - ньюкаслская болезнь

НД - нормативная документация

OB - остаточная влажность

ОМ - обезжиренное молоко

СТО - стандарт организации

ТУ - технические условия

GMP - Good Manufacturing Practice (надлежащая производственная практика) MRS - среда Манна-Рогоза-Шарпа

Подписано в печать 16.02.2013г.

Усл.пл. - 1.5 Заказ № 12524 Тираж: ЮОэкз.

Копицентр «Чертеж.ру» ИНН 7701723201 107023, г.Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Провоторова, Олеся Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ^ Современные особенности промышленного животноводст

1.2 Пробиотики, пребиотики исинбиотики.

1.3 Биотехнологические аспекты получения синбиотиков.

1.4 Факторы, влияющие на эффективность синбиотиков.

1.5 Технология изготовления про-и пребиотиков.

1.6 Оборудование - современные тенденции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Технология производства и оценка эффективности синбиотиков на основе бесклеточных пробиотиков метаболитного типа"

В настоящее время интенсивно развивается такое направление экобиотехно-логии, как разработка и использование в практике пробиотиков, пребиотиков и синбиотиков [57, 77, 88, 101, 155, 167, 172]. Эти лечебно-профилактические и ростостимулирующие экологически безопасные препараты способствуют снижению техногенной и микробиологической нагрузки на организм животного в условиях интенсивного современного промышленного животноводства и птицеводства [29, 92, 127, 142, 169, 173, 176].

В области пробиотических лечебных препаратов и пищевых продуктов активно разрабатываются бесклеточные пробиотики (метаболитного типа), которые по сравнению с клеточной формой более стабильны при хранении, не снижают свою биологическую активность при применении на фоне лечебного курса антибиотиков, не оказывают побочных действий на организм человека, в отличие от живых микроорганизмов, способных в ряде случаев вызывать и/или усиливать инфекционные и воспалительные процессы [11, 14, 33, 41, 68]. Культуральная жидкость (основа бесклеточной формы пробиоти-ка) - побочный продукт в традиционной технологии производства бактерийных препаратов или концентратов. Его утилизация, как отхода производства, приводит к значительным экономическим потерям и загрязнению окружающей среды. Поэтому разработка и производство бесклеточных пробиотиков -один из этапов создания безотходного производства бактерийных препаратов. Для агропромышленного комплекса России это направление является инновационным [15, 33, 50].

Синбиотики - научно обоснованный комплекс про- и пребиотиков [28, 39, 49, 72, 135, 136, 141] - при малых расходах (от 0,2 до 5 кг на тонну корма) физиологически активны, безопасны для животных, технологичны в производстве и применении [27, 83, 105, 114, 128]. Их можно производить по унифицированным малоотходным технологиям на гибких технологических линиях, тиражированных и размещенных в непосредственной близости к потребителю [9, 45, 86, 87]. Разработка таких технологий является одним из перспективных направлений развития биотехнологии для АПК РФ.

Во ВНИТИБП накоплен значительный опыт разработки состава и технологии производства синбиотических комплексов для птицеводства и коневодства [66, 86, 111]. Синбиотики необходимо разрабатывать с учетом специфики систем пищеварения, способов кормления и т.д. для каждого вида сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Цель исследований заключалась в разработке технологии производства бесклеточного пробиотика из лакто- и споро-образующих бактерий, пребиотика и биологически активной добавки из высшего лечебного гриба, создании на их основе новых синбиотиков и оценке их эффективности в АПК РФ (животноводстве и птицеводстве).

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- разработать аппаратурное оформление и методику расчета технологической линии изготовления препаратов;

- определить эффективные условия проведения распылительного высушивания биомассы гриба;

- изготовить опытные партии препаратов (бесклеточный пробиотик, пребиотик и БАД) и провести их доклинические исследования;

- разработать рецептуры синбиотиков и исследовать их эффективность для крупного рогатого скота (КРС) и птицы.

Определены параметры культивирования бактерий Ь. ркг^агит и состав питательной среды. Разработан режим сублимационного высушивания концентрированной бактериальной массы (КБМ) лактобактерий. Впервые для про- и пребиотиков разработана методика расчета технологической линии их производства.

Практическая значимость работы. Разработанная малоотходная технология производства новых препаратов апробирована и внедрена на опытном производстве ВНИТИБП. В доклинических исследованиях показана безопасность и эффективность опытных серий препаратов. С учетом требований Правил вМР разработана и утверждена директором ВНИТИБП нормативная документация: на препараты - технологические регламенты и проекты стандартов организации (СТО); на синбиотики - проекты инструкций по применению.

Разработаны и предложены для практического использования в животноводстве и птицеводстве новые синбиотики, применение которых способствует повышению продуктивности животных и птицы, обеспечению гарантии качества, биологической и экологической безопасности как самой продукции, так и процесса ее производства.

Результаты исследований положены в основу разработки четырех Методических положений, утвержденных Россельхозакадемией в установленном порядке: по обоснованию режимов сублимационного высушивания пробио-тических препаратов; по расчету технологических линий производства про-биотических и симбиотических препаратов; по применению компьютерной программы Microsoft Office VISIO 2010 для построения технологических схем; по применению пакета Microsoft Office EXCEL 2010 для построения сложных технологических графиков (на примере процесса сублимационного высушивания препаратов-пробиотиков).

Полученные экспериментальные данные использованы для обоснования разработанной во ВНИТИБП и одобренной Президиумом Россельхозакаде-мии (протокол №4 от 21.04.2011) «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации», а также в лекционном материале курсов повышения квалификации специалистов птицеводческих предприятий «Новые технологии и пути повышения эффективности производства мяса бройлеров» (ГНУ ВНИТИП Рос-сельхозакадемии, г.Сергиев Посад, 2012г.).

Основные положения работы, выносимые на защиту:

- технология производства бесклеточного пробиотика из Ь. р1ап1ашш и В. БиЫШБ, КБМ пробиотических бактерий, препаратов из высшего лечебного гриба (пребиотика и БАД);

- аппаратурное оформление технологической линии производства препаратов в малоотходном цикле;

- режимы сублимационного высушивания КБМ пробиотических бактерий и распылительного высушивания БАД;

- рецептуры синбиотиков на основе этих препаратов;

- эффективность синбиотиков для молодняка птицы и КРС.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обеспечение продовольственной и биологической безопасности страны является основной задачей АПК на современном этапе, что делает актуальными научные разработки, направленные на ее решение [77, 87, 138, 140].

В настоящее время организм человека и животных подвергается воздействию целого комплекса неблагоприятных факторов, влияющих на нормальное функционирование основных систем жизнедеятельности, среди которых влияние ухудшающейся экологической обстановки, увеличение количества стрессовых ситуаций, массовое бесконтрольное применение химиоте-рапевтических препаратов, в том числе и антибиотиков [51, 56, 74, 132, 141].

При профилактике болезней сельскохозяйственных животных и птицы необходимо учитывать :

- наличие комплекса инфекций в хозяйствах, на фоне которого борьба с отдельно взятой инфекцией становится неэффективной за счет снижения общего иммунного статуса организма животных [47];

- в условиях интенсивного промышленного ведения животноводства повышается роль болезней, обусловленных условно-патогенной микрофлорой и ассоциациями возбудителей [91, 92];

- большая концентрация животных создает благоприятные условия для быстрого перезаражения, при этом изменяется значение различных факторов передачи возбудителей от зараженных животных к восприимчивым [53, 73, 103, 174, 177, 181];

- неблагоприятные экологические факторы, недоброкачественные корма и несбалансированное кормление, плохое содержание животных приводят к резкому ухудшению качества продукции (мяса, молока, яиц) и несоответствию ее требованиям ФАО и ВОЗ [5, 6, 30, 73, 147, 149, 154, 155].

Интенсивный характер современных технологий выращивания сельскохозяйственных животных и птицы оказывает негативное влияние на микроэкологию желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), изменяя эволюционно сложившуюся в условиях свободного выгула структуру кишечного микробиотипа. Это служит одной из причин появления и распространения дисбак-териозов животных и птицы, стратегия и тактика терапии и профилактики которых с помощью только антибактериальных средств не всегда эффективна и безопасна.

Одним из современных подходов к решению проблемы является разработка, производство и применение новых экологически безопасных эффективных препаратов, способных обеспечить биологическую защиту животных [5,27, 90, 103, 158, 160-163].

Такие препараты должны обеспечивать:

- повышение физиологического и иммунного статуса организма животных;

- лечение и профилактику заболеваний молодняка и взрослых особей за счет защиты от патогенных и условно-патогенных возбудителей болезней ЖКТ;

- компенсацию в рационе кормления дефицита аминокислот, витаминов и микроэлементов, а также повышение степени усвоения кормов;

- токсико- и радиопротективного действие, снижающее влияние неблагоприятных экологических факторов (загрязнения окружающей среды нитратами, пестицидами, гербицидами, тяжелыми металлами и радионуклидами);

- повышение эффективности вакцинопрофилактики инфекций при ее использовании в комплексе оздоровительных мер;

- качество и безопасность продукции.

Это обусловило интенсивное развитие экобиотехнологий, в частности направление, связанное с разработкой и применением пробиотиков, пребиоти-ков и синбиотиков, как в здравоохранении, так и в ветеринарии [30, 46, 101, 107, 116, 123, 151-153, 159]. Такие лечебно-профилактические и ростости-мулирующие экологически чистые препараты физиологичны по своему действию, безвредны для животных, просты в наработке, дешевы, технологичны для группового применения, что особенно актуально для отечественного птицеводства, занимающего передовые позиции в АПК.

1.1. Современные особенности промышленного животноводства.

В промышленном производстве необходимо создавать такие условия содержания животных и птицы, чтобы обеспечить полную реализацию ее генетических возможностей. Как наиболее важные факторы, влияющие на эффективность отрасли, в настоящее время выделяют эпизоотическую ситуацию в хозяйстве, наличие и уровень стрессов, режимы кормления и поения.

Среди причин отхода животных и птицы, и в первую очередь молодняка, основное место занимают болезни, связанные с нарушением функций желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). На предприятиях с высокой концентрацией поголовья они являются основной причиной гибели молодняка. Сдвиги в количественном и качественном составе нормальной и условно-патогенной микрофлоры приводят к дисбактериозу, снижению усвояемости питательных веществ корма и, как следствие, к диарее и падежу [11, 42, 84, 116, 167].

Чаще всего этиологических факторов болезни несколько - ассоциация патогенов может быть представлена вирусами, бактериями, патогенными грибами, простейшими и другими паразитами в различных сочетаниях.

В большинстве случаев инфекционные болезни протекают в латентной и субклинической формах [11, 13]. Это явление приобрело массовый, эпизоотический характер и негативно влияет на течение ассоциированных инфекций, вызывает обострение разнообразных сопутствующих патологических процессов. Протекание заболевания в ассоциативной и смешанной формах затушевывает истинные причины болезни и усложняет эпизоотическую ситуацию.

В этом процессе также велика роль условно-патогенных микроорганизмов. К условно-патогенным относятся микроорганизмы, которые секретиру-ют суперантигены, постоянно присутствующие в условиях промышленнго содержания животных, ослабляют их иммунную систему, не вызывая при этом клинических признаков заболевания. Вследствие этого заболевания, вызываемые другими патогенами, протекают на фоне извращенного иммунного ответа и аутоаллергических реакций, что значительно осложняет их течение [78, 81, 84, 164-166]. Условно-патогенные микроорганизмы характеризуются многочисленностью, гетерогенностью популяций, участием в разных микробиоценозах. Гетерогенность выражена в устойчивости к антибиотикам, де-зинфектантам и физическим факторам, создаёт сложности при идентификации выделенных культур. Кроме того, популяции не только гетерогенны, но и изменчивы. В процессе проведения лечебно-профилактических мероприятий устойчивые варианты переходят в множественно устойчивые.

Нарушение микроэкологического равновесия кишечного биотопа под действием ряда экзогенных (антибиотики, вакцинация) и технологических факторов приводит не только к доминированию потенциально патогенных микробов. Ускоряются темпы изменчивости условно-патогенных микроорганизмов, усиливаются генетический обмен и скорость формирования клонов, несущих плазмиды лекарственной устойчивости и нередко включающих гены, детерминирующие адгезивные, цитотоксические и энтеротоксические свойства условно-патогенных бактерий.

Антибиотики (АБ) применяют в животноводстве и птицеводстве как для лечения и профилактики болезней (колибактериоза, респираторного мико-плазмоза, сальмонеллеза, диарреи ), так и в качестве стимуляторов роста (особенно в птицеводстве и свиноводстве). Терапевтические курсы АБ входят в технологию содержания бройлеров и свиней [1, 2, 166].

К кормовым антибиотикам относят препараты, при введении которых в рационы животных и птицы улучшается обмен веществ, повышается коэффициент использования кормов, активизируется резистентность организма.

В Европе АБ использовали в качестве стимуляторов (промоутеров) роста с 1950-х годов по 2006 год, когда кормовые АБ были запрещены. В связи с риском появления устойчивых штаммов бактерий в продуктах питания животного происхождения в странах Евросоюза стали вводить запреты на применение кормовых АБ. От использования АБ в лечебных целях отказаться в условиях промышленного животноводства и птицеводства невозможно, хотя их широкое использование также влияет на появление резистентных к ним возбудителей (в том числе и опасных для человека), особенно когда их применение становится результатом плохого менеджмента, несбалансированного кормления и низкого гигиенического статуса хозяйства.

В РФ в качестве кормовых (ростостимулирующих) препаратов разрешено использовать только антибиотики немедицинского назначения, не применяющиеся в ветеринарной практике как лечебные и профилактические средства. Наиболее часто применяемые кормовые АБ: Бацилихин (Россия), Био-вит-80 (Украина), Сал Карб (Бельгия), Флавомицин (Германия), Тилмовет премикс (Болгария) и др. Применение АБ в качестве стимуляторов роста в медицине неизвестно.

Важную роль в терапии основного заболевания и устранении факторов, вызвавших нарушение нормофлоры и ее функций, играют препараты, которые в настоящее время разделяют на 3 основные группы: пробиотики, пребиотики и синбиотики [30, 126, 127, 129, 150, 180-182].

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Провоторова, Олеся Владимировна

Результаты исследования эффективных условий распылительного высушивания биомассы гриба (п=3; Р=95%) опыта Параметры высушивания Потери, % Характеристика препарата

ТвХ5 °с ТцЫХ °с Мощн., КВТ Упод., л/ч Общий белок,% от асв (не менее 38) Остаточная влажность (ОВ), %

1 120 90-80 14 7 35 49,1 7,1

2 140 100-90 18 7 10 49,2 4,8

3 160 120-110 21,5 7 7 49,2 2,5

2.2.1.3. Аппаратурное оформление технологической линии изготовления препаратов в малоотходном цикле. Аппаратурное оформление технологической линии получения препаратов в малоотходном цикле включало разработку технологической схемы основных стадий процесса изготовления препаратов (рис. 7,11), подбор и характеристику необходимого оборудования, создание аппаратурной схемы изготовления препаратов (рис. 12,13).

Проделанная в этом плане работы послужила основанием для разработки методики расчета технологической линии производства пробиотических и симбиотических препаратов (ПиСП).

При разработке методики нами использованы инструкции по изготовлению и контролю биологических препаратов, разработки ВНИТИБП, опыт производства пробиотических и симбиотических препаратов (ПиСП) в условиях опытного производства института, а также опыт создания методик расчетов технологических линий в смежных отраслях промышленности.

Методика расчета технологической линии состоит из следующих разделов:

- выбор схемы технологического процесса производства препарата и ее обоснование;

- расчет материального потока основного процесса производства;

- выбор и расчет количества основного технологического оборудования.

Выбор схемы процесса производства относится не только к области технологии: из возможных вариантов нужно выбрать такую схему, которая наряду с высокими качественными показателями продукции обеспечивала бы наибольший экономический эффект. Экономическими критериями выбора варианта технологической схемы должны быть: сокращение длительности производственного цикла, уменьшение расхода сырья и энергии на единицу продукции, снижение технологических потерь и увеличение выхода продукции, обеспечение высокого качества готовой продукции, повышение производительности труда, снижение себестоимости продукции.

Схема процесса производства препарата должна быть оптимальной, учитывать современные достижения науки и опыт передовых предприятий.

Компоненты ЗС, вода

25 Г

Бесклеточный пробиотик контроль и склад готовой продукци

Посевная серия тй контроль т склад готовой продукции

Посевная серия

В.5иЫ на контроль и склад готовой продукции

Рис. 12. Аппаратурная схема изготовления бесклеточного пробиотика.

I - термостат; 2, 12 - биореактор для культивирования бактерий; 3,13 - фильтр грубой очистки; 4, 14 - установка для ультрафильтрации; 5, 10, 17 - емкости для смешивания; 6, 15, 18 - установка для фасования; 7, 19 - низкотемпературный холодильник; 8, 20 - сублимационная установка; 9,16, 21 -устройство для этикетирования;

II - шуттель-аппарат; 22 - емкость для изготовления питательной среды (ПС); 23 - емкость для изготовления ЗС; 24, 25 - парогенератор.

Пребиотик на конроль И склад готовой продукции

БАД

На контроль И склад Готовой продукции

Рис. 13. Аппаратурная схема производства пребиотика и БАД из гриба Б. ЗатЬистит 1 - термостат с качалкой; 2 — биореактор для культивирования гриба и автолиза биомассы; 3 — нутч-фильтр; 4 - установка для ультрафильтрации автолизата; 5,8 - устройство для фасования и укупоривания продукта; 6,9 - устройство для этикетирования продукта; 7 - распылительная сушилка; 10 - емкость для изготовления питательной среды; 11 - парогенератор.

Основу деятельности каждого предприятия составляет производственный процесс - процесс воспроизводства материальных благ и производственных отношений, производственный процесс является основой действий, в результате которых исходные материалы превращаются в готовую продукцию, соответствующую своему назначению.

В каждый производственный процесс входят основные и вспомогательные технологические процессы. Технологические процессы, обеспечивающие превращение сырья и материалов в готовую продукцию, называются основными.

Вспомогательные технологические процессы обеспечивают изготовление продуктов (полупродуктов), используемых для обслуживания основного производства, например, подготовка воды, воздуха и так далее.

Технологические процессы различаются по характеру изготавливаемой продукции, используемым материалам, применяемым методам и способам производства, организационному построению и другим признакам. Но при всем этом они имеют и ряд признаков, позволяющих объединить различные процессы в группы.

Общепринято технологические процессы разделять на механические, физические, химические, биологические и комбинированные.

При механических и физических процессах изменяются только внешний вид и физические свойства материала. Химические и биологические процессы приводят к более глубоким превращениям материала, вызывая изменение его первоначальных свойств. Комбинированные процессы представляют собой сочетание указанных процессов и являются наиболее распространенными в практике.

Технология промышленного производства биопрепаратов представляет собой комплекс взаимосвязанных физических, химических, биофизических, биохимических, физико-химических процессов. Все эти процессы протекают в большом числе разнотипного оборудования, связанного между собой материальными, энергетическими потоками и образуют технологическую линию. На технологической линии осуществляются технологические процессы, которые можно разделить на стадии.

Промышленное производство ПиСП состоит из следующих стадий:

- приготовление посевного материала;

- культивирование микроорганизмов;

- концентрирование;

- ресуспендирование;

- фасовка (розлив) препарата;

- глубокое замораживание;

- сублимационное высушивание препарата;

- укупорка и закатка флаконов с препаратом;

- этикетировка;

- контроль на стадиях производства и готового препарата;

- упаковка готовой продукции;

- хранение препарата.

К вспомогательным технологическим стадиям относятся:

- очистка и стерилизация воздуха и других газов;

- водоподготовка;

- подготовка и стерилизация посуды и оборудования;

- очистка и стерилизация жидких вспомогательных ингредиентов.

Технологический процесс изображается в виде функциональной блоксхемы производства препарата.

Функциональная схема показывает технологическую связь между основными стадиями данного процесса производства, каждая из которых состоит из основных технологических операций. Функциональная схема дает обобщенное представление о процессе производства в целом.

Для систематизации материала дается технологическая схема процесса производства по стадиям от получения посевного материала /биологического сырья/до выпуска готового препарата.

После разработки технологической схемы производства препарата, разрабатывается аппаратурно-технологическая схема промышленного производства. Для разработки аппаратурно-технологической схемы производства биопрепарата надо знать количественное значение по конечному продукту. По этой цифре подбирается все основное и вспомогательное оборудование и количество материалов и реагентов, которое необходимо для технологического процесса.

Аппаратурно-технологическая схема - графическое изображение процесса, в котором каждый элемент процесса /аппараты и машины/ представлен в виде условного общепринятого изображения, а технологические связи отображаются направленными линиями со стрелками, изображений выбирается, по возможности, малым, чтобы схема имела легко обозримый вид.

К схеме дается подробное описание стадий технологического процесса изготовления ПиСП. Процессы производства излагаются последовательно по стадиям и операциям с указанием технологических параметров р, т, выход) и краткой характеристикой технологического оборудования.

Материальный поток - последовательное перемещение сырья, материалов и полуфабрикатов по стадиям и операциям технологического процесса, обеспечивающее целенаправленное функционирование технологической линии.

Расчет материального потока производства дается на серию препарата с указанием производственных потерь на каждой стадии и операции технологического процесса.

За серию принимают количество препарата, выработанное из культу-ральной жидкости, полученной за один цикл культивирования микроорганизмов в одном биореакторе.

Для проведения расчета материального потока устанавливаются еле-дующие исходные данные: объем биореактора (Уб) м ; коэффициент заполнения (К3); оптическая концентрация микробных клеток в культуральной жидкости по (ОК млрд/мл); вводимые добавки (08) л, %; потери полуфабрикатов по стадиям (Пп) л, %; выход полуфабрикатов по стадиям (В) л; объем вакцины в одном флаконе или ампуле (Урасф.) л ; количество доз в одном флаконе или ампуле (а) доз.

Технологический расчет линии следует начинать с расчета основных показателей: объема питательной среды и добавок, объема инокулята, объема и выхода культуральной жидкости.

Выбор схемы технологического процесса производства ПиСП в значительной степени предопределяет подбор определенных видов основного технологического оборудования.

Выбор основного технологического оборудования проводится на основании его технических характеристик, технологических параметров и требований, предъявляемых к каждой стадии производства препаратов.

Технологическая линия комплектуется оборудованием, выпускаемым серийно предприятиями России, зарубежными фирмами и разрабатываемым с учетом производительности, эксплуатационных характеристик и требований производства.

Технико-экономическими критериями выбора оборудования являются:

- техническая и экономическая целесообразность использования оборудования для данной технологической операции;

- производительность труда рабочих, обслуживающих выбранное оборудование;

- условия труда с точки зрения удобства обслуживания, техники безопасности, санитарных условий;

- межремонтный период, удельные расходы топлива, электроэнергии, пара, холода;

- уровень механизации процесса;

- степень использования данного оборудования в поточной линии; обеспечение снижения производственных потерь материалов и готовой продукции;

- возможность автоматического контроля и регулирования процесса, осуществляемого на данном оборудовании.

В технологической линии выделяется ведущее технологическое оборудование. Ведущим оборудованием принято считать аппарат, производительность которого определяет выработку всей технологической линии. Таким оборудованием в технологической линии производства ПиСП является аппарат для производственного культивирования микроорганизмов - биореактор.

Для проведения расчета количества основного технологического оборудования устанавливаются исходные данные: з

2) Объем (V, м ) и коэффициент заполнения (К3) для емкостей; л

3) Производительность машин и установок ("^ЛО м /час; фл/час;

4) Время занятости оборудования (Т), час;

5) Фонд рабочего времени в году (Ф), час.

Для производства с прерывным процессом годовой (расчетный) фонд времени работы оборудования равен календарному фонду времени за вычетом выходных и праздничных дней и времени на капитальный и планово-предупредительный ремонт. Фонд времени исчисляется в часах, исходя из трехсменного режима работы и установленной продолжительности смен с учетом сокращения рабочего времени в предпраздничные дни и пятидневной рабочей недели.

Расчет начинают с определения количества циклов культивирования, необходимого для выполнения годового (планового) задания по выпуску препарата.

По результатам, изложенным в разделе 2.2.1, в соответствии с требованиями разработанного во ВНИТИБП ГОСТ Р 54763-2011 («Средства лекарственные для ветеринарии. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, согласования и утверждения») разработаны технологические регламенты изготовления препаратов.

2.2.2. Характеристика состава и показатели качества препаратов.

На опытном производстве (фото 1-8) изготовлены опытные серии препаратов, исследован их состав, определены показатели качества и их нормируемые значения.

Фото 1

П-201

Фото 5.

2.2.2.1. Бесклеточный пробиотик.

В механизме действия пробиотических микроорганизмов большое значение имеет подавление роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Наличие в одном препарате метаболитов кислотообразующих бактерий нормальной микрофлоры (Lactobacillus plantarum) и спорообразующих бактерий (Bacillus subtilis) позволяет сочетать механизмы действия и тех, и других.

В опытах in vitro определена биологическая (антагонистическая) активность (АнтА) препарата в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ и в отношении микроорганизмов, выделенных в хозяйстве от больных послеродовыми эндометритами коров (п=10) (рис. 14).

Полученные результаты свидетельствуют, что:

- препарат обладает выраженным антагонизмом в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ;

- большинство штаммов микроорганизмов, выделенных от больных послеродовыми эндометритами коров, чувствительны к бесклеточному пробиотическому препарату. зо

26,3

Рис. 14. Антагонистическая активность беклеточного пробиотика в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ и микроорганизмов, выделенных хозяйстве от больных послеродовыми эндометритами коров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Провоторова, Олеся Владимировна, Щёлково

1. Алексеев, И.А. Качество мяса и субпродуктов молодняка крупного рогатого скота при применении пробиотической добавки к корму бацилл / И.А. Алексеев, С.Г. Петрова // Ветеринарный врач. № 5. - 2012. - С. 63-66.

2. Андреева, A.B. Иммунобиологические изменения в организме телят под влиянием композиций фитопробиотиков и полисолей микроэлементов / A.B. Андреева, О.Н. Николаева // Достижения науки и техника в АПК. №4. -2008.-С. 36-39.

3. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П.Ашмарин, A.A. Воробьев // JL: Ленмедгиз, 1962. 180 с.

4. Байрамашвили, Д.И. Биотехнологические способы получения фармацевтических препаратов : автореф. дис. . д-ра хим. наук / Д.И. Байрамашвили -М., 2007.- 49с.

5. Бакулина, Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии / Л.Ф. Бакулина, И.В. Тимофеев, Н.Г. Перминова и др. // Биотехнология. №2. - 2001. - С. 48-56.

6. Безгин, В.М. Основы промышленной иммунологии / В.М. Безгин, Быкова H.H., Козлов В.Е. и др. // Курск, изд-во КГСХА, 2011. 512с.

7. Белявская, В.А. Разработка технологии получения таблеточной формы препарата субалин / В.А. Белявская, Н.Г. Ромашева, И.Б. Сорокулова и др. // Биотехнология. № 2. - 2001. - С. 64-69.

8. Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков // М: Колос, Химия, 2004. 295 с.

9. Богданов, В.В. Биорегуляторы новой группы, выделенные из среды культивирования гриба Fusarium sambucinum / В.В. Богданов, Э.Ф. Фаткулина,

10. А.И. Григораш // Грибные биотехнологии. Раздел 17 : Тезисы докладов 3-го съезда микологов России. -М., 2012г. С. 369.

11. Бондаренко, В.М. Метаболитные пробиотики: механизмы терапевтического эффекта при микроэкологических нарушениях / В.М. Бондаренко // Consilium Medicum. №7 - 2005. - С. 437-443.

12. Булатов, A.C. Изыскание штамма микроба-антагониста в отношении сальмонелл / A.C. Булатов // Ветеринария. № 5. - 2003. - С. 26-29.

13. Бурнышева, Н.В. Пробиотики и сохранность телят в Пермском Крае / Н.В. Бурнышева // Достижения науки и техника в АПК. №3. - 2006. - С. 4042.

14. Вахитов, Т. Я. Перспективы создания пробиотических препаратов на основе «чувства кворума» у бактерий / Т.Я. Вахитов, J1.I-I. Петров, В.М. Бондаренко и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. № 3. -2006.-С. 105-113.

15. Волков, М.Ю. Метаболиты Bacillus Subtilis как новые перспективные пробиотические препараты / М.Ю. Волков, Е.И. Ткаченко, Е.В. Воробейчи-ков и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. № 2. -2007. - С. 75-80.

16. Гаврилова, H.H. Создание ассоциации из молочнокислых и пропионово-кислых бактерий, активной в отношении возбудителя колибактериоза и сальмонеллеза / H.H. Гаврилова, И.А. Ратникова, К. Баякышова и др. // Биотехнология. № 2. - 2005. - С.26-32.

17. Геркели М.Н. Организация двухстадийной распылительной сушки термолабильных материалов в щадящем температурном режиме / М.Н. Геркели // Биотехнология: вода и пищевые продукты : мат. научного и практич. конгресса.- М., 2008.- С.ЗЗ.

18. Глушанова, H.A. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лак-тобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro // H.A. Глушанова, Б.А. Шендеров // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. № 2. -2005. - С. 56-61.

19. ГОСТ Р 52249-2009. Правила производства и контроля лекарственных средств / М.: Стандартинформ, 2010.-139с.

20. ГОСТ Р 54065-2010. Средства лекарственные для животных пробиотиче-ские. Методы определения пробиотических микроорганизмов / М.: Стандар-тинформ, 2010. -32с.

21. ГОСТ Р 54763-2011 «Средства лекарственные для ветеринарии. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, согласования и утверждения».

22. ГОСТ Р ИСО 9001-2008. Система менеджмента качества. Требования / М.: Стандартинформ, 2008. 37с.

23. Государственная Фармакопея РФ. XII издание, часть 1. 2007. ст.14 «Ио-нометрия», п.З «Потенциометрическое определение pH».

24. Григораш, А.И. БАД «Флоравит Э» на основе экстрактов гриба Fusarium sambucinum эффективный иммуномодулятор и адаптоген / А.И. Григораш, J1.B. Погорельская, H.A. Бредихина и др. // http://www.floravit.ru/publications2006 immunomodulator.html - 2006.

25. Григораш, А.И. Биосинергетики биорегуляторы метаболизма широкого действия / А.И. Григораш, Г.И. Воробьева, А.Е. Кудрявцев и др. // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. - 2009. - №2. - С. 171.

26. Грязнева, Т.Н. Разработка глубинного способа культивирования бацилл -компонентов пробиотика Биод-5 / Т.Н. Грязнева // Биотехнология. № 5. — 2004.-С. 67-68.

27. Данилевская, Н.В. Лактобифадол для стимуляции продуктивности дойных коров / Н.В. Данилевская, В.В. Субботин, O.A. Вашурин и др. // Ветеринария. №2. - 2003. - С. 50-54.

28. Данилевская, Н.В. Фармакологические аспекты применения пробиотиков

29. H.B. Данилевская II Ветеринария. № 11. - 2005. - С. 6-10.

30. Дебабов, Д.В. Устойчивость к антибиотикам: происхождение, механизмы, подходы к преодолению / Д.В. Дебабов // Биотехнология. № 4. - 2012. -С.7-17.

31. Егорова, В.Н. Распылительная сушка основ и компонентов питательных сред / В.Н.Егорова, А.А.Нежута, А.С.Фоменко и др. // Научн. основы технологии промышленного производства вет. биол. препаратов : Сб. тезисов II Всесоюзн. Конф. М., 1981. - СЛ17-118.

32. Еникеев, Р.Т. Пробиотическая терапия препаратом «Ветом 1,1» для ранней терапии желудочно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота / Р.Т. Еникеев, Р.Б. Хазипов, Ф.Ф. Яхин // Достижения науки и техника в АПК. №4. - 2007. - С. 48.

33. Закирова, C.B. Влияние Бактоцеллолактина на бактериальную и цитологическую картину половых органов коров / C.B. Закирова, Е.В. Паньков, A.A. Ивановский // Достижения науки и техника в АПК. №9. - 2007. - С. 28-29.

34. Зорина, В.В. Модуляция клеток иммунной системы лактобактериями / В.В. Зорина, Т.Н. Николаева, В.М. Бондаренко // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. № 6. - 2004. - С. 57-60.

35. Ивановский, A.A. Применение Руменофита при желудочно-кишечных заболеваниях телят / A.A. Ивановский, О.В. Белорыбкина // Достижения наукии техника в АПК. -№11.- 2006. С. 39-40.

36. Ижик, А.В. Изоляция гликолипидов из Lactococcus lactis subsp. cremoris БИМ В-493-Д и Lactobacillus plantarum БИМ В-495-Д / А.В. Ижик, Г.И. Новик, М. Пасьцяк и др. // Биотехнология. № 1. - 2012. - С. 31-42.

37. Канардов, П.П. Экспериментальные данные изучения токсических свойств Биоспорина-В на лабораторных моделях / П.П.Канардов, Д.А. Дев-ришов // Ветеринарная медицина №1. - 2001. - С. 15-16.

38. Катлинский, А.В. Курс лекций по биотехнологии / А.В. Катлинский, 10.0. Сазыкин, С.Н. Орехов и др. Москва, 2005. - 150с.

39. Кондрахип, И.П. Влияние пробиотика лактин-К на липидно-белковый обмен и яйценоскость кур / И.П. Кондрахин, Е.В. Репко // Ветеринария. № 8.-2012.-С. 42-44.

40. Корнеева, О.С. Биотрансформация сахарозы в изомальтозу природный заменитель сахара с пребиотическими свойствами / О.С. Корнеева, O.IO. Божко, Г.П. Шуваева // Биотехнология. - № 2. - 2008. - С. 46-50.

41. Красочко, П.А. Влияние бесклеточного пробиотического препарата «Ба-цинил» на иммунную систему телят при терапии респираторных заболеваний / П.А. Красочко, И.А. Красочко, Ю.В. Санжаровская // Ветеринарный врач. -№4.-2011.-С. 11-14.

42. Кузин, А.И. Пробиотик Спорметрин для профилактики и лечения при эндометрите коров / А.И. Кузин, Г.В. Борисова, Д.В. Губанов // Ветеринария. -№ 11.-2002.-С. 28-29.

43. Лаптев, Г.Ю. T-RFLP новый биотехнологический метод для оценки микрофлоры рубца крупного рогатого скота / Г.Ю. Лаптев, Л.А. Кряжевских // Актуальные проблемы биологии в животноводстве : мат. V Междун. науч. конф. - Боровск, 2010. - С. 287-288.

44. Лоенко, H.H. Экстракт биомассы гриба Fusarium sambucinum в кормлении самок соболей / Н.Н.Лоенко, И.Е.Чернова, К.В. Харламов и др. // Актуальные проблемы биологии в животноводстве : мат. V Междун. науч. конф.- Боровск, 2010.-С.290-291.

45. Лыкова, Е.А. Антибактериальная резистентность штаммов, входящих в состав препаратов пробиотиков / Е.А. Лыкова // Журнал микробиологии,эпидемиологии и иммунологии. № 2. - 2000. - С. 63-66.

46. Малик, Н.И. Ветеринарные пробиотические препараты / Н.И. Малик // Ветеринария. № 7. - 2001. - С. 46-51.

47. Методика проведения научных и производственных исследований по кормлению сельскохозяйственной птицы. Рекомендации / Под общей редакцией Фисинипа В.И. и Имангулова Ш.А. // Сергиев Посад: ВНИТИП, 2004.44 с.

48. Методические рекомендации по физико-химическому и биологическому контролю белковых гидролизатов для бактериологических питательных сред / под ред. Простякова А.П. / М., 1983.-27с.

49. Методические указания по определению уровня антител к вирусу ныо-каслской болезни в РТГА, утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 23.06.97 г., № 13-7-2/988.

50. Нежута A.A. Научное обоснование и методика разработки и совершенствования промышленной технологии сублимационного высушивания биопрепаратов : автореф. дис. . д-ра биологических наук / А.А.Нежута М., 2003. -44с.

51. Нежута, A.A. Технические и технологические аспекты сублимационной сушки химфармпрепаратов / A.A. Нежута, Е.С. Сербис, Ю.В. Зудилип // Медицинский бизнес. № 2 (215). - 2012. - С. 24-25.

52. Неминущая, JI.А. Синбиотики белковый кормовой продукт 21 века / Л.А.Неминущая, Г.И.Воробьева, Э.Ф.Токарик и др. // Научные основы производства ветеринарных биол. препаратов : мат. Междун. научно-практич. конф. - Щелково, 2009.- С. 489-497.

53. Неминущая, Л.А. Технология производства и обеспечение качества син-биотиков ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ, эффективность их применения в птицеводстве : автореф. дис. . д-ра биологических наук/ Л.А. Неминущая Щелково, 2011. -52с.

54. Николаева, Т.Н. Иммуномодулирующий эффект белковых фракций, выделенных из бифидобактерий / Т.Н. Николаева, В.М. Бондаренко, А.И. Николаева и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. № 2. - 2004. - С. 60-64.

55. Новик, Г.И. Получение нового продукта Бифибак и изучение его влияния на продукцию цитокипов / Г.И. Новик, A.A. Самарцев, Е.Ф. Конопля и др. // Биотехнология. № 1. - 2008. - С.64-71.

56. Ноздрин, Г.А. Профилактическая и ростостимулирующая эффективность жидких форм ветомов при применении их новорожденным телятам / Г.А. Ноздрин, А.Г. Ноздрин, А.Б. Иванова и др. // Достижения науки и техники АПК. -№ 10.-2010.-С. 60-62.

57. Овод, A.C. Профилактика диарей новорожденных телят пробиотиками / A.C. Овод, В.В. Мосейчук // Ветеринария. №.2. - 2007. - С. 6-7.

58. Овчинников, A.A. Изменения кишечной микрофлоры телят молочного периода выращивания при использовании в рационе сорбента и пробиотика / A.A. Овчинников, Л.В. Иванова, Е.В. Иванов // Ветеринарный врач. № 1. -2012.-С. 37-39.

59. Огнева, О.А. Влияние биологически активной добавки «Кормикс-СО» на здоровье и продуктивность животных / О.А. Огнева, П.Г. Нестеренко // Актуальные проблемы биологии в животноводстве : мат. V Междун. науч. конф. Боровск, 2010. - С. 204-205.

60. Панин, А.Н. Биотехнологические аспекты изготовления сухих пробиоти-ческих препаратов / А.Н.Панин, Н.И.Малик, Ч.К. Авылов // Науч. основы пр-ва вет.биол.препаратов : сб. науч. тр.- Щелково, 2000.-С. 343-345.

61. Панин, А.Н. Проблема обеспечения продовольственной безопасности Российской Федерации и безопасности продовольствия / А.Н.Панин, В.А. Мельников//Ветеринария.-2011.-№ 1 С.12-15.

62. Панин, А.Н. Современный подход к регуляции безопасности пробиотиков / А.Н. Панин, Н.А. Малик, О.С. Илаев, Е.В. и др. // Ветеринария. № 1. -2011.-С. 41-44.

63. Пировано, Ф. Пробиотики: производственно-технологические аспекты / Ф.Пировано // Пробиотики и пробиотические продукты : тез. докл. Всерос. конф,- М., 1999.-С. 38.

64. Попов, А.Ю. Современный подход к аппаратурно-технологическому оформлению ферментационных процессов в биотехнологии / А.Ю.Попов // Биотехнология: вода и пищевые продукты: мат. научного и практич. конгресса.- М., 2008.- С.241-242.

65. Похиленко, В. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность / В. Похиленко, В. Перелыгин // Химическая и биологическая безопасность. № 2-3. - 2007. - С. 20-41.

66. Римарева, J1.B. Перспективные биотехнологии в производстве биокорректоров пищи, БАД и кормов / J1.B. Римарева, Н.С. Погоржельская // Биотехнология: вода и пищевые продукты: мат. научного и практич. конгресса.- М., 2008.- С.367-268.

67. Самуйленко, А.Я. Задачи биотехнологии в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации / А.Я.Самуйленко, А.А.Раевский, Н.А.Бондарева и др. // Ветеринария и кормление. 2011.- №2.- С.22-29.

68. Самуйленко, А.Я. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов / А.Я.Самуйленко, Е.А.Рубан М: Россельхозакадемия.-Т 1.- Т 2.- M.: РАСХН, 2000. - 781 с.

69. Сафронова, В.И. Методы консервации коллекционных культур микроорганизмов. Методические рекомендации / В.И.Сафронова, Ю.С.Оследкин, О.В. Свиридова и др. // С.-Петербрг, Пушкин, 2007.-С.6-9

70. Сидоров, М.А. Нормальная микрофлора животных и ее коррекция про-биотиками / М.А. Сидоров, В.В. Субботин, Н.В. Данилевская // Ветеринария.- № 11.-2000.-С. 17-22.

71. Смоленский В.И. Обеспечение качества производства и применения лекарственных средств в промышленном птицеводстве. ЛИ Межд. Ветер. Конгресс по птицеводству.- М.- 2007.- С.28-31.

72. Смолянинов, Ю.И. Влияние экспериментальной пробиотической добавкина молочную продуктивность коров / Ю.И. Смолянинов, Е.М. Сутулов, Д.С. Белый // Достижения науки и техника в АПК. -№11.- 2008. С. 40-44.

73. Современные способы сушки / Подготовлено по материалам книги «Инновационные технологии и оборудование фармацевтического производства» //Медицинский бизнес. № 2 (215). - 2012. - С. 26-30.

74. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. Биргера М.О. // М.: Медицина, 1982.- 462с.

75. Стегний, Б.Т. Перспективы использования пробиотиков в животноводстве / Б.Т. Стегний, С.А. Гужвинская // Ветеринария. № 11.- 2005. - С. 10-11.

76. Субботин, В.В. Опыт разработки и применения пробиотика ветеринарного назначения жвачным животным / В.В. Субботин, Н.В. Данилевская // Руководство. М.,2010. - 43с.

77. Субботин, В.В. Профилактика желудочно-кишечных болезней новорожденных животных с симптомокомплексом диареи / В. В. Субботин, М.А. Сидоров // Ветеринария № 4. - 2001. - С. 3-7.

78. Сутулов, Е.М. Пробиотические кормовые добавки в рационе телят / Е.М. Сутулов, К.В. Киреева, В.А. Мартынов // Достижения науки и техники АПК. -№06.-2010.-С. 54-55.

79. Сушкова, В.И. Безотходная конверсия растительного сырья в биологически активные вещества / В.И. Сушкова, Г.И. Воробьева М.: ДеЛи принт, 2008.-216с.

80. Тараканов, Б.В. механизмы действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных / Б.В. Тараканов // Ветеринария. -№ 1.-2001.-С. 47-54.

81. Тараканов, Б.В. Пробиотический потенциал Lactobacillus Casei Subsp. Pseudoplantarum при выращивании телят / Б.В. Тараканов, Т.А. Николичева // Ветеринария. № 3. - 2011. - С. 46-49.

82. Татаринов, С.С. Применение штаммов Bacillus Subtilis в профилактике послеродовых осложнений коров австрийской селекции в условиях Якутии / С.С. Татаринов, М.П. Неустроев, Н.П. Тарабукипа //Достижения науки и техники АПК. № 05. - 2011. - С. 66-68.

83. Татарчук, О.П. Характеристика пробиотического штамма Bacillus Subtilis CBS 117162 и кормовой добавки на его основе / О.П. Татарчук //Ветеринария. №4. - 2012. - С. 20-22.

84. Теоретические и практические основы технологии сублимационного высушивания биопрепаратов / Нежута A.A., Токарик Э.Ф., Самуйленко А.Я. и др. -Курск: Изд-во КГСХА, 2002.-239с.

85. Ш.Титова, Е.И. Положительные аспекты применения пробиотиков в коневодстве / Е.И. Титова // Естественные и технические науки. № 6(56). - 2011. -С. 93-95.

86. Тихонов И. В. Промышленное культивирование микроорганизмов : учебно-методическое пособие по биотехнологии / под ред. Тихонова И.В.-М.: МГАВМиБ, 2000, 60 с.

87. Тихонов И.В. Технология приготовления стабилизированной рабочей культуры в качестве посевного материала для глубинного культивирования / Тихонов И.В., Овсянников Ю.С., Романов В.Е // Ветеринарная медицина.-2010.-№3-4.-С.23-25.

88. Токаев, Э.С. Свойства единой синбиотической системы бифидобактерий с пробиотиком Fibregum / Э.С. Токаев, В.И. Ганина, A.C. Багдасарян, Ю.Г. Григорова, С.И. Перминов, Т.Ф. Вустина, И.Н. Мозговая, В.В. Макаров // Биотехнологя. № 6. - 2006. - С. 51-62.

89. Трокоз, В.А. Перспективы применения биологически активных веществ из куколок дубового шелкопряда в животноводстве / В.А. Трокоз // Актуальные проблемы биологии в животноводстве : мат. V Междун. науч. конф. -Боровск, 2010. С. 229-230.

90. Урбах, В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях / Урбах В.Ю. // М.: Медицина, 1975. 242 с.

91. Федеральный закон РФ от 12 апреля 2010г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств. Статья 12.- С.6-7.

92. Федюкина, Г.Н. Оценка свойств сухих бактерийных препаратов по данным метода ЯМР-релаксации / Г.Н. Федюкина, В.Я. Волков // Биотехнология. -№ 2. -2009. -С. 73-82.

93. Хартман, К. Планирование эксперимента в исследовании технологических процессов. / М: Мир, 1977. 552с.

94. Хорошилова, Ы.В. Иммуномодулирующее и лечебное действие пробио-тиков / Н.В. Хорошилова // Иммунология. № 6. - 2003. - С.352-356.

95. Шабанова, Н.А. Влияние метаболитов Lactobacillus Fermentum на ультраструктуру патогенных эшерихий / Н.А. Шабанова, В.В. Гостева, Н.В. Кли-цунова, В.М. Бондаренко // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. № 2. - 2009. - С. 3-6.

96. Шамилова, Т.А. Состояние кишечного микробиоценоза поросят при ми-котоксикозе на фоне применения пробиотика / Т.А. Шамилова, JI.E. Матро-сова, Ф.Г. Ахметов / Ветеринарный врач. № 1. - 2011. - С. 4-6.

97. Шолохова Е.И. Биофармацевтические аспекты пробиотиков / Шолохова Е.И. // Пробиотические микроорганизмы современное состояние вопроса и перспективы использования: мат. Междун. научно-практич. конф.- М.,2002.-С.64-65.

98. Щербаков, П.Н. Применение фитобациллина при отъеме поросят / П.Н. Щербаков // Ветеринария. № 10. - 2001. - С. 41.

99. Affitives, antibiotics and probiotics: Choices for the future // Poultry intern.-Vol. 35, №4.- 1996.-P. 34-39.

100. Bansal, S. Probiotics in health and disease / S.Bansal // J. Assoc. physicians.-2001.-№ 7.- P.735-741.

101. Barbosa, T.M. Screening for bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract / T.M. Barbosa et al. // Appl. Environ. Microbiol.- 2005.- Vol.71.-P.968-978.

102. Berg, R.D. Probiotics, prebiotics, or conbiotics / R.D. Berg // Trends Microbiol. 1998.-Vol. 6. - P.89-92.

103. Collins, M.D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut / M.D. Collins // Am J. Clin. Nutr.-1999.- № 9.- P.1052-1057.

104. Crary, R.S. Effects of probiotics and prebiotics on blood lipids / R.S.Craiy, T. Christine, M.Williams // British Jornal of Nutrition.-1998.-Vol. 7.- P. 225-230.

105. De Valdez, G.F. Effect of drying medium on residual moisture content and lability of freeze dried lactic acid bacteria / G.F.De Valdez, G.S.De Jion, A.P. De Rmz Holgado et al. //Appl. Environ. Microbiol.- 1985.- № 2,- P. 413-415.

106. Earll, A. M. Ecology and genomics of Bacillus Subtilis / A. M.Earll, R.Losick, R. Ко Iter // Trends in Microbiology.-2006.-Vol. 16, № 6.-P. 269-275.

107. EFSA Technical guidance on the assessment of the toxigenic potential of Baccillus species used in animal nutrition // EFSA Journal. 2011. № 9 (11 ):2245. 13p.

108. Folwaczny, C. Probiotics for prevention of ulcerative colitis recurrence: alternative medicine added to standard treatment / C.Folwaczny // Gastroenterol.-2000.-Vol.38.-P.547-550.

109. Fuller, R. Probiotics and prebiotics: microtiora management for improved gut health / R.Fuller, G.R. Gibson // Clin. Microbiol. Infect.-1998.-№4.- P. 477-480.

110. Fuller, R. Probiotics in man and animals / R.Fuller // J. Appl. Bact.- 1989.-№ 66.- P.365-378.

111. Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria / Ed. Gasson M.J. and de Vos W.M. Blackie Academic and Professional, Glasgow, 1996. - P.211-251.

112. Gibson, G.R. Aspects of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use / G.R.Gibson, R.Fuller // J. Nutr.- 2000.-Vol.130, № 2,- P.391-395.

113. Gissen, A.S. Off probiotics, prebiotics and synbiotics / A.S. Gissen // ISS VRP'S Inc. Vit. Res. Prod. Newsletters. USA, 1995. - P. 111-117.

114. Glebocka, K. Gut health is a critical factor for litter quality / K.Glebocka // World Poultiy.-2008.-№ 12.-P.27-31.

115. Green, A.A. The role of probiotic in producing quality poultry products / A.A.Green, D.W.B Sainsbury.: XV Europ. Symp. Quality of Poultry Products. XV Europ. Symp. Quality of Poultry Meat.- Turkey, 2001.-P. 245-251.

116. Greiff, D. Applications of vacuum technigues to the freeze-drying of biological materials / D.Greiff// AlCh E Sym. Ser.-1972.-Vol.68, № 125.-P.7-15.

117. Hong, H.A. The use of bacterial spore formers as probiotics / H.A.Hong et al. // FEMS Microbiol. Rev.- 2005.-Vol.29.-P.813-835.

118. Hunter, J.O. A review of the role of the gut microflora in irritable bowel syndrome and the effects of probiotic / J.O.Hunter, J.A. Madden // Br. J. Nutr.- 2002,-Vol.88 (suppl. IV).-P.67-72.

119. Huovinen, P. Bacteriotherapy: the time has come / P.Huovinen // Br. Med. J. 2001. - Vol. 323. - P. 353-354.

120. Ishibashi, N. Probiotics and safety / N.Ishibashi, S.Ymazaki // Am. J. Clin. Nutr.-2001.- Vol.73 (suppl. III).- P.465-470.

121. Isolari, E. Probiotics: Effects on immunity / E.Isolari , Y.Sutas, P.Kankaanpaa et al. // Am J. Clin. Nutr. 2001. - Vol. 73, N 2. - Suppl. 1. - P. 444-460.

122. Isolauri, E. Probiotics: effects on immunity / E.Isolauri, Y.Sutas, P. Kankaan-paa et at. // J. Clin. Nutr.- 2001.- Vol.73 (suppl. II).- P.444-450.

123. Kailasapathy, K.A. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. / K.A. Kailasapathy // Chin J. Immunol. Cell Biol.-2000.- № 78.- P. 80-84.

124. Kaur, I. P. Probiotics: potential pharmaceutical applications / I. P.Kaur, A.

125. Cyopra // Eur. J. Pharm. Sci. 2002. - Vol. 15, N 1. - P. 1-9.

126. Killen, M. Genetic modification of intestinol lactobacilli and bifidobacteria / M.Killen, M.Klatnhamm / /J. Mol. Biol.- 2000.- № 2.- P. 41-50.

127. Kirchgatterer, A. Natural therapy instead of chemistry. Probiotics in gastroenterology / A.Kirchgatterer, P. Knoflach // Acta Med. Austriaca.- 2004.- № 31 (l).-P 13-17.

128. Korotkova, E.I. Usage potential of microbal nature antioxidants in meat production / E.I.Korotkova, Y.A.Karbainov, O.A. Avramchik // Analytical and Bio-analytical Chemistry.- 2003.- V.375, № 3.- P.465-468.

129. Leary, A. NuPro: Giving broiler chicks a flying start to success / A.Leary: International Poultry Scientific Forum.- USA, 2007.-P.179.

130. Lebenthal, E. Probiotics an important therapeutic concept awaiting validation / E.Lebenthal, Y.Lebenthal // IMAJ.- 2002.-№4.-P.374-375.

131. Leclere, V. Characterization of a constitutive mycosubtilin overproducing Bacillus subtilis strain and its antagonistic activity / V.Leclere, M.Bechet, A.Adam et al. // Appl Environ Microbiol.- 2004.-Vol. 7l.-P.4577-4584.

132. Levesque, Justin. The innovation process and quality tools//Justin Leves-que, Y. Fred Walker // Quality Progress.-July, 2007.-P. 11-13.

133. Ltaf-ur-rahman. Probiotics as an immune enhancer in broilers / Ltaf-ur-rahman, Sarzamin khan, Daulat khan et all // Sarhad J. Agric.-2009.-Vol.25, №3.-P.457-462.

134. Maruta, Kiyoshi. Probiotics or antibiotics / Kiyoshi Maruta // World Poultry.-1999.-№3,-P. 112-127.

135. Midilli, M. The effects of enzyme and probiotic supplementaiton to diets on broiler performance / M.Midilli, S.D. Tuncer // Turk. J. Vet. Anim. Sci.- 2001.-№5.-P.895-903.

136. Morikawa, M. Beneficial bio film formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species / M.Morikawa // J. of Bioscience and Bioengineer.-2006.-Vol.101, No.l.-P. 1-8.

137. Nanney, R.I. Nutritional digestibility value of yeast extract in male broiler chicks /R.I.Nanney, P.R. Ferket// International Poultry Scientific Forum.- USA, 2007.-P.135.

138. Obayshi, Y. Some factors affecting preservability of freeze-drying bacteria /

139. Y.Obayshi, S.Ota, S.Arai//J. Hyg. Camb.-1961-Vol.59, № 1.-P.77-91.

140. Ogawa, M. Inhibition of in vitro growth of Shiga toxin-producing E.coli O 157:H7 by probiotic Lactobacillus strains due to production of lactic acid / M.Ogawa, K.Shimizu, K.Nomoto // Int. J. Food Microbiol.- 2001.- № 21.- P. 135140.

141. Panda, A.K. Growth, carcass characteristics, immunocompetence and response to Escherichia coli of broilers fed diets with various levels of probiotic / A.K.Panda, M.R.Reddy, S.V.R. Rao et al. // Archiv fur Geflugelkunde.- 2000.-Vol. 64.-P.152-156.

142. Papagianni, M. Ribosomalli synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function and application / M.Papagianni // Biotechnol. Adv. 2003,21 (6): 465-499.

143. Perdigon, G. Lactic acid bacteria and their effect on the immune system / G.Perdigon, R.Fuller, R.Raya // Curr. Issues Intes. Microbiol.- 2001.-№2.-P.27-42.

144. Petrochkongkaew, A. Isolation of Bacillus spp. From Thai fermented soybean (Thua-nao): screening for aflatoxin B 1 and ochratoxin A detoxification / A.Petrochkongkaew, P.Taillandier, P.Gasaluck et al. // J. Appl. Microbiol.-2008.-№ 104,- P.1495-1502.

145. Reid, G. Probiotics for urogenital health / G.Reid // Nutr. Clin. Care.- 2002.-№5.-P.3-8.

146. Ricca, E. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications / E.Ricca, et al., eds. Horizon Scientific Press, 2004.- P.35-44.

147. Roberfroid, M.B. Prebiotics: preferential substrates for specific germs? / M.B. Roberfroid // Am. J. Clin. Nutr.- 2001.-Vol.73(suppl. II).-P.406-409.

148. Roberfroid, M.B. Prebiotics and probiotics: are they functional foods? M.B. Roberfroid//Am. J. Clin. Nutr.- 2000.-Vol.71, №6.-P. 1682-1687.

149. Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat, and chemicals / P.Setlow // J. Appl. Microbiol.-2006.- September; 101(3).-P. 514-525.

150. Shanahan, F. Probiotics in inflammatory bowel disease / F.Shanahan // Gut.-2001.-Vol.48.-P.609.

151. Vanbelle, M. New probiotics and application of them in veterinary science and medicine / M.Vanbelle // Ann. Microbiol.-2000.-Vol. 140a, №8.- P. 251-253.

Информация о работе

Провоторова, Олеся Владимировна
кандидата технических наук
Щёлково, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Технология производства и оценка эффективности синбиотиков на основе бесклеточных пробиотиков метаболитного типа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы