Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Технология производства синбиотика Лактосубтил-Хорс, эффективность его применения в коневодстве

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Технология производства синбиотика Лактосубтил-Хорс, эффективность его применения в коневодстве"

На правах рукописи ТИТОВА Екатерина Игоревна

НОВЫЙ СИНБИОТИК ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ В КОНЕВОДСТВЕ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 ДПР 2012

Щелково - 2012

005017760

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский технологический институт биологической промышленности» Российс академии сельскохозяйственных наук, г. Щелково

Научный руководитель -

Официальные оппоненты -

Ведущая организация ■

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Неминущая Лариса Анатольевна

Матвеева Ирина Николаевна, доктор биологических наук, ГНУ «Всероссийский научно - исследовательс: и технологический институт биологической промышленности», отдел молекулярной биологии и вирусологии, заведующий

Тихонов Игорь Владимирович, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина», кафедра биотехнологии, заведующий

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательск] институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко»

Защита состоится 15 мая 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационн совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора н; Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийском научно-исследовательском технологическом институте биологической промышленности» РАСХН по адр( 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, стр ВНИТИБП; тел/факс: (8 496) 567-32-63; e-mail: vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Г «Всероссийский научно-исследовательский и технологический инсти биологической промышленности».

Автореферат размещен на сайте ВАК Министерства образования и науки ' http://wvvvv.vak.ed.gov.ru/

Автореферат разослан 12 апреля 2012г. Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Фролов Ю. Д.

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ФГБУ «ВГНКИ» — Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ФГУП НИИ ГосГенетика, г. Москва)

КФХ «Гришин » - крестьянское фермерское хозяйство «Гришин»

AJIT - аланинамииотрансфераза

АнтА - антагонистическая активность

асв - абсолютное сухое вещество

ACT - аспартатаминотрансфераза

БАВ - биологически активные вещества

ГГТ - гамма-глутамилтранспептидаза

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

КЖ - культуральная жидкость

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НД - нормативная документация

ОМ - обезжиренное молоко

РВ - редуцирующие вещества

РЭК - развивающиеся эмбрионы кур

ТУ - технические условия

ФЗ - ферментолизат отходов зерносырья

ЩФ - щелочная фосфотаза

GMP - Good Manufacturing Practice (надлежащая производственная практика)

M.S. - Master Seed (главный посевной материал)

P.S. - Production Seed (производственный посевной материал)

S.L.S. - Seed Lot System (система посевных материалов)

W.S. - Working Seed (рабочий посевной материал)

1.Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время коневодство в России являете активно развивающейся отраслью сельскохозяйственного животноводства i характеризуется рядом специфических особенностей. Основные из них - ви, продуктивности (различные виды механической работы, полезной для человека) i четкое разделение на коневодство племенное (коннозаводство) и пользовательское рабочее и продуктивное (В.В.Калашников, И.Ф. Драганов, В.Г. Мемедейкин, 2011).

Как показывают научные исследования, стрессовые воздействия на животны при перевозке и на жеребят при отъеме, несбалансированное питание и нарушени санитарных норм содержания лошадей вызывают значительные изменения экологической нише штаммов микроорганизмов желудочно-кишечного тракт; изменения популяционного уровня кишечных бактерий. Это приводит к ослабленш здоровья, нарушению нормальной работы желудочно-кишечного тракта лошаде (С.М. Буденный, 1959; Е.В. Зинченко, А.Н. Панин, 2000; А.Б. Муромцев, 2004). ] связи с этим все более актуальной становится проблема профилактики, лечения нормализации микробного баланса в пищеварительном тракте (в том числ минимизация последствий антибиотикотерапии), повышения эффективност выращивания и сохранности лошадей. Один из способов ее решения - разработка применение лекарственных средств нового поколения, которые характеризуютс высокой биодоступностью и положительно влияют на микробиоценоз желудочне кишечного тракта животных, что приводит к оздоровлению всего организма в цело1 и снижению микробизма окружающей среды. К их числу относятся эубиотики пробиотики и пребиотики (В.А. Антипов, 1991; И. В. Тихонов, Е. С. Воронин и др 2000; Т. Н. Грязнева, 2005; A.A. Кульпиисова, 2005). В последние годы накопле значительный материал, отражающий действие различных пре- и пробиотически препаратов на сельскохозяйственных животных, птицу, человека. Многие из эти препаратов влияют на гуморальный и клеточный иммунитет, зоотехнически показатели, могут служить естественными стимуляторами роста и обладать токсико и радиопротективным действием, снижающим влияние неблагоприятны экологических факторов (M.R. Adams, C.J. Hall, 1988; B.B. Субботин, Н.Б Данилевская, 2005; А.Н. Панин, H.H. Малик, О.С. Илаев, 2012).

Наиболее перспективным направлением является создание синбиотиков -комплексов про- и пребиотиков, которые могут быть использованы для создани лечебно-профилактических препаратов, обладающих способностью положительн!

воздействовать на здоровье животного, повышать его естественную сопротивляемость, не оказывая при этом какого-либо отрицательного влияния на организм (JI.A. Неминущая, Г.И. Воробьева, Э.Ф. Токарик и др., 2009). Во ВНИТИБП накоплен значительный опыт разработки состава и технологии производства синбиотических комплексов. Разработаны новые безопасные и эффективные синбиотические комплексы для птицеводства АВИЛАКТ-ФОРТЕ и ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ (Л.А. Неминущая, В.И. Еремец, А.Я. Самуйленко и др. 2010). При переходе к применению синбиотиков другим видам сельскохозяйственных животных необходимо учитывать их специфику. Особенности использования лошадей в сельском хозяйстве и спортивных состязаниях требуют разработки нового синбиотического комплекса, более эффективного по пробиотическим и пребиотическим свойствам.

Важная характеристика нового препарата - его конкурентоспособность на рынке, одним из основных составляющих которой является качество. Под качеством лекарственного средства (ЛС) понимается, прежде всего, его пригодность к применению, т.е. эффективность и безопасность (А. П. Мешковский, 2001). В соответствии с Федеральным Законом «Об обращении лекарственных средств», проведение доклинических исследований и клинических испытаний является обязательным этапом разработки новых лекарственных средств и кормовых добавок для животных (В. И. Еремец, Э.Ф. Токарик, Н. К. Еремец и др., 2001).

Таким образом, разработка новых препаратов для коневодства на основе про- и пребиотиков с использованием современных подходов к обеспечению их качества является актуальной, перспективной и представляет научный и практический интерес.

Цель работы и задачи исследований. Цель работы - разработать рецептуру нового синбиотика, технологию его изготовления и способ применения в коневодстве для жеребых кобыл и жеребят.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

научно обосновать состав синбиотического комплекса (пробиотики + пребиотическая кормовая добавка) для применения в коневодстве; - исследовать характеристики штамма Lactobacillus plantarum М-30, используемого для изготовления нового пробиотика ЛАКТОПЛАНТ;

- определить состав биологически активной добавки ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС, обладающе пребиотическими свойствами;

- освоить технологию изготовления препаратов ЛАКТОПЛАНТ и ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮ1 с использованием универсальной питательной среды для культивировани микроорганизмов;

- изготовить опытные образцы препаратов и провести их доклинически исследования;

- определить эффективность применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОР< (ЛАКТОПЛАНТ+АВИСУБТИЛ+ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС) для жеребых кобыл и жеребят;

- разработать способ применения синбиотика и коммерческое предложение по ег использованию в коневодстве.

Научная новизна. Разработан новый синбиотический комплек ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС и способ его применения для жеребых кобыл и жеребя различных возрастных групп. Показано, что применение синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ ХОРС в коневодстве способствует улучшению физиологического состояния животны: и повышает неспецифическую резистентность их организма.

Для обеспечения высокой пробиотической активности нового пробиотик ЛАКТОПЛАНТ выбран штамм лактобактерий Lactobacillus plantarum, штамм М-30 i показано, что по уровню антагонистической активности к патогенны' микроорганизмам и резистентности к антибиотикам он удовлетворяет требованиям предъявляемым к продуцентам пробиотиков.

Разработана новая биологически активная пребиотическая добавка ЦЕРЕВЕТ ПЛЮС, обладающая высокой питательной ценностью, состоящая из комплекс; биомассы инактивированных клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, шт. diastaticu ВКПМ-^у-1218 и биомассы мицелиалыюго гриба Fusarium sambucinum.

Эффективность применения нового синбиотика в коневодстве для жеребы: кобыл и жеребят определена с использованием широкого спектра показателей клинические исследования (показатели температуры, пульса и дыхания, состояние пищеварительной системы, наличие аппетита, состояние волосяного покрова) гематологические и биохимические показатели крови, параметры жеребят отьемышей (высота в холке, вес).

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и предложены:

- новый синбиотический комплекс для коневодства;

- новый пробиотик ЛАКТОПЛАНТ и биологически активная добавка ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС, входящие в состав комплекса;

- способ применения синбиотика для лошадей при смешивании с кормом.

По результатам испытаний комплекса в крестьянском фермерском хозяйстве показаны его безопасность и эффективность.

Результаты исследований использованы для обоснования разработанной во ВНИТИБП и одобренной Президиумом Россельхозакадемии (протокол №4 от 21.04.2011) «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации», а также в лекционном материале «Пробиотики в коневодстве» для специалистов КФХ «Гришин». Основные положения, которые выносятся на защиту:

- характеристика штамма лактобактерий Lactobacillus plantarum, штамм М-30 по показателям специфической (пробиотической) активности;

- схема доклинических исследований безопасности и активности новых препаратов, гармонизированная с международными требованиями;

- технология изготовления препаратов с использованием универсальной питательной среды на основе ферментолизата отходов зерносырья;

- показатели питательной ценности пребиотической добавки;

- эффективность применения синбиотика в коневодстве для жеребых кобыл и жеребят различных возрастных групп;

- способы применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС в коневодстве для жеребых кобыл и жеребят различных возрастных групп.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работ проводили совместно с главным научным сотрудником ВНИТИБП, доктором биологических наук, профессором Г.И. Воробьевой, заведующим лабораторией сушки биопрепаратов, доктором биологических наук А.А. Нежутой, заведующим отделом противобактерийных препаратов, кандидатом ветеринарных наук Е.Э. Школышковым.

Апробация результатов работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены: в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий на заседаниях ученого совета и методической комиссии ВНИТИБП (2010-2011 гг.); на Международном

конгрессе «Биотехнология - 2011»; на трех Международных конференциях, проводившихся в Москве, Тюмени, Екатеринбурге. (2011-2012 гг.).

Публикация научных исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАЬ Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страница: машинописного теста и состоит из введения, обзора литературы, собственны; исследований, обсуждения результатов, выводов, предложений для практики, списк: литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована ЛГтаблицами и jEj рисунками. Список использованной литературы содержит Л/Л источников, в тол числе - ¿О иностранных авторов.

Благодарности. Автор выражает благодарность директору ВНИТИБП академику РАСХН А.Я. Самуйленко и научному руководителю кандидат} биологических наук JI.A. Неминущей. В выполнении некоторых раздело! диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативнук помощь сотрудники института Э.Ф. Токарик, Г.И. Воробьева, В.И. Еремец Т.А.Скотникова, Н.К.Еремец, А.А. Нежута, А.И. Албулов, В.И. Клюкина Е.П.Сапегина, Е.Э.Школьников, И.В. Павленко, Ю.Д. Фролов, Т.А. Авдеева, а такж< сотрудники КФХ «Гришин»: В.А. Гришин, А.Н. Сухоткин - за что приносим им сердечную благодарность.

2. Собственные исследования

Работа выполнена в 2010 - 2012 годах в отделе обеспечения качеств; лекарственных средств для животных ВНИТИБП РАСХН в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ, задание 08.06.02 «Разработать молекулярно-биологические основы конструирования и технологии производства лечебно-профилактических препаратов с использованием биологически активных веществ природного происхождения и микробиологического синтеза». Испытания эффективности комплекса проводили в крестьянском фермерском хозяйстве (КФХ) «Гришин» (Нижегородская область, поселок Починки), в ГУ «Мордовской Республиканской Ветеринарной Лаборатории» и Ветеринарном кабинете «Доктор НеБолит» (г. Саранск).

Материалы и методы. Объектами исследований служили: штаммы-продуценты (Lactobacillus plantarum, штамм М-30, ВКПМ № В-2991; Bacillus subtilis,

штамм М-8, ВКПМ № В-1948; Saccharomyces cerevisiae (diastaticus), штамм ВКПМ-у-1218; Fusarium sambucinum, штамм MKF 2001-3, ВКПМ № F-867); пробиотики ЛАКТОПЛАНТ (пробиотик в жидкой и сухой формах, содержащий живые клетки L. plantarum, шт. М-30) и АВИСУБТИЛ (пробиотик в жидкой и сухой формах, содержащий живые клетки В. subtilis, шт. М-8); биологически активная добавка ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС (сухая биомасса мицелиального гриба F. sambucinum шт. MKF 2001-3 и инактивированных клеток дрожжей S. cerevisiae diastaticus BKI IM—у-1218); синбиотик ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС (комплекс препаратов ЛАКТОПЛАНТ, АВИСУБТИЛ и ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС).

Для оценки безопасности препаратов определяли токсичность для белых беспородных мышей (масса тела 12-14 г) после внутрибрюшинного введения препарата в широком интервале доз; токсичность для 9-10 суточных SPF-эмбрионов кур (тест эмбриотоксичпости).

Антагонистическую активность пробиотиков характеризовали в опытах in vitro -по величине задержки роста патогенных штаммов эшерихий (К-88, К-99, А-20Е) и сальмонелл (S. typhimurium, S. dublin, S. gallinarum). Резистентность к антибиотикам определяли in vitro дисковым методом. Устойчивость бактерий-пробиотиков к действию желудочного сока (сухой медицинский, желудочный сок «Эквин», НПО «Биомед», г. Пермь) и желчи (желчь медицинская, ООО «Самсон», г. Санкт-Петербург) определяли по изменению количества живых бактерий после контакта с ними. Количество жизнеспособных бактерий определяли высевом на среды MRS-5 и сусло-агар.

Для характеристики и стандартизации химического состава кормовой добавки на базе аналитической лаборатории ГосНИИСинтезбелок определяли: массовую долю сухих веществ (по ГОСТ 28561-90); массовую долю золы (по ГОСТ 12572-67); массовую долю липидов (по ГОСТ 13496.15-97); общий белок (по ГОСТ 26889-86); общее содержание углеводов (по ГОСТ 26176-91); макро- и микроэлементы методом атомио-абсорбционной спектрофотометрии (на приборе AAS-1N); органические кислоты методом газо-жидкостной хроматографии (на хроматографе Хыолетт -Паккард, колонка - полисорб); витамины (флюорометрическим методом по ГОСТ 29138-91, 19139-91, 29140-91); состав и содержание аминокислот (на аминокислотном анализаторе Биотроник LC-7000).

Эффективность синбиотика для жеребых кобыл и жеребят различных возрастов оценивали по показателям: клиническим (температура, пульс, дыхание, состояние

шерстного покрова, пищеварительной системы, наличие аппетита); гематологическим (эритроциты, лейкоциты, гемоглобин); биохимическим (общий белок, альбумин, каротин, белковые фракции, резервная щелочность, кальций, глюкоза, фосфор, ЛДГ, ACT, ЩФ, AJ1T, ГГТ); параметров жеребят-отьемышей (высота в холке, вес).

Выращивание культур проводили в пробирках и флаконах на шуттель-аппарате, а также в лабораторных установках АНКУМ-2М емкостью 10 дм3, которые оснащень системами автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования (температура, рН, парциальное давление растворенного кислорода -р02, окислительно-восстановительный потенциал - еН, расход воздуха на аэрацию скорость вращения мешалки и оптическая плотность бактериальной суспензии). рН в культуральной жидкости определяли потенциометрическим методом, р02 -датчиками СКБ БП (г. Пущино), еН - потенциометрически с использованиел электродов типа ЭО - 01. Оптическую плотность культуры измеряли н; фотоколориметрах ФЭК - 56, КФК - 2 и блоке оптической плотности АНКУМ - 2М.

Сухие формы препаратов получали методами сублимационного и распылительного высушивания. Контроль готовых препаратов осуществляли в соответствии с разработанными стандартами организации (СТО).

Все экспериментальные данные проверяли на наличие «промахов» методом «Определения грубых ошибок» при заданном уровне значимости 95%. Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стыодента-Фишера при уровне значимости Р < 0,05. В экспериментах на животных статистическую обработку проводили при п=11, N=3. Расчет количества жизнеспособных бактерий проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина. Компьютерное обеспечение статистических расчетов осуществляли с помощью стандартных программ типа MATHCad-2001.

Результаты исследований.

Характеристика Lactobacillus plantarum, штамм М-30. Штамм М-30, зарегистрированный в ВКПМ, в дополнение к паспортным данным характеризовали в соответствии с требованиями, предъявляемыми к продуцентам пробиотиков.

Лактобактерии данного штамма устойчивы к воздействию желчи и несколько меньше - желудочного сока. Снижение концентрации живых бактерий по сравнению с исходным значением составило (0,8±0,2) lg КОЕ/см3 и (1,6±0,3) lg КОЕ/см3 соответственно (п=5).

При определении АнтА в опытах in vitro (п=10) установлен (см. рис.1) выраженный антагонизм штамма в отношении патогенных микроорганизмов.

Рис. 1. Антагонистическая активность лактобактерий.

Исследование антибиотикорезистентности показало (п=5), что лактобакгерии высокочувствительны (диаметр зоны ЗР >25мм) к кламоксилу, левомицетину, тетрациклину, цефазолину, ампициллину и рифампицину; чувствительны (15-25 мм) к гентамицину; умеренно чувствительны (11-15мм) к офлоксацину, ципрофлоксацину, энрофлону, линкомицину и флавомицину (см. рис. 2).

Рис. 2. Антибиотикорезистентность лактобактерий.

Изготовление и контроль посевного материала. Согласно современным требованиям (ГОСТ Р 52249-2009, ГОСТ Р 2001-2008) изготовление и контроль посевного материала, используемого в технологическом процессе производства биопрепаратов, является обязательным условием обеспечения их качества. Система посевных материалов состоит из главного (Master Seed, M.S.), рабочего (Working Seed, W.S.) и производственного (Production Seed, P.S.) посевного материала, предназначенного только для производства серии конечной продукции.

Микроорганизмы выбранных штаммов (L. plantarum, М-30; В. subtilis, М-8; S. cerevisiae (diastaticus) ВКПМ-у-1218; F. sambucinum MKF 2001-3) культивировали в соответствии с условиями, указанными в паспорте на данный штамм. Полученные культуры контролировали микроскопированием на отсутствие посторонней микрофлоры и подлинность (культурально-морфологические признаки), стабилизировали путем сублимационного высушивания с защитной средой ОМ (M.S. - в ампулах по 1 см3, W.S. - в ненициллиновых флаконах по 2 см3) по режимам, разработанным при участии доктора биологических наук A.A. Нежуты. Готовый посевной материал (M.S. и W.S.) контролировали по показателям подлинности, безопасности и активности, a M.S.- дополнительно на соответствие основным характеристикам штамма.

На процедуру изготовления и контроля посевных материалов лактобактерий разработан и утвержден директором института стандарт организации - СТО.

Технология изготовления и доклинические исследования препаратов (ЛАКТОПЛАНТ, АВИСУБТИЛ и ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС), изготовление опытных серий. Данный этап работы включал:

- разработку технологии изготовления пробиотика на основе лактобактерий и белковой кормовой добавки, состоящей из инактивированной биомассы дрожжей-сахаромицетов и биомассы гриба;

- изготовление опытных серий и проведение доклинических исследований препаратов, предназначенных для испытаний их эффективности в коневодстве на жеребых кобылах и жеребятах;

разработку технологической документации (лабораторные и опытно-промышленные регламенты) и стандартов организации на пробиотик ЛАКТОПЛАНТ и кормовую добавку ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС.

В соответствии с рекомендациями Международной Комиссии по номенклатуре фармацевтических субстанций и препаратов новым разработкам присвоены собственные названия:

- пробиотик ЛАКТОПЛАНТ - бактериальный препарат, содержащий живые клетки молочнокислых бактерий L. plantarum штамма М-30.

- белковая кормовая добавка ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС - содержит сухую биомассу гриба F. sambucinum и инактивированных клеток дрожжей S. cerevisiae diastaticus.

В качестве второго пробиотика в новом синбиотическом комплексе нами использован ранее разработанный во ВНИТИБП пробиотик АВИСУБТИЛ, содержащий живые клетки В. subtilis, шт. В-1948.

Разрабатываемые препараты имеют микробиологическую природу, поэтому процесс их изготовления является типовым для микробиологических производств и подчиняется общей технологической схеме, состоящей из подготовительных и вспомогательных работ, а также основных технологических процессов.

Технология изготовления пробиотика ЛАКТОПЛАНТ.

Культивирование L. plantarum, штамм М-30. Посевной материал (P.S.) для культивирования бактерий в биореакторе получали из рабочей посевной серии (W.S.) при выращивании в колбах с питательной средой на основе ферментолизата отходов зерносырья (ФЗ). Состав среды ФЗ: (NH4)2S04 - 0,05 г; КН2Р04 - 0,02 г; дрожжевой автолизат - 10 см3, мел - 3 г; ферментолизат отходов зерносырья - 1,0 дм3. Для получения ферментолизата смесь измельченной ржи и пшеничных отрубей (в соотношении 30:70) разбавляли водой (гидромодуль 1:6 или 1:8) и подвергали последовательно: термообработке при температуре 80±1°С - 1 ч; обработке в роторно-пульсанионном аппарате при температуре 75±1°С - 40 мин; ферментолизу зерновой пульпы глюкавамарином ГЗХ при температуре 55±1°С -4ч при pH 5,0-5,2. Среду стерилизовали при 1 атм 40 мин. Характеристика среды после стерилизации: редуцирующих веществ РВ- 2,5-3,0%; NH„-900 -1000 мг/дм3; Р205 - 400-500 мг/дм3.

Для получения посевного материала/инокулята (P.S.) L. plantarum культивировали в термостате при температуре 30±0,5°С и перемешивании (каждые 4 ч) в течение 68-74 ч. После окончания процесса состояние культуры контролировали микроскопированием на отсутствие посторонней микрофлоры и соответствие культралыю-морфологическим признакам; определяли накопление клеток, которое составляло 109-Ю10КОЕ/см3.

Затем посевной материал использовали для культивирования L. plantarum в ферментере «Анкум-2М» по режиму: количество P.S. - 10% от объема питательной среды ФЗ; температура - 32±0,5°С, время - 20-24 ч; после засева и до окончания культивирования процесс происходит без аэрации при непрерывном перемешивании со скоростью вращения мешалки 40 - 180 об/мин, pH среды с начального значения 7,0-7,2 снижается до 6,5-7,0 и затем поддерживается на этом уровне до конца процесса. Накопление лактобактерий - не менее 5x10 КОЕ/см3.

Изготовление готовой формы. Для пробиотика разработано две готовые формы - жидкая и сухая. После культивирования и контроля качества продукт в первом случае фасовали в первичную тару и укупоривали, во втором - фасовали в кассеты и подвергали сублимационному высушиванию. Количество живых бактерий L. plantarum в сухом материале составляло не менее 2хЮ9КОЕ/г.

Технология изготовления пребиотической добавки ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС.

Культивирование дрожжей-сахаромицетов осуществляли по режиму, разработанному ранее во ВНИТИБП для препарата ЦЕРЕВЕТ. Посевной материал (P.S.) культивировали в колбах со средой ФЗ на качалке (g=160 об/мин.) при температуре 33±1°С и рН 4,5-5,5 в течение 24-36 ч до полного потребления свободных углеводов. Контролировали состояние культуры, определяли концентрацию биомассы (23-25 г/дм3), содержание остаточных РВ в культуралыюй среде (0,1-0,2%) и использовали для культивирования в ферментере «Анкум-2М» при следующих параметрах: объем посевного материала - 4-5%; начальное значение рН 5,0±0,5; температура - 31±1°С; время - 18-19 ч; постоянное перемешивание (120 об/мин), аэрация (1 дм3воздуха/1 дм3среды, расход воздуха 7-9 м3/час). Конечная концентрация биомассы - 20-25 г/дм3, содержание РВ в среде - 0,1-0,2%.

В качестве биокатализатора при культивировании дрожжей в ферментере использовали культуральную жидкость (КЖ) гриба F. sambucinum в количестве 1,0% от объема среды. При добавлении КЖ в питательную среду сокращалось время накопления биомассы с 19 до 10 часов, увеличивалась скорость потребления Сахаров (на 32,1%), минерального азота (на 21,5%) и фосфора (на 45,4%).

Биомассу подвергали плазмолизу при 80°С в течение 1 ч, контролировали на отсутствие живых клеток и сушили на распылительной сушилке Niro Atomizer (температура на входе - 130°С, на выходе - 95°С). В сухом продукте содержание общего белка составляло 40-45%, истинного белка - 30-38%.

Культивирование F. sambucinum осуществляли по режиму, разработанному ранее во ВНИТИБП для препарата АВИСТИМ. Засевной материал (P.S.) получали культивированием в колбах со средой ФЗ при температуре 26±1°С на качалке (160 об/мин). Контролировали микроскопированием состояние культуры, определяли накопление биомассы - 5-6 г/дм3 и использовали для культивирования в биореакторе при следующих параметрах: объем инокулята - 2-4%; температура - 27±2°С; время -30-34 ч; перемешивание постоянное при п=120 об/мин; барботаж воздухом (при 1,1 атм); остаточное давление 0,25 атм; начальное значение рН 5,5-6,0; процесс

заканчивали при снижении рН до 4,1±0,5. Через 12 часов после начала процесса отбирали пробы (1 раз каждые 3 часа) для определения рН среды, концентрации биомассы, контроля состояния мицелия. После окончания процесса культуральную среду подкисляли до рН 3,0-3,5 и выдерживали в течение 1-3 ч. Концентрация биомассы составляла 10-12 г/дм3, содержание белка - 46-53%. Сушили на распылительной сушилке Niro Atomizer (температура на входе - 130°С, на выходе -95°С). Определяли химический состав биомассы гриба и дрожжей-сахаромицетов (см. табл.1).

Таблица 1

Химический состав биомассы гриба и дрожжей-сахаромицетов.

Показатели состава Характеристика биомассы

гриба дрожжей-сахаромицетов

Общий белок, (%, от асв) 49,2 46,1

Углеводы, (%, от асв) 24,9 25,1

Липиды, (%, от асв) 8,1 7,9

Нуклеиновые кислоты, (%, от асв) 3,9 4,5

Зола, (%, от асв) 8,0 7,1

Влажность, % 7,8 9,8

Готовую форму препарата получали смешиванием биомассы дрожжей и биомассы гриба в соотношении 1:1.

Сравнение химического состава ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС и аналогичной лечебно-профилактической добавки для лошадей «РгоЬюПс.ч» (фирма ЕриПК'Б, Англия) показало, что ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС содержал больше белка на 27,3%; макро- и микроэлементов: фосфора на 19,9%, кальция на 34,9%, железа в 4,3 раза, марганца в 2,9 раза; аминокислот в 2,7-3 раза. В состав препарата «РгоЬюйсб» входит дрожжевая культура 8. сегсччв1ае (Био-Мос), лакто- (Ь. аиёорЫПиэ) и бифидобактерии (2 х 109 КОЕ/г).

Изготовление и доклинические исследования (ДИ) опытно-промышленных серий препаратов. По разработанной технологии в условиях опытного производства ВНИТИБП изготовлено: по 6 серий пробиотиков ЛАКТОПЛАНТ и АВИСУБТИЛ (3 серии в жидкой форме и 3 серии - в сухой); 6 серий кормовой добавки (пребиотика) ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС. Все серии прошли ДИ на безвредность и специфическую активность.

Для пробиотиков определяли отсутствие контаминации посторонней микрофлорой, безвредность для мышей и отсутствие эмбриотоксичности. В качестве показателей специфической активности определены: подлинность; количество

15

жизнеспособных микроорганизмов; антагонистическая активность in vitro против патогенных микроорганизмов; резистентность к антибиотикам.

Значения АнтА опытных серий пробиотиков сравнивали со значениями, полученными при контроле посевных материалов: у лактобактерий зона задержки роста эшерихий - не менее 10,9 мм, сальмонелл - не менее 14 мм; у бацилл зона задержки роста эшерихий - не менее 15 мм, сальмонелл - не менее 10 мм.

Резистентность опытных серий препаратов ЛАКТОГГЛАНТ и АВИСУБТИЛ к антибиотикам не отличалась от значений, полученных для посевных материалов.

Препарат ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС контролировали по следующим показателям: отсутствие металломагнитпой примеси; наличие живых дрожжевых клеток; токсичность экспресс-методами биотестирования кормов на инфузориях стилонихиях и колподах; наличие бактерий рода сальмонелл; общая бактериальная обсемененность; эмбриотоксичность. Специфическую активность характеризовали по питательной ценности, которая согласно НД на кормовые добавки определяется содержанием в них белка, углеводов, липидов, сухих веществ и влаги.

Полученные результаты контроля опытных серий по всем показателям соответствовали установленным для них нормам, что свидетельствует о воспроизводимости разработанной технологии. Разработаны и утверждены директором ВНИТИБП технологические регламенты производства и стандарты организации на ЛАКТОПЛАНТ и ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС.

Определение эффективности синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС в коневодстве для жеребых кобыл и жеребят. ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС -синбиотический комплекс, включающий пробиотики ЛАКТОПЛАНТ и АВИСУБТИЛ, а также биологически активную добавку ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС.

Опыты проводили на кобылах в период случки (11 голов), кобылах в период последней четверти жеребости (11 голов), на жеребятах в период отъема (11 голов), на жеребятах - годовиках (11 голов). Животным опытной группы препараты комплекса задавали вечером, с запаренной кашей овса. Животные контрольной группы синбиотик не получали.

Исследования эффективности (4 опыта) реализованы по схеме (см. табл.2): - определение безвредности и эффективности синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для кобыл в период случки (Опыт №1);

определение эффективности синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для жеребых кобыл в последнюю четверть жеребости (Опыт №2);

определение эффективности синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для жеребят-отъемышей (Опыт №3);

определение эффективности применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для жеребят-годовиков (Опыт №4);

- разработка способа применения синбиотического комплекса.

Таблица 2

Схема опытов.

Группы Схема применения препаратов (дозировка и дни)

Дни ЛАКТОПЛАНТ АВИСУБТИЛ ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС

Доза (г) Доза (г) Доза (г)

Опыт №1 1-2-й 5 10 10

3-4-й 7 15 15

5-6-й 10 20 20

7-8-й 12 30 25

Опыт №2 10 100 (мл) 25 25

Опыт№3 10 50 (мл) 14 12,5

Опыт №4 10 75 (мл) 20 25

Безвредность и эффективность синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для кобыл в период случки. В опыте №1 определяли безвредность для лошадей синбиотического комплекса в различных дозировках на кобылах 1999-2005 гг. и 2000- 2006 гг. рождения. За 1 неделю до случки лошади опытной группы в течение 8 дней получали препараты синбиотического комплекса.

В период применения синбиотика и далее в течение 8 дней наблюдений показатели температуры, пульса и дыхания соответствовали норме в опытной и контрольной группах. В опытной группе после использования добавки не было отмечено нарушений со стороны пищеварительной и других систем; улучшился аппетит и состояние шерстного покрова за счет равномерного отрастания волоса по всей площади поражений.

В контрольной группе: отмечено у 2-х кобыл нарушения со стороны ЖКТ (колики-1 голова, диспепсия - 1 голова); у всех кобыл сохранились, либо усилились дефекты шерстного покрова; ухудшился аппетит по сравнению с опытной группой. Результаты гематологических и биохимических исследований показателей крови животных показаны в табл.3.

Таблица 3

Гематологические и биохимические показатели крови на фоне применения ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС кобылам в период случки (п=11 ,N=3).

Показатель До эксперимента После эксперимента Норма

Опыт. Контр. Опыт. Контр.

Гемоглобин (11г/%) 12,1 12,5 13,4 11,2 8-14

Эритроциты (7 млн./мкл) 3,96 3,8 5,6 4 6-9

Лейкоциты (9тыс./мкл) 5,6 6 7,03 5 7-12

Общий белок (г/л) 34,05 35,76 55,28 37,8 47-75

Альбумин (г/л) 27,53 25,94 33,04 23,56 27-37

Кальций (ммоль/л) 3,928 4,237 3,768 2,602 2,6-4,0

Глюкоза (ммоль/л) 6,097 5,205 5,01 4,81 3-7

Фосфор (ммоль/л) 0,7 0,405 1,5 0,541 0,7-1,9

ЛДГ (Ед.) 299,3 351,2 250,3 348,4 100-400

ACT (Ед.) 180,64 168,8 235,27 170,9 130-300

Щ Ф (Ед.) 212,93 193,2 237,6 200,5 70-250

АЛТ (Ед.) 4,02 3,327 15,03 5,732 2,7-20

ГГТ (Ед.) 41,85 48,26 10,61 47,84 1-20

После окончания курса применения синбиотика в крови животных опытной группы отмечена нормализация уровня гемоглобина и эритроцитов, лейкоцитов, а также альбумина, глюкозы, фосфора, ACT, АЛТ, ГГТ.

При дальнейшем проведении случки в конеферме была установлена 100% оплодотворяемость кобыл опытной группы, в то время как в контрольной группе прохолостело (не забеременело) 2 кобылы из 4-х.

Определение эффективности применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для жеребых кобыл в последнюю четверть жеребости. В опыте №2 использованы жеребые кобылы 11 голов (последняя четверть беременности) 1999-2005 гг. и 19992004 гг. рождения. Лошади опытной группы в течение 10 дней получали препараты синбиотического комплекса.

Результаты клинических исследований животных были аналогичны полученным в опыте №1.Результаты гематологических и биохимических исследований показателей крови животных показаны в табл.4.

Таблица 4

Гематологические и биохимические показатели крови на фоне применения ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС жеребым кобылам, (п=11,Ы-3)

Показатель До эксперимента После эксперимента Норма

Опыт Контр. Опыт Контр.

Гемоглобин (11г/%) 12,3 12,6 13,8 11,2 8-14

Эритроциты (7 млн./мкл) 3,86 3,9 6,1 4,5 6-9

Лейкоциты (9тыс./мкл) 5,8 6 7,1 5 7-12

Общий белок (г/л) 34,45 35,74 56,31 37,73 47-75

Альбумин (г/л) 26,89 26,04 34,04 23,56 27-37

Кальций (ммоль/л) 3,142 2,985 3,758 2,671 2,6-4,0

Глюкоза (ммоль/л) 6,124 5,401 5,48 5,04 3-7

Фосфор (ммоль/л) 0,8 0,405 1,6 0,602 0,7-1,9

ЛДГ (Ед.) 300,2 321,3 253,1 342,6 100-400

ACT (Ед.) 182,53 170,5 228,68 173,1 130-300

Щ Ф (Ед.) 210,94 196,69 234,78 203,82 70-250

АЛТ (Ед.) 5,43 3,327 13,74 5,732 2,7-20

ГГТ (Ед.) 17,52 18,93 14,13 20,65 1-20

Таким образом, результаты, полученные в опытах №№1,2, свидетельствуют об улучшении физиологического состояния взрослых животных и повышении неспецифической резистентности их организма.

Эффективность применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС жеребятам-отъемышам. В опыте №3 использованы 11 жеребят-отъемышей 2011 года рождения. Жеребята опытной группы в течение 10 дней получали синбиотический комплекс ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС.

На фоне применения добавки, состоящей из синбиотического комплекса и далее в течение 10 дней наблюдений показатели температуры, пульса и дыхания соответствовали норме у животных опытной и контрольной групп. В опытной группе после использования добавки не было нарушений со стороны пищеварительной и других систем; улучшился аппетит и состояние шерстного покрова за счет равномерного отрастания волоса по всей площади поражений. Результаты гематологических и биохимических исследований показателей крови животных показаны в табл.5.

Таблица 5

Гематологические и биохимические показатели крови на фоне применения ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС жеребятам-отьемышам. (п=11,Ы=3)

Показатель До эксперимента После эксперимента Норма

Опыт. Контр. Опыт. Контр.

Гемоглобин (11 г/%) 10,8 10,6 13 12 8-14

Эритроциты (7млн./мкл) 6,9 7,1 7,1 6,9 6-9

Лейкоциты (9тыс./мкл) 6,9 7,7 7,9 7,4 7-12

Общий белок (%) 6,71 7,1 7,23 6,55 7,0-7,8

Альбумин (%) 52 50,38 54,26 50,32 35-55

а-глобулин (%) 18,52 18,02 18,9 17,1 14-18

3-глобулин (%) 13,82 14,48 14,83 14,47 20-26

у-глобулин (%) 15,38 17,17 18,34 17,11 18-24

Каротин (мг/%) 0,232 0,249 0,449 0,399 0,4-1

Кальций (мг/%) 12,7 12,5 13,17 12,5 10-14

Резервная щелочность (0б.%С02) 47,63 46,6 51,87 40,3 50-65

При гематологических исследованиях отмечена нормализация уровня гемоглобина и эритроцитов в крови. При биохимических исследованиях отмечена нормализация общего белка, каротина, резервной щелочности, у-глобулина .

Эффективность применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для жеребят-годовиков. В опыте №4 использованы жеребята-годовики, а именно молодые кобылы 2010 года рождения. Лошади опытной группы в течение 10 дней получали препараты синбиотического комплекса.

Результаты клинических исследований животных, гематологических и биохимических показателей крови были аналогичны полученным в опыте №3.

Результаты гематологических и биохимических исследований показателей крови животных показаны в табл.6.

Таким образом, результаты, полученные в опытах №№3,4, свидетельствуют об улучшении физиологического состояния жеребят и повышении неспецифической резистентности их организма, повышения иммунитета, что важно как при отъеме, так и при дальнейшем развитии.

Таблица 6

Гематологические и биохимические показатели крови на фоне применения ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС жеребятам-годовикам. (п=11, N=3)

Показатель До эксперимента После эксперимента Норма

Опыт. Контр. Опыт. Контр.

Гемоглобин (11 г/%) 8 12,5 13,5 11,2 8-14

Эритроциты (7млн./мкл) 7 3,8 7,8 4 6-9

Лейкоциты (9тыс./мкл) 7 6 9,5 5 7-12

Общий белок (%) 7,5 7,15 7,71 7,04 7,0-7,8

Альбумин (%) 33,3 32,64 35,21 32,34 35-55

а-глобулин (%) 16,34 14,5 17,1 14,1 14-18

(З-глобулин (%) 19,51 19,43 21,54 19,04 20-26

у-глобулин (%) 20,13 20,44 22,61 20,4 18-24

Каротин (мг/%) 0,124 0,099 0,216 0,199 0,4-1

Кальций (мг/%) 12,1 12 12,6 10,6 10-14

Резервная щелочность (0б.%С02) 46,23 45,3 50,21 38,7 50-65

Измерения параметров у жеребят-отъемышей в опытной группе до приема курса синбиотика составили в среднем - высота в холке 135,4 см и вес 305 кг. Параметры в контрольной группе жеребят-отъемышей в среднем высота в холке составила 131,2 см и вес 296 кг. Параметры жеребят-годовиков в опытной группе после приема синбиотика соответственно составили в среднем высота в холке 146,4 см и вес 397 кг. А в контрольной группе соответственно в среднем высота в холке 142,см и вес 390 кг.

Разработка способа применения синбиотического комплекса ЛАКТОБУСТИЛ-ФОРТЕ. По результатам анализа данных, полученных в научно-производственных опытах на лошадях, разработан способ применения синбиотика и инструкция по его применению.

Способ применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС:

- одним курсом 10-14 дней, препараты в дозе пробиотик ЛАКТОПЛАНТ (в жидкой форме из расчета 0,1% от массы тела животного или в сухой форме из расчета 0,05% от массы тела животного), пробиотик А13ИСУБТИЛ (из расчета 0,05% от массы тела животного), биологически активная кормовая добавка ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС (из расчета 0,05% от массы тела животного).

Проведен сравнительный расчет стоимости курса применения разработанного синбиотика и аналогичной по его составу кормовой добавки «РгоЬю^сэ» (фирмы

EQUIMINS, Англия): Probiotics (стоимость 2600 руб./кг) в 4,19 раза более дорогой, чем ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС (стоимость 650 руб./кг).

Разработано коммерческое предложение по использованию синбиотического комплекса ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС в коневодстве.

3. Выводы

1. Разработан новый синбиотический комплекс ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для применения в коневодстве, включающий пробиотики ЛАКТОПЛАНТ и АВИСУБТИЛ, а также биологически активную кормовую добавку ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС.

2. Штамм Lactobacillus plantarum М-30, используемый для изготовления препарата ЛАКТОПЛАНТ, устойчив к действию желудочного сока и желчи; in vitro обладал выраженным антагонистическим действием по отношению к патогенным штаммам сальмонелл S. gallinarum, S.typhimurium, S.dublin (зона задержки роста - не менее 11 мм) и эшерихий Е. coli К-88, Е. coli К-99, Е. coli А-20 (зона задержки роста - не менее 14 мм);умеренно-чувствителен к офлоксацину, ципрофлоксацину, энрофлону, флавомицину и линкомицину.

3. Биологически активная кормовая добавка ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС содержит (в весовом соотношении 1:1) сухую инактивированную биомассу дрожжей S. cerevisiae diastaticus, шт. ВКПМ-у-1218 и сухую биомассу высшего гриба F. sambucinum, шт. MKF 2001-3. Сравнение химического состава препарата ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС и аналогичной лечебно-профилактической добавки для лошадей «Probiotics» (фирмы EQUIINS, Англия) показало, что ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС содержал больше белка (на 27,3%), макро- и микроэлементов (фосфора - на 19,9%; кальция - на 34,9%;марганца - в 2,9 раза; железа - в 4,3 раза), аминокислот (лизина, аргинина, фенилаланина, треонина и триптофана - в 2,7 - 3 раза).

4. Использование универсальной питательной среды на основе ферментолизата отходов зерносырья при культивировании микроорганизмов обеспечивало высокое накопление продукта: L. plantarum - не менее 5x109 КОЕ/см3, биомассы гриба и дрожжей 10-12 г/л и 20-25 г/л соответственно.

5. Сухую форму пробиотика ЛАКТОПЛАНТ получали методом сублимационного высушивания, что обеспечивало концентрацию бактерий в препаратах не менее 2х 109 КОЕ/г. Компоненты кормовой добавки (сухую инактивированную биомассу дрожжей и гриба) получали методом распылительного высушивания,

содержание протеина в сухом виде составило не менее 40% и 45% (от сухого вещества) соответственно.

6. Для жеребых кобыл и жеребят различных возрастов установлена безвредность препаратов комплекса в дозировках: ЛАКТОПЛАНТ - от 5 до 12 г/голову, АВИСУБТИЛ - от 10 до 30 г/голову, ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС - от 10 до 25 г/голову.

7. Применение синбиотика для жеребых кобыл и жеребят различных возрастов способствовало:

- улучшению клинических показателей (состояние шерстного покрова, пищеварительной системы, аппетита);

- увеличению таких гематологических и биохимических показателей крови как гемоглобин, эритроциты, общий белок, альбумин, кальций, р-глобулин, каротин, резервная щелочность, что является важным показателем улучшения состояния животных, так как свидетельствует об улучшении кровообращения, обмена веществ, энергообесиеченности, компенсаторных и приспособительных механизмов организма лошади;

- увеличению параметров жеребят-огьемышей (высота в холке, вес).

8. Разработан способ применения синбиотического комплекса ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС - одним курсом 10-14 дней в дозах: пробиотики ЛАКТОПЛАНТ (0,1% от массы тела животного) и АВИСУБТИЛ (0,05% от массы тела животного), ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС (0,05% от массы тела животного).

4. Практические предложения На основании проведенных исследований предлагаются для практики синбиотический комплекс ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для коневодства и нормативная документация по его изготовлению, контролю и применению, утвержденная директором ВНИТИБП:

-стандарт организации на посевные серии Ь.р1ап1агит штамм М-30;

- опытно-технологические регламенты изготовления препаратов ЛАКТОПЛАНТ и ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС;

- стандарты организации на препараты ЛАКТОПЛАНТ и ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС;

- инструкция по применению синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС.

5.Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Самуйленко, А.Я. Кормовые добавки на основе сиибиотических комплексов - перспективы разработки и применения / А.Я. Самуйленко, ЛА. Неминущая, Е.И. Титова, Г.И. Воробьева, О.В. Провоторова, Е.О. Литвинова // Ветеринария и кормление,- 2012,- №2,- С.22-23.

2.Титова, Е.И. Применение синбиотического комплекса в последнюю четверть жеребости кобыл / Е.И. Титова, А.Я. Самуйленко, JI.A. Неминущая, В.И. Еремец // Коневодство и конный спорт,- 2011.-№2. - С.22-23.

3. Неминущая, Л.А. Перспективные биотехнологии получения новых синбиотиков для сельскохозяйственных животных / JI.A. Неминущая, Т.А. Скотникова, Е.И. Титова, О.В. Провоторова, Н.К. Еремец, И.В. Бобровская, З.А. Канарская // Вестник Казанского технологического университета. - 2012,- №4. - С.82-87.

4. Титова, Е.И. Положительные аспекты применения пробиотиков в коневодстве / Е.И. Титова // Естественные и технические науки. - 2011.- №6. - С.93-95.

5.Титова, Е.И. Применение пробиотической добавки жеребым кобылам / Е.И. Титова // Проблемы современной биологии: материалы III Международной научно-практической конференции. - Москва, 2012. - С.55-59.

6. Титова, Е.И. Пробиотики в коневодстве / Е.И. Титова // Современное состояние естественных и технических наук: материалы V Международной научно-практической конференции,- Москва, 2012. - С.59-64.

7.Титова, Е.И. Экологически безопасные препараты на основе пробиотиков и их применение в коневодстве / Е.И. Титова // Научные исследования - основа модернизации сельскохозяйственного производства: материалы Международной научно — практической конференции. - Тюмень, 2011. -С.74-77.

8.Неминущая, JI.A. Биотехнологические аспекты получения синбиотических комплексов для сельского хозяйства / Л. А. Неминущая, А.Я. Самуйленко, Г.И. Воробьева, Е.И. Титова, О.В. Еремец // Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы VI Московского Международного конгресса. - Москва, 2011.-С.215-216.

9.Самуйленко, А.Я. Опыт создания и применения стандартных образцов предприятия для обеспечения и контроля качества иммунобиологических препаратов для ветеринарии / А.Я. Самуйленко, Т.А. Скотникова, J1.A. Неминущая, J1.C. Люлькова, Н.К. Еремец, М.А. Малышева, Н.И. Ким, О.В. Еремец, Е.И. Титова // Стандартные образцы в измерениях и технологиях: материалы III Всероссийской научно-технической конференции с международным участием. - Екатеринбург, 2011. - С.143-144.

Заказ № 46ю Объем: 1 пл. Тираж: 120 экз. Отпечатано в ООО РПК «Триумф» 129344, г. Москва, ул. Искры, дом 31, корп. 1. офис 601. www.triumfprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Титова, Екатерина Игоревна, Щёлково

61 12-3/900

ГНУ «ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ

ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА СИНБИОТИКА ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС, ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ В КОНЕВОДСТВЕ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2012 г.

ОСНОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВГНКИ - Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ФГУП НИИ ГосГенетика, г. Москва)

ВНИВИП - Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства

ВНИТИП - Всероссийский научно-исследовательский технологический институт птицеводства

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

КФХ «Гришин » - конно-фермерское хозяйство «Гришин»

AJIT - аланинаминотрансфераза

АнтА - антагонистическая активность

асв - абсолютное сухое вещество

ACT - аспартатаминотрансфераза

БАВ - биологически активные вещества

БМ - биомасса

BP - вспомогательные работы ГГТ - гамма-глутамилтранспептидаза ДИ - доклинические исследования ЖКТ - желудочно-кишечный тракт КЖ - культуральная жидкость КОЕ - колониеобразующие единицы ЛДГ - лактатдегидрогеназа ЛЖК - летучие жирные кислоты МПА - мясо-пептонный агар НД - нормативная документация ОМ - обезжиренное молоко ПР - подготовительные работы

PB - редуцирующие вещества

РЭК - развивающиеся эмбрионы кур

СП - санитарные правила

СТО - стандарт организации

ТП - основные технологические процессы

ТУ - технические условия

ФЗ - ферментолизат отходов зерносырья

ФР - физиологический раствор

ЩФ - щелочная фосфотаза

в/б - внутрибрюшинно

GCP - Good Clinical Practice (надлежащая клиническая практика) GLP - Good Laboratory Practice (надлежащая лабораторная практика) GMP - Good Manufacturing Practice (надлежащая производственная практика)

M.S. - Master Seed (главный посевной материал)

P.S. - Production Seed (производственный посевной материал)

S.L.S. - Seed Lot System (система посевных материалов)

SPF (specific pathogen free) - свободный от специфических патогенов

W.S. - Working Seed (рабочий посевной материал)

СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................... 12

1.1. Состояние коневодства в России........................... 12

1.2. Особенности пищеварения и обмена веществ у лошадей.......................................................... 15

1.3. Кормление лошадей........................................... 25

1.4. Критерии содержания лошадей............................. 33

1.5. Факторы, индуцирующие изменение кишечной микрофлоры...................................................... 36

1.6. Пробиотики, пребиотики и биологически активные кормовые добавки в коневодстве........................... 39

1.7. Заключение по обзору литературы........................ 59

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..................... 61

2.1. Материалы и методы.......................................... 61

2.2. Результаты исследований.................................... 72

2.2.1. Характеристика Lactobacillus plantarum, штамм М-30. 72

2.2.2. Изготовление и контроль посевного материала......... 74

2.2.2.1. Посевной материал Lactobacillus plantarum, штамм

М-30 для пробиотика ЛАКТОПЛАНТ.................... 77

2.2.2.2. Посевной материал B.subtilis для пробиотика АВИСУБТИЛ................................................... 82

2.2.2.3. Посевной материал дрожжей S.cerevisiae и гриба F.sambucinum для биологически активной добавки ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС............................................. 86

2.2.3. Технология изготовления и доклинические исследования препаратов (ЛАКТОПЛАНТ, АВИСУБТИЛ и ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС), изготовление 92 опытных серий...................................................

2.2.3.1. Технология изготовления пробиотика ЛАКТОПЛАНТ... 93

2.2.3.2. Технология изготовления пребиотической добавки ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС............................................... ЮО

2.2.3.3. Изготовление и доклинические исследования опытно-промышленных серий препаратов.............. 108

2.2.4. Определение эффективности синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС в коневодстве для жеребых кобыл и жеребят............................................... 112

2.2.4.1. Безвредность и эффективность синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для кобыл в период случки... 113

2.2.4.2. Определение эффективности применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для жеребых кобыл в последнюю четверть жеребости........................... 121

2.2.4.3. Эффективность применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС жеребятам-отъемышам....... 128

2.2.4.4. Эффективность применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС для жеребят-годовиков......... 136

2.2.4.5. Разработка способа применения синбиотического комплекса ЛАКТОБУСТИЛ-ФОРТЕ......................... 145

2.2.4.6. Оценка экономической эффективности применения синбиотика..................................................... 145

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ......................................................151

4. ВЫВОДЫ................................................................................................................159

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ............................................161

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................162

7. ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................................................188

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Как показывают научные исследования, стрессовые воздействия на поголовье при перевозке и жеребят при отъеме, несбалансированное питание и нарушения санитарных норм содержания лошадей вызывают значительные изменения в экологической нише штаммов микроорганизмов желудочно-кишечного тракта, изменения популяционного уровня кишечных бактерий. Стало очевидно, что несоблюдение зоогигиенических норм и кормления приводят к ослаблению здоровья, нарушению нормальной работы желудочно-кишечного тракта лошадей [24, 59, 94].

В связи с этим все более актуальной становится проблема профилактики, лечения и нормализации микробного баланса в пищеварительном тракте, минимизации последствий антибиотикотерапии, повышения эффективности выращивания и сохранности лошадей. Один из способов ее решения - разработка и применение лекарственных средств нового поколения, которые характеризуются высокой биодоступностью и положительно влияют на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта животных, что приводит к оздоровлению всего организма в целом и снижению микробизма окружающей среды. К их числу относятся эубиотики - пробиотики и пребиотики [2, 24, 82, 148].

В последние годы накоплен значительный материал, отражающий действие различных пре- и пробиотических препаратов на сельскохозяйственных животных, птицу, человека. Наиболее перспективным является создание симбиотиков - комплексов про- и пребиотиков, которые могут быть использованы для создания лечебно-профилактических препаратов, обладающих способностью положительно воздействовать на здоровье организма хозяина, повышать его

естественную сопротивляемость, не оказывая при этом какого-либо отрицательного влияния на организм [33, 59, 104, 160]. Многие из симбиотиков влияют на гуморальный и клеточный иммунитет, зоотехнические показатели, могут служить естественными стимуляторами роста и обладать токсико- и радиопротективным действием, снижающим влияние неблагоприятных экологических факторов.

При разработке нового препарата необходимо учитывать перспективы его конкурентоспособности на рынке, одним из основных составляющих которой является качество. Под качеством лекарственного средства (JIC) понимается, прежде всего, его пригодность к применению, т.е. эффективность и безопасность [92].

В связи с принятием Закона РФ «О Техническом Регулировании», подготовкой России к вступлению в ВТО, установлению партнерских отношений с зарубежными фирмами и требованиями стандартов ИСО 9000: 2000 появились новые подходы к разработке, производству и применению JIC. Эти подходы реализованы в международных правилах лабораторной, клинической и производственной практики (Good Laboratory Practice - GLP, Good Clinical Practice - GCP, Good Manufacturing Practice - GMP), которые ужесточают контроль безопасности и эффективности JIC на всех этапах его разработки, производства и применения [56].

Правила GLP делают обязательными доклинические исследования эффективности и безопасности лекарственных средств. В законе «Об обращении JIC» [153] установлена необходимость проведения доклинических исследований и клинических испытаний регистрируемых продуктов [55, 121, 122, 150, 200, 211]. Планирование и проведение доклинических исследований (ДИ), связанных с определением безопасности исследуемого вещества, осуществляется в соответствии с Правилами GLP (Good Laboratory Practice) и требованиями Директивы ЕС

86/609/ЕЭС от 1986 г. «О защите животных, используемых в экспериментальных и научных целях» [54, 92, 114, 115, 116]. Применение этих Правил обязательно при разработке и внедрении новых ЛС. Схема, по которой реализуются ДИ, конкретизируется в зависимости от того, к какому классу относится препарат (иммунобиологический, фармацевтический, БАД) [46].

Таким образом, проблема создания для коневодства новых эффективных отечественных синбиотических комплексов является актуальной, а ее решение представляет научный и практический интерес.

Цель работы и задачи исследований. Цель работы - разработать рецептуру нового синбиотика, технологию его изготовления и способ применения в коневодстве для жеребых кобыл и жеребят.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- научно обосновать состав синбиотического комплекса (пробиотики + пребиотическая кормовая добавка) для применения в коневодстве;

- исследовать характеристики штамма Lactobacillus plantarum М-30, используемого для изготовления нового пробиотика ЛАКТОПЛАНТ;

- определить состав биологически активной добавки ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС, обладающей пребиотическими свойствами;

- освоить технологию изготовления препаратов ЛАКТОПЛАНТ и ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС с использованием универсальной питательной среды для культивирования микроорганизмов;

изготовить опытные образцы препаратов и провести их доклинические исследования;

- определить эффективность применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС (ЛАКТОПЛАНТ+АВИСУБТИЛ+ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС) для жеребых кобыл и жеребят;

- разработать способ применения синбиотика и коммерческое предложение по его использованию в коневодстве.

Научная новизна. Разработан новый синбиотический комплекс ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС и способ его применения для жеребых кобыл и жеребят различных возрастных групп. Показано, что применение синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС в коневодстве способствует улучшению физиологического состояния животных и повышает неспецифическую резистентность их организма.

Для обеспечения высокой пробиотической активности нового пробиотика ЛАКТОПЛАНТ выбран штамм лактобактерий Lactobacillus plantarum, штамм М-30 и показано, что по уровню антагонистической активности к патогенным микроорганизмам и резистентности к антибиотикам он удовлетворяет требованиям, предъявляемым к продуцентам пробиотиков.

Разработана новая биологически активная пребиотическая добавка ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС, обладающая высокой питательной ценностью, состоящая из комплекса биомассы инактивированных клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, шт. diastaticus ВКПМ-у-1218 и биомассы мицелиального гриба Fusarium sambucinum.

Эффективность применения нового синбиотика в коневодстве для жеребых кобыл и жеребят определена с использованием широкого спектра показателей: клинические исследования (показатели температуры, пульса и дыхания, состояние пищеварительной системы, наличие аппетита, состояние волосяного покрова); гематологические и биохимические показатели крови; параметры жеребят-отъемышей (высота в холке, вес).

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и предложены:

- новый синбиотический комплекс для коневодства;

- новый пробиотик ЛАКТОПЛАНТ и биологически активная добавка ЦЕРЕВЕТ-ПЛЮС, входящие в состав комплекса;

- способ применения синбиотика для лошадей при смешивании с кормом.

По результатам испытаний комплекса в крестьянском фермерском хозяйстве показаны его безопасность и эффективность.

Результаты исследований использованы для обоснования разработанной во ВНИТИБП и одобренной Президиумом Россельхозакадемии (протокол №4 от 21.04.2011) «Концепции научного обеспечения создания и развития региональных биологических предприятий по производству препаратов для защиты животных, растений и средств, повышающих эффективность функционирования агропромышленного комплекса Российской Федерации», а также в лекционном материале «Пробиотики в коневодстве» для специалистов КФХ «Гришин».

Основные положения, которые выносятся на защиту:

- характеристика штамма лактобактерий Lactobacillus plantarum, штамм М-30 по показателям специфической (пробиотической) активности;

- схема доклинических исследований безопасности и активности новых препаратов, гармонизированная с международными требованиями;

технология изготовления препаратов с использованием универсальной питательной среды на основе ферментолизата отходов зерносырья;

- показатели питательной ценности пребиотической добавки;

- эффективность применения синбиотика в коневодстве для жеребых кобыл и жеребят различных возрастных групп;

- способы применения синбиотика ЛАКТОСУБТИЛ-ХОРС в коневодстве для жеребых кобыл и жеребят различных возрастных групп.

Апробация результатов работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены: в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий на

заседаниях ученого совета и методической комиссии ВНИТИБП (2010-2011 гг.); на Международном конгрессе «Биотехнология - 2011»; на трех Международных конференциях, проводившихся в Москве, Тюмени, Екатеринбурге. (2011-2012 гг.).

и

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Состояние коневодства в России

Со времени приручения человеком дикой лошади прошло почти 6 тыс. лет. За это время на ее основе в мире выведено около 250 пород лошадей. Они весьма разнообразны: рост породных лошадей колеблется от 38 см до 2 м и более, живая масса - от 13 кг до тонны и более, но каждая из них удовлетворяет определенные потребности человека, служит ему. Развивающий научно-технический прогресс не уменьшает роли лошади в жизни человека, а только меняет структуру направлений конеиспользования [6].

Коневодство, отрасль сельскохозяйственного животноводства, характеризующаяся рядом специфических особенностей. Основной из этих особенностей является главный вид ее продуктивности - различные виды механической работы, полезной для человека. Второй особенностью отрасли является ее четкое разделение на племенное коневодство, называемое коннозаводством, и коневодство пользовательское, в котором мы различаем два направления - рабочее и продуктивное. Такое разделение вызвано тем, что одновременное использование лошади в рабочих, продуктивных или спортивных целях и ее эффективное племенное использование практически не представляется возможным [75].

Когда-то Россия по численности лошадей была буквально «впереди планеты всей» - в 1916 году 38 млн. голов! Первая мировая война, революция и Гражданская война унесли почти половину лошадей. К 1929 году поголовье было во многом восстановлено - 34,6 млн. - главным образом благодаря тому, что лошади были незаменимыми и на селе, и в качестве транспортного средства в городах. Только в одной Москве в начале 30-х годов использовали свыше 30 тыс. тягловых, или ломовых, лошадей [86].

К 1934 году поголовье лошадей сократилось более чем на 55% и составило 15,7 млн. голов. Однако своевременно принятые правительственные меры способствовали значительному росту численности лошадей, и к 1941 году их поголовье достигло 21 млн.

Временная оккупация немецко-фашистскими захватчиками части территории СССР, куда входили основные коневодческие хозяйства, нанесла большой урон данной отрасли, к 1946 году в стране осталось всего 7 млн. лошадей [7].

Как свидетельствует новейшая история, перестроечные годы и распад Советского Союза привели к значительному сокращению поголовья всех видов сельскохозяйственных животных, понесло большой урон и коневодство (см.табл.1) [5,86].

За 1991-2006 годы конское поголовье во всех категориях хозяйств России уменьшилось с 2618 до 1304,4 тыс. голов, в 2 раза. В 2007-2009 годах наметилось устойчивая тенденция увеличения численности лошадей с 1304,4 до 1375,3 тыс. голов (5,4%) [67].

По характеру хозяйственного использования лошадей отрасли по-прежнему сохранились четыре основных направления: рабоче-пользовательное, продуктивное (молочное и мясное табунное), досуговое (конный спорт, туризм и прокат лошадей) и племенное коневодство.

Ведущим направлением в системе внутриотраслевого разделения труда является рабоче-пользовательское коневодство. На начало 2010 года во всех категориях хозяйств имелось 994 тыс. рабочих лошадей, включая молодняк, что составляет 72,3% от общего конского поголовья. Лошади, в качестве животного тягла, широко используются на внутри хозяйственных перевозках отдельных непоточных грузов на короткие расстояния, обработке дачных участков и огородов и для разъездов. Особенно значительное поголовье рабочих лошадей занято на пастьбе под верхом продуктивного скота всех видов.

Таблица 1

Динамика численности лошадей в ряде стран мира (тыс. гол.)

Страна 1964г 1966т 1971г 1981г 1985г 1988г 1990г 1998г

Китай 7600 7600 8883 11100 10978 10691 10294