Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Надмолекулярная организация и регуляция активности ферментов катаболизма фосфотриоз

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Надмолекулярная организация и регуляция активности ферментов катаболизма фосфотриоз"

Р1'Б од

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. Г.К.БУНЯТЯНА

На правах рукописи

НАЗАРЯН Карен Бабкенович

НАДМОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ КАТАБОЛИЗМА фОССуОТРИОЗ

(03.00.04. - биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ереван - 1993

Работа выполнена в лаборатории органоспецифических соедим{»мий Института молекулярной биологии HAH Армении

Официальные оппоненты: член—корреспондент HAH Армении

д.б.н., профессор Оганесян С.С., " д.б.н., профессор Акопян Ж.И., д.б.н., ст.н.с. Бурбаееа Г.Ш.

ведущая организация: Институт биохимии им. Баха.РАН

Защита состоится ^_____^gurn^p^f 1993 г. в /¡Z часов на

заседании специализированного совета Д 005.15.01 при Инстит ичохимии (-»и. Г.Х.Бунмтяна HAH Армении, Ереван, 357044, ул. П.Севака 5/1.

С дигtf-ртацирй можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. Г.Х.Бунятяна HAH Армении.

Автореферат разослан ""1993 г.

Ученый секретарь

специализированного совета, i докт'эр биологических наук, / JJ

| »¡.г»фес«:с!р / ¡fps * * / А.А.Симонян

(JUatt^-*-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее десятилетие стали складываться новые представления об op г аниаации метаболизма, связанные с Формированием понятий о надмолекулярной организации Ферментов. Надмолекулярные ферментные комплексы, вероятно, являйтея одним из промежуточных звеньев между ферментами и органеллами в иерархии клеточных структур. В настоящее время ступени молекулярной и надмолекулярной организации метаболизма можно представить таким образом; ферментная субъединица, четвертичная структура ферментов, надмолекулярные ферментные комплексы и конъюгаты, клеточные органепли, клетки, ткани и т.д., каждая с присущей ей системой регуляции. Примеров обнаруженных к настоящему времени надмолекулярных ферментных комплексов множество. К наиболее} изученным из ник нужно отнести мультиферментный комплекс Prom у банттрий, пируватдегидрогемааный комплекс и др. Их существование маде.гно установлено как in vitro, так и in vivo. На столь очевидна ситуация при комплексообрг.аовании оодорастооримых Ферментов. Известно, что внутриклеточная кон-I центрация цитоплазматических водорастворимых белков достигает ■ 250—400 мг/мл. При таких высоких концентрациях белки in vitro самопроизвольно агрегирует. Естественно предположить, что а клетке цитоплазматические балки структурированы и, вероятна, целенаправленно организованы. Предположение о структурно-функционально Й организации гликолитических Ферментоз зародилось вслед за гипотезой о надмолекулярной организации водорастворимых белков. Это неудивительно, поскольку известно, что, во — первых, основную часть водорастворимых белков цитоплазмы < 65% водорастворимых белков Е. coli и более 50Х ммеечных белкоа> составляют гликолитические ферменты; во-вторых, гликолитические Ферменты, являясь на протяжении многих лет самым популярным объектом о биохимии, изучены весьма обстоятельно. Кроме того, гликолиз, по-видимому, самый консерватизм^ метаболический путь. Это предоставляет возможность широких обоб>эемий для многих еи/toe клеток и тканей при изучении оакомомермостей его организации в одной органе. Вероятно, в этом отмокюиии среди всех других метаболических путей гликолиз уникален. Поэтому многие исследования надмолекулярной организации гликолиза у млекопитамщих были ограничены самым изученным и удобным объектом — ферментами из мышечной ткани. Однако

Использованные сокращения: Е-енолаоа, РГМ-фосфоглицератмутаза, П.Ч—пируваткиназа, ЛДГ-лактатдегидрогеназа, ГК-гексокинаэа, РфК -фосфофруктокиназа, А-альдолаза, ГАРЙ.-глицеральдегид-3-фосфат— дегидрогеназа, РГК-фосфоглицераткиназа, ,2-Рг —2-фосфоглицерат, З-Рг -з-фосфоглицерат, Реп -фосфоенолпируоат, ГаР -глицер-альдегид-3-фосфат, Рг-2,3 -2,3-дифосфоглицерат, ФИТЦ -флуорес-цеин изотиоцианат, ИфА —иммуноферментный анализ

s последние годы в результате исследований гликолиза в ЦНС выявилась более высокая степень сложности и гетерогенности г ли— политических ферментов. Известно, что в UHC, как и а мышцах, гликолиз всецело зависит от единственного субстрата - глюкозы, которая является практически единственным источником энергии для ткани головного мозга, т.е. гликолиз для ЦНС является жизненно важным путем метаболизма. Изоферментный спектр гликолитических Ферментов в ЦНС имеет свои особенности, несвойственные ни одному другому аргону. Они выражаются в том, что ряд гликолитических ферментов в нервной ткани представлен уникальными или характерными для ЦНС изоферментами. Вначале специфичность изоф&рментов была установлена для нейроиспециФИ— ческой енолаэы и 'альдолаэы С4. Затем был выявлен ряд физика — химических и Функциональных отличий и для других ферментоо, локализованных в ЦНС, по сравнению с ферментами из других органов. В этой связи представляется интересным провести сравнительное изучение комплексообраэук'-чей способности мозгоспе— цифических и неспецифических изоферментов. Возможно, это поможет понять степень специализации надмолекулярной организации ферментов в ЦНС и других органах. С другой стороны, до настоящего времени в центре внимания исследователей находились в основном ферменты, локализованные в дивергентных точках метаболических путей. Это обычно сложные регуляторные ферменты, активность которых контролируется множеством факторов. Учитывая, что для получения однозначных отоотоэ, как правило, хгелатепько иметь дело с наиболее простой системой, сохраняющей изучаемые? свойства, представляется интересным проведение сравнительных исследований на ферментах, находящихся в дивергентных и нэди-вергемтных участках метаболических путей. Действительно, если комплексообразование играьт вакну» роль о физиологии клетки, то структура и функции комплексов должны различаться о зависимости от того, какие ОерментЦ в ходит о ого состав — "неравновесные", регуляторные, находящиеся в точках ветвления пути или нет. На наш взгляд, целесообразна провести подобное» исслэдсзл— ние, выбрав в качестве объекта изучения систему форментса, катализирующую обмен фосфотриоз. Это иаоферменты Е (альфа, Сета и гамма), РГМ (ММ и ВВ> и ПК (М1 и М2), которые яолетэтев весьма интересными объектами исследования надмолекулярной организации гликолитических ферментов. Реакция, катализируемой Е, находится на недивергентном участке гликолиза, а Е известна как "равновесный" нерегуляторный оермонт. РГМ — тскже типичный равновесный "нерегуляторный" фермент, локализованный О нодивергентном участке, а ПК — один из ключевых регулятормым ОСр— ментов гликолиза, находящийся в точке ветвления пути« Цель и задачи исследования. Основная цель наставшей работы заклиналась в изучении белок - белковых взаимодействий гликолитических ферментов катаболизма фосфотриоз и выявлении ООО—

можностей регуляции их активности как при комплексooépазова-нии, так и при воздействиии на них физиологически активных соединений эндогенной природы. Отсюда витекамт задачи исследования: изучить взаимодействия различных изоферментоо РГН, Е и ПК с применением известных методов и разработать пешие адекватные методы для выявления комплексообразования "растворимых" слабых комплексов гликолитических ферментов. Изучить дейстпие физиологически активных аминокислот, метаболитов и гормонов на свойства нерегуляторных и регуляторних ферментов, их кинетические характеристики.

Научная ночизна работы. При помощи метода измерения анизотропии влуоресценции изоферментов Е, меченных СИТЦ, впервые пока— осно взаимодействие бета и гамма изоферментов Е с ПН и ВВ изо— ©еригмтами РГМ и с 111 изооериеитом ПК. Как йлчестаенные, так и количественные характеристики комплексов подтверждаются при изучении их методами кинетического анализа, гель—Фильтрации в объем» сефадокса, а также специально разработанного нами метода сэндвич ИфА. При оэаимодойстоии Е с РГМ активность первой подавляется по типу смешанного ингибирования, которое снимается 2,3—диг>ос©оглицератом — кофактором РГМ. Единственный эффективный эндогенный ингибитор енолазной реакции — ГаР, при совместном действии с РГМ действует кооперативно. Показано, что стероидный гормон эстрадиол—17бета оказызает индуцирующее влипни® только на регуляторные ферменты — ГК, РОК и ПК, не меняя актизности Е, РГМ и других "равновесных" гликолитических фер— нентоэ. Активность ПК меняется при краткосрочных экспозициях гормона, однако о этом случае изменяется но суммарная фермой— татизная актизиость, а происходит перераспределение мембрано— связанного, применбранного и водорастворимого пулов фермента, что, вероятно, обеспечивает адекватное воздействии гормона изменения актизности ПК.

Практическая оначимость работы. Проведенное исследование дает козу» информацию о формировании комплексов гликолитических фермантеэ. Согласно результатам работы, большая часть РГМ, Е и ГЕ< ln vivo могут существовать о составе биферментных комплексов. Обнаруженное? каление открыэает возможности для создания принципиальна нспого вида иммунодиагностикумов, сконструированных на осноэа антител ц биферментным конъпгатам, применение которых молот служить диагностическим тестом при различных онкологических и нервно-психических заболеваниях. Определение бифермэнтного комплекса Е—РГМ или Е—ПК создаст предпосылки для позыоеНия диагностической ценности такого широко известного диагностического маркера, каким является нейронспециоическая Е. ЕЗыпаленные закономерности регуляции активности РГМ, Е и ПК могут дать возможность целенаправленного воздействия на их активность in vivo через изменение гормонального статуса организма.

-h-

йпробация работы. Результаты работы докладывались на! Всс-сокюмой конференции па ¿нахимии нервной системы, Ереван 1932, Сов^тско-Фрамцуоском симпозиуме "Структура и функции белков и нуклеиновых кислот", Цхалтубо, 1982, XVI конференции ФЕБО, Москва, 1984, Международном симпозиуме "Химическая физика ферментативного катализа", Таллинн, 1987, Международном биохимическом конгрессе, Прага 1988, VII Европейской нейрохимической конференции, Лейпциг, 1989, конференциях ИМБ "Вопросы молекулйрно—клеточной биологии", 1985, 1983, Республиканских конференциях по физико-химической биологии 1986, 1989 и др. Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 16 статей.*

ОС.ъсн и структура работы. Работа изложена на 185 страницах машинописного текста и содержит 50 рисунков и 14 таблиц. Библиография включает 287 наименований литературных источников на русском и английском языках.

В главе 1 (Общее введение) излажена точка ¡зрения автора на проблему надмолекулярной организации ферментов, q частности водорастворимых Ферментов и ее основной части гликолитических ферментов.

В главе 2 (Обзор литературы) приводятся современные представления о надмолекулярной организации гликолитических серментоо, обсуждаются возможные пути такой организации и ев роль в регуляции метаболизма.

В главе 3 приводится описание материалов и методоз исследования. В работе использованы высокоочищенныо препараты РГМ, Е, ПК и других гликолитических ферментов, полученныа из различных скелетных мышц, тканей головного мозга и других срганоз крупного рогатого скота и человека- Приаодится описаниа мсггодоа их очистки, в том числе разработанная мешая мэтодика очистки Е и ПК с использованием гидрофобной хроматографии, при помоги которой удалось получить препарат нейрснспгцифичсской Е с наивысшей удельной активностью. Описываются матады определения основных фиаико-химических и иммунологических свойств аыгзука— оанных ферментов, характеристики модиоицирозенних С'ЛТЦ препаратов ферментов, которые служили для аыкэлския фермент—Сгрмзн— тных взаимодействий методом анизотропии Олуоресцснции. Краткоа содержание остальных глао приводится ними.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для исследования роли фермент-ферментных взаимодействий о физиологии клетки необходимо предварительна доказать их наличие в модельных экспериментах in vitro. После установления факта взаимодействия, выявить степень его специфичности, распространенности для ферментов из различных источников в модельных системах и затем попытаться перенести полученные результаты на живые клетки. Первая проблема находится в центре внимания энзимо— логов на протяжении последних десяти лет, а пути к решении второй проблемы только нащупываются и, судя по всему, она станет приоритетной а повестке дня исследователей будущего десятилетия.

Необходимым условием для изучения комплексообразования in vitro является наличие соответствующих высокоочищенных феомен-то», совершенно свободных от поимесей других активностей. Таким образом, первоочередной задачей настоящего исследования было очистить и охарактеризовать гликолитическиз ферменты: РГМ, Кф 3.4.2.1, Е, КО 4.2.1.11 и ПК, Кф 2.7.1.40.

1. ОЧИСТКА И СВОЙСТВА РГМ, Е и ПК

Источником ферментов служила в основном Фракция водорастворимых белков тканей головного мозга крупного рогатого скота.

Очистка РГМ состояла из высаливания сульфатом аммония, хроматографии на КМ— и ДЭАЭ — целлюлозе, гель — фильтрации на се— Оадексе G—130. Препарат очищен в 145 раз, а удельная активность составляла 156 ед./мг мин. На всех стадиях очист»:.и, содержащие РГМ Срвкции элиирооались в виде единственного пика, что свидетельствует об отсутствии в ткани головного мозга нескольких изо-фгркомтоз РГМ или ее множественных форм. Это согласуется с литературными данными о существовании о ЦНС одного иэофермента РГМ (Carrseraa и СОлат.19S3, Slouqult и сааат.1986). Те препараты РГМ, которыа использовали для изучения Фермент—ферментных взаимодействий, подвергали дополнительной очистке препаративным электрофорезом о ПААГ, полностью исключающим возможность присутст— сия примэсной енолазной активности, но следовая фосфатазная активность сохранялась, свидетельствуя о бифункциональном характере фермента. Сопоставление полученных в настоящей работе результате» по изучению основных физико-химических свойств ВВ изофер— мента РГМ из нервной ткани с результатами ряда авторов не выявило су!%эстоенных различий. Иммунологические свойства РГМ изучали о реакции двойной иммунодиффузии антисыворотки к препарату моэ— гозого фермента и экстрактов головного мозга, печени, сердца, мы&ц и семенников крупного рогатого скота. При этом было показано, что по сравнении с экстрактом головного мозга, антисыооротка с экстрактами других органов дает значительно более низкий титр. О продолжение этих исследований полученная антисыворотка была протестирована а реакции иммунопреципитации мутазной активности и» экстрактов различных тканей. Она осаждает из экстракта ткани

-е-

л

1

О,в 1,2 О

[НлС13 н

о,4

Рис.1 Подавление активности РГМ антисызороткой к ВВ РГМ о экстрактах тканей 1-гоЛооного мозга, 2-скалатных иищ, 3-ссрдца, 4-печени крупного рогатого скота.

Рис.2 Действие №С1(а) и КС!(б) на активность ьльса <1>» бета <2) и гамма (3) иэадермвитоа Е.

Ло оси ординат - процент от начальной ектизности Сгрмента.

о,2

о,1

Ампотропня 1 А

Анизотропия ( • )

О,2

»О 10

Рис.3 Концентрационная г «зксимость анигэтролин СИТЦ-мзчсннмх альоа и гамма изовсрнснтоэ Е. а-алъфа Е в присутствии 3 мМ хлорида магния, б— и о—гамма Е о присутствии ЗмМ клорида магнии (0), то пс + 50 мМ 2Рг и + 50кН ЭДТЛ 1А> о ЗОкМ имидааольнзм Суогрэ, рН 7,3, при 20 С. Спло^иио линии <а, С и □) - тсаротичоскиа криоыэ, рассчит^нмиэ для диссоциации мономар-диизр с Кс1 3, 0,03 и 1 мхН соатоотстсснно. Сзличинд удельной Слуоросцсгмции от концентрации но оазисит.

гало«мого мозга 05Х начальной активности (рис.1). То жгг количество антисиворо-íKM Из экстракта прмрии, сердца и скелетных мышц иейтрллиаует cootbstcto»«<o 20, ЗО и 107. активности ргм. Это свидетельствуйт ой иимуиологической нрил'*нтичипчти f! м голодного нозга и флрмента из других тканей. Допалмитрльнис иссл1?л"«дния, проведенные о этой области методом двойной иммуноля^уоии, выявили лишь частичную иммунологическую специфичность прегюратав G13 РГМ из головного моага и сердца.

Енолаза у млекопитающих представлена тремя го«одиж?риыми маоФерментами (альфа—альфа, бета—бета и гамма-гакма) . В головной мозгу млекопиТАищих иариду с мойр ом длимой гамма—гам*.л £ существует локализованная в глиальмих элементах изоФорма £, очень похожая на альфа-альфа изофе-рмент печени или идентичная ему. Исходя из »того, нами была разработана такая методика выделения, которая позволяла одновременно получать и альфа—альфа, и глмма-гамма иооферменти, используя для их получггния как гомо-, Тек и гетеродин^ш. При фракциниропании оодорлствор»^>аых t'i'пчí^h f яысалиаа««$ихся сульфатом аммония между 40Х и 7G X нлеи-^енмрн, ^олазная активность делилась на три фракции, г альфа—

альфа, альоа-гамма и гамма—гамма ияофермеяты. Затем апьОа-а;;\,Фа мэофермент очигчали на колонке с Й.ЭЛЭ—ц при рН 5,0. На этой стадии для повышения выхода выделения о некоторых случаях вали и фракцию, содержащую альоа-гамма гетеролииго. Впоследствии вместо рехроматографии в кислой среле или изоэлеюгороску— сироаания, дакпцими низкий о и ход ио-яа малой емкости колонки, стали использовать гидрофобную хроматографии» ма пктил-сгОдрозе при рН 7,5, что позволило повысить как выход Фермента, так и ого удельную активность. Несмотря на большое число описанных и литературе методов выделения гамма—гамма изофермента, Hcnojtt.-асюанная впервые нами гидрофобная хроматография на октил—софа— розе в качестве последней стадии очистки, вероятно оказалась оптимальной, потому что позволила получить препарат с tíantiwcuiftrt удельной активностью (103 ед./мг белка мин). Указанной метод очистки достаточно универсален, т.к. применим и для тканей мозга чолоаека. При воздействии 0,2—1,2 М растворов МаС1 и КС1 выпалена существенное различие о степени устойчивости к ним альфа—альфа, бета—бета и .гамма-гамма изоферментога Е (рис.2). Бета—бета и гамма—гамма изоферменты при 30 мин инкубации сохраняет ВО—90Х начальной активности, тогда как алы>а-апьОа ияоФер-мент — лишь 35-45Х. Для исследования причин наблмдаешх различий изучено действие сульфатоо, хлоридоз и бромидов одновален1— ных металлов на лктионость альфа—альфа и гамма—гамма иэофермон-тоа Е головного мозга. Наблюдаемые различия о степени мнлктит»-pymsero действия той или иной соли можно объяснить расположением соответстпуюимх анионов и катионов.в "лиотропном" ряду. Что »а касается неодинакового действия одних и тех же салсй на альфа—альфа и гамма—гамма изоферменты, то, вероятна здесь преобладают электростатические взаимодействия, и различия облуслоо— /юны величиной сродства магния к апофермемту. Действительно, как показывают данные по определению Km для магния, ее значение на порядок выше у альфа-альфа, по сравнении с гамма—гамма изо-

Ферментом. Различная степень сродства изоферментов к магнии может приьести к различным значением Kd для альфа—альфа и гамма гамма иэофе?рментоп. Для определения Kd применяли метод анизотропии Флуоресценции меченных изоферментое Е. Поскольку Е млекопитающих является димером, то данные,' показанные на рис.3, сравнивали с теоретическими кривыми, рассчитанными для равновесия типа димер-мономер, при этом использовали Кс, приведенные в подписи к рисунку. Димер гамма—ганка Е был более стабилен в присутствии ионов Hg <Kd=0,03 мкН», в то время как о присутствии ЭДТА он делался более диссоциируемым <Kd-l мкМ)- Димер альод—альфа Е менее стабилен при концентрациях ниже 1 мкМ, что свидетельствует о значительно более высоких значениях его Kd. Это подтверждает результаты предыдущих исследований о более оы— с окон устойчивости гамма-гамма Е к различным денатурирующим воздействиям и, следовательно, инактивацию Е в таком случав можно объяснить диссоциацией димера о неактивный мономер.

ПК из мозга традиционно отождествляется с мышечным изофер— ментом М1, но, несмотря на это, он относительно плохо изучен. Известны лишь единичные работы па очистке и изучению его свойств. После гомогенизации, экстракции и центрифугирования для дальнейшей очистки использовали фракцию, высаливающуюся между 50 и 70У. насыщения сульфатом аммония. Ее фракционировали на колонке с фосфоцеллюлозой Р11 и с октил—сефарозой. Конечный препарат фермента имел удельную активность 292 ед/мг белка. Он содержал менее О,17. еноллэнай активности, РГМ активность не обнаружена. Литературные данные показывают близость структурных и Функциональных характеристик М1 изофермента, выделенного из различных источников. Во всех проанализированых нами работах такого рода авторы ограничивались очисткой и изучением свойств мозгового фермента и сравнением их с данными других исследователей. Для выявления же минимальных различий о соойстоах описанных Ферментов этого явно недостаточно, ввиду неизбежных различий в методике очистки, точности и тщательности сравнения получении х результатов. Поэтому для более ясного представления степени сходства и различия кинетических характеристик М1 изо— Фермента ПК, мы провели сравнительное исследование очищенных нами препаратов из мозга и скелетных мызац крупного рогатого скота и коммерческого фермента из мыац, кролика (Табл.1).

! 1 • !Скелетная 1Нервная > мышца !ткань ¡кр.рог ¡кр.рог. "скота 1скота : I 1Скелетная 1 1мышца 1 ■ кролика 1 : t i t

"Удельй.активность ¡233 1292 S2B0 1

• Km(Реп)мМ ¡0,04 IO,2 10,05 1

!Ки(АДР>мМ !0,4 Ю,3 ¡0,3 S

!Р1 SB, 9 ¡0,5 ¡8,9 1

¡Кг,Суб,кД 557±2 ¡58*2 5Û±2 t

Оказалось, что имеют место суадестненние раалимия по Кт дли Реп и небольшие оариации Мг и р1. Г1ос леднис?, на наш взгляд, могут выть следствием рапличий о нетоди^дх имлолрнмя ГЧК. Относительно иммунологической специфичности и:зофермг»нтог» ПК »4 литературе имеется единственна« точна зрения и ряд ланнмх , подтнержд^кнцих ее. 8 соответствии с ней, М1 и М2, а также? и и и-юоерм^нты попарно иммунологически идентичны. Наши результаты также неоригинальны о этом отношении: в реакции доойной иммунодиффу^ии препараты ПК, онищенмыо т мозга и скелетных мышц, (и'Л«ф«рм4,нг М1), а также из ломе»< <изофермент М2> крупного рогатого скота, давали реакции полной иммунологической идентичности.

Приведенные выше результаты исследования некоторых сгойств изоферментов трех гликолитических фермонто» определенно уклаы— оамт на особенности их функционирования о ЦНС. >ти псг)б»?кности варьируют от небольших, но значимых функциональных и иммунологических различий между одним и тем же изоФорментом « мереной и других тканях для РГМ и П< и существованием специализир^пнмой, нейронспецифической изоформы для Е. На основании наших и других работ о этой области иоыно оак'личить, что изофермонты, характерные для нервной ткани ( в большей степени это относится к иооферментам, имеющим нейронляьную локализацию), отличаются более низкой ИЗ»Т, высокой устойчиоостьм к различии« ииактипиру-ющим воздействиям. По ряду своих функциональных характеристик они стоят ближе к Ферментам, характерным для мышечной, чем, например, печеночной ткани- Объяснение этому, вероятно, можно найти в том, что метаболизм нервной ткани, так же как и мышечной, относится к гликалитическому типу, а отличие от печоноч— ной, функционирующей по глюконеогенетическому типу. С другой стороны, заслуживает снимания попытка связать большую устойчивость некоторых гликсэлитических ферментов к инактивации раство— ' рами солей с имеющими место в нейронах примембранныки лекальными колебаниями концентраций К^ N3, С1" при генерации потенциалов действия и, возможног другими специфическими для нейронов событиями.

2. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЛИКОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В ЦНС

В главах 4.5—4.7 предпринято систематическое изучение возможности регуляции гликолиза в ЦНС аминокислотами, метаболитами гликолиза, а также другими биологически актиоными соединениями. Глутаминовая кислота, аланин, фенилаланин и ГАМК — медиаторы и физиологически активные соединения о ЦНС при концентрациях 0,1—ЮО мМ, превышающие на несколько порядков их эндогенное содержание в мозгу, ие оказывают сколько—нибудь заметного влияния на активность изоферментов Ё млекопитающих, а также Е из мышц« Следовательно, вряд ли указанные аминокислоты могут играть значительную роль в регуляции енолаэной активности. Глюкоза, глмкоэо-1—фосфат, глюкозо—6—фосфат, фруктоза , фруктозо-6-фосфат, фруктозо—1,б-дифосфат, глицеральде-гид, 2Ргл и ГаР подавляют активность Е- Данные по изучению влияния указанных метаболитов на активность бета-бета Е су-

«lecTHiíMuo ме отличдМ1С я от такомых л л<и гаинд-г-амма изофермен--Tá. Регул«торноу ииачение, по-видимому, могут иметь 2Ргл и ГаР, о »п/и.»йс: тыующие и комцентрациих на три порядка им»« ос-тйяьных. (поскольку 2Г ли h«íí обнаружен о тканях млекопитающих, ом не* мажет олишь на Е in vivo» Goл^шшй интерес представляет воаножность ингибироилиия енолазной активности ГаР, который О отлично от 2Гли, яиляясм иетаболитон гликолиза, может окасзм— и^ть регулирующее «действие в фиоиологическич условиях. Изучение . кинетики реакции при раалимнык концентрациях ÍаР показа-до, ЧТО он миЛПУМИО проявляет СВОИ» ингибирующую rtKTHOMOCTW, по сравнению со скоростью фернеитатиуной реакции. Игэучемие? уанисимости емолазной актинмости от времени инкубации при концентрациях ГаР О,4-4 «И показало, что она имеет лкспонон ■ циггльиый характер и выходит на плато через 1Ъ-20 мин- Поело 15 мин инкубации гймма-гамма Е с равными концентрациями ГаР о координатах Лайнуиоера-Бэр.<а выявляется конкурентный неха-нипм ингибирсоания (рис .4) с Ki , paet-чэй 0,1 мГ1. Для подобного типа медленно реагирующих ингибиторов, если фермент предварительно не имкубироеагь с ингибитором, можно оымислити Ka*yi«y— ♦оси константу скорости первого порядка к, которая пропорциональна коне таи re скорости второго порядка обрааоааиия ф<?р — монт-иигибиторного комплексе. Расснитанная таким образом кон-стйН1а скорпсти к для nctpu гамма—гамма Е~ ГаР раина 1,15 1/мин. Сопостаиио езначеним этой величины и Ki с таковыми для взаимодействие гамма-гамма Е— РГМ (Ka * 1 1/иии> , можно сдс-длть вывод о приблизительно раыной эффективности этих двух ингибиторов. По лигс?ратурнмм средняя концентрация ГаР

и саркоплазме мышц составляет примерно 0,1 мМ, а в головном моагу крыс — 0,01> мМ (Прохорова, 1979). Однако если принять во внимание оме оку га стч»гтен*> компартмеитализации нейронов и допустить, что ферменты и метаболиты гликолиза (е их числе и Е, РГМ и ГаР > находятся а одном компартменте, то, очевидно, их локальная ко.чцонграция п ЦНС окажется ещэ ишо. Поэтому, хотя значение Ki для Гар вдвое выше по сравнении» с его средним содержанием в ЦНС, имгибирующий эффект этого соодин<ан\л» предетаиляется значимым.

О ряде работ показано модулирующее действие стероидных горионис* на ферментные системы, ссясзанное с обменом биогенных аминов и аминокислот (Luine и соапт, 1977, Mongil и Kanugo 197Ü . С другой стороны, покауано, что экспериментальную эпилепсии» у крыс можно вызвать иведеиием антимооговых аутоанти— тел, которые направлены протии моэгоспецифическик антигенов (VI a J kovi с и JanV.'Ovi с , 1991 ) . Интересно, что среди них аначи-тельну» роль отводят моагослецифическим и:зоФерментам »ликоли—

учитынА? их üucoKoe содержание о нервной ткани. Поэтому есгсстоонио предполжить, что и гликолитические ферменты могут бить подвершены регулирующему илиянию стероидных половых fop—

I/iA 240

SO

40

30

20

"КГ

Ш-7мМ

С13»0,4мГ<

)«0,2мМ

1

1 ДСП, кМ

I

~ТСГ

Рис.4 Зависимость. начальной сксростч «знолаансй рогкции от содержании субстрата посла "5 мим инкубации оермантя при рааличмыи концентрациях ëРв координатах ЛаИнуивира-Вэрка-

2,0

1,0

JJ

гГ

л а а

I

а 6 и

2

JÚ

Д £> а

Рис.3 П'С «ктмпкпсть <по оси ординат — мкМ/мг íio/исл) в синап-тоссмллинсЯ еракции моага крыс посла Фиксации глк»тара/«.диги-яон в контроле» (1) и черэа 10 (2), 20 (3» и ЗО <4) кж. пос-яз нолдейстоип »страдиола. а— растворимая фракции, в- ела— босавяеннпя с кяийрангми фракция и о— прочносоиэжнна» с нан-Сранаки Срамима. Р<0,05.

(1 о

моноа. Значения «ктианости гликопитичвскик ©ермянтоя в моогу крыс до и после обрабо1«(и »страдиалом приас!дты в тд^л. 2 1« иа которой иилна, что активности регуляторных ©ермантоа повышаются череа 4 часа после инъекции эстрадиола. В то ме орымя активности "равновесных" ферментов А, ГАРД, РГК, РГМ и Е не ияменимтся под ооадейстпием эстрадиола.

Тайл. II

I ГК р;>ств i ГК момбр I РОК 1 ГК

__________!____________:___________1__________I..........

: : I :

Контроль. 50,054*0,009 :0, 174*0,002 »1,21*0,02 U,00*0,007 >страдиол ¡0,0754.0,603»¡О,200*0,00д»I2,45*0,09«I3,10*0,06» 2»страдиол+!0,053*й,007* :0, 174±'J,001*I 1 ,31+0,03 11 ,96*0,04 Актиномиц.! ! I I

__________!_____________1_________ _______;___________

I А 1 ГАРД Т РГК I РГП I Е

- - > I ( '

i 1 1 1 1 Контр. ! 0,73*0,0210, 139*0,04 IO,72-tO,Oai 1 ,8610, OS I 1 ,01*0,03

! I III 3стр. !0,75±0,02i0, 146*0,0410,70*0,09 I 1 ,0Q±0,07I 1 ,03*0,01 _______1____ i . _____1.........

Активность о мкм/мг мин, » Р<0,05 (п-10)

Учитывая выбранное время экспозиции, монно предположить, что актиишия регуляторных ©срмвнтоо ость реаультат гормональной индукции, что подтверждаетея данными по йктиномици-новой блокаде. Полученные реаультаты намолятся о хорошем соотоатсюии с данными Baquar и Мс Loan, 1972, показавшими биосинтез de novo ГК, РФК и ПК о матке крыс поело обработки »страдиолом. Вероитно, существует общий для осох тканей — мишеней механизм эстрадиолооой индукции, который приводит к активации гликолиза о иолом через ггаоишвмиа активности трох кинаа, являющихся действительно ключевыми ферментами этого метаболического пути. Поскольку рецепторы эстрадиола о ЦНС обнаружены только а нейронах, но на D глиальнык элементам (Dofiariicb и со-авг.,, 1985), можно допустить, что эстрадиолоаая регуляция гликолиза имеет место лишь о нейронах. Если такая регуляция осуществляется о Форме гормональной индукции на клаточмок уровне, то она должна быть выражена eiajtoa отчотяиао в условиях клеточной культуры In vitro, гдо отсутствует "Су-Серное " дейстипе гомеостаад организма и ряд другим Оактороо. Поэтому для проверки этого предположения исследовали воздействие эстраднода на культуру клеток мышиной нейровластомы С13СО. При использовании гормона в концентрации 2S мкг/мл, активность изучаемых Оерментоа возросла на 60,5; 84,4 и 14£),8Х лея ГК, РОК и ПК, соответственно. 50мкг/ил дали пояи-

акти^юсги мл /'¿,'2 м 21 17., а ЮО мкг/ил ~ на

147,АО?Д м 134%. Иггиг-сгмгс, м»о I К, Рфк м ПК н рлп/иччмых тклнях гродстйг»п'1«м рля/*мчнмми н»*>орами игклрерирмтоп. Не» я»-

ЛГ'ЛСП *гП<,Л'<*ЧГ»ННГ-м Г» »ТОМ ()ГИО«|ММИИ И 7)(.)НИ Ц1Н*. Покати по—

иьиуени«? суичярмой дмгип^юс ги к/1юч1->«ын С»орм»»нгоп гликолиза при

ЭС Тр ЛД»«ОЯОГЗОМ ПОЯ Л^^с Г??ИИ, МЫ Л*Д.*/Ч1Си Ц*»Л»»Ю ВЫЯСНИТЬ, 1МКИИ

г?<(?нмо г и из су^^с та у »ещи>: п тт»м г олов» юг о мозга

про по Л *МвТ ММТ«?ЛЬНОС г», к гормону. Иг- ТО/ЮМ изофокусиропа—

ния я ПЛЛГ мы покаалли, что но асо, а лишь характерные для и*??*ромо!| ис*ой^рм'*»мты «5ктмаируи>тс я ктрадиолам. Олнан о известна , нто ионскиа г»олозм^> гормон«, и эст радиол в и к чис ло, о*э — ллдлют и другой, моди<Г*иииру»смч«?й компонентой е-оялггЛстйн;,', Онл, нлк праоило, прор.элйатся на более? ранним стадиях гормонального ооялгПсгоич и сражается о иэменпнии жтивнссти ряда Фер — КЗчТО:» мс-рс'З нсгемс^ныс? м*ух«знизг*ч. Для йыяаяения неизученных « »том спног'стчи на г/ичолиа ЦНС ис.по :ьзопаям м«?то—

лнху о*;р«>/>огкм су*5к/уточных "прспдратоо с.оа*?ыми растворами гттаральл*'' ида, пос^с лп^ещул получать /;аннис* об актипности не» только опдерлегоориного и номбрлносояэакнсго пуяоо, но и оп-р«>дг?лить .»ктиэнпсть т.н. примекирлнного еерментного пула, который по рЯДЗ ИССЛГ*ДОП<ЗТеЯ1*?Й играет пл*ную роль при нг$м«»н{*ни$4н бис;иолагич!?ского состояния орг лнизмэ, связанных с т.п. эО^ктизнэсти синапел". Обработка интактных сннсптосом г лгот*?ральдг?гидом уменьшает количсстао солмбилизи— роялмнгсЯ ГК о 4 раз л- Е о тох »о услопияч но меняет своего

распределения. Поскольку ПК ГШЛЯОТС Я СрПрМГНТОМ, имеющим

змлчитальник п^имтгчг'реккый пул, то сстостоенно ьыло избрать эт-от й><*р«рнг о к«чц(?с осмоэного объекта иссяедовлния. При эгем гериен добавляли к препарату синдптосом ех Отроге черес* гтромгеггутнгм оремени. ПК актигзност»» измеряли во фракциях синллтсллдс^ы, слабо связанной с синлптичоскими мембрз-

С»кстрагмруатся КС1 > и прочно связанной с мембранами <не* экстрягкруатс?* КС1 ) • Как еидно ио рис.5, суммарная ПК актив-е^п^т»» с» си» ^»птссомзльнсГ! еррледии почти не изменяется, но о полср ас трсржоЯ , сл&Со— и прочно соколиных с мембраной р а к — цм^и прсиско^ит статистически знзчиког? перераспределение активное геЛ. Л;<тмзиос"гь ПХ уооличиоается о прочно связанной Срлнгглии и угегиьгаая'тся п растоорммаГ« я лабильно связанной Срлкимям. Тгжоэ псгрсраспродояониз можно объяснить следующим

П?< о »-«ерпнын окончаниях локализована о примембранной сона9 и скнт&£**рся&нныа нолгкулы оермента „должны рас-

ГРродоАитьст схолии»« образом, поскольку прочно связанный пул, ©гтроятм», су^лдигэизл^но более? сначин, чем остальные. Вслед— стриэ т¿¿кого п^рэхода растасримсй формы о мембраносаязанмую п г^т^илэ незэт ъ^мтсмсифицироэатъся гликолиз о целом.

■i. ОЗЛИлидЬИСГЫИЕ ЬНОЛЛЗЫ, «.OCCUÍ JIHUEI'AIМУíазы И ПИИУНА1КИМЛЗи

Дли иынс»№ния вйэми№<ости взаимодействии изиФермиитоо Е и РГМ мы испольоовдли измерение аииаотропии флуоресценции ©ер-менгйв, мечь'мнмх СИ III. Меченную ФИТЦ гднма-гдмна Е о конечной концентрации 1 мкМ смешивали с мозговой РГМ в различных кон-ценрациях и определили вели^шну аниэотороии Олуор ;сцснции через 20 нин, когда система приходила о раоновесиэ (рис.6). Дяо теоретические кривые, рассчитанные для Kd 5 и 15 мкМ, хорошо иллюстрируют величину Kd образовавшегося комплекса. Анизотропия альфа—альфа Е, меченной ФИТЦ, не изменяется при добаалении РГ/1. В случае использования меченной РГМ и аяьОа - альфа или г — гамма Е также не наблюдается изменения анизотропии о

широком диапазоне концентраций. Конечно, неизменность анизотропии не яэлпется достаточным основанием для того, чтобы утверждать об отсутствии озаимодейстоий, поскольку повышение подвижности коыалвнтно связанной с белком метки может компенсировать увеличение анизотропии. Для однозначного ответа на вопрос о взаимодейстоии альфа—альфа Е с РГМ требуются дальнейшие исследования с применением других мотодоо. Рис.7 гока-оыиает iiyvику иаменйнмя акигзотрDnw-I после инкубации 4 мкМ гямма-гамма Е, меченной СИТЦ, с 165 мкМ намеченной РГМ. Тьк кйк концентрация РГМ о 42 раза превышает енолаоную (условия, обоспечизакицие реакцию псевдопароого порядка), наблюдается резкое повышение анизотропии. После иыхода величины анизотропии на плато (через 20 мин), смесь разбавляли 20-кротно буфером (на рис.7 показано стрелкой). Наступающее аа этим снижение анизотропии отражает диссоциацию комплекса. Экспериментальные точки на рис.11 соответствуют экспоненциальной крипой e—к•t с к •»kd*,0,24 /мин. Из соотношения kd / ka ~ К вычислена коне тента диссоциации Kd комплекса, равная 40 мкМ. Эта величина несколько выше, но того же порядка, что и а предыдущем эксперименте при ее определении методом раинооеснэго титроаамия. Если комплекс между гамма-гамма Е и РГМ имеет функциональную значимость, то иэ такого взаимодействия долани вытекать определенные кинетические следствия — ингибирозоние или актизация каталитической активности. Поэтому о следующей серии эксперимантоо изучали зависимость скорости снолазной реакции от степени насыщения 2Рг о присутствии и а отсутствие РГМ. Hpi. этом Pi— 2,ЗдиР был опущен, чтобы избежать РГМ реакции, ведущей к обра-ооиатя Зрг. Условия для измерения енолазной актизности более предпочтительны, даже и присутствии стократного избытка "балластной" РГИ, т.к. Кга для 2Рг РГМ иэ шлиц раана 2 мМ (BcrQ-roouer, 1V75), мозга - 0,20 Mii, о то оремя как для гамма-гамма Е - 0,007 мМ. Таким образом, да«о если РГМ при использооанной максимальной концентрации (7,4 мкЮ спязыаает какую—то часть 2Рг в отсутствие Рг-2,ЗдиР, концентрация 2Рг у меняйте я не более, чем на 2,57.. При этом измеряемое начальные скорости'. непосредственно откладывали на графике в координатах Лайнуиае— ра-Сэрка (рис.С ). Вид зависимости указывает на смешанный тип

1РГМЗ м«11

Рис.6 Раонояеснок титроэание моченной СИТИ гамма Е (1кмМ> РГМ- Откланэмиэ камдсн* экспериментальной точ1£м предстагитег ио спбп разброс пяти отдельных измерений. • Эксперименты про— аоди.ли о ЗОмЛ имилазоллюм йуоере, рН 7,3 а отсутстпиа или п присутстоии (К) 2-Рг (ЗОО мкП> или о присутствие 100 мкМ Рг-2,ЗдкР (о). Ца!иб»т о определении "лмизотропии <0,015. Оерхнн ■ и някнпя тооротичшгкио кривыо рассчитаны для стехиометрии поаимодайстпип 1*1 с К(1 5 и 15 мкМ сизтоотстпиино. Рис.7 Кинэтика обрааоппния и распада комплекса Е—РГИ. Ппчамнуи Е емсвиаали с намоченной ПГП о ион'-'чиий концентрации 4 и 165 ш<М соответственно и регистрироолли паэьинниа анизотропии со оримишм. Чероз 20 с.ии (пока-лано страякой) смась 20 кр-та \ лзйаолягзл буфарои. Тиаротичкски« кривые рассчитаны дл ч ассоциации 1—«"''и диссоциации 1— Экачанип, получении« для к1 I к2 ¿или разни 1 и 0,24 1/мин.

Рис.0 Графики Лайнуиоера-Бэрка (а) и Диксона (£>) актииности гамма Е о отсутствии и в присутствии различны* концентраций РГМ. Услоэия эксперимента описаны о раздала 3 и а подписи к . рис. 7. Конечная концентрация гамма Е была 0,1 мк!1, а РГМ -О <*>. 3,7 мкМ .<+> и 7,4 мкМ <0>. Активность иаморнпи о отсутствии РГМ, но о присутствии Ю мкМ Р1—2,ЗдиР <Д) и а присутстоии Ь мкМ РГМ + Ю мкМ Рг-2,ЗдиР >. На график» Диксона*,О, и*,- концентрации 2Рг, которые били раоны 3£>, 6 и 1,2.

—tti-

11мг или|и)нанин (!»к1л|'1пной alftmühoctm РГМ. ,-jto íiíjuut свилот^лъ-

riBuödn, о польяу того, что енолаанап акти-зность по трансоор-мдции s'f 'í и Реп частично или полгкк тью ингибиропена р тройной комплексе РГГ1-2Рг~Е. Таким ofipasom, mosho утсеркдать, что риолааная акгипиос гь и комл№ксе Е-2КГ-ÍTM рдана мул-j или по крайней мере оначигельно ниже, чем о комплексе Е-2Рг. |£сли г читать, ааиисичость, получениу» о координатах CUticconä линейной , то Ко комплекса fei—РГП равна примерно 5 мкИ — сидчениэ очень близкое? к полученным а предыдущим экспериментах. Ииги-оирозанио енолаомой актиэности, набямласно» о отсутствио Рг -У.ЗдиН, про7 ииоричнг распространенной kgiíhw шии , ерг лдсно которой прямой транспорт ингермедиага о комплексе приводит и укгч премию yiar-оаэы и уиелич(?нии потока мг?таболито£з. í I п з г oí (у о дальнейшем изучали слияние Рг—2,ЗдиР на активность Е, О ©го присутствии мемду 2-Рг и 3—Иг практически мгноаенмо достигалось раинооесие ввиду омсокой t тнцентрацин РГМ. Слодооатола.но, рвалинаи концентрация 2—Рг в система состаоляла ы^?сту»д

часть от добаоленного, поскольку коне тента рааноиесия найду 2-Рг и 3—Рг раина 0,2. íto примято в расчет при псстроомии графика на рис.12, т.«., о эти* случаях брали шестикратные концентрации 2-Рг (нл рис.0 ппллаака символом В). Как видно ИЭ приведенных данных, о присутствии сиоиологмческих конце/нтрациЛ коьактора F-ГМ сюлааная актизность полностью посг.танаализаст-с». Возникает вопрос — сохраняется ли при этом кокплскс Е-РГМ? и^рагицшись к магоду Анизотропии Флуоресценции, моино за*ш— тип., что комплекс не претерпеоаот сущгстаснних изменений при наличии или отсутстоии в сред» Pi—2,ЗдиР.

• íi предыдущих экспериментам процесс ксмпль-кссюбразавлнип исслодоеали лишь на оснозе определения параметре» Е- йьйстои— тельно, попытки изучения «»-(изотропии <глурр^сц*;нцни 14 И окаоа— яись безуспешными, т.к. ома ни изменяется ни при разйаелэним сермента, ни при его титроаании. Е. Определенна кс еи-рмснтатиг»— ной активности РГМ для кинетическим исс/к?<.оо&мий комплаксо-р(:разойания невозможно без до£»аг.л:?ния a K--i<-<y сроду

избытка £ или доугих еермемтоэ. Поэтому для иаучония поиодсмия РГМ йыли использованы другие методы. (Здни-ч из ним гель—Фильтрация о объеме. При до£>авлзмим уаелячиосыаяхся количеств мышечной К оначениэ Kay уменьшается, что спркдог.?кнз свидетельствует о пользу комллзксоосраоаалхмя. Прояполокиз стехионетрив связывания мсиду h и ('Iii 1>1, № для комплекса в присутствии и в отсутствие субстрата - 2Рг - Сила сцснина примерно в 0,3 и 1 мкИ соответственно. Эти величины срааними со оначенивми, полученными предыдущими методики, и сьидотольстсу— ют о том, что CHIЦ не олияат на &аоиннасть изученных Ссрмси— таа. Кроме того, был разработан ноаый могсд днв СП?ей с лгии а белок—белковым взаимодействий, ссмоааммый на »крамирсзении антигенных детерминант на поверхности Ca/a<озей глаЗу.зд при

комплаксообраэоойнии. В принципе при наличии соответствующих лмтисипороток МОЖНО ОПреДОЛЯ ТЬ ВОЗМОЖНОСТЬ KOMOil*?KCI3<Jtíprtrjt)í».l ~ ний любых йнтигемсич и количестистш интерпетироиать результаты, ПОСКОЛЬКУ При HCfîX ПИД.1Х ОПЛИМОДОЙСТЙИЯ, исроятно, экранируется хотя бы часть йнтигпнных детерминант. Злиисимскть иммунорелктипности РГМ от концентрации бетл-бета и глммл глммл Е показана на рис.9 . Из него видно, что в препаратах Е, даже при их максимальной концентрации, РГМ не детектируете и- Т.к. осе измерения проподили о среде с пмсоким содержанием Г-СП, то мдасгтециоичес«ая пероксилаян.щ актишюсть и пзанмол»?нстиие U с анти-РГМ—JqG, а также С авидином или биотипом пренебрежимо малы. Мы но обнаружили различил о степени иммуиорелити^ности РГМ при ее комплексообразопании с бета или гамма иаооермеитами Е, несмотря на их полную иммунологическую идентичность. На основе полученных результатов, представленных на рис.9, была разработана модель для получение количестп*«нной информации о пзаимодейстеии E-f "M. В этой модели рассматриваются следующие равновесии:

ftm + РГМ <—> Дт-РГМ Kfimu = Г Лл 3 * [ РГМ 3 / tftm-РГМЗ

РГП + Е <—> РГМ-Е Ко = ЕРГМЗ*1Е 3 / 1РГМ-Е 3

ftm + РГМ-Е < — > Лт-РГМ-Е Kaw [Л.-яЗ*1 РГМ-Е 3 / tAm-РГМ-Е 3 Пгл-РГМ +■ Е < — > Пт-РТМ-Е Ко = [Ля1-РГМЗ*СЕ 3 / ГЛт-ГГМ-Е 3 Лп—РГМ + Di < — > Am-РГМ-Вi Km « íAm-РГМЗМВ i 3 / САт-РГМ-Bi3 где, Лгя —анти-РГМ—IqG, Bi -йиотин-апидмм—п<зроксилаоа (посколь-. ку аяидин очень прочно связывается с биотином, их диссоциация о расчет на принимается). Константы К предстаоляиг из себя константы диссоциации соответствующих комплексов. С помощью компьютерной программы tk Solver Plus бил рассчитан процент распределения комплекса САт—РГМ—Bi 3 как функция концентрации Е. Эта величина была рассчитана для двух фиксироааннык концентраций РГМ, которые использованы в эксперименте - О,Л и 1,2 мкМ. При пиачении величин Ко Œ 1 мкМ, Кати. — 0,05 мкМ и Khi = 0,2 мкМ получено хорошее соответствие с экспериментальной кривой. Таким образом, аеличшча Kd для комплекса Е—РГМ равна 1 мкП, что очень хорошо согласуется с данными, полученными при использозамии предыдущих методов. Обобщая эту часть работы, можно оакяячить, что поскольку четырьмя незаоисикими методами установлено комплексообр^зоозниэ меиду бета—бета и гамма—гамма изоферментами Е с ММ и ВЕЗ изоФерментами РГМ и Kd во всех случаях была величиной одного и того ке порядка, то такое взаимодействие, по крайней мере in vitro, определенно существует.

Из приведенных в разделах 4.8 и 4.9 данных может сложиться пп'гчатлонио о неспециФичсском озаинодейстаии между Е и РГМ. Исходя иа »того, были продолжены исследования по изучению, возможности оолимодействип между Е с-одной стороич, и другими белками и гликолитическими ферментами — с другой. Цля этой «ели были выбраны ГК, ГАРД и А из скелетных мышц, ГК дрожжей, л также БСА. Скриннинг указанных соединений в плане их

1 ад СЕЗ <мкН)

Рис. V HQA РГМ и присутствии раа/инии« концинтраииЛ шиачноЛ Ь". Иммуморишстинность определяли при 4V2 мм. Экстннкция, намеренная о отсутствии РГМ Цыпа одинаковой (0,3> для осек концентраций Е. По ординате отломан процент мммунороактиа— ности, по абсцисса — концентрация Е. Эксперимзнтальнмэ точки с иеличиной ошибки — сродное из S наааиисимых определений о отсутствие <*> и о присутствии 0,& <•) и 1,2 (**) нкМ РГК.

СГКЗ мкМ

Рис.10 Равновесное титроааниа иыченной С~!ТЦ гамма Н (1 инП) ПК. С)сталька условия как на рис. Ь-

иодЮсгпия с Е осуществляли при помощи кинитичвскога аналмаА. . Для экспериментов а качестве кточника Е использовали препараты очищенного глмма—гамма иаоОарманта (табл. III» я>, л Для моделирования ситуации in vivo - »кстракт водорастворимых Cajntoa (тавл. 111, <J>.

7д£5л. 1 J I, а

Концентрация велкоа <wtiM>

1 I 0 1 20 ! Í.O 1 ЮО

1БСЛ 1 5012 ! 3012 I 4Я12 ! 4 7 ±2

1Альло/шэа 1 30±2 1 51*3 1 31« ¡ 4В13

1Гси<сокинлоа 1 50t2 1 4013 1 47*2 4712

1Глицеральдзгид-3— 1 50 *2 1 ЛВ*2 ; 47*3 1 47i2

!фосфат~д«?гидрогон:»яа 1 t !

1РГИ 1 1 I 3042 1 45*2 1 1 2Ь»3 i 10i5 f

Тсвл.III

Концентрация «Змлкоо (мкМ)

20

1

60

1

100

1ССЙ

IАльдоллэа I Гексокимавл ¡Глицеральдвгид—3-1«осе>ат—дегидрогкназа 1РГМ

l0,311.0,02J0,34i0f03 10,51£0,0310,5410,02 !0,5010,021О,М40,02 I0,49±0,01!0,44*0,02 1 I

i О, SOdtO, 0210,23*0,03 t !

tO,3110,02

10.4410.03 IO,42*0,03 J0,47±0,03 I

10.1010.04 I

I0,31±0,01 !0,47t0,03 ' О , 4 V i 0 ,02 ¡0,47*0,03 I ¡

IQ,09*0,02 I

I

Как видно иа табл.III, только внесение о сроду РГМ приводит к аиачитольнону пода««лцник4 егнолааной активности. БСА и другио гликолити шские ©ерменты таким »ф$«ктом не обладак>т, т.е. ингибируюыео двйстпи» РГМ на аиопл:зчую активность проявляет довольно уо- у» специфичность. Данные гю сш цифнчности ингивируишего действия РГМ подтверждаются и при «о погздойст— они на оноляэнув активность экстракта водорастворимых балко«. Таким образом, учитывая »ти данные, а такжо ноэмомнопь ригу— Лдции >того процесса оиаиологичесиими концентрациями Рг — 2,ЗдиР, можно предположить, что ояаимодсйствио Е-РГМ специфично, а способность к комплексоойрааооании сложилась на ранних стадиях юоляции, паррллоллкио г. организацией »того мета -Ёолического пути. Действительно, Batke и Тотря, 19вЗ, изучай компликсоабразовянис Мб>*лу А и ГЛРД, также обнаружили ра»ну» комллвксообраоутечу» способность Ферментов из раоличны* источников и их гибридов.

I

Мри ия/чении взаимолейстния Ь и ПК как и в случае с ff И. ичмеряяи Флупоесценцич меченной Е а присутствии различных кон-цг>м<р«ций ПК. На рис. № показана теоретическая кривая, соот-н(»гстяу»1ная Kcl | мкП, которая наиболее полно согласуется с по-луч&нными энспгрименглльными точками- Раэбрас полученных дан-нук нлколигся в том же интервале, что и для пары Е — РГМ„ Вне-омие о среду намеченной t вытесняет меченную ОИ1Ц £ из комплекса, что говорит о комплексообраэумщей равноценности обеих f.. Кинетический анализ енолазной реакции в присутствии различных ко>»цемтрацнй ПК проводили о двух системах, в случае опое— деления енолаэнои активности пои 240 нм, ПК активность должна выть подавлена, т.к. аа ходом реакиии следили по повышению содержания Hen. С этой целью из инкубационной среды исключали второй субстрат Г!К реакции — АДР. При представлении данных по инкубации Е и ПК в координатах 'айнуивера — Бэрка видно, что Km Е умемьшаегя, a V/nax не изменяется (рис. 11,а>, причем р.мачеиин Km, полученные о отсутствие ПК, вполне согласуются с литературными. Изучение эффекта при 340 нм в сопряженной ферментной системе дает примерно те же результаты <рис. 12). И в »том случае Km для 2-Рг уменьшается, a Vmax остается постоянной. Изменение концентрации ЛАГ иа 5ти значения не влияет. Выиод, который следует иа »тих экспериментов» сродство 2-Рг к Ь повышается и в прямой реакиии присутствие ПК может увеличить эффективность Е реакции. Полученные данные укладываются в рамки представлении о повышении Эффективности метаболического пути при озаймадействии ферментов. Изучение обратной енолазной реакции не выявило существенных различий в присутствии и в отсутствие ПК. Изменив условия эксперимента, можно смоделировать ситуацию, при которой комплексоабразооание невозможно, ü этом случае реакцию запускали Е, и затем через различные промежутки времени в инкубационную среду добавляли избыток смеси ПК и ЛйГ. Во всех изученных промежутках времени активность была ниже, чем о условиях, способствующих комллФксооЁоа-зоааним. Теперь посмотрим может ли комплекс Е—Ре*ч служить субстратом для ПК реакции? Для этого .мы сравнивали Г1!£ аюгмоность, используя в качестве субстратов Реп и АЦР в присутствии или a отсутствие Е- В первом случае Е была взята в молярном »oäurtee, по сравнению с Реп. Данные табл.IV показывают, что ПК оа крайней Mi?ре с одинаковой эффективностью может утилизировать ила свободный Реп, так и Е-Реп. Если рассчитать концентрацию Реп, которая остается свободной в присутствии использованного нами количества Е, то оказывается, что при этом скорость вермомга— тив»юй реакции будет несравненно ниже. Результаты приаедснмих экспериментов показывают, что при взаимодействии Е и ПК in vitro имеет место образование комплекса, который может

Pt4C.ll а) Определения енолазной активности в прямой реакции (суЯстрат - 2Рг> при 240 нм, <•) - Е, <Ю - Е«ПК-1с40. б) Определение емолавной активности ь обратной реакции (субстрат - Реп).

1/С31

Рис.12 Определенна енолазной активности о прямой реакции при 340 нм, (•> - Е«ПК!ЛДГ - 1:2x2, <Д> - 1>1&>2, («?) - 1:40г2 и <*) - 1|40И0.

Tartlt. IV/

!Комц.еноллоы i Конц. фосфоемолпируеата Скорость р-ции|

1 <мкМ> 1 1 об«ая 1 свободная »

t 1 О ! 1 63 1 О 1 ЗО SO С.з t 1 SO 1 1 О.З 1 1 0,5 1 33±7 1 32±6 1 0,3t0,03 1

лирооагь общий интермедиат, поскольку ПК »ффсктиано утилизирует и качестве субстрата оншшоний ©ермснт-субсгратный комплекс.

ЗАКЛОЧЕНИЕ

Обобщив результаты »кспериментоо по изучении озаимодейстиия между различными из&Ферментами Е, РГМ и ПК , на основании получении* несколькими неаиисиишш митодами данных мощно сделать количественные выводы о комплексообразооании между парами РГМ - Е и £ - IK, а такие о целесообразности такого процесса iп vivo. Значения Kd для пары РГМ - t, полученные методами анизотропии флуоресценции, кинотичасмого анализа, гель — фильтрации в объеме сефадокса и иммуноСерментного анализа лежат а диапазоне 1 - 40 м«М. Существенный различий в степени комплексообраоооания у бота—Сета и гамма—гамма Е не наблюдается. Из результатов экспериментов по взаимодействию РГМ с Е иошно оаключить, что Е саяоыаавтея с РГМ в области активного центра, но при »том экранируется небольшая часть ев поверхностных антигенных детерминант. Действительно, бота-бота и гамма-гамма иоофстр менты, четко различающиеся иммуналогически , одинаково связываются с ГОТ и СО изоферментами РГМ. Предположим, что о связывании на участвуют "вариабельные" участки молекулы, ответственные оа иммунологические различия бета-бета и гамма-гамма иоофермемтоа. Тогда следуот допустить, что "вариабельный" участок альфа-альфа иоофермомта имеет иную структуру и препятствует компломсообраооианию. Ферментативная активность иаоформ Е, свяаываммвихся с РГМ, имгибмруется послед-

ной и модулируется ее кофактором, что свидетельствует о вовлеченности актионого центра Е а сайты контакта. Антигенные детерминанты ММ и ВВ изоферментоо РГМ экранирумтся при взаимодействии, что легло е основу метода изучения комплексов при помощи ИфА. О то же время активность РГМ в присутствии Е оче-пидно не подавляется, что позволяет использовать Е в качество дополнительного фермента при определении РГМ. Следовательно, "вариабельные" участки бета-бета, гамма-гамма мзофермемтов Е и lirt, ВВ изоферментов РГМ структурно разобщены с участками ак-тганык центров. Причем, в комплексообразовании Е-РГМ участвуит сдйты активного центра Е и поверхностные антигенные детерминанты РГМ, но т.к. активные центры взаимодействующих фермен-теэ сторически но сйлижены — каналирования не происходит. Биологический смысл образования компекса Е-РГМ может заключаться о приобретении новых регуляторных свойств «чувствительность Е к P«—2,ЗдиР, кооператиякасть эффекта ГаР и РГМ) и защите обвге-го иитермодиата от атаки ессОатаэ. Вероятно такова же и функция кокллжса ГАРД - РГК, оедь их об«ий интермедиат - 1, Зди-Г — такие находится в медиоергентном участке. Неслучайно, что хотя сучестаозание комплекса доказано во многих исследования», относительно тунно ляр оо а ни а метаболита пыскаэыоамтся обоснован иуэ сомнения. Комплексоойразование для пары Е - ПК установлено методами анизотропии Флуоресценции и кинетического анализа, л гтзлучекныз оначония Kd сравнимы с такоаыми для предыдущей пары и рязмм примерно 1 «wM. Изучения кинетики о на л а змей реакции показало, что о присутствии молярного избытка ПК (даже в таких ус-гсэия», когда пирупаткиназная реакция не происходит) позьпаа-■этея сродетоо Е к 2Рг, но не Реп. Повышение сродства Е к 2Рг о нгмал5»1«зм, прадстационарном периоде на псе т приз ости к увелчче— юсэ скорости потока. Отражением этого вероятно тлявтея низкая, по срезное«» с другими метаболитами гликолиза содержание епсЗодмаЯ 2Рг а мыиячкой и нервной тканях. Использование ком-n/S!£Ca Е—2Рг о качестве субстрата ПК реакции указывает на воз-«■годность пргмого переноса мотаболита. Оормироэанио комплекса E-C5Í и Tyt«KíJrvípoasHH3 выг.злена с использованием различных мз-телея и удозлэтзоряэт критериям, предложенным рядом аатороэ. Рсяетгсксетруктурный анализ кристаллов Е и ПК (Lebioda и Stec, !*?2Ь> сипгил oif«жуп стспень их идентичности м позволил сделать с„-:од из только о Соль сой вероятности их кокплексообра— ссэгння In vivo, но и предположить, что указанные Ферменты прсизгз-алм путетм дизергемции от общего профермента. Поскольку r^T.'rz.TVJr.:'» ^с-ркгмты озяимодейстоуггг нексэалентно и oSpasytsT

комплексы, то субстраты и другие еи^иологически С5Стт^зн5.:з соединения должны олияте» на процессы конплгдссообра— ссдгэв1я. ¡1с";стП1гго/!!.но, из рис. 3 видно, что 2Рг осяаблязт вэп^моягГ.ггтсиз, поскольку Kd в присутг-тэии суйстрата насколько ctr""!. Слэдооатольно, на отрезке, соотъ^тстпукгдам смолаомой решении, по-льгзениэ концентрации 2Рг призедет к уэоличеми?« скс^остм потока, поскольку удельная активность Е о сооЗодьч»«

состоянии выше. Падение удельной активности весьма характерно при комплексообраэоеании и присуще не только бифермантнм комплексам. Так, активность ферментов в цитоооле намного ниже, чем в смеси, содержащей те же «ерменты в большом разбавлении. Однако для доказательства регуляторного значения обнаруженного эффекта необходимо сопоставить физиологические концентрации ферментов и метаболитов, а также четко представить с какими еще белками, элементами цитоскелета и мембран реагируют указанные ферменты. Использованные нами при изучении взаимодействия концентрации Ферментов сравнит! с Физиологическими, а значения Kd лежат в пределах 1 мкП. Суммарные концентрации изоформентов РГМ, Е и ПК в скелетных мышцах составляют■13, ЮО и бО мкН, соответственно. Следовательно, небольшие изменения величины Kd не могут сильно влиять на комплексообразованме и большая часть Ферментных пулов во всех случаях Судет входить в состав комплексов. В нервной ткани в силу более низких концентраций указанных ферментов ситуация благоприятна для регуляции по вышеуказанному типу. Допустив, что часть ферментных пулов взаимодействует и с другими белками, а также структурными элементами клетки, можно предположить, что процесс образования и диссоциации комплексов имеет место и о мыиечной ткани. Одна иа гипотез надмолекулярной организации гликолиза, предложенная Рязановым и Спириным, 1985, содержит в своей основе предположение о циклическом процессе, а именно — сорбции — десорбции «ерм^нтое с мембранной или цигоскелатной "основы". Если несколько расширить ее рамки, то в нее укладывается и обнаруженное нами перераспределение мекду различными пулами ПК при изменении функционального состояния клетки ( в качестве фактора, изменяющее о функциональное состояние, в данном случае применяется гормональное воздействие эстрадиола). С другой стороны, трудно представить, что огромная масса гликолитических ферментов, находящихся в мышечных или нервных клетках, целиком ориентирована на процессы сорбции — десорбции и совершенно мв взаимодействует друг с другом без "посредничества" мембраи или элементов цитоскелета. Это становится особенно очевидным, если принять по внимание результаты экспериментов по взаимодействии in vitro многих гликолитических ферментов. Наиболее вероятным представляется сосуществование обоим процессов и если механизм сорбции - десорбции при помощи метаболитов имеет место для некоторых ферментов И жестко локализован в примебранной области, то механизм ассоциации — диссоциации ферментным пар имеет, вероятно, более широкое распространение. Образование при атом комплексов, содержащих три или болев гликолитичаских варианта не подтверждается экспериментально. Из схемы на рис.12 видно, что практически все метаболиты гликолиза используется более чем в двух реакциях. 2Рг (а также Pi—1,ЗдиР) составляет исключение и реакция с ее участием может в полной мере рассматриваться как недиеергентная. функция ферментным комплексов

Г ЬР (3.1.3.7)

Гликоо«

ГК«2.7. 1. 1 >

Г6РДГ(1.1.1.47)

Глмкозо—ЬГ- "

А I ИСТ<5.3.1.4)

ЬГямко~лянт ом-АР

Люоитоя-Р

|ГРИ<3.3.1.7) ф 0КК<2.7. 1.4)

фруктвао-АР ———————

Г |РСК(2.7.1.11) (3.1.3.11) |

—> Сруктоэ*

ецр

<4.1.2.131

Сру«тооо-1 Р2 1

ТРК <2.7.1.28)

1 Г

ГЛРД (1.2.1.12) Глиц»ральдогиА-Р ( ■ >1,3 Р2-глицгр«т

Диоксиамвтон-Р

ГТК <2.7.2.3)

ТРУКЗ.З.1. 1)

I Глицдцод-р ЗР-глмцврат

грйги. 1.1.а> и и 1

ЗРГвГ<1.1.1.73) Т РГИ

ЗР-оксипирув«т <-Ч 1(3.4.2.1)

ГЯК<2.7. 1.31)

Глицврвт <-

2Р— глмиерат РЕГЕС<«. 1.1.32> АС

6ТР + Оксалоацатаг <-

I

(4.2.1.11)

РСПК(4.1.1.3) СО + Оксжлавцвтаг <■' —»РЕП

СКГ(4.2.1.13) I ГЕ<

Аиот альдегид Лактат йцотид КоА

СКГ(4.2.1.13) I ГС< .< 1(2.7.1.40)

ЩХ(4.1.1.1) ф <■ Пируоат

па~<1.2.4.» [

Рис. 13 Гликолиз (кирмыо линии) и согрпзсмнью с ним оснооныа мэтаболичвскиз пути у млскспитаеких.

аряд ли может ограничиваться туннелированием метаболитов , т.к. и экспериментально и теоретически показано, что оно не присолит к снижению концентрации свободных метаболитое или существенному повышению скорости потока в стационарном состоянии. Однако приобретение новых регуляторных свойств и даже снижение скорости метаболического потока могут также служить важной составляющей регуляторного механизма.

ВЫВОДЫ

St. При помощи нового метода очистки изоферментов енолазы — гидрофобной хроматографии получен препарат нейронепециоичес— кого изофермента, обладающий удельной активностью 10S ед/мг мин. Гидрофобная хроматография на октил - сефарозе применима для очистки нейронспецифической енолазы из мозга быка и человека и может служить универсальным методом получения фермента с максимальной удельной актианостью. С использованием тех ке принципов разработан новый метод очистки пируваткиназы из мозга быка с удельной активностью 292 ед/мг мин.

2. Гликолиз в ЦНС и в культуре клеток нейробластомы С1300 регулируется стероидными гормонами, причем чувствительными к гормону являются только характерные для нервной ткани изоферментм регуляторных гликолитических ферментов! гексокиназы, фосфо— Фруктокиназы и пируваткиназы. Енолаза, глицеральдегид—3—Фос— фатдегидрогемаза, фосфоглицераткиназа и ©осфоглицератмутаза к воздействию стероидных гормонов нечувствительны.

3. Сравнительное изучение физико-химических и иммунологическим

- свойств фосфоглицератмутазы, енолазы и пируваткиназы выявила особенности изоферментов, характерных для нервной ткани и позволило сделать вывод о специфичности катаболизма фосфотриоэ а ЦНС.

4. Разработан новый сэндвич метод иммунофермонтного анализа для выявления комплексообразования енолазы и фосфоглицератмутазы, принципиально применимый при изучении любых белок-белковых взаимодействий.

3. Показано, что бета и гамма изоферментм енолазы, взаимодействуя in vitro с ММ и В8 изоферментами фосфоглицератмутазы, образуют комплексы с Kd порядка 10 мкМ. Сопоставляя Kd с эндогенным содержанием указанных иэофермонтоо, можно сделать вывод, что их большая часть in vivo комплексироэана. Данные по комплексообразованию, полученные при помаши нескольких методов, позволяют заключить, что сайты взаимодействия енолазы перекрываются с активным центром, а сайты взаимодействия фосфоглицератмутазы на перекрываются.

6. Енолазная активность в комплексе приобретает чувствительность к 2,3 дифосфоглицерату — кофактору фосфоглицератмутазы, а совместное действие эндогенного ингибитора енолазы - ГаР и фосфоглицератмутазы носит кооперативый характер.

7. Комплексообразование енолазы специфично, поскольку она не

реагирует с другими гликолмтическими ферментами глмцеральдегид-З—фосфатдегидрогемаэой, гексокимаоой, альдолазой, а также с бччьим сывороточным альбумином.

0. Бета и гамма изоферменты енолазы образуют комплекс с Н1 изотер ментом пируваткинаэы с Kd порядка i ккМ, причем о комплексе сродстоо енолазы к 2—«гасфоглицорату ouaie, чем в свободном состоянии. Специальными кинетическими исследованиями показано, что при образовании комплекса енолаза — пи— руваткиназа последняя может о качестве субстрата эффективно утилизировать комплекс енолаза — фосфоемолпируаат. Подобный эффект макет свидетельствовать о тумнелировании интермедиата.

9. На примере ферментов, учасгоуюаих о катаболизме фосфотриоз

— фасфоглицоратмутазы, ено/моы и пируваткинаэы, и образующих комплексы фосCorлицератмутаза - онолаза и енояаза — пи— рузаткинаэа, а таккэ при анализе литературных данных пока— оеыо, что кскплзксы, оСраааэгиние ферментами, катализируюсь'»'»» превращение имтермедиатов о недипергентмых точках ке-тдСализмл, нз обладают свойствами тумналирозания интермедиата. Между тем, комплексы, саизднные с катализом интермедиата о дивергентном участке метаболизма, могут туннелиро-лать, кмтермедилт, определяя таким образом направление мвта-¿олиэма. ОЯчэЯ характеристикой надмолекулярных комплексов

г/аналитических ферментса галяется приобретение новых регу-лптерних соойста, неприсус!и>с индивидуальным ферментам.

СПИСОК РАБОТ, ОЛУБЯККОВАЖЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. fiazaryar» К.П., Kerapetian N.H., Kazarian В.A. Purification and phyaico-chemical properties o-f neuronspecific protein Î4-3-2//<> th Si latéral Syeip. USSR-France "Structure and Functlon Prot. №cl. Acide", Tskhaltubo, 19S2, p. 113.

2. Назергн К.Б., Карапетян Ч.Г., Казаргэч Б. А. Енолазная актив-кость белкоэ нераной системы//Натериалы IX всесоюзной кон-ферениии по биохимии нерзной системы, Ереван, 19S3, с.72.

3. Nazaryen К.П., K-arapetian N.H., Kazârian В.А. , Comparative Cfcudy of braln enolaso ioozyeoa//là FEBS Met.,Moscou,1934,p.ЮЗ.

4. Изоаргн К.G., Карапптян Н.Г., Каэарян Б.А. Очистка и физико'

— кимически*> сосйстоа изоферментоо енолазы мозга быка// КгЯрокимия, 1"33, т.4, с.41О—414.

5. Наосргм К.Б., Микаолян Л.Г., Казарян Б.А., Авакян Ц.М. ПгмЗрлннап функция енолаоы головного мозга//ДАН СССР, 1986, t.2D7, с.226-229.

Ь. HaaapftH К.Б., Каэлрам Б.А., Карапетян Н.Г. функциональные

саойстоа иэоформэнтоа внолазы//Укр.биохим.ж.19й6,т.58,с.72-76.

7. Нааерем К.Б., Каграманям М.С., Геворкян Э.С., Панукян К.Л,Ка-олркн Б.А. Регуляция активности гли олитическич ферментов в культуро клеток нейробластомы С1300 при воздействии эстради-олл//Иайрохимия, 1987, т.6, с.365-571.

В. Назарян К.Б., Геворкян Э.С., Костанян А.А., Акопям Н.С., Паносян Г.A. О взаимосвязи гормональной индукции регуляторных ферментов гликолиза и судорожной активности головного мозга крыс// мевропатол. псих. 1937, No 6, С.870-873.

9. Batke J,, Nazarуап К.В. Mechanise of the metabolite

transfer between bovine brain phosphoglycerate mutase and gaimra cnoltee. Comparison of u non-divergent and a divergent metabolite flux// Mater. Synp. Chemical Physics of Enzyme Catalysis, Tallinn, 1987, p. 155.

10. Batke J. , Nazaryan K.B., Karspetian N. Complex of brain D-photphoglycerate mutes« and qanuna enolase and its reactivation by I>—glycerate 2,3-bisphosphate//Arch. Biochem. Biophys. 1988, v. 264, р.510-51в.

11. Nazaryan К.В., Batke J. Reactivation of the brain enolase and.phosphglycerate mutase enzyme cootplex by 2,3—bi sphoepho— glycerate//In 14th Congr.Biochem. Prague, 1988, TH 358.

12. Wajs M., Nazaryan K.B., Kuetrzeba-Wojci~ka 1., Pietkiewitz J., Molna E., Wolny M. Comparative studies of catalytic, kinetic and immunological properties of enolase from carp muscle and bovine brain//In 14th Congr.Bioche®. Prague, 1988, "1H 772.

13. Назарян К.Б., Егорян P.У., Каэарян Б.А. Очистка, оизико -химические и иммунологические свойства 1)~Фос©оглицерат мутазы иа мозга быка//Нейрохимия, 1988,т.7, с.366-573.

14. Геворкян Э.С., Назарян К.Б., Костянян А.А. Модифицирующее действие эстрадиола и прогестерона на эпилептическую активность головного мозга крыс//Проблемы эндокринологии, 1989, т.33, с.72—76.

15. Nazaryan К.В., Kostanyan A.A. Central nervous system

• glycolysis regulation by sex steroid hormones//In 8th European Neurochem. Soc. Met., Leipzig, 1989, p 4:4.

16. Назарян К.Б. Взаимодействие между енолазой и пируват-киназой из мышцы кролика//Биол.«иАрмении 1990, т.43, с.21-26.

17. Назарян К.Б., Карапетян Н.Г., Каэарян Б.А. Различия в устойчивости изоферментов енолазы при инкубации р растворах нейтральных солей//Нейрохимия, 1990, т.9, с.215-222.

18. Назарян К.Б., Костанян А.А., Каэарян Б.А, Регуляция гликолиза в головном мозгу крыс эстраднолом и прогестероном//Нейрохимия, 1990, т.9, с. 332-338.

19. Назарян К.Б.,Егорян Р.У..Каэарян Б.А. Взаимодействие енолазы и фс сфоглицератмутазы головного мозга//Нейрохимия,1990,т,9,с,326-331.

20. Назарян К.Б., Вайс М., Егорян Р.У., Кустжеба - Вуйцитска И., Петкевич Я. Регуляция активности мейронспецифичеекой енолазы некоторыми эндогенными соединениями//Биохимия, 1992, т.57, с.1827-1833.

21. Kostanyan A.A., Nazaryan K.B. The regulation of ret brain pyruvate kinase by estradiol-17 betta//Biochwn. Int. 1991, v.24, p.867-875.

22. Kostanyan A.A., Nazaryan K.B. Rat brain glycolysis regulation by estradiol 17 betta//®iochim. Biophys. Acta 1992, v. 1133, p.301-303,

23. Магагуап K.B,, Climent F. , Tampa P., Bi room an В., Batke J. Interaction of rabbit muscle enolase and D-phoephoglycerate mutase studied by EL ISA and by batch gel - fj1tration//Arch. Biochem. biophys, 1992, V. 296, p.650-653.