Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимическое обоснование применения L-аспарагиновой кислоты и функционально связанных витаминов для коррекции биоэнергетики в ткани головного мозга в условиях гипоксии замкнутого пространства

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимическое обоснование применения L-аспарагиновой кислоты и функционально связанных витаминов для коррекции биоэнергетики в ткани головного мозга в условиях гипоксии замкнутого пространства"

ордена ленина и ордена дружбы народов ' академия наук украинской ссср

'ордена трудового красного шашишститут биохимии им. а.В.палладина

На правах рукописи

' абу асали имад илья '

БИОХИМИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ь-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНО СВЯЗАННЫХ ВИТАМИНОВ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ БИОЭНЕРГЕТИКИ В ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ ЗАМКНУТОГО ПРОСТРАНСТВА

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискакие ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1991

Работа выполнена на кафедре биохимии Одесского государственного университета им.И.И.Мечникова. -

Научный руководитель доктор мед'*цинекюс наук,

профессор Розанов А.Я. Официал ьныэ оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Хмелезский Ю.В. . ,

КЬнди^ат биологических наук, с.н.с.

V

Терлецкая Я.Т.

Ведущая организация - Институт питания АШ СССР

■ ' - -. • Защита диссертации состоится "31" ОК) Я В РЯ 1991 года в -/^У часов иа заседании специализированного совета К 016.07.01 в:Институте биохимии им. А.В.Палладина АН УССР по адресу: 25203Р,г.Киев, ул.Леонтовича,9. .

•С диссертацией' можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. а.В.Палладина АН УССР.

Автореферат разослан года.

Ученый секретарь ,

"Специализированного Совета О.В.Кирсенко_

• ' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность темы. Проблема гипоксии является центральной медихо-5иологической проблемой: она включает в сеС-я физиоло1ичеекие,бис-симические и,фармакологические аспекты. -Несмотря на большое коли- • tecTBO средств и способов борьбы с гипоксией биохимическое обосно-тние и разработка новых приемов антигипоксического воздействия сс-'ается актуальной задачей-. Одним из наиболее привлекательных-и пло-' ;отворных направлений в решении этой задачи является испытание ан-■игипоксических свойств естественных метаболитов, биорегуляторов, I пищевых факторов (витаминов), создание производных на их основе. >азработка принципов комплексирования этих соединен;.й с целью полугнил, эффективных и малотоксйчнкх антигипоксических препаратов Кръисановский Г .Н. 1984-1985; Максимович Я.Б.,1988; Розанов А-.Я.1985) ¡сходя из этих положений мы обратили внимание на такой активный ме-аболит как Ь-аспартат. В современной медицине он широко ггименяет-я в виде аспарагината калия или магния, причём в основном как сре-,ство коррекции ионного баланса, т.е. как носитель калия и магния;. ■ то же время вполне вероятная и из биохимических позиций целесооб-азнад метаболическая роль молекулы Ь-аспаргиновой кислоты поч-и е учитывается. Исходя из этого перед нами была поставлена задача босновать- с биохимической точки зрения пригодность Ь-АСП для кор-" екции метаболизма мозга при гипоксических воздействиях. Выбор нер- •, ной ткани как основного-объекта исследовании определяется особой ольга АСП в .'мозге, где он выполняет медиаторную и метаболическую ункции. В отношении последней, т.е. метаболической функции Ь'-ас-артатз. многие проблемы также остаются.нерешенными. 3 последних ■ уководствах по биохимии указывается, что малат-аспартатный "челнок-мозге отсутствует (Страйер Л.,1984; Ленинджер А.,1985); э то же ремя в литературе имеются сведения об обратном (Brand М.0,1974). зучение метаболических и антигипоксических эффектов Хг-АСЛ предг ' элагалось в сочетании с витаминно-коферментным комплексом Яента-ярувит,, разработанным в апробированным на кафедре биохимии ОГУ И.И.Мечникова под руководством А.Я.Розанова. Перечисленные юторы определяет актуальность настоящего исследования. зль'и задачи исследования: Изучить некотсрые возможные биохими-эские механизм.! защитного действия L-AGH и витаминно-кофермектг» >го комплекса Пентапирувята при гипоксических воздействиях и обо-ювать возможность их совместного "применения с'целых коррекции щоксических нарушений, метаболизма." Для достижения данной цели ■

' - 2 -

необходимо решить следующие основное-задачи: . , •

1 - 'Оценить эффективность L-АСП в сравнении с другими естественны-

ми метаболитами при гипоксии замкнутого, пространства, выявите дозовую зависимость эффектаЬ-АСЛ.-.

2 - Исследовать катаболизм меченого L-АСЛ в различных' отделах го-

ловного.мозга, сравнить с интенсивностью катаболизма Других естественнъх метаболитов, сопоставить полученные результаты с. результатами физиологических наблюдений. •

3 - Изучить фармакодинадаку и катаболизм Ь-АСП в организме при ги-

поксии замкнутого пространства, исследовать влияние l-АСП на ■активность ферментов и содержание промежуточных продуктов ЦТК состояние трансаминаз и систему ГАШ голодного мозга.

4 _ Изучить модифицирующее действие пиридоксаль-5-фосфата и витад

но-коферментного комплекса Ленталирувит на метаболические и ф: миологические эф|вкты Ь-АСП. Научная новизна. Впервые показано, что L-АСП обладает защитным действием при шоксии замкнутого пространства и.высотной■гипокси одновременное ...назначение комплекса Л-. .■'апирувит усиливает защитно действие L-АСП. Установлено, что при гипоксии замкнутого простран ства в головном мозге повидается активность'ACT и ускоряется ката болизм Ь-АСД до ^"^COg. Показано, что защитное действие L-АСД ci зано с нормализацией активности дегидрогеназ и содержания промеж} _ точных продуктов LfCK. Установлено, что при гипоксии замкнутого n¡ странства, мозг активнее, чем в норме поглощает экзогенный инъещ рованный L-АСП. Впервые обнаружено., что нагрузка экзогенным L-A( в условиях гипоксии замкнутого пространства приводит, к усилению продукцииТАМК к Г^-реакций¥Тад0№ом_мозге_« На основании полу ■ценных данных дано обоснование использования l-АСП в сочетании с комплексом Ленталирувит для коррекции метаболизма мозга при гипс _сических воздействиях на организм. '..'.' Практическая ценность работы. Проведенные исследования даот осно вание для расширения' сферы использования имеющихся препаратов ас ларагиновой кислоты с учетом ее метаболических эффектов. В резул тате экспериментов подобраны, оптимальные дозировки и условия при ■ менения аспартата с целью достижения максимального защитного эффекта при различных формах гипоксии. Апробирован новый (кофермег-: нЬ.-витаминный) вариант комплекса Ленталирувит,'который может рте основой для соответствующей медицинской фармакологической разработки.

ДГфобсЩия раО'оть: » пуЯли.^ацич. Материала диссертации доложены на теоретической сеютаре кафедры 5иоглади ОГУ им.'.!,И.Мечникова в .Î&89, JS'?D и 199Г годах, на заседал и и Одесского отделения .сйцестла био;:им1«о8 в I9CI года, на Всесоюзном совещании "Субст- ' ратм очисленчп как одатгогеиы" (Лущкно-,К'89г.), ка В се с од л .ом совещании "Фгаиологин и биоэнергетика гипоксии" 0"ушино,199*г.). JfrtftWitatffK у. внздренйа По материалам диссертации опубликована 4-статьи, ,3 -статги напрарлены' о п^ать; Материалы диссертации ис-прл?>$,ултся п учебном процессе кафедры биохимии и кгфедры флэиоло-гии _QT7npn чккии курса ле;сг,йи. Практический рекомендация Ьктегса-юцие яг работ i пере'дпнь- для апгюбиции » клинику нейрохирургии и нейрореакиматолггии Одесского Мед/цинского' института км.К.'И.Ф.ро-гова.

■ Структура, и объем рс&огы, Диссертационная работа состоит из введения, обзора,литератур», экспериментальной части, вклкчаящей ме-тодчческум главу и 3 глав-i описания соСствекнмх результатов, об-сужДбкиь лолученнул результатов, выводов, списг.а исполы/ованных источников' (241 наименование, в том числе 110 советских и 13Г ¿ару-5еяньк. авторов). Диссертации изложена на 14;» г границах мзиинопис--1 но.'о текста v. иллюстрирована 21 ' .рисуькмм и 7 таспицали.

МШРИШ И МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЙ

O67.P1ÍTOM исгяедоэалия служчли белые крысы линии Вистар ( самки) и гибриднке мши (СВАх С57(Я1ао.Л /61,, которых содержали-' на стандартом рацлонз г/вария. Пег.эльзовпли половозрелых кркс-cawîK (''-6 yec.,itacc>. 150-200г), а также стар*« крыс <i'i-I8 чес, mf.cca 300- 4ССг. ). Ocçee количество исполъзсрокных животных составило 2C0Ü нчиеН и ООО крьге.

В качестве модели гипоксчческих воздействий нами избрана ги-. поксия Замкнутого пространства к высотная гипсксия. В первом сяу> чее ммзей помещали п герметически земкнут!® камеры с жизненной кубатурой на одно животное 125 см3, (сстрел гипоксия) и 668 с.\.3 (по-дострая гипоксия). Во втором случае крыс помечали в ьксикатор объемов 8000 см3 по 6 половозрелых или по 4 старых и "по-Днимгли на высоту" 8500 м со скоростью 60 t./сек. Регистрировали предолжитель-. ность да.эни животных от моумнта помещения в' камеру до последнего атонально! о вдоха "-А'рэс'считыпг-лн средшию продолжительность *изни (СШО, а "ракже распределение сроков гибели животных во времени. При iicrispîalîViH защитного действия субстратов и витаминно-кофермепт-н.к ко.яыекооа раствора ?ет,еств нейтрализовали до рН=?,4 с помо-

ftbiC каНСОз и вводили подкожно. .Все использованные немеченые суО-с-гратк, витамины, коферменты и реактивы соответствовали уровня ©чистки Reagent Grade.

Кситрольцш животным вводили физиологический раствор. ■ V• . При проведении радиоизотопных исследований использовали 1~4Д4С-аспарагиновую кислоту (' Amt .-sham ) с удельной активно-стыз 3,0 ГБк.ммоль , I-^C-У-аминомасляную кислоту (institute of isotopes,Budapest) с удельной активностью 438.08 МБк.ммоль-*, 1-*^0-<-кетоглутаровую кислоту ( Amersham ' ) с удельной активностей 2,18 ГБк.ммоль" , кетоглутаро^уя кислоту, динатрие-ву» соль ( Amershan ) с удельной активностью 562,4 ЫБк.ммоль"*^, 1,4-^. янтарную кислоту ( Amersham, GB) с удельной активность» 4,11 ГБк.ммоль-1

Катаболизм меченых субстратов в гомогенатах моэга in vitro оценивали по выходу ^COg согласно методике Gubler С.et aíI974) в модификации Розанова З.А. (1989). Учитывали коэффициент улавливания 'из. объема поглотителем и степень гашения радиоактивности, определенные .заранее в модельных экспериментах. Яри изучении распределения меченого L-ACil in vivo оценивали общую радиоактивность тканей по общепринятой методике с подщолачиванием и высушиванием гомогенатов тканей. Подсчет радиоактивности твердых образцов осуществляли с помощью газопроточного -счетчика 2I54-I-IM "Протока" в режиме 2 if.

При проведении биохимических исследований использовали гомо-генаты и митохондриальную фракцию из ткани -мозга. Митохондрии получали согласно методическим рекомендациям Ещенко Н.Д. (1982). Активность пируватдегидрегеназного комплекса (ЦДЮ, с^-кетоглута-ратдегидрогеназного комплекса (КГДК), мала.тдегидрогеназы (МДГ) и сукцинатдегидро геназы (СДГ) определяли как рекомендовано Ещенко Н.Д. и Вольским Г.Г. (1982) и ЛахомовоР В'.А. и соавт.(1982). Активность аспартат- и аланинаминотрансферазы определяли согласно методическим рекомендациям Осадчей л.м. (1982) .. Содержание проме-' «уточных метаболитов цикла Кребс^ (пирувата, лактата, «С -кетоглу-тарата изоцитрата, оксалоацетата, малата) определяли ферментативными методами после их экстракции хлорной кислотой (Ещенко Н.Д. 1982). Содержание- свободных аминокислот (глутамата, ГАМК их-АСП) определяли по методике Оыгинского И.А. и соавт. с использованием хроматографии на-бумаге (1965). При определении активности глу-тачатдекарбоксилазы (ГДК) также использовали методику Сытинского И.А, и соавт. (1955) в модификации Розанова В.А. (1980). .

Y -5-

' Белок определяли по методу Ъоту D.H. et aiiI95I). Результаты обработаны статистически с применением методов вариационной i непараметрической статистики (Сепетлиев-1968).

OCHOBHÜS РЕЗУЛЬТАТА И Щ OBOTiE^HHE

I. Изучение защитного действия ь-АСЛ при гипоксических воздействиях

Изучение защитного действия ь-АСП при гипоксии в сравните-иьном аспекте с другим^ субстратами являлось необходимым условием »сей дальнейшей работы. Особый интерес представляло изучение защитного Действия L-АСЛ при гипоксии зашмутого пространства. Эта модель гипоксии имеет большое практическое значение, поскольку отражает реальную жизненйуд ситуацию пребывания в гермозамкну-гых объемах, например при аварийных обстоятельствах.землетрясениях, и т.д. На организм при этом действует целый ряд факторов: снижение парциального давления 0^, увеличение парциального давления COg, ювнпение температуры и влажности, накопление в воздухе антропогенных ядов, - аммиака, различных альдегидов, спиртов и других сое-*инений. В то же время на клеточном уровне характер изменений метаболизма мо-ет рассматриваться как комплекс неспецифических ги-мксических нарушений (Малкин В.Б. ,1983; Сулимо-Самуйло ß.K. ,1979; Игаджанян H.A.,Г986). 'Поэтому мы пользуемся термином "гипоксия замкнутого пространства" (ГЗД) для обозначения данного состояния. 1аии исследоважя показали (рис.1), что Х-АСЛ при. профилактическом юдкожном введении обладает достоверным выраженным защитным действием при ГЗЯ, Причем его эффект' зависит от дозы и времени от молен^ инъекции до помещения в камеру. Выяснилось, чтоЪ -АСП был тболее эффективным при дозе 100 мг/кг и при введении непоередст-зенно (за 3-5 мин) до моделирования гипоксии.

Ваянным представлялся вопрос о сравнительной эффективности Ь -АСП и других естественных метаболитов, многие из которых обедают защитным действием при гипоксии {Гацура В.З., 1988, Бобков З.Г.,1984). 1

Мы сравнивали l -АСЛ с эффективностью эквимолярных доз таких зубстратов как пируват, <*(,-кетоглутарат, сукцинат, * глутамат, ас-, шрагин и ГАМК. Как видно из полученных данных (рис.2) ь -АСП действовал примерно с такой же эффективностью, как глутамат, пи-руват и ГАМК,о^-кетоглутарат, сукцинат и аспарагин действовали злабее. ' ' • - '

- б -

СПЖсек 1050

950

' 850

750

650

Г

-АСПгООмгЛг

---АСП100 мг/кг

---АСП 50 мг/кг

30

мин 60

Рис Л. Зависимость 'зшцитного действия аспартата при гипоксии замкнутого пространства от дозы и времени от момента .введения до помещения ч камеру. <Ъ горизонтали - время после введения, М1ш; по вертикали - средняя продолжи--тельность жизни (С;И) в гиаоксичесхой камере. »

180Г В '/. от контроля 160 . 140 120 100

1 2 3 <5 лимит Л-кг еукциндт гд9

Щ- СОЧЕТАНИЕ СИБСТРАТОВ С ПЕНТАПИРМИТОМ

Рис.2. Изменение СШ мыл ей в условиях острой ГЗД (объем камер! 125 см3 для животного) при защите метаболитами (белые столбики) и их сочетанием с комплексом Лентапирувит (черные столбики). (в %. от контроля со СШ 12,36*0,25ми1

в этих экспериментах мы проверяли также влияние одновременного введения пиридоксаль-5-фосфата (ПАЛФ) (3 мг/кг) и комплекса Пеитапи-рувит . (тиаминпирофоефат 0,7-1 мг/кг, липоат 4,6-5 мг/кг, никотина? 7,4-7,5 мг/кг, 4-фосфо-пантотенат натрия II-I2 мг/кг и рибо-флавинмонофосфат 3,5-3,7 мг/кг), на защитное действие исследуемых субстратов,' Выяснилось, что ЛАЛФ незначительно усиливал защитное действие ДСП, в то время как. Пентапирувит на 30-60% усиливал защитный эффект глутамата, аспартата, ГАМК и аспарагина.

'Комплекс Пентапирувит сам по себе также обладал защитным.„.Л-ствием,. увеличивая СШ ммпей в ГЗП на 36%. Примерно такие же закономерности, наблюдались при изучении.защитного действия субстратов и витаминов на модели более мягкой гипоксии, когда СШ (милей) сос-®шга0(95,13^3,35 мин). Защитное действие субстратов и витаминов проявлялось н£ фоне выявленной индивидуальной резистентности животных к гипойсии» При этом эффект вводимых соединений проявлялся либо в удлинении СПЯ как чувствительных так и устойчивых животных, либо в переходе всех животных в категорию устойчивых. Последнее наблюдалось при совместном применении Ir-АСП и Пентапирувит.Можно полагать, что субстраты окисления и витаминно-коферментные факторы в данной ситуации выступают как адаптогены, способствующие болев адекватной приспособляемости организма в начальные периоды пребывания в гермообъеме, вследствие чего отдаляются сроки гибели кивотных. Важно подчеркнуть, что защитное действие АСП проявлялось но только при ГЗП, но и при высотной гипоксии (6500 м над уровнем моря), что свидетельствует об универсальном характере антигипоксического действия АСП, ; '

Эффект АСЛ проявлялся не только у молодых, но и у старых животных т.е., при снижении функциональных резервов организма.

Эта часть, исследований послужила основанием для дальнейших экспериментов по изучению возможных механизмов защитного действия

1-асп.

Z, Сравнительное изучение катаболизма меченых субст- ' ратов. Влияние ПАЛФ и комплекса Пентапирувит. Одной из наиболее вероятных причин хорошего защитного эффекта АСП при гипокеических состояниях является его быстрое включение в метаболизм мозга. Для оценки этой возможности мы провели ряд исследований в. которых измеряли выход при добавлении Й.СЦ к гомогенатам различных отделов мозга (мозжечок, кора, ствол). L-АСП добавляли-к гомогенатам в возрастающих концентрациях (0,1; r,vI0 и 100 мМ) время инкубации со став;» 10 мин. Наблюдался поч-

- fi -

ти яинсйшЯ прирост впгеда i<5CO, вплоть до концентрации 10'кМ, однако при концентрации ЛСЛ 100 Ш внход 14С02..тееньшался, Что', может бсть спяпано с ингибирумщим влиянием высокой концентрации ACti h i ACT активность, о чем имеются сведения в литературе { Qui-roda С. e.a.,ISSö). Вццелсние *4СС£ в К0Ре наибольшее, в стволе несколько меньше, чем в коре, а в мозжечке достоверно меньше чем в коре. Таким образом, наибольшая интенсивность катаболизма L-АСц до ^üOo происходит в высших отделах головного мозга, кэтс.р'й как известно отличается наибольшей интенсивность» реакций окислительного метаболизма (Палладии A.B.,1У72-1975). Для сравнения мы исследовали выход ^Оо при добавлении эквимолярных количеств меченьк других субстратов 1,4-14С-ЯК, 5-14(Х-КГ и 1-14( ГА!ЛК. Порте два субстрата непосредственно входят в ЦТК и могут дать информацию о лимитирующей роли ACT по отношение к катаболизму АСП, поскольку от нее не зависят. Что касается ГАМК, то она внбрана для сравнения, поскольку так же как й АСЛ включается в метаболизм после стадии трпнсаминиро пания с участием ГАМК-^кетоглу-таратаминЬтрянсфероэм. 's

Если представить В!Ход С0о при декарбоксилировании перечне' лонн'тх субстратов в процентах, от добавленной радиоактивности, то получается наглядная карт™а (рис.3, для сравнения исследована 1-14С-«(-КГ, псе субстраты в кснцентраики I мУ)

$0

х

20

1 - ГАМК

2 - 5-кГ

3 - ЯК

4 - АСП

5 - 1-кГ

п

t I

f=Effl

п

I I

Г"»

I

Рис.3 Декарбоксилиро-вание меченых субстратов при их добавлении в концентрации I мМ. 'До вертикали -%% от добавленной радиоактивности. Пунктиром обозначены значения выхода *4С02 после коррекции.

Полученный результат можно объяснить тем, что1-^^С-Ч-КГ теряет ^СО^ непосредственно при входе в ЦТК, а тжже при «<-декарбокси

1 г г 4 5

м0!ж(ч0к

12 3 4 5

КОЩ ;

■effl

1 2 3 4 5

<Т»вА

лировании образующейся из нее ГДУ. Остальнке субстраты декарбок-силируотся на стадии, оксалоацетата или на стадииизоцитрата. ко-торуе относятся к разряду медленных (Ещенко,1У82). Те субстраты, у которых цепь метаболических превращений до стадии декарбокси-лирования метки коротка и представлена бкстркад реакциями (сук-цинат и АСШ, дают. наиболъшя виход ^СО^. Если скорректировать полученное результаты с учетом прохирального характера цитрата, образующегося из всех субстратов кроме (пунитирная

..линия), то видно, что быстрее всего декарбоксилируется 1,4-^С-ЯК,. а затем в убывающем порядке идут 4- С-АСЛ, 5-^С-<-;£Г и 1-^С-ГАЩ."

Интенсивность катаболизма АСЛ мечет зависеть от скорости 'его включения в ЦТК и от интенсивности потока в самом ЦТК. Перв1Я путь мотет бсть ускорен при добавлении ЛАЛФ - кс?актср трансами-наз, а второй при добавлении комплекса Лентапирувит-, стимулирующий дегидро'генази кетскислот. '

Как видно из предстанленн'.к даннюс (рис.4) преинк.убация гомо-' генатов мозга 40 кхИ Ац* (черн!Х5 столбики) приводило'к достй-верной активации катаболизма ДСЛ И4<-:й , меченого по I и 5-поло-. жениям. "___

В 1 ОТ «СХОДНОГО УРОЬНЯ

110

но -

2 но

120 100 10 60 ¿0 20 О

5-«С-«£кГ • Я-К

ГАМК

АСП

Рис

,4. Вл'ияние предынкубации с комплексом коферментов и с пиридоксаль-5-фосфатом на интенсивность катаболизма меченых субстратов. Длительность' предынкубаши - 5 мин.

': ' - 10 - . С другой стороны, прединкубация гомогенатов с комплексом Дентапи-рувит-в коферменгном варианте (ТИФ 0,03 мкМ, лидоат 0,6 мкМ, Co-SH-0,3 мкМ, НАД 0,5 мкМ, ад 0,06 мкМ). выявила стимулирующее влияние на катаболизм ГАМК и АСД и в меньшей степени на ■ катаболизм o¿-KP (полосатые столбики рис.4). г Таким образом, полученные данные свидетельствуют об активирующем влиянии ЛАЛФ и комплекса кофе'рментов in vitro на катабо-

• лизм субстратов ЦТК, причем катаболизм АСД достаточно выраженно

. активируется как при добавлении ПАЛФ, так и комплекса коферментов. Однако важно убедиться,что этот эффект наблюдается не только in vitro,' но и in vivo . Мы спланировали данный эксперимент таким ооразом, чтобы не только выявить влияние комплекса, но и оценить, его эффективность при снижении функциональных резервов : •организма, в частности, при старении. :

В данной'серии экспериментов молодым половозрелым.и старым крысам'вводили коферментно-витаминный комплекс включающий витамин Bj (8,3 мг/кг) витамин Bg- На (24,12 мг/кг), флавинмононук-■ леотид (9,13 мг/кг), никотинамид (19,54 мг/кг), в виде эабуферен-ных , НаНСОз до рН-7,4 растворов внутрибрюшинно. ■

.Как зидно из представленных данных (табл.1) у старых животных ; • интенсивность катаболизма АСД примерно ниже в 1,5-2 раза, чем у молодых как в. мозге, так и в печени.

• :. Таблица I.

■ Влияние витаминно-коферментного комплекса при одно-• • кратном введении на катаболизм АСД в гомогенатах от- ' Делов мозга и печени (нмоли ^^COg ткани .мин~* ■ > V п-б-8 кР <^0,05, KKP<0,02,ias£ Р <Ч),001 по сравнению с контролем) \ .. ;

• объект . : Молодые животные :с'те: Старые животные сте-

:контроль :опыт+ К.В. контроль .: опыт+K.B.j^Jjj

_:_:_:вации : _: вации

-.'.Мозжечок; 9.7Í0.2 КП,6±0,47 19,5% 3,9*0,07 ^,2640,05 9,2%

Кора' . Ю,7±0,9 Д5,18±0,95 41,8% 7,2^,75 ^,4±0,9. 30,5%

Ствол 7,46±0,65 xIO,2iO,73 36,7% 4,7640,29^3240,69 32,7%

¿Ьчёнь - 67,842,12 X60Í2,48 18% 46,l40,89 J§,3±2,I : 26,5%

. Через сутки после одаократиого. введения комплекса Дентапи-рувит наблюдалась активизация катаболизма АСД как в отделах мозга, так и в печени, причем у молодых животных, степень активации

- II - '

была больше в отделах мозга, а у старых животных в печени. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что использованный витаминно-коферментный комплекс Пентапирувит не только обладает стимулирующим влиянием на катаболизм АСЛ in vitro, но и способен оказывать аналогичное влитгде в экспериментах in vivo. При этом стимулирующее влияние комплекса на катаболизм AC1I проявляется как у молодых, так и у старых животных, т.е. при снижении функциональных резервов организма.

3.Некоторые биохимические механизмы защитного действия • АСЛ и комплекса Пентапирувит при гипоксических состояниях.

Проведенные исследования подтолкнули на? к изучению катаклизма и фармакодинамики AC1I в организме животных при ГЗП. Лри изучении фармакодинамики АСЛ введенного в дозе ICO мг/кг выяснилось . (рис.5), что накопление метки в крови, печени и мозге в первые 40 мин после введения характеризуется сигмоидной зависимостью.

Рис.5 • ФармакодинамикаЬ -4-АСЛ. в организме мгоей в норме и при ГЗП. Накопление меченого АСЛ в крови, печени и головном мозге после его введения интакт-ннм (кривые) и помещенным в гермообъем(столбики) жи-вотнм.ьПо горизонтали-вре-мя в мин ,ло вертикали- ; накопление X, -АСЛ в мг.кг' массы ткани.К -кровь, Л -печень, ■ М-, моа.г),'

40 мин

При этом накопление метки в печени примерно на порядок превышает. накопление ее в мозге. Пребывание в гермозамкнутом объеме существенно изменяет фармакодинамику введенного АСЛ: его накопление в' . мозге и в печени усиливается в первые 10" мин гипоксического воздействия. Таким образом, при ГЗЛ происходит усиление проникновения ' АСП из крови н ткани, что может отражать компенсаторную реакцию организма. ' _ •

При изучении интенсивности катаболизма меченого АСЛ, добавленного в концентрации 10 мМ к гомогенатам головного мозга мнаей пребывавших в гермозамкнутом объеме показано (рис.б), что катаболизм АСП в мозге при гипоксическом воздействии отчетливо и достоверно возрастает до определенного периода (8 мин), после чего эта'компенса-' торная реакция постепенно ослабевает .по-видимому, в силу грубых нарушений в метаболизме мозга.

РИС.6 : ,

Интенсивность катаболизма Ниолк ис0,-г" ткани- мин" L~4-I4C-ACÍI в услови- 300 яхГЗЛ, при защите L-АСЛ (2) и при за- £50 щите Ь-АСП,комплексом Пентапирувит(З). g^ •(По горизонтали- время пребывания в:термокамере в мин. пб-вер- 150 тикали - интенсивность катаболизма АСД.

мин

При этом обнаружилось, что если животным предварительно 'вводили с-целыо защиты от гипоксии Ь-АСП (100 мг/кг), то интенсивность его катаболизма в. гомогенатах мозга ¿ггс^годостоверно повыаалась. Одновременное профилактическое введение Пентапирувит еще „больше усиливало эту компенсаторную реакцию метаболизма. И так^ одним .из биохимических механизмов действия АСП и'Пентапирувит. при ГЗП является.ускорение.катаболизма АСП в нервной ткани на начальных стадиях гипоксии, что сопровождается повьюением поступления его в мозг. Все эти факты указывают на то, что включение АСП в обмен является важной компенсаторной реакцией метаболизма при гипоксии и что мозг испытывает при гипоксических воздействиях повшенную потребность в 1-АСП. Поскольку включение АСП в метаболизм зависит от . функции трансаминаэ, :а дальнейшая судьба образующегося бксалоаце-тата связана с активность» ферментов ЦТК,. логическим продолжением экрлериментов было изучение состояния трансаминаз.дегидрогеназ ЦТК, '¿.'также содержания промежуточных продуктов ЦГК при ГЗП и введении Х.-АСП и Яентапирувита.

Результаты определения активности ферментов (дегидрогеназ, и трансаминаз) представлены на рис.7. Как видно из представленных

»них на II-I2 мин острого гипоксического воздействия (период нь-гупления гипоксическю судорог) в митохондриях головного мозга алей отмечается резкое угнетение активности дегидрогеназ кетокис-эт и МДГ. Активность МДГ и АДГ в цитоплазме снижалась незначите-ьно, Трансаминазы нервной ткани претерпевали неодноэ»; >чные измени ия : активность АСГ проявляла тенденцию к повышению как в миао-пндриях, так и и цитоплазме, а активность АЛТ достоверно снижаюсь в обоих компартментах. У животных, которым предварительно с элью защиты от. гипоксии вводили АСП, в этот же период наблюдения ¡стивность дегидрогеназ кетокислот в митохондриях была достоверно ыпе, чем у незащищенных, хотя и не достигала контрольных значений, живность МДГ также достоверно повшалась, а активность СДГ в ми-эхондриях и МДГ в цитоплазме даже превыпала уровень нормальных квотных.

Введение АСП уменьшало подавление АЛТ-активности и усиливало цаптивную реакцию ак чзации ACT. Эти тенденции сохранялись, хотя в несколько ослабленном виде, до 14-15-й мин наблюдения, т.е. э момента возникновения судорог у г ицищенных животных. Одновре-гнное применение АСЛ и комплекса Пентапирувит приводило к тому, го наблюдаемые изменения были более выраженными. Таким образом, циим из биохимических механизмов действия l-АСД и комплекса Лен-аяирувит является подержание высекой функциональной активности Ьгидрогеназ и тпансамкназ в нервной тхакк сггдиЖгипл^сическо-э воздействия.

'Анализ содержания основных' промежуточных продуктов ЦТК в нер-яой ткани при.этом, а.также уровня диктата и'пирувата показ-ал, го введение Ь-АСП ослабляет выраженность типичных гипоксичесКих крушений: повышения уровня лактата и пирувата. к изменения сбвтног ения между ними, подъема уровня иэоцитрата и снижения содержанья С-КГ, малата к.ЩУК. Корригирующий эффект АСЛ значительно улучшатся при введении комплекса Пентапирувит и,как вытекает из анализа олученных данных, зяключаетстгтг основном в обеспечении сбалансиро-анного функционирования быстрой и медленной части ЦТК при гипокси-веком состоянии'. , J " ;

Полученные данные о взаимосвязанных и однонаправленных изме-ениях активности трансаминаз и дегидрогеназ ЦТК хорошо соответст-уот '•'• современнш . представлениям '' о структурно-функциональном цинстве этих ферментных систем в составе надмолекулярных комплек-эв - метаболонов, (Веескиаав 3,19"б-1987; Добарев А.Е.,1987), а акже о существовании системы быстрого трансаминазного цикла скис-енйя биоэнергетических субстратов - цикла'^раунштейна (Кондра-

нова М.Н.,1988), На заключительной стадии работа мы провели серда экспериментов которая была продиктована существующими представле яиями о метаболической и медиаторной функции L-АСЛ в мозге, В час-гности хорошо известная и детально исследованная в последнее &ремя роль L-АСП как возбуждающего нейромедиатора и эндогенного фактора яейродёструкции (Раевский К.С.,1986; Кертис О.Р.,19В9;Козловский В.Л.,1990);вьгаывает дополнительныэ вопросы о механизмах защитного' действия АСЛ при гипоксии. Здесь сразу необходимо отметить, что нейротоксическое, действие экзогенного АСЛ наблюдается только при его значительных дозах, порядка (500-1000 мг/кг и более) и при его многократном введении ( Abdul-0. ,1085; Firütelstein 1.Ц1983).

Нами, как уже указывалось, было установлено, что наиболее ¡эф-фективньми антигипоксическими дозами были дозы порядка 50-Ю0мг/кг, кроме того в .специальной серии экспериментов было установлено, что эти метаболические дозы АСЛ повыпаит в нервной ткани активность глутаматдекарбойсилазы и увеличивают содержание эндогенной Г/СИ, которая как известно, является основным центральным тормозным ней-ромедиатором (Сытинский И.А.,19?7;Раевский К.С.,1986). Причем как видно из представленных данных (рис.8) при ГЗЯ в н ной ткани примерно в равной степени снижается уровень ГЛУ.АСЛ иГАМК. 9 Г

в

Рис. 8

Изменения содержания 7

ГЛУ.ГАМК и АСЛ в голо- 6

вном мозге мыпей в

различных периодах 5

ГЗП. До-вертикали-содер^

жание аминокислот, в _т

мкмолях. г ткани. 1-контроль(интактные) 3-14-я мин ГЗП,защита АСП, судороги;4- 10-я мин ГЗЛ, защита АСЛ, .' бессудорожный период.

3

мкмом, г*' ткани

г к мк

з ' я глутамат дъ'п

Черная точка -Р<,0,05; сравнение с интактными; пустая точка -Р<^0,05; сравнение с незащищенными. Введение АСП с целью защиты от гипоксии ослабляет снижение фонда ГЛУ и значительно пополняет эндогенный фонд АСП.и ГАМК. Таким образом, несмотря на то, что АСЛ является возбуждающей аминокислотой, при его системном введении он в ходе метаболических

аспартат

пргоращений в нервной ткани способен пополнять фона эндогенной rte, что такие может быть одним из существенных механизмов его за ttiiTiioro действия.

Таким образом проведенные исследования, в которых детально . проанализировано защитное действие ДСП при гипоксических состоя- .. нцях и неучены некоторые биохимические механизмы этого защитного п^Мсточя-, позволяет высказать рекомендации практического характера 0. частности;,мы считаем, что применение существующих препаратов АС долтно'осуществляться с учетом его метаболических, нейротрансмитте ¿ЭДектов, приведенных в настоящей работе. '

. ВЫВОДЫ

- I, Представлены биохимические обоснования применения L-АСП в сочетании с комплексом функционально-связанных витаминов и коферт ментов Пентапирувит (тиаминпирофосфат., липоат, 4-фосфопантотенат натрия, никотичат, флавинмононуклеотид) с целью коррекции метаболизма мозга и защиты организма при гипоксических воздействиях.

. 2. !> -АСП обладает выраженным защитным эффектом при гипоксии < замкнутого пространства и. высотной гипоксии, оптимальной дрзой

-АС11 при введении непосредственно перед гипоксическим воздействием является 100 мг/кг массы при острой гипоксии и 50 мг/кг при подострой гипоксии. ' ' ■ .">.

3. Защитное действие ¿ -АСП при гипбкейи связана с его спосс бно'стью быстро включаться в метаболизм в мозге; при.гипоксии наблюдается адаптивное ускорение катаоолизма'L -АСП и изменение фар-мр.::одинамики введённого подкожно и -АСП: pro накопление в мозге и' печени я поступление в кровь из места введения- ускоряются. .

4. Одним'из биохимических механизмов реализации защитного эффекта Ь.-АСП б нервной ткани .при Г'ЗИ является нормализация сниженной активности основных ферментов шкла Кребса (изоштрат-,о£-ке-тоглутарат, сукшнат- и малатдегидрогеназы) в митохондриях, Koppel пи я сниженных уровней промежуточных субстратов ЩК.й повышенного уровня изоцитрата (~кетоглутарат§, оксалоаиетатамалата), а также ослабление гкпоксического подъема уровня пирувата,и лактата. .

5. Экзогенный АСД усиливает адаптивную реакцию-активации ACT в митохондриях и постмитохондриальной суйернатанте при Г311, .

6. Одним из механизмов антигипоксичесного действия■ АСП'являе1 ся активизация продукции в'нервной ткани ГАШ в глутаматдекарбока лазной реакции: •. ■ ■ V . ••.."•

7. Физиологические и метаболические "эффекты АСП "iri vivo >, in vitro усиливаются под действием комплекса Лентапирувит в бол*

шей степени, чел под действием П№. Совместное применение АСП и комплекса Пентапирувит эффективно ка:с у молодых,« так и у старых животных, что открывает перспективы . х применения для коррекции гипокчшческих расстройств метаболизма в общемедицинской и гериатрической практике. -

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Розанов В.Ач Абу Асали И.И., Розанов А.Я. Сравнительное изучение кгтаболизма меченных о£-кетоглутарата,' сукцината, аепар-тата и ГАМК в нервной ткани. Влияние пиридоксаль-5-фосфата // Украинский биохимический журнал.-1990,~Т,!б2.-№5.-0.61-67.

2. Розанов В.А., Абу Асали И.И., Розанов А.Я, Изучение нейромота-бодических эффектов и антигипоксической активности витаминно-

, коферментного комплекса, включающего тиаминпирофосфат, липолг, 4-фосфо-пантотен.-г, никотинат и флавинаденнмоно^уклеотид // Вопросы медицинской химии,-1990.-T.36.-3f6.-С.66-69.

3.* Абу Асали И.И.; Розанов В.А., Розанов А.Я. Изучение защитного действия аминокислот- субстратов окисления, витаминов, кофер-

■ ментов и их комплексов при гипоксии замкнутого пространства// Физиологический журнал.-1990.-Т.Зо.-№4.-С.32-37.

4. Абу Асали И.И., Рейтарова Т.Е., Розанов В.А., Розанов А.Я. О возможности участия системы метаболизма ГАМК в механизмах защитного действия -аспартата при гипоксии замкнутого прост-ранства//5армакология и токсикология.-1991.-Т.53.-№ .-С.'

5. Абу Асали И.й., Резанов В.А. Розанов А.Я. ^армакодкнамкка и катаболизм 1 -аспартата в организме мышей-при пребывании а гермозаыкнутом объеме и антигипоксической защите аспартатом и витаминйо-кофармеитным комш1вксом//^изиологический курнал,-

"l99I.-T.37.-F 43.''