Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутанты вируса оспы коров с делециями генов ВВК-семейства

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Мутанты вируса оспы коров с делециями генов ВВК-семейства"

На правах рукописи

КОЛОСОВА Ирина Валерьевна

МУТАНТЫ ВИРУСА ОСПЫ КОРОВ С ДЕЛЕЦИЯМИ ГЕНОВ 2ШК"-СЕМЕЙСТВА

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

|1 с МДР 20 ¡1

Кольцове - 2011

4840244

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Щелкунов С.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Локтев В.Б. доктор биологических наук, профессор Зенкова М.А.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск).

Защита состоится «11» марта 2011 г. в Ц.00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559; тел. 8 (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «10» февраля 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Трошкова Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Поксвирусы, объединенные в семейство Poxvirhiae, характеризуются самыми крупными размерами вирионов и генома среди вирусов животных, отличаются от вирусов многих других семейств тем, что их жизненный цикл проходит в цитоплазме клеток (Moss, 1996). Наиболее активно в данном семействе изучают вирусы рода Orthopoxvirus, поскольку он содержит патогенные для человека вирусы натуральной оспы (ВНО), оспы обезьян (BOO), оспы коров (ВОК) и осповакцины (ВОВ) (Маренникова и Щелкунов, 1998; Fenner et al., 1989). Особое место в этих исследованиях занимает изучение структурно-функциональной организации генома данных вирусов.

Полагают, что поксвирусы в процессе эволюции включили в состав своей ДНК нуклеотидные последовательности, кодирующие различные белки клетки, которые в первую очередь необходимы для модулирования иммунных реакций организма на вирусную инфекцию, обеспечивая тем самым преодоление данными вирусами различных защитных систем хозяина (Маренникова и Щелкунов, 1998; Alcami and Koszinowski, 2000). Кроме того, в составе генома ортопоксвирусов выявлены гены, продукты которых гомологичны представителям семейств белков клетки, не участвующие напрямую в процессах иммуномодуляции, а регулирующие такие процессы, как клеточный цикл, формирование цитоскелета и т.п. (Shchelkunov et al., 1993; Senkevich et al., 1993). Такие функции, возможно, выполняют белки семейства ВВК, входящего в суперсемейство kelch-подобных белков (Adams et al., 2000).

Белки, кодируемые этими генами, вовлечены в процессы стабилизации и динамики актиновых филаментов, участвуют в образовании цитоскелета, не только в связанном с актином виде, но и самостоятельно, играют роль в регуляции генной экспрессии, деградации белков с участием протеасом, а также выполняют разнообразные функции в других аспектах

з

жизнедеятельности клетки и организма и важны для их функционирования (Xue and Cooley, 1993; Laezza et al., 2007; Greenberg et al., 2008; Yu et al., 2008).

В настоящее время известно, что поксвирусы являются единственным семейством в царстве Vira, в составе генома которых выявлены наборы генов ВВК-белков. Несмотря на многочисленность ВВК-ттоъ у ортопоксвирусов функция их до сих пор остается невыясненной.

Цели и задачи исследования Целью настоящей работы является введение направленных делеций в выбранные ВВК-гены ВОК, штамм GRI-90, и изучение свойств созданных мутантов в системах in vitro и in vivo. В процессе работы решались следующие задачи:

1. Проведение компьютерного анализа видоспецифических различий генов ортопоксвирусов, кодирующих ВВК-белки.

2. Получение и анализ шести векторных плазмид для интеграции/делеции в целевые гены ВОК: pAA57R, pAB9R, pAB19R, pAC18L, pAG3L, pADl IL.

3. Получение клонового варианта ВОК и создание на его основе рекомбинантных мутантов с единичными и множественными делениями генов, кодирующих ВВК-белки.

4. Изучение влияния делеций ВВК-генов на биологические свойства полученных вирусов в системах in vitro и in vivo.

Научная новизна и практическая значимость работы Изучение функций генов Яб/<"-семейства ортопоксвирусов является важной фундаментальной задачей. Впервые на основании выполненного сравнения геномных последовательностей ВОК, BOO, ВНО, и ВОВ обнаружено, что ВОК содержит 6 генов семейства ВВК, ВОВ - 3, BOO - 1, а в геноме ВНО все эти гены делегированы или мутационно разрушены.

Впервые получены и охарактеризованы шесть рекомбинантных плазмид интеграции для последовательного введения направленных делеций в гены семейства ВВК: D11L, C18L, G3L, A57R, B9R и BI9R штамма GRI-90 ВОК.

Впервые созданы 18 мутантов ВОК с делециями как единичных генов DHL, C18L, G3L, A57R, B9R или B19R, так и двух, трех, четырех, пяти и шести генов семейства ВВК, при этом рекомбинанты с множественными (больше одной) делециями были получены с различными сочетаниями удаляемых генов. Показано, что гены этого семейства не являются существенными для репродукции ВОК.

Впервые обнаружено, что у мутантов ВОК с последовательными делециями от одного до четырех генов DHL, C18L, G3L и A57R, кодирующих ВВК-белки, наблюдаются следующие эффекты в зависимости от числа инактивированных генов: изменяется спектр чувствительных культур клеток, мутанты ВОК, утратившие три гена, имеют сниженную способность размножаться в перевиваемой культуре клеток почки собаки (MDCK), а мутанты по четырем генам утрачивают такую способность; в культуре клеток CV-1 мутанты по четырем генам ВВК при температуре 37°С формируют бляшки меньшего размера по сравнению с исходным ВОК, а при инкубации при повышенной температуре (39,5°С) продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным ВОК; мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины значительно меньшего размера и с меньшим содержанием вируса по сравнению с исходным ВОК; удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназалыюм заражении мышей линии BALB/c.

Практическая значимость данной работы состоит в том, что выявленный эффект атгенуации вируса при делегировании генов семейства ВВК может быть применен при получении безопасных вакцин новейшего поколения на основе ВОВ. Метод временной доминантной селекции, использованный в данной работе, в настоящее время применяется нами для создания высоко аттенуированных вариантов ВОВ с целью получения живых противооспенных вакцин нового поколения.

Положения, выносимые на защиту Гены семейства ВВК не являются существенными для репродукции ВОК.

Инактивация генов семейства ВВК у ВОК приводит к следующим эффектам:

1) изменяется круг чувствительных культур клеток, мутанты ВОК, утратившие три гена {DHL, C18L, G3L), имеют сниженную способность размножаться в культуре клеток MDCK, а мутанты по четырем генам {DI1L, C18L, G3L, Л57К) утрачивают такую способность;

2) мутанты с делециями четырех генов ВВК в культуре клеток CV-1 при температуре 37°С формируют бляшки меньшего размера по сравнению с исходным ВОК, а при инкубации в течение 72 ч после инфицирования при температуре 39,5°С, продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным вирусом (р<0,05);

3) мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины меньшего размера - их диаметр составляет 0,96±0,38 мм и 0,84±0,27 мм, соответственно, а исходного ВОК - 2,1±0,33 мм, с меньшим содержанием в них вируса: титр в тройных мутантах составляет 2х105 БОЕ/оспина, в четверных -1,6x105 БОЕ/оспина, по сравнению с исходным вирусом, титр которого определяли как 2x106 БОЕ/оспина (р<0,05);

4) удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназальном заражении мышей линии BALB/c. Для исходного вируса величина LDso составляла 1,1x10s БОЕ/мышь, в то время как для мутантного клона она равна 8,7х105 БОЕ/мышь (р<0,05).

Публикации и апробация работы По материалам диссертации опубликованы 6 статей в журналах списка, рекомендованного ВАК.

Результаты работы были представлены на на международных и российских научных конференциях:

XHIth International Poxvirus and Iridovirus Symposium (Montpellier, France, 2000); XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference (Oxford, England,

2004); Ш международная конференция "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, Россия, 2007); XlVth International Congress of Virology (Istanbul, Turkey, 2008).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков, 11 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, 9 разделов результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 17 отечественных и 186 иностранных источников.

Личный вклад автора Получение клонированного варианта ВОК, рекомбинантных мутантов с делециями генов, кодирующих ВВК-белки, ПЦР-анализ полученных вирусов, выполнен лично автором. Схема получения плазмид интеграции разработана C.B. Серегиным. Автором получены и охарактеризованы три плазмиды интеграции. Работы по изучению оспин, индуцируемых делеционными вариантами ВОК на ХАО КЭ, и оценка степени патогенности полученных ВОК при интраназапьном заражении мышей проводили совместно с Г.В. Кочневой и Т.А. Лупан. Микроскопические исследования выполнены Е.И. Рябчиковой и О.С. Тарановым при участии автора в подготовке исходных материалов. Компьютерный анализ генов, кодирующих ВВК-белки, проведен совместно с A.B. Тотмениным, И.В. Бабкиным и Д.В. Антонец.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Сравнительный компьютерный анализ генов, кодирующих ВВК-белки, в геномах поксвирусов

Гены ВВК-семейства были найдены у представителей семейства Poxviridae, в геноме которых соответствующие ОРТ локализованы в вариабельных концевых участках (рис. 1).

CPV-tJRI

MI'V-ZAJ

VARUM»

VAC-CO I*

D11L

C18L

C~1

G3L

D16L-OlaL

D iaU D12.SL C2L

C3C

<i=3 ,

CTL

Сз <—i .

В

CPV-UKI

MPV-ZAI

VAR-JND

VAC-COP

Рис, 1. Схема расположения ОРТ ВВК-белков в левой (А) и правой (В) концевых видоспецифичных областях генома ортопоксвирусов (ВОК: CPV-GRI, BOO: MPV-ZAI, ВНО: VAR-IND, BOB: VAC-COP). Стрелками обозначены направление ОРТ, названия которых приведены над стрелками. Тонкими линиями обозначены районы делеций в ДНК одних вирусов относительно других

В результате выполненного компьютерного анализа нами обнаружено, что ВОК кодирует шесть белков рассматриваемого семейства размером около 500 а.к. каждый со взаимной идентичностью по аминокислотной последовательности в интервале 22-26 %. ВОВ кодирует лишь три полноразмерных ВВК-белка (C2L, F3L и A55R), которые высоко гомологичны соответствующим белкам вируса оспы коров (99,4, 97,9 и 98,6% идентичности, соответственно), BOO - один (C9L, 97,3% идентичности с G3L BOK-GRI), а у ВНО все потенциальные рамки трансляции (ОРТ) разрушены в результате множественных мутаций или делецин и поэтому выявляются лишь короткие ОРТ, являющиеся нефункциональными фрагментами генов вируса-предшественника (табл. 1).

Таблица 1

Сравнение ОРТ генов ВВКу ортопоксвирусов

BOK-GRI 90 ВОВ-СОР BHO-IND BOO-ZAi

ОРТ Длина, а.к. ОРТ Длина, а.к. ОРТ Длина, а.к. ОРТ Длина, а.к.

D11L 521 — - - — - —

D13L 201 D16L 105

CI8L 512 C2L 512 D13.5L 79 D17L D18L D19L 77 98 107

G3L 485 F3L 480 C7L 179 C9L 487

A57R 564 A55R 564 J7R J8R 71 172 B1R 70

B9R 501 B10R 166 - - - -

B22R 70 B18R 70

B19R 557 — B23R B24R 83 88 — —

Все шесть ВВК-белков BOK-GRI содержат в своем составе N-концевой ВТВ-домен, промежуточный ВАСК-домен и С-концевой Kelch-домен. Был проведен сравнительный анализ выравненных с использованием программы Clustal X версия 1.83 аминокислотных последовательностей доменов: ВТВ, BACK и Kelch ВВК-белков разных штаммов. ортопоксвирусов. Следует

отметить, что ВВК-reuu обнаруживают низкую взаимную гомологию и это может обуславливать различные структурно-функциональные свойства кодируемых белков.

Показано, что только в ОРТ A57R BOK-GRI имеется пять классических kelch-мотивов, но наблюдаются нарушения в первом из них, у G3L и B9R -четыре kelch-мотива, у C18L в С-концевом четвертом мотиве вместо дуплицированного находится единичный глицин. У B19R и DHL имеются три kelch-мотива, но в случае D11L - первый kelch-мотив нарушен. Полное нарушение kelch-мотива у белков BOK-GRI B9R, C18L, G3L и B19R произошло лишь в С-концевых повторах Kelch-доменов, что, по-видимому, не приводит к нарушению «p-пропеллерной» структуры, в которую могут укладываться сохранившиеся kelch-мотивы (Adams et al., 2000). Таким образом, ВВК-белки ВОК различаются не только по аминокислотной последовательности, но могут заметно отличаться по архитектуре «p-пропеллерного» домена, который может состоять из трех-пяти циркулярно расположенных слоев/лопастей.

Несмотря на многочисленность ВВК-белков у ортопоксвирусов, функция их до сих пор остается невыясненной. Возможная роль изучаемых генов заключается в определении круга хозяев и/или возможности персистенции вируса в организме животного, поскольку малопатогенный для человека и имеющий наиболее широкий круг чувствительных к нему животных ВОК кодирует самый многочисленный набор ВВК-белков, в то время как у ВНО, высокопатогенного для своего единственного хозяина - человека, в организме которого отсутствует персистенция этого вируса, все гены ВВК-семейства мутационно разрушены.

Получение клопового варианта ВОК Важно отметить, что проводимые до последнего времени исследования по выявлению функций генов, были выполнены на ВОВ, природный резервуар и происхождение которого не установлены (Маренникова и Щелкунов, 1998). В связи с этим представляло интерес исследовать свойства генов ВВК-белков у

ю

ортопоксвирусов, выделенных из природных источников. На наш взгляд, наиболее интересен в этом отношении ВОК, который имеет наибольшее количество ВВК-генов в составе генома и, по совокупности свойств может рассматриваться в качестве прародителя других видов ортопоксвирусов, патогенных для человека (Сафронов и др., 1999; Shchelkunov et al., 2002), в том числе и ВОВ (Downie, 1970). ВОК может достаточно адекватно использоваться для выявления и изучения генов, определяющих его свойства in vivo, так как этот вирус имеет очень широкий круг хозяев, в том числе и мелких лабораторных животных (Маренникова и др., 1984; Маренникова и Щелкунов, 1998).

Для работы нами был выбран штамм GRI-90, выделенный в 1990 году в Москве от ребенка 4,5 лет, заразившегося от больного крота. Этот штамм имеет хорошо известную короткую пассажную историю (Маренникова и др., 1996).

На первом этапе было проведено клонирование исходного штамма ВОК GRI-90 для того, чтобы избежать возможной внутриштаммовой гетерогенности вируса при отборе индивидуальных рекомбинантных клонов. Методом бляшек были отобраны 9 индивидуальных клонов, ДНК которых подвергли рестрикционному анализу с использованием эндонуклеазы рестрикции Hiná\\\ наряду с ДНК исходного штамма ВОК GR1-90. Для дальнейшей работы выбрали три клоповых варианта ВОК, не отличающиеся по рестрикционной картине ДНК от исходного штамма GRI-90.

Последующий визуальный анализ оспин на ХАО КЭ показал, что через 48 ч инкубации все оспины, образованные клоновыми вариантами, имели одинаковый размер (около 2 мм в диаметре) и характерный красный цвет. В это же время родительский штамм ВОК вызывал образование гетерогенных по размеру (от 0,5 до 3 мм в диаметре) оспин, среди которых наряду с красными встречались и белые, несколько более крупные оспины, число которых не превышало 2%. Такой феномен описан для многих природных изолятов ВОК (Archardet al., 1984).

Сравнительное изучение патогенности выбранного клона №5 (обозначенного ВОК-5) и исходного ВОК GRI-90 на нелинейных белых мышах не выявило заметных различий. Рассчитанная по методу Кербера ЛД50 (Лакин, 1990) для клонового варианта составила 5,6x104 БОЕ/мышь, а для исходного ВОК - 7,6х104 БОЕ/мышь. Исходя из полученных данных, для дальнейшей работы был отобран клон ВОК-5, с которым и были проведены эксперименты по встройке созданных нами плазмид интеграции, обеспечивающих направленную делецию генов ВВК ВОК.

Конструирование плазмид интеграции для направленной делении ВВК-пноъ

Для получения вирусов с направленно введенными делениями генов, кодирующих ВВК-белки, нами был выбран метод временной доминантной селекции (Falkner and Moss, 1988; Falkner and Moss, 1990). Для реализации этого подхода создается плазмида интеграции, которая несет как доминантный селективный маркер (ген gpt E.coli под контролем 7.5К-промотора ВОВ), расположенный вне протяженных областей гомологии с ДНК вируса, так и последовательности генома ВОК, фланкирующие делегируемый ген (рис. 2).

Ген gpt E.coli кодирует фермент ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу (XGPRT), который может синтезироваться в клетках млекопитающих и способен восстанавливать метаболизм пуриновых нуклеотидов, блокируемый микофеноловой кислотой (MPА) (Хеймс и Хиггинс, 1987; Щелкунов, 1997). В результате единичного кроссинговера плазмиды интеграции и вирусной ДНК образуется рекомбинантный вирусный геном, содержащий как ген gpt, так и протяженные повторяющиеся последовательности, представляющие собой сегмент вирусного генома с целевой делецией и этот же сегмент без делеции (рис. 3). Такая генетическая конструкция нестабильна и может существовать лишь под селективным давлением. При снятии селективных условий происходит внутримолекулярная рекомбинация по областям гомологии, в результате которой образуется два

вида вирусов - с делецией и без нее, причем выщепляется вся плазмидная часть вместе с селективным маркером, что позволяет получать в дальнейшем двойные, тройные и т.д. рекомбинантные вирусы по различным участкам генома, используя эту же методику селекции.

.»ЛУРдрЕ! А57ГЗ ^ВогМ

никлнг)-' ' ' ""рСВ64

I

Рис. 2. Схема получения гибридной плазмиды интеграции на примере рДА57Я.

Ь и Я - фрагменты генома ВОК, фланкирующие делегируемый ген слева и справа, соответственно. Стрелками и цифрами над ними обозначены праймеры для ПЦР

А57Н

К

1 '■'"■'"^ > ......|

I- Д К др!

А571Ч

ж//.. '. г::

Я'

и А57Р

Рис. 3. Схема получения рекомбинантных ВОК с направленно делегированным геном А57Я. Ь' и Я' - области генома ВОК, гомологичные соответствующим фрагментам Ь и И. гибридной плазмиды интеграции рДА57Я

Конструирование плазмнд вышеописанного типа осуществляли в несколько этапов. На первом этапе была получена плазмида pUCgpl на основе pUCl9 и pMGCg/;/ на основе pMGC20, содержащие ген gpt Е. coli, под контролем 7,5К-промотора ВОВ. Структура клонированного EcoRl-EcoRI-фрагмента ДНК плазмиды рМGCgpt была подтверждена секвенированием по методу Максама и Гилберта (Maxam and Gilbert, 1980).

Затем получали плазмиды с делециями по каждому из шести генов семейства ВВК. Для этого из байка клонированных фрагментов ВОК, ранее полученного в нашей лаборатории (Рязанкина и др., 2000), выбрали плазмиды рСВ64, рСВ5, рСВЗ, рСН22б, pCMS4 и рСЕ13, содержащие соответственно ОРТ A57R, C18L, D11L, G3L, B9R и B19R с фланкирующими их областями. Эти плазмиды использовали в качестве матриц при проведении ПЦР. Олигонуклеотидные праймеры рассчитывали таким образом, чтобы делеция целевого гена не приводила к нарушению прилегающих к нему ОРТ.

В результате, были получены целевые плазмиды интеграции pAA57R, pAC,18L, pADllL, pAG3L, pAB9R и pAB19R, обеспечивающие возможность получения рекомбинантных ВОК с направленно делегированными генами A57R, C18L, DHL, G3L, B9R и B19R семейства ВВК-белков. Структура данных плазмид была подтверждена детальным рестрикционным анализом.

Получение мутантов ВОК с направленно делегированными генами, кодирующими ВВК-белки

Общая схема получения делециониых вариантов ВОК приведена на рис. 3 (на примере гена A57R). Используемый метод трансфекции и селекции обеспечивает выход делециониых вариантов ВОК с частотой свыше 50% (Falkner and Moss; 1990). Нами были проведены эксперименты по трансфекции зараженных клонами ВОК клеток CV-1, выбранными плазмидами интеграции. После четырех-шести пассажей в условиях селекции, вирус клонировали под агарозным покрытием методом бляшек. Для этого вирусную суспензию трижды обрабатывали ультразвуком в течение 30 с, титровали на монослое клеток CV-1

и выделяли клоны, используя 2-х кратную поддерживающую среду ДМЕМ с 2% агарозой. Далее эти клоны подращивали в неселективных условиях и реклонировали как описано выше. После проведения трансфекции, селекции и клонирования отбирали по 10-24 предполагаемых делеционных мутантов каждого вида (одинарные - удален один ВВК-ген, двойные - удалено два гена, тройные - три гена, четверные - четыре гена и т.д.). Монослой клеток С\М заражали этими вирусными клонами с множественностью 0,1-1 БОЕ на клетку, инкубировали 1 ч при 37°С. Через 1-2 суток, при появлении ЦПД, поддерживающую среду удаляли, клетки промывали физиологическим раствором, затем разрушали их двукратным замораживанием-оттаиванием и выделяли вирусную ДНК согласно методике (ЕБровйо й а1., 1981).

В качестве контроля эффективности трансфекции и селекции при получении вариантов ВОК с множественными делециями генов ВВК параллельно проводили эксперимент по получению варианта ВОК или с одинарной делецией этих генов, или делегировали тот же ген у варианта ВОК с другим, но меньшим набором делеций.

ПЦР-анализ выделенной вирусной ДНК проводили, используя пары праймеров для предварительного анализа, в этом случае оба праймера находились внутри фланкирующих фрагментов ВОК (Ь и Я). Для подтверждения делеции в вирусной ДНК, были рассчитаны праймеры, один из которых лежал внутри левого фрагмента, полученного при клонировании, а другой располагался за правым клонированным фрагментом на геноме ВОК.

В результате работы нами были получены 18 рекомбинантных вариантов ВОК с делециями генов, кодирующих ВВК белки: делеция 1 гена: АА57Я; АВ9И; АВШ; АО 111; ЛС18Ь; АОИ делеция 2 генов: АА57И4В9Я; АОШАСЗЦ А031АС18Ь делеция 3 генов: АА57ЯАВ9ЯАВ19Я; АйШАОЗЬАСШ делеция 4 генов: АА57МВ9МВ19М01И; АА57МВ9МВ191ЫС181; АВ9И4011ЬАСЗЬАС18Ь; АВШАП11ЬАС,31АС181\ АЛ57ЯА01ИЛОЗШС181

деления 5 генов: AA57RAB9RAB19RAC18LAD11L деления 6 генов: AA57RAB9RAB19RAC18LAD1ILAG3L.

По два-три независимых клоновых варианта каждого типа были наработаны, определен их титр, выделена ДНК и проведен детальный ее анализ с помощью ПЦР. В качестве примера приведена электрофореграмма полученных в ПЦР-анализе фрагментов ДНК, которая подтвердила наличие делений во всех шести генах ВОК AA57RAB9RAB19RAC18LADI1LAG3L), кодирующих ВВК-белки (рис. 4).

A57R(0;2) B19R(0;1) B9R(0;2) C18L(0;2) DUL(0;2) G3L(0;1)

<-*"-t-*-ч i- -\ <■- -i /-A-> /-*-ч

BOK 61 101 1S1 BOK61 101 151 BOK «1 101 151 M BOK £1 101 151 BOK 61 101 151 BOK 61 101 151

Рис. 4. ПЦР анализ мутантных по шести генам ВВК выбранных клонов ВОК. Электрофореграмма разделения фрагментов ДНК ВОК, полученных в результате ПЦР в 1% агарозном геле. 61, 102, 151 - мутатнтные клоны; ВОК — исходный клон ВОК-5; М - 1КЬ ДНК маркер. Сверху над квадратными скобками указаны используемые праймеры на соответствующий анализируемый ген

Все полученные делеционные варианты образовывались с высокой частотой, являлись жизнеспособными и стабильно сохраняли генотип в течение нескольких пассажей (клонирование, реклонирование, подращивание). Таким образом, были получены мутанты ВОК с направленно нарушенными всеми шестью генами, кодирующими ВВК-белки, что подтвердило предположение о том, что данные гены не являются существенными для репродукции ортопоксвирусов на культуре клеток СУ-1.

Изучение биологических свойств мутантных вариантов ВОК

Используемая в данной работе методология обратной генетики позволяет надеяться на выявление свойств ВВК-тенов при сравнительном изучении исходного вируса и его мутантов с направлеными делениями. В виду того, что ВОК имеет широкий круг хозяев и ВВК-геиы представлены у него самым большим среди поксвирусов количеством, актуальным является изучение мутантов с одновременными множественными делениями этих генов. С этой целью, из полученной в предыдущем разделе коллекции мутантных ВОК с различными комбинациями делеций ВВК-генов, нами были использованы кроме одиночных мутантов (DHL, C18L, G3L, A57R), также двойные (ADJ1LAG3LA), тройные {AD11LAG3LAC18L) и четверные {AA57RAD1JLAG3LAC18L) делеционные мутанты ВОК в сравнительном исследовании их биологических свойств.

Поскольку ОРТ, обуславливающие синтез ВВК-белков, находятся в вариабельных концевых фрагментах генома ортопоксвирусов, где локализованы гены, которые определяют круг хозяев и уровень вирулентности для чувствительного хозяина, на первом этапе мы провели сравнительные исследования репродукции исходного ВОК и делеционных мутантов у которых удалены 1, 2, 3 или 4 ВВК-тена в культурах клеток и на ХАО КЭ; определили спектр культур клеток, в которых могут размножаться эти вирусы; провели эксперименты по оценке вирулентности в принятой лабораторной модели ВОК - мыши BALB/c (Martinez et al., 2000); выполнили работы по определению связи ВВК- генов с температурной чувствительностью вируса. Для установления особенностей взаимодействия вируса с клеткой-хозяином ставили целью сравнить характер цитопатичсского эффекта ВОК и его мутантов с четырьмя делениями ВВК-генов в культуре клеток CV-1. Для оценки различий в структуре оспин, образованных мутантными и «диким» вариантом ВОК на ХАО КЭ, был использован электронно-микроскопический анализ. Так как для разнообразных клеточных систем показана связь ВВК-

белков с актиновым цитоскелетом и их участие в формировании цитоплазматических выростов (Spence et al., 2ООО; Inoue et al., 2005; Jiang et al., 2007), было проведено изучение влияния делений четырех #5Л"-генов на эти функциональные активности вируса.

Репродукции различных делсционных мутантов ВОК в первичной (ФЭК) п перевиваемой (CV-1) культурах клеток

Изучение репродукции различных делеционных вариантов ВОК: клон 8 -с делецией одного гена (AD11L), клон 27-е делениями двух генов (AD11LAG3L), клон 73-е делециями трех генов (AD11LAG3LAC18L), в первичной - фибробластов куриных эмбрионов (ФЭК) и перевиваемой - почки африканской зеленой мартышки (CV-1) культурах клеток не выявило существенных отличий от родительского клона ВОК-5 (табл. 2). Все мутанты хорошо размножались в тестируемых культурах клеток.

Таблица 2

Репродукция различных вариантов ВОК в первичной (ФЭК) и перевиваемой

(CV-1) культурах клеток

Вирус Титр вируса1, LogioBOE/мл Культура клеток

CV-1 Время после инфекции (часы) ФЭК Время после инфекции (часы)

24 I 48 24 48

ВОК-5 6,3±0,3 1 7,0±0,2 6Д±0,3 6,8±0,2

Одинарный мутант (клон 8) 6,2±0,2 6,9±0,3 6,0±0,2 6,4±0,3

Двойной мутант (клон 27) 6,1±0,2 7,1 ±0,2 6,3±0,3 6,6±0,3

Тройной мутант (клон 73) 5,4±0,5 7,0±0,2 6,2±0,3 6,6±0,2

'Тнтры вируса представлены как среднеарифметические значения ± стандартное отклонение. Стандартное отклонение рассчитано с использованием независимого критерия Стьюдента для уровня значимости р<0,05.

Динамика роста мутантов ВОК в культуре клеток СУ-1 В данной части работы более подробно изучили динамику развития исходного ВОК-5 и мутантных клонов ВОК - 216, 337 с делециями четырех генов (АЛ57ЯАО! 1ЬАСЗЬАС181.), кодирующих ВВК-белки. Для этого,

монослой культуры клеток СУ-1, полученный на б-ти луночных планшетах, инфицировали вирусами с множественностью заражения 0,01 БОЕ/кл. Время после инфекции составляло 12, 24, 36, 48, 60 и 72 часа. На каждом временном этапе определяли титр вируса. В работе использовали два независимых мутантных клона ВОК для 'исключения внутриклоновой гетерогенности. Полученные результаты (рис. 6) показывают, что кривые развития вирусов в культуре клеток СУ-1 не различаются. Это указывает на то, что делеция даже четырех генов ВВК не влияет на репродуктивные функции ВОК в изученной культуре клеток.

с; 2 Ш

О из о о>

£ р

12 24 36 48

время (часы)

60

72

Рис. 5. Сравнительный анализ размножения исходного ВОК (ВОК-5) и делеционных клонов 216 и 337 (АА57КАВ11ЬАОЗЬАС181) на монослое культуры клеток СУ-1, инфицированных множественностью заражения 0,01 БОЕ/кл

Сравнение цитопатнческого эффекта ВОК и'его делеционных мутантов в культуре клеток СУ-1

Культура клеток СУ-1 высокочувствительна к заражению ВОК и его мутантами с делецией ВВК-тенов. Нами было отмечено, что бляшки, формируемые делеционными клонами 216 и 337 (АА57КАВ1 НАОЗЫавЬ) заметно меньше по диаметру, чем бляшки ВОК-5. Небольшие цитопатические фокусы регистрировались уже через 24 ч после заражения монослоя клеток СУ-

1 как мутантантными клонами, так и ВОК-5: клетки округлялись и отслаивались. Через 48 ч формировались видимые бляшки. ВОК-5 вызывал более выраженное повреждение монослоя; бляшки, индуцированные мутантами 216 и 337, выглядели существенно мельче. Они имели сильно изрезанные контуры, что не позволило провести прямое определение их размеров. Для сравнения цитопатического эффекта ВОК и вариантов с делениями четырех ВВК-генов использовали измерение оптической плотности окрашенных бляшек, включая и центральные, и периферические зоны. Величина оптической плотности одной бляшки составила 0,18 ± 0,02 (ВОК-5) и 0,33 ± 0,03 (четверные мутанты - 337 и 216), что свидетельствует о снижении цитопатического эффекта мутантов на монослой клеток СУ-1.

Рис. 6. Морфология бляшек, сформированных в сплошном монослое культуры клеток CV-1 вирусом оспы коров дикого типа (ВОК-5) (Аа, В) и четверными мутантами 216 (АЬ, С) и 337 (Ас). Окраска кристаллическим фиолетовым через 48 ч. после заражения с множественностью 50±10 БОЕ/лунку. Инкубация при 37°С. Длина масштабной линии соответствует 10 мм (A) and 500 рм (В, С)

Таким образом, выявленное снижение цитопатического эффекта является

одним из проявлений делении ЯЙА'-генов при инфекции in vitro и, по-видимому, приводит к более продолжительному сохранению зараженных клеток на подложке и, соответственно, к более длительному периоду репродукции вируса. Возможно, это обстоятельство обеспечивает равный уровень наработки дочернего вируса мутантами и исходным ВОК на культуре клеток СV-1.

Рост мутантов ВОК при повышенной температуре

Исследование такого интегрального признака вирулентности, как предельная температура размножения вируса (Fenner et al„ 1989), также выявило различия между мутантными вариантами и исходным штаммом ВОК. Были проведены эксперименты по культивированию ВОК-5, а также мутантных клонов с делениями двух генов (клон 27), трех генов (клоны 73, 52), четырех ВВК-генов (клоны 216 и 337) при пермиссивной (37°С) и непермиссивной (39,5°С) температурах. Монослой культуры клеток CV-1, полученный на 6-ти луночных планшетах, заражали вирусами с множественностью 0,1 БОЕ/кл. Сорбцию вируса проводили при соответствующих температурах (37°С и 39,5°С). Через 48 ч, инфицированные клетки разрушали путем двукратного замораживания - оттаивания, а вышедший в результате этого в среду вирус титровали. Изучение кинетики накопления ВОК в клетках CV-I в пермиссивных условиях (37°С) в течение 12, 24, 36, 48, 60 и 72 часов не выявило значительных различий между ВОК-5 и четверными мутантами. Однако при инкубации в течение 72 ч в непермиссивных условиях (39,5°С) продукция вариантов ВОК с делециями четырех генов ВВК была достоверно в 100 раз ниже в сравнении с исходным ВОК-5 (рис. 7). Таким образом, нами показано, что делеция ВВК-ттои обуславливает температуро-чувствительный фенотип, ведущей к аттенуации ВОК при повышении температуры среды. Интересно, что ВНО, у которого ВВК-rtuu отсутствуют, имеет минимальную в семействе Poxviridae величину предельной температуры формирования оспин на ХАО КЭ (37,5-38,5°С). Для

BOO (один ВВК-ген) этот показатель составляет 39,0-39,5°С, для ВОВ (три ДЖ-гена) он равняется 41°С (Маренникова и Щелкунов, 1998)

КЛОМЫ

Рис. 7. Рост исходного вируса оспы коров (ВОК, клон 5), а также вариантов ВОК с делецией двух («27»), трех («52» и «73») и четырех («216» и «337») ВВК- генов при культивировании в пермиссивных (37°С) и непермиссивных (39,5°С) условиях, р<0,05

Сравнительная оценка чувствительности различных культур клеток к делецнонным мутантам ВОК

Для оценки спектра чувствительныхкультур клеток для разных вариантов ВОК нами было использовано II линий клеток различного происхождения: CV-1, клетки почки макаки-резус (LLCMK-2), клетки карциномы шейки матки человека (HeLa), клетки легкого человека (MRC-5), фибробласты легкого эмбриона человека (J1-68), клетки почки свиньи (PK-15),

9

клетки почки собаки (MDCK), клетки почки взрослого нормального быка (MDBK), клетки почки кролика (RK-13), клетки остеосаркомы человека (HOS), клетки кожно-мышечной ткани эмбрионов мышей (ЗТЗ). Разные культуры клеток были инфицированы исходным неклонированным ВОК, исходным клоном ВОК-5, на основе которого получали варианты с направленными делециями, и мутантными вирусами: клоном - 73, имеющим одновременные делеции трех генов (äC18LADllLAG3L) и клонами - 216, 337 с одновременными делециями четырех генов ВВК (AC18LADIILAG3LAA57R). Результаты экспериментов суммированы в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительная оценка чувствительности культур клеток к различным

вариантам вируса оспы коров

Культура клеток Время после инфекции (часы) Рост вируса, титр ЬойЮБОЕ/мл)вирус

Исходный неклонир. ВОК ВОК-5 Клон 73 Клон 216 Клон 337

CV-1 24 6,2±0,2 6,1 ±0,2 5,4±0,5 6,3±0,2 6,2±0,3

48 6,9±0,3 7,13±0,2 7,0±0,2 7,4±0,3 7,2±0,2

L-68 24 5,5±0,3 5,1±0,2 5,0±0,4 4,4±0,2 4Д±03

48 6,6±0,2 6,9±0,3 6,8±0,2 6,5±0,3 6,8±0,2

HOS 24 6,4±0,2 6,3±0,2 5,7±0,4 5,8±0,3 5,9±0,2

48 7,1±0,2 7,1±Q,3 7,4±0,2 7,2±0,2 6,8±0,4

LLCMK-2 24 4,5±0,2 4,4±0,3 3,8±0,3 3,6±0,1 4,3±0,3

48 5,4±0,2 5,3±0,2 5,3±0,3 4,8±0,2 4,7±0,2

MDBK 24 <1,0±0,2 2,3±03 <1,0±0Д <1,0±0Д

48 <1,0±0Д <1,0±0,2 <1,0±0,2 <1,0±0,2 <1,0±0,2

RK-13 24 5,7±0,2 5,6±0,3 5,1±0,2 5,3±0,1 6,0±0,2

48 7,0±0,1 6,7±0,2 6,7±0,1 6,7±0,2 6,9±0,3

HeLa 24 б,4±0,2 6,4±0,3 6,0±0,3 6,5±0,4 6,4±0,3

48 7,2±0,3 7,3±0,2 6,8±0,3 7,3±0,2 7,3±0,3

MDCK 24 4,5±0,2 3,8±0,4 3,6±0,2 <1,1±0,2 <1,1±0Д

48 5,0±0,3 5,1±0,2 4,4±0,2 <1,0 2,5±0а

MRC-5 24 5,0±0,4 5,4±0,2 4,6±0Т3 4,7*0,3 4ß±0,2

48 7,0±0,2 7,1 ±0,3 6,9±0,2 6,9±0,2 6,5±0,2

ЗТЗ 24 5,0±0,2 4,8±0,2 4,1±0,4 4,0±0,4 3,8±0,4

48 5,7±0,3 5,7±0,2 4,6±0Д - 4,5±0,2

PK-15 24 5,7±0,3 5,0±0,4 4,5±0,4 4,4±0,3 -

48 6,5±0,4 6,2±0,4 5,8±0,3 5,9±0,2 6,3±0,4

Титры вируса представляли как среднеарифметические значения ± стандартное отклонение. Стандартное отклонение рассчитано с использованием независимого критерия Сгьюдента для уровня значимости р<0,05.

Поскольку динамика размножения одинарных и двойных делеционных мутантов во всех культурах клеток не отличалась от вируса дикого типа, данные не включили в таблицу. Было показано, что репродукция родительского клона ВОК-5 во всех культурах клеток не отличалась от исходного неклонированного природного изолята. Обнаружилось, что все тестируемые варианты ВОК, в том числе и вирус «дикого» типа, слабо или практически не

размножаются в культуре клеток МОВК. Видимо, это можно будет использовать в будущем в качестве дифференциального признака при идентификации ВОК. Выявлено отставание репродукции (24 часа инкубации) четверных и, в некоторых случаях, тройных мутантов в культурах клеток ЗТЗ и МЯС-5. В культуре Ь-68 четверные мутанты размножаются достоверно хуже «диких вариантов» ВОК. Показано, что в культуре клеток МОСК через 48 ч после инфекции тройные мутанты размножаются достоверно хуже исходных вирусов, а четверные мутанты способность размножаться на них утратили. Таким образом, гены ВВК могут быть важны в определении круга хозяев вируса и/или тканевого тропизма.

Сравнительное изучение оспин, формируемых на ХАО КЭ делецноннымн мутантами ВОК

Адекватной моделью для исследования интегральных биологических характеристик является способность различных вариантов ВОК вызывать образование оспин (развитие очагов локального поражения) на ХАО КЭ, их визуальный, вирусологический и микроскопический анализ. Размеры и внешний вид оспин варьируют в зависимости от вида вируса и входят в ряд классификационных признаков ортопоксвирусов (Магепшкоуа е1 а1., 1964). Микроскопическая структура оспин определяется интенсивностью размножения вируса и степенью пролиферативной, инфильтративной и деструктивной реакций, которые являются формообразующими факторами, обусловливающими характерную морфологию оспин того или иного поксвируса (ЯуаЬсЫкоуа е1 а!., 1990).

Визуальный анализ оспин, индуцированных на ХАО через 48 ч после инфицирования исходным клоном 5, одинарными и двойными делеционными мутантами ВОК, не выявил заметных различий. Выраженные различия морфологии оспин были обнаружены между ВОК-5 и тройными, и четверными мутантами. Исходный ВОК-5 вызывает образование на ХАО КЭ крупных красных оспин диаметром 2,1±0,33 мм, тогда как оспины, индуцированные

тройными (А сл^лтилвщ и четверными {АС 181А 0111Л 031.ЛА 5 7 К) мутантами, имеют беловатый цвет и существенно меньшие размеры (Р<0,05), их диаметр составляет 0,96±0,38 мм и 0,84±0,27 мм, соответственно.

Рис. 8. Оспины на ХАО куриных эмбрионов, образуемые 1 - ВОК-5 СЯ1-90, 2 и 3- вирусами с делецией двух (2), трех (3) и четырех (4) ВВК-геиоъ

В таблице 4 приведена количественная оценка содержания вирусов в отдельных оспинах, образованных делеционными мутантами ВОК.

Таблица 4

Количественная оценка (выход) вирусного материала, полученного из

отдельных оспин на ХАО КЭ

Вирусный штамм Ьоп^ЕОЕ/осгтина

ВОК-5 6,3±0,4

27 (двойной мутант) 6,6±0,3

52 (тройной мутант) 5,8±0,3

73 (тройной мутант) 5,3±0,3

216 (четверной мутант) 5,1±0,2

337 (четверной мутант) 5,2±0,2

Доверительный интервал ± ЯП был определен в грех независимых экспериментах с уровнем значимости Р<0,05

Как видим, «урожай» вируса в оспинах, образованных четверными мутантами, достоверно ниже аналогичных характеристик родительского штамма. Количество вируса в оспинах, образованных тройными мутантами, варьирует в большей степени, однако, также существенно ниже вируса дикого типа. «Урожай» вируса в оспинах, образованных двойным мутантом, не отличается от родительского штамма ВОК.

Микроскопическое исследование оспин

Светооптическое изучение полутоихих срезов выявило ярко выраженные различия в строении оспин, индуцированных на ХАО КЭ исходным вирусом ВОК-5 и четверными мутантами ЛС1 ёЬАШ ИЛСЗЬАА5 7К - 216 и 337. Было показано, что в оспинах, образованных мутантами 216 и 337, область центрального некроза не выражена, число слоев эпителия не превышает трех-пяти даже в центре оспины, что свидетельствует о нарушении пролиферации эпителиальных клеток в зоне размножения вируса. В центре оспины находится зона деструкции, содержащая полость, ограниченную поверхностными слоями эпителия, в которой локализуются единичные разрушенные клетки. Оспины исходного вируса оспы коров имеют четкую форму диска. Эпителий хориона в зоне оспины многослойный, количество слоев клеток увеличивается от периферии к центру, достигая 13-15. Воспалительно-клеточная реакция не выражена как в оспинах, индуцированных исходным вирусом, так и мутантами.

Сравнение клеток, зараженных четверными мутантами и исходным вирусом, показало, что репродукция мутантов приводит к формированию меньшего числа зрелых вирионов, а во многих клетках репродукция останавливается на стадии сборки незрелых, вирионов. Вместе с тем, при размножении мутантов происходит образование значительного числа внеклеточных «одетых» вирионов, что обуславливает диссеминацию вируса в соединительную ткань оспины.

Анализ полученных на оспинах данных показывает, что параметры морфогенеза четверных мутантов и исходного вируса не различаются, т.е.

делеция четырех копий генов не приводит к нарушению формирования вирусных частиц. Однако параметры инфекции мутантами и исходным вирусом значительно различаются на клеточном и тканевом уровне, и эти различия, по всей видимости, обусловлены развитием патологических изменений в инфицированных клетках. Можно предположить, что продукты экспрессии ВВК-генов необходимы для «сбалансированного» использования клеточных систем репродуцирующимся вирусом. Отсутствие этих продуктов приводит к нарушению функций клеток, и, как следствие, к снижению воспроизводства вируса, чем, возможно, и обусловлено уменьшение размера и вирусного содержания оспин, образованных делеционными мутантами ВОК, и снижение их вирулентности для ВАЬВ/с мышей, показанной ниже.

Эксперименты на лабораторных мышах

Определение 1Л)50

Вирулентность мутантных вирусов оценивали по величине ЬО50 при интраназальном заражении мышей линии ВАЬВ/с. Группы по 8-10 мышей были интраназально инфицированы десятикратными разведениями вирусов в диапазоне доз от 104 до 107 БОЕ в 30 мкл физиологического раствора. Контрольной группе вводили аналогичное количество физиологического раствора. Мышей наблюдали на протяжении 21 суток. Признаки заболевания проявлялись уже на 3-4 сутки после инокуляции. Симптомами являлись: выраженное нарушение дыхания, повышенная температура, отсутствие аппетита. Число падших и выживших животных регистрировали в течение всего эксперимента. Ь05а рассчитывали по методу Кербера. Для исходного вируса ВОК-5 1Л350 составляла 1Дх105, в то время как для мутантных клонов 216 и 337 (ДС18М011МСЗЫА57К) она была равна 4,8х105 и 8,7х105, соответственно. Результаты пр^едставленые в таблице 5, показывают, что по мере удаления большего числа ВВК-генов вирулентность снижается и для четверного мутанта достоверно отличается от исходного вируса.

Таблица 5

Вирулентность ВОК, штамм ОЩ-90, и делеционных мутантов при интраназальном заражении ВА1,В/с мышей

Вирусные клоны Logio LD50 (БОЕ/мышь)*

ВОК-5 5,03±0,07

27 (двойной мутант) 4,59±0,55

73 (тройной мутант) 5,58±0,41

216 (четверной мутант) 5,68±0,34

337 (четверной мутант) 5,94±0,18

* Доверительный интервал ± SD был определен в трех независимых экспериментах с уровнем значимости Р<0,05

Для того чтобы выжить в организме хозяина, вирусы эволюционировали, используя ряд сложных механизмов, направленных на уклонение от хозяйского антивирусного иммунного ответа (Tortorella et а)., 2000; Finlay and McFadden, 2006). Было высказано предположение о том, что поксвирусные ВВК-белки выполняют ряд функций в ходе инфекции, возможно за счет взаимодействия с цитоскелегом или во время убиквитинизаций (Wilton et а]., 2008). Поскольку члены семейства поксвирусов, в большинстве случаев, кодируют по несколько ВВК-белков, то возможно, подобно клеточным аналогам, могут функционировать и как куллин-3-субстратспецифичные адаптеры (Zhang et al., 2009). Более того, было показано, что два ВВК-белка, кодируемых генами EVM150 и EVM167 ВЭ, взаимодействуют с куллином-3 и что ВТВ-домен EVM150 и EVM167 является необходимым и достаточным для этого взаимодействия (Wilton et al., 2008). Возможно, снижение вирулентности является следствием того, что делеция ¿ЯК-генов приводит к нарушению механизмов преодоления вирусом защитных реакций организма животных.

Связь ВВК-белков ВОК с актиновым цитоскелетом клетки и их участие в формировании цитоплазматических выростов

Связь ВВК-белков с актиновым цитоскелетом и участие в формировании цитоплазматических выростов показаны для разнообразных клеточных систем (Furukawa et al., 2003; Spence et al., 2000). При изучении, мутантов ВОК с

делецией четырех ВВК-генов в культуре клеток СУ-1 были выявлены следующие изменения: сократилось не только число инфицированных клеток с отростками, но и длина отростков. Проведенные исследования показали, что клетки СУ-1, зараженные ВОК-5 и мутантами по четырем генам ВВК 216 и 337, сохраняли полигональную форму в течение 15-22 ч после инфекции и имели размеры 40 х 50 цщ, высоту в области ядра 2-2,5 цш. Вирусные антигены выявлялись в зараженных клетках в виде глыбок и гранул. Актиновый цигоскелет в большинстве зараженных клеток сохранялся лишь как редкие стресс-тяжи и полосы по линии прикрепления к подложке. Клетки с длинными цитоплазматическими отростками обнаруживались в монослое клеток СУ-1 через 22 ч после заражения исходным ВОК-5. Длина отростков составляла 40 -120 цм, тогда как толщина не превышала 0,5 цм. Как правило, одна клетка имела 1-2 отростка. Вирусные антигены выявлялись не только в теле клетки, но и по всей длине отростков, содержащих также актиновые микрофиламенты. Электронная микроскопия подтвердила наличие вирусных структур в отростках, содержащих в основном зрелые вирионы. Следовательно, репродукция ВОК в клетках культуры СУ-1 сопровождалась актин-связанным формированием длинных цитоплазматических отростков, несущих вирусные частицы. При репродукции четверных мутантов в культуре клеток СУ-1 также формировались цитоплазматические отростки, однако они были существенно короче (20 - 60 цм). При инфекции мутантами из 300 зараженных клеток отростки регистрировались в 63, тогда как при репродукции ВОК 127 клеток из 300 имели отростки, несущие вирусные антигены.

Таким образом, проведенные исследования обнаруживают изменения, связанные с делецией ВВК-теяоь ВОК и указывают на то, что действие продуктов, синтезированных этими генами, как правило, зависит от числа удаляемых генов Дб/С-семейства. Кроме того, несомненно, важна роль ВВК-белков ВОК в поксвирусной инфекции и распространении вируса от клетки к клетке.

выводы

1. На основании сравнения геномных нуклеотидных последовательностей вирусов оспы коров, осповакцины, оспы обезьян и натуральной оспы идентифицированы все ортопоксвирусные гены семейства ВВК и выявлены видоспецифичные отличия вирусов: ВОК содержит 6 генов данного семейства, ВОВ - 3, BOO - 1, а в геноме ВНО все эти гены делетированы или мутационно нарушены.

2. Получены шесть рекомбинантных плазмид интеграции для последовательного введения направленных делеций в гены семейства ВВК вируса оспы коров штамм GRI-90.

3. Создана коллекция из 18 мутантов вируса оспы коров с делециями единичных ВВК-генов DI1L, C18L, G3L, A57R, B9R или B19R, а также двух, трех, четырех, пяти и шести генов этого семейства. Показано, что ВВК-гены ВОК не является существенным для репродукции вируса в культуре клеток CV- 1.

4. При изучении мутантов ВОК, у которых последовательно делетированы от одного до четырех генов ЯЯ/Г-семейства {DHL, C18L, G3L, A57R), обнаружено, что в зависимости от числа делегированных генов наблюдаются следующие эффекты:

а) изменяется круг чувствительных культур клеток. Мутанты ВОК, с делецией трех ВВК-ге нов, достоверно хуже размножаются в культуре клеток почки собаки (MDCK), чем исходный ВОК через 48 ч после инфицирования, а мутанты по четырем генам утрачивают эту способность (р<0,05);

б) в культуре клеток CV-1 мутанты по четырем генам ВВК при температуре 37°С формируют бляшки достоверно меньшего размера по сравнению с исходным ВОК, а при инкубации при повышенной температуре (39,5 °С) в течение 72 ч, продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным ВОК (р<0,05);

в) мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины меньшего размера - их диаметр составляет 0,96±0,38 мм и 0,84±0,27 мм, соответственно, а у исходного ВОК - 2,1±0,33 мм. Содержание вируса в них также отличается: титр в- тройных мутантах составляет 2x105 БОЕ/оспина, в четверных - 1,6х105 БОЕ/оспина, в то время как в исходном вирусе - 2х106 БОЕ/оспина (р<0,05);

г) удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназальном заражении мышей линии BALB/c. Для исходного вируса оспы коров LD50 составляла 1,1x10s БОЕ/мышь, в то время как для мутантного клона - 8,7x105 БОЕ/мышь (р<0,05).

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Shchelkunov S., Totmenin A., Kolosova I. Species-specific differences in organization of orthopoxvirus kelch-like proteins // Virus Genes. - 2002. - V. 24. -№2.-P. 157-162.

2. Щелкунов C.H., Тотменин А.В., Колосова И.В., Сандахчиев JI.C. Видоспецифичные различия в организации генов kelch-подобных белков ортопоксвирусов, патогенных для человека // Докл. Акад. Наук. - 2002. - т. 383. -№ 2.-С. 271-275. :

3. Тотменин А.В., Колосова И.В., Щелкунов С.Н. Изучение ортопоксвирусных генов, кодирующих kelch-подобные белки. I. Анализ видоспецифичных различий по структурной организации // Молекул, биология. - 2002. - т. 36. - № 4. - С. 610-616.

4. Колосова И.В., Серегин С.В., Кочнева Г.В., Рябчикова Е.И., Бессмельцева Е.В., Бабкина И.Н., Соленова Т.Е., Бабкин И.В., Щелкунов С.Н. Изучение ортопоксвирусных генов, кодирующих kelch-подобные белки. II. Создание вариантов вируса оспы коров с направленными делениями генов // Молекул, биология. - 2003. - т. 37. - №4. - С. 585-594.

5. Kochneva G., Kolosova I., Maksyutova Т., Ryabchikova E., Shchelkunov S. Effects of deletions of kelch-like genes on cowpox virus biological properties // Arch. Virol. - 2005. - V. 150. - № 9. - P. 1857-1870.

6. Кочнева Г.В., Таранов O.C., Лупан T.A., Юдин П.В., Рубцов Н.Б., Байбородин С.И., Колосова И.В., Щелкунов С.Н., Дроздов И.Г., Рябчикова Е.И. Изучение влияния делеции BTB/kelch-гонов вируса оспы коров на некоторые характеристики инфекции in vitro // Вопросы вирусологии. - 2009. - №1. - С. 2832.

Материалы научных конференций

7. Totmenin A.V., Seregin S.V., Kolosova I.V., Shchelkunov S.N. Orthopoxviral proteins of the kelch repeat superfamily. - In: Xlllth International Poxvirus and Iridovirus Symposium. Montpellier, France. Sept. 2-6, 2000. P. 36.

8. Kochneva G.V., Kolosova I.V., Maksyutova Т.Е., Ryabchikova E.I., Shchelkunov S.N. Effects of deletions of kelch-like genes on cowpox virus biological properties. In: XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference. Keble College, Oxford, England. Sept. 3-8, 2004. P. 137.

9. Кочнева Г.В., Таранов O.C., Лупан T.A., Юдин П.В., Колосова И.В., Щелкунов С.Н., Рябчикова Е.И. Влияние делеции генов семейства kelch вируса оспы коров на структурную реорганизацию инфицированных клеток. III международная конференция "Фундаментальные науки - медицине". Новосибирск, Россия. Сент. 2-8,2007. С. 61.

10. Kochneva G., Ryabchikova Е., Kolosova I., Sivolobova G., Yudin P., Taranov O., Lupan Т., Shchelkunov S. Comparative studies of cowpox and mousepox virus mutants with deletions of BTB/kelch genes. XIV International Congress of Virology. Istanbul, Turkey. Aug. 10-13 2008. P. 342.

Список сокращений

а.к. - аминокислота (аминокислотный остаток)

ВОК - вирус оспы коров

ВОВ - вирус осповакцины

ВНО - вирус натуральной оспы

BOO - вирус оспы обезьян

ВЭ (ВОМ) - вирус эктромелии (вирус оспы мышей)

КЭ - куриные эмбрионы

MP А — микофеноловая кислота

ООЕ - оспинообразующая единица

ОРТ - открытая рамка трансляции

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ХАО - хорионаплантоисные оболочки

ЦПД - цитоплазматическое действие

ВВК-белки (гены) - ВТВ/ВАСК/Ке1сЬ-белки (гены)

Благодарности

Автор выражает искреннюю признательность руководителю работы д.б.н., профессору С.Н. Щелкунову и глубокую благодарность своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми была выполнена диссертационная работа: к.б.н. C.B. Серегину, к.б.н. Е.А. Уваровой, Т.Е. Максютовой, С.Н. Якубицкому, к.б.н. Г.В. Кочневой, Т.А. Лупан, д.б.н., профессору Е.И. Рябчиковой, к.м.н. О.С. Таранову, к.б.н. A.B. Тотменину, к.б.н. И.В. Бабкину и Д.В. Антонец. Особую благодарность автор приносит д.б.н., профессору В.Б. Локтеву, к.х.н. Л.Н. Яшиной и д.м.н. Е.М. МалковоЙ за внимательное прочтение и обсуждение материалов диссертации, ценные замечания и рекомендации, а также к.б.н. В.П. Мишину, к.б.н. C.B. Серегину, к.б.н. И.Н. Бабкиной и к.б.н. Г.В. Кочневой за критическое рассмотрение и обсуждение результатов работы.

КОЛОСОВА Ирина Валерьевна МУТАНТЫ ВИРУСА ОСПЫ КОРОВ С ДЕЛЕЦИЯМИ ГЕНОВ ВВК-СЕМЕЦСТВА

Автореф. дисс. на соискание учёной степени кандидата биологических наук.

Подписано в печать 08.01.2011. Заказ №8. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа СО РАН 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колосова, Ирина Валерьевна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Структурная организация и функциональная роль Kelch-домена.

1.2. Структурная организация, распространение и функции белков, содержащих ВТВ-домен.

1.3. BACK-домен в BTB-Kelch-белках.

1.4. Структурная организация и функции BTB-BACK-Kelch-белков.

1.5. BTB-BACK-Kelch-белки ортопоксвирусов.

2. Материалы и методы.^.

2.1. Материалы.

2.2. Получение компетентных клеток .Е. coli.

2.3. Трансформация компетентных клеток Е. coli.

2.4. Выделение и анализ плазмидной ДНК.

2.5. Трансфекция клеток млекопитающих плазмидной ДНК.

2.6. Титрование вируса и клонирование методом бляшек.

2.7. Выделение вирусной ДНК в препаративном варианте.

2.8. Культивирование вируса на ХАО КЭ.

2.9. Анализ морфологии и размеров вирусных бляшек в культуре клеток CV-1.

2.10. Заражение животных.

2.11. Компьютерный анализ данных.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Сравнительный компьютерный анализ генов, кодирующих ВВК-белки, в геномах поксвирусов.

3.2. Получение клонового варианта ВОК.

3.3. Конструирование плазмид интеграции для направленной делеции ВВК-генов.

3.4. Получение мутантов ВОК с направленно делетированными генами, кодирующими ВВК-белки.

3.5. Изучение биологических свойств мутантных вариантов ВОК.

3.5.1. Репродукция различных делеционных мутантов ВОК в первичной (ФЭК) и перевиваемой (CV-1) культурах клеток.

3.5.2. Динамика роста мутантов ВОК в культуре клеток CV-1.

3.5.3. Сравнение цитопатического эффекта ВОК и его делеционных мутантов в культуре клеток CV-1.

3.5.4. Рост мутантов ВОК при повышенной температуре.

3.5.5. Сравнительная оценка чувствительности различных культур клеток к делеционным мутантам ВОК.

3.5.6. Сравнительное изучение оспин, формируемых на ХАО КЭ делеционными мутантами ВОК.

3.5.7. Электронно-микроскопическое исследование оспин.

3.5.8. Эксперименты на лабораторных мышах.

3.5.8.1. Определение 1Л)5о.

3.5.8.2.0пределение динамики изменения среднего веса мышей, инфицированных мутантами ВОК, с делециями ВВК-генов.

3.5.9. Связь ВВК-белков ВОК с актиновым цитоскелетом клетки и их участие в формировании цитоплазматических выростов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мутанты вируса оспы коров с делециями генов ВВК-семейства"

Вирусы, объединенные в семейство Poxviridae, характеризуются самыми крупными размерами вирионов и генома среди вирусов животных, отличаются от вирусов многих других семейств тем, что их жизненный цикл проходит в цитоплазме клеток. Представители этого семейства инфицируют практически все таксономические группы животных, начиная от насекомых и кончая млекопитающими, в том числе человека. Наиболее активно в данном семействе изучают вирусы рода Orthopoxvirus, поскольку он содержит патогенные для человека вирусы натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров и осповакцины. Особое место в этих исследованиях занимает изучение структурно-функциональной организации генома данных вирусов.

Полагают, что поксвирусы в процессе эволюции включили в состав своей ДНК нуклеотидные последовательности, кодирующие различные белки клетки, которые в первую очередь необходимы для модулирования иммунных реакций организма на вирусную инфекцию, обеспечивая тем самым преодоление данными вирусами различных защитных систем хозяина. Кроме того, в составе генома ортопоксвирусов выявлены гены, продукты которых гомологичны представителям семейств белков клетки, не участвующих напрямую в процессах иммуномодуляции, а регулирующих такие процессы, как клеточный цикл, формирование цитоскелета и т.п. (Koonin et al., 1992). Такие функции, возможно, выполняют вирусные ВВК-белки.

Впервые выявленные у Drosophila melanogaster, гены семейства ВВК присутствуют в геноме многих беспозвоночных и позвоночных животных, включая человека. Белки, кодируемые этими генами, вовлечены в процессы стабилизации и динамики актиновых филаментов, участвуют в образовании цитоскелета, не только в связанном с актином виде, но и самостоятельно, играют роль в регуляции генной экспрессии, деградации белков с участием протеасом, а также выполняют разнообразные функции в других аспектах жизнедеятельности клетки и организма и важны для их функционирования.

В настоящее время известно, что поксвирусы являются единственным семейством в царстве Vira, в составе генома которых выявлены наборы генов ВВК-белков. Несмотря на многочисленность ВВК-белков у ортопоксвирусов функция их до сих пор остается невыясненной.

Вирус оспы коров имеет самый большой набор из шести генов, кодирующих ВВК-белки. Этот вирус является также единственным патогенным для человека представителем рода ортопоксвирусов, который дает широкие возможности лабораторного изучения, так как он имеет обширный круг чувствительных животных.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является введение направленных делеций в выбранные ВВК-теаы вируса оспы коров, штамм GRI-90, и изучение свойств созданных мутантов в системах in vitro и in vivo.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Проведение компьютерного анализа видоспецифических различий генов ортопоксвирусов, кодирующих ВВК-белки.

2. Получение и анализ шести векторных плазмид для интеграции/делеции в целевые гены ВОК: pAA57R, pAB9R, pAB19R, pAC18L, pAG3L, pADl 1L.

3. Получение клонового варианта вируса оспы коров и создание на его основе рекомбинантных мутантов с единичными и множественными делециями генов, кодирующих ВВК-белки.

4. Изучение влияния делеций ВВК-генов на биологические свойства полученных вирусов в системах in vitro и in vivo.

Научная новизна и практическая значимость работы

Изучение функций генов ЯШС-семейства ортопоксвирусов является важной фундаментальной задачей. Впервые на основании выполненного сравнения геномных последовательностей вирусов оспы коров, осповакцины, оспы обезьян и натуральной оспы обнаружено, что ВОК содержит 6 генов семейства ВВК, ВОВ - 3, BOO - 1, а в геноме ВНО все эти гены делетированы или мутационно нарушены.

Впервые получены и охарактеризованы шесть рекомбинантных плазмид интеграции для последовательного введения направленных делеций в гены семейства ВВК: D11L, C18L, G3L, A57R, B9R и B19R штамма GRI-90 вируса оспы коров.

Впервые созданы 18 мутантов ВОК с делециями как единичных генов D11L, C18L, G3L, A57R, B9R или B19R, так и двух, трех, четырех, пяти и шести генов семейства ВВК, при этом рекомбинанты с множественными (больше одной) делециями были получены с различными сочетаниями удаляемых генов. Показано, что гены этого семейства не являются существенными для репродукции вируса оспы коров.

Впервые обнаружено, что у мутантов ВОК с последовательными делециями от одного до четырех генов {DHL, C18L, G3L и A57R), кодирующих ВВК-белки, наблюдаются следующие эффекты в зависимости от количества инактивированных генов: изменяется спектр чувствительных культур клеток, мутанты ВОК, утратившие три гена, имеют сниженную способность размножаться в перевиваемой культуре клеток почки собаки (MDCK), а мутанты по четырем генам утрачивают такую способность; в культуре клеток CV-1 мутанты по четырем генам ВВК при температуре 37°С формируют бляшки меньшего размера по сравнению с исходным ВОК, а при инкубации при повышенной температуре (39,5°С) продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным ВОК; мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины значительно меньшего размера и с меньшим содержанием вируса по сравнению с исходным ВОК; удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназальном заражении мышей линии BALB/c.

Практическая значимость данной работы состоит в том, что выявленный эффект аттенуации вируса при делегировании генов семейства ВВК может быть применен при получении безопасных вакцин новейшего поколения на основе вируса осповакцины. Метод временной доминантной селекции, использованный в данной работе, в настоящее время применяется нами для создания высоко аттенуированных вариантов ВОВ с целью получения живых противооспенных вакцин нового поколения.

Положения, выносимые на защиту

Гены семейства ВВК не являются существенными для репродукции ВОК.

Инактивация генов семейства ВВК у ВОК приводит к следующим эффектам:

1) изменяется круг чувствительных культур клеток, мутанты ВОК, утратившие три гена {D11L, C18L, G3L), имеют сниженную способность размножаться в культуре клеток почки собаки, а мутанты по четырем генам утрачивают такую способность;

2) мутанты с делениями четырех генов ВВК {D11L, C18L, G3L, A57R) в культуре клеток CV-1 при температуре 37°С формируют бляшки меньшего размера по сравнению с исходным вирусом оспы коров, а при инкубации в течение 72 ч после инфицирования при температуре 39,5°С, продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным ВОК (р<0,05);

3) мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины меньшего размера - их диаметр составляет 0,96±0,38 мм и 0,84±0,27 мм, соответственно, а исходного ВОК - 2,1±0,33 мм, с меньшим содержанием в них вируса (титр в тройных мутантах составляет 2x105 БОЕ/оспина, в четверных — 1,6х105 БОЕ/оспина, по сравнению с исходным ВОК, титр которого определяли как 2x106 БОЕ/оспина) (р<0,05);

4) удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназальном заражении мышей линии BALB/c. Для исходного вируса величина LD50 составляла 1,1x105 БОЕ/мышь, в то время как для мутантного клона она равна 8,7x105 БОЕ/мышь (р<0,05).

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликованы 6 статей в журналах списка, рекомендованного ВАК.

Результаты работы были представлены на научных конференциях:

Xlllth International Poxvirus and Iridovirus Symposium, Montpellier, France, Sept. 2-6, 2000; XVth International Poxvirus and Iridovirus Conference, Keble College, Oxford, England, Sept. 3-8, 2004; III-я международная конференция "Фундаментальные науки — медицине", Новосибирск, Россия, Сент. 2-8, 2007; XlVth International Congress of Virology, Istanbul, Turkey, Aug. 10-13, 2008.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков, 11 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, 9 разделов результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 17 отечественных и 186 иностранных источников.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Колосова, Ирина Валерьевна

107 Выводы

1. На основании сравнения геномных нуклеотидных последовательностей вирусов оспы коров, осповакцины, оспы обезьян и натуральной оспы идентифицированы все ортопоксвирусные гены семейства ВВК и выявлены видоспецифичные отличия вирусов: ВОК содержит 6 генов данного семейства, ВОВ - 3, BOO — 1, а в геноме ВНО все эти гены делегированы или мутационно нарушены.

2. Получены шесть рекомбинантных плазмид интеграции для последовательного введения направленных делеций в гены семейства ВВК вируса оспы коров штамм GRI-90.

3. Создана коллекция из 18 мутантов вируса оспы коров с делециями единичных BBK-tqíiob DHL, C18L, G3L, A57R, B9R или B19R, а также двух, трех, четырех, пяти и шести генов этого семейства. Показано, что ВВК-гены ВОК не является существенным для репродукции вируса в культуре клеток CV-1.

4. При изучении мутантов ВОК, у которых последовательно делетированы от одного до четырех генов 2?ДК"-семейства {D11L, C18L, G3L, A57R), обнаружено, что в зависимости от числа делегированных генов наблюдаются следующие эффекты: а) изменяется круг чувствительных культур клеток. Мутанты ВОК, с делецией трех ВВК-т&нов, достоверно хуже размножаются в культуре клеток почки собаки (MDCK), чем исходный ВОК через 48 ч после инфицирования, а мутанты по четырем генам утрачивают эту способность (р<0,05); б) в культуре клеток CV-1 мутанты по четырем генам ВВК при температуре 37°С формируют бляшки достоверно меньшего размера по сравнению с исходным ВОК, а при инкубации при повышенной температуре (39,5 °С) в течение 72 ч, продукция таких мутантов в 100 раз ниже по сравнению с исходным ВОК (р<0,05); в) мутанты по трем и четырем генам ВВК формируют на ХАО КЭ оспины меньшего размера - их диаметр составляет 0,96±0,38 мм и 0,84±0,27 мм, соответственно, а у исходного ВОК - 2,1±0,33 мм. Содержание вируса в них также отличается: титр в тройных мутантах составляет 2x105 БОЕ/оспина, в четверных - 1,6x105 БОЕ/оспина, в то время как в исходном вирусе - 2x106 БОЕ/оспина (р<0,05); г) удаление четырех генов ВВК приводит к достоверному снижению вирулентности ВОК при интраназальном заражении мышей линии BALB/c. Для исходного вируса оспы коров LD50 составляла 1,1x105 БОЕ/мышь, в то время как для мутантного клона - 8,7x105 БОЕ/мышь (р<0,05).

109

Заключение

Выявленные впервые у Drosophila melanogaster, гены семейства ВВК присутствуют в геноме многих позвоночных и беспозвоночных, включая человека (Xue and Cooley, 1993; Albagli et al., 1995; Prag and Adams, 2003). Белки, кодируемые этими генами, участвуют в реорганизации цитоскелета клеток (Lecuyer et al., 2000; Chen et al., 2002; Sasagawa et al., 2002), поддержании структуры комплекса Гольджи (Nacak et al., 2006), деградации белков с участием протеасом (Furukawa et al., 2003), а также в других аспектах жизнедеятельности клетки и организма и важны для их функционирования (Ohmachi et al., 1999; Kang et al., 2004). Гены ДВ/Г-семейства были найдены у представителей семейства Poxviridae, в геноме которых соответствующие ОРТ локализованы в вариабельных концевых участках (Shchelkunov et al., 1998; Shchelkunov et al., 2002). Следует отметить, что ВВК-тевы обнаруживают низкую взаимную гомологию и это может обуславливать различные функциональные свойства кодируемых белков.

Набор ВВК-г&аов у членов семейства поксвирусов варьирует, что возможно обеспечивает специализацию вируса к определенным хозяевам. Известно, что геном слабопатогенного для людей ВОК содержит 6 генов семейства ВВК, тогда как в геноме высокопатогенного ВНО все гены этого семейства разрушены (Shchelkunov et al., 1994). Геномы ВОВ, ВЭ и BOO содержат три, четыре и один ВВК-тены, соответственно (Kotwal and Moss, 1988; Shchelkunov et al., 2002; Chen et al., 2003). К началу наших работ функция этих генов у ортопоксвирусов была неизвестна. Изучение роли ВВК-генов в репродукции ВОК представляло особый интерес в связи с тем, что этот вирус имеет наибольший набор этих генов, имеет широкий круг хозяев и считается родоначальником рода Orthopoxvirus (Маренникова и Щелкунов, 1998; Shchelkunov et al., 1998).

На основе шести полученных нами векторных плазмид интеграции, методом временной доминантной селекции были сконструированы мутанты ВОК (штамм GRI-90) с направленными делециями одного, двух, трех, четырех, пяти и шести ВВК-генов. При этом рекомбинанты с множественными делециями (больше одной) были получены с разными сочетаниями удаляемых генов. Все 18 мутантов оказались жизнеспособными и стабильно сохраняли генотип в течение нескольких пассажей.

С целью изучения сравнительных свойств исходного ВОК и делеционных мутантов, у которых последовательно удалено 1, 2, 3 или 4 гена {DHL, C18L, G3L, A57R), кодирующих ВВК-белки, нами было проведены эксперименты по исследованию их биологических свойств.

Показано, что динамика репродукции различных делеционных мутантов ВОК с удалением одного, двух и трех ЯШ^-генов в первичной (ФЭК) и перевиваемой (CV-1) культурах клеток не отличается от исходного ВОК. Изученная динамика развития вирусов, делеционных по четырем генам семейства ВВК в культуре клеток также CV-1 не обнаружила разницы с «диким» ВОК.

Нами был проведен сравнительный анализ цитопатического эффекта, формируемого исходным ВОК и мутантами с делециями четырех ВВК-тъъоъ в культуре клеток CV-1. Показано, что через 48 ч бляшки, образованные ВОК, обнаруживали более выраженное повреждение монослоя, в то время как бляшки, продуцируемые четверными мутантами, выглядели существенно мельче. Определенная нами оптическая плотность окрашенной бляшки, включая центральные и периферические зоны, составляла 0,18 ± 0,02 для исходного ВОК и 0,33 ± 0,03 для четверных мутантов. Таким образом, выявленное снижение цитопатического эффекта является одним из проявлений делеции BBK-tquob при инфекции in vitro и, по-видимому, приводит к более продолжительному сохранению зараженных клеток на подложке и, соответственно, к более длительному периоду репродукции вируса. Возможно, это обстоятельство обеспечивает равный уровень наработки дочернего вируса мутантами и исходным ВОК на культуре клеток CV-1.

Также нами было изучено влияние повышенной температуры на рост мутантных по двум, трем, четырем генам ВВК ВОК. Показано, что при культивировании ВОК, а также мутантных клонов с делецией четырех ВВК-генов в культуре клеток СУ-1 при температуре 37°С через 72 ч после инфицирования не наблюдалось значительных различий между ними. В то время как при инкубации в течение 72 ч в непермиссивных условиях при повышенной температуре (39,5°С) продукция мутантов ВОК с делециями четырех генов ВВК была достоверно в 100 раз ниже по сравнению с исходным вирусом. Интересно, что вирус натуральной оспы, у которого ВВК-тоны отсутствуют, имеет минимальную в семействе Рохугпс^ае величину предельной температуры формирования оспин на ХАО КЭ (37,5-38,5°С). Для вируса оспы обезьян (один ВВК-тек) этот показатель составляет 39,0-39,5°С, для ВОВ (три ВВК-теяз) он равняется 41°С (Маренникова и Щелкунов, 1998).

Мы определили спектр культур клеток, в которых могут размножаться мутантные вирусы. В эксперименте использовали 11 перевиваемых культур клеток различного происхождения. Обнаружилось, что все тестируемые варианты ВОК, в том числе и вирус «дикого» типа, слабо или практически не размножаются в культуре клеток почки бычка (МОВК). Видимо, это можно будет использовать в будущем в качестве дифференциального признака при идентификации ВОК. В культурах клеток фибробластов мыши (ЗТЗ) и легкого человека (МЖ>5) выявлено отставание репродукции тройных и четверных мутантов от «диких» ВОК. Показано, что в культурах фибробластов легкого эмбриона человека (Ь-68) четверные мутанты размножаются достоверно хуже исходного ВОК, а в культуре клеток почки собаки (МОСК) они утратили эту способность. Таким образом, ВВК-тешл ВОК, по-видимому, можно отнести к группе генов круга хозяев.

При определении вирулентности мутантных вирусов, которую оценивали по величине ЬБзо при интраназальном заражении мышей линии ВАЬВ/с показано, что по мере удаления большего числа ВВК-тенов вирулентность снижается и для четверного мутанта достоверно отличается от исходного вируса.

Для того чтобы выжить в организме хозяина, вирусы эволюционировали, используя ряд сложных механизмов, направленных на уклонение от хозяйского антивирусного иммунного ответа (Tortorella et al., 2000; Finlay and McFadden, 2006). Было высказано предположение о том, что поксвирусные ВВК-белки выполняют ряд функций в ходе инфекции, возможно за счет взаимодействия с цитоскелетом или во время убиквитинизации (Wilton et al., 2008). Поскольку члены семейства поксвирусов, в большинстве случаев, кодируют по несколько ВВК-белков, то возможно, подобно клеточным аналогам, могут функционировать и как куллин-3-субстратспецифичные адаптеры (Zhang et al., 2009). Более того, было показано, что два ВВК-белка, кодируемых генами EVM150 и EVM167 ВЭ, взаимодействуют с куллином-3 и что ВТВ-домен EVM150 и EVM167 является необходимым и достаточным для этого взаимодействия (Wilton et al., 2008). Возможно, снижение вирулентности является следствием того, что делеция ВВК-генов приводит к нарушению механизмов преодоления вирусом защитных реакций организма животных.

Показано, что удаление трех генов ВВК-белков ВОК не сказывается на репродуктивной способности вируса в системе культуры клеток. Однако, на уровне «миниорганизма» в системе КЭ наличие уже 3-х делеций в геноме ВОК начинает сказываться на его репродуктивной способности. Анализ размеров оспин и количественная оценка содержания в них вируса выявили ту же зависимость по отношению к числу делетированных генов ДВ/^-семейства. Удаление 3-х и 4-х генов приводило к достоверному уменьшению размера оспин и количества продуцируемого вируса.

Эти данные были уточнены и расширены при микроскопическом исследовании оспин, образованных на ХАО КЭ делеционными мутантами.

Микроскопический анализ оспин, образованных четверными мутантами, подтвердил выявленные для тройных мутантов изменения и обнаружил их дальнейшее нарастание по мере удаления генов. Сравнение клеток, зараженных четверными мутантами и исходным вирусом, показало, что репродукция мутантов приводит к формированию меньшего числа зрелых вирионов, а во многих клетках репродукция останавливается на стадии сборки незрелых вирионов. Вместе с тем, при размножении мутантов происходит образование значительного числа внеклеточных «одетых» вирионов, что обуславливает диссеминацию вируса в соединительную ткань оспины. Таким образом, проведенное микроскопическое исследование показало, что внесение в геном вируса оспы коров четырех делеций приводит к нарушению репродукции вируса в клетках и развитию дегенеративных изменений структуры клеток.

Нами было показано, что все шесть ВВК-белков BOK-GRI содержат N-концевой ВТВ-домен и С-концевой kelch-домвн (Shchelkunov et al., 2002). Именно за счет этих доменов из актиновых микрофиламентов происходит формирование межклеточных кольцевых каналов ооцита дрозофилы (Robinson and Cooley, 1997). Можно предположить, что схожую функцию в организации внутриклеточных «транспортных магистралей» для своих вирионов выполняют ВВК-белки ВОК. По-видимому, в этом процессе принимают участие и какие-то другие элементы клеточного или вирусного происхождения, поскольку, в клетках, зараженных четверными мутантами, в отличие от исходного вируса, обнаруживаются электронно-плотные включения небольших размеров, состоящие из агрегатов тонких волокон, аморфного вещества и трубчатых структур, и отмечается связь этих включений с системой актиновых микрофиламентов клетки.

Анализ, полученных на оспинах данных, показывает, что параметры морфогенеза четверных мутантов и исходного вируса не различаются, т.е. делеция четырех генов ВВК не приводит к нарушению формирования вирусных частиц. Однако параметры инфекции мутантами и исходным вирусом значительно различаются на клеточном и тканевом уровне, и эти различия, по всей видимости, обусловлены развитием патологических изменений в инфицированных клетках. Можно предположить, что продукты экспрессии ВВК-тепоъ необходимы для «сбалансированного» использования клеточных систем репродуцирующимся вирусом. Отсутствие этих продуктов приводит к нарушению функций клеток, и, как следствие, к снижению воспроизводства вируса, чем, возможно, и обусловлено уменьшение размера и вирусного содержания оспин, образованных делеционными мутантами ВОК, и снижение их вирулентности для BALB/c мышей.

Связь ВВК-белков с актиновым цитоскелетом и участие в формировании цитоплазматических выростов показаны для разнообразных клеточных систем (Furukawa et al., 2003; Inoue et al., 2005; Spence et al., 2000). Делеция ВВК-тевов приводила к сокращению числа клеток, продуцирующих цитоплазматические отростки при репродукции BOB in vitro (Cullinan et al., 2004). Аналогичные изменения были выявлены нами при изучении мутантов ВОК с делецией четырех ВВК-теяов в культуре клеток CV-1: сократилось не только число клеток с отростками, но и длина отростков. Выявленные в зараженных мутантами клетках шарообразные структуры, содержащие актиновые микрофиламенты и вирусные антигены, очевидно, отражают неспособность клетки завершить формирование отростка. Конфокальная микроскопия подтвердила, что в формировании отростков принимают участие актиновые микрофиламенты инфицированных клеток, а отростки содержат вирусные антигены. Учитывая, что отростки содержат, главным образом, зрелые вирусные частицы, можно заключить, что формирование длинных отростков зараженными клетками является одним из механизмов распространения поксвирусной инфекции in vitro. Показано, что репродукция поксвирусов сопровождается разрушением актинового цитоскелета зараженной клетки (Blasco and Moss; 1992). Может быть, активность вирусных ВВК-генов позволяет в какой-то степени компенсировать это разрушение и сформировать цитоплазматические отростки зараженной клеткой, обеспечивая перемещение вирусных частиц на значительные расстояния от тела клетки.

Таким образом, проведенные нами исследования обнаруживают изменения, связанные с делецией ВВК-тъпоъ ВОК и указывают на то, что действие продуктов, синтезированных этими генами, как правило, зависит от числа удаляемых генов 5Я/£-семейства. Кроме того, несомненно, важна роль ВВК-белков ВОК в поксвирусной инфекции и распространении вируса от клетки к клетке.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колосова, Ирина Валерьевна, Кольцово

1. Вирусология. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Б. Мейхи. М: Мир. - 1988. -344 с.

2. Ежова Г.П., Бабаев A.A., Новиков В.В. Биоинформационные аспекты протеомики и деградации белка. Учебно-методический материал по программе повышения квалификации «Хранение и обработка информации в биологических системах». Нижний Новгород - 2007. - 86 с.

3. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Д. Гловера. М: Мир. - 1988. - 538 с.

4. Лакин Г.Ф. Биометрия. М: Высшая школа 1990. - 352 с.

5. Маниатис Т., Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир. - 1984. — с. 480.

6. Маренникова С.С., Шелухина Э.М., Ефремова Е.В. Новый аспект в биологии вируса оспы коров. // Acta Virol. 1984. - Т 28. - С. 437-444.

7. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. КМК. - 1998. - 386 с.

8. Ю.Хеймс Б., Хиггинс С. Транскрипция и трансляция. Методы. Москва: Мир.-1987.-400 с.

9. Приходько Г.Г., Дегтярев С.Х., Речкунова Н.И., Сосновцев C.B., Чижиков В.Е. Общий метод определения участков расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции // Биотехнология. 1990. - №1. — С. 12-16.

10. Рябчикова Е.И., Стрельцов В.В., Петров B.C. Субмикроскопические изменения хорион-аллантоисной оболочки куриных эмбрионов при заражении их вирусом осповакцины // Вопросы вирусологии. 1990. - Т. 6.-С. 506-509.

11. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М: Мир. - 1975. -319 с.

12. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Ч. 2. Новосибирск: Новосибирский университет. 1997. - 400 с.

13. Adams J.C, Kelso R., Cooley L. The kelch repeat superfamily: propellers of cell function//Trends Cell Biol.-2000.-V. 10.-P. 17-24.

14. Adams J.C., Seed B., Lawler J. Muskelin, a novel intracellular mediator of cell adhesive and cytoskeletal responses to thrombospondin-1 // J. EMBO 1998. -V. 17.-P. 4964^4974.

15. Ahmad K.F., Engel C.K., Prive G.G. Crystal structure of the BTB domain from PLZF // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 12123-12128.

16. Ahmad K.F., Melnick A., Lax S., Bouchard D., Liu J., Kiang C.L., Mayer S., Takahashi S., Licht J.D., Prive G.G. Mechanism of SMRT corepressor recruitment by the BCL6 BTB domain // Mol. Cell. 2003. - V. 12. - P. 1551-1564.

17. Alcami A., Koszinowski U.H. Viral mechanisms of immune evasion // Trends Microbiol. 2000. -V. 8. - P. 410-418.

18. Archard L.C., Mackett M., Barnes D.E., Dumbell K.R. The genome structure of cowpox virus white pock variants // J. Gen. Virol. 1984. - V. 65. - P. 775886.

19. Bai C., Sen P., Hofmann K., Ma L., Goebl M., Harper J.W., Elledge S.J. SKP1 connects cell cycle regulators to the ubiquitin proteolysis machinery through a novel motif, the F-box // Cell. 1996. - V. 86. - P. 263-274.

20. Balinsky C.A., Delhon G., Afonso C.L., Risatti G.R., Borca M.V., French R.A.,Tulman E.R., Geary S.J., Rock D.L. Sheeppox virus kelch-like gene SPPV-019 affects virus virulence // J. Virol. 2007. - V. 81. - № 20. - P. 11392-11401.

21. Ball H.J., Melnick A., Shaknovich R., Kohanski R.A., Licht J.D. The promyelocyte leukemia zinc finger (PLZF) protein binds DNA in a high molecular weight complex associated with cdc2 kinase // Nucleic Acids Res. -1999. V. 27. - P. 4106-4113.

22. Banks L., Pim D., Thomas M. Viruses and the 26S proteasome: hacking into destruction // Trends Biochem. Sci. 2003. -V. 28. - № 8. - P. 452-^59.

23. Bardwell V.J., Treisman R. The POZ domain: a conserved protein-protein interaction motif// Genes Dev. - 1994. - V. 8. - P. 1664-1677.

24. Barry M., Früh K. Viral modulators of cullin RING ubiquitin ligases: culling the host defense // Sei. STKE. 2006. - V. 335.

25. Bateman A., Birney E., Cerruti L., Durbin R., Etwiller L., Eddy S.R., GriffithsJones S., Howe K.L., Marshall M., Sonnhammer E.L. The Pfam protein families database // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - P. 276-280.

26. Bawden A.L., Glassberg K.J., Diggans J., Shaw R., FarmerieW., Moyer R.W. Complete genomic sequence of the Amsacta moorei entomopoxvirus: analysis and comparison with other poxviruses // Virology. 2000. - V. 274. № 1. - P. 120-139.

27. Baxby D. Laboratory characteristics of British and Deutch strains of cowpox virus // Zbl. Vet. Med. 1975. - V. 22. - P .480-487.

28. Bixby K.A., Nanao M.H., Shen N.V., Kreusch A., Bellamy H., Pfaffinger P.J., Choe S. Zn -binding and molecular determinants of tetramerization in voltage-gated K+ channels //Nat. Struct. Biol. 1999. - V. 6. - P. 38-43.

29. Blasco R., Moss B. Role of cell-associated enveloped vaccinia virus in cell-to-cell spread // J. Virol. 1992. - V. 66. - № 7. - P. 4170-4179.

30. Bork P., Doolittle R.F. Drosophila kelch motif is derived from a common enzyme fold // J. Mol. Biol. 1994. - V. 236. - P. 1277-1282.

31. Botuyan M.V., Mer G., Yi G.S., Koth C.M., Case D.A., Edwards A.M., Chazin W.J., Arrowsmith C.H. Solution structure and dynamics of yeast elongin C in complex with a von Hippel-Lindau peptide // J. Mol. Biol. — 2001. — V. 312. — P. 177-186.

32. Chen N., Buller R.M., Wall E.M., Upton C. Analysis of host response modifier ORFs of ectromelia virus, the causative agent of mousepox // Virus Res. -2000.-V. 66. -P.155-173.

33. Chen Y., Derin R., Petralia R.S., Li M. Actinfilin, a brain-specific actin-binding protein in postsynaptic density // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 30495-30501.

34. Coscoy L., Ganem D. A viral protein that selectively downregulates ICAM-1 and B7-2 and modulates T cell costimulation // J. Clin. Invest. 2001. - V. 107.-№ 12.-P. 1599-1606.

35. Coulter H.D. Rapid and improved method for embedding biological tissues in Epon 812 and Araldit 502 // J. Ultrastr. Res. 1976. - V. 20. - P. 346-355.

36. Cullinan S.B., Gordan J.D., Jin J., Harper J.W., Diehl J.A. The Keapl-BTB protein is an adaptor that bridges Nrf2 to a Cul3-based E3 ligase: oxidative stress sensing by a Cul3-Keapl ligase // Mol. Cell. Biol. 2004. - V. 24. - P. 8477-8486.

37. David G., Alland L., Hong S.H., Wong C.W., DePinho R.A., Dejean A. Histone deacetylase associated with mSin3A mediates repression by the acute promyelocytic leukemia-associated PLZF protein // Oncogene. 1998. - V. 16.-P. 2549-2556.

38. Deshaies RJ. SCF and Cullin/Ring H2-based ubiquitin ligases // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. - V. 15. - P. 435-467.

39. Diaz E., Schimmôller F., Pfeffer S.R. A novel Rab9 effector required for endosome to TGN transport // J. Cell Biol. 1997. - V. 138. - P. 283-290.

40. Downie A.W. Smallpox. Infectious agents and host reactions // by ed. S.Mudd. Philadelphia: Saunders. - P. 419-123.

41. Eichinger L., Bomblies L., Vandekerckhove J., Schleicher M., Gettemans J. A novel type of protein kinase phosphorylates actin in the actin-fragmin complex // J.EMBO 1996. - V. 15. - P. 5547-5556.

42. Espinas M.L., Jimenez-Garcia E., Vaquero A., Canudas S., Bernues J., Azorin F. The amino-terminal POZ domain of GAGA mediates the formation of oligomers that bind DNA with high affinity and specificity // J. Biol. Chem. -1999.-Y. 274.-P. 16461-16469.

43. Esposito J., Condit R., Objeski J. The preparation of orthopoxvirus DNA // J. Virol. Methods. 1981.-V. 2.-P. 175-179.

44. Evans S.V. SETOR: hardware-lighted three-dimensional solid model representations of macromolecules // J. Mol. Graph. 1993. - V. 11. - № 2. -PP. 134-138, 127-128.

45. Falkner F.G., Moss B. Escherichia coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors // J. Virol. 1988. -V. 62.-P. 1849-1854.

46. Falkner F.G., Moss B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses // J. Virol. 1990. - V. 64. - P. 3108-3 111.

47. Feldman R.M., Correll C.C., Kaplan K.B., Deshaies R.J. A complex of Cdc4p, Skplp, and Cdc53p/cullin catalyzes ubiquitination of the phosphorylated CDK inhibitor Siclp// Cell. 1997. -V. 91. - P. 221-230.

48. Fenner F., Wittek R., Dumbell K.R. Orhopoxviruses. San Diego: Acad. Press Inc.-1989.-432 p.

49. Finlay B.B., McFadden G. Anti-immunology: evasion of the host immune system by bacterial and viral pathogens // Cell. 2006. - V. 124. - № 4. - P. 767-782.

50. Froggatt G.C., Smith G.L., Beard P.M. Vaccinia virus gene F3L encodes an intracellular protein that affects the innate immune response // J. Gen. Virol. -2007.-V. 88.-P. 1917-1921.

51. Fukui Y., Miyake S., Satoh M., Yamamoto M. Characterisation of the Schizosaccharomyces pombe ral2 gene implicated in activation of the rasl gene product//Mol. Cell. Biol. 1989. - V.9. - P. 5617-5622.

52. Furukawa M., He Y.J., Borchers C., Xiong Y. Targeting of protein ubiquitination by BTB-Cullin 3-Rocl ubiquitin ligases // Nat. Cell Biol. -2003.-V. 5.-P. 1001-1007.

53. Geyer R., Wee S., Anderson S., Yates J., Wolf D.A. BTB/POZ domain proteins are putative substrate adaptors for cullin 3 ubiquitin ligases // Mol. Cell. 2003. - V. 12. - P. 783-790.

54. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus // Virology. 1990. - V. 179. -P. 247-266.

55. Greenberg C.C., Connelly P.S., Daniels M.P., Horowits R. Krpl (Sarcosin) promotes lateral fusion of myofibril assembly intermediates in cultured mouse cardiomyocytes // Exp. Cell Res. 2008. - V. 314. - № 5. - P. 1177-1191.

56. Gulbis J.M., Zhou M., Mann S., MacKinnon R. Structure of the cytoplasmic beta subunit-Tl assembly of voltage-dependent K+ channels // Science. -2000. -V. 289. P. 123-127.

57. Gunn T.M., Miller K.A., He L., Hyman R.W., Davis R.W., Azarani A., Schlossman S.F., Duke-Cohan J.S., Barsh G.S. The mouse mahogany locus encodes a transmembrane form of human attractin // Nature. — 1999. — V. 398 -P. 152-156.

58. Hara T., Ishida H., Raziuddin R., Dorkhom S., Kamijo K., Miki T. Novel kelch-like protein, KLEIP, is involved in actin assembly at cell-cell contact sites of Madin-Darby canine kidney cells // Mol. Biol. Cell. 2004. - V. 15. -P. 1172-1184.

59. Hernandez M.C., Andres-Barquin P.J., Holt I., Israel M.A. Cloning of human ENC-1 and evaluation of its expression and regulation in nervous system tumors // Exp. Cell. Res. 1998. - V. 242. - P. 470-477.

60. Hon W.C., Wilson M.I., Harlos K., Claridge T.D, Schofield C.J., Pugh C.W., Maxwell P.H., Ratcliffe P.J., Stuart D.I., Jones E.Y. Structural basis for the recognition of hydroxyproline in HIF-1 alpha by pVHL // Nature. 2002. - V. 417.-P. 975-978.

61. Inoue A., Kang M., Fujimura L., Takamori Y., Sasagawa K., Itoh H., Tokuhisa T., Hatano M. Overexpression of Ndl-s, a variant form of new kelch family protein, perturbs the cell cycle progression of fibroblasts // DNA Cell Biol. -2005.-V. 24.-P. 30-34.

62. Ishido S., Wang C., Lee B.S., Cohen G.B., Jung J.U. Downregulation of major histocompatibility complex class I molecules by Kaposi's sarcoma associated herpesvirus K3 and K5 proteins // J. Virol. 2000. - V. 74. - № 11. - P., 53005309.

63. Ito N., Phillips S.E., Yadav K.D., Knowles P.F. Crystal structure of a free radical enzyme, galactose oxidase // J. Mol. Biol. 1994. - V. 238. - № 5. - P. 794-814.

64. Itoh K., Wakabayashi N., Katoh Y, Ishii T., Igarashi K., Engel J.D., Yamamoto M. Keapl represses nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain // Genes Dev. -1999.-V. 13.-P. 76-86.

65. Jiang S., Seng S., Avraham H.K., Fu Y., Avraham S. Process elongation of oligodendrocytes is promoted by the Kelch-related protein MRP2/KLHL1 // J. Biol. Chem. 2007. - V. 282. - P. 12319-12329.

66. Johnson K.M., Mahajan S.S., Wilson A.C. Herpes simplex virus transactivator VP 16 discriminates between HCF-1 and a novel family member, HCF-2 // J. Virol. 1999. - V. 73. - P. 3930-3940.

67. Kang M.I., Kobayashi A., Wakabayashi N., Kim SG., Yamamoto M. Scaffolding of Keapl to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2004.-V. 101.-P. 2046-2051.

68. Katsani K.R., Hajibagheri M.A., Verrijzer C.P. Co-operative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology // EMBO J. 1999. - V. 18. - P. 698-708.

69. Kim I.F., Mohammadi E., Huang R.C. Isolation and characterizationof IPP, a novel human gene encoding an actin-binding, kelch-like protein // Gene. -1999.-V. 228.-P. 73-83.

70. Kim T.A., Lim J., Ota S., Raja S., Rogers R., Rivnay B., Avraham H., Avraham S. NRP/B, a novel nuclear matrix protein, associates with pllO(RB) and is involved in neuronal differentiation // J. Cell Biol. 1998. - V. 141. - P. 553-566.

71. Kim T.A., Ota S., Jiang S., Pasztor L.M., White R.A., Avraham S. Genomic organization, chromosomal localization and regulation of expression of the neuronal nuclear matrix protein NRP/B in human brain tumors // Gene. 2000. -V. 255.-P. 105-116.

72. Koonin E.V., Senkevich T.G., Chernos V.I. A family of DNA virus genes that consists of fused portions of unrelated cellular genes // Trends Biochem. Sci. -1992. -V. 17. № 6. - P. 213 - 214.

73. Kotwal G.J., Moss B. Vaccinia virus encodes a secretory polypeptide structurally related to complement control proteins // Nature. 1988. - V. 335. -P. 176-178.

74. Kotwal G.J., Moss, B. Analysis of a large cluster of nonessential genes deleted from a vaccinia virus terminal transposition mutant // Virology. 1988. - V. 167.-P. 524-537.

75. Kreusch A., Pfaffinger P.J., Stevens C.F., Choe S. Crystal structure of the tetramerization domain of the Shaker potassium channel // Nature. — 1998. — V. 392.-P. 945-948.

76. Laezza F., Wilding T.J., Sequeira S., Coussen F., Zhang X.Z., Hill-Robinson R., Mulle C., Huettner J.E., Craig A.M. KRIP6: a novel BTB/kelch protein regulating function of kainate receptors // Mol. Cell Neurosci. 2007. - V. 34. - № 4. - P. 539-550.

77. Lecuyer C., Dacheux J.L., Hermand E., Mazeman E., Rousseaux J., Rousseaux-Prevost R. Actin-binding properties and colocalization with actin during spermiogenesis of mammalian sperm calicin // Biol. Reprod. 2000. -V. 63.-P. 1801-1810.

78. Li X., Lopez-Guisa J.M., Ninan N., Weiner E.J., Rauscher F.J. 3rd, Marmorstein R. Overexpression, purification, characterization, and crystallization of the BTB/POZ domain from the PLZF oncoprotein // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 27324-27329.

79. Li X., Zhang D., Hannink M., Beamer L.J. Crystal structure of the Kelch domain of human Keapl // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - P. 54750-54758.

80. Lonergan K.M., Iliopoulos O., Ohh M., Kamura T., Conaway R.C., Conaway J.W., Kaelin W.G. Regulation of hypoxia-inducible mRNAs by the von

81. Hippel-Lindau tumor suppressor protein requires binding to complexes containing elongins B/C and Cul2 // Mol. Cell Biol. 1998. - V. 18. - P. 732741.

82. Luna E.J., Hitt A.L. Cytoskeleton-plasma membrane interactions // Science. -1992.-V. 258.-P. 955-964.

83. Mata J., Nurse P. teal and the microtubular cytoskeleton are important for generating global spatial order within the fission yeast cell // Cell. 1997. - V. 89.-P. 939-949.

84. Maxam A.M., Gilbert M. Sequencing end-labeled DNA with base- specific chemical cleavages // Meth. Enzymol. 1980. - V. 65. - P. 499-560.

85. McPherson M.J, Quirke P., Taylor G.R. Polymerase chain reaction: a practical approach. Oxford University Press. - 1991. - 253 c.

86. McPherson M.J., Ogel Z.B., Stevens C., Yadav K.D., Keen J.N., Knowles P.F. Galactose oxidase of Dactylium dendroide. Gene cloning and sequence analysis // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 8146-8152.

87. Melnick A., Carlile G., Ahmad K.F., Kiang C.L., Corcoran C., Bardwell V., Prive G.G., Licht J.D. Critical residues within the BTB domain of PLZF and Bcl-6 modulate interaction with corepressors // Mol. Cell Biol. — 2002. V. 22. -P. 1804-1818.

88. O.Miller R.G. Non-parametric estimators of the mean tolerance in bioassay // Biometrica. 1973. -V. 60. - P. 535-542.

89. Min J.H., Yang H., Ivan M., Gertler F., Kaelin W.G. Jr., Pavletich N.P. Structure of an HIF-lalpha-pVHL complex: hydroxyproline recognition in signaling // Science. 2002. - V. 296. - P. 1886-1889.

90. Minor D.L., Lin Y.F., Mobley B.C., Avelar A., Jan Y.N., Jan L.Y., Berger J.M. The polar T1 interface is linked to conformational changes that open the voltage-gated potassium channel // Cell. 2000. - V. 102. - P. 657-670.

91. Mok K.W., Cullis P.R. Structural and fusogenic properties of cationic liposomes in the presence of plasmid DNA // Biophys. J. 1997. - V. 73. - P. 2534-2545.

92. Mosavi L.K., Cammett T.J., Desrosiers D.C., Peng Z.Y. The ankyrin repeat as molecular architecture for protein recognition // Protein Sci. — 2004. V. 13. -P. 1435-1448.

93. Moss B. in Fields Virology. Eds Fields B.N., Knipe R.M., Chanock R.M., Melnick J., Roizman B., Shope R. Philadelphia: Raven Press. - 1996. - P. 2637-2671.

94. Motchoulski A., Liscum E. Arabidopsis NPH3: A NPH1 photoreceptor-interacting protein essential for phototropism // Science. 1999. - V. 286. - P. 961-964.

95. Nacak T.G., Leptien K., Fellner D. The BTB-kelch protein LZTR-1 is a novel Golgi protein that is degraded upon induction of apoptosis // J. Biol. Chem. — 2006. V. 281. -P. 5065-5071.

96. Nanao M.H., Zhou W., Pfaffinger P.J., Choe S. Determining the basis of channel-tetramerization specificity by x-ray crystallography and a sequence-comparison algorithm: Family Values // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. -V. 100.-P. 8670-8675.

97. Payne L.G. Significance of extracellular enveloped virus in the in vitro and in vivo dissemination of vaccinia// J. Gen. Virol. 1980. -V. 50. - P. 89-100.

98. Payne L.G. The existence of an envelope on extracellular cowpox virus and its antigenic relationship to the vaccinia envelope // Arch. Virol. 1986. —V. 90.-P. 125-133.

99. Perkus M.E., Goebel S.J., Davis S.W., Johnson G.P., Norton E.K., Paoletti E. Deletion of 55 open reading frames from the termini of vaccinia virus // Virology. 1991. -V. 180. - P. 406-410.

100. Petroski M.D., Deshaies R.J. Function and regulation of cullin-RING ubiquitin ligases // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. - V. 6. - № 1. - P. 9-20.

101. Philips J., Herskowitz I. Identification of Kellp, a kelch domain-containing protein involved in cell fusion and morphology in Saccharomyces cerevisiae II J. Cell. Biol. 1998. - V. 143. - P. 375-389.

102. Pickart C.M. Mechanisms underlying ubiquitination // Ann. Rev.Biochem. -2001.-V. 70.-P. 503-533.

103. Pickup D.J., Ink B.S., Hu W., Joklik W.K. Spontaneous deletions and duplications of sequences in the genome of cowpox virus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V.79. - P. 6817-6821.

104. Pintard L., Willis J.H., Willems A., Johnson J.L., Srayko M., Kurz T., Glaser S., Mains P.E., Tyers M., Bowerman B., Peter M. The BTB protein MEL-26 isa substrate-specific adaptor of the CUL-3 ubiquitinligase // Nature. 2003b. — V. 425. -P, 311-316.

105. Prag S., Adams J.C. Molecular phylogeny of the kelch-repeat superfamily reveals an expansion of BTB/kelch proteins in animals // BMC Bioinformatics. 2003. - V. 4. - № 42. - Epub 2003 Sep 17.

106. Ramos S., Khademi F., Somesh B.P., Rivero F. Genomic organization and expression profile of the small GTPases of the RhoBTB family in human and mouse // Gene. 2002. - V. 298. - P. 147-157.

107. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints // Amer. J. Hyg. 1938. - V. 27. - P. 493-497.

108. Rivero F., Dislich H., Glockner G., Noegel A.A. The Dictyostelium discoideum family of Rho-related proteins // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29.-P. 1068-1079.

109. Robinson D.N., Cooley L. Drosophila kelch is an oligomeric ring canal actin organizer // J. Cell Biol. 1997. - V. 138. - P. 799-810.

110. Ryabchikova E.I., Strel'tsov V.V., Petrov V.S. Submicroscopic modifications of chorion-allantoic membrane of chicken embryos infected with vaccinia virus // Problems Virology. 1990. - V. 6. - P. 506-509.

111. Rychlik W., Rhoads R.E. A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA // Nucleic Acids Res. 1989. - V. 17. - P. 8543-8551.

112. Sakai T., Wada T., Ishiguro S., Okada K. RPT2. A signal transducer of the phototropic response in Arabidopsis 11 Plant Cell. — 2000. V. 12. - P. 225236.

113. Salas-Vidal E., Meijer A.H., Cheng X., Spaink H.P. Genomic annotation and expression analysis of the zebrafish Rho small GTPase family during development and bacterial infection // Genomics. 2005.- V. 86. - P. 25-37.

114. Schmid M.F., Agris J.M., Jakana J., Matsudaira P., Chiu W. Three-dimensional structrue of a single filament in the Limulus acrosomal bundle: scruin binds to homologous helix-loop-beta motifs in actin // J. Cell Biol. -1994. V. 124. - P. 341-350.

115. Schulman B.A., Carrano A.C., Jeffrey P.D., Bowen Z., Kinnucan E.R., Finnin M.S., Elledge S.J., Harper J.W., Pagano M., Pavletich N.P. Insights into SCF ubiquitin ligases from the structure of the Skpl-Skp2 complex // Nature. -2000.-V. 408.-P. 381-386.

116. Seng S., Avraham H.K., Jiang S., Yang S., Sekine M., Kimelman N., Li H., Avraham S. The nuclear matrix protein, NRP/B, enhances Nrf2-mediated oxidative stress responses in breast cancer cells // Cancer Res. 2007. - V. 67. -P. 8596-8604.

117. Shackelford J., Pagano J.S. Targeting of host-cell ubiquitin pathways by viruses // Essays Biochem. 2005. -V. 41. - P. 139-156.

118. Shchelkunov S.N. Functional organization of variola major and vaccinia virus genomes // Virus Genes. 1995. - V. 10. - P. 53-71.

119. Shchelkunov S.N., Blinov V.M., Resenchuk S.M. Analysis of the nucleotide sequence of 53 kpb from the right terminus of the genome of variola major virus strain India-1967 // Virus Res. 1994. - V. 34. - P. 207-236.

120. Shchelkunov S.N., Blinov V.M., Sandakhchiev L.S. Ancyrin-like proteins of variola and vaccinia viruses // FEBS Lett. 1993. - V. 319. - P. 163-165.

121. Shchelkunov S.N., Massung R.F., Esposito J J. Comparison of the genome DNA sequences of Bangladesh-1975 and India-1967 variola virus // Virus Res. 1995.-V. 36.-P. 107-118.

122. Shchelkunov S.N., Resenchuk S.M., Totmenin A.V., Blinov V.M., Marennikova S.S., Sandakhchiev L.S. Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses // FEBS Lett. 1993. - V. 327. - P. 321-324.

123. Shchelkunov S., Totmenin A., Kolosova I. Species-specific differences in organization of orthopoxvirus kelch-like proteins // Virus Genes. 2002. — V. 24.-P. 157-162.

124. Skowyra D., Craig K.L., Tyers M., Elledge S.J., Harper J.W. F-box proteins are receptors that recruit phosphorylated substrates to the SCF ubiquitin-ligase complex // Cell. 1997. - V. 91. - P. 209-219.

125. Smith G.L., Chan Y.S. Two vaccinia virus proteins structurally related to the interleukin-1 receptor and the immunoglobulin superfamily // J. Gen. Virol. -1991.-V. 72.-P. 511-518.

126. Smith G.L., Vanderplasschen A., Law M. The formation and function of extracellular enveloped vaccinia virus // J. Gen. Virol. 2002. - V. 83. - P. 2915-2931.

127. Sodeik B. Mechanisms of viral transport in the cytoplasm // Trends in Microbiology. 2000. - V. 8. - P. 465-472.

128. Soltysik-Espanola M., Rogers R.A., Jiang S., Kim T.A., Gaedigk R., White R.A., Avraham H., Avraham S. Characterization of Mayven, a novel actin-binding protein predominantly expressed in brain // Mol. Biol. Cell. 1999. -V. 10.-P. 2361-2375.

129. Spence H.J., Johnston I., Ewart K., Buchanan S.J., Fitzgerald U., Ozanne B.W. Krpl, a novel kelch related protein that is involved in pseudopod elongation in transformed cells // Oncogene. 2000. - V. 19. - № 10. - P. 1266-1276.

130. Spriggs M.K. One step ahead of the game: viral immunomodulatory molecules //Annu. Rev. Immunol. 1996. -V. 14. - P. 101-130.

131. Stebbins C.E., Kaelin W.G. Jr., Pavletich N.P. Structure of the VHL-ElonginC-ElonginB complex: implications for VHL tumor suppressor function // Science. 1999. - V. 284. - P. 455-461.

132. Stevenson P.G., Efstathiou S., Doherty P.C., Lehner P.J. Inhibition of MHC class I-restricted antigen presentation by gamma 2-herpesviruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -V. 97. - № 15. - P. 8455-8460.

133. Stogios P.J., Downs G.S., Jauhal J.J., Nandra S.K., Privé G.G. Sequence and structural analysis of BTB domain proteins // Genome Biol. 2005. - V. 6. -№ 10. - Epub 2005 Sep 15.

134. Stogios P.J., Privé G.G. The BACK domain in BTB-kelch proteins // Trends Biochem. Sci. 2004. - V. 29. - № 12. - P. 634-637.

135. Strang C., Cushman S.J., DeRubeis D., Peterson D., Pfaffinger P.J. A central role for the T1 domain in voltage-gated potassium channel formation and function // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 28493-28502.

136. Tortorella D., Gewurz B.E., Furman M.H., Schust D.J., Ploegh H.L. Viral subversion of the immune system // Annu. Rev. Immunol. 2000. — V. 18 — P. 861-926.

137. Tulman E.R., Afonso C.L., Lu Z., Zsak L., Kutish G.F., Rock D.L. The genome of canarypox virus // J. Virol. 2004. - V. 78. - № 1. - P. 353-366.

138. Tulman E.R., Afonso C.L., Lu Z., Zsak L., Sur J.H., Sandybaev N.T., Kerembekova U.Z., Zaitsev V.L., Kutish G.F., Rock D.L. The genomes of sheeppox and goatpox viruses // J. Virol. 2002. - V. 76. - № 12. - P. 60546061.

139. Ulane C.M., Horvath C.M. Paramyxoviruses SV5 and HPIV2 assemble STAT protein ubiquitin ligase complexes from cellular components // Virology. 2002. - V. 304. - № 2. - P. 160-166.

140. Upton C., Macen J.L., Wishart D.S., McFadden G. Myxoma virus and malignant rabbit fibroma virus encode a serpin-like protein important for virus virulence // Virology. 1990. - V. 179.-P. 618-631.

141. Upton C., McFadden G. Tumorigenic poxviruses: analysis of the viral DNA sequences implicated in the tumorigenicity of Shope fibrome virus and malignant rabbit virus // Virology. 1986. - V. 152. - P. 308-321.

142. Varkey J.P., Muhlrad P.J., Minniti A.N., Do B., Ward S. The Caenorhabditis elegans spe-26 gene is necessary to form spermatids and encodes a protein similar to the actin-associated proteins kelch and scruin // Genes Dev. 1995. -V. 9.-P. 1074-1086.

143. Way M., Sanders M., Chafel M., Tu Y.H., Knight A., Matsudaira P. Beta-scruin, a homologue of the actin cross-linking protein scruin, is localised to the acrosomal vesicle of Limulus sperm // J. Cell Sci. 1995. - V. 108. - P. 31553162.

144. Way M., Sanders M., Garcia C., Sakai J., Matsudaira P. Sequence and domain organization of scruin, an actin-cross-linking protein in the acrosomal process of Limulus sperm // J. Cell. Biol. 1995. - V. 128. - P. 51-60.

145. Weissman A.M. Themes and variations on ubiquitylation // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. -V. 2. - № 3. - P. 169-178.

146. Wilkins A., Ping Q., Carpenter C.L. RhoBTB2 is a substrate of the mammalian Cul3 ubiquitin ligase complex // Genes Dev. 2004. - V. 18. - P. 856-861.

147. Wilson A.C., Freiman R.N., Goto H., Nishimoto T., Herr W. VP16 targets an amino-terminal domain of HCF involved in cell cycle progression // Mol. Cell. Biol. 1997. -V. 17. - P. 6139-6146.

148. Wilton BA, Campbell S, Van Buuren N, Garneau R, Furukawa M, Xiong Y, Barry M. Ectromelia virus BTB/kelch proteins, EVM150 and EVM167, interact with cullin-3-based ubiquitin ligases // Virology. 2008. - V. 374. - P. 82-99.

149. Wolff T., O'Neill R.E., Palese P. NS1-Binding protein (NS1-BP): a novel human protein that interacts with the influenza A virus nonstructural NS1 protein is relocalized in the nuclei of infected cells // J. Virol. 1998. - V. 72. -P. 7170-7180.

150. Wong C.W., Privalsky M.L. Components of the SMRT corepressor complex exhibit distinctive interactions with the POZ domain oncoproteins PLZF, PLZF-RARalpha, and BCL-6 // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 2769527702.

151. Xu L., Wei Y., Reboul J., Vaglio P., Shin T.H., Vidal M., Elledge S.J., Harper J.W. BTB proteins are substrate-specific adaptors in an SCF-like modular ubiquitin ligase containing CUL-3 II Nature. 2003. - V. 425. - P. 316-321.

152. Xue F., Cooley L. Kelch encodes a component of intercellular bridges in Drosophila egg chambers // Cell. 1993. - V. 72. - P. 681-693.

153. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors // Gene. 1985. V. 33. - P. 267-271.

154. Yu X., Yu Y., Liu B., Luo K., KongW., Mao P., Yu X.F. Induction of APOBEC3G ubiquitination and degradation by an HIV-1 Vif-Cul5-SCF complex // Science. 2003. - V. 302. - P. 1056-1060.

155. Zhang L., Villa N.Y., McFadden G. Interplay between poxviruses and the cellular ubiquitin/ubiquitin-like pathways // FEBS Lett. 2009. - V. 583. - № 4.-P. 607-614.

156. Zheng N., Schulman B.A., Song L., Miller J.J., Jeffrey P.D., Wang P., Chu C., Koepp D.M., Elledge S.J., Pagano M. Structure of the Cull-Rbxl-Skpl-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex // Nature. 2002. - V. 416. - P. 703709.

157. Ziegelbauer J., Shan B., Yager D., Larabell C., Hoffmann B., Tjian R. Transcription factor MIZ-1 is regulated via microtubule association // Mol. Cell. 2001. - V. 8. - P. 339-349.