Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуногенные свойства и структура генома вируса оспы кур, репродуцированного в культуре клеток

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яременко, Лилиана Ивановна, Москва

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамент ветеринарии

I

ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ

ПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи

ЯРЕМЕНКО ЛИЛИАНА ИВАНОВНА

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА И СТРУКТУРА ГЕНОМА ВИРУСА ОСПЫ КУР, РЕПРОДУЦИРОВАННОГО В КУЛЬТУРЕ

КЛЕТОК.

03.00.06 - Вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор В.В.ГУНЕНКОВ, заслуженный деятель науки, лауреат премии Правительства РФ

Кандидат биологических наук Ю.О.СЕЛЯНИНОВ

Москва - 1999 г.

СОДЕРЖАНИЕ Стр.

ВВЕДЕНИЕ 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ "Оспа птиц" , 8

1. Общие сведения об оспе птиц 8

2. Характеристика возбудителя 9

2.1. Строение вир иона 9

2.2. Физико-химические свойства 10

2.3. Характеристика нуклеиновой кислоты 11

2.4. Характеристика полипептидного состава вируса оспы кур 14

3. Молекулярно-биологические методы изучения структуры генома 17

3.1. Физическое картирование геномов 19

3.2. Молекулярно-биологическая характёристика ДНК различных представителей семейства Рохушс1ае 22

4. Некоторые аспекты формирования иммунитета при оспе птиц 28

5. Профилактика оспы кур 30

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 36

6. Материалы и методы 36

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 45 1. Изучения влияния дозы вакцинного вируса на динамику формирования и длительность иммунитета против оспы у цыплят разного

возраста, привитых аэрозольно 45

1.1. Выбор эффективной дозы культурального вируса оспы кур для аэрозольной иммунизации цыплят 45

1.2. Изучение динамики формирования иммунитета у цыплят 60-дневного возраста в первые дни после аэрозольной вакцинации 49

1.3. Динамика формирования иммунитета у цыплят, вакцинированных в возрасте 106 дней вирусом в дозе 1000 и 2000 ТЦД50 53

1.4. Динамика формирования иммунитета у цыплят, вакцинированных аэрозольно в 136-дневном возрасте 61

1.5. Сравнительные данные о влиянии возраста и дозы вакцинного вируса на эффективность аэрозольной вакцинации цыплят 65

i

1.6. Сравнительное изучение длительности противооспенного иммунитета у кур, вакцинированных аэрозольно 67

2. Изучение динамики формирования и длительности иммунитета у цыплят, вакцинированных внутрикожно 71

3. Изучение эффективности иммунизации против оспы цыплят раннего возраста 77

3.1. Результаты внутрикожной вакцинации цыплят раннего возраста 77

3.2. Результаты интраназальной вакцинации цыплят культураль-

ным вирусом оспы кур , 79

3.3. Результаты оральной иммунизации цыплят суточного возраста 81

4. Молекулярно-биологические исследования вакцинного штамма ВГНКИ-3 вируса оспы кур, репродуцированного в культуре клеток 83

4.1. Изучение полипептидного состава вакцинного штамма вируса оспы кур 86

4.2. Рестрикционный анализ ДНК вируса оспы кур шт.ВГНКИ-3 и построение физических карт генома 86

ОБСУЖДЕНИЕ 97

ВЫВОДЫ ' 106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 108

ПРИЛОЖЕНИЕ 123

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Оспа птиц известна более двухсот лет. Однако острота проблемы специфической профилактики этой болезни у домашних птиц сохраняется до настоящего времени. Это связано в основном с тем, что условия современного промышленного птицеводства, характерной чертой которого является концентрация птиц на малых площадях, предрасполагают к появлению и быстрому распространению в хозяйствах оспенной болезни, а ветеринарная наука, призванная совершенствовать средства и методы вакцинопрофилактики, отстала в решении этой задачи. Так, до 1990

I

года биологическая промышленность страны выпускала для профилактики птичьей оспы две эмбриональные вакцины из вирусов оспы голубя (шт.Нью-Джерси) и оспы фазана (шт.27-АШ), которые по причине низкой иммуногенности создавали у цыплят иммунитет, длящийся не более 3-4 месяцев. Поэтому их должны были применять не менее 3-5 раз, да еще весьма трудоемким способом: втиранием цыплятам с помощью щеточки в фолликулы ощипанной голени. Для выполнения этой работы не хватало ветеринарного и вспомогательного персонала. Это способствовало поддержанию стойкого

I

неблагополучия по этой болезни в птицеводческих хозяйствах и целых регионах.

Существенные перемены в области специфической профилактики оспы у птиц в нашей стране произошли после внедрения в 1989 году сухой культуральной вакцины из вируса оспы кур и вскоре, в 1993 году, жидкой культуральной вакцины из голубиного вируса оспы, разработанных в ВГНКИ В.В.Гуненковым, З.Я.Чистовой, Г.Д.Кузнецовой и др. (1990, 1992, 1993).

Первая вакцина вводится птицам уколом в перепонку крыла однократно и обеспечивает создание иммунитета на срок не менее 12 месяцев. Вторая применяется аэрозольно и стимулирует образование иммунитета на срок до 7 месяцев.

Недостатком первой вакцины является небольшой запас инфекционной активности, чтобы быть примененной аэррзольно. А у второй недостаточная иммуногенность, поэтому она требует двукратного применения.

Цель и задачи исследований.

Целью настоящих исследований явилось изучение иммуногенных свойств и структуры генома вируса оспы кур, репродуцированного в культуре клеток, с перспективой создания более иммуногенной культуральной вакцины, пригодной для нескольких способов применения.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение влияния дозы вакцинного вируса оспы кур шт.ВГНКИ-3, репродуцированного в культуре клеток, на формирование и длительность противооспенного иммунитета у цыплят, привитых аэрозольно.

2. Изучение динамики формирования и длительности иммунитета против оспы у цыплят, привитых культуральным вирусом оспы внутрикожно.

3. Изучение эффективности иммунизации против оспы цыплят раннего возраста.

4. Изучение структуры генома вируса оспы кур, шт.ВГНКИ-3, репродуцированного в культуре клеток, методом рестрикционного анализа.

Научная новизна работы.

Показана высокая иммунизирующая активность культурального вируса оспы кур при аэрозольном и внутрикожном применении цыплятам в возрасте 60, 106 и 136 дней. Иммунитет формируется в течение 5-7 дней на срок не менее 12-14 месяцев. Установлена зависимость динамики образования и длительности противооспенного иммунитета главным образом от дозы вакцинного вируса при иммунизации цыплят в возрасте 60 дней и старше. Экспериментально показано, что длительность противооспенного иммунитета у цыплят, привитых внутрикожно в возрасте 1-18 дней, ограничивается сроком, не превышающим 3-4 месяцев.

Методом рестрикционного анализа установлена структура генома вакцинного штамма ВГНКИ-3 вируса оспы кур, а также признаки сходства и отличия его от других штаммов вируса этого вида. Разработаны физические карты генома вируса.

Практическая значимость работы заключается в том, что обоснована целесообразность применения штамма ВГНКИ-3 вируса оспы кур, репродуцированного в культуре клеток, для иммунизации цыплят и кур против оспы с использованием нескольких способов иммунизации. Профили рестрикции и размеры PST 1, Sal Gl, Hind Ш и Bam HI фрагментов ДНК штамма ВГНКИ-3 могут служить его генетическими маркерами.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на: • 13 Международном симпозиуме Всемирной ассоциации ветеринарных микробиологов, иммунологов и специалистов по инфекционным болезням, 1994 (Перуджа - Мантова, Италия).

• Второй Международной научно-практической конференции

I

«Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции», 1997 (Москва).

• Конференции ВНИИВВиМ, посвященной 40-летию института, 1998 (г.Покров).

Диссертационная работа апробирована на межлабораторном совещании ВГНКИ (протокол N 4 от 29.03.99 г).

Публикации. По материалам исследований опубликованы 4 печатные работы (Россия, Италия).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Штамм ВГНКИ-3 вируса оспы кур, репродуцированный в культуре клеток куриного эмбриона, обладает высокими иммунизирующими свойствами при аэрозольном, внутрикожном и интраназальном применении цыплятам разного возраста.

2. Сроки формирования противооспенного иммунитета не зависят существенно от возраста прививаемых цыплят, дозы и пути введения вакцинного вируса.

3. Доза вакцинного вируса оказывает существенное влияние на длительность противооспенного иммунитета у цыплят.

4. Цыплята, привитые внутрикожно в возрасте 1-18 дней, приобретают иммунитет на срок, не превышающий 3-4 месяцев.

5. Структура генома вакцинного культурального вируса по результатам рестрикционного анализа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОСПА ПТИЦ

I

1. Общие сведения об оспе птиц.

Оспа птиц - медленно протекающая болезнь, характеризующаяся развитием пролиферативных поражений на неоперенных частях тела птиц, а также на слизистых оболочках пищеварительного респираторного тракта, рта и пищевода (Tripathy 1984, 1989,1991, Olufemi, 1996, Boyle D.B.,1997, Ostrowski, 1996). Болезнь поражает цыплят, индеек, голубей, фламинго, перепелов, фазанов, канареек, страусов (Tripathy, 1991,A1-Ani, 1986, Arai S.,

1991, Olufemi, 1992, Perelman, 1988). Существуют две классические

»

формы клинического проявления болезни: кожная,

характеризующаяся появлением пролиферативных поражений на

неоперенных участках кожи, и дифтеритическая, при которой

поражаются слизистые оболочки ротовой и носовой полостей, а

также подглазничной ямки (Сюрин В.Н., 1998). При кожной форме

оспы обычно обнаруживают бородавчатые образования, покрытые

бурым кровянистым струпом, чаще на гребне, бородках, сережках, у

основания клюва, на щеках. Течение болезни преимущественно

хроническое. Оспа, протекающая без осложнений, заканчивается в

!

течение 5-6 недель. Кожная форма чаще протекает доброкачественно. Переболевшие куры становятся истощенными, многие слепнут на один или оба глаза. Летальность среди взрослых кур достигает 10-20%, среди молодняка, особенно в холодное время года - 50-70% (Сюрин В.Н. и др.,1998). Описана также атипичная форма оспы у бройлеров, при которой оспины появлялись только на оперенных участках кожи (Fallavena L.C et al, 1993). У индеек также описана венерическая форма оспы (Metz et al, 1985). Методом

борьбы с оспой является иммунопрофилактика. Важную роль в профилактике играет защита от насекомых для предотвращения механического переноса возбудителя москитами (Boyle D.B. et al.,1997).

2. Характеристика возбудителя.

t

Вирус оспы кур является типичным представителем рода вирусов оспы птиц (Avipoxvirus) подсемейства вирусов позвоночных (Chordopoxvirinae) семейства оспенных вирусов Poxviridae (Fenner F. et al., 1979, Tripathy et al., 1991).

2.1. Строение вириона.

Вирион вируса оспы кур кирпичевидной формы, средние размеры которого 258x354 nm (Randall С.С., Gafford, 1964 ), длина 3220 + 902 А, ширина 2640 ± 793 А и осевое соотношение 1,22 (Ф.Феннер, Б.Мак-Ослен и др., 1977). Типичный вирус оспы состоит из наружной трехслойной мембраны, которая заключает в себе двояковогнутую сердцевину, напоминающую форму гантели, и две овальные структуры - латеральные тела, функции которых не ясны (Панчева С., 1982). Вирусы оспы птиц имеют такую же структуру (Arhelger R., Randall С.С, 1964, Cheville N.F. et al., 1966 , Tajima M., Ushijima J., 1966). Наружный и внутренний слои оболочки

осмиофильны, средний - осмиофобный. На поверхности мембраны

i

имеются наружные шипики, размер которых варьирует от 300 А до 400 А. Обработка вируса оспы кур трипсином приводит к разрушению вирусной мембраны и высвобождению переплетенных канатоподобных структур, а также к потере шиловидных отростков. Внутренний слой мембраны, состоящий из субъединиц размером 40

А, имеет толщину 200-300 A (Hyde J.M., Gafford L.G. et al., 1965 ). Внеклеточные вирионы вируса оспы птиц покрыты дополнительной наружной оболочкой, отсутствующей у внутриклеточных вирионов. Она играет важную роль в индукции вируснейтрализующих антител (Сюрин В.Н.и др., 1998).

2.2. Физико-химические свойства вируса.

Вирусы оспы обладают различной устойчивостью к воздействию температуры. Наибольшую устойчивость имеют штаммы, распространенные в странах с тропическим климатом (Маренникова С.С., Мальцева Н.И., 1964). Это свойство характерно для отдельных штаммов и потому может варьировать у одного и того же вируса (Гуненков В.В., Сюрин В.Н., 1966). По данным (Щеглова И.В., 1971) отдельные клоны вируса оспы птиц теряли инфекционные свойства через 40 минут прогревания при 56° С, тогда как исходный штамм инактивировался через 20 минут. При нагревании до 50° С вирус теряет инфекционную активность в течение 30 минут, до 60° С - в течение 8 минут (Andrews С, Pereira H.G., 1978).

Большей термостабильностью обладают лиофилизированные вирусы оспы кур и голубей. При 100° С они сохраняют инфекционный титр в течение 10 минут, далее он снижается и через 120 минут наступает их полная инактивация. При температуре минус 4° С лиофилизированные вирусы сохраняются в течение 170 дней (Alboiu М., Bern S. et al, 1967).

Вирус оспы птиц чувствителен к этиловому спирту, быстро

погибает в гниющем субстрате. В оспенных корочках при

j

температуре минус 15 градусов вирус выживает до 2 лет и более. Вирус оспы кур инактивируется 1% раствором каустической соды и

фенола. Формалин в разведении 1:1 ООО инактивирует его в течение 9 дней. Хлороформ-бутанол разрушает вирус, но не действует на

ДНК, трипсин не оказывает действия ни на ДНК, ни на вирус в

j

целом (Randall et al,1966 ). Устойчивость к обработке эфиром является общим признаком для этой группы возбудителей (Mattews R.E.F. et al., 1982 ).

2.3. Характеристика нуклеиновой кислоты. У представителей рода Avipoxvirus присутствуют все признаки, общие для семейства Poxviridae, включая форму вириона, локализацию репликации в цитоплазме и большой геном,

I

представленный двухцепочечной ДНК (R.Drillien, D.Spehner et al 1987). Негенетическая реактивация наблюдается между вирусами не только одного рода, но и между представителями различных родов вирусов оспы позвоночных. Это показывет, что у всех представителей оспенных вирусов общие механизмы репликации. (Hanafusa 1959; Гуненков В.В.,1966; Гуненков В.В., Сюрин В.Н., 1966).

Геном вирусов оспы представлен двухспиральной линейной молекулой ДНК, состоящей из 130-375 тысяч пар нуклеотидов.

I

Концы ДНК ковалентно связаны и содержат инвертированные повторы различной длины. Доля Г-Ц пар в нуклеотидном составе поксвирусов позвоночных составляет 35-64%. С нуклеоидом вириона ассоциировано 15 ферментов, некоторые из них участвуют в транскрипции ДНК и модификации информационных РНК:аденировании, кэпировании и метилировании (Сюрин В.Н.и др., 1998). Терминальные регионы 30-35 kb генома вируса оспы кур содержат гены, определяющие важнейшие вирусные

характеристики, такие как спектр хозяев, вирулентность, тропизм и поведение в культуре клеток. Физическое расположение этих генов варьирует и степень консервативности среди них значительно ниже, чем у генов из центрального региона генома (Mockett, Archard, 1979).

ДНК вируса оспы кур неинфекционна. Вирусы оспы

I

размножаются в цитоплазме клетки. Процессы, связанные с их репродукцией, исследованы главным образом на различных вариантах вируса осповакцины и типичны для всех представителей семейства. Репликативный цикл делится на следующие стадии: адсорбция, проникновение в клетку, раздевание, ранняя транскрипция, репликация ДНК, поздняя транскрипция, сборка вируса, созревание и выход из клетки (Б.Филдс, Д.Найп и др., 1989). Внешняя мембрана вируса сливается с клеточной плазматической мембраной или с мембраной вакуоли, образованной путем

I

инвагинации, что приводит к проникновению вирусного нуклеоида в цитоплазму виропексисом (Dales S., Kajioka R., 1964, Chang A., Metz D.N., 1976, Панчева С., 1982 ). Стадия раздевания протекает в две фазы. Вначале под влиянием протеолитических ферментов разрушается большая часть белка и фосфолипидов оболочки вируса и высвобождается нуклеоид. Этот процесс продолжается около 20 минут. Далее с ДНК нуклеоида осуществляется транскрипция, а рибосомами клетки обеспечивается синтез ранних вирусных

протеинов и вирусспецифического раздевающего в том числе. Под

i

воздействием последнего происходит депротеинизация ДНК до формы, чувствительной к ДНК-азе (Гуненков В.В., Сюрин В.Н., 1966, Ф.Феннер, Б.Мак-Ослен и др., 1977, Панчева С., 1982).

На стадии ранней транскрипции, протекающей до репликации вирусной ДНК, транскрибируется около половины вирусного генома. Происходит синтез ряда ранних белков и ферментов на клеточных рибосомах (Esteban M., Metz D.N., 1973, Williamson J.D., Cooke В.S., 1973, Brakel S, Kates J., 1974, Pennington T.N., 1974, Boone R.F. Eusinger M.J. et al, 1977, Boone R.F, Moss В., 1978, Paoletti E, Grady L.J., 1977).

Специфическим признаком вирусов оспы является цитоплазматическая локализация ^ репликации ДНК, хотя новосинтезированная вирусная ДНК иногда попадает в ядро ( Pennington T.N, 1974, Gafford L.G, Randall C.C, 1976). Ее синтез укладывается во времени с 1,5 ч до 6 часов после заражения (Joklik W.K, Becker J, 1964). На поздних стадиях транскрибируется почти весь геном и синтезируются ранние и поздние структурные белки и ферменты ( Paoletti Е,Соорег N. et al, 1974, Paoletti Е, Grady L.J, 1977, Boone R.F, Moss В, 1978).

Начальные стадии образования вириона происходят в ограниченных гранулярных областях цитоплазмы, расположенных в с�