Мультифункциональный ядерный белок эукариот Е(у)2 и механизм его действия

Краснов, Алексей Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мультифункциональный ядерный белок эукариот Е(у)2 и механизм его действия
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Мультифункциональный ядерный белок эукариот Е(у)2 и механизм его действия"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РАН

На правах рукописи

Краснов Алексей Николаевич

Мультифункциональный ядерный белок эукариот Е(у)2 и механизм его действия.

Специальность 03.00.03 - "Молекулярная биология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

0034иа юо

Москва - 2009

003489168

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, лаборатории регуляции экспрессии генов

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Георгиева София Георгиевна Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Габибов Александр Габибович

Академик РАН, доктор биологических наук, профессор Жимулев Игорь Федорович Доктор биологических наук, профессор Карпов Вадим Львович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится 28 декабря 2009 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.37.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан н°ября 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета /\

кандидат фармацевтических наук Грабовская Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В последние годы произошел значительный прорыв в молекулярной биологии и медицине. Определены нуклеотидные последовательности геномов многих организмов, картированы гены, определены последовательности белков. В эту постгеномную эру важный вопрос заключается в том, какие механизмы лежат в основе реализации этой первичной генетической информации, как организм регулирует транскрипцию многих генов, какие регуляторные факторы задействованы и как. Большое значение имеет изучение взаимосвязей между различными этапами экспрессии генов и механизмов контроля этих этапов в процессе развития организма.

Исследование инсуляторов и других регуляторных элементов генома важно не только для понимания работы транскрипционной сети клетки, но и имеет большое прикладное значение для медицины, фармакологии и биотехнологии. Инсуляторы играют важную роль при создании ДНК-векторов для продукции биологически активных белков человека, используемых для диагностики и лечения различных заболеваний. Уровень продукции лекарственных белков напрямую зависит от эффективности работы этих регуляторных областей.

Многочисленные исследования показали, что в регуляции экспрессии генов задействовано несколько дискретных, контролируемых процессов: изменение структуры хроматина, изменение локализации гена внутри ядра и привлечение на промотор гена мультибелковых комплексов, активация транскрипции, элонгация и процессннг мРНК, экспорт мРНК из ядра в цитоплазму. В данной работе впервые описан механизм действия белка Е(у)2, связывающий все эти этапы реализации генетической информации.

Цель работы н основные задачи исследования.

Целью данной работы стало изучение белка Е(у)2 и механизмов его участия в регуляции экспрессии генов эукарнот. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Охарактеризовать ген е(у)2 и его белковый продукт с точки зрения эволюционного подхода.

2. Идентифицировать Е(у)2-содержащие белковые комплексы и белки-партнеры, с которыми взаимодействует Е(у)2 в составе этих комплексов.

3. Идентифицировать биологические процессы, в которые вовлечен Е(у)2 и изучить механизм его участия в этих процессах.

Научная повита и практическая значимость работы.

Впервые описаны механизмы действия белка Е(у)2 в регуляции экспрессии генов эукариот. Показано, что белок Е(у)2 связывает несколько этапов реализации генетической информации. Этот белок важен для формирования активной структуры хроматина как на инсуляторах. так и на промоторах активно транскрибирующихся генов, участвует в активации транскрипции и последующем транспорте мРНК из ядра в цитоплазму. Таким образом, Е(у)2 является ключевым компонентом многих процессов, лежащих в основе жизнедеятельности клетки.

Проведен анализ структуры и эволюции гена, кодирующего Е(у)2, у эукариот, показана высокая консервативность гена и белка Е(у)2 в эволюции. Найден ген е(у)2Ь D.melanogaster, кодирующий белок Е(у)2Ь, являющийся паралогом белка Е(у)2. Показано, что в то время как Е(у)2 экспрессируется во всех тканях организма и на всех стадиях развития, Е(у)2Ь является белком, специфическим для мужских зародышевых клеток. Таким образом, выявлен новый тестис-специфический компонент общего транскрипционного аппарата, регулирующего экспрессию генов в половых клетках. Показано, что ген е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Ь. Описан достаточно редкий случай, когда ретрокопия гена функционально заменила исходный ген в эволюции, а не потеряла активность, превратившись в псевдоген.

В данной работе показано, что Е(у)2 является новым, ранее не описанным компонентом SAGA гистонацетилтрансферазного комплекса дрозофилы. Изучена роль SAGA комплекса в активации транскрипции гена теплового шока hsp70. Показано, что именно SAGA, а не общие транскрипционные факторы, формирующие преинициаторный комплекс РНК-полимеразы II (TFI1D, TFIIB и TFIIF), участвует в реинициации транскрипции на промоторе гена hsp70 при тепловом воздействии. Таким образом, SAGA комплекс необходим для активации транскрипции генов ответа на стресс. Показано, что Е(у)2 также является компонентом нового ассоциированного с ядерной порой комплекса АМЕХ, который участвует в организации экспорта мРНК из ядра. Показано, что в составе АМЕХ Е(у)2 взаимодействует с белком Xmas-2. На модели кластера SAGA-зависимых генов теплового шока hsp70 было показано, что Е(у)2 является белком, координирующим транскрипцию hsp70 генов, их ассоциацию с ядерной порой (NPC) и экспорт мРНК hsp70.

Таким образом, впервые в многоклеточном организме был описан белок, осуществляющий физическую связь между транскрипцией генетического локуса, его внутриядерным положением и экспортом его транскриптов.

Показано, что Е(у)2 и Xmas-2 (комплекс АМЕХ) играют роль в тотальном экспорте мРНК из ядра в цитоплазму. В частности, АМЕХ участвует в транспорте мРИК генов домашнего хозяйства trf2 и actin из ядра в цитоплазму.

Изучена функция Е(у)2 в составе SAOA комплекса. Идентифицирован компонент SAOA комплекса Sgfll, с которым непосредственно взаимодействует Е(у)2. Показано, что SAGA комплекс многоклеточных обладает деубиквитиназной активностью гистонов Н2А и Н2В. Идентифицированы три субъединицы SAGA комплекса человека Е(у)2, Sgfl 1 и Nonstop, которые формируют деубиквнтиназный модуль. Показано, что этот модуль способен блокировать репрессию, опосредованную гетерохроматнном и действовать как позитивный кофактор для активации транскрипции ядерными рецепторами. Также впервые было показано, что Е(у)2 является белковым компонентом Su(Hw)-зависимых инсуляторов. Е(у)2 связывается с доменом цинковых пальцев белка Su(Hw) и необходим для барьерной, но не для энхансер-блокирующен, активности Su(Hw)-зависимых инсуляторов. Показано, что SAGA комплекс рекрутируется на Su(Hw)-зависимые инсуляторы и что для этого необходим белок Е(у)2. Предложена модель SuHw-E(y)2-SAGA инсуляторного комплекса, согласно которой, роль Е(у)2 в осуществлении барьерной функции заключается в рекрутировании гистон модифицирующих ферментов GCN5 и Nonstop на инсуляторы, что в свою очередь препятствует распространению гетерохроматина и репрессирующему действию белков группы Polycomb. Аипобация работы. Результаты диссертации были представлены на международных российских и зарубежных конференциях: III Съезд Биохимического Общества~(Санкт-Петербург, 2002), "Molecular Genetics of Eucariotes" (Moscow, 2003), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2003), "Advances in Molecular Cell Biology" (Moscow, 2004), 6th EMBL International PhD Students Symposium "Animal Models" (Rome, Italy, 2005), EMBO Workshop "Mechanisms of nucleocytoplasmic transport" (Sicilia, Italy, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 8th Young Scientist Forum and 33d FEBS Congress (Athens, Greece, 2008), "Хромосома 2009" (Новосибирск 2009). Публикации. По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ, из которых 17 статей в российских и международных журналах и 12 тезисов докладов и материалов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 225 страницах, содержит 38 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 397 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Белок Е(у)2 важный компонент транскрипционной машины эукариот.

1.1. Введение.

Гены энхансеры yellow [е(у)] были изолированы в генетическом скрининге, целью которого был поиск мутаций влияющих на активатор зависимую транскрипцию. Эти гены были названы энхансерами yellow, так как были обнаружены по усилению фенотипа у мутации, которая вызвана инсерцией Мдг4 в ген yellow. Было показано, что ген е(у)1 кодирует белок TAF9, субъединицу TFIID и SAGA комплексов. Мутация гена е(у)2 вызвана внедрением мобильного элемента Stalker и оказывает различное влияние на морфологию мух: короткое тельце, расставленные крылья, глаза с измененными фасетками и низкая фертильность. Эта мутация также влияет на слабые мутации в генах yellow, white, cut и scutes. Таким образом, генетические данные свидетельствуют о том, что е(у)2 влияет на экспрессию различных генов. Было показано, что ген е(у)2 актнвно транскрибируется на всех стадиях развития D. melanogaster и кодирует белок, размером 11 кДа. Е(у)2 дрозофилы способен коактивировать транскрипцию с хроматиновой матрицы и является компонентом большого белкового комплекса, который также содержит TAF9.

1.2. Поиск белков, взаимодействующих с Е(у)2, в дрожжевой двухгибридной системе.

Для идентификации компонентов Е(у)2-содержащих комплексов, был проведен поиск белков, взаимодействующих с Е(у)2, в дрожжевой двугибридной системе. Для этого Е(у)2 был клонирован в одной рамке считывания с ДНК-связывающем белком LexA. кДНК библиотека была клонирована в одной рамке считывания с активационным доменом транскрипционного фактора GAL4. В общей сложности было проскринировано около 2x106 клонов, что в два раза превосходит представительность библиотеки. Клоны отбирали по способности клеток расти на среде без гистидина и зкспрессируюшие Р-галактозидазу. Было отобрано 12 уникальных клонов, кодирующих белки, взаимодействующие с Е(у)2. Была определена нуклеотидная последовательность полученных клонов. Среди обнаруженных белков наибольший интерес представляли белки Xmas-2, Su(Hw), Sgfll. Белок Xmas-2 является гомологом дрожжевого белка Sac3, который участвует в организации экспорта мРНК из ядра в цитоплазму. Белок Su(Hw) является необходимым компонентом инсуляторов дрозофилы. Этот инсулятор блокирует различные энхансеры если расположен между энхансером и промотором. Он также способен нейтрализовать репрессирующий эффект PRE и частично защищать трансген от репрессирующего эффекта, когда тот интегрирован в гетерохроматин. Белок Sgfl 1

является компонентом SAGA комплекса, который принимает участие в формировании активной формы хроматина, что необходимо для активации транскрипции. Таким образом, генетические и биохимические исследования показывают, что белок Е(у)2 является участником многих важных процессов, необходимых для жизнедеятельности клетки.

2. Анализ структуры гена и белка Е(у)2 эукариот.

2.1. Анализ аминокислотной последовательности белка Е(у)2 эукариот: у D.melanogaster существует ген-паралог е(у)2Ь.

С помощью поиска аминокислотной последовательности Е(у)2 D.melanogaster против белковых баз данных было найдено 19 белков с Е-value < 10*4. Белок человека, собаки и мыши имеет идентичную аминокислотную последовательность. Попарное сравнение Е(у)2 с гомологами из организмов Н.sapiens, A.thaliana и S.cerevisiae выявило гомологию 56, 52, и 42 %, соответственно, что указывает на его высокую эволюционную консервативность (Рис. 1).

1___10_____20_,30 40 52

AMmUanu М КН S VN R Р Р Т Р D Е D DÉA D G F Е KDKVTIREIINVKLVE1üE|eJmЕL|RDR L H. sapiens---------------gV V S KM N К Lj AqBbMAI NQ KLJeBGE RE|JkE L LRAMl

S.cerevisiae-------------------MTMDT AQLJJqiBQBLVeBg UYELjS N E L§ARL

Umelanogaler------------------------MSTS GajfD^TVL|G|Ksrip^LCpt!L

53 60 70 80 90 104

A.lhillwim BECGЯКРЕДДасДЕнДККKGRF- riVTVDELIRVMT PKlRASVFDSVKAELL H.sapiens 1eCGWKDüMahc1eMKEKGBe-HVTVDDl1ae1TPk|rALVPDSVKKELL

Л'.cerevisiae JQEGWVDК vIdITÍS eIn---§NESTК FT0|щт1бPkIL E§VS LjStKt|L

D.melanogaler TECGW§DEVBJc|nHmekgtnnS FTVJQLIAEÍTPkJrtLVP!D§VKKELI.

105 110 125

A.thaliana g|RIQNFI;VSAAL---------

H.sapiens §RIRTFLAQH§SL--------

S. cerevisiae К ОI fe E F L E EIТАГ Q-------

D.melanogaler M^IRTILTEIe|ePDEPEDES

Рис. 1. Множественное выравнивание белка Е(у)2 и его гомологов из разных видов.

Интересно, что у £)./яe/a»ogaíto• с помощью поиска в базе данных Р1уВа8е был найден паралог Е(у)2, названный нами Е(у)2Ь. Е(у)2Ь обладает меньшей эволюционной консервативностью, чем Е(у)2. Идентичность последовательностей Е(у)2 и его паралога Е(у)2Ь (С014612-РА) составила 52% (Рис. 2). Аналогичный паралог был выявлен и у близкого вида Л/меиоЫбясига.

1 _20 30 40 55

Е(у)2 -------М|ТЗСАУВаУТ|ъ(бв1Лк|ЬЬС|КЬТЕС6ИЕввьМСЯМ1|МЕ|

Е(у)2Ь МТ1ЫКЕТс|оРПРСУКРт|я|ооНА|к|ььн|кЬУЕССИНК^НЕМ1аы11МЕ1

56 70 80 90 108 Е(у)2 0ТЫЫЗЕТ\Л0ЫАЕЁТРКАНТЬУРИаУККЕИИЯкТ1ЬТЕ1ЕЕЕР0ЕРЕ0ЕЗ Е(у)2Ь GVDN-INR^QLAAQ^VPQARALVPJVVKNEИHHAALDK------------

Рис. 2. Выравнивание белка Е(у)2 и его параиога Е(у)2Ь.

2.2. Анализ экзон-интронной структуры гена е(у)2: ген е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Ь.

Анализ экзон-интронной структуры генов е(у)2 и е(у)2Ь показал, что е(у)2Ъ содержит три экзона, в то время как е(у)2 содержит один экзон (Рис. ЗА). С помощью поиска в базе данных Р1уВа8е, гомологи гена е(у)2, содержащие один и три экзона, были также найдены в геноме 0.р$еис1ооЪзсига. Сравнение е(у)2Ь 0.те1апо§аз1ег с его ортологом у Ь.рзеидооЫсига показал схожую эюои-иитронную структуру. Позиции нитронов в гене е(у)2Ь также эволюционно консервативны. Отсутствие интронов в гене е(у)2 привело к предположению, что е(у)2 является ретрокопией е(у)2Ь.

Для проверки этой гипотезы был проведен анализ последовательностей, окружающих ген е(у)2. Было обнаружено, что ген е(у)2 С,те1апо§а$1ег окружен прямыми повторами длиной 17 п.н. в позиции -12 и +528 п.н. относительно старта транскрипции. Эти повторы являются характерным маркером ретропозиции и были также найдены у Дгмема'оойгато (Рис. ЗБ).

Этот результат совместно с одноэкзопной структурой гена е(у)2 подтверждают, что е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Ь. Как и ожидается для исходного гена и его ретрокопии, последовательности окружающие эти гены полностью различны.

е(у)2 е(у)2Ь

Рис. 3. Ген е(у)2 яляется ретрокопией гена е(у)2Ь.

А - Структура генов е(у)2 и е(у)2Ь D.melanogaster и О.р.чеиЛооЬксига. Экзоны отмечены темными прямоугольниками. Позиции прямых повторов отмечены красными маркерами. Б - Последовательности прямых повторов окружающих е(у)2 D.melanogaster и Д/мггк/ообзсига. Идентичные нуклеотиды отмечены красным.

2.3. Е(у)2 экспрессируется повсеместно, тогда как Е(у)2Ь обладает тканеспецифичной экспрессией.

Ранее было показано, что е(у)2 активно экспрессируется почти во всех клетках дрозофилы. Был исследован профиль экспрессии гена е(у)2 в различных тканях мыши. Нозерн-блот анализ показал, что е(у)2 мышей транскрибируется во всех протестированных тканях (Рис. 4А). Был исследован профиль экспрессии е(у)2Ь дрозофилы, который сравнили с профилем е(у)2. В то время как мРНК е(у)2 присутствует на всех стадиях развития, высокий уровень экспрессии е(у)2Ь был обнаружен в самцах (Рис. 4Б). Дальнейшее исследования показали, что е(у)2Ъ экспрессируется только в тестисах (Рис. 4В, Г).

i5c„äc

s tSSfHsi

е =2

e(y)2/sus1

G3PDH

«о akb

S |

| f 1 E ! I e(y)2h m

Ф)2__

Ras2--

If S в R

с £

• 0.65kjb « 0 55kb

Ф Е *я

hsS

е(у)2/>

. # -0.65kb

о(у)2 * -> * -0 55кЬ

гЯ.ЧА

sSS

Е(у}2 —• -13kD

Eiyjib Ab' * yl Abi - -10kD

Phc. 4. E(y)2b обладает тканеспецифичной экспрессией, в то время как е(у)2 обладает повсеместной экспрессией. (А) Нозерн гибридизация РНК приготовленной из различных тканей мыши с пробой к е(у)2 мыши. G3PDH использовали как контроль. (Б) Нозерн гибридизация РНК поли(А)+ РНК приготовленной из различных стадией развития D.melanogaster с пробами к е(у)2Ь и е(у)2. Ras2 использовали как контроль. (В) Нозерн гибридизация РНК из взрослых самцов, самцов без тестисов (каркасы) и тестисов с пробами к е(у)2Ь и е(у)2. рРНК использовали как контроль. (Г) Вестерн блот гибридизация белковых экстрактов из тестисов, каркасов и эмбрионов с антителами специфичными для Е(у)2 и Е(у)2Ь. Использовали различные анти-Е(у)2Ь антитела: первые антитела (АЫ) получали против короткого пептида, специфичного для Е(у)2Ь, вторые антитела (АЬ2) получали против полного рекомбинантного белка. Антитела против рекомбинантного Е(у)2Ь давали кросс реакцию с Е(у)2. Поэтому для использования этих антител для вестерн блот анализа, проводили истощение антител против рекомбинантного белка Е(у)2. И наоборот, антитела анти-Е(у)2 истощали против рекомбинантного Е(у)2Ь.

2.4. Промоторные регионы е(у)2 и е(у)2Ь генов обеспечивают их экспрессионный паттерн: в то время как е(у)2 обладает повсеместной экспрессией, экспрессия е(у)2Ь ограничена стадией первичных сперматоцитов.

Для того, чтобы понять, где именно экспрессируются гены е(у)2 и е(у)2Ь, были получены конструкции, в которых ген (З-галактозидазы был поставлен под контроль промоторов этих генов. Указанные конструкции использовали для инъекций в эмбрионы D.melanogaster. Показано, что под контролем промотора е(у)2 (З-галоктозидаза экспрессируется на протяжении всего семенника, а также в других органах мухи, тогда как под контролем промотора е(у)2Ъ экспрессия происходит лишь в узкой зоне семенников (Рис. 5). На данной стадии дифференцировки половых клеток происходит переключение митотической программы клеточного цикла на мейотическую. Видимо, Е(у)2Ь участвует в смене этих программ. Таким образом, в то время как экспрессия е(у)2 является повсеместной, е(у)2Ь функционирует только в развивающихся половых клетках самцов.

К rf Ш

, to Mffl

control e(y)2^LacZ e(y)2b_LacZ e(y)2b_LacZ

Рис. 5. Экспрессия e(y)2b ограничена зоной первичных сперматоцитов. Были получены линии трансгенных мух, в которых ген LacZ находится под контролем промотора гена е(у)2 (e(y)2_LacZ) или e(y)2b (e(y)2b_LacZ). Представлена окраска семенников трансгенных и контрольных мух. На правой панели увеличенное изображение. Стрелкой указана область экспрессии LacZ в линии e(y)2b_LacZ.

2.5. Белок Е(у)2Ь не способен функционально заменить Е(у)2.

Представлял интерес вопрос, способен ли белок Е(у)2Ь выполнять функции Е(у)2. Описанная ранее мутация е(у)2" обладает несколькими морфологическими проявлениями. Ранее было показано, что мутация е(у)2"' снижает уровень транскрипции гена yellow в мутантном аллеле у2 в щетинках торакса, а также приводит к стерильности самок, уменьшает выживаемость и оказывает слабое влияние на морфологию мух: укороченное тело, глаза с нерегулярно расположенными фасетками. Кроме того, у 14% самцов имеются нарушения в строении девятого и десятого тергитов.

Таблица 1. Результат экспериментов по комплементации муташш е(у)2'' трансгенами, экспрессирующими белки Е(у)2 или Е(у)2Ь.

Генотип Кол-во Уровень Выживае- Нарушение

исследован пигментации мость, %** строения

-ных линий щетинок* тер гитов, %***

еМГ1 1 2 72 14

е(у)2и1; Р{\и',5и(Нм)_е[у)2} 3 5 93-98 0

еМ2и1; Р{м',5и(Нп)_е(у)2Ь} 5 2 69-74 12-16

е(у)2"'; Р{\ы*,5и(Нм)_е(у)2Ь} х 2 1 2 74 15

'Уровень пигментации оценивали у 3-5-дневных самцов, развивавшихся при 25°С; 0 -пигментация щетинок у мух У до 5 -пигментация у муху*.

"Процент выживших трансгенных самцов по сравнению с самцами линии РМ4. Для каждой трансгенной линии анализировали не меньше 200 самцов.

***Процент самцов, имеющих мутантный фенотнп по сравнению с нормальными трансгсннымн линиями.

Мы проверили, будет ли убиквитарно экспрессирующнйся е(у)2Ь комплементировать мутантный фенотип е(у)2"1. Была создана конструкция, которая содержала кДНК е(у)2Ь под контролем убиквитарного промотора 5и(Ны) (Р/и'+, Зи(Нц')_е(у)2Ь}). Были получены 5 трансгенных линий, несущих трансген в различных участках генома. Конструкция Р{п-+. 5и(Нк)_е(у)2), содержащая кДНК е(у)2 под контролем промотора Зи(Н\\% была использована в качестве контроля. При анализе транскрипции гена е(у)2Ь в тканях трансгенных мух с методом ОТ-ПЦР было показано, что трансген экспрессируется повсеместно. Однако, результаты экспериментов по комплементации мутации е(у)2"' показали, что введение трансгена Р{и'+, 8и(Нк)_е(у)2Ь} (даже двух его копий) в линию мух, несущих мутацию е(у)2"', не приводило к спасению каких-либо фенотипических проявлений мутации (Табл.1). В то же время, инсерцня контрольной конструкции Р{м'+, 8и(Н\\')_е(у)2} восстанавливала все выше перечисленные проявления мутации е(у)2"' (Табл.1). Таким образом, расхождение между белками Е(у)2Ь и Е(у)2 настолько значительно, что белок Е(у)2Ь не может функционально заменять белок Е(у)2.

2.6. Уникальность примера генов е(у)2 и е(у)2Р.

Высокий уровень гомологии белка Е(у)2 согласуется с гипотезой, что он функционально заменил исходный ген, который стал подвергаться менее сильному селекционному давлению. Показано, что ген е(у)2Ь 0.те1апо§аз1ег, является паралогом гена е(у)2. Ген е(у)2 обладает повсеместной экспрессией, в то время как экспрессия е(у)2Ь ограничена

зоной первичных сперматоцитов. Полученные данные позволяют предположить, что ген е(у)2 является ретрокопией интронсодержащего гена е(у)2Ь, которая утеряла оба интрона в результате ретропозишш. Прямые повторы, окружающие ген е(у)2, являются дополнительным аргументом в пользу этой гипотезы.

Повсеместная экспрессия е(у)2 у позвоночных позволяет предположить, что ген е(у)2Ъ дрозофилы ранее обладал повсеместной экспрессией, но утерял ее в процессе эволюции. Большинство известных ретрогенов тестис-специфические, в то время как исходный ген обладает убиквитарной экспрессией. В этой работе описана противоположная ситуация, когда ретрокопия стала более важной, чем исходный ген.

Сравнение аминокислотных последовательностей различных гомологов Е(у)2 показало, что белок Е(у)2 эволюционно более консервативен, чем Е(у)2Ь. Эксперименты показали, что исходный ген эволюционировал столь значительно, что не способен выполнять исходные функции. В результате е(у)2 функционально заменил исходный ген. Таким образом, ретрокопия гена не только не стала неактивной, превратившись в псевдоген, но и функционально заменила исходный ген в эволюции.

3. Белок Е(у)2 входит в состав SAGA гистонацетнлтрансферазного комплекса дрозофилы.

3.1. Изучение взаимодействия Е(у)2 с компонентами SAGA комплекса дрозофилы. Как было показано ранее, Е(у)2 входит в состав большого комплекса, содержащего белок TAF9, субъединицу TF11D и SAGA комплексов. Показано, что Е(у)2 копреципитируется с некоторыми белками TAF, однако экспериментальные данные указывают, что, по-видимому, основной Е(у)2-содержащий комплекс отличен от TFIID. Было решено проверить, является ли Е(у)2 субъединицей SAGA комплекса. Для этого белки из ядерною экстракта эмбрионов дрозофилы были соосаждены специфическими поликлональными антителами против Е(у)2 или GCN5. GCN5 представляет собой каталитическую субъединицу SAGA комплекса. Антитела против Е(у)2 соосадили известные субъединицы SAGA: TRRAP, GCN5, ADA2b и TAF10 (Рис. 6А, дорожка 6), при этом в контрольном соосаждении эти белки отсутствовали (дорожка 7). Антитела против GCN5 также соосадили Е(у)2 наряду с другими известными составляющими SAGA комплекса (дорожка 4). Таким образом, Е(у)2 входит в состав SAGA комплекса D.metanogaster.

см

О _

О ш

а в

V Е(У)2 Р .. наложение -:<а".

/' -\ у •bVVySl л GCN5 '""> ■ Ы »m« Г ^ «*.*№■- У

TRRAP«- — ••

GCN5 — fci

ADA2B — ---— -

TAF10 ----—

Е(у)2 ► '--

12 3 4

Рис. 6. Взаимодействие Е(у)2 с компонентами SAGA комплекса дрозофилы. А - Вестерн-блот анализ результатов соосаждения белков эмбрионального ядерного экстракта дрозофилы антителами против Е(у)2, GCN5 или предиммунной сывороткой (контроль). Указаны фракции: исходная (ТЭ), супернатант (СН) и иммунопреципигат (ИП). Слева указаны антитела, которые использовали для анализа.

Б - иммуноокрашивание политенных хромосом дрозофилы антителами против Е(у)2 и GCN5. Хромосомы показаны целиком и в увеличенном виде. Показано наложение Е(у)2 и GCN5 сигналов.

Для того, чтобы исследовать взаимодействие Е(у)2 и SAGA комплекса in vivo, методом иммунофлуоресцентного окрашивания определили расположение локусов связывания Е(у)2 по отношению к локусам связывания SAGA комплекса на политенных хромосомах дрозофилы. Для иммуноокрашивания использовались специфические антитела против Е(у)2 и Gcn5. В результате было выявлено, что Е(у)2 ассоциирован с большим количеством локусов на политенных хромосомах (Рис. 6Б), многие из которых содержат также Gcn5 (Рис. 6Б, наложение). Это говорит о том, что в клетке Е(у)2 является субъединицей функциональных SAGA комплексов, но, по-видимому, выполняет и другие функции. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Е(у)2 - новый компонент SAGA комплекса дрозофилы.

3.2. Изучение внутриклеточной локализации Е(у)2 и компонентов SAGA комплекса дрозофилы.

Методом иммуноокрашивания была исследована локализация Е(у)2 в клетках дрозофилы линии Schneider (S2). Оказалось, что распределение Е(у)2 внутри ядра имеет вид точечных структур (Рис. 7А и 7Б, панель а) и похоже на распределение GCN5 и ADA2b (Рис. 7 А и 7Б, панели д, и). Но в отличие от них, Е(у)2 также концентрируется вблизи ядерной оболочки.

Для более точной локализации Е(у)2 вблизи ядерной оболочки были проведены эксперименты по совместному иммуноокрашиванию клеток антителами против Е(у)2, ламина и компонентов №С (комплекс ядерной поры). Оказалось, что сигналы Е(у)2 не совпадают с сигналами ламина, однако колокализуются с сигналом ЫРС на периферии ядра (Рис. 7А и 7Б, панели в, г). Далее было исследовано взаимодействие компонентов ЫРС с Е(у)2 в эмбриональном ядерном экстракте. Антитела против Е(у)2 соосадшш компоненты ЫРС комплекса вместе с самим Е(у)2 (Рис. 7В, дорожка 3). Эти результаты говорят о том, что в клетках Е(у)2-содержащие комплексы могут находиться в контакте с ядерной порой.

ламин наложение

Е(У)2 а ■ я я

GCN5 е Щ

ADA2b ЛЬ и v к V а

TAF1 □ : / О ИЗ L

Е(У)2 GCN5 ADA2b TAF1

NPC наложение

а ш Я

т я 1«

и к 0

н О а

ИП

NPC(62Kfla) —

Рис. 7. Внутриядерная локализация Е(у)2.

А - Иммуноокрашивание S2 клеггок дрозофилы антителами против Е(у)2, GCN5, ADA2b и TAF1 вместе с антителами против ламина (ЮООх).

Б - Иммуноокрашивание S2 клеток дрозофилы антителами против Е(у)2, GCN5, ADA2b и TAF1 вместе с антителами против компонентов NPC (ЮООх).

В - Вестерн-блот анализ результатов соосаждения белков эмбрионального ядерного экстракта дрозофилы антителами против Е(у)2, GCN5 или предиммунной сывороткой (контроль). Указаны исходная фракция экстракта (ТЭ) и иммунопреципитат (ИП). Для проявки использовали антитела МаЬ414, узнающие в Вестерн-блот анализе нуклеопорин р62.

Г - Электронные микрофотографии ультратонких крио срезов S2 клеток дрозофилы. Препараты были обработаны антителами против Е(у)2. Связавшиеся антитела визуализировали с помощью протеина А, конъюгированного с золотом. Частицы золота видны в виде черных точек и преимущественно расположены вблизи ядерной мембраны (ям) и часто ассоциированы с

комплексом ядерной поры (NPC), который отмечен белой стрелкой. Ядерная и цитоплазматическая стороны клетки указаны как (я) и (ц), соответственно.

Так как Е(у)2 входит в состав SAGA комплекса, были проведены эксперименты по изучению совместного внутриклеточного распределения типичных субъединиц SAGA комплекса, таких как GCN5 и ADA2b, и компонентов NPC комплекса. Оказалось, что в некоторых областях вблизи ядерной оболочки наблюдается наложение соответствующих сигналов (Рис. 7Б, панели ж,з и л,м). Было замечено, что вблизи ядерной мембраны некоторые точечные структуры, содержащие GCN5, совпадают со структурами, содержащими Е(у)2. Кроме того, антитела против GCN5 соосадили компоненты NPC из ядерного эмбрионального экстракта (Рис. 7В, дорожка 4), хотя и в значительно меньшей степени, чем антитела против Е(у)2. Эти данные свидетельствуют о том, что определенная фракция SAGA комплексов контактирует с NPC.

Внутриядерное расположение Е(у)2 было исследовано при помощи методов электронной микроскопии. Е(у)2-сигнал преимущественно локализуется вблизи внутренней ядерной мембраны (Рис. 7Г), при этом в большинстве случаев Е(у)2 находится в контакте с ядерной порой. В некоторых случаях Е(у)2 сигнал обнаруживается с цитоплазматической стороны ядерной мембраны. Таким образом, результаты показывают, что Е(у)2 связывается с ядерной стороной NPC, а также может перемещаться на цитоплазматическую сторону ядерной поры.

4. SAGA комплекс участвует в транскрипции гена hsp70 до и после теплового шока.

4.1. Основные компоненты TFIID комплекса покидают сайты генов теплового шока после их активации.

Быстро активирующиеся гены теплового шока - удобная модель для изучения процессов регуляции активации транскрипции у дрозофилы. При тепловом воздействии активируются гены теплового шока, что приводит к возникновению пуфов в участках расположения этих генов на политенных хромосомах дрозофилы. В данной работе для анализа использовали локусы 87А и 87В, содержащие несколько копий гена теплового шока hsp70.

Для изучения роли транскрипционных комплексов в активации транскрипции генов теплового шока, была исследована динамика различных компонентов этих комплексов на политенных хромосомах в сайтах 87А и 87В как до, так и после теплового шока. Ранее методом иммуноокрашивания политенных хромосом D.melanogaster было показано, что после теплового воздействия РНК-полимераза II аккумулируется в пуфах активно

транскрибирующихся генов теплового шока. Этот факт был использован как положительный контроль как для оценки степени ответа на тепловое воздействие, так и для точности картирования.

Результаты экспериментов показали, что белки, входящих в состав комплекса TFIID (ТВР, TAF1, TAF2, TAF4, TAF5, TAF8, TAF9 и TAF10) присутствуют в сайтах локализации гена hsp70 до теплового воздействия, что согласуется с опубликованной моделью активации генов теплового шока. Однако было обнаружено, что после теплового воздействия данные белки в пуфах 87А и 87В не детектируются. Аналогичные результаты были получены для комплекса TFIIB и TFIIF. (Рис. 8). Необходимо отметить, что компоненты TFIID присутствуют при тепловом шоке в экдизоновых пуфах, которые образуются в процессе развития личинки под воздействием экдизона, и не содержат генов теплового шока. На определенной стадии развития личинки эти пуфы можно наблюдать одновременно с пуфами, индуцированными тепловым шоком.

NHS HS

87А 87В S7A В7В

NHS HS

87А 87В 87A 87В

■И ЕЯ

ЩИ

цщ i«

гт • t1

228

mm 22UH1 DC

BEB III

ICE к;

Pol II ТВР

Pol II TAF1

Pol II TAF4

Pol II TAF8

Pol II TAF10

Pol II TFIIB

Pol II

TFIIF (RAP30)

Рис. 8. Колокализация ТВР, TAF1, TAF8, TAF9, TAF10, TFIIB и TFIIF и РНК-полимеразы II до и после теплового воздействия. Сигнал детектировали при помощи вторичных флуоресцентных антител. Линиями показаны сайты 87А и 87В до теплового воздействия. NHS - нет теплового шока; HS - 20 мин. теплового шока.

mm ■

2Ы л

ЗШ

OB БЗ

■ si Я ЯИ

Таким образом, можно предположить, что, несмотря на то, что комплексы TFI1D и TF1IB участвуют в инициации транскрипции генов теплового шока, они не принимают участия в процессе реинициации транскрипции этих генов в ответ на тепловой шок.

4.2. Компоненты GCN5 НАТ-содержащего комплекса и комплекса Mediator, а также HSF присутствуют в сайтах теплового шока после их активации.

Возникает вопрос, какие транскрипционные факторы могут участвовать в реинициации транскрипции гена hsp70. С этой целью был проведен анализ на присутствие в локусах 87А и 87В двух основных компонентов GCN5 НАТ-содержащего комплекса SAGA -GCN5 и TRRAP. Оказалось, что оба фактора (GCN5 и TRRAP) присутствуют в сайтах 87А и 87В до и после теплового шока. Такие же данные были получены для субъединицы Mediator - комплекса MED 13 и субъединицы комплекса TFI1H (Рис. 9). Высокий уровень основного фактора транскрипции генов теплового шока HSF был обнаружен в данных локусах после теплового шока, что подтверждает результаты, полученные другими исследователями. Интересно, что некоторое количество HSF было обнаружено в данных локусах и до теплового воздействия. NHS HS 87А 87В 87 А 87В

и ■ вя

н ш

Pol II TRRAP

Pol II MED13

TBP

TFIIH

(XPB)

•i

шя D

ЯШЕ ШЯ

ж ИУД

ШЯ

БЕЯ

Рис. 9. Колокализация РНК-полимеразы И и факторов HSP, GCN5, TRRAP, MED13 и TFIIH до и после теплового воздействия. Проводили двойное иммуноокрашивание политенных хромосом D.melanogasier дикой линии Oregon. NHS - нет теплового шока; HS - 20 мин. теплового шока.

Таким образом, можно предположить, что после теплового воздействия в процессе реинициации транскрипции генов теплового шока принимает участие SAGA-комплекс совместно с медиаторным комплексом и фактором теплового шока. Интересно, что хотя было показано присутствие белков GCN5 и TRRAP в сайтах 87А и 87В после теплового шока, белки TAF, также являющиеся компонентами SAGA-комплекса, в этих районах не были обнаружены. Видимо, при активации гена hsp70 участвует специфический SAGA-комплекс, не содержащий некоторых своих субьедипиц.

4.3. Данные хроматин-иммунопреципитации подтверждают данные иммуноокрашивания политенных хромосом.

Для еще одной независимой оценки участия транскрипционных факторов в активации транскрипции генов теплового шока и определения количественных показателей исследуемых белков до и после теплового шока, был использован метод хроматин-иммунопреципитации (СЫР). Количество ДНК, полученной в хроматин-иммунопреципитации, определяли с помощью ПЦР в режиме реального времени, как на промоторе гена hsp70, так и на кодирующей рамке.

Было показано, что РНК-полимераза И, а также компоненты SAGA комплекса, присутствуют на промоторе гена hsp70 как до, так и после теплового воздействия. Причем, их количество значительно увеличивается после активации гена. Компоненты TFIID комплекса присутствуют на промоторе гена hsp70 до теплового воздействия и не детектируются после активации гена (Рис. 10). Таким образом, результаты, полученные в хроматин-иммунопреципитации, подтверждают данные иммуноокрашивания политенных хромосом.

Promoter Gene

XPB (TF1IH)

Promoter Gene

TBP

Promoter Gene

TFIIB

Promoter Gene

TAF4

nh _____ . _

-------

Рис. 10. В активации гена hsp70 участвует SAGA комплекс, а не TFIID.

А - Результаты хроматин иммунопрецяпитации для компонентов SAGA и TFI1H комплексов, РНК-ншимеразы II (Pol II), HSF и MED13.

В - Результаты хроматин иммунопрецинитации для компонентов TFI1D и TFIIB комплексов. Белыми и черными столбиками показано количество преципитированной ДНК до и после тепловой индукции, соответственно. Указано количество ДНК в процентах от внесенной ДНК.

Таким образом, SAGA комплекс участвует в транскрипции гена hsp70 как до, так и после теплового шока. После активации тепловым шоком количество некоторых общих транскрипционных факторов, ответственных за активацию транскрипции (TFIID, TFIIB и TFI1F) на промоторе гена h$p70 значительно снижается, в то время как количество таких факторов как GCN5, TRRAP, TFIIH и Медиатора - увеличивается. Видимо, комплекс

TFI1D является не существенным для реиницнации транскрипции гена hsp70 при тепловом воздействии и преимущественно SAGA комплекс активирует транскрипцию генов ответа на стресс. Причем, можно предположить, что в активации генов теплового шока участвует специфический SAGA-комплекс, не содержащий некоторых белков TAF. Возникает вопрос, а входит ли белок Е(у)2 в состав этого SAGA комплекса, который собирается на промоторе гена hsp70. С помощью хроматин иммунопреципитации и иммуноокрашивания политенных хромосом было показано, что белок Е(у)2 действительно присутствует на промоторе гена hsp70 как до, так и после теплового шока, причем его количество увеличивается после активации гена (Рис. 11).

NHS

Е(У)2

DAPI

merge

Ii м *

i i-

Е(у)2

Рис. 11. Белок Е(у)2 вовлечен в экспрессию гена hsplO как до, так и после теплового шока. (А) Е(у)2 присутствует в пуфах теплового шока 87А и 87В (указаны стрелками) на политенных хромосомах как до теплового шока (NHS), так и после (HS). (Б) Результат хроматин иммунопреципитации белка Е(у)2. Белыми и черными столбиками показано количество преципитированной ДНК до и после тепловой индукции, соответственно. Указано количество ДНК в процентах от внесенной ДНК.

5. Е(у)2 входит с состав нового ассоциированного с ядерной порой комплекса АМЕХ, который участвует в организации экспорта мРНК.

5.1. Е(у)2 взаимодействует с белком Xmas-2 (X-linked male sterile-2).

В результате поиска белков, взаимодействующих с Е(у)2, в дрожжевой двугибридной системе был найден белок Xmas-2 (X-linked male sterile-2). Взаимодействие E(y)2 и Xmas-2, было измерено с помощью субстрата CPRG (Рис. 12А), что показало достаточно сильную степень взаимодействия между этими двумя белками. Анализ аминокислотной последовательности Xmas-2 показал, что он имеет значительную гомологию с дрожжевым белком Sac3, который участвует в организации экспорта мРНК из ядра. Область гомологии содержит приблизительно 200 аминокислот и соответствует GANP домену белка Sac3. В двугибридной системе с Е(у)2 взаимодействует фрагмент Xmas-2, отличный

от GANP домена, однако этот фрагмент также содержит несколько консервативных участков с Sac3.

Было исследовано взаимодействие Е(у)2 и Xmas-2 в клетках дрозофилы методом иммуноосаждения. Использовали специфические поликлональные антитела против Е(у)2 или Xmas-2. Антитела против Е(у)2 соосадили Xmas-2 (Рис. 12Б, дорожка 4), а антитела против Xmas-2 соосадили Е(у)2 (дорожка 6), в то время как в контрольных соосаждениях белки отсутствовали (дорожки 5 и 7). Важно отметить, что присутствующий в клетках белок Xmas-2 соосаждался антителами против Е(у)2 не полностью. Аналогично, не весь Е(у)2 соосаждался антителами против Xmas-2 (Рис. 12Б, дорожки 2,3 и 4,6). Этот результат указывает на то, что помимо комплекса, в который Е(у)2 и Xmas-2 входят совместно, в клетках Е(у)2 и Xmas-2 находятся в несвязанном состоянии, либо входят как субъединицы в состав других комплексов. Такая картина хорошо согласуется с тем, что Е(у)2 является также и компонентом SAGA комплекса.

рост на среде активность без His (¡-галактозидззы

1ехА-Е(у)2 ♦ GAU-AD-Xmas-2 LexA-GAL4-AD LexA-E(y)2 •> GAL4-AD

СН

ИП

| ¡ | | ¡ g.

п ш X Ш I X I ь о s i 2 s 2

Xmas-г— ' Е(у)г— .

1 2 3 4 5 6 7

г е

65! 5 300t 30

Е(У)2

ламин

NPC

Xmas-2 наложение

/ а б i в V « « 4 |г '

» д е 3

Я к а SI

№РС(62кДа)-

1 2 3

Рис. 12. Взаимодействие Е(у)2 и Хтав-г.

А - Результат взаимодействия Е(у)2, слитого с С-концом ЬехА, и Хта8-2 (аа 755-1370), слитого с ОАЬ4 активационным доменом (АО) в двугибридной системе. Проводился анализ активации генов НЕЗЗ и Ьас2. Экспрессия гена Ьас2 анализировалась методом определения активности (3-галактозидазы по формуле и=ЮООхОО/(1 х 0.5x00), где I - время инкубации в минутах. Б - Вестерн-блот анализ результатов соосаждения белков эмбрионального ядерного экстракта дрозофилы антителами против Е(у)2, Хтаз-2 или предиммунной сывороткой (контроль). Указаны

фракции: исходная (ТЭ), супернатант (СН) и иммунопреципитат (ИП). Слева указаны антитела, которые использовали для анализа.

В - Иммуноокрашивание S2 клеток дрозофилы антителами против Xmas-2 вместе с антителами против ламина и компонентов NPC (ЮООх).

Г - Вестерн-блот анализ соосаждения белков эмбрионального ядерного экстракта дрозофилы антителами против Xmas-2 или предиммунной сывороткой (контроль). Для проявки использовали антитела МаЬ414, узнающие в Вестерн-блот анализе нуклеопорин р62.

В S2 клетках было проанализировано относительное расположение Xmas-2 по отношению к Е(у)2, ядерной ламине и NPC (Рис. 12В). Оказалось, что точечные структуры, в виде которых распределены Е(у)2 и Xmas-2 в ядре, в значительной степени совпадают вблизи ядерной оболочки (Рис. 12В, в и г). Этот результат хорошо согласуется с данными экспериментов по иммуноосаждению (Рис. 12Б) и демонстрирует, что Е(у)2 и Xmas-2 находятся вместе на периферии ядра. Более того, периферические сигналы Xmas-2 совпадают с сигналами NPC, а не ламина. Также было показано взаимодействие между Xmas-2 и компонентами NPC в эмбриональном ядерном экстракте (Рис. 12Г). Затем было исследовано влияние Xmas-2 на внутриклеточное распределение Е(у)2. Падение уровня белка Xmas-2 в результате РНК-интерференции, проведенной в S2 клетках дрозофилы (Рис. 13А), привело к перераспределению Е(у)2 внутри ядра и, главное, количество Е(у)2 вблизи ядерных пор сильно уменьшилось. Полученные результаты говорят о том, что: Е(у)2 и Xmas-2 образуют комплекс; Е(у)2 входит в состав по крайней мере двух различных комплексов, один из которых состоит из Xmas-2 и, возможно, других белков, а второй является SAGA комплексом; Е(у)2 и Xmas-2 ассоциированы с NPC, но не с ламином; распределение Е(у)2 на периферию ядра зависит от Xmas-2.

5.2. Белки Е(у)2 и Xmas-2 необходимы для экспорта мРНК из ядра в цитоплазму. Так как гомолог Xmas-2 у дрожжей участвует в экспорте мРНК из ядра, мы предположили, что белки Е(у)2 и Xmas-2 дрозофилы могут иметь аналогичную функцию. Для того, чтобы изучить влияние Е(у)2 и Xmas-2 на экспорт мРНК из ядра, уровень экспрессии этих белков в S2 клетках был понижен методом РНК-интерференции. Эффективность РНК-интерференции контролировали методами RT-PCR или Вестерн-блот анализа (Рис. 13А). Распределение поли(А)-содержащих РНК визуализировали при помощи олиго(сГГ) пробы, меченой СуЗ. В S2 клетках и в контрольном эксперименте большая часть мРНК обнаруживалась в цитоплазме (Рис. 13Б, верхняя панель). Однако, при подавлении экспрессии либо Е(у)2, либо Xmas-2 поли(А)-содержащие РНК накапливались внутри ядра (Рис. 13Б). Таким образом, полученные результаты

свидетельствуют о том, что Е(у)2 и Хта8-2 необходимы для эффективного экспорта мРНК из ядра.

Е(у)2 — ^ Хггж-г—

pSK РНК-и

Е(У)2 РНК-и

Xmas-РНК-и

Рис. 13. Влияние Е(у)2 и Xmas-2 на экспорт мРНК из ядра.

А - Вестерн-блот анализ уровней экспрессии Е(у)2 и Xmas-2 в нормальных S2 клетках и клетках, подвергшихся РНК-интерференции (5 суток). В качестве контроля нанесения анализировали уровень экспрессии тубулина.

Б - РНК in situ гибридизация S2 клеток дрозофилы, подвергшихся РНК-интерференции, комбинированная с иммуноокрашиванием клеток антителами к ламину. Для РНК-интерференции использовались дцРНК, соответствующие фрагменту вектора pSKII (контроль), кДНК генов е(у)2 и Xmas-2. В качестве зонда к мРНК использовали СуЗ-олиго(сГГ) пробу. Показаны одиночные клетки, отражающие общую картину (ЮООх).

5.3. Белки Е(у)2 и Xmas-2 необходимы для экспорта транскриптов hsp70 генов.

Как было показано выше, SAGA комплекс необходим для активации генов теплового шока hsp?0. Кластер hsp70 генов состоит из шести практически идентичных копий, которые находятся в хромосомных локусах 87А и 87В. Методом иммуноокрашивания политенных хромосом и хроматин иммунопреципитации было показано, что Е(у)2 также присутствует на этих генах. Поэтому кластер hsp70 генов был выбран в качестве модели для изучения функций Е(у)2. Транскрипция генов hsp70 в клетках дрозофилы может быть синхронно активирована воздействием теплового шока, поэтому влияние нокаута Е(у)2 или Xmas-2 на экспорт транскриптов hsp70 генов изучали в нормальных условиях и после

теплового шока. Также было проанализировано влияние Е(у)2 и Xmas-2 на экспорт транскриптов генов actin и Irfi. Методом флуоресцентной РНК in situ гибридизации (RNA FISH) с пробой, гибридизующейся с транскриптами генов hsp70, было показано, что нокаут как Е(у)2, так и Xmas-2 приводит к нарушению экспорта тестируемых транскриптов, так как наблюдалось накопление соответствующих мРНК в ядре (Рис. 14А). Этот эффект имел место как до, так и после теплового шока. Аналогичные результаты были получены при помощи амплификации ядерных РНК методом RT-PCR. Для RT-PCR реакции использовали праймеры, соответствующие транскриптам генов hsp70, actin, trjl. При РНК-интерференции как Е(у)2, так и Xmas-2 наблюдалось увеличение количества hsp70 транскриптов в ядре в 4-10 раз. Похожим образом при нокауте обоих белков происходило увеличение уровня транскриптов генов actin и trf2 в ядре в 2-3 раза (Рис. 14Б). Нужно отметить, что использование метода РНК-интерференции не приводило к изменению длины и качества тестируемых транскриптов, что было проверено при помощи Нозерн-блот анализа (Рис. 15Г). Следовательно, Е(у)2 и Xmas-2 необходимы для эффективного экспорта мРНК транскриптов hsp70 генов из ядра.

pSK РНК-и

Е(У)2 РНК-и

Xmas-2 РНК-и

hsp70

ДО ТШ

DAPI наложение

после ТШ hsp70 DAPI наложение

ДО ТШ

го о.

4 1D

m * 8 X

1 6

I 4 CD У § 2 ш m

> п

т Т в»

н в

после ТШ

Т . PSK

РНК-и

3 Е(У)2 РНК-и

ш Xmas-2 РНК-и

hsp70

актин

trf2

hsp70

Рис. 14. Влияние Е(у)2 и Xmas-2 на экспорт индивидуальных мРНК.

А - Анализ распределения транскрипта гена hsp70 до и после теплового шока (до ТШ, после ТШ) методом РНК in situ гибридизации S2 клеток, подвергшихся контрольной РНК-интерференции (фрагментом вектора pSKII), РНК-интерференции Е(у)2 и Xmas-2. В качестве зонда использовался фрагмент hsp70 гена, меченый СуЗ. Ядра клеток окрашены DAPI. Показаны одиночные клетки, отражающие общую картину (ЮООх).

Б - Количественный анализ уровней транскриптов генов hsp70, actin и trf2 в ядрах контрольных клеток (pSKII) и клеток после РНК-интерференции Е(у)2 или Xmas-2 до теплового шока (до ТШ) и после него (после ТШ). После выделения ядер из них очищалась РНК и уровень каждого транскрипта измерялся методом RT-Q-PCR с использованием соответствующих олигонуклеотидов. В каждом эксперименте уровень транскрипта в контрольном эксперименте принят за единицу (черные столбцы), а его изменения в результате РНК-интерференции Е(у)2 (светло серые столбцы) или Xmas-2 (темно серые столбцы) представлены как кратные по сравнению с контролем. Ошибки представляют собой среднеквадратичное отклонение в трех разных экспериментах.

5.4. Изучение влияния Е(у)2 и Xmas-2 на расположение hsp70 локусов внутри ядра.

Данные о взаимодействии компонентов SAGA комплекса с NPC указывали на то, что Е(у)2 является фактором, осуществляющем связь между экспортной машиной клетки и транскрибирующимися генами. Поэтому было исследовано влияние Е(у)2 и Xmas-2 на позиционирование hsp70 локусов внутри ядра. Внутриядерное расположение hsp70 локусов было определено методом флуоресцентной ДНК m situ гибридизации (DNA FISH) в нормальных условиях и после теплового шока.

Было обнаружено, что, когда клетки находятся в нормальных условиях, hsp70 локусы часто наблюдаются на периферии ядра, при этом, как правило, они собраны в одну территорию (норма до ТШ, hsp70, Рис. 15Аа и 15Б). Для того, чтобы количественно оценить распределение сигнала от кластера hsp70 генов, площадь ядра была разделена на три концентрические зоны равной площади, а расположение сигнала определено ранее описанным методом. Когда под действием теплового шока происходила активация транскрипции hsp70 генов, расположение кластера hsp70 генов оставалось преимущественно периферическим: (норма после ТШ, hsp70, Рис. 15А6 и 15Б); hsp70 локусы по-прежнему были сконцентрированы в одну или две территории. В отличие от hsp70 генов, две геномные копии используемого в качестве контрольного конститутивно экспрессирующегося гена trf2 наблюдались в виде отдельных точечных сигналов и проявляли равномерное распределение независимо от того, подвергались ли клетки тепловому шоку или нет (норма до и после ТШ, trf2, 15Ав, 15Аг и 15Б). Было замечено, что как в нормальных условиях, так и в стрессовых условиях нокаут Е(у)2 или Xmas-2 приводил к нарушению периферического расположения кластера hsp70 генов (Рис. 15Аа, 15А6): его распределение внутри ядра оказывалось практически равномерным (Рис. 15Б). При этом hsp70 локусы покинули свою территорию, в которой они были собраны в исходных клетках, и их стало возможно различить по отдельности друг от друга. В контрольном эксперименте внутриядерное расположение кластера hsp70 генов не изменялось (контроль, Рис. 15Аа, 15А6 и 15Б). Таким образом, нокаут Е(у)2 или Xmas-2 приводит к нарушению связывания кластера hsp70 генов с ядерной оболочкой независимо от того, активирована транскрипция с этих генов или нет.

А до ТШ после ТШ до ТШ после ТШ

норма • % 1 вв вв

■ш вв шм

Е № РНК-и | ■ В f ш

Xmas-2 РНК-и В Б в

контроль В В В в

в.

? 9

ё о - §

11 s а о а>

# s

hsp70

trf2

llll

1.0 1.7 0.6

до ТШ после ТШ

РНК-и pSK

| РНК-и pSK РНК-и ' Е(у)2 РНК-и Xmas-2

trf2

hsp70

до ТШ после ТШ

S S

i* х°-га V

I Ш X •5 (N1 л й я « о — Е г ш X

"Орыа РНК-и РНК-и контроль HOPVa РНК-и РНК-и «омтроль Е|/)2 Xmas-2 Е(у)2 Xmas-2

до ТШ после ТШ

Рис. 15. Влияние Е(у)2 и Xmas-2 на расположение hsp70 локусов вблизи ядерной оболочки и регуляцию их транскрипции.

А — Анализ распределения hsp70 (а, б) и trf2 (в, г) локусов методом ДНК in situ гибридизации в нормальных S2 клетках и клетках после РНК-интерференции контрольным фрагментом (pSKJI), Е(у)2, Xmas-2 до (а, в) и после (б, г) теплового шока. Ядра окрашены DAPI. Шесть копий hsp70 генов, находящихся в разных хромосомных областях (87А и 87В), локализуются вместе (ЮООх). Б - Количественный анализ присутствия hsp70 и trf2 локусов на периферии ядра в нормальных S2 клетках и клетках после РНК-интерференции до и после теплового шока. Для определения положения сигнала относительно ядерной оболочки были проанализированы конфокальные изображения каждой клетки в отдельности. Для этого ядерное пространство было разделено на три концентрические области равной площади. На диаграмме представлен процент сигналов, попавших в область, примыкающую к оболочке ядра до (черные столбцы) и после (серые столбцы) теплового шока. Каждый столбец представляет усреднение значений, полученных в трех различных экспериментах, указано среднеквадратичное отклонение.

В - Количественный анализ уровня hsp70 транскриптов в S2 клетках при РНК-интерференции Е(у)2 (серые столбцы), Xmas-2 (белые столбцы) и контрольной РНК-интерференции (черные столбцы) методом RT-PCR. Уровни hsp7Q транскриптов до теплового шока указаны над соответствующими столбцами (среднеквадратичное отклонение составляет менее 10%). Уровни экспрессии нормализовали по уровню рибосомальной РНК. Уровень экспрессии hsp70 транскриптов в клетках дикого типа был принят за единицу.

Г - Нозерн-блот анализ уровней экспрессии индивидуальных транскриптов (trfl, itsplO, actin) в S2 клетках, подвергшихся РНК-интерференции. Тотальная РНК была выделена из клеток после РНК-интерференции Е(у)2, Xmas-2 и контрольным фрагментом. Для гибридизации использовались пробы, специфические к индивидуальным генам. Нанесено 10 мкг тотальной РНК. В качестве контроля нанесения использовалась 18S рибосомальная РНК.

5.5. Изучение влияния Е(у)2 и Xmas-2 на регуляцию транскрипции hsp70 генов.

Была исследована роль Е(у)2 и Xmas-2 в регуляции транскрипции с промоторов hsp70 генов. Для этого изучалось влияние падения уровня экспрессии Е(у)2 и Xmas-2 (в результате РНК-интерференции) на общее количество hsp70 мРНК методом ПЦР в реальном времени (Рис. 15В). В отсутствие теплового шока детектировался низкий уровень hsp70 транскриптов в S2 клетках. При нокауте Е(у)2 наблюдалось увеличение уровня hsp70 мРНК приблизительно в полтора раза, а при нокауте Xmas-2 этот уровень понизился почти в два раза. Напротив, в условиях теплового шока нокаут Е(у)2 привел к уменьшению общего количества hsp70 мРНК приблизительно в два раза, а уменьшение уровня hsp70 транскриптов при нокауте Xmas-2 было менее значительным. Важно отметить, что методом Нозери-блот анализа наблюдались те же эффекты, что и методом ПЦР в реальном времени, и не происходило какой-либо деградации или качественных изменений в изолированных мРНК (Рис. 15Г). Таким образом, нокаут Е(у)2 или Xmas-2 приводит к нарушению регуляции транскрипции hsp70 генов.

5.6. Е(у)2 необходим для экспорта мРНК гена trf2.

Мутация гена trf2 (trf1) была вызвана внедрением Р-элемента в район 7Е6-8 район X хромосомы дрозофилы. Клонирование фрагмента, содержащего инсерцию Р-элемента в линии ttf', показало, что Р-элемент встроился в 15 т.п.н. выше, ранее описанного гена trf2 (Рис. 16А). Ранее описанная кДНК гена tr/2 gene содержала открытую рамку считывания, соответствующую белку длиной 632 амнокислотных остатков. Чтобы проверить, принадлежит ли место инсерции Р-элемента транскрипту гена fr/2, был проведен ОТ-ПЦР используя мРНК из взрослых мух, используя один праймер из области инсерции Р-элемента, а второй их ОРС гена trf2. Секвенирование ОТ-ПЦР продукта показало, что он содержит как сайт инсерции, так и последовательность ОРС trj2. Для получения полноразмерной кДНК trf2 были сконструированы праймеры, основанные на последовательностях, полученных в результате 3'- и 5'-RACE. В результате был изолирован полноразмерный кДНК клон, длиной 7.2 т.п.н. Выравнивание кДНК клона с геномной последовательностью показало экзон-интронную структуру гена trf2 (Рис. 16А). Ген trf2 содержит 10 интронов, включая два длинных интрона 7.6 и 4.7 т.п.н. в 5' нетранслируемой области гена (Рис. 16А). Инсерция Р-элемента произошла во второй экзон гена. Изолированная кДНК содержит ОРС длиной 1,715 аминокислотных остатка, включая С-концевые 632 аминокислоты TRF2, описанные ранее. Для детекции белка, соответствующего длинной ОРС, в кролике были получены антитела. Вестерн-блот

анализ показал, что антитела детектируют полосу, соответствующую белку расчетной молекулярной массы (Рис. 16Б).

кДа

Рис. 16. Структура гена trf2.

А - экзон-интронная структура гена. Кодирующая область выделена черным цветом. Обозначено место инсерции Р-элемента в мутантной линии trf .

Б - Вестерн блот анализ белкового экстракта из культуры клеток D.melanoguster. Для иммунного окрашивания были использованы антитела к TRF2. Слева указан маркер молекулярного веса.

Как показано выше Е(у)2 в составе SAGA комплекса рекрутирует ген hsp70 на NPC, что необходимо для его эффективной транскрипции и последующего транспорта мРНК из ядра в цитоплазму. Возникает вопрос, как белки Е(у)2 и Xmas-2 влияют на внутриядерное расположение и экспорт мРНК других генов. Для ответа на этот вопрос был изучено влияние этих белков на экспорт мРНК генов actin и trf2 и их внутриядерное расположение.

С помощью метода ДНК in situ гибридизации было изучено распределение гена actin и trf2 внутри ядра в нормальных S2 клетках и клетках после РНК-интерференции контрольным фрагментом (pSKII), Е(у)2, Xmas-2 как до теплового шока, так и после. Оказалось, что при нокауте Е(у)2, Xmas-2 и в контрольном опыте не происходило изменение внутриядерного расположения этих генов по сравнению с клетками дикого типа, как в нормальных условиях, так и после теплового шока (Е(у)2 РНК-и, Xmas-2 РНК-и, контроль, Рис. 15Ав, 15Аг и 15Б). Нарушения в транспорте мРНК этих генов было измерено при помощи амплификации ядерных РНК методом RT-PCR. Для RT-PCR реакции использовали праймеры, соответствующие транскриптам генов actin и trfl. При РНК-интерференции как Е(у)2, так и Xmas-2 наблюдалось увеличение уровня транскриптов этих генов в 2-3 раза (Рис. 14Б). В ходе двугибрмдного скрининга было обнаружено взаимодействие белка Е(у)2 с белком рАЬр, который связывается с поли-А последовательностью мРНК. Таким образом Е(у)2 участвует в двух процессах, связанных с транспортом мРНК. Е(у)2 участвует как в рекрутировании SAGA-зависимых генов на ядерную пору и последующем

экспорте мРНК, так и в экспорте мРНК постоянно транскрибирующихся генов. Первый процесс осуществляется путем взаимодействие SAGA комплекса на промоторе гена hsp70 с комплексом ядерной поры, посредством взаимодействия Е(у)2 и Xmas-2, второй процесс видимо осуществляется путем взаимодействия белка Е(у)2 с мРНК через белок рАЬр либо через другие белки посредники.

6. Е(у)2 входит в состав деубиквитиназного модуля SAGA комплекса, участвующего в формировании активной формы хроматина.

6.1. Белки Е(у)2, Nonstop, Sgfll формируют тройной модуль SAGA комплекса.

В ходе двугибридного скрининга было найдено взаимодействие белка Е(у)2 и белка Sgfl 1, компонента SAGA комплекса. Таким образом, был идентифицирован белок, с которым непосредственно взаимодействует Е(у)2 в составе этого комплекса. У дрожжей гомологи белков Sgfl 1, Nonstop и Е(у)2 входят в состав модуля SAGA комплекса, осуществляющего деубиквитинилирование гистонов (Dub модуль). Каталитической субъединицей этого комплекса является белок Nonstop. Было высказано предположение, что у человека и дрозофилы функции этих белков схожи.

Результаты коиммунопреципитации показали, что белки Sgfl 1, Nonstop и Е(у)2 являются субъединицами SAGA комплекса человека. Показано, что белок Sgfl 1 взаимодействует с белками Е(у)2 и Nonstop. Непосредственного взаимодействия между белками Е(у)2 и Nonstop не обнаружено. Также было показано, что Sgfl 1 необходим для ассоциации белков Е(у)2 и Nonstop с остальным SAGA комплексом. Схематическое изображение Dub модуля приведено на рисунке 17.

Рис. 17. Схема деубиквитиназного комплекса E(y)2-Sgfl 1 -Nonstop в составе SAGA комплекса. Sgfl 1 необходим для ассоциации Dub модуля с остальным SAGA комплексом.

6.2. SAGA комплекс человека способен деубиквитииилировать гисточы Н2В u II2A in vitro.

Было проверено, способен ли SAGA комплекс человека деубиквитииилировать гистоны. Для этого клетки НЕК293Т были одновременно трансфедированы экспрессионными векторами, кодирующими гистон Н2В с FLAG эпитопом (FLAG-H2B) и убиквитин с эпитопом НА (HA-Ub). Клетки растили 48 часов и рекомбинантный гистон Н2В очищали, использую антитела к FLAG-эпитопу. С помощью вестерн-блот анализа было показано, что антитела к НА-эпитопу специфически узнают убиквитинилированную форму гистона Н2В (H2Bubl) (Рис. 18А, дорожки 4 и 5), в то время как антитела к FLAG-эпитопу узнают немодифицированный гистон Н2В и более слабую полосу, соответствующую H2Bubl. Когда конструкции Flag-H2B или HA-Ub отсутствовали в трансфекции, антитела к НА-эпитопу не детектировали сигнал, соответствующий H2Bubl, что дополнительно свидетельствует о специфичности детекции (Рис. 18А, дорожки 2 и 3). Для определения деубиквитиназной активности SAGA комплекса использовали очищенную фракцию Н2В, содержащую как не модифицированный Н2В, так и H2Bubl. К очищенной фракции гистонов добавляли очищенный SAGA комплекс человека. Два независимых эксперимента показали, что добавление SAGA комплекса значительно уменьшает уровень H2Bubl, в то время как уровень немодифицированного гистона Н2В оставался неизменным (Рис. 18Б, сравнение дорожки 2 с дорожками 3 и 4). При увеличении концентрации SAGA комплекса в реакции, уровень H2Bubl дополнительно снижался (Рис. 18Б, дорожки 4 и 5). Аналогичные эксперименты показали, что SAGA комплекс способен деубиквитинилировать гистон Н2А (Рис. 18В).

A Flag-IP

Flag-H2B +

HA-Ub +

anti-HA

anti-Flag

I HA-Ub Flag-H2B

I HA-Ub Flag-H2B »-«Flag-H2B

12 3 4

FI-H2B+HA-Ub + + + +

FI-H2B +

SAGA + —

-« HA-Ub Flag-H2B

anti-HA

anti-Flag ^^

1 2 3 4 5

FI-H2A+HA-Ub + + +

FI-H2A +

SAGA + +

anti-HA —' ^ HA-Ub Flag-H2A

12 3 4 Рис. 18. Деубиквитиназная активность SAGA комплекса человека.

А - Очистка рекомбинантного Н2В и моноубиквитинилированного Н2В (H2Bubl). Клетки НЕК293Т были одновременно трансфецированы экспрессионными векторами, кодирующими гистон Н2В с FLAG эпитолом (FLAG-H2B) и убиквитин с эпитопом НА (HA-Ub). Белки из клеточного экстракта осаждались антителами к FLAG эпитопу и детектировались указанными антителами. Н2ВиЫ специфически детектируется антителами к НА-эпитопу выше легкой цепи IgG (*).

Б - Очищенный SAGA комплекс способен удалять убиквитин с H2Bubl. Для определения деубиквитиназной активности SAGA комплекса использовали очищенную фракцию Н2В, содержащую как не модифицированный Н2В, так и H2Bubl. К очищенной фракции гистонов добавляли очищенный SAGA комплекс человека (дорожки 3, 4 и 5). Рекомбинантные Н2В и H2Bubl анализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием антител к FLAG и НА эпитопам, как указано на рисунке.

В - Очищенный SAGA комплекс способен удалять убиквитин с H2Aubl. Рекомбинантный убиквитинилированный гистон Н2А был очищен так же, как и H2Bubl в (А). Добавление SAGA комплекса уменьшает количество H2Aubl (дорожки 3, 4).

6.3. Деубиквитиназный модуль блокирует репрессию, опосредованную гетерохромат ином.

Для изучения функции Dub модуля in vivo, было исследована роль этого модуля в модификации структуры хроматина у D.melanogasler. Была использована линия Infi)№""' в которой ген while в результате перестройки попал в область гетерохроматина, что привело к мозаичности окраски глаз, в силу частичной инактивации гена. Скрещивание линии In(l)W"4h с исследуемой мутацией позволяет определить, является ли мутация гена модификатором эффекта положения мозаичного типа (PEV), что может указывать на участие белка, кодируемого этим геном, в модификации структуры хроматина. Была проверена мутация (not02069) и делеция (Df[3L]ED225) гена nonstop на модели PEV и показано, что инактивация гена nonstop приводит к двукратному снижению уровня пигментации глаз (Рис. 19). Была также проверена мутация гена sgfl 1 на модели PEV. Оказалось, что sgfll подобно nonstop действует как энхансер PEV, так как его мутация приводит к снижению уровня пигментации глаз. Этот результат указывает, что белки Nonstop и Sgfl 1 участвуют в формировании активной формы хроматина и препятствуют репрессии, опосредованной гетерохроматином.

+/+ nof>m 7+

df(3L) ED225/+

ln(1)Wm4h/+

0.1-1

с о со

§ 0-05 -|

□ +/+ ■ 02069/+ □ ED225/+

ln(1)Wm4h/+

Рис. 19. Белок Nonstop препятствуют репрессии, опосредованной гетерохроматином. Две линии мух несущие мутация гена nonstop (not02069) или делецию области nonstop (Df[3L]ED225) и мухи дикого типа (+/+) скрещивались с линией ¡n(lfm4b. Модификацию PEV в потомстве анализировали визуально по изменению окраски глаз (левая панель) и по измерению OD48o (правая панель).

Было исследовано влияние белков Sgfl 1, Nonstop, Е(у)2 на эффект положения на модели активатор-зависимой транскрипции. Было показано, что все эти белки являются позитивными кофакторами для активации транскрипции ядерными рецепторами. Таким образом, Dub модуль SAGA комплекса, может влиять как на глобальную структуру

хроматина, выступая как модификатор эффекта положения (PEV), так и выполнять ген специфические функции, выступая как коактиватор ядерного рецептора.

7. Е(у)2 является новым компонентом 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов дрозофилы.

7.1. Е(у)2 взаимодействует с доменами цинковых пальцев белка Su(Hw). Как указывалось выше, секвенирование клонов найденных в ходе двугибридного скрининга показало, что один из них содержал кДНК, кодирующую полипептид, соответствующий 363-941 аминокислотам белка Su(Hw). Белок Su(Hw) является необходимым компонентом инсуляторов дрозофилы. Этот инсулятор блокирует различные энхансеры если расположен между энхансером и промотором. Он также способен нейтрализовать репрессирующий эффект PRE и частично защищать трансген от репрессирующего эффекта, когда тот интегрирован в гетерохроматин. То есть инсулятор способен выполнять как энхансер-блокирующую, так и барьерную функцию. В дальнейших экспериментах в двугибридной системе было также показано, что Е(у)2 взаимодействует и с полноразмерным белком Su(Hw). Для локализации фрагмента Su(Hw), необходимого для взаимодействия с Е(у)2, были проверены различные фрагменты в дрожжевой двугибридной системе (Рис. 20А). Результаты экспериментов показали, что за взаимодействие с белком Е(у)2 отвечает район белка Su(Hw), включающий с 7 по 12 «цинковые пальцы» (аминокислоты 435-620). Эти результаты были также подтверждены в системе in vitro. Фрагмент белка Su(Hw) с 435 по 620 аминокислоты был сшит с GST, и рекомбинантный белок был иммобилизован на сефарозе, конъюгированной с глютатионом, на которой затем инкубировали рекомбинантный белок E(y)2-His. Белок Е(у)2 взаимодействовал только с Su(Hw)-GST, но не взаимодействовал с одним GST (Рис. 20Б). Кроме того, Su(Hw)-GST не взаимодействовал с рекомбинантным транскрипционным фактором TAF10-His, который был использован в качестве отрицательного контроля. Следовательно, Е(у)2 взаимодействует с доменом цинковых пальцев Su(Hw).

домом цинковых пальцев

энхансер-блокиругощий домен

кислыи домен

-итшхош-

1 2 3 4 5 6 7 в 9 1011 12

363 Я 781

ШПШПШ «О 3« ПШШШ

40, :. т 7SI

435 : гол ■ ™

497 ■ 781

941

кислым домен

Взаимодействие

941 + +

+ +

х m

GST-Su(Hw) — GST-

1Л

§ i

I й Ь

m и ej

- GST-Su(Hw)

-GST

- His-TAFIO

His-E(y)2 —

Рис. 20. Взаимодействие E(y)2 и Su(Hw).

A - Результат взаимодействия E(y)2, слитого с С-концом LexA, и различных фрагментов Su(Hw), слитых с GAL4 активационным доменом (AD) в двугибридной системе. Схематически представлена структура полноразмерного белка Su(Hw) и использованных полипептидов: домены, номера аминокислотных остатков. Взаимодействие отмечено знаком «+», отсутствие взаимодействия - знаком «-». Все протестированные фрагменты были проверены на отсутствие взаимодействия с LexA.

Б - Анализ результатов связывания рекомбинантных Е(у)2 и Su(Hw) на GST-связывающей матрице. Иммобилизованные на матрице белки GST-Su(Hw) или GST были проинкубированы с белками His-E(y)2 или His-TAFIO (в качестве контроля). Связавшиеся белки были разделены методом SDS-электрофореза в полиакриламидном теле и окрашены красителем Coomassie.

7.2. Изучение взаимодействия Е(у)2 и Su(Hw) in vivo.

С целью проверить взаимодействие белков Su(Hw) и Е(у)2 in vivo, были проведены эксперименты по соосаждению этих белков. Для этого использовали ядерной экстракт, выделенный из эмбрионов дрозофилы. Антитела против Su(Hw) взаимодействовали с Su(Hw) и соосаждали некоторое количество белка Е(у)2, и наоборот, антитела против Е(у)2 соосаждали белок Su(Hw) (Рис. 21А). Однако значительное количество Е(у)2 не осаждалось антителами против Su(Hw). Для того чтобы исследовать, будет ли суперэкспрессия Su(Hw) увеличивать степень ассоциации Е(у)2 с Su(Hw), были проведены эксперименты по соосаждению белков с использованием ядерного экстракта, выделенного из клеток дрозофилы S2, трансформированных экспрессионным вектором, кодирующим белок Su(Hw) и эпитоп FLAG.

Снова только часть белка Е(у)2 соосаждалась антителами против Su(Hw)-FLAG (Рис. 21 Б). Полученные результаты позволяют утверждать, что Su(Hw) и Е(у)2 действительно взаимодействует in vivo. Однако, часть белка Е(у)2 оказывается не связанной с белком Su(Hw), и вероятно, выполняет другие функции.

Эти результаты свидетельствуют о том, что Е(у)2 и Su(Hw) действительно физически взаимодействуют в клетках дрозофилы. Тем не менее, большая часть Е(у)2 не связана с Su(Hw). Полученные данные согласуются с данными о том, что Е(у)2 входит в состав SAGA комплекса и образует комплекс с Xmas-2.

СН ИП

ИП

A si х st х § б о ä é

^ г: 25 ~з I -SS Е

m Ш W Ш W г ГО ¿ ш и

Su(Hw) ШШШ» Su(Hw) FLAG фф mm

E(y)2 'W — Ä .. Ш2

Рис. 21. Взаимодействие E(y)2 и Su(Hw) in vivo.

A - Вестерн-блот анализ результатов соосаждения белков эмбрионального ядерного экстракта дрозофилы антителами против Е(у)2 или предиммунной сывороткой (контроль). Для анализа использовались антитела против Su(Hw) и Е(у)2. Указаны фракции: исходная (ТЭ), не связавшаяся (СН) и иммунопреципитат (ИП).

Б - Вестерн-блот анализ результатов соосаждения белков из лизата S2 клеток, трансформированных конструкцией Su(Hw)-3xFLAG, антителами против Е(у)2 или предиммунной сывороткой (контроль). Для анализа использовались антитела к FLAG эпитопу и антитела против Е(у)2. Указаны фракции: исходная (лизат), не связавшаяся (СН) и иммунопреципитат (ИП).

Чтобы оценить роль взаимодействия между Зи(Нш) и Е(у)2 в регуляции экспрессии генов, были проведены генетические эксперименты с использованием мутаций генов $и(Нк) и е(у)2. Комбинация мутаций ¡и(Нп')~ и е(у)2"1 оказалась легальна на стадии личинки и куколки. Таким образом, результаты, полученные генетическими и биохимическими методами позволяют предположить, что между белками 5и(Нш) и Е(у)2 существует значительное функциональное взаимодействие.

7.3. Е(у)2 рекрутируется на Би(Нп>)-зависимые инсуляторы.

Далее было исследовано возможное участие Е(у)2 в функционировании 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов. Для этого проверили, связывается ли Е(у)2 с последовательностями известных на сегодняшний день 5и(Нш)-зависимых инсуляторов. Сначала были проведены эксперименты по осаждению хроматина, выделенного из Б2 клеток, антителами против Е(у)2 и 5и(Н\у) (хроматин-иммунопреципитация, СЫР). Были протестированы известные 5и(Н«)-связывающис последовательности, являющиеся инсуляторами: МДГ-4, 1А2, 50А, 62Р, 66Е и 87Е, и последовательности, не проявляющие свойств инсуляторов (240). В качестве контрольных использовались 1А1 и 1А6 последовательности, где 8ц(Н\у) отсутствует. Все хромосомные участки, кроме 24Б, обнаруживались после осаждения хроматина антителами против 8и(Н\у) на уровне, сходном с МДГ-4 инсулятором (Рис. 22А). То есть в Б2 клетках имеет место специфическое связывание 5и(Н\у) с протестированными последовательностями. Далее методом СЫР было проанализировано связывание Е(у)2 с теми же участками ДНК (рис. 22Б). Последовательности, с которыми специфично связывается Б^Ни1), были обогащены после осаждения хроматина антителами против Е(у)2, в то время как район 240, где связывание Би(Нш) слабее, осаждался антителами против Е(у)2 в значительно меньшей степени. Незначительное количество ПЦР продукта было получено при использовании праймеров для 1А1 и 1А6 последовательностей. Таким образом, Е(у)2 присутствует на последовательностях 8и(Н\у)-инсуляторов.

gypsy IA-1 1A-2 1A-6 24D 50A 62D 66E 87E

Su(Hw)

1.8 1.6 1.4

1.2

з Q, С

lililiL

gypsy IA-1 1A-2 1A-6 24D 50A 62D 66E 87E

E(y)2

Рис. 22. Связывание E(y)2 с 8и(Н\у)-зависимыми инсуляторами.

А и Б - Результаты хроматин иммунопреципитации (ChIP) последовательностей ДНК, с которыми связываются Su(Hw) (А) и Е(у)2 (Б). Показано среднее значение четырех СЫР экспериментов, результаты представлены в процентах от исходного количества ДНК. ChIP результаты со специфическими антителами против Su(Hw) и Е(у)2 в виде серых столбцов, с неспецифическими антитепами - черных столбцов. Указано стандартное отклонение.

Далее была проведено сравнение локусов связывания Е(у)2 и Su(Hw) на политенных хромосомах. Хорошо изучены два положения МДГ-4 инсулятора: инсерции МДГ-4

ретротранспозона в у2 и .чс" локусы на конце Х-хромосомы дрозофилы. При иммунофлуореецентном окрашивании политенных хромосом мух дикого типа специфическими антителами против 8и(Н\у) в уеИок-а.чскасЧс-зсшс районе Х-хромосомы детектируются несколько полос слабой интенсивности, а при окрашивании препаратов линии в этой области появляются две новые яркие полосы (Рис. 23А). Антитела против Е(у)2 распознавали те же самые две полосы, что показывает, что Е(у)2 связывается с МДГ-4 инсулятором.

Локусы связывания Е(у)2 и 5и(Н\у) на политенных хромосомах частично совпадают (Рис. 23Б и 23В). Однако уровни интенсивности Е(у)2 и 5и(Н\у) сигналов не коррелируют друг с другом, в некоторых случаях Е(у)2 не обнаруживается в локусах связывания Su(Hw) и во многих случаях Е(у)2 детектируется в локусах, где 5и(Нш) не детектируется. Таким образом, результаты указывают на то, что Е(у)2 связывается с некоторой частью Би(Нш)-инсуляторов.

Е(У)2 Su(Hw) merge DAP I

E(y)2 Su(Hw) merge DAP I

Рис. 23. E(y)2 связан с Зи(Нл¥)-зависимыми инсуляторами на политенных хромосомах. А - Иммуноокрашивание конца Х-хромосомы личинок дрозофилы линий Oregon и y~scDI антителами против Е(у)2 и Su(Hw). Показано наложение Е(у)2 и Su(Hw) сигналов. ДНК окрашена DAPI.

Б - Иммуноокрашивание политенных хромосом дрозофилы линии Oregon антителами против Е(у)2 и Su(Hw). В - увеличенное изображение.

7.4. Е(у)2 необходим для барьерной функции Su(Hw)-3aeucuMbix инсуляторов.

Для инсуляторов характерно наличие двух активностей. Энхансер блокирующая активность инсулятора блокирует взаимодействие между энхансером и промоторов, в том случае если инсулятор расположен между энхансером и промотором. В этом случае инсулятор защищает промотор от активации энхансером. Благодаря барьерной активности, инсулятор способен защищать промотор от репрессии со стороны

А - /

' /

/ Oregon т

Е(У)2

Su(Hw)

J, ш ^ л»* Щ

^ % merge w J Jf ¿"V ф , .f* i ^Jt1 ■

гетерохроматина или регуляторных элементов PRE. Таким образом инсуляторы способны формировать области независимой транскрипции, обеспечивая защиту промоторов как от активации, так и от репрессии. Для исследования участия Е(у)2 в функционировании инсуляторов in vivo, была использована yellow регуляторная система как модель. В ряде генетических экспериментов, было показано, что Е(у)2 необходим для барьерной, но не для энхансер-блокирующей, функции инсуляторов. Таким образом, белок Е(у)2 препятствует репрессирующему эффекту гетерохроматина и белков группы Polycomb, то есть препятствует формированию неактивной формы хроматина.

7.5. Е(у)2 необходим для рекрутирования SAGA комплекса на Su(Hw)-3aeucnMbie инсуляторы.

Как было показано выше, Е(у)2 является компонентом SAGA комплекса, который препятствует репрессирующему эффекту гетерохроматина. Поэтому проверили, присутствуют ли SAGA комплекс на последовательностях известных на сегодняшний день Su(Hw)-3aBiicHMbix инсуляторов. Были проведены эксперименты по осаждению хроматина, выделенного из S2 клеток, антителами против белков GCN5 и Ada2b, которые являются компонентами SAGA комплекса. Были протестированы известные Su(Hw)-связывающие последовательности, являющиеся инсуляторами: МДГ-4, 1А2, 50А, 62D, 66Е, 87Е. В качестве контрольных использовались 1А1 и 1А6 последовательности, где Su(Hw) отсутствует. Эксперимент по хроматин иммунолреципитацин показал, что компоненты SAGA комплекса GCN5 и Ada2b действительно присутствуют на Su(Hw)-зависнмых инсуляторах (Рис. 24).

gypsy 1A1 1A2 1A6 50A 62D

Б Ada2b

66E 87E

0.7 0.6 0.5

I 0.4

5? 0.3 0.2 0.1 0

gypsy 1A1 1A2 1A6 50A 62D 66E 87E

GCN5

Рис. 24. Связывание GCN5 и Ada2b с 5и(Н»)-зависимыми инсуляторами.

А и Б - Результаты хроматин иммунопрешшитации (ChIP) последовательностей ДНК, с которыми связываются Ada2b (А) и GCN5 (Б). Серыми столбцами отмечены СЫР результаты со специфическими антителами против Ada2b и GCN5, черными столбцами отмечен отрицательные контроли с использованием неспецифических антител. Указано стандартное отклонение.

Далее было проверено, насколько необходим белок Е(у)2 в рекрутировании SAGA комплекса на 8и(Н\¥)-инсуляторы. Как показано выше, белок Е(у)2 непосредственно взаимодействует с Sgfl 1, через который связан с остальным SAGA комплексом. Поэтому цепочка белковых посредников между ДНК и компонентами SAGA комплекса может выглядеть так: Su(Hw), Е(у)2, Sgfl 1 (Рис. 26). С помощью хроматин иммунопреципптации

проверили, как изменяется рекрутирование GCN5 на 5и(Н\у)-зависимые инсуляторы при нокауте Su(Hw), Е(у)2 или Sgfl 1 по сравнению с нормальными клетками. Результаты представлены на рисунке 25. Из результатов следует, что для рекрутинга GCN5 и как следствие, SAGA комплекса на 8ц(Н\у)-зависимые инсуляторы, необходимы все три белка - Su(Hw), Е(у)2, Sgfl 1. Это дополнительно подтверждает, что этот комплекс действительно связан с инсуляторами через цепочку этих трех белков.

100

MSuHw RNAi ■ Е2 RNAi Ы Sgfll RNAi Ш Контроль

gypsy

1А2

50А

62D

66Е

87Е

Рис. 25. Белки Su(Hw), Е(у)2 и Sgfl 1 необходимы для рекрутирования SAGA комплекса на 8и(Нш)-зависимые инсуляторы. Представлен эксперименты по осаждению хроматина, выделенного из S2 клеток (Контроль), и S2 клеток в которых методом РНК интерференции был уменьшен уровень белков SuHw (SuHw RNAi), Е(у)2 (E(y)2 RNAi) или Sgfll (Sgfll RNAi). Использовали антитела к GCN5, который является каталитической субъединицей SAGA комплекса. За 100% выбрано количество ДНК, которое осаждается антителами к GCN5 в контрольном эксперименте.

7.6. Модель Su(Hw)-iaeucuMozo инсулятора.

Таким образом показано, что белок Е(у)2 связывается с доменом цинковых пальцев белка Su(Hw) и необходим для барьерной, но не для энхансер-блокирующей, активности Su(Hw) зависимых инсуляторов. Е(у)2 необходим для рекрутирования комплекса SAGA на инсуляторы. Su(Hw) содержит область цинковых пальцев для связывания с ДНК-последовательностью инсулятора и два белок связывающих домена. EBD домен белка Su(Hw) связывает белок Mod(mdg4)-67.2 и соответствующий белковый комплекс, который ответственен за энхансер-блокирующую активность инсулятора. Домен цинковых пальцев также связывает Е(у)2 через который рекрутируется белок Sgfl 1 и

SAGA комплекс, с его каталитическими субъединицами GCN5 и Nonstop (Рис. 26). По всей вероятности, этот белковый комплекс осуществляет барьерную функцию инсулятора, посредством ацетилирования и деубиквитинилирования гистонов каталитическими субъединицами SAGA комплекса, что в свою очередь препятствует распространению гетерохроматина и препятствует репрессирующему действию PRE.

SAGA GCN5

Инсулятор

Рис. 26. Модель SuHw-E(y)2-SAGA инсуляторного комплекса.

выводы.

1. Найден ген е(у)2Ь, кодирующий белок Е(у)2Ь, являющийся паралогом белка Е(у)2. В то время как Е(у)2 экспрессируется во всех тканях организма и на всех стадиях развития, Е(у)2Ь является белком, специфическим для мужских зародышевых клеток. Показано, что ген е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Ь. Показано, что ретрокопия гена может функционально заменить исходный ген в эволюции.

2. Белок Е(у)2 входит в состав SAGA транскрипционного комплекса дрозофилы. Часть Е(у)2-содержащих SAGA комплексов находится в контакте с ядерными порами.

3. Изучена роль SAGA комплекса в активации транскрипции гена теплового шока hsp70. Показано, что именно SAGA, а не общие транскрипционные факторы, формирующие преинициаторный комплекс РНК-полимеразы II (TFIID, TFIIB и TFIIF), участвует в реинициации транскрипции на промоторе гена hsp70 при тепловом воздействии. Таким образом, SAGA комплекс необходим для активации транскрипции генов ответа на стресс.

4. Е(у)2 взаимодействует с белком Xmas-2 и вместе с ним входит в состав нового ассоциированного с ядерной порой комплекса АМЕХ, который участвует в организации экспорта мРНК. На модели кластера SAGA-зависимых генов теплового шока hsp70 было показано, что Е(у)2 является белком, координирующим транскрипцию hsp70 генов, их прикрепление к NPC и экспорт мРНК.

5. Показано, что Е(у)2 и Xmas-2 (комплекс АМЕХ) играют роль в тотальном экспорте мРНК из ядра в цитоплазму. В частности, АМЕХ участвует в транспорте мРНК генов домашнего хозяйства trf2 и actín из ядра в цитоплазму.

6. Идентифицирован компонент SAGA комплекса Sgfll, с которым непосредственно взаимодействует Е(у)2 в составе этого комплекса. Показано, что GCN5-coдержащий SAGA комплекс многоклеточных обладает деубиквитиназной активностью гистонов Н2А и Н2В. Идентифицированы три субъединицы SAGA комплекса человека Е(у)2, Sgfl 1 и Nonstop, которые формируют деубиквитиназный модуль. Показано, что этот модуль способен блокировать репрессию, опосредованную гетерохроматином и действовать как позитивный кофактор для активации транскрипции ядерными рецепторами.

7. Показано, что Е(у)2 является белковым компонентом Su(Hw)-3aBnCKMux инсуляторов. Е(у)2 связывается с доменом цинковых пальцев белка Su(Hw) и необходим для барьерной, но не для энхансер-блокирующей, активности 8и(Нш)-зависимых инсуляторов. Показано, что SAGA комплекс рекрутируется на 8и(Н\у)-зависимые инсуляторы и что белок Е(у)2 необходим для этого. Предложена модель SuHw-E(y)2-SAGA инсуляторного комплекса, согласно которой, роль Е(у)2 в осуществлении барьерной функции заключается в рекрутировании гистон модифицирующих ферментов GCN5 и Nonstop на инсуляторы, что в свою очередь препятствует распространению гетерохроматина и репрессирующему действию белков группы Polycomb.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ.

Статьи в международных журналах:

1. Lebedeva L.A., Nabirochkina E.N., Kurshakova М.М., Robert F., Krasnov A.N.. Evgen'ev M.B., Kadonaga J.T., Georgieva S.G., Tora L. Occupancy of the Drosophila hsp70 promoter by a subset of basal transcription factors diminishes upon transcriptional activation. PNAS, 2005, vol. 102, 18087-18092.

2. Krasnov A.N.. Kurshakova M.M., Ramensky V.E., Mardanov P.V., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G. A retrocopy of a gene can functionally displace the source gene in evolution. Nucleic Acids Research, 2005, vol. 33, pp. 6654-6661.

3. Kopytova D.V., Krasnov A.N.. Kopantceva M.R., Nabirochkina E.N., Nikolenko J.V., Maksimenko O.G., Kurshakova M.M., Lebedeva L.A., Yerokhin M.M., Simonova O.B., Korochkin L.I., Tora L., Georgiev P.G., Georgieva S.G. Two isoforms of Drosophila TRF2 are involved in embryonic development, premeiotic chromatin condensation, and proper differentiation of germ cells of both sexes. Molecular and Cellular Biology, 2006, vol. 26, pp. 7492-7505.

4. Kurshakova M. M., Krasnov A. N.. Kopytova D. V., Shidlovskii Y. V., Nikolenko J. V., Nabirochkina E. N., Spehner D., Schultz P., Tora L., and Georgieva S. G. SAGA and a novel Drosophila export complex anchor efficient transcription and mRNA export to NPC. EMBO Journal, 2007, vol. 26, pp. 4956-4965.

5. Kurshakova M.M., Maksimenko O.G., Golovnin A.K., Pulina M.V., Georgieva S.G., Georgiev P.G., Krasnov A.N. Evolutionarilv conserved E(y)2/Susl protein is essential for the

barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila. Molecular Cell, 2007, vol. 27, pp. 332-338.

6. Zhao Y., Lang G., Ito S., Bonnet J, Metzger E., Sawatsubashi S., Suzuki E., Le Guezennec X„ Stunnenberg H.G., Krasnov A.N.. Georgieva S.G., Schule R., Takeyama K., Kato S., Tora L., Devys D. A SAGA/STAGA module mediates histone H2A and H2B deubiquitination, coactivates nuclear receptors, and counteracts heterochromatin silencing. Molecular Cell, 2008, vol. 29, pp. 92-101.

Статьи в российски» журналах:

7. Георгиева С.Г., Набирочкина E.H., Солдатов A.B., Краснов A.II. Обзор ресурсов интернет-сайта "Практическая молекулярная биология". Молекулярная биология, 2001, том 35, номер 6, стр. 1116-1119.

8. Марданов П.В., Краснов АЛ!.. Куршакова М.М., Набирочкнна E.H., Георгиева С.Г. Исследование нового тканеспецифичного фактора транскрипции РНК полимеразы 11. Генетика, 2005, том 41, номер 4, стр. 536-541.

9. Копытова Д.В., Краснов А.Н.. Симонова О.Б., Модестова Е.А., Корочкин Л.И., Георгиева С.Г. Изучение гена lawc-trf2 Drosophila melanogaster и его белкового продукта. ДАН, 2005, том 405, номер 1, стр. 380-382.

10. Куршакова М.М., Набирочкина E.H., Лебедева Л.А., Георгиева С.Г., Евгеньев М.Б., Краснов А.Н. Участие общих транскрипционных факторов в регуляции транскрипции гена hsp70 in vivo. ДАН, 2006, том 411, номер 2. стр. 282-285.

И. Лебедева Л.А., Набирочкина E.H., Евгеньев М.Б., Георгиева С.Г., Краснов А.Н. Исследование участия общих транскрипционных факторов и SAGA- комплекса в активации транскрипции на модели гена hsp70 in vivo. Генетика, 2007, том 43, номер 1, стр. 32-37.

12. Николенко Ю.В., Краснов А.Н. Строение и механизмы действия ядерных рецепторов. Генетика, 2007, том 43, номер 3, стр. 308-316.

13. Копытова Д.В., Краснов А.Н. Семейство белков TRF (ТВР-подобных факторов). Генетика, 2007, том 43, номер 3, стр. 317-322.

14. Копытова Д.В., Николенко Ю.В., Лебедева Л.А., Набирочкина E.H., Шидловский Ю.В., Георгиева С.Г., Краснов А.Н. Изучение гена trf2 Drosophila melanogaster и его белкового продукта. Генетика, 2008, том 44, номер 2, стр. 163-169.

15. Копытова Д.В., Копанцева М.Р., Набирочкина Е.Н., Воробьева Н.Е., Георгиева С.Г., Краснов А.Н. Функция транскрипционного фактора TRF2 Drosophila melanogaster. Генетика, 2008, том 44, номер 3, стр. 309-314.

16. Куршакова М.М., Копытова Д.В., Набирочкина Е.Н., Сошникова Н.В., Георгиева С.Г., Кпаснов А.Н. Консервативный белок E(y)2/Susl взаимодействует с Su(Hw)-3aBiicnMbiMH инсуляторами у Drosophila. Генетика, 2009, том 45, номер 3, стр. 330-335.

17. Куршакова М.М., Копытова Д.В., Набирочкина Е.Н., Николенко Ю.В., Шидловскнй Ю.В., Георгиева С.Г., Краснов А.Н. Консервативный фактор E(y)2/Susl входит в состав SAGA комплекса, а также нового ассоциированного с ядерной порой комплекса у Drosophila. Генетика, 2009, том 45, номер 10, 1332-1340.

Тезисы конференций:

18. Пулина М.В., Марданов П.В., Краснов А.Н. Новый транскрипционный фактор ENHANCER OF YELLOW 2 и его гомолог. III Съезд Биохимического Общества. Санкт-Петербург, 26.06-01.07,2002, стр. 414-415.

19. Георгиева С.Г., Набирочкина Е.Н., Краснов А.Н.. Солдатов А.В., Георгиев П.Г. Новые транскрипционные факторы РНК полимеразы II. III съезд биохимического общества. Санкт-Петербург, 26.06-01.07,2002, стр. 393-394.

20. Kopitova D.V., Krasnov A.N. Studing the expression of Trt2 gene. International Conference "Molecular Genetics of Eucariotes". Moscow, 4-7 February, 2003, p. 17.

21. Kurshakova M.M., Krasnov A.N. Proteins that interact with the enhancer of yellow 2 transcription factor identified by search in yeast two-hybrid system. International Conference "Molecular Genetics of Eucariotes". Moscow, 4-7 February, 2003, p.20.

22. Kopitova D.V., Lebedeva L.A., Simonova O.B., Krasnov A.N. Studing the expression of Trf2 gene. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Kyiv, Ukraine, 25-27 September, 2003, p.83.

23. Mardanov P.V., Shidlovskii Yu.V., Kurshakova M.M., Krasnov A.N.. Nabirochkina E., Georgieva S. The novel transcription activation factor E(y)2. Advances in Molecular Cell Biology, Conference devoted to the 10th anniversary of the center for medical studies. Moscow, June 17-18, 2004, pp. 103-118.

24. Kurshakova M.M., Mardanov P.V., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G., Krasnov A.N. Studing E(y)2, the novel transcription activator that is present in multiprotein complex containing TAF9. 1st International EMBL-Monterotondo (6th EMBL) International PhD Students Symposium "Animal Models". Rome, Italy, May 12-14, 2005, p.40.

25. Kurshakova M.M., Krasnov A.N.. Kopytova D.V., Shidlovskii Yu.V., Nikolenko Ju.V., Nabirochkina E.N., Gcorgieva S.G. Novel export complex is responsible for efficient transcription and the mRNA transport through the nuclear pore. EMBO Workshop "Mechanisms of nucleocytoplasmic transport". Sicilia, Italy, 27-31 October, 2007, p.97

26. Георгиева С.Г., Краснов А.H.. Набирочкина Е.Н. Новые механизмы взаимосвязи различных стадий активации транскрипции и транспорта мРНК. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая, 2008, стр. 92.

27. Копытова Д.В., Куршакова M. М., Краснов А.И.. Николенко Ю.В., Набирочкина Е.Н., Тора Л., Георгиева С.Г. Е(у)2, новый фактор экспорта мРНК Drosophila melanogaster. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая, 2008, стр. 432.

28. Shidlovskii Y, Kurshakova M.M., Krasnov A.N.. Kopytova D.V., Nikolenko Ju.V., Nabirochkina E.N., Spehner D., Schultz P., Laszlo T., Georgieva S.G. Novel export complex is responsible for efficient transcription and mRNA transport through the nuclear pore. 8th Young Scientist Forum and 33d FEBS Congress. Athens, Greece, 26.06-03.07., 2008, p.131.

29. Краснов A.H.. Куршакова M.M., Копытова Д.В., Набирочкина Е.Н., Николенко Ю.В., Шидловский Ю.В., Георгиева С.Г. SAGA и новый экспортный комплекс осуществляют эффективную транскрипцию и экспорт мРНК к NPC. Международная конференция «Хромосома 2009». Новосибирск, 31 августа-06 сентября, 2009, стр. 105.

Заказ № 14б-а/11/09 Подписано в печать 24.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. пл. 2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Краснов, Алексей Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Инициация транскрипции РНК полимеразы II эукариот.

1.1. РНК полимераза II.

1.2. Коровые элементы промотора.

1.3. Базальная транскрипция. Общие факторы транскрипции.

1.4. Семейство TRF (ТВР-подобных факторов).

2. Хроматин.

2.1. Структура хроматина. Модификации гистонов.

2.2. Структурные и биохимические особенности гетерохроматина.

2.3. Гетерохроматин и транскрипция. Эффект положения гена.

2.4. Белковые комплексы, изменяющие структуру хроматина.

3. Gcn5-содержащие комплексы многоклеточных.

3.1. Транскрипция и ацетилирование.

3.2. Структурная организация GCN5 и PCAF белков и их функции.

3.3. ССЫ5-содержащие STAGA/TFTC-подобные комплексы массой 2 МДа.

3.4. GCNS-содержащие АТАС комплексы массой 700 кДа.

3.5. Трехмерная структура SAGA/TFTC-подобных комплексов.

3.6. Функции GCNS-содержащих комплексов.

4. Экспорт мРНК и транскрипция.

4.1. Рецептор и адаптеры экспорта мРНК.

4.2. TREX комплекс.

4.3. Sac3-Thp 1 -Sus 1 -Cdc31 комплекс.

5. Транскрипция на периферии ядра.

5.1. Эпигенетическое состояние генома.

5.2. Транскрипционно неактивный хроматин и ядерная периферия. Репрессия теломер у дрожжей.

5.3. Ядерная ламина и репрессия генов.

5.4. Транскрипционно активные гены на периферии ядра.

5.5. Влияние мРНК на прикрепление генов к ядерным порам.

5.6. SAGA комплекс участвует в организации связывания генов с ядерной порой.

6. Инсуляторы.

6.1. Доменная организация генома.

6.2. Инсуляторы генов теплового шока (scs и scs').

6.3. Su(Hw)-3aBHCHMbift инсулятор.

6.4. Инсуляторы в регуляторной области гена Abd-B.

6.5. Инсуляторы бета-глобиновых генов кур и млекопитающих.

6.6. Инсуляторы локуса HI9Tgf2.

6.7. Барьерная активность бета-глобиновых инсуляторов.

7. Гены теплового шока.

7.1. Гены теплового шока как модельная система.

7.2. Строение промотора.

7.3. Факторы теплового шока.

7.4. Транскрипция гена hsp70.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

2. Работа с дрожжами. Скрининг библиотеки кДНК в двугибридной системе.

3. Работа с клетками.

4. Работа с ДНК.

5. Работа с РНК.

6. Работа с белками.

7. Иммуноокрашивание.

8. Гибридизация in situ.

9. Электронная микроскопия.

10. Анализ изображений.

11. Хроматиниммунопреципитация.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Белок Е(у)2 важный компонент транскрипционной машины эукариот.

1.1. Введение.

1.2. Поиск белков, взаимодействующих с Е(у)2, в дрожжевой двухгибридной системе.

2. Анализ структуры гена и белка Е(у)2 эукариот.

2.1. Анализ аминокислотной последовательности белка Е(у)2 эукариот: у D.melanogaster существует ген-паралог е(у)2Ь.

2.2. Анализ экзон-интронной структуры гена е(у)2: ген е(у)2 является ретрокопией гена е(у)2Ь.

2.3. Е(у)2 экспрессируется повсеместно, тогда как Е(у)2Ь обладает тканеспецифичной экспрессией.

2.5. Белок Е(у)2Ь не способен функционально заменить Е(у)2.

3. Белок Е(у)2 входит в состав SAGA гистонацетилтрансферазного комплекса дрозофилы.

3.1. Изучение взаимодействия Е(у)2 с компонентами SAGA комплекса дрозофилы.

3.2. Изучение внутриклеточной локализации Е(у)2 и компонентов SAGA комплекса дрозофилы.

4. SAGA комплекс участвует в транскрипции гена hsp70 до и после теплового шока.

4.1. Основные компоненты TFIID комплекса покидают сайты генов теплового шока после их активации.

4.3. Данные хроматин-иммунопреципитации подтверждают данные иммуноокрашивания политенных хромосом.

5.1. Е(у)2 взаимодействует с белком Xmas-2 (X-linked male sterile-2).

5.2. Белки E(y)2 и Xmas-2 необходимы для экспорта мРНК из ядра в цитоплазму.

5.3. Белки Е(у)2 и Xmas-2 необходимы для экспорта транскриптов hsp70 генов.

5.4. Изучение влияния Е(у)2 и Xmas-2 на расположение hsp70 локусов внутри ядра.

5.5. Изучение влияния Е(у)2 и Xmas-2 на регуляцию транскрипции hsp70 генов.

5.6. Е(у)2 необходим для экспорта мРНК гена trf2.

6.1. Белки Е(у)2, Nonstop, Sgfll формируют тройной модуль SAGA комплекса.

6.2. SAGA комплекс человека способен деубиквитинилировать гистоны Н2В и Н2А in vitro.

6.3. Деубиквитиназный модуль блокирует репрессию, опосредованную гетерохроматином.

7. Е(у)2 является новым компонентом 8и(Нш)-зависимых инсуляторов дрозофилы.

7.1. Е(у)2 взаимодействует с доменами цинковых пальцев белка Su(Hw).

7.2. Изучение взаимодействия Е(у)2 и Su(Hw) in vivo.

7.3. Е(у)2 рекрутируется на 8и(Н\¥)-зависимые инсуляторы.

7.4. Е(у)2 необходим для барьерной функции 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов.

7.5. Е(у)2 необходим для рекрутирования SAGA комплекса на 8и(Н\у)-зависимые инсуляторы.

7.6. Модель Su(Hw)-3aBHCHMoro инсулятора.

ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Основные результаты.

2. Ген е(у)2 функционально заменил исходный ген е(у)2Ъ в процессе эволюции.

3. Е(у)2 - новый компонент SAGA комплекса дрозофилы.

4. SAGA комплекс участвует в транскрипции гена hsp70 до и после теплового шока.

5. Е(у)2 входит с состав нового комплекса, осуществляющего экспорт мРНК.

6. Е(у)2 в комплексе с Xmas-2 осуществляет прикрепление hsp70 локусов к NPC.

7. Е(у)2 координирует транскрипцию генов, прикрепление к NPC и экспорт мРНК.

8. Биологический смысл прикрепления hsp70 локусов к ядерной поре.

9. Е(у)2 - новый белковый компонент 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов.

10. Возможные механизмы барьерной активности 8и(Н\у)-инсуляторов.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мультифункциональный ядерный белок эукариот Е(у)2 и механизм его действия"

В последние годы произошел значительный прорыв в молекулярной биологии и медицине. Определены нуклеотидные последовательности геномов многих организмов, картированы гены, определены последовательности белков. В эту постгеномную эру важный вопрос заключается в том, какие механизмы лежат в основе реализации этой первичной генетической информации, как организм регулирует транскрипцию многих генов, какие регуляторные факторы задействованы и как. Большое значение имеет изучение взаимосвязей между различными этапами экспрессии генов и механизмов контроля этих этапов в процессе развития организма.

Многочисленные исследования показали, что в регуляции экспрессии генов задействовано несколько дискретных, контролируемых процессов: изменение структуры хроматина, изменение локализации гена внутри ядра и привлечение на промотор гена мультибелковых комплексов, активация транскрипции, элонгация и процессинг мРНК, экспорт мРНК из ядра в цитоплазму. В данной работе впервые описан механизм действия белка Е(у)2, связывающий все эти этапы реализации генетической информации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Краснов, Алексей Николаевич

выводы.

7. Показано, что Е(у)2 является белковым компонентом Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов. Е(у)2 связывается с доменом цинковых пальцев белка Su(Hw) и необходим для барьерной, но не для энхансер-блокирующей, активности 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов. Показано, что SAGA комплекс рекрутируется на 8и(Н\у)-зависимые инсуляторы и что белок Е(у)2 необходим для этого. Предложена модель SuHw-E(y)2-SAGA инсуляторного комплекса, согласно которой, роль Е(у)2 в осуществлении барьерной функции заключается в рекрутировании гистон модифицирующих ферментов GCN5 и Nonstop на инсуляторы, что в свою очередь препятствует распространению гетерохроматина и репрессирующему действию белков группы Polycomb.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Краснов, Алексей Николаевич, Москва

1. Abruzzi, К. С., Belostotsky, D. A., Chekanova, J. A., Dower, К., and Rosbash, М. (2006) З'-end formation signals modulate the association of genes with the nuclear periphery as well as mRNP dot formation, EMBOJ25, 4253-4262.

2. Abruzzi, К. C., Lacadie, S., and Rosbash, M. (2004) Biochemical analysis of TREX complex recruitment to intronless and intron-containing yeast genes, EMBO J 23, 26202631.

3. Adelman, K., Marr, M. Т., Werner, J., Saunders, A., Ni, Z., Andrulis, E. D., and Lis, J. T. (2005) Efficient release from promoter-proximal stall sites requires transcript cleavage factor TFIIS, Mol Cell 17, 103-112.

4. Ahn, S. G., and Thiele, D. J. (2003) Redox regulation of mammalian heat shock factor 1 is essential for Hsp gene activation and protection from stress, Genes Dev 17, 516-528.

5. Akhtar, A., and Gasser, S. M. (2007) The nuclear envelope and transcriptional control, Nat Rev Genet 8, 507-517.

6. Andrulis, E. D., Neiman, A. M., Zappulla, D. C., and Sternglanz, R. (1998) Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing, Nature 394, 592-595.

7. Andrulis, E. D., Zappulla, D. C., Ansari, A., Perrod, S., Laiosa, С. V., Gartenberg, M. R., and Sternglanz, R. (2002) Escl, a nuclear periphery protein required for Sir4-based plasmid anchoring and partitioning, Mol Cell Biol 22, 8292-8301.

8. Aoyagi, N., and Wassarman, D. A. (2000) Genes encoding Drosophila melanogaster RNA polymerase II general transcription factors: diversity in TFIIA and TFIID components contributes to gene-specific transcriptional regulation, J Cell Biol 150, F45-50.

9. Asturias, F. J. (2004) RNA polymerase II structure, and organization of the prcinitiation complex, Сип-Opin Struct Biol 14, 121-129.

10. Avramova, Z., and Tikhonov, A. (1999) Are scs and scs' 'neutral' chromatin domain boundaries of the locus?, Trends Genet 15, 138-139.

11. Becker, P. В., and Horz, W. (2002) ATP-dependent nucleosome remodeling, Annu Rev Biochem 71, 247-273.

12. Bell, A. C., and Felsenfeld, G. (2000) Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene, Nature 405, 482-485.

13. Bell, А. С., West, A. G., and Felsenfeld, G. (1999) The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators, Cell 98, 387-396.

14. Bell, В., and Tora, L. (1999) Regulation of gene expression by multiple forms of TFIID and other novel TAFII-containing complexes, Exp Cell Res 246, 11-19.

15. Bender, M. A., Bulger, M., Close, J., and Groudine, M. (2000) Beta-globin gene switching and DNase I sensitivity of the endogenous beta-globin locus in mice do not require the locus control region, Mol Cell 5, 387-393.

16. Bender, M. A., Reik, A., Close, J., Telling, A., Epner, E., Fiering, S., Hardison, R., and Groudine, M. (1998) Description and targeted deletion of 5' hypersensitive site 5 and 6 of the mouse beta-globin locus control region, Blood 92, 4394-4403.

17. Berger, S. L. (2002) Histone modifications in transcriptional regulation, Curr Opin Genet Dev 12, 142-148.

18. Blackwood, E. M., and Kadonaga, J. T. (1998) Going the distance: a current view of enhancer action, Science 281, 60-63.

19. Blake, M. C., Jambou, R. C., Swick, A. G., Kahn, J. W., and Azizkhan, J. C. (1990) Transcriptional initiation is controlled by upstream GC-box interactions in a TATAA-less promoter, Mol Cell Biol 10, 6632-6641.

20. Blanton, J., Gaszner, M., and Schedl, P. (2003) Protein:protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo, Genes Dev 17, 664-675.

21. Boellmann, F., Guettouche, Т., Guo, Y., Fenna, M., Mnayer, L., and Voellmy, R. (2004) DAXX interacts with heat shock factor 1 during stress activation and enhances its transcriptional activity, Proc Natl Acad Sci US A 101, 4100-4105.

22. Bondarenko, V. A., Liu, Y. V., Jiang, Y. I., and Studitsky, V. M. (2003) Communication over a large distance: enhancers and insulators, Biochem Cell Biol 81, 241-251.

23. Brand, M., Yamamoto, K., Staub, A., and Tora, L. (1999) Identification of TATA-binding protein-free TAFII-containing complex subunits suggests a role in nucleosome acetylation and signal transduction, J Biol Chem 274, 18285-18289.

24. Brasset, E., and Vaury, C. (2005) Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes, Heredity 94, 571-576.

25. Brickner, J. H., and Walter, P. (2004) Gene recruitment of the activated INOl locus to the nuclear membrane, PLoS Biol 2, e342.

26. Brownell, J. E., Zhou, J., Ranalli, Т., Kobayashi, R., Edmondson, D. G., Roth, S. Y., and Allis, C. D. (1996) Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation, Cell 84, 843-851.

27. Buchenau, P., Hodgson, J., Strutt, H., and Arndt-Jovin, D. J. (1998) The distribution of polycomb-group proteins during cell division and development in Drosophila embryos: impact on models for silencing, J Cell Biol 141, 469-481.

28. Bulger, M., and Groudine, M. (1999) Looping versus linking: toward a model for longdistance gene activation, Genes Dev 13, 2465-2477.

29. Burke, T. W., and Kadonaga, J. T. (1997) The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila, Genes Dev 11, 3020-3031.

30. Burke, T. W., and Kadonaga, J. T. (1996) Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters, Genes Dev 10, 711-724.

31. Butler, J. E., and Kadonaga, J. T. (2002) The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression, Genes Dev 16, 2583-2592.

32. Cai, H. N., and Shen, P. (2001) Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity, Science 291, 493-495.39.

Информация о работе

Краснов, Алексей Николаевич
доктора биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Мультифункциональный ядерный белок эукариот Е(у)2 и механизм его действия - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы