Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфология и биологический свойства Actinomyces pyogenes, выделенного из репродуктивных органов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Морфология и биологический свойства Actinomyces pyogenes, выделенного из репродуктивных органов крупного рогатого скота"

' ! Г. !•

ВСЕРОССИЙСКИЙ КАУЧНО-ЖСЗДОМТЕШЬСИЙ ИНСШТУТ ЭКСПЕНМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.КОВАЯЕПКО РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СВЛЬСКаСОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

ТЕНЬКОВА ОЖКГА ВИКТОРОВНА

МОРФОЯОП1Я И ШОЯОШЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АСТШОМУСВЗ РХ00ЕНВЗ , ВЫДЕЛЕННОГО из РЕПРОДУКТИВНЫХ .ОРГАНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03,00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на ооискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики патологии воспроизводства животных, в лаборатории биохимии и молекулярной биологии и в лаборатории физико-химических методов yi биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко

Научные руководители - доктор ветеринарных наук, профеооор

М.А.Лучко - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Б.А.Фомин

Официальные оппоненты:

- доктор ветеринарных наук, профессор А.В.Голиков (ЕИЭВ)

- кандидат биологических наук, отарший научный сотрудник В.П.Радченков (ВИЛ)

Ведущее учреждение - Московская ветеринарцая академия имени К.И.Скрябина (МВА)

Защита ооотоитоя 49" ллли? 1992 г. в У У чаоов на заоедании специализированного совета Д 020.28.01. по защите диооертаций на ооиакание ученой степени доктора наук при Воероо-оийоком научно-иооледователъсном институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, Мооква, Кузьминки, виэв.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан " УУ" Otsc-L-frft-Uf' 1992 г.

; Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Ф.Г.Терешков

;' ОБЩАЯ ХАРАКГЕВЮТЯКА РАБ01Ы

- - Актуальность теш. Интенсивное развитие животноводства возможно при условии получения здорового приплода, сохранения маточного стада и производителей. Однако патология репродуктивных органов рогатого скота, связшшая о болезняза бактериального и вирусного происхождения, наносит ощутимый ущерб животноводству.

На IX Международном симпозиуме по инфекционным заболеваниям репродуктивных органов животных (Италия, 1986) к числу бактерий, вызывающих нарушение функции воспроизводительных органов у коров И овец, отнесены Bruoalla, Canpylobaoter, Hlanydia, Corjnabaotariu» Laptoeplare, bastarla, Salmonella , а также риккетсии и микоплазмы ( Utk«л , 1986).

3 специальной литературе, а также в определителях микробов (Цион, 1948; Красильников, 1949; Bargy'» » 1986) род СагупаЪао-tsr представлен 58 видаи.ш, относящимся к трем группам о различной патогенностью для человека, животных и раотений,- Ряд зару- . бежных исследователей считает, что лишь Corynabaetarlus pyogen»в может быть причиной пренатальных потерь и эндометритов у коров ( Boutar.Hartigan, Millar,Darld , 1986),

Характеристика представителей рода Aotinonjo»» на сегодняшний день остаются недостаточно изученными. Многие виды коринебак-терий, изменяющие свои морфологические свойотва в процеоое poofa и развития остаются неполностью классифицированными.

До настоящего времени мало изучен вид Aotiaomyeae (Оогу -nabaot«riaa)p7og«n%aKaK причи.а нарушения воспроизводительной функции у крупного рогатого скота. Ветеринарные научные учреждения и диагностические лаборатории страны не располагают методами выделения коркяебактерий и способами диагностики патологии, вызываемой ими. Данные по морфологическим, биохимическим и патогенным

свойствам Л.pyogenes , отраженные в научной литературе, противоречивы.

Учитывая вышеизложенное, представляет научный и практически! интерео изучение мор^олопш и биологических свойств A. pyogsnce , а также его роли как этиологического агента при бесплодии и абортах у коров.

Цель работк. Изучить морфологию и биологичеохие свойотва А. pyogenic ( выделенного при патологии репродуктивных органов Kopi к разработать методические указания по диагностике.

Задачи исследования

- Выделить A. pyogenen из абортированных плодов, репродуктивных органов крупного рогатого окота, изучить его морфологию и культурально-биохимичеокие свойотва;

- Уточнить видовую принадлежность выделенных изолятов А, pyogenes по молекулярной характеристике нуклеиновых кислот, в частности ДНК;

- Изучить антигенные свойства выделенных штатов A .pyogenes в реакциях агглютинации (РА), преципитации (Fil), диффузионной преципитации в геле (РДП);

- Определить патогенноогь и токсигенносгь A. pyogenes для лабораторных жиеотеех; '

- В экспериментальных условиях выловить патогенное влияние A. pyogenes на воспроизводительную функцию крупного рогатого скота.

Научная новизна. '.

Изучены морфология в биологические свойотва ( культуральние бмхшвчвокже, серологические, патогенноогь и токсигснесогь) А. pyogenes , выделенного в различных географических зонах отранн при патологии органов воспроизводства крупного рогатого окота,

от павшх норок и вынужденно jöztux зубров.

Определен нуклеотиддай состав и уровень гомология нуклео-тидннх последовательностей ДК выделенных культур, на основании чего показана высокая степень их генетического родства.и принадлежность к виду А. pyogen»» , что подтверждено изучением антлгеп-1ШХ взаимосвязей штаммов а PA, HI, РДИ.

В экспериментальных условиях установлено патогенное влияние А. руозапэв на сЕункцип органов воспроизводства у крупного рогатого скота.

Практическая ценность.

полученные результаты вопли в "Методические указания по выделении И идентификации Aotinoaycae (CorjTWbsotarlUi-a) P70g»n«3 при патологии репродуктивных органов у крупного рогатого скота" для научно-исследовательских учреждений. Утверждены Ученым Советом ШЭЗ (25 декабря 1991 г., протокол 'S 18).

Апробация работа.

[материалы диосертационной работы долояены а обоуядены на конференции молодых ученых и специалистов БИЭВ в I9B9 году, на 1У Всесоюзной конференции во НИ иШЕП в IS9I голу, на заседании Ученого Совета БИЭВ в 1991 году, на производственном совещании сотрудников кафедры эпизоотологии и организации ветеринарного дела Троицкого ветеринарного икотатуга я на иежгабор^торном совещании сотрудников ШЭВ в 1992 году.

Публикации. Ло теме-диссертации опубликовано 4 научннх статьи. .

Ооъем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текога, содержит 18 таблиц, иллгстрирована 17 рисунками. Cdстоит из введения, обзора латера-турц, собствешшх исследований, обсуждения результатов, выводов,

практических предложений и списка литературы, который включает 182 источника, из них 104 зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1,'лте риалы и методы Исследования проведены в период о 1988 по 1991 гг. в лаборатории эпизоотологии,диагностики и профилактики патологии воспроизводства животных, в лаборатории молекулярной биологии и биохимии, в лаборатории физико-химических методов и биотехнологии и Вышне-Золоцком отделе о опытной базой (о. Лисий) Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко.

В опытах использовала 16 телок случного возраста, 40 кроликов и 760 белых мышей.

С целью изоляции А. руо£*п*ш бактериологически последовали 143 пробы патологического материала, полученного от животных иа различных географических зон отраны, из них 53 - от абортированных и мертворожденных плодов крупного рогатого окота, 16 - от павших норок, 36 - от вынужденно убитых зубров и 38 проб влагалищной слизи от коров о острым послеродовым эндометритом.

Изучено 17 штаммов А, руов»пвв : 6 выделены наш из абортированных плодов крупного'рогатого окота в хозяйствах Московской и Сахалинской областей; 3 изолированы от коров о острым послеродовым эндометритом в Воронежской и Тверокой областях; 3 - от павших норок из хозяйства в Сашрокой области; 3 - из репродуктивных органов вынужденно убитых вубров в Ивано-Франковской области и 2 штамма получены из зарубежных лабораторий, в том числе один штамм С-272 из Канада (М.М.Гароиа) и ЮТ из (Ж (А.А.Свдор-чук) - в дальнейшем обозначен как А. руовап«« шташ 18.

Для выделения А. руо£»п»» пз патологического материала использовали мясо-пептонный агар о теллуритом калия (0,0255), для культивирования штаммов - полужидки Г1. (0,15^) мясо-печеночно -пептонный агар (ПНА), плотный (3%) мясо-леченочно-пептонный агар (МЫА), агар Мартена, мясо-пептонный агар (И1А), бульон Хоттингера, Г,!артена, Китт-Тароцци, мясо-пептонный бульон (МПБ). Во все питательные ореды добавляла 10-12? сыворотки крови барана или лопади.

При исследовании абортированных плодов делали высевы из:-оодержимого желудка, двенадцатиперстной кишки, кусочков паренхиматозных органов, легких, мозга и регионарных лимфатических узлов,атак же околоплодных вод и последа.

Лооевы инкубировали в микроаэрофильных условиях при 37°С в течение 24-48 ч в обычном термостате, в эксикаторах или. в вакуумном термостате, заполненном газовой смесью, состоящей из 85$ азота, 10% углекислого таза, 5% кислорода.

Морфологию клеток 24-, 72-, 120-часойых культур А. руог«-пэа, выращенных на жидких и плотных питательных средах, изучали •световой и электронной микроскопией. Культуральные и биохимические овойотва изолятов определяли общепринятыми в бактериологии методами (Баргер, 1981; Нагтву, 1980; Ио1аеи=п , 1974 и др.). Видовую принадлежность культур микроорганизмов уотанавлив&ли по определителя!! бактерий л актиноми^ет (Красильников, 1949; В»г -ет'в, 1986) в сравнении о типовыми штаммами.полученными из Канада и (Ж1А.

Препараты ДНК штаммов выделяли методом деградации клеточных стенок при помови пресса Хьпга с последгщим экстрагированием нуклеиновых кислот по методике Иагнит, 1961. !!уклеотидный состав ДК определяли спектрофотометрячески по тепловой денату-

рации ( Uarmuj Doty , IS62). Гомологию нуклеотидных последова-тельноотей ДНК устанавливали в двух реакциях ДНК-ДНК гибридизации. В качестве реперных использовали штаммы A. pyogenes С-272 Й Staphylococcus аигеия Covan-1 . ДНК реперных штаммов метили радиоактивными изотопами о помощью реакции " ник-трансляции" ( Maniatl* 1982). Степень подобия нуклеотидных последовательностей определяли по проценту связывания 1.:етки в гомологичной и гетерологичной реакциях ДНК-ДНК гийрвдизации.

Антигешше свойства изолятов А. pyogen«» изучали в прямой и перекрестной РА (в пробирках и на стекле), PU и РДЛ в геле. В РА использовали клеточные антигены: двухсуточная культура с концентрацией 10 млрд м.т./мл, прогретая при 100°С на водяной бане в течение I часа и формалинизированная (0,3$ формалина). Раот-воршый антиген (экзотоксин), приготовленный путем фильтрации двухсуточной бульонной культуда и 0 антиген, полученный ультразвуковым разрушением бактериальных клеток, изучали в РА, РП и РДП в геле.

Для получения гипериммунных сывороток кроликов иммунизировали формалинизировакным антигеном (0.356) о концентрацией 10 илрд м.т./мл пятикратно о интервалом 7 дней, подкожно. Животных обескровливали через недела после последней инъекции антигена. Сыворотку крови, полученную по общепринятой методике, консервировали борной киолотйй и хранили в холодильнике при + 4°С. Активность л специфичность пшерамцунных сывороток определяли о гомологичными и гетерологичньаш антигенами в аэрологических реакциях,

Тоноигеннооть штаммов устанавливали по гемолитичеокой, гем-агглютинационной и дерыонекротичеокой активнооти эндотокоина А. wog«»« на кроликах маооой 2,5-3,0 кг, а также путем внутри-брюшинного введения экзотоксина белым мышам.

Эндотоксин представляет собой центрп£утат взвеси бактериальных клеток, разрушенных ультразвуком низкой частоты (22 кГц) и высокой интенсивности (60 Зт/стл2) в течение 30 минут на УЗДН-2.

.¡атогенность выделенных штаммов A. pyogenes определяли путем заражения белых мыаей и половозрелых телок. С этой целью мышам массой 18-20 г пнграперитонеально вводили суточную взвеоь культуры A.pyogenes , полученной на агаре Мартена,в дозах I, 2, 3, 4, 5, 8, 10 млрд м.т./мл.

У половозрелых телок массой 350-370 кг предварительно исключили инфекционную и другую патологию органов воспроизводства путем ректального, бактериологического и серологического методов исследования.

С целью сокращения сроков проведения эксперимента применили стт^гляцию и синхронизацию половой охота и овуляции у телок по схеме, предложенной М.К.Прокофьевым (1989). Препараты эстрофан и сурфагон вводили внутримышечно.

Искусственное осеменение телок провели ректоцервикальным способом о активностью спермы 5-6 баллов.

Для заражения подопытных животных использовали культуру А. pyogenes (пта^м 10), выделенную отаршим научным сотрудником И.П.Иренковым от крупного рогатого скота, которая была предварительно пассирована на половозрелой телке.

Хивотных разделили на 4 группы: I) - 6 телок осеменили двукратно о интервалом 12 часов и через 4 часа после каждого осеменения им ввели культуру A.pyogenes в шейку матки в дозе 5 тиб. м.т. в объеме I мл; 2) - 3 нетелям на 8 месяце стельнооти внутривенно нвеля культуру A. pyogenea в дозе 0,5 нлрд м.т. в объест I ил; 3) - 4 негелям на В месяце стельнооти ввели во влага-лице культуру A. pyogenes в дозе 50 тыо. м.т. в объеме 10 мл; 4) - 3 телок осеменили двукратно о интервалом 12 часов (контроль)

Через 4 часа после каждого ооеменения в шейку катки ввели I ил стерильного физиологического раствора. На 8 месяце стельности животным контрольной группы внутривенно и во влагалище "ввели отерильный физиологический раствор, соответственно, I и 10 мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I. Выделение A.pyogeae« . Морфология, кулмуральные и биохимические свойства.

От разных видов животных из различных географических зон отраны выделено 15 штаммов А. pyogen»« . В большинстве случаев из абортированных плодов коров выделяла чистую культуру А. pyogen* в . При исследовании вагинально-цервик&льной слизи коров наряду о A.pyogene« чаото выделяли сопутствующую банальную микрофлору.

Выделенные штаммы обладали одинаковыми морфологическими овойотвама. В мазках, окрашенных по Ppajjy, обнаруживали грампо-дожительные кокки (0,7 х 0,8 дам) и грамотрицателыше тонкие, чаото'Изогнутые палочка с закругленными концами (1,4 х 0,28 ыкм), расположенные кучками, короткими цепочками, в вида буквы Т, У, китайских иероглифов, частокола. При длительном культивировании (10-15 оуток) на кидаит оредах появлялась нитевидные я спиральные формы.

При электроныо-шкроокодическом исследовании штаммов A.pyogene« установлено,что деление клеток происходит симметрично шш аоишетрично, образованием о ел т. А. pyogenee имеет-З-слой-ную клеточную отенку (0,119 - 0,025 шш), в цитоплазме клеток наблюдали рибосомы, мезооош, нуклеоцд (зернистый, нитевидный, в виде оегрегатов).

Кудьтурально-биохимичеише овойотва иволировашшх штаммов

A. руодома были также сходным. Микроорганизм лучше раотет на ША и ШБ при добавлении 10-12;» сыворотки крови. На жидких питательных средах рост культуры характеризуется появлением на дне пробирки рыхлого ооадка, разбивающегося при встряхивании, я помутнением надосадочной жидкости. IIa твердых питательных средах через 24 часа образуются гладкие, блестящие, с возвытпа-щимоя центром, белые или прозрачные колонии, диаметром 0,1 -2,0 мм. На среде о теллуритом калия колонии приобретают черный цвет. А. P70g*n»e неподвижный микроорганизм, что четко проявляется при посеве его в полужидкий агар и росте строго по. уколу. Спор и капсул не образует. Ферментирует глюкозу и лактозу, разлагает гилпурат натрия, овертывает и пептонизирует о образованием кислоты молоко, гемолизируег эритроциты барана и кролика; не окисляет раффинозу, инозит, дульцит, не образует индол, не разлагает мочевину, не выделяет сероводород, не переводит нитрата в нитраты, каталаэ оо трлцателышй. Гноеродные актин ока- . цета шоокочувотвительны и антибиотикам пёнициллинового ряда: зона заде юти роста составляет 35-40 мм. Описанные выше овой-отва культуры А. pyog»n»e оохраншзт в лиофилизированном состояния в течение 24 кеолцев п при периодическом переоеве на про-тя=2И2Н 30 иесяцев (орок наблюдения).

2. Идентификация изолятов на оонове изучения молекулярных характеристик ДНК.

2.1. Выделение в спектральные характеристика ДНК.

Накопление бактериальной маосы проводили в 0,5 и 2,0 литровых колбах в бульоне Мартена или Хоттннгера о добавлением 10% сыворотка крова барана в вакууггяом терноотате при 37°С. Из 5-оуточной бульонной культуры А. руоекааи после центрифугирования получала 1,8 - 3,7 г бактериальной кассы. Среднее кола-

чеотво ДНК из I г влажной биомассы составило 440 мкг.

Качество препаратов ДНК определяли по показателям гипер-хромного эффекта (ГЭ) и опектральным характеристикам. Дополнительно степень очистки ДНК A. pyogenes ж стафилококка определяли о помощью электрофореза в агарозном геле. Проведенные после дования показали, что ДНК изученных образцов не конташни-рована примесями белков, полисахаридов, РНК. Средняя величина гиперхромного эффекта составила 27,7 + 3,1 %, а молекулярный вес препаратов ДНК значительно превышал 21 тыс. 1\Б.

В результате получены полимерные препараты, о высокой чистотой, пригодные для определения молекулярных характеристик.

2.2, Определение нуклеотидного ооотава ДНК A. pyogtnee Нуклеотидаый ооотав ДНК, определенный методом температурной денатурации, 10 иоолсдованных препаратов предот&влек в таблице I.

Таблица I.

Температура плавления и 1Ц ооотав препаратов ДНК

№№ ! Препарат I Температура плавления ! Мол.£ ГЦ содержания

пп ! !' I-!-

_!_1 _1 1 ! "

I. Aotinomyc«« pyogsnto

С-272 77,65 58,0 0,2

2. I 77,90 ■ 58,6 ■ 0,2

3. 2 77,80 58,3 0,4

4. 3 •77,70 58,1 0,3

5. 8 7Э, 10 59,0 0,6

6. 9 77,75 58,2 0,2

7. 10 77,70 58,1. 0,2

8. 16 77,60 58,3 0,3

9. 18 .78,0 58,8 0,5

Продолжение таблицы I Х+а 77,8 + 0,14 58,4 + 0,3

Ю. згарЬ71оооооиа

аиг»ия Сотап-1 71,2 42,2 0,6

Из данных таблицы видно, что Щ содержание ДНК 9 исследованных штаммов А. руое»п»а находится в пределах 58,0 - 59,0 мол.$ , со средним значением 58,4 + 0,3 мол.#. Вое штаммы представляют собой теоную группировку, резко отличащуюоя от отафи-лококка. ГЦ оодержание 31прЬу1оооосия аигеиз Сотап-1 составило 42,2 + 0,6 мол.Я.

Таким образом, результаты определения нуклеотидного соо-тава ДНК исследуемых штаммов свидетельствует об их принадлежности к виду А. руогвпоя.

2.3. ДНК-ДИК гибридизация. Результаты определения гомологий нуклеотидшх последовательностей приведены в таблице 2

Таблица 2

Степень подобия нуклеотидных последовательностей ДНК.

К» 1 Штамм ! % гомологии НП ДНК (Па)

пп ! I---

• I с А. Р7ок»пза С-272 ! ЗЪарЬ. а-лчпа Сотап-1

I. Ас11пояуовз

ИГОвюэа С-272 100,0+6,7 . 2,1 ± 0,1

2. I 103,0 + 9,8 1,8 ± 0,3

3. 2 92,9 14,0 1,9 + 0,2

4. 3 94,6 + 12,1 2,0 + 0,2

5. - 8 99,9 + 4,4 1.7 ± 0,1

6. о 95,0 + 8,2 2,1 + 0,1

7. 10 96,9 + 5,3 2,2 + 0,1

8. Г 100,2~+ 7,3 1,5 + 0,3

9. 10 113,1 + 16,1 2,0 + 1,0

X + а 99,5 +~5,7 1,9 + 0,2

10. 31арНу1оооооиа о иге ил Сотап-1 2,3 ±0,1 100,0 + 8,9

- 12 -

Анализ результатов дНК-ДНК гибридизации о реаерншш препаратами ДНК штамма С-272 показал полную генетическую гомогенность исследуемой группы микроорганизмов, исключая препарат ДНК згарЬу-'1о со о сия аихеиа Сотап-1 _ Уровень гомологии нукле о ти даых последовательностей ДНК А. руов«п»« соотавил 92,9 - 113,1?. В то хе время штамм 31арЬу1оооосия а иге и* Сотап-1 проявил низкую го-мологичность (2,3?).

Таким образом, реакцией ДНК-ДНК гибридизации подтверждена принадлежность изученных шташов к виду АоИ.пояус«в руодопм Причем изоляты от разных видов животных (крупный рогатый окота зубр, норка) из различных регионов страны представляют ообой плотную генетичеокую группу по степени подобия нуклеогидных последовательностей, о уровнем гомологии ДНК в средней 99,5 ^ 5,7..

3. Серологические овойотва штаммов

ХеНлоцгом руо£яп*а

ГЪпериммунные кроличьи сыворотки, полученные к 13 штаммам А. Р70е*п*а , агглютинировались гомологичными антигенами в РА на стекле о образованием белых хлопьев в течение I минуты. В пробирочной РА антисыворотки реагировали о гомологичными антигенами в разведении 1:3200 - 1:6400, о гетерологичными 1:100 -1:1600. В перекрестной реакции титры антител о термостабильными ( гретыми) антигенами были ниже, чем о форыалиниаированныыа. В первом случае максимальный титр антител наблюдали в разведе-. нии 1:800, а во втором 1:1600.

Результата оценки антигенных свойотв выделенных шташов А. родима в рд дредотавлены 8 таблице-3.

Раотворимые антигены А. руодам»' изучали в реакции кольце» преципитации и в реакции диффузионной преципитации в геле. Активность антигенного комплекса А. рзгодо«« выявляли- о нативны-

Перекрестная FA о гилериштшшыи кроличьими сывороясаш

Л» . • АНТИГЕНЫ

пп СГ

С-272

ф г ф г ф г ■ ф г ф Г фгфг ф г

I' С-272 6400 6400 400 200 200 - 800 200 400 - 400 100 200 200 200 ~

2 1 400 400 3200 ' 3200 400 100 200 100 100 - 100 -. 200 100 -

3 2 200 100 400 - 6400 3200 1600 800 1600 1600 1600 800 1600 800 800 200 '4 3 800 400 200 200 1600 800 3200 3200 1600 800 200 - 1600 800 200 200

5 4' 400 200 100 ' 1600 800 1600 200 6400 6400 200 100 800 800 200

6 5 400 200- 100 - 1600 1600 800 - 400 200 6400 3200 100 - -7. 6 200 100 .200 200 1600 800 800 400 1600 400 100 100 6400 6400 200

8 7 200 200 100 - 800 400 800 800 400 400 400 100 200 - 6400 6400 ,

9 8 800 400 800 800 800 400 800 200 - 400 800 • 400 400 200 -

10 9 200 200 800 200 400 400 400 400 - - - - 400 - 800 400 £1 10 200 200 100 - 200 200 800 ' 400 100 - 200 200 200 200 800 .100

12 14 400 - - - 400 400 100 - 200 200 400 100 100 - 800 800

13 18 400 400 400 100 '.800 . 400 200 - 100 - 40С 400 400 200 400 200

Примечание: СГ - сыворотки гипершацунные

ф - фогашшназарованный антиген г -гретый антиген -- РА в разведении 1:50

и

с

Продолжений таблицы ?

А II Т И Г 3 H Ц

8 9 10 14 18

Ф г Ф г Ф г ф г Ф г

т 0-272 800 400 200 100 800 400 800 200 400 400

2 I 600 400 600 400 200 • 100 100 - 400 200

3 2 400 400 400 400 400 200 800 400 400 200

4 3 800 400 400 200 400 200 200 - 400 400

5 4 400 400 100 - 800 400 200 100 400 400

Г> 5 800 '■ 800 - - 400 200 400 - - -

7 6 800 ' 800 200 200 100 - 200 - 290 200

8 7 800 400 ' 800 200 400 200 1600 800 400 200

9 8 5400 6400 400 200 400 200 800 800 400 200

10 9 "400 400 3200 3200 100 - . 400 100 400 400

II 10 800 400 100 100 . 6400 6400 100 - 800 400

12 14. 400 400 400 100 100 100 3200 3200 400 200

13 18 600 400 400 200 200 100 400 400 6400 6400

?Л о гидврищунными н ролл чьша оывороткаш

:т пп Сыворотга Антиганы С-272 I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 14 18 H.Z.C.

1 О-антаген

I С-272 I/I6 1/2 1/2 1/4 1/8 1/2 1/2 1/4 1/4 .1/8 1/8 1/2 1/4 - .

"2. 5 1/8 1/2 1/2 1/2 1/4 I/I6 1/1 1/4 1/1 1/2 I/I 1/2 I/I -

3 8 1/4. 1/4 V4 1/8 1/4 1/2 1/2 1/4- I/I6 1/2 1/4 1/4 1/4 -

4 10 • V8 ' 1/2 ' 1/2 1/8 1/4 .1/4 1/2 1/4 1/8 1/2 I/I6 1/2 1/2 -

5' 16 1/2 1/2 1/2 1/2 V4 1/2 1/2 1/2 1/8 1/2 1/4 1/2 1/2 _ 1

Энзотоиоаны й

I С-272 1/4 + + + + + + + . + + + ■ + + 1

2 I .3/2 + + + + + + + + + -

3 2 + 1/2 + +■ . + + + + + + + + -

4 3 + + + 1/2 + + + + + + + + -г -

5 4 + + + 1/2 + + + + + + + + -

6 5 . + + • + + 1/4 + + + + + + + -

7 6 .. + + + + + + 1/2 + + + + + -

а 7 + + + + + + + 1/2 + + + -г -

9 8 ■+ + + + + + + 1/4 + + + -

10 9 + + + + + + + + + 1/2 + + + -

л 10 - +- + + + + + + + + + 1/4 + + -

12' 14 + + + + + + + + + + + 1/2 + -

13 18 + + ■ + + + + + + + + + 1/4 -

. ми антисывороткаки.

Данные таблицы 4 свидетельствуют о высокой специфической активности антисывороток по отношению к исследуемым антигенам. В РКП с гомологичным О-ангигеноы антитела обнаруживали в титрах 1:16, гетерологичные антигены вызывали образование преципитата в разведениях от 1:2 до 1:8.

Экзотоксины были менее активными в РКП о антиоыворотхаш. Положительную реакцию преципитации давали неразведенные экзотоксины с нативными гетерологичными антисыворотками. С гомологичными сыворотками преципитины выявляли в титрах 1:2 - 1:4.

Экзотоксин и разрушенный ультразвуком О-антиген в РДП во-следовали о нативными сыворотками. С помощью перекрестной реакции была проведена оценка антигенного родства выделенных штаммов А. руодопав ..Наиболее выраженные линии преципитации отмечали при взаимодействии антвоыворотск о гомологичными антигенами, гетерологичные антигены обладали меньшей активность», образуя олабо выраженные линии преципитации.

Было установлено,что вое изученные штаммы А. руодогм являются серологически родственными, обладают общими термолабильными и те рмоотабильными антигенами о типовыми культу рема. Гиперимцунные оыворотки крови кроликов к А. руов«паа выооко-опецифичны и активны. В целях оерологической идентификации А. ^ руо^апм можно попользовать цельноклеточные и растворимые антигены. • _

4. Тожож-еннооть А. руовапм

В двух опытах изучено действие экзотоксина при внутрибрю-шшшом введении белым мылах. В первом ориентировочном опыте установлено, что надооадочная жидкость 3-, 5-,- 7-суточных бульонных культур вызывает гибель белых шшей через 24-48 чаооа по-

)Л9 введенля. В основном опыте изучала действие экзотоксина 5-[ 30-оуточных бульонных культур. Из II штаммов A. pyogenes только 4 (С-272, 5, 8, 10) вызывали гибель белых шшей при вну-грибрюшинноы введении надосадочной жидкости в дозах 0,4; 0,5; ),8; 1,0; 1,2 ил. При вскрытии у павших мышей наблюдали крове-шлолнение селезенки и почек, печень была глинистого цвета, хряблая, увеличена в размере, сосуда кишечника и брыжейки кро-зенаполнены.

Исследования показали, что испытанные штам.щ A.pyogenes обладали различной отепенью токсигенности для белых шшей. 100% табель шшей вызвали штаммы 8 и 10, а экзотоксин штатов С-272 i 5 вызвал гибель 40$ животных.

Извеотно, что показателями токсигенности микроорганизма иогут служить геыолитичеокие, гекагглютинирующие и дермонекро-гические овойотва ( Биргер М.О. и др., 1982). Изученные эндо-гокоины A. pyogenee С-272, 5, 8, 10 проявили указанные свой-втва в различной отепени. Так реакцию гемагглютинации у всех птаммов наблюдали в более высоких разведениях, в отличии от реакции гемолиза я дерыонекроза. Эндотоксин 4 наследованных штампов A. pyogenee ' проявил гемолитическую и дермонек рогаче скую активнооть в разведения 1:4 - 1:8 и гемагглютинирующую 1:8 -1116, что свидетельствует о родстве эндотоксинов иоследованных птаммов A. pyogenee,

5. Патогеннооть A. pyogenee а) Свыт по заражению белых шшей. -Степень патогенноотя IQ штаммов A.pyogenee , выделенных от крупного рогатого охота, зубров а норок для белых мышей била различной: отешв »2, 3, 7 (кокковидяая фоща) и 8,10 (палочковидная форма) внаыааля гибель дошей на третья оуткя посла

введешш, соответственно, 3 и I млрд м.т./мл. Ыташ I в дозе 3 млрд м.т./гл вызывал гибель двух шшей из трех зараженных на четвертые сутки после введения культуры, а штамм 6 в дозе 4 млрд м.г./мл. Менее вирулентными были штаммы 4 и 5, летальная доза которых соотавила 10 л 8 шрд м.т./мл.

Лрл высеве проб из внутренних органов на 1.ПА и ШБ о 1055 сыворотки крови барана через 24-48 часов культивирования наблю дали характерный для A. pyogenes рост. В мазках были грамвари-абельные кокковидные и палочковидные клетки, расположенные куч-калл, в виде буквы Т, У, китайских иероглифов.

Показано, что A.pyogenes вызывает гибель белых мышей при внутрпбрлгшнном введении. В опыте установлена патогеннооть десяти штаммов A. pyogenes . Наибольшей вирулентностью обладали штаммы, выделенные от коров с острым послеродовым эндометритом и от павших норок. Не отмочено овязл мевду формой микробной клетки и вирулентностью культуры.

б) Опыт по зар&г.енли крупного рогатого скота. У трех животных первой группы через 12-24 часа после введения культуры A. pyogenes в шейку матки наблэдали обильные гнойные истечения из половых органов. Нетели стояли широко рао-ставив задние конечности, хвост был приподнят и испачкал гнойными .выделениями. Слизистая влагалища гиперемирована, на её стенках и в нижней части отмечали скопление слизи белого цвета, У трех других толок указашше клинические признаки были выражены в кеньпеП степени. Общее состояние животных было удовлетворительное, аллетит сохранен, температура.тела 37,6 - 39,2°С. Через З-о суток гнойные истечения из вагины прекратились. У ш-лот;шх других групп выпеуказаннкх клинических признаков ко отмечено.

- 19 -

При бактериологическом исследовании гнойных истечений у ивотных первой группы выделяли А.рус^«пва в ассоциации с ;ишечной палочкой, стрептококка!,и и стафилококками. Оыцешшс [золяты А. руог«п«а по культуралышм, биохимическим н сероло-'ическим свойствам соответствовали исходно;'! культуре.

В последующее время две нетели из первой группы абортиро-¡али на 5 и 7 месяцах стельности; одна нетель отелилась в срок; ?ри телки на протяжении 5-6 месяцев (срок наблюденгя) регулярно гриходили в половую охоту и подвергались искусственному ооемене-иц но оплодотворение у них так и не наступило.

При бактериологическом исследовании абортированных плодов зыделили А. руоввпоа в чистой культуре, в большинстве случаев 13 паренхиматозных органов. При патолого-анатомическом исследовании отмечали гнойный плацентит, аутачиз плодовых тканей, а 1ри покрытии абортированных плодов - фибринозный перикардит, иеврит и перитонит.

При внутривенном и влагалищном способах заражения А. руо-5»п»я у нетелей (П и Ш групп) наблюдали после отела оотрый гнойно-катаральный эндометрит. У животных отмечали повышение температуры тела до 40,5°С, Из наружных половых органов выделялся гадкий слизиото-гнойный экооудат. При исследовании на третий день пболе отела о вагинальным зеркалом отмечено, что шейка . иатки открыта. При ректальном исследовании установлено отоутот-вие сокращения рогов матка и флюктуация при пальпации. Из нер-викальной и влагалищной слизи у животных П и Ш групп на 3 день пооле отела выделили А. руое*пвв в трех случаях в здотой культура и в II в аоооцаацаа о банальной микрофлорой. -

У нетелей контрольной группы во время беременности и после благополучно завершикгахоя родоа клинических признаков зндомвт-

paта не наблюдали. При бактериологическом исследовании церви-калышй и влагалпзшой слизи на третий день после отела А.pyog» nee не выделили.

Таким образом, введение А. pyogen»а в шейку матки при искусственном осеменении вызывает аборты на 5-7 месяцах стельности. Заражение нетелей A. pyogenes в яремную вену или во влагалище на 8 месяце стельности сопровождается острым послеродовым эндометритом.

В II В О Д Ы

1. A.pyogenes выделяется из абортированных плодов коров в палочковидно" и кокковвдной формах, имеющих идентичные культу ралыше, биохимические и серологические свойства и генооио-тематические признаки, что необходимо учитывать при диагностике патологии репродуктивных органов у крупного рогатого скота. Для культивирования микроорганизма необходимо пониженное содержание кислорода и обогащение питательной ореды нормальной сывороткой крови.

2. Характерными вндовкш особенностями штаммов А. pyogen« при шрацпвашм на питательных средах являются: полиморфизм, грамварлабелыюсть, размер клеток 0,7 х 0,8 мкм (кокковидные) и 1,4 х 0,28 1ЛШ (палочковидные), симметричное и аоиыметричное деление.

3. Шделенше от крупного рогатого скота, зубров, норок культуры Л.pyoganea , из различных географических зон страны идентичны типовым ита'я-ам (С-272 и 18) и однородны по биологическим свойствам. Культурально-биохимические свойства сохраМя-птоя у л;:ос:•з 1:роеап:згх и периодически пересеваемых культур Л. pyogenes в течеш:е 24 и 30 месяцев (срок наблюдения). Культуры д. pyogenea высокочувствительны к антибиотикам пеняцилти-

«ового ряда (зона задержки роста 35-40 ш).

4. Нуклеотидный соотав ДНК штаммов А. pyogen«« , ииделешшх зз абортированных плодов и половых органов разных видов яивот-янх, совпадает о нуклеотидным составом типовых штаммов (С-272 и 18) и характеризуется содержанием гуанин + цитозин в среднем 58,3 +'0,3 ыол.$. Степень гомологии нуклеотидных последовательностей у выделенных шташов 99,5 + 5,7

5. Установлено,что большинство выделенных штаммов А. руо-вамяимеет близкое антигенное родство, что подтверждено в РА, ?Л,РДП. Титры антител о гомологичными антигенами составляют,соответственно, 1:3200 -'1:6400; 1:16; 1:32 - 1:64, с гетерологич-¡шми 1:50 - 1:1600; 1:2 - 1:8; 1:2 - 1:4.

6. Экзотоксин выделенных штаммов А. pyog»na« вызывает гл-5ель белых мышей при внутрибршинном введении. Эндотоксин ита;.:-.10B А. pyogaran обладает гемолитической и дермояекротической активностью в разведении 1:4 - 1:8 и гедагглютинирутоцей 1:8 - I:u>.

7. В эксперименте установлено патогенное влияние A. pyoga-ыа на репродуктивную функцию крупного рогатого скота. Введение Lpyoganaa в шейку ь&тки при искусственном, осеменении вызыва-jt длительные перегулы или аборты на 5-7 меояцах отельнооти. внутривенное введение А. pyoganaa на 8 месяце отельнооти или во злагалйще вызывает острый послеродовый гнойно-катаральный эндометрит.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРДДЙСШШЕ

Г1о результатам проведенных исследований разработаны "!.!ето-дачесние указания по выделению и идентификац и Aotinonyoae (Со-ryntbaotorlua) pjogartae при патология репродуктивных органов ! крупного рогатого скота" для научно-исследовательских учрек-;ений. Утверждены Учении Советом ШЭВ (25 декабря 1S9I г., протокол ,'f 18).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Теныссша О.В. Морфология Доипоазгсээ руэзэпзэ в зависимости от уоловий культивирования. // Бюллетень ЕИЭВ. -1989. - 71.-е. 53-56.

2. Иренков И.П., Тенькова О.В. Титрование ДзПпзяуоао егозэ-

(кокковой формы), выделенных от крупного рогатого скота. // Билле тень ВИЭВ. - 1989. — Я 71. - 0.59-61.

3. Тенькова О.В. Действие экзотокоина Аэипв=увв« руодэ» ив» на белых мышей. // Тев. докл. 1У Всесоюзной конференции " Науч1ше основы технологии промышленного производства ветеринарных биологичеоких препаратов"» - М. - 1991. - С. 87-80.

4. Лучко М.А., Тенькова О.В. Патогеннооть п вирулентность АоМпопусва р7о^сев для белых шпэй, / Тез. дохл. 1У Всесоюзной конференции ^Научные основы технологии прокышгзнного производства ветеринар!шх биологических препаратов". - М,-1991,- с. 88-89.

Подписано в печать 2.03.92. Заказ 5S2 Формат 60x90/16 Тира* 120

Москва. Типография РАСИ