Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Т-ЛИМФОЦИТЫ В ВОССТАНОВЛЕНИИ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ У КОРОВ ПОСЛЕ ОТЕЛА

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Т-ЛИМФОЦИТЫ В ВОССТАНОВЛЕНИИ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ У КОРОВ ПОСЛЕ ОТЕЛА"



На правах рукописи

Хлопонин Всеволод Серафимович

Т-лимфоциты в восстановлении воспроизводительном

функции у коров после отела Специальность 03.00.13 — Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Дубріовииьі, Московской области

2005 г.

Диссертационная работа выполнена иа кафедре биологии воспроизведения, искусственного осеменения и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных Российской академии менеджмента в животноводстве (РАМЖ).

Научный руководитель: доктор биологических наук

РАДЧЕНКОВ Виктор Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

КЛІШСКШІ Юрні» Дмитриевич

кандидат биологических наук, доцент ЛОГИНОВ Игорь Андреевич

Ведущая организация: Московская государственная

академия ветеринарной медицины н биотехнологии им. К.П. Скрябина.

Зашита состоится « О » 2005 года в ДО часов на заседании

диссертационного совета Д 006. в'їЗ. 01 при Всероссийском государственном научно-нсследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132. Московская область, Подольский район, пос, Дубровицы, ВГНИИЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНИИЖ. Автореферат разослан у&ъъMS 2005 года

Ученый секретарь диссертационного сот ©ra^y/i^t^'ii-П. Губанова кандидат биологических наук /

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Увеличение продуктивности в молочном скотоводстве в значительной степени зависит от сокращения времени от отела до плодотворного осеменения. Удлинение ссрвис-псриода часто обусловлено возникновением у коров в поел «отельный период воспалительных процессов в половых путях. В этой форме нарушения репродуктивной функции значительный удельный вес принадлежит хроническим гнойно-катаральным эндометритам (Нежданов А.Г., Иноземцев В.П. 1996; K.ask К. et al-, 2003),

Несмотря на многообразие экзо- и эндогенных факторов, вызывающих увеличение сервис-периода у крупного рогатого скота, непосредственной их причиной является угнетение иммунной системы и в первую очередь местного иммунитета тканей половых путей. Подавление активности лимфоидной гкани матки снижает ее репараггнвную регенерацию и способствует колонизации ее у ело в нопато генной микрофлорой. Данная микрофлора, синтезируя факторы патогснности (эндо-, экзотоксины и др.), усиливает згу иммунодспрессию (Beadley K.W. et al., 2003; Dettellenx U.C. et. al. 1995).

В настоящее время существует большое количество способов ликвидации воспаления и восстановления воспроизводительной функции у коров с хроническими гнойно-катаральными эндометритами. Большинство этих способов основано на применении антимикробных препаратов. Существенным недостатком их является высокая устойчивость к ним штаммов условнопатогенных микроорганизмов, а также их иммунодепресснвиое действие (Dosogrte H. et al-, 1998, Hoelen D. et al., 1997). В связи с этим наиболее перспективным направлением в профилактике и ликвидации эндометритов у коров считают разработку способов восстановления активности местного иммунитета тканей'матки (Kummer V., et al., 1997).

Известно, что Т-лимфоциты осуществляют важную роль в регуляции практически всех звеньев иммунитета. В частности, они сами синтезируют и регулируют синтез другими клетками про- и противовоспалительных нитокинов. Соотношение этих цитокинов определяет направленность i

фонд научной литературы

/"35253"

клетках, их устойчивость к действию апоптогенних факторов и многие другие физиологические функции в организме, оказывающие непосредствен нос влияние на репаративные процессы в тканях (Miyamoto D. et al.; 2000,; Suzuki Т. et al., 1995; Vati Kampen C.s 1999).

Недавно было показано, что Т-лимфоцнты осуществляют защиту не только от внутриклеточных патогенов, но у некоторых видов млекопитающих эти лимфоциты, сенсибилизнрованные к Ps. aeruginosa, в присутствии данного микроорганизма синтезируют бактерицидные лимфокины по отношению к широкому спектру уело в но патогенных микроорганизмов, нередко выделяемых от коров с хроническим гной но-катаральным и эндометритом.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы было определение возможного существования у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота прямой антибактериальной активности к внеклеточным патогенам; изучение и мму но протекти в ной роли Т-лнмфоцитов в восста нов ленин репродуктивной функции у коров после отела, а также выяснение возможности сокращения времени восстановления этой функции посредством активации местного иммунитета тканей матки.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1). Определить возможное существование у Т-лммфоцитое крупного рогатого скота прямой бактерицидной активности по отношению к внеклеточным патогенам. 2), Выяснить роль макрофагов в существовании этой возможной функции у Т-лимфоцитов крупного рогатого скота 3). Изучить специфичность индукторного и эффекторного звеньев возможного вида иммунитета. 4). Определить конкретные механизмы возможной прямой Т-клеточнон антимикробной активности, 5). Провести сравнительное изучение содержания Т-, В-лимфоцитов, Е-РОК и бактерицидной активности Т-клеток периферической крови здоровых коров и коров с хроническим і ной но-катаральным эндометритом. 6). Выявить возможность коррекции местного иммунитета лимфоидной ткани матки у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, с целью стимуляции его противовоспалительного и

репаративного эффекта. 7). Сравнить эффективность обработки ИССП и левоэритроци клином коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом по времени прекращения воспалительного процесса, времени от начала лечения до плодотворного осеменения, а также по числу коров, ставших стельными от первого осеменения и за 90 суток. 8). Изучить численность Т-, В-лимфоцитов, Е-РОК, а также бактерицидную активность Т-клеток периферической крови коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом до и после обработки их ИССП.

Научная новиша. Впервые показано, что у крупного рогатого скота: Т-лимфоциты обладают прямой бактерицидной активностью по отношению к внеклеточным патогенам, которая усиливается после специфической рссенсибилизации; антимикробная функция Т-клеток возрастает в присутствии макрофагов; для активации этого вида иммунитета, в отличие от иммунитета к внутриклеточным патогенам, не требуется непосредственного контакта Т-клстки и макрофагов, он осуществляется синтезом макрофагами ИЛ-1; индукторное звено прямого антимикробного иммунитета является специфическим, тогда как эффекторнос - нсспеиифично и направлено против широкого спектра внеклеточных патогенов; цитотоксическое проявление этого вида иммунитета, в отличие от иммунитета к внутриклеточным патогенам, не требует обязательного контакта Т-лимфоцита н клегки-мишени, а опосредуется синтезом Т-клеткам и растворимых бактерицидных факторов; Т-лимфоциты способны оказывать прямое антимикробное действие на большинство уело в но патогенных микроорганизмов, в том числе и Ас(, pyogenes, нередко обнаруживаемых в патологическом материале, полученном от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом; у коров с хроническим гной но-катаральным эндометритом, по сравнению со здоровыми коровами, отмечена тенденция снижения прямой бактерицидной активности Т-лнмфоцитов периферической крови, а также внутрипопуляционное изменение среди них - снижение обшей численности Т-клеток с одновременным увеличением количества R-POK; внутри маточная обработка ИССП, по сравнению с аналогичной обработкой

левоэритроцнклином коров с хроническим гной но-катаральным эндометритом, оказала сильный противовоспалительный эффект, активировала репаративную регенерацию матки, повысила результативность от первого осеменения, за 90 суток и значительно укоротила период времени от начала лечения до плодотворного осеменения; более сильное протективное действие ИССП, по сравнению с левоэрнтроикклином, было связано с интенсивным изменением у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, местного и отчасти системного соотношения про- и противовоспалительных цитокинов. У коров, обработанных ИССП, в первые сутки после обработки происходило обострение воспалительного процесса, сопровождающееся увеличением выделения из матки гнойных масс, повышением температуры тела, снижением аппетита, суточного удоя, что было обусловлено действием прововоспалительных цитокинов. Стимуляция восстановления маточных структур после ликвидации воспалительного процесса была связана с активностью проти во воспалительных цитокинов, индуцирующих анаболитическне процессы в организме и обладающих антнамоптогепным действием; у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, после обработки ИССП, по сравнению с ее началом, отмечено увеличение бактерицидной активности Т-лимфоцитов периферической крови, а также общего их количества, происшедшие, главным образом, за счет возрастания Е-РОК,

Практическая значимость работы. Разработан метол определения прямого антимикробного иммунитета Т-лнмфоцитое крупного рогатого скота по отношению к внеклеточным патогенам. Данный метод может быть использован в научных исследованиях по изучению этого вида иммунитета в норме и различных патологиях у животных. Определен новый подход в разработке методов нммуномолуляцин местного иммунитета тканей матки, проявляющийся в активации антимикробного иммунитета (в том числе и Т-клсточного), а также в усилении репаративной регенерация тканей. Данная разработка может быть использована для дальнейшего совершенствования предложенного подхода им му но коррекции местного иммунитета лимфоидных тканей матки.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на международной научно-практической конференции РАМЖ, п, Быково, 2003 и 2004 гг.; международной научно-практической конференции ВГНИИЖ, п. Дубровицы, 2004 г.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 печатных работах.

Объем работы. Диссертация изложена на 10S страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов м методов исследований, результатов, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, содержит 17 таблиц и 1 рисунок. Список литературы включает 196 источников, втом числе 176 иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту: 1). Т-лимфоциты крупного рогатого скота, как и других видов млекопитающих, обладают прямой бактерицидной активностью к внеклеточным паразитам. Эта активность усиливается после специфической рссенсибилизации, а также в присутствии макрофагов. Данное стимулирующее действие макрофагов обусловлено синтезом ими ИЛ-1. 2). Индукторное звено прямого антимикробного иммунитета Т-лимфоцитов носит специфический характер, тогда как эффекторное -неспецифично и проявляет бактерицидную активность к широкому спектру внеклеточных патогенов, в том числе и условнопатогенным микроорганизмам, нередко выделяемым из патологического материала, полученного от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом. 3). Обработка коров с хроническим п юн но-катаральным эндометритом, ИССП стимулирует активность местного иммунитета лнмфондных тканей маски, проявляющейся в ликвидации воспалительного процесса и усилении восстановления маточных структур. 4). Главное иммуномодулнрующее действие ИССП связано с индукцией ЛПС клеточной сгенки Ps, aeruginosa миграции фагоцитарных клеток и лимфоцитов в очаг воспаления и поочередная стимуляция местного и отчасти системного синтеза клетками иммунной системы (в первую очередь Г-

лимфоцитами) про- и противовоспалительных цитокинов, обеспечивающих антивоспалительное и репарапгивное действие в матке.

2. Материалы м методы исследований

Лабораторные исследования были проведены в Российской академии менеджмента в животноводстве МСХ РФ и НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН. Научно-производственные исследования были проведены в агрофирме "Повадн некое" Домодедовского района Московской области. Всего в экспериментах было использовано 116 коров черно-пестрой породы.

Последовательность проведения экспериментов представлена на рис. I.

Выделение обшей популяции лейкоцитов периферической крови крупного рогатого скота осуществляли посрелством гемолиза эритроцитов 0,83% раствором хлористого аммония, забуференного трис с ph-7,4. Субпопуляцию м о нону кле арных клеток этой крови получали на градиенте плотности фикол-всрографина (1,077).

Субпопуляинн лимфоцитов, обогащенные Т-, или В-клетками получали посредством их разделения на поверхности пластика, нагруженного антителами к мембранным маркерам этих лимфоцитов соогветственно-Thy и mlg (Мейсон Л. И др., 1990). Количественное определение: Т-лимфоцитов в периферической крови осуществляли непрямым иммунофлуоресцентным методом с использованием кроличьей антисыворот ки к Thy антигену (Yotmg T.J., 1981); В-лимфоцитов в реакции комплементарного розеткообразования (ЕАС-РОК); Т-лимфоцнтов, экспрессирующих CD2 am и ген, методом спонтанного розеткообразования {Соколовская И.И, и др., 1985),

В изучения прямой антимикробной активности Т-лнмфоцитов (по Maerkham R.B. et al., I9S5) использовали интактные либо ресенсибшшзнроваиные лимфоциты коров.

Схема исследовании

Рис. 1. Изучение антибактериальной активности Т-лимфоцитов и восстановление воспроизводительной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом после обработки ИСС11, либо яевоэр(гтроц»клином.

Ресенсибилизацию лимфоцитов осуществляли посредством инкубации с тер мои пакти ви ро ванн ной суспензией семи штаммов синегнойной палочки с наиболее распространенными в нашей стране ссротипами. Эти штаммы были выделены сотрудниками лаборатории ожоговых инфекций НИИЭМ им. Н,Ф, Гамалеи из 1522 клинически» штаммов Ps. aeruginosa, полученных из разных регионов России (ТИССП-1). После завершения инкубации лимфоциты отмывали от бактерий и смешивали с равным объемом термоинактивированной суспензии Ps. aeruginosa штамма 1412, входящего в состав ТИССП-1 и имеющего серотип Од, инкубировали, затем лимфоциты вновь отмывали от микробных тел и вносили по 0,1 мл лимфоцитов (4х 105 микр. тел/на лунку) в лунки мнкротнтратора с макрофагами или без них, туда же приливали взвесь живых бактерий синегнойной палочки из расчета 1 ~2х 1 Г)" клеток/лунку, инкубировали 4 часа при +37°С и 5% С02. Затем содержимое лунок осторожно ресуспекдировали, отбирали пробы и высеивали на чашки Петри с мясо пептидным агаром (МП А). По разнице числа колоний между контрольными и опытными пробами определяли степень бактерицидной активности лимфоцитов.

В эксперименте по определению специфичности индукторного звена синтеза Т-лимфоцитами крупного рогатого скота бактерицидных лимфокинов ресенсибилизацию лимфоцитов осуществляли термоин активированной суспензией редко ветре чающегося штамма Ps. aeruginosa № 1874, Он серотипа (коллекционный фонд лаборатории ожоговых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) - ТИИСП-2. Контрольную группу лимфоцитов ресенсибилизировалн ТИИСП-І. В обоих случаях в качестве живых клеток-мишеней использовали штамм 141S.

При изучении специфичности эффекторного звена антимикробной активности Т-лимфошгтов после совместного культивирования в течение трех часов при +37°С и 5% СО; рТ-клеток, макрофагов и микробных тел штамма 1418, собирали надосадочную жидкость, фильтровали се через фильтр с порами 0,45 мк, разводил» двукратно от 1:1 ло 1:8 и каждую пробу этих разведений

вносили no 0,1 мл в лунки микропланшета, содержащие взвесь микроорганизмов (1x10" клеток на лунку) Staph, aureus, Е. coli, Act. pyogenes, Str. pyogenes, Ps, aeruginosa (Оц серотипа), полученные из коллекции лаборатории ожоговых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Инкубировали 4 часа при +37°С и затем определяли степень бактерииндности Т-лимфокинов,

Эндогенную стимуляцию антимикробной активности Т-лнмфоцнтов у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом осуществляли посредством внутри маточного введения им нн активирован ной суспензии семи штаммов синепюйной палочки. Суспензию готовили по методу Мороз А.Ф. и др., 1981.

Научно-производственных опыты проводили на коровах с хроническим гнойно-катаральным эндометритом. Отдельно были отобраны две группы таких коров, инфицированных Act. pyogenes. Этот микроорганизм идентифицировали на селективной среде - МПА с 0,02% содержанием тедлурнта кадия (Тенькова О .В, и др., 1991).

Животным опытных групп внутриматочно вводили четырехкратно с интервалом в 24 часа инактнвированную суспензию штаммов синегнойнон палочки из расчета 100 мл (10s микр. тел/мл) на одно введение, животным контрольных групп также внутриматочно по такой же схеме вводили лсвоэритроциклин.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Изучение іл vitro у крупного рогатого скота Т-клеточного иммунитета по отношению к штаммам условноиатогениоГі микрофлоры 3.1.1. Прямое бактерицидное действие Т-клеток крупного рогатого скота по отношению к штаммам си неп г о it и oil палочки

Многочисленными исследователями было показано, что Т-лимфоциты крупного рогатою скота (как н других видов млекопитающих) осуществляют ведущую роль как в регуляции клеточного и гуморального иммунитета, так и в эффекторной функции иммунной системы - элиминации клеток, инфицированных внутриклеточными патогенами. В то же время у мышей была обнаружена не классическая функция этих клеток, проявляющаяся в прямом бактерицидном действии их по отношению к штаммам условнопатогснной микрофлоры (Maerkham R.B. et al., 1985). В связи с этим на первом этапе исследований изучали возможность наличия аналогичной функции у Т-клеток крупного рогатого скота.

В данном эксперименте использовали Т-лимфоциты, выделенные от клинически здоровых коров (сухостойный период). Так как монокины, синтезируемые макрофагами, способны в значительной степени усиливать как регуляторную, так и эффекторную функции Т-клеток, то в этом опыте также изучали возможность участия макрофагов в становлении прямой бактерицидной активности Т-лимфоцигов по отношению к одному из типичных представителей условнопатогснной микрофлоры - еннегнойной палочке. Результаты этих исследований представлены в табл. 1.

Как видно из данных, представленных в табл. I, Т-лимфониты крупного рогатого скота обладают незначительной бактерицидной активностью по отношению к с и не гной ной палочке. В то же время наметилась тенденция возрастания этой активности в присутствии макрофагов.

Незначительное бактерицидное действие Т-лимфоцитов коров по отношению к синегнойнон палочке, установленное в данном эксперименте, в отличие от выявленной ранее аналогичной функции у Т-клеток мышей Markham R. В. et al, (1985), по-видимому, обусловлена тем, что авторы в своих опытах

использовали Т-лимфоциты, выделенные от животных в период становления вторичного иммунного ответа к Ps. aeruginosa, то есть иа стадии, близкой к максимальной сенсибилизации Т-клеток к антигенам этого микроорганизма.

Таблица 1

Прямая антибактериальная активность Т-клеток крупного рогатого

скота по отношению к синегнойной палочке

Группы, Мононуклеарные клетки Колонии Ps. aeruginosa

№ число % к контролю

1 Т-клетки 787,8 ± 94,3 90,4

2 Т + макрофаги 570,8 ± 53,1 * 65,5

3 Макрофаги 651,0 ± 73,4 74,7

4 Среда 87),5 ± 102,0 100,0

* Р< 0,05

Таким образом, вполне вероятно, что в нашем эксперименте инкубации Т-лимфонитов с синегнойной палочкой недостаточно для интенсивной стимуляции прямой бактерицид ион активности этих клеток. В то же время известно, что синегкойная палочка, как и большинство других уеловнопатогенных микроорганизмов, неотделима от среды обитания животных (Радченков В.П. и др., 1987), то есть взрослые животные, как правило, сенсибилизированы к представителям этой микрофлоры. Исходя из этого, в следующем эксперименте определяли влияние ресснсибилизацни ТИССП-1 Т-лимфоцитов на их прямую антимикробную активность, В качестве клеток мишеней использовали штамм 14)8.Результаты этих исследований представлены в табл. 2.

Как видно из данных, представленных в табл. 2, нрТ-клеткн (как и в предыдущем эксперименте) практически не проявили антибактериальную активность к синегнойной палочке. В то же время они имели сенсибилизацию к этому микроорганизму, так как их ресенсибдизация ТИССП-1 индуцировала проявление этой активности, которая увеличилась по сравнению с контролем на статистически достоверную величину. Присутствие в культуре клеток

макрофагов повысило бактерицидную функцию рТ-клеток на еще большую величину.

Таблица 2

Влияиие ресеисибилизации Т-клеток

Группы, Культура клеток Бактериальные катании

№ число % к контролю

1 нрТ-клетки 845,8 ± 73,4 95,9

1 рТ-клетки 600,0 ± 43,2' 68,1

3 рТ-клетки + макрофаги 171,6 + 24,2" 19,5

4 Среда 881,6+96,6 100,0

* - Р <0,05; **-Р<0,01 Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что Т-

лимфощ|ты крупного рогатого скота обладают прямой бактерицидной

активностью к штаммам синегнойной палочки. Эта активность значительно

увеличивается в присутствии макрофагов.

Известно, что макрофаги индуцируют Т-клеточный иммунитет (в том

числе к противоннфекиионный) как посредством прямого контакта с Т-клетками

предшественниками ЦТЛ (презентация антигена), так и посредством синтеза

монокинов, главным образом ИЛ-1.

В связи с этим в следующем эксперименте изучали функцию макрофагов в

индукции а нти бактериально го действия Т-лимфоцитов. Результаты этого

эксперимента представлены в табл. 3,

Как видно из данных, представленных в табл.3, антибактериальное

действие Т-лнмфнинтов в присутствии как макрофагов, так и монокинов, было

практически одинаково. Аналогичная активность Т-клеток была установлена и в

присутствии ИЛ-1 в дозе 5 ЕО. Разница между 1, 2 и 4 группами была

статистически недостоверна.

Таким образом, усиление антимикробной активности Т-клеток обусловлено не прямым межклеточным взаимодействием, а синтезом макрофагами ИЛ-1.

Таблица 3

Функция макрофагов в становлении прямой бактерицидной активности Т-клеток

Группы, Культура клеток Колонии синегнойной палочки

Xs Число % к контролю

1 рТ-клетки + макрофаги 183,9± 21,3* 21,3

2 рТ-клеткм + монокпны 220,4 * 25,2* 25,5

3 рТ-клетки + ИЛ-1 (IFLD) 467.2 i 34.4* 54,1

4 рТ-клетки + ИЛ-1 (5 ED) 276,8 ± 20,0* 32,1

5 Среда 863,4 ±98,1 100,0

* - р<0,05

Результаты вышеприведенных экспериментов показали, что Т-клетки крупного рогатого скота обладают прямой бактерицидной активностью по отношению к сине гнойной палочке. Вместе с тем известно, что в использованном нами выделении мо нону кле арных клеток на градиенте плотности фикол-всрографина от 16 до 20% получаемых клеток составляют В-лимфошгты. Вполне вероятно, что в наших экспериментах антимикробное действие Т-лимфошггов может быть частично обусловлено В-клетками.

В связи с этим в следующем эксперименте изучали антимикробную активность субпопуляций лимфоцитов, обогащенных Т- или В-клетками. Результаты эксперимента представлены в табл. 4.

Как видно из данных, представленных в табл. 4, гибель бактерий во второй и третьей группах была практически одинакова, следовательно, бактерицидная активность в данном случае обусловлена действием только макрофагов, В-лимфоциты в этом процессе практически не принимали никакого участия. Напротив, численность микробов в присутствии обогащенной субпопуляции рТ-клеток (1 группа) снизилась на статистически вы со ко достоверную величину по

сравнению с контролем, она была также значительно ниже, чем выживаемость сшгегиойной палочки во второй и третьей группах клеток (Р < 0,05).

Таблица 4

Лити бактсриал ьиая активность сг бп опуляц и и лимфоцитов.

"руплы, № Культура клеток Колонии Ps. aeruginosa

число % к контролю

1 рТ-клетки (обработка антн-^

сывороткой) + макрофаги 140 ±19,2* 29,5

2 рВ-клетки (обработка ТЪу-антисы- 310,0 ±26,3 65,1

вороткой) + макрофаги

3 Макрофаги 326,0 ± 28,6 68,5

4 Среда (контроль) 476,4 ±33,1 100,0

* - Р < 0,05

Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что ресснсибилизация лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота к сикепюйноб палочке индуцирует прямую бактерицидную активность Т-, а не В-клеток.

Известно, что классическая эффекторная функция цитотокснческнх Т-лимфоиитов осуществляется лишь в непосредственном контакте с клеткой мишенью. В связи с этим в следующем эксперименте изучали механизм обнаруженного нами бактерицидного действия Т-лимфоцитов у крупного рогатого скота. Для этого лимфоциты культивировали с и «активированной суспензией синегнойной палочки, собирали надосад очную жидкость, очищали ее от клеток и микробов и добавляли к живой суспензии Ps. aeruginosa. Результаты эксперимента представлены в табл.5.

Как видно из данных, представленных в табл.5, бактерицидная активность рТ-клсток и над осадочной жидкости была практически одинаковой (разница между группами статистически недостоверна), в тоже время разница в антимикробной активности между этими группами и контрольной группой была

статистически высокодостоверной (Р < 0,01), Следовательно, эффекторным звеном прямого антимикробного иммунитета Т-лнмфопитов крупного рогатого скота является не прямое взаимодействие этого лимфоцита с микробной клеткой, а синтез Т-клеткам» бактерицидных лимфокмнов.

Таблица 5

Бактерицидное действие надосадочной жидкости рТ-кяеток

Группы, № Факторы, индуцирующие бактерицидный эффект Колонии синегнойной палочки

число % к контролю

1 рТ-клетки + макрофаги Надосадочиая жидкость рТ-лимфоцитов в разведении: 194,4 ± 23,3* 19,9

2 1 : 1 222,8 ± 19,7* 22,8

3 ] : 2 451,0 ±33,3* 46,1

4 1 662,2 ±49,2** 68,2

5 I : 8 821,0 + 94,8 84,0

6 і Среда (контроль) 977,4 ± 88,6 100,0

Р < 0,05 **- Р < 0,0!

Результаты экспериментов, представленные в этой главе, показати, что Т-клетки крупного рогатого скота, как и аналогичные лимфоциты мышей, обладают прямым антимикробным действием на внеклеточный патоген. Эта функция Т-клсток не связана с непосредственным их контактом с бактериями, а обусловлена синтезом ими бактерицидных цитокинов. Антибактериальное действие Т-лимфопитов усиливается в присутствии мак-рофагов, Данная функция макрофагов опосредствуется через синтез ими ИЛ-1.

3.1.2. Определение специфичности антимикробного Т-клеточного иммунитета по отношению к штаммам у ело в I ю п а тогенп о Г| микрофлоры

Известно, что классические ретуляторные и эффекторные функции Т-лимфоцитов имеют специфический характер и рестриктнрованы по антигенам 1 или II классов главного локуса гистосов мести мости. В то же время некласеическнй прямой антимикробный Т-клеточныЙ иммунитет, установленный ранее у мышей, хотя также носит специфический характер сенсибилизации, но эффекторные шггокины этого вида иммунитета обладают неспецифической антимикробной активностью по отношению ко многим видам условной ато ге нн ы х м икроорган и змо в,

В связи с этим в следующем эксперименте у крупного рогатого скота изучали специфичность прямого антимикробного Т-клеточного иммунитета и возможное участие в этом процессе макрофагов.

Т-лимфошггы ресепсибнлизировали ТИССП-1, либо ТИССП-2. В качестве клеток-мишеней использовали живые бактерии О} серотипа. Результаты эксперимента представлены в табл. 6.

Как видно из данных, представленных в табл. 6, во всех трех опытных группах произошло снижение числа бактериальных колоний, причем наибольшее их уменьшение произошло в первой группе. Во второй и третьей группах эта гибель микроорганизмов была практически одинаковой, то есть она была обусловлена лишь антибактериальной активностью макрофагов, но не Т-клеток.

Как ноказази результаты этого эксперимента, синтез бактерицидных цитокинов происходит лишь при совпадении ссротнпоЕ, сенсибилизирующих и ресинсибилизируюших штаммов синегнойной палочки. Следовательно, проявление прямой бактерицидной активности у Т-лнмфоцитов является строго специфическим, В отличие от Т-клеток у макрофагов этот процесс носит неспецифический характер.

Таблица 6

Специфичность синтеза бактерицидных цитокииоврТ-лиліфоцитамч

Груп- Рестиму- Серотип тер- Колонии синегнойной

па, ляция Культура клеток м оинактив li- палочки

№ po в энных число %

бактерий к контролю

1 ТИССП-1 рТ-клетки + О, 13 6,4 ¿22,6 21.3

макрофаги

2 - макрофаги Oi 311,9»-25,0 48,7

3 ТИССП-2 рТ-клетки + О,, 2SS,7±32,3 45,1

макрофаги

4 - Среда (контроль) 640,2 і-56,7 100,0

В следующем эксперименте изучали специфичность эффекторного звена прямой антибактериальной активности Т-лимфоцитов. Для этого рТ-клстки инкубировали с макрофагами и терм оинактив про ванным штаммом Оз серотнпа, собирали надосадочную жидкость, удаляли Т-клетки, добавляли эту жидкости к культуре штаммов Staph aureus, Б. Coli, Act. pyogenes, Str. pyogenes, Ps. aeruginosa (Оп серотнпа), часто выделяемых от коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, и определяли бактериальную выживаемость. Результаты эксперимента представлены в табл. 7.

Как видно из данных, представленных в табл. 7, бактерицидные лимфокины, синтезируемые рТ-лимфоцитами, полностью подавляют рост Staph, aureus, Е. coli и значительно снизили рост Str. pyogenes, Aci. pyogenes и Ps. aeruginosa (PO,01).

Таким образом, результаты этого эксперимента указывают, что эффекторное звено прямой бактерицидной активное™ Т-лимфоиитов имеет неспецифический характер, так как рестимуляция штаммом одного вида бактерий вызывает гибель не только других штаммов этого вила, но и других видов и даже представителей других семейств условнопатогенных микроорганизмов.

Таблица 7

Специфичность бактерицидных личфокинов рТ-лимфоцитое

Количество колоний микроорганизмов

Культу Staph, aureus Е. cotí Act. pyogenes Str. pyogenes Ps. aeruginosa

ра клеток число % число % число % число % число %

Г-клетки чакрофа ги Среда 0** 0** 0** 0** 371,9 ±49,4** 37,7 179,6 ±36,8** 20 232,0 ±23,8** 28,8

899,0 ±60,6 100,0 737,6 ±98,8 100,0 986,9 ' ± 49,4 100,0 898,8 ± 78,8 100,0 828,8 ±40,0 100,0

** - Р <0,01

3.2. Клеточный иммунитет у клинически здоровых коров и коров с хроническим эндометритом

Известно, что клеточный иммунитет играет важную роль как в

антимикробном иммунитете, так и в регенерации поврежденных тканей.. Поэтому в следующем эксперименте (табл. 8) было изучено содержание Т- и В-лнмфоцнтов и Е-РОК в крови коров и коров опытной и контрольной групп.

Таблица 8

Содержание Т- и В-лимфоцшпов и Е-РОК в периферической крови здоровых коров и коров с хроническим эндометритам

Лимфоциты от

животных

Здоровых С эндометритом

Т-клетки

Всего подсчитано лимфоцитов

іисло

2000

67,5±М,4

2000 ІП7І 58.5±15,6

Е-РОК

Всего подсчитано лимфоцитов

число

1000 1000

из них Е-РОК

шел о

130 207

%

13,0±|0,б 20,7±12,8

В-клетки

Всего подсчитано лимфоцитов

число

число

2000 2000

из них В-клетки

406 526

%

I

20,5±12,8 26,3± 13,9

Как видно из данных, представленных в табл. 8, существенной разницы в содержании Т-, В-клеток и Е-РОК в периферической крови у здоровых коров и коров с хроническим эндометритом не обнаружено, хотя у коров с эндометритом и наметилась тенденция в сторону снижения численности Т-лимфошггов с одновременным увеличением Е-РОК и В-лимфоцитов

.Также в следующем эксперименте при изучении прямой бактерицидной активности Т-клеток здоровых коров и коров с хроническим гнойно-катаратьным эндометритом была установлена тенденция уменьшения антимикробной активности Т-клеток у животных второй группы по сравнению с первой. Схожесть в бактерицидной активности Т-клеток периферической крови здоровых и больных коров может быть связана с тем, что относительно невысокая концентрация микробов в зоне воспаления недостаточна для интенсивной миграции к ней Т-лимфоиитов. Помимо этого известно, что живые бактерии синтезируют факторы, препятствующие адгезии их с клетками иммунной системы.

3.3. Влияние нияктнвироваппой суспензии сине! ионной палочки на восстановление яоспрошводшельиоП функции у коров с хроническим эндометритом

Результаты экспериментов, проведенных выше, показали, что, с одной стороны, ресе ней били зацня Т-клеток ТИССП-1 вызывает локальный синтез этими лимфоцитами бактерицидных лимфокинов широкого спектра действия, с другой стороны, данная суспензия стимулирует синтез макрофагами ИЛ-1, одного из ведущих цитокинов, регулирующих регенеративные процессы в организме. Также ранее было показано, что к месту нанесения ТИССП-1 усиливается приток лимфоцитов и фагоцитов (Мороз А.Ф. и др., 1981).

В связи с этим для определения возможности ликвидации воспалительного процесса и восстановления воспроизводительной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом было испытано внутри маточное введение ТИССП-1. Так как в дополнительном эксперименте

было установлено, что большинство штаммов условной ато генной микрофлоры, выделенных от коров с хроническим гной но-катаральным эндометритом, не были чувствительны к эритромицину и левом цистину, то животных контрольной группы обрабатывали левоэ р итроци кли н ом. Результаты эксперимента представлены в табл. 9.

Таблица 9

Восстановление воспроизводительной функции у коро« с хроническим гнойно-катаральным эндометритом после обработки их ТИССП-1

либо левоэритроцикли ном

Время от начала Стало стельными

Обработка Чис- Время от лечення

ло отела до до при- Плодот- от первого 90 суток

ко- начала хода пер- ворное осеменения

ров лечения вой охоты осемене- чис- % чис- %

(сут.) (сут.) ние (сут.) ло ло

ТИССП-1 16 24,4 ± 1,6 22,0±3,5 * 41,1+4,7** 9 5 6,3 ±0,4 14 87,5±8,3

Левоэритр 14 25Д±1,б 31,0±!,3* 59,0*6,5* 6 42,8-1:12,5 10 71,4*12,1

цикл и н

* - Р < 0,05, ** - Р<0,01

Как видно из данных, представленных в табл. 9, время or начала обработки до прихода первой охоты у коров опытной группы сниэияось на статистически достоверную величину (Р < 0,05). Время от начала обработки до плодотворного осеменения также снизилось на статистически достоверную величину (Р < 0,01). Число коров, ставших стельными в первую охоту и в течение 90 суток, было выше в группе животных, обработанных ТИССП-l по сравнению с коровами, обработанными левоэр итроци кли ном. У животных, обработанных ТИССП-1, как правило, на вторые сутки после обработки наблюдали резкое усиление выделения гнойных масс, что свидетельствует об усилении фагоцитарной активности и переходе хронического воспаления в острое. Выделение гнойных масс у животных опытной группы прекращалось обычно на третьи сутки от начала лечения. У коров, обработанных левоэритроииклином, на вторые сутки

после начала лечения наблюдалось незначительное увеличение выделения гнойных масс, прекращение выделения которых происходило на 5-7 сутки после начала обработки.

В связи с тем, что по мнению многочисленных исследователей Act, pyogenes является ведущим микроорганизмом, вызывающим острые и хронические эндометриты, нами были отобраны две группы коров с хроническим гной но-катаральным эндометритом, от которых был выделен этот условно патогенный микроорганизм. Так как в специальном эксперименте нами было установлено, что восстановление воспроизводительной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом было практически одинаково как после обработки ТИССП-1, так и суспензией, ннактивированной экторищщом (менее трудоемким процессом), то в этом эксперименте животных опытной группы обрабатывали экгорицид-ин активирован ной суспензией штаммов си негнойной палочки.

Результаты эксперимента представлены в табл. 10.

Таблица 10

Результативность обработки инактивированной суспензией синегнойной палочки либо левозратроцикяином корое, с эндометритом, вызванным Act

pyogenes

Время от начала Стало стельными

Чис- Время обработки

ло от отела до прихода ДО от первого за 90 су г.

Обработка ко- до начала первой плодотвор- осеменения

ров обработ- охоты ного чис- % чис- %

ки (сут.) (сут.) осеменения (сут.) ло ло

ЭкИССП1 14 26,5 ±0,4 30,4 ±2,8** 42,6*5,2 7 50.0*13,3 12 85,8±9,3

Контроль: 15 26,1*0,3 41,2±2,0** 54,4±4,8 6 40,1±12,6 11 73,3111,4

1 - 'инактивация зкторишідом ;" -обработка левоэритроциклнном; * * - Р < 0,0!

Как видно из данных, представленных с табл. 10, и н актив и ров энная суспензия штаммов синегнойной палочки является эффективным средством ликвидации воспалительного процесса и восстановления репродуктивной функции у коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, вызванным Act. pyogenes. Эффективность обработки этим препаратом была выше, нежели результативность обработки левоэритроциклином.

В целях получения более достоверной информации по эффективности обработки инактивированной суспензией Ps. aeruginosa коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом был проведен научно-производственный эксперимент, результаты которого представлены в табл. 11.

Как видно из данных, представленных в табл. П, у коров, обработанных и н актив ирован н о й суспензией штаммов синегнойной палочки, время от начала лечения до прихода первой охоты снизилось в среднем на 10 суток (при статистически достоверной разнице с контролем - Р < 0,01), число коров, ставших стельными в течение 90 суток, увеличилось по сравненню с контрольной ipynnoft на 17 суток (Р <0,05).

Таблица 11

Восстановление воспроизводительной функции у коров с эндометритом, после обработки их инактивированной суспензией __ синегнойной палочки либо левоэритроци клипом_

Время от начала Стало стельными

Чис- Время обработки

ло от отела до ДО от первого за 90 сут.

Обработка ко- до начала прихода плодотвор- осеменения

ров обработ- первой ного чис- % числ %

ки охоты осеменения ло о

(сут.) (сут.) (сут.)

ЭкИСП 1 43 25,б±0,6 32,±0,8** 42,8*2,9** 23 53,5±7,б 39 90,7±4,4*

Контроль * 38 25,9*0,6 42,0+3,3** 59,9±4,8** 16 42,1 ±8,0 23 71,1 ±7,4*

' - инактивация экторицидом; "^"-обработка левоэритроци клином

* - Р < 0,05; **-Р<0,01

Таким образом, установлено, что лнакт»ейрокаиная суспензия штаммов сннегнойной палочки является эффективным средством ликвидации воспаления и восстановления воспроизводительной фунkuiiи у коров с хроническим эндометритом.

3,4. Изменение клеточного иммунитета у коров с хроническим гноГшо-катаральным эндометритом до н после обработки их МССП-1.

На первом этапе этих исследований изучали изменение прямой бактерицидной активности Т-клеток периферической кровн коров до и после обработки их инакти ворованной суспензией Ps, aeruginosa. Результаты эксперимента представлены в табл. 12.

Таблица 12

Антимикробный Т-клеточныЙ иммунитет у коров, с эндометритом, после

обработки их суспензией еннепюйной палочки

Культура клеток- Число колоний Act. pyogenes

до обработки после обработки

всего % к контролю всего % к контролю

Сред а (контроль) 801,Si90,6 100,0 SO 1,8±90,6 100,0

рТ-клетки 706,4±64,0 1 88,1 535>2±47,3 66,7

рТ-клетки+макрофаги 409,8±40,1 * 51,1 270,2±19,4* 33,7

* - Р < 0,05 ;1 - td = 2,15

Как видно из данных, представленных в табл. 12, восстановление маточных структур у коров после успешной ликвидации у них той но-катарального эндометрита сопровождалось возрастанием прямой бактерицидной активности Г-лимфоцитов (разница близка к статистически достоверной: 1с1 = 2,15), которая значительно возрастала в присутствии макрофагов.

В следующем эксперименте изучали содержанке Т-, В-лимфоцнто» и Е-РОК в периферической крови коров с эндометритом до и после обработки их инактнвированной суспензией штаммов си негной нон палочки, В этом

эксперименте было установлено, что у коров с хроническим гной но-катаральным эндометритом, после обработки их инактивированной суспензией штаммов синегнойной палочки наметилась тенденция увеличения в периферической крови количества лимфоцитов, преимущественно - Т, а также Е-РОК.

Таким образом, результаты этих экспериментов показали, что при ликвидации воспаления и стимуляции инволюции половых органов у коров с хроническим гной но-катаральным эндометритом после обработки их инактивированной суспензией Ps. aeruginosa происходит увеличение периферической крови количества Т-лимфоцитов и возрастает их антимикробная активность.

Выводы

1. В иммунитете к внеклеточным патогенам Т-лимфоциты крупного рогатого скота осуществляют не только регуляцию В-клеточного иммунитета, но и оказываю! прямое бактерицидное действие на эти патогены.

2. B-лимфоциты крупного рогатого скота, в отличие от Т-лимфоцитов, не оказывают прямого антимикробного действия на внеклеточные патогены, то есть их функция в -защите организма от этих патоген о в обусловлена только антитело ге н ез ом.

3. Макрофаги усиливают прямую бактерицидную активность Т-клеток крупною рогатого скота по отношению к внеклеточным патогенам, но эта их модулирующая функция, как при индукции пролиферации антигенспецифических клонов ЦТЛ к внутриклеточным патогенам, не связана с презентацией антигена, а обусловлена лишь синтезом ИЛ-1.

4. Индукторное звено прямого антимикробного действия Т-лимфоцитов крупного рогатого скота на внеклеточные патогены, как и при формировании ЦТЛ к внутриклеточным патогенам, строго специфично. Напротив, эффекторное звено этого вида иммунитета, по сравнению с иммунитетом к внутриклеточным патогенам, не является специфичным,

5. Прямая бактерицидная функция Т-лимфоцитов крупного рогатого скота по отношению к внеклеточным патогенам, по сравнению с иммунитетом Т-

клеток к внутриклеточным патогенам, не требует прямого контакта Т-клетки п клетки-мишени, а опосредуется синтезом Т-лимфоци сами растворимых бактерицидных факторов.

6. У коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом, по сравнению со здоровыми коровами, отмечается снижение в периферической крови обшего количества Т-лимфоцитов, а также ослабление их прямой бактерицидной активности по отношению к внеклеточному патогену Ps. aeruginosa.

7. Внутри маточная обработка коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом ИССП, по сравнению с обработкой левоэритроциклином, была более эффективной. У коров, обработанных ИССП, по сравнению с коровами, обработанными левоэритроциклином, произошла более быстрая ликвидация воспалительного процесса в эндометрии, процесс инволюции матки завершился быстрее, результативность от первого осеменения и за 90 суток была выше (соответственно на 11% и 21%), а время от начала обработки до плодотворного осеменения короче на 17 суток

S. Обработка коров с хроническим гнойно-катаральным эндометритом ИССП по сравнению с обработкой левоэритроциклином уже на вторые сутки после ее начала резко увеличивала выделение из матки гнойных масс, которое нередко сопровождалось повышением температуры тела, снижением аппетита и суточного удоя. Эти внешние проявления острого воспаления исчезали к 3-4 суткам после обработки, что и стимулировало репаративную регенерацию в маточных структурах.

9. Обработка коров с хроническим гной и о-катаральным эндометритом, ИССП, сопровождалась повышением содержания в периферической крови общего количества Т-лимфоцитов а также их субпопуляции, экспрсееируюшей CD2 антиген. Это увеличение общей численности Т-клеток произошло, главным образом, за счет количественного роста CD2 Т-лимфоцитов.

10. Иммуномодулируюшие свойства ИССП связаны с активацией ЛПС и иными бактериальными антигенами преимущественно местного, поочередного

синтеза лимфоцитами, главным образом Т, про воспалительных и противовоспалительных иитокинов.

Практические предложения

I. Рекомендовать Научно-исследовательским учреждениям, занимающимся изучением причин нарушения воспроизводительной функции у коров после отела, а также способов их предупреждения, метод определения прямой антибактериальной активности Т-лимфошггов по отношению к условнопатогениым микроорганизмам

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1, Радченков В.П,, Хлопонин B.C., Мороз А.Ф. Антибактериальная активность Т-лимфоцитов крупного рогатого скота по отношению к Pseudomonas aeruginosa // Доклады РАСХН. 2003, № 4, с.44-47.

2, Радченков В.П., Хлопонин B.C., Мороз Л.Ф. Участие макрофагов в прямом антибактеральном иммунитете Т-лимфоцитов крупного рогатого скота к условнопатогениым бактериям. // Вестник РАСХН, 2004, № 4, с.80-82,

3, Радченков В.П,, Хлопонин B.C., Мороз А.Ф, Бактерицидная активность Т-лимфоцитов коров до и носле лечения хронического эндометрита // С-х биология, 2004, № 4, с. 99-102.

4,Радченков В.П., Хлопонин B.C. Клеточные иммунные реакции у коров до и после лечения хронического гнои но-катарального эндометрита И Материалы международной научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» -Быково. - 2003, с.56-57

5,Хлопонин B.C. Т-лимфоциты в восстановлении маточных структур у коров больных хроническим гной но-катаральным эндометритом // Материалы международной научно-практической конференции «Повышение

конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» -Быково. - 2003, с. 54-55.

6. Радченков В.П., Хлопонин B.C. Прямая бактерицидная активность Т-лимфоцитов крупного рогатого скота к внеклеточным патогенам // Материалы юбилейной международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию академии «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» - Быково. - 2004, с. 204-205.

7. Радчснков В.П., Хлопонин B.C., Блюма С.Н. Т-лнмфоциты в восстановлении воспроизводительной функции у коров // /^териалы международной научно-практической конференции «1 Ірошлоу; настоящее и будущее зоотехнической науки». - Дубровицы — 2004, т.З, c..W4-I Y&.

/І

- с^р^Ь

¿Г. -

- ^ / О , г- о

Издательство РУЦЭБТЖ 142132, Московски обл.. Подольский р-н, л Дубровниы Тел (8 - 27) «-14-24. (8 - 27)65-14-07

Сдано в набор 24,02.2005, Подписано в печать 25,02.2005 _Заказ № 5- Печ. п. \2 Тираж 100 эк!_