Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональная оценка роли P2Y-рецепторов в пищеводе при ахалазии

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная оценка роли P2Y-рецепторов в пищеводе при ахалазии"

И04609652

Сабиров Алексей Германович

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РОЛИ Р2У-РЕЦЕПТОРОВ В ПИЩЕВОДЕ ПРИ АХАЛАЗИИ

03.03.04-клеточная биология, цитология, гистология 03.03.01 - физиология

Автореферат

диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 6 СЕН 2010

Казань-2010

004609652

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский универси Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители:

доктор медицинских наук Рагинов Иван Сергеевич

кандидат медицинских наук, доцент Мухамедьяров Марат Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН Швалев Вадим Николаевич

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РТ Зефиров Тимур Львович

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение высш профессионального образования «Российский государственный медицинский универси им. Н.И. Пирогова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

заседании диссертационного совета }, _ и ГОУ ВПО «Казанси

государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению социальному развитию» (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Казанси государственный медицинский университет» (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49, корпус Б).

(г. Москва)

Защита диссертации состоится «_ Ж.»

2010г.в/?<Ж?'

часов 1

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Залялютдинова Л.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Изучение роли метаботропных P2Y-рецепторов в регуляции физиологических функций организма является актуальной проблемой современной медицины (Зигаишин А.У., Зиганшина Л.Е., 2009). Экспрессия P2Y-рецепторов выявлена на плазматической мембране практически каждой клетки организма млекопитающих, и они участвуют во всех ключевых клеточных процессах (Зиганшин А.У., 2005; BurnstockG., 2009).

В настоящее время активно исследуют участие различных типов P2Y-рецепторов в регуляции сократительной активности мышц. В экспериментах на препаратах ушка правого предсердия человека активация Р2У-рецепторов вызывает снижение амплитуды сокращений, а их блокирование - обратный эффект (Рычков A.B., 2007). Показано, что активация Р2У-рецепторов пиримидиновым нуклеотидом УТФ вызывает расслабление гладкомышечных клеток пещеристого тела (Calvert R.C., 2008) и толстой кишки (Van Crombruggen К. et al., 2007).

Необходимо отметить, что отсутствуют сведения о роли Р2У-рецепторов в регуляции сократительной активности ГМК пищевода Вместе с тем, модуляция работы Р2У-рсцепторов представляется перспективным подходом в коррекции нарушений моторики пищевода, наблюдающихся при ахалазии - одного из наиболее часто встречающихся заболеваний пищевода. Среди всех функциональных нарушений пищевода ахалазия составляет свыше 31% (Beisei R., 1966, Ивашкин В.Т., Трухманов A.C., 2000). Этиология заболевания неизвестна (Dughera L. et al., 2008), в то же время выдвигаются следующие теории развития ахалазии пищевода (АП): теория психических нарушений (Францкевич A.B., 1977), генетическая (Stein D.T., Knauer С.М., 1982., Frieling T. et al., 1988., Sachdev A. et ail., 2004) и вирусная (Jones D.B. et all., 1983, Robertson C.S., Martin B.A., Atkinson M., 1993, Castagliuolo I. et all., 2004).

В основе патогенеза лежит повышение тонуса нижнего пищеводного сфинктера (НПС) и нарушение перистальтики пищевода вследствие дегенерации тормозных нейронов межмышечного (ауэрбьховского) нервного сплетения, которые отвечают за релаксацию гладкой мускулатуры НПС во время акта глотания (Park W., Vaezi M.F., 2005). В результате этого нарушается прохождение пищи из пищевода в

желудок, что приводит к дилатации пищевода и кахексии пациента (Farrokhi F., Vaezi MF., 2009). Опасность этого заболевания заключается в высоком риске развития плоскоклеточного рака и аденокарциномы пищевода на фоне ахалазии (Zendehdel К. et al., 2007). Несмотря на широкий спектр используемых методов лечения АП, результаты часто неэффективны и имеют ряд серьезных осложнений (Bruley des Varannes S., Scarpignato С., 2001., Iqbal A. et al, 2006).

Отсутствие данных об экспрессии Р2У-рецепторов в стенке пищевода, о роли пуринергических механизмов в регуляции сократительной функции пищевода в норме и при патологии пищевода делает данное исследование актуальным. Кроме того, ответ на поставленные вопросы позволит в дальнейшем значительно продвинуться в понимании роли Р2У-рецепторов в регуляции физиологических функций и развитии заболеваний желудочно-кишечного тракта, открыть новые возможности в медикаментозной терапии при помощи препаратов с пуринергическим механизмом действия. Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение экспрессии различных типов Р2У-рецептороп в нижней трети пищевода и их роли в регуляции сократительной активности пищевода в норме и при ахалазии.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Провести сравнительное исследование экспрессии Р2УЬ P2Y2 и P2Y4-рецепторов в нижней трети пищевода человека в норме и при ахалазии.

2. Выполнить морфофункциональный анализ результатов, полученных на экспериментальной модели ахалазии у крыс и провести оценку соответствия клинической и морфологической картине заболевания у человека.

3. Провести сравнительное исследование сократительной активности ГМК нижней трети пищевода и НПС крыс в норме и на фоне экспериментальной ахалазии.

4. Провести сравнительное исследование экспрессии P2Yb P2Y2 и Р2У4-рецепторов в нижней трети пищевода крысы в норме и при экспериментальной ахалазии.

5. Оценить изменения сократительных ответов ГМК нижней трети пищевода и НПС крыс под действием различных агоиистов и атагонистов Р2У-рецепторов в норме и при экспериментальной ахалазии.

Научная новизна

В диссертационной работе впервые проведено комплексное морфофизиологическое изучение роли Р2У-рецепторов в регуляции сократительной активности пищевода. Было установлено, что в норме у человека и крысы P2Y| 2,4-рецепторы локализуются во всех слоях стенки нижней трети пищевода. Впервые был проведен детальный морфофункциональный анализ течения экспериментальной ахалазии (ЭА) у крысы и доказана адекватность данной модели клинической и морфологической картине заболевания человека. Дана детальная характеристика нарушений сократительной активности нижней трети пищевода и НПС in vitro при ЭА у крыс. Также показано, что блокагоры Р2У-рсцспторов увеличивают амплитуду медленных сократительных ответов НПС, тогда как активаторы не оказывают влияния. При ЭА эффекты как агонистов, так и антагонистов Р2У-рецепторов значительно видоизменяются, что свидетельствует о выраженном нарушении метаботропной пуринергической регуляции НПС. Научно-практическая ценность

Выполненная работа расширяет знания о пуринергических механизмах регуляции функции пищевода и детально характеризует участие различных типов Р2У-рецепторов в сократительной активности нижней трети пищевода. В ходе исследования была разработана модифицированная методика ЭА у крыс, выполнен морфофункциональный анализ полученных результатов и доказана адекватность модели ЭА клинической и патологоанатомической картине заболевания у человека. Таким образом, нами было показано, что в дальнейшем данная модель может быть использована для разработки и изучения современных методов лечения ахалазии пищевода. Полученные экспериментальные данные значительно расширяют и дополняют паши представления об участии пуринорсцепторов в регуляции функций пищеварительного тракта в норме и патологии и являются перспективными в плане разработки новых подходов к лечению ахалазии при помощи лекарственных препаратов с пуринергическим механизмом действия. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. P2Y[ 2,4-рецепторы локализуются в стенке пищевода человека и крысы в норме; при ахалазии у человека и при экспериментальной ахалазии у крысы происходит изменение экспрессии вышеуказанных типов Р2У-рецепторов.

2. Активность Р2У-рецепторов оказывает угнетающее влияние на сократительную активность ГМК нижнего пищеводного сфинктера крысы в норме. При экспериментальной ахалазии у крыс происходит выраженное нарушение метабспгропной пуринергической регуляции нижнего пищеводного сфинктера. Личный вклад диссертанта

Приведенные в работе данные получены при личном участии соискателя на всех этапах работы, включая составление плана исследования, постановку задач, выбор методов исследования, проведение экспериментов, обработку экспериментальных данных и оформление публикаций. Соискателем впервые в России методом иммуногистохимии с использованием ЬБАВ-кй (Б А КО) изучена экспрессия Р2У1 ¿¿-рецепторов в нижней трети пищевода человека и крысы в норме и при ахалазии, дана детальная характеристика нарушений сократительной активности пищевода при ЭА.

Достоверность полученных данных

Достоверность полученных данных достигнута использованием достаточного количества образцов для исследования, конкретной постановкой и решением поставленных задач с использованием статистического метода. Достоверность различий между результатами оценивали по »-критерию Стыодента. Сведения об апробации результатов диссертации

Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях и форумах: 12 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2008), Всероссийской конференции «Научное наследие академика Л.А.Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний» (Санкт-Петербург, 2008), XIV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2009), XV межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2009), XV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2010), совместном заседании кафедр гистологии, цитологии, эмбриологии и нормальной физиологии ГОУ ВПО «КГМУ Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Публикации материалов исследования

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 2 статьи в ведущих научных репетируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для опубликования основных результатов диссертации. Общий объем публикаций -1.8 у. п. л., вт.ч. авторский вклад-1.1 у. п. л.. Внедрение результатов работы

Полученные данные используются при чтении лекций на кафедрах гистологии, цитологии, эмбриологии и нормальной физиологии Казанского государственного медицинского университета. Кроме того, результаты исследования внедрены в лечебный процесс Республиканского Клинического Онкологического Диспансера Министерства Здравоохранения Республики Татарстан (РКОД МЗ РТ). Структура н объем диссертации

Диссертация объемом 111 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 145 названий, из них 25 отечественных и 120 иностранных авторов. Диссертация содержит 34 рисунка и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Опыты проводили на 310 беспородных белых крысах массой 180-200 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария в пластмассовых клетках с наполнителем при температуре 18-20°С, имели свободный доступ к пище и воде.

Для морфологического исследования также использовали образцы тканей человека:

1) биоптаты мышечной стенки нижней трети пищевода на 1-2 см выше кардиалыюго сфинктера 35 пациентов, страдавших ахалазией пищевода 3 степени с длительностью заболевания от 9 месяцев до 13 лет, взятые во время операции лапароскопической кардиомиотомии с фундопликацией по Геллеру/Дору во втором торакальном отделении РКОД МЗ РТ (опытная группа).

2) кусочки стенки пищевода 34 пациентов второго торакального отделения РКОД МЗ РТ, больных раком средней/нижней трети пищевода, не получавших

предоперационную лучевую терапию. Пациентам выполнили операцию траисхиатальную экстирпацию пищевода, после которой макропрепарат незамедлительно направлялся наг плановое гистологическое исследование в патологоанатомическое отделение РКОД МЗ РТ, во время которого вырезали кусочки здоровой стенки пищевода на протяжении всей толщи стенки размером 1x1см на значительном расстоянии от опухоли (контрольная группа).

У всех испытуемых после проведения разъяснительной беседы было получено письменное добровольное согласие на участие в исследовании, которое проведено с разрешения Этического Комитета Республики Татарстан (выписка из протокола Бюро №1 от 13 января 2009г.). Моделирование ахалазии пищевода на крысах

Исходя из данных зарубежной литературы первая серия крыс была прооперирована согласно стандартной, опубликованной ранее методике (Goto S., Grosfeld J.L., 1989, Febronio L.H. et al., 1997). Учитывая высокую послеоперационную летальность, в дальнейшем животные были подвергнуты модифицированной операции экспериментальной ахалазии. Все хирургические манипуляции с животными проводили под уретановым наркозом (600 мг/кг внутрибрюшинно). В асептических условиях выполняли верхнюю срединную лаларотомию и осуществляли доступ к брюшной части пищевода. Под брюшную часть пищевода подкпадывали протектор (отрезок из плотного полиэтилена 4x1.5 см.), затем осуществляли аппликацию на выделенную часть пищевода марлевой турунды, смоченной 0,2% раствором бензалкония хлорида - (БХ), (Sigma, CIIIA) в течение 30 минут. Необходимо отметить, что БХ является синтетическим анионовым детергентом, обладающим неспсцифическим механизмом действия, приводящим к гибели нейронов (PrimorN., 1986).

За этот промежуток времени турунду дважды по мере высыхания капельно смачивали БХ из инсулинового шприца. Затем брюшную полость зашивали непрерывным обвивным швом. Контрольную группу («ложно-оперированную») составили животные, которым при прочих одинаковых условиях раствор БХ был заменен на физиологический раствор. Интактную группу составили животные, которым не проводилась хирургическая операция. Для анализа течения ЭА производился контроль массы животных при помощи ежедневного взвешивания на

лабораторных весах (МЕРА ВМ-2/6, Россия), начиная со дня операции и до 20-х суток послеоперационного периода. На 21-е сутки после операции крысам под уретановым наркозом бООмг/кг выполнили верхнюю срединную лапаротомию и измерили давление в нижней трети пищевода и НПС с помощью двухмиллиметрового датчика, состоящего из эластического резинового шарика и эпидурального катетера, который соединен с манометром.

Гистологические и иммуногистохимические исследования Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, обезвоживали и заключали в парафин по стандартной методике. Срезы с парафиновых блоков выполняли серийно на ротационном микротоме Leica RM 2125 RT, (Германия), толщиной 3-5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимического анализа по локализации Р2У]>2>4-рецепторов, а также белков S100 и виментина использовали моноклонапыше антитела (разведеиие 1:100, Sigma) (табл. 1) и LSAB-kit (DAKO).

Таблица 1

Антитела, использованные в иммуногистохимическом исследовании

Антитело Производитель Разведение

Р2Угрецептор Sigma (США) 1:100

Р2У2-рецептор Sigma (США) 1:100

Р2У4-рецептор Sigma (США) 1:100

Белок S100 DAKO (Дания) 1:100

Виментин DAKO (Дания) 1:80

Миографическое исследование

Эксперименты по исследованию сократимости пищевода проводили на установке Power Lab, оборудованной датчиками силы MLT 050/D (AD Instruments, США). У крыс под наркозом иссекали нижнюю треть пищевода вместе с кардиальной частью желудка Далее из области НПС выделяли циркулярную полоску, а из нижней трети пищевода - продольную полоску длиной 7-8 мм и диаметром 2-4 мм. В течение препаровки и всего эксперимента препараты пищевода находились в перфузиониом растворе следующего состава (в мМ): NaCl -125, К.С1 - ¿.¿, CaCi2 -¿, MgSü4 - i, NaH2P04 - 1.25, NaHC03 - 25, глюкоза -11. Перед экспериментом раствор аэрировали

карбогеном в течение часа. pH раствора поддерживали в пределах 7.3-7.4, а температуру на уровне 20°С. Препараты пищевода фиксировали вертикально одним концом к тензометрическому датчику, другим - к неподвижному штативу, а затем погружали в отдельные резервуары объемом 20 мл, куда подавался перфузионный раствор и карбоген. Сокращения полосок пищевода вызывали электрической стимуляцией с частотой 1 имп/мин, амплитудой сигнала 10 В, продолжительностью стимула 50 мс. После погружения препаратов в резервуары следовал период приработки в течение 40-60 минут, в ходе которого мышечным полоскам постепенно придавалось оптимальное натяжение. Для исследования роли Р2У-рецепторов использовали следующие препараты: РС2 - антагонист P2Y24A] ¡.п-реиепторов, PPADS - антагонист P2Yii4>i3-peqenTopoB, АТФ - агонист P2YiД4 п 12.ц-рецепторов, УТФ - агонист Р2У2Д611 -рецепторов. Все использованиые вещества - производства Sigma-Aldrich (США). Эффекты препаратов на сократительную активность оценивался через 60 минут от момента подачи в экспериментальную ванночку, концентрация -10"4 М.

Обработка и статистический анализ данных

Толщину волокон циркулярного и продольного мышечных слоев пищевода крыс контрольной и ахалазийной групп оценивали на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилин-эозином. Толщину вычисляли при помощи программы ImagePro как расстояние между противолежащими краями мышечного волокна. Регистрация сократительных ответов полосок пищевода и обработка полученных результатов проводилась с помощью программы Chart 5.55 (AD Instruments, США). Результаты исследования подвергались статистической обработке на персональном компьютере с использованием программных комплексов Origin 7.5. Все результаты представлены в виде М±т, где М - среднее значение, т - стандартная ошибка. Достоверность различий между средними величинами оценивалась с использованием ¿-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сравнительное изучение экспрессии РгУ^-рецепторов в пищеводе человека в норме и при ахалазни

Иммуногистохимические исследования Р2У1-рсцспторов в контрольной

и

группе показали, что позитивная реакция локализуется во всех слоях клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия. Позитивная иммуногистохимическая реакция определяется в клетках, предположительно, в фибробластах подслизистого и шванновских клетках межмышечного сплетений, а также в нервных волокнах в толще мышечной стенки. Локализация Р2Угрецспторов наблюдается в единичных клетках (фибробластах) подслизистого и шванновских клетках межмышечного слоев, в многослойном плоском эпителии, а также в волокнах внутреннего мышечного слоя стенки пищевода. Р2У4-рецепторы локализуются в многослойном плоском неороговевающем эпителии, в клетках подслизистого сплетения, во внутреннем и наружном мышечных слоях стенки пищевода По данным зарубежных авторов в подслизистом сплетении органов ЖКТ присутствуют фибробласты, в которых экспрессируются P2Yi ¿-рецепторы (Furuya К., 2005). Учитывая эти данные, следует предположить, что в подслизистом слое пищевода человека исследованные нами пуринорецепторы локализуются именно в фибробластах. Мы предполагаем, что зафиксированное окрашивание в межмышечном сплетении пищевода локализуется в шванновских клетках на основании сравнительного анализа иммуногистохимических результатов по экспрессии белка S100 и Р2У-рецепторов в стенке пищевода контрольной группы: S100, как и P2Y-рецепторы экспрессируются в нервных волокнах, а также в клетках округлой и колечкообразной формы преимущественно межмышечного сплетения, по структуре идентичных шванновским. Также, по данным мировой литературы P2Y-рецепторы преимущественно локализуются в нейронах, шванновских клетках и клетках Кахаля межмышечного сплетения органов ЖКТ (Giaroni С. et al., 2002, Van Nassauw L„ 2006, Gallego D„ 2008).

Нами выявлена зависимость между изменением экспрессии Р2У-рецепторов и видом лечения, которое получали больные с ахалазией. Так, у больных, не получавших какого-либо лечения до оперативного вмешательства, а также у пациентов, прошедших процедуру бужирования (пневмокардиодилатацию), на различных участках биоптата наблюдается яркая позитивная реакция к P2Yi-рецепторам во множественных толстых мышечных пучках и единичных тонких волокнистых структурах, которые могут являться дегенерировавшими нервными волокнами (остаточными бюнгнеровскими лентами). У больных, получавших до

операции лечение ботулотоксином типа А (БТА), также наблюдается позитивная реакция в бюнгнеровских лентах, но в меньшей степени. Этот факт уменьшения экспрессии Р2у~1 -рецепторов можно объяснить тем, что мышечные волокна парализованы БТА и изначально находятся в расслабленном состоянии, поэтому адаптационный механизм к хроническому спазму выражен слабее.

Исследования Р2У2-рецепторов в пищеводе больных с ахалазией, прошедших процедуру бужирования и не получавших лечения до операции, показали, что в обоих случаях позитивная иммуногистохимическая реакция локализуется в волокнистых структурах (предположительно, в фиброзно-соединительных прослойках) рядом с ГМК и в пучках мышечных волокон. Следует предположить, что ГМК пищевода этих пациентов способны сокращаться. Усиление экспрессии Р2У) 2-рецепторов в пищеводе может являться адаптационным механизмом ткани в ответ на длительный спазм и механическую травму.

Исследования Р2У4-рецепторов в пищеводе больных с ахалазией показали, что наблюдается негативная реакция в пищеводах больных, получавших и не получавших лечение до операции. Таким образом, экспрессия Р2У124 -рецепторов широко представлена в стенке пищевода человека контрольной группы. Морфофункцнональный анализ модели экспериментальной ахалазии у крыс

ЭА пищевода у крыс с клинической и морфологической точки зрения характеризуется: 1) снижением массы тела крыс с ЭА к 20 суткам до 71.6±1.8 % от значений, полученных до операции (п=9, р<0,05); 2) повышенным давлением (гипертопусом) в области НПС и нижней трети пищевода на 14% (п==5, р<0.05) и 12% (п=5, р<0.05) при сравнении с контролем, соответственно; 3) пролиферацией и гиперплазией клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия; 4) значительной гипертрофией (в 4 раза) продольных и циркулярных мышечных волокон НПС и нижней трети пищевода; 5) исчезновением экспрессии белка Б100 в подслизистом нервном сплетении и регенерацией тонких волокнистых структур с формированием бюнгнеровских лент в межмышечном нервном сплетении; б) разрастанием фиброзно-соединительной ткани в стенке пищевода. Таким образом, морфологическая картина пищевода при ЭА у крысы коррелирует с таковой при АП у человека, что подтверждает адекватность исследованной нами модели заболевания.

Сократительная активность пищевода крысы в норме и при экспериментальной ахалаши

В экспериментах на интактных крысах было выявлено два типа сократительных ответов пищевода на электрический стимул - быстрый и следующий за ним медленный ответ (рис. 1Б). Амплитуда быстрого ответа, как для НПС, так и нижней трети пищевода, была достоверно больше в сравнении с медленным (р<0.05). В случае НПС медленные сократительные ответы наблюдались в 92.3% случаев, а быстрые - лишь в 38.5% экспериментов (п=13). Таким образом, для НПС более характерны медленные ответы (рис. 1А), поэтому в дальнейшем только они были подвергнуты анализу. В 7.7% случаев наблюдались спонтанные сократительные ответы (рис. 1В), по форме сходные с медленными, электрически вызванными сокращениями. Для нижней трети пищевода были характерны двухфазные сократительные ответы, состоящие из быстрой (присутствовала в 100% случаев) и медленной (присутствовала в 92.3% случаев) фаз. Спонтанная активность нижней трети пищевода была выявлена значительно чаще в сравнении с НПС - она наблюдалась в 46.2% случаев. Двухфазпосгь электрически вызванной сократительной активности пищевода может быть объяснена сокращением ГМК под действием электрического стимула (прямое раздражение) и в ответ на выделение медиатора из нервных окончаний (непрямое раздражение).

На модели ЭА характер сократительной активности пищевода значительно изменялся: быстрые сократительные ответы НПС наблюдались чаще (46.2% экспериментов), а медленные - реже (69.2%, п=13), однако амплитуда сокращений достоверно не отличалась в сравнении с иптактными животными (р<0.05). В 15.4% случаев наблюдались спонтанные медленные сократительные ответы, что больше в сравнении с данными, полученными на интактных крысах. Для нижней трети пищевода были характерны, как и в норме, двухфазные сократительные ответы. Однако частота встречаемости как быстрых, так и медленных ответов, была снижена в сравнении с нормой - до 92.3% и 76.9% соответственно.

в

_10.021

1 мин

Рис. 1. Сократительная активность пищевода ннтастнок крысы

На графиках А и Б представлена механомиографическая запись электрически вызванных сократительных ответов НПС и нижней трети пищевода интактных крыс, соответственно (усреднения по 20 реализациям). Стрелками указаны моменты нанесения электрических стимулов (ЭС). На графике В показан пример спонтанной сократительной активности нижней трети пищевода интактных крыс: общая длительность окна - 9 минут; частота активности - 3.2 мин"'. Данные отдельных экспериментов.

Амплитуда быстрого ответа была достоверно выше в сравнении с данными, полученными на интактных крысах (р<0.05), тогда как амплитуда медленного ответа не отличалась (р>0.05). Спонтанная активность нижней трети пищевода при ахалазии была меньше по амплитуде и встречалась значительно реже в сравнении с контрольными показателями - лишь в 30.8% экспериментов.

Таким образом, мы впервые выявили характер нарушений сократительной активности пищевода на модели АП. При ЭА в случае НПС в сравнении с нормой чаще встречались быстрые вызванные ответы и спонтанная активность, что может объясняться растормаживанием ГМК вследствие дегенерации тормозных нейронов пищевода. Снижение частоты встречаемости медленных вызванных ответов может, по всей видимости, быть связано с нейромедиаторным дефицитом в результате дегенерации нейронов (Та1са1шЫ Т., 2003), а также с повышенным тонусом НПС при АП.

Сравнительное изучение экспрессии Р2У1Д4-рецепторов в стенке пищевода крыс контрольной группы и при экспериментальной ахалазии

Иммуногистохимические исследования Р2Угрецепторов в контрольной группе крыс показали, что яркая позитивная реакция наблюдается в многослойном плоском неороговевающем эпителии, а также в волокнах циркулярного мышечного слоя. Р2У2-рецепторы локализуются в многослойном плоском неороговевающем эпителии, нервных волокнах межмышечиого нервного сплетения, продолыюм мышечном слое стенки пищевода Р2У4-рецепторы локализуются в многослойном плоском неороговевающем эпителии пищевода, клетках, предположительно, фибробластах подслизистого и шванновских клетках межмышечного нервных сплетений пищевода, в циркулярных и продольных мышечных волокнах. Иммуногистохимические исследования Р2У]-рецепторов у крыс с ЭА показали, что сохраняется позитивная реакция в мышечных волокнах внутреннего (циркулярного слоя) и в многослойном плоском эпителии. Исследования Р2У2-рецепторов у крыс с ЭА выявили, что позитивная иммуногистохимическая реакция локализуется, в отличие от контрольной группы, в циркулярных мышечных волокнах и исчезает в многослойном плоском неороговевающем эпителии. Изучение Р2У4-рецепторов у крыс опытной группы показало, что экспрессия данного типа пуринорецепторов отсутствует во всех слоях многослойного плоского неороговевающего эпителия и не

наблюдается в гладкомышечных волокнах циркулярного и продольного слоев. Сопоставляя результаты, полученные по локализации P2Yi 2,4-рецепторов в пищеводе человека и крыс в контроле и при ахалазии наблюдается схожая картина по локализации указанных типов Р2У-рецепторов.

Роль Р2У-рецснторов в регуляции сократительной активности пищевода в норме и при экспериментальной ахалазии

В целях изучения участия Р2У12|4-рецепторов в регуляции сократительной активности пищевода использовали ряд наиболее распространенных антагонистов и агонистов Р2У-рецепторов. В норме, в случае НПС, неспецифический блокатор P2Y-рецепторов РС2 приводил к увеличению амплитуды медленного ответа до 325.3±35.8% от исходной величины (п=4, р<0.05). Более специфический блокатор PPADS оказывал сходное, но гораздо менее выраженное влияние - увеличивал амплитуду сокращений до 125.1±10.3% от исходной (п=4), (рис. 2).

Активаторы пуринорецепторов АТФ и УТФ не оказывали достоверного влияния на амплитуду медленных сократительных ответов (р>0.05).

Полученные нами данные об эффектах Р2У-антагонистов свидетельствуют о наличии Р2У-опосредованной тонической активности тормозных нейронов, ингибирующих в норме сократительную активность НПС. Сопоставляя эффекты различных агонистов и антагонистов пуринорецепторов, можно говорить о наибольшем участии Р2У2- Р2У4- и Р2Уб-рецепторов в регуляции тонуса НПС, а также об отсутствии существенного вклада со стороны Р2Х-рецепторов.

При ЭА в случае НПС, неспецифический антагонист Р2У-рецепторов РС2 достоверно не влиял на амплитуду медленного ответа (п=4, р>0.05). Более специфический блокатор Р2У-рецепторов PPADS вызывал снижение амплитуды медленных ответов до 75.7±9.5 % от начального значения (п=4, р<0.05), (рис. 2). Таким образом, при ЭА эффекты Р2У-антагонистов значительно видоизменялись -отсутствовали (РС2), либо имели противоположную направленность (PPADS).

Эффекты агонистов пуринорецепторов также значительно отличались. Как АТФ, так и УТФ в условиях ЭА приводили к усилению амплитуды медленных ответов НГ1С - до 139.4±18.4 и 170.3±28.1% от исходных значений соответственно (п=4, р<0.05).

Значительная модификация эффектов Р2У-агонистов и антагонистов при ЭА может объясняться отсутствием Р2У-опосредованного нейронапьного контроля в результате гибели тормозных нейронов. В этом случае будут преобладать эффекты на P2Y-peueirropbi непосредственно ГМК. Более выраженные влияния PPADS в сравнении с РС2 и УТФ в сравнении с АТФ свидетельствуют об увеличении экспрессии Р2У]-рецепторов, в отношении которых РС2 и АТФ неактивны. Это наблюдение подтверждается данными иммуногистохимии (неопубликованные данные). Примечателен тот факт, что АТФ и УТФ усиливают сократительную активность НПС при ЭА, но не в норме. Возможно, этот феномен оказывает вклад в патогенетический механизм развития АП.

Ö О

250200150100500

-50

Г I Норм4

ИШЭА

РС2

PPADS

АТФ

УТФ

Рис. 2. Влияние Р2\"-агонистов и антагонистов на сократительную активность нижнего пищеводного сфинктера.

Показаны изменения амплитуды медленных сократительных ответов НПС под действием Р2У-антагонистов (РС2, PPADS) и агонистов (АТФ, УТФ) через 60 минут от начала действия вещества в норме (белые столбцы) и при экспериментальной ахалазии (ЭА, серые столбцы)

18

Выводы

1. В нижней трети пищевода человека контрольной группы Р2Уи,4-рецепторы локализуются в клетках многослойного плоского неороговевающего эпителия, в фибробластах подслизисгого слоя, шванновских клетках и нервных волокнах межмышечного нервного сплетения, в продольных и циркулярных мышечных волокнах.

2. В биоптатах пищевода пациентов с ахалазией меняется локализация Р2У12,4-рецепторов: происходит исчезновение Р2У4-реце1Ггоров в мышечной стенке, сохраняется экспрессия Р2У]-рецепторов в мышечных волокнах и тонких волокнистых структурах (бюнгнеровских лентах), Р2Уг-рецепторов - в фиброзно-соедииительных прослойках между гладкомышечными волокнами.

3. В нижней трети стенки пищевода крысы в норме Р2У]д,4-рецепторы экспрессируготся в клетках многослойного плоского неороговевающего эпителия, в фибробластах подслизисгого нервного сплетения, в шванновских клетках и нервных волокнах межмышечного нервного сплетения, в продольных и циркулярных мышечных волокнах.

4. В нижней трети стенки пищевода крыс с экспериментальной ахалазией меняется локализация Р2У-рецепторов: Р2Уг-рецепторы локализуются в волокнах циркулярного мышечного слоя и исчезают в многослойном плоском эпителии и в продольном мышечном слое, полностью отсутствует экспрессия Р2У4-рецепторов во всех гистологических структурах.

5. Морфологическая картина нижней трети пищевода крыс с экспериментальной ахалазией соответствует таковой при ахалазии у человека и характеризуется: 1) пролиферацией клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия с гиперплазией до 15 слоев; 2) гипертрофией циркулярных и продольных мышечных волокон нижней трети пищевода; 3) отсутствием экспрессии белка 8100 в подслизистом нервном сплетении и ее наличием в бюнгнеровских лентах в межмышечном нервном сплетении; 4) значительным увеличением экспрессии виментина между мышечными волокнами и в подслизистом слое по сравнению с контрольной группой.

6. В миографических исследованиях сократительной активности нижнего пищеводного сфинктера в норме выявлено два типа сократительных ответов -

быстрый и следующий за ним медленный ответ (время нарастания 4.77±1.03 с, время полурасслабления - 4.81±0.88 с). Медленные сократительные ответы наблюдались в 2.4 раза чаще в сравнении с быстрыми. При экспериментальной ахалазии частота встречаемости быстрых вызванных ответов увеличивалась (46.2% экспериментов), а медленных - уменьшалась (69.2%).

7. В миографических исследованиях сократительной активности нижней трети пищевода в контроле выявлены двухфазные сократительные ответы, состоящие из быстрой и медленной фаз. В отличие от нижнего пищеводного сфинктера, быстрая фаза присутствовала в 100% случаев (время нарастания - 0.27±0.02 е., время расслабления - 0.3±0.03 е.), а медленная фаза - в 92.3% случаев (время нарастания -3.42±0.43 е., время полурасслабления - 4.94±0.9 е.). Спонтанная активность нижней трети пищевода наблюдалась в 7 раз чаще в сравнении с нижним пищеводным сфинктером. При экспериментальной ахалазии частота встречаемости как быстрых (в 92.3% экспериментов) так и медленных (в 76.9% экспериментов) ответов была снижена в сравнении с контролем. Спонтанная активность была меньше по амплитуде и встречалась значительно реже в сравнении с контрольными показателями.

8. В контрольных условиях блокирование метаботропных Р2У-рецепторов под действием PPADS или РС2 приводило к увеличению амплитуды медленных сократительных ответов нижнего пищеводного сфинктера крысы - до 325.3±35.8% и 125.1±Ю.З% от исходных значений, соответственно. Эффекты активаторов P2Y-рецепторов АТФ и УТФ не оказывали достоверного влияния на амплитуду медленных сократительных ответов.

9. В условиях экспериментальной ахалазии эффекты агонистов и антагонистов P2Y-рецепторов на амплитуду медленных ответов нижнего пищеводного сфинктера значительно видоизменялись в сравнении с контролем: PPADS вызывал ее снижение до 75.7±9.5 % от исходного значения, РС2 не оказывал достоверного влияния, АТФ и УТФ приводили к увеличению амплитуды - до 139.4±18.4 и 170.3±28.1% огг исходных величин, соответственно.

10. Эффекты как агонистов, так и антагонистов P2Y-peuemopoB не оказывали достоверного влияния на быстрые и медленные сократительные ответы нижней трети пищевода

Практические рекомендации

Рекомендовать внедрение в практику патологоанатомических отделений диагностические мероприятия в виде иммуногистохимической оценки экспрессии P2Y12,«-рецепторов в биоптатах стенки пищевода больных ахалазией с целью дальнейшего подбора и коррекции лечения пациентов с данным заболеванием при помощи лекарственных препаратов с пуринергическим механизмом действия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вклад Р2У-рецепторов в регуляцию сократительной активности пищевода in vivo и in vitro / А. Г. Сабиров [и др.] // Биология - наука XXI века: тез. докл. 12-ой междунар. школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2008. - С. 149150.

2. Влияние Р2У-рсцепторов на моторику пищевода / А. Г. Сабиров [и др.] // Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний: тез. докл. Всерос. конф. «Научное наследие академика Л. А. Орбели». - СПб., 2008. - С. 143-144.

3. Модификация метода экспериментальной ахалазии у крыс и анализ его эффективности / А. Г. Сабиров [и др.] // Казанский медицинский журнал. -2009. - Т. 90, №2. - С. 282-284.

4. Морфофункциональный анализ экспериментальной модели ахалазии пищевода у крыс / А. Г. Сабиров [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 148, №4. - С. 452-456.

5. Применение препарата «Ксимедон» в лечении экспериментальной ахалазии у крыс / А. Г. Сабиров [и др.] // Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ: тез. докл. Рос. конф., посвящ. 75-летию проф. И. А. Студенцовой. - Казань, 2008. -С. 46-47.

6. Пуринергическая регуляция сократительной активности пищевода в норме и в условиях экспериментальной ахалазии / М. А. Мухамедьяров [и др.] // Молодые ученые в медицине: тез. докл. XIV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Казань, 2010. - С. 287.

7. Пуринэргический контроль сократительной активности пищевода в норме и в модели ахалазии у крыс / М. Л. Мухамедьяров [и др.] // Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний: тез. докл. Всерос. конф. «Научное наследие академика Л. А. Орбели». - СПб., 2008. - С. 106-107.

8. Развитие экспериментальной ахалазии пищевода под влиянием производного пиримидина ксимедона / А. Г. Сабиров [и др.] // Актуальные проблемы патофизиологии: тез. докл. XV межгородской конф. молодых ученых. - СПб., 2009.-С. 95-96.

9. Сабиров А. Г. Пуринергическая регуляция сократительной активности пищевода в норме и в модели ахалазии / А. Г. Сабиров // Молодые ученые в медицине: тез. докл. XIV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Казань, 29-30 апр. 2009 г. / науч. ред.: В. А. Анохин. - Казань, 2009. - С. 174.

10. Диагностика и лечение ахалазии кардии: учеб. пособие для врачей / [Е- И. Сигал и др.]. - Казань: [б.и.]. - 44 с.

Список сокращений

АП - ахалазия пищевода

АТФ - аденозии 5'-трифосфорная кислота

БТА - ботулотоксин типа А

БХ - бензалкония хлорид

ГМК - гладкомышечные клетки

НПС - нижний пищеводный сфинктер

РКОД МЗ РТ - Республиканский Клинический Онкологический Диспансер

Министерства Здравоохранения Республики Татарстан

РС2 - реактив синий 2

УТФ - уридин-5'трифосфорная кислота

ЭА - экспериментальная ахалазия

Р2У - метаботропные пуринорецепторы

Р2Х - ионотропные рецепторы

РРАБ8 - пиридоксальфосфат-6-азафепил-2',4'-дисульфоновая кислота

Подписано в печать 30.07.10г. Форм. бум. 60x80 1/16. Печ. л.1.

Тираж 110. Заказ №312. Отпечатано с готового оригинал - макета в ООО «Весгфалика» г. Казань, ул. Б. Красная, 67. Тел.: 236-62-72; 260-38-41

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Сабиров, Алексей Германович

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность темы.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.3. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:.

1.4. Научная новизна.

1.5. Научно-практическая ценность.

1.6. Личный вклад диссертанта.

1.7. Достоверность полученных данных.

1.8. Апробация работы.

1.9. Реализация результатов исследования.

1.10. Структура и объем диссертации.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Р2У-рецепторы: классификация, функции, клиническое значение.

2.2. Морфофункциональная организация пищевода.

2.2.1. Краткая гистологическая характеристика пищевода.

2.2.2. Нижний пищеводный сфинктер.

2.2.3. Иннервация пищевода.

2.3. Физиология акта глотания.

2.4. Ахалазия пищевода.

2.4.1. Общие сведения.

2.4.2. Морфофункциональные изменения в стенке пищевода человека при ахалазии.

2.4.3. Этиология заболевания.

2.4.4. Основные методы лечения ахалазии пищевода.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Объекты исследования.

3.2. Моделирование ахалазии пищевода на крысах.

3.3. Гистологические исследования.

3.4. Миографическое исследование пищевода.

3.5. Обработка и статистический анализ данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Сравнительное изучение экспрессии Р2У] ¿¿-рецепторов в пищеводе человека в норме и при ахалазии.

4.2. Морфофункциональный анализ модели экспериментальной ахалазии у крыс.

4.2.1. Течение экспериментальной ахалазии у крыс.

4.2.2. Морфологические изменения в стенке пищевода крыс с экспериментальной ахалазией.

4.2.3. Сократительная активность пищевода крысы в норме и при экспериментальной ахалазии.

4.3. Сравнительное изучение экспрессии Р2У1 ¿¿-рецепторов в стенке пищевода крыс контрольной группы и при экспериментальной ахалазии

4.4. Роль Р2У-рецепторов в регуляции сократительной активности пищевода в норме и при экспериментальной ахалазии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфофункциональная оценка роли P2Y-рецепторов в пищеводе при ахалазии"

1.1. Актуальность темы

Изучение роли метаботропных Р2У-рецепторов в регуляции физиологических функций организма является актуальной проблемой современной медицины [7]. Экспрессия Р2У-рецепторов выявлена на плазматической мембране практически каждой клетки организма млекопитающих, и они участвуют во всех ключевых клеточных процессах [8, 48].

Для нужд клинической медицины активно исследуют участие различных подтипов Р2У-рецепторов в регуляции сократительной активности мышц. В экспериментах на препаратах ушка правого предсердия человека активация Р2У-рецепторов вызывает снижение амплитуды сокращений, а их блокирование - обратный эффект [14]. Показано, что активация Р2У-рецепторов пиримидиновым нуклеотидом УТФ вызывает расслабление гладкомышечных клеток пещеристого тела [26] и толстой кишки [78].

Необходимо отметить, что отсутствуют сведения о роли Р2У-рецепторов в регуляции сократительной активности пищевода. Вместе с тем, модуляция работы Р2У-рецепторов представляется перспективным подходом в коррекции нарушений моторики пищевода, наблюдающихся при ахалазии -одного из наиболее часто встречающихся заболеваний пищевода. Среди всех функциональных нарушений пищевода ахалазия составляет свыше 31% [43, 9]. Этиология заболевания неизвестна [28]. В основе патогенеза лежит повышение тонуса нижнего пищеводного сфинктера (НПС) и нарушение перистальтики пищевода вследствие дегенерации тормозных нейронов межмышечного (ауэрбаховского) нервного сплетения, которые отвечают за релаксацию гладкой мускулатуры НПС во время акта глотания [109]. В результате этого нарушается прохождение пищи из пищевода в желудок, что приводит к истощению пациента и дилатации его пищевода [66]. Опасность этого заболевания заключается в высоком риске развития плоскоклеточного рака и аденокарциномы пищевода на фоне ахалазии [120]. Несмотря на широкий спектр используемых методов лечения АП, результаты часто неэффективны и имеют ряд серьезных осложнений [46, 88].

Отсутствие данных об экспрессии Р2У-рецепторов в стенке пищевода, о роли пуринергических механизмов в регуляции сократительной функции пищевода в норме и при патологии пищевода делает данное исследование актуальным. Кроме того, ответ на поставленные вопросы позволит в дальнейшем значительно продвинуться в понимании роли Р2У-рецепторов в регуляции физиологических функций и развитии заболеваний желудочно-кишечного тракта, открыть новые возможности в медикаментозной терапии при помощи препаратов с пуринергическим механизмом действия.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Сабиров, Алексей Германович

6. ВЫВОДЫ

1. В нижней трети пищевода человека контрольной группы Р2У1)2,4-рецепторы локализуются в клетках многослойного плоского неороговевающего эпителия, в фибробластах подслизистого слоя, шванновских клетках и нервных волокнах межмышечного нервного сплетения, в продольных и циркулярных мышечных волокнах.

2. В биоптатах пищевода пациентов с ахалазией меняется локализация Р2У1 ¿¿-рецепторов: происходит исчезновение Р2У4-рецепторов в мышечной стенке, сохраняется экспрессия Р2У1-рецепторов в мышечных волокнах и тонких волокнистых структурах (бюнгнеровских лентах), Р2У2-рецепторов -в фиброзно-соединительных прослойках между гладкомышечными волокнами.

3. В нижней трети стенки пищевода крысы в норме Р2У1>2,4-рецепторы экспрессируются в клетках многослойного плоского неороговевающего эпителия, в фибробластах подслизистого нервного сплетения, в шванновских клетках и нервных волокнах межмышечного нервного сплетения, в продольных и циркулярных мышечных волокнах.

4. В нижней трети стенки пищевода крыс с экспериментальной ахалазией меняется локализация Р2У-рецепторов: Р2У2-рецепторы локализуются в волокнах циркулярного мышечного слоя и исчезают в многослойном плоском эпителии и в продольном мышечном слое, полностью отсутствует экспрессия Р2У4-рецепторов во всех гистологических структурах.

5. Морфологическая картина нижней трети пищевода крыс с экспериментальной ахалазией соответствует таковой при ахалазии у человека и характеризуется: 1) пролиферацией клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия с гиперплазией до 15 слоев; 2) гипертрофией циркулярных и продольных мышечных волокон нижней трети пищевода; 3) отсутствием экспрессии белка ЭКЮ в подслизистом нервном сплетении и ее наличием в бюнгнеровских лентах в межмышечном нервном сплетении; 4) значительным увеличением экспрессии виментина между мышечными волокнами и в подслизистом слое по сравнению с контрольной группой.

6. В миографических исследованиях сократительной активности нижнего пищеводного сфинктера в норме выявлено два типа сократительных ответов

- быстрый и следующий за ним медленный ответ (время нарастания 4.77±1.03 с, время полурасслабления - 4.81±0.88 с). Медленные сократительные ответы наблюдались в 2.4 раза чаще в сравнении с быстрыми. При экспериментальной ахалазии частота встречаемости быстрых вызванных ответов увеличивалась (46.2% экспериментов), а медленных -уменьшалась (69.2%).

7. В миографических исследованиях сократительной активности нижней трети пищевода в контроле выявлены двухфазные сократительные ответы, состоящие из быстрой и медленной фаз. В отличие от нижнего пищеводного сфинктера, быстрая фаза присутствовала в 100% случаев (время нарастания -0.27±0.02 е., время расслабления - 0.3±0.03 е.), а медленная фаза - в 92.3% случаев (время нарастания - 3.42±0.43 е., время полурасслабления - 4.94±0.9 е.). Спонтанная активность нижней трети пищевода наблюдалась в 7 раз чаще в сравнении с нижним пищеводным сфинктером. При экспериментальной ахалазии частота встречаемости как быстрых (в 92.3% экспериментов) так и медленных (в 76.9% экспериментов) ответов была снижена в сравнении с контролем. Спонтанная активность была меньше по амплитуде и встречалась значительно реже в сравнении с контрольными показателями.

8. В контрольных условиях блокирование метаботропных Р2У-рецепторов под действием РРАОЭ или РС2 приводило к увеличению амплитуды медленных сократительных ответов нижнего пищеводного сфинктера крысы

- до 325.3±35.8% и 125.1±10.3% от исходных значений, соответственно.

Эффекты активаторов Р2У-рецепторов АТФ и УТФ не оказывали достоверного влияния на амплитуду медленных сократительных ответов.

9. В условиях экспериментальной ахалазии эффекты агонистов и антагонистов Р2У-рецепторов на амплитуду медленных ответов нижнего пищеводного сфинктера значительно видоизменялись в сравнении с контролем: РРАОБ вызывал ее снижение до 75.7±9.5 % от исходного значения, РС2 не оказывал достоверного влияния, АТФ и УТФ приводили к увеличению амплитуды - до 139.4±18.4 и 170.3±28.1% от исходных величин, соответственно.

10. Эффекты как агонистов, так и антагонистов Р2У-рецепторов не оказывали достоверного влияния на быстрые и медленные сократительные ответы нижней трети пищевода.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендовать внедрение в практику патологоанатомических отделений диагностические мероприятия в виде иммуногистохимической оценки экспрессии Р2У12,4-рецепторов в биоптатах стенки пищевода больных ахалазией с целью дальнейшего подбора и коррекции лечения пациентов с данным заболеванием при помощи лекарственных препаратов с пуринергическим механизмом действия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Сабиров, Алексей Германович, Казань

1. Берзина А. А. Случай кардиоспазма у девочки 12 лет / А. А. Берзина // Врачебная газета. 1938. - №1. - С. 62.

2. Василенко В. X. Ахалазия кардии / В. X. Василенко, Т. А. Суворова, А. Л. Гребенев. М.: Медицина, 1976. - 280 с.

3. Василенко В. X. Болезни пищевода / В. X. Василенко, А. Л. Гребенев, М. М. Сальман. М., 1971. - 407 с.

4. Гайваронский И. В. Нормальная анатомия человека: учебник для мед. вузов: в 2 т. / И. В. Гайваронский. 3-е изд., испр. - СПб.: СпецЛит, 2003.-Т. 2.-424 с.

5. Гребенев А. Л. Болезни пищевода / А. Л. Гребенев, С. С. Катаев, Р. Н. Гуревич // Клиническая медицина. 1982. - №12. - С. 60-66.

6. Зиганшин А. У. Р2-рецепторы: перспективная мишень для будущих лекарств / А. У. Зиганшин, Л. Е. Зиганшина. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. -136 с.

7. Зиганшин А. У. Р2-рецепторы: теоретические предпосылки клинического воздействия / А. У. Зиганшин, Л. Е. Зиганшина, Дж. Бернсток // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2002. - Т. 134, №10.- С. 365-370.

8. Зиганшин А. У. Роль рецепторов АТФ (Р2-рецепторов) в нервной системе / А. У. Зиганшин // Неврологический вестник. 2005. - Т. 37, №1-2. -С. 45-53.

9. Ивашкин В. Т. Болезни пищевода / В. Т. Ивашкин, А. С. Трухманов.- М.: Триада-Х, 2000. 179 с.

10. Лурия Р. А. Болезни пищевода и желудка. 3-е изд., значит, доп. / Р. А. Лурия. - М.-Л., 1941. - 480 с.

11. Моргенштерн А. 3. Ахалазия пищевода / А. 3. Моргенштерн. М.: Медицина, 1968. - 160 с.

12. Осипкова Т. А. Рентгендиагностика кардиоспазма: дис. . канд. мед. наук / Т. А. Осипкова. М., 1953. - 180 с.

13. Роднаев Э. Р. Кардиоспазм и идиопатическое расширение пищевода / Э. Р. Роднаев // Труды 1 Московского медицинского института. М.-Л., 1935.-Т. 1, №1. - С. 135-152.

14. Рынков А. В. Влияние температуры на пуринорецептор-опосредуемые сократительные ответы гладкой и сердечной мышц: автореф. дис. . канд. мед. наук: 14.00.25, 14.00.16 / А. В. Рынков; Казан, гос. мед. ун-т.-Казань, 2007.- 19 с.

15. Савиных А. Г. Эзофагогастростомия при лечении кардиоспазма / А. Г. Савиных // Анналы института им. Склифосовского. 1942. - Т. 3, №1. - С. 82-111.

16. Сократительная активность большой подкожной вены бедра человека, опосредованная Р2-рецепторами / А. У. Зиганшин и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. - Т. 135, №1. -С. 29-32.

17. Сотников В. И. Эндоскопическое лечение кардиоспазма / В. И. Сотников, Т. П. Пинчук, Т. А. Логинова // Клиническая медицина. 1996. -Т. 74, №4. - С. 65.

18. Тамулявичюте Д. И. Болезни пищевода и кардии / Д. И. Тамулявичюте, А. М. Витенас. М.: Медицина, 1986. - 224 с.

19. Федоров С. П. Клинические лекции по хирургии кардиоспазма / С. П. Федоров. М.-Л., 1923.- 168 с.

20. Францкевич А. В. Кардиоспазм: этиопатогенез, лечение / А. В. Францкевич // Здравоохранение Белоруссии. 1977. - №7. - С. 62-64.

21. Черноусов А. Ф. Лечение кардиоспазма и ахалазии кардии пневмокардиодилатацией / А. Ф. Черноусов, А. Н. Гаджиев, А. Л. Шестаков // Анналы хирургии. 2000. - №3. - С. 50-53.

22. Черноусов А. Ф. Хирургическое лечение нервно-мышечных заболеваний пищевода / А. Ф. Черноусов, В. А. Андрианов, А. П. Гаджиев // Анналы хирургии. 2001. - №1. - С. 35-38.

23. Шулутко А. М. Эндоскопическая хирургия в лечении ахалазии пищевода / А. М. Шулутко, А. Ю. Моисеев, А. М. Казарян // Эндоскопическая хирургия. 2001. - №5. - С. 16-21.

24. Эльдарханов В. Ю. Особенности клинических проявлений кардиоспазма в различных стадиях / В. Ю. Эльдарханов // Терапевтический архив. 1997. - №2. - С. 22-25.

25. A functional study of purinergic signalling in the normal and pathological rabbit corpus cavernosum / R. C. Calvert et al. // BJU Int. 2008. -Vol. 101, N8.-P. 1043-1047.

26. Abbracchio M. P. Purinoceptors: are there families of P2X and P2Y purinoceptors? / M. P. Abbracchio, G. Burnstock // Pharmacol. Ther. — 1994. -Vol. 64, N3.-P. 445-475.

27. Achalasia / L. Dughera et al. // Minerva Gastroenterol. Dietol. 2008. -Vol. 54, N3.-P. 277-285.

28. Achalasia and thyroid disease / M. H. Emami et al. // World J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 13, N4. - P. 594-599.

29. Achalasia cardia in mother and son / A. Sachdev et al. // Indian J. Gastroenterol. 2004. - Vol. 23, N3. - P. 109.

30. Achalasia is not associated with measles or known herpes and human papilloma viruses / S. Birgisson et al. // Dig. Dis. Sci. 1997. - Vol. 42, N2. - P. 300-306.

31. Achalasia of the esophagus: Pathologic and etiologic considerations / R. R. Cassella et al. // Ann. Surg. 1964. - Vol. 160, N. - P. 474-485.

32. Achalasia treatment in the elderly: is botulinum toxin injection the best option? / N. Zarate et al. // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2002. - Vol. 14, N3. -P. 285-290.

33. Achalasia. A morphologic study of 42 resected specimens / J. R. Goldblum et al. // Am. J. Surg. Pathol. 1994. - Vol. 18, N4. - P. 327-337.

34. Al Yassin T. M. Fine structure of squamous epitheilum and submucosal glands of human oesophagus / T. M. Al Yassin, P. G. Toner // J. Anat. 1977. -Vol. 123, Pt. 3. - P. 705-721.

35. Allescher H. D. Medical treatment of esophageal motility disorders / H. D. Allescher, W. J. Ravich // Dysphagia. 1993. - Vol. 8, N2. - P. 125-134.

36. Alterations in purinoceptor expression in human long saphenous vein during varicose disease / M. J. Metcalfe et al. // Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. -2007. Vol. 33, N2. - P. 239-250.

37. Anatomic dilatation of the cardia and competence of the lower esophageal sphincter: a clinical and experimental study / O. Korn et al. // J. Gastrointest. Surg. 2000. - Vol. 4, N4. - P. 398-406.

38. Annese V. Botulinum toxin in long-term therapy for achalasia / V. Annese, V. D'Onofrio, A. Andriulli // Ann. Intern. Med. 1998. - Vol. 128, N8. -P. 696.

39. Architecture and function of the gastroesophageal barrier in the piglet / Y. Vicente et al. . // Dig. Dis. Sci. 2001. - Vol. 46, N9. - P. 1899-1908.

40. Are human herpes viruses or measles virus associated with esophageal achalasia? / H. Niwamoto et al. // Dig. Dis. Sci. 1995. - Vol. 40, N4. - P. 859864.

41. Bell R. C. Laparoscopic closure of esophageal perforation following pneumatic dilation for achalasia / R. C. Bell // Surg. Endosc. 1997. - Vol. 11, N5. -P. 476-478.

42. Belsey R. Functional disease of the esophagus / R. Belsey // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1966.-Vol. 52, N2.-P. 164-188.

43. Blackshaw L. A. New insights in the neural regulation of the lower oesophageal sphincter / L. A. Blackshaw // Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. -2008.- Vol. 12. Suppl. 1. - P. 33-39.

44. Boeckxstaens G. E. The lower oesophageal sphincter / G. E. Boeckxstaens // Neurogastroenterol. Motil. 2005. - Vol. 17, N1. - P. 13-21.

45. Bruley des Varannes S. Current trends in the management of achalasia / S. Bruley des Varannes, C. Scarpignato // Dig. Liver Dis. 2001. - Vol. 33, N3. -P. 266-277.

46. Burnstock G. Cell Membrane Receptors for Drugs and Hormones: a multidisciplinary approach / G. Burnstock; eds: R. W. Straub, L. Bolis. Y.: Raven Press, 1978. - 206 p.

47. Burnstock G. Purinergic signalling: past, present and future / G. Burnstock // Braz. J. Med. Biol. Res. 2009. - Vol. 42, N1. - P. 3-8.

48. Christensen J. Three layers of the opossum stomach: responses to nerve stimulation / J. Christensen, E. I. Torres // Gastroenterology. 1975. - Vol. 69, N3.-P. 641-648.

49. Clinicopathological studies of esophageal carcinoma in achalasia: analyses of carcinogenesis using histological and immunohistochemical procedures / O. Chino et al. // Anticancer Res. 2000. - Vol. 20, N5C. - P. 3717-3722.

50. Cloned and transfected P2Y4 receptors: characterization of a suramin and PPADS-insensitive response to UTP / S.J. Charlton et al. // Br. J. Pharmacol.- 1996. Vol. 119, N7. - P. 1301-1303.

51. Co-expression of vimentin and cytokeratins in parietal endoderm cells of early mouse embryo / E. B. Lane et al. // Nature. 1983. - Vol. 303, N5919. - P. 701-704.

52. De Nardi F. G. The normal esophagus / F. G. De Nardi, R. H. Riddel // Am. J. N. Surg. Pathol. 1991. - Vol. 56, N15. - P. 296-309.

53. Delapava S. Ectopic gastric mucosa of the esophagus. A study on histogenesis / S. Delapava, J. W. Pickren, R. H. Adler // N. Y. State J. Med. -1964.-Vol. 64, N.15 P. 1831-1835.

54. Diamant N. E. Neuromuscular mechanisms of primary peristalsis / N. E. Diamant // Am. J. Med. 1997. - Vol. 103, N5. - P. 40-43.

55. Duffy P. E. The laparoscopic reoperation of failed Heller myotomy / P. E. Duffy, Z. T. Awad, C. J. Filipi // Surg. Endosc. 2003. - Vol. 17, N7. - P. 1046-1049.

56. Ebbesson S. O. Quantitative studies of superior cervical sympathetic ganglia in variety of primates including man. II Neuronal packing density./ S. O. Ebbesson // J. Morphol.- 1968.-Vol. 124, N2.-P. 181-186.

57. Enteric co-innervation of striated muscle fibres in human oesophagus / B. Kallmunzer et al. // Neurogastroenterol. Motil. 2008. - Vol. 20, N6. - P. 597-610.

58. Esophageal achalasia: is the herpes simplex virus really innocent? / I. Castagliuolo et al. // J. Gastrointest. Surg. 2004. - Vol. 8, N1. - P. 24-30.

59. Esophageal body length, lower esophageal sphincter length, position and pressure in health and disease / R. E. Marshall et al. // Dis. Esophagus. 1999. -Vol. 12, N4.-P. 297-302.

60. Etzel E. May the disease complex that includes megaesophagus (cardiospasm), mega-colon and megaureter be caused by chronic vitamin B deficiency / E. Etzel // American J. Med. Science. 1942. - Vol. 203, N2. - P. 87.

61. Expression of the P2Y1 nucleotide receptor in chick muscle: its functional role in the regulation of acetylcholinesterase and acetylcholine receptor / R. C. Choi et al. // J. Neurosci. 2001. - Vol. 21, N23. - P. 9224-9234.

62. Family occurrence of achalasia / V. Annese et al. // J. Clin. Gastroenterol. 1995. - Vol. 20, N4. - P. 329-330.

63. Family occurrence of achalasia and diffuse spasm of the oesophagus / T. Frieling et al. // Gut. 1988. -Vol. 29, N11.-P. 1595-1602.

64. Farrokhi F. Idiopathic (primary) achalasia / F. Farrokhi, M. F. Vaezi // Orphanet. J. Rare Dis. 2007. - Vol. 2, N38. - P. 38.

65. Friedland G. W. Comparative anatomy of feline and canine gastric sling fibers. Analogy to human anatomy / G. W. Friedland, S. Kohatsu, K. Lewin // Am. J. Dig. Dis. 1971. - Vol. 16, N6. — P.493-507.

66. Functional anatomy of the gastroesophageal junction / J. F. Delattre et al. // Surg. Clin. North Am. 2000. - Vol. 80, N1. - P. 241-260.

67. Furuya K. Characteristics of subepithelial fibroblasts as a mechano-sensor in the intestine: cell-shape-dependent ATP release and P2Y1 signaling / K. Furuya, M. Sokabe, S. Furuya // J. Cell. Sci. 2005. - Vol. 118, Pt. 15. - P. 32893304.

68. Gender effect on clinical features of achalasia: a prospective study / J. Mikaeli et al. // BMC Gastroenterol. 2006. - Vol. 6, N1. - P. 12.

69. Goto S. The effect of a neurotoxin (benzalkonium chloride) on the lower esophagus / S. Goto, J. L. Grosfeld // J. Surg. Res. 1989. - Vol. 47, N2. - P. 117119.

70. Gromotka R. The vegetative system and diseases of the digestive organs / R. Gromotka, N. Henning // J. Psychiatr. Neurol. 1966. - Bd. 4, N. 130 - P. 1697.

71. Heller myotomy is superior to dilatation for the treatment of early achalasia / M. Anselmino et al. // Arch. Surg. 1997. - Vol. 132, N3. - P. 233240.

72. Heller's myotomy with fiindoplication by endoscopic surgery / J. Garcia-Alvarez et al. // Cir. Cir. 2007. - Vol. 75, N4. - P. 263-269.

73. Hypotensive effect of UDP on intraocular pressure in rabbits / A. Markovskaya et al. // Eur. J. Pharmacol. 2008. - Vol. 579, N1-3. - P. 93-97.

74. Identification of G alpha 11 as the phospholipase C-activating G-protein of turkey erythrocytes / D. H. Maurice et al. // Biochem. J. 1993. - Vol. 290, Pt. 3.-P. 765-770.

75. Inhibitory purinergic P2 receptor characterisation in rat distal colon / K. Van Crombruggen et al. // Neuropharmacology. 2007. - Vol. 53, N2. - P. 257271.

76. Inoue K. Purinergic systems in microglia / K. Inoue // Cell. Mol. Life Sci. 2008. - Vol. 65, N19. - P. 3074-3080.

77. Iobagiu S. Achalasia in a 91-year-old patient / S. Iobagiu // J. Gastrointestin. Liver Dis. 2008. - Vol. 17, N4. - P. 484-486.

78. Irwin D. A. The anatomy of auerbach's plexus / D. A. Irwin // Am. J. Anat. 1931. - Vol. 49, N54. - P. 141-166.

79. Is there a set of histologic changes that are invariably reflux associated? / K. Takubo et al. // Arch. Pathol. Lab. Med. 2005. - Vol. 129, N2. - P. 159-163.

80. Janig W. The sympathetic nervous system in pain / W. Janig // Eur. J. Anaesthesiol. Suppl. 1995. - Vol. 10, N3. - P. 53-60.

81. Kahrilas P. J. Maximizing outcome of extraesophageal reflux disease / P. J. Kahrilas // Am. J. Manag. Care. 2000. - Vol. 6, N16. - P. 876-882.

82. Kennedy C. How should P2X purinoceptors be classified pharmacologically? / C. Kennedy, P. Leff // Trends Pharmacol. Sci. 1995. - Vol. 16, N5.-P. 168-174.

83. Khan T. A. Effect of change of position on the function of the canine lower esophageal sphincter / T. A. Khan, J. S. Crispin, J. F. Lind // Gastroenterology. 1974. - Vol. 67, N5. - P. 957-964.

84. King B. F. Involvement of P2Y1 and P2Y11 purinoceptors in parasympathetic inhibition of colonic smooth muscle / B. F. King, A. Townsend-Nicholson // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008. - Vol. 324, N3. - P. 1055-1063.

85. Laparoscopic re-operation for failed Heller myotomy / A. Iqbal et al. // Dis. Esophagus. 2006. - Vol. 19, N3. - P. 193-199.

86. Lymphocytes and Langerhans cells in the human oesophageal epithelium / K. Geboes et al. // Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopathol. 1983. - Vol. 401, Nl.-P. 45-55.

87. Mayberry J. F. Epidemiology and demographics of achalasia / J. F. Mayberry // Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am. 2001. - Vol. 11, N2. t- P. 235248.

88. Mearin F. Impaired gastric relaxation in patients with achalasia / F. Mearin, M. Papo, J. R. Malagelada // Gut. 1995. - Vol. 36, N3. - P. 363-368.

89. Medical treatment of esophageal achalasia. Double-blind crossover study with oral nifedipine, verapamil, and placebo / G. Triadafllopoulos et al. // Dig. Dis. Sci.- 1991.-Vol. 36, N3.-P. 260-267.

90. Megaesophagus in rats / L. H. Febronio et al. // Res. Exp. Med. (Berl.).- 1997. Bd. 197, N2. - S. 109-115.

91. Melanocytes and melanosis of the oesophagus in Japanese subjects-analysis of factors effecting their increase / K. Ohashi et al. // Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopathol. 1990. - Vol. 417, N2. - P. 137-143.

92. Merkel cells in the human oesophagus / J. L. Harmse et al. // J. Pathol.- 1999.-Vol. 189, N2.-P. 176-179.

93. Mittal R. K. The esophagogastric junction / R. K. Mittal, D. H. Balaban, N. Engl // J. Med. 1997. - Vol. 336, N13. - P. 924-932.

94. Modelling the P2Y purinoceptor using rhodopsin as template / A. M. Van Rhee et al. // Drug Des. Discov. 1995. - Vol. 13, N2. - P. 133-154.

95. Moll R. Intermediate filaments and their interaction with membranes. The desmosome-cytokeratin filament complex and epithelial differentiation / R. Moll, W. W. Franke // Pathol. Res. Pract. 1982. - Vol. 175, N2-3. - P. 146-161.

96. Monnig P. J. Familial achalasia in children / P. J. Monnig // Ann. Thorac. Surg. 1990. - Vol. 49, N6. - P. 1019-1022.

97. Moore B. W. Chemistry and biology of the S-100 protein / B. W. Moore // Scand. J. Immunol. Suppl. 1982. - Vol. 9, N55. - P. 53-74.

98. Nomenclature and classification of purinoceptors / B. B. Fredholm et al. // Pharmacol. Rev. 1994. - Vol. 46, N2. - P. 143-156.

99. Non-surgical treatment of achalasia / J. Taclc et al. // Hepatogastroenterology. 1991. - Vol. 38, N6. - P. 493-497.

100. O1 Donnell A. M. Deficiency of purinergic P2Y receptors in aganglionic intestine in Hirschsprung's disease / A. M. O' Donnell, P. Puri // Pediatr. Surg. Int. 2008. - Vol. 24, N1. - P. 77-80.

101. Oesophagitis is common in patients with achalasia after pneumatic dilatation / I. Leeuwenburgh et al. // Aliment. Pharmacol. Ther. 2006. - Vol. 23, N8.-P. 1197-1203.

102. P2 receptors in the murine gastrointestinal tract / C. Giaroni et al. // Neuropharmacology. 2002. - Vol. 43, N8. - P. 1313-1323.

103. P2Y1 receptors mediate inhibitory neuromuscular transmission and enteric neuronal activation in small intestine / D. Gallego et al. // Neurogastroenterol. Motil. 2008. - Vol. 20, N2. - P. 159-168.

104. Palmer E. D. The esophagus and its diseases / E. D. Palmer. New York: Hoeber, 1952. - 553 p.

105. Park W. Etiology and pathogenesis of achalasia: the current understanding / W. Park, M. F. Vaezi // Am. J. Gastroenterol. 2005. - Vol. 100, N6.-P. 1404-1414.

106. Paterson W. G. The lower esophageal sphincter / W. G. Paterson, Y. Zhang // Clin. Invest. Med. 2002. - Vol. 25, N1-2. - P. 47-53.

107. Patients with achalasia lack nitric oxide synthase in the gastroesophageal junction / F. Mearin et al. // Eur. J. Clin. Invest. 1993. - Vol. 23, N11.-P. 724-728.

108. Pianet I. ADP and, indirectly, ATP are potent inhibitors of cAMP production in intact isoproterenol-stimulated C6 glioma cells / I. Pianet, M. Merle, J. Labouesse // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. - Vol. 163, N2. - P. 1150-1157.

109. Plasticity of interstitial cells of Cajal: a study of mouse colon / M. S. Faussone-Pellegrini et al. // Cell. Tissue Res. 2006. - Vol. 325, N2. - P. 211217.

110. Preiksaitis H. G. Cholinergic responses in the cat lower esophageal sphincter show regional variation / H. G. Preiksaitis, L. Tremblay, N. E. Diamant // Gastroenterology. 1994. - Vol. 106, N2. - P. 381-388.

111. Preliminary report of an association between measles virus and achalasia / D. B. Jones et al. // J. Clin. Pathol. 1983. - Vol. 36, N6. - P. 655-657.

112. Primary esophageal motor disorders in childhood, genuine achalasia excluded / E. Devouge et al. // Arch. Pediatr. 2002. - Vol. 9, N7. - P. 664-670.

113. Primor N. Action on ileal smooth muscle of synthetic detergents and pardaxin / N. Primor // Gen. Pharmacol. 1986. - Vol. 17, N4. - P. 413-418.

114. Purification of an A1F4- and G-protein beta gamma-subunit-regulated phospholipase C-activating protein / G. L. Waldo et al. // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266, N22. - P. 14217-14225.

115. Region-specific distribution of the P2Y4 receptor in enteric glial cells and interstitial cells of Cajal within the guinea-pig gastrointestinal tract / L. Van Nassauw et al. // Auton. Neurosci. 2006. - Vol. 126-127, N30. - P. 299-306.

116. Risk of Esophageal Adenocarcinoma in Achalasia Patients, a Retrospective Cohort Study in Sweden / K. Zendehdel et al. // Am. J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 132, N21. - P. 324-356.

117. Robertson C. S. Varicella-zoster virus DNA in the oesophageal myenteric plexus in achalasia / C. S. Robertson, B. A. Martin, M. Atkinson // Gut.- 1993. Vol. 34, N3. - P. 299-302.

118. S-100 protein in human chondrocytes / K. Stefansson et al. // Nature. -1982. Vol. 295, N5844. - P. 63-64.

119. S-100 protein remains a practical marker for melanocytic and other tumours / A. J. Cochran et al. // Melanoma Res. 1993. - Vol. 3, N5. - P. 325330.

120. Scott A. B. Botulinum toxin injection into extraocular muscles as an alternative to strabismus surgery / A. B. Scott // Ophthalmology. 1980. - Vol. 87, N10.-P. 1044-1049.

121. Sebaceous glands in the esophagus / U. Thalheimer et al. // Endoscopy. -2008.-Vol. 40, N2.-P. 57.

122. Seery J. P. Asymmetric stem-cell divisions define the architecture of human oesophageal epithelium / J. P. Seery, F. M. Watt // Curr. Biol. 2000. -Vol. 10, N22.-P. 1447-1450.

123. Selective antagonism by PPADS at P2X-purinoceptors in rabbit isolated blood vessels / A. U. Ziganshin et al. // Br. J. Pharmacol. 1994. - Vol. 111, N3.- P. 923-929.

124. Singaram C. Neuropathology of the gut / C. Singaram // Semin. Neurol. -1996. Vol. 16, N3. - P. 227-234.

125. Spassova J. M. On the afferent innervation of the esophagus in man / J. M. Spassova // Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 1959. - Vol. 65, N67. - P. 327-346.

126. Stein D. T. Achalasia in monozygotic twins / D. T. Stein, C. M. Knauer // Dig. Dis. Sci. 1982. - Vol. 27, N7. - P. 636-640.

127. Takahashi T. Pathophysiological significance of neuronal nitric oxide synthase in the gastrointestinal tract / T. Takahashi // J. Gastroenterol. 2003. -Vol. 38, N5.-P. 421-430.

128. Takaki M. Gut pacemaker cells: the interstitial cells of Cajal (ICC) / M. Takaki // J. Smooth Muscle Res. 2003. - Vol. 39, N5. - P. 137-161.

129. Terris B. Structure and role of Langerhans' cells in the human oesophageal epithelium / B. Terris, F. Potet // Digestion. — 1995. Vol. 56. -Suppl. 1.-P. 9-14.

130. The nature of the myenteric infiltrate in achalasia: an immunohistochemical analysis / S. B. Clark et al. // Am. J. Surg. Pathol. 2000. -Vol. 24, N8.-P. 1153-1158.

131. The P2Y purinoceptor in rat brain microvascular endothelial cells couple to inhibition of adenylate cyclase / T. E. Webb et al. // Br. J. Pharmacol. -1996. -Vol. 119, N7.-P. 1385-1392.

132. The pacemaker activity of interstitial cells of Cajal and gastric electrical activity / P. Camborova et al. // Physiol. Res. 2003. - Vol. 52, N3. - P. 275284.

133. The role of vagal visceral afferents in the control of nociception / W. Janig et al. // Prog. Brain Res. 2000. - Vol. 122, N43. - P. 273-287.

134. Transient lower esophageal sphincter relaxations and reflux: mechanistic analysis using concurrent fluoroscopy and high-resolution manometry / J. E. Pandolfino et al. // Gastroenterology. 2006. - Vol. 131, N6. - P. 1725-1733.

135. Ultrastructure of free-ending nerve fibres in oesophageal epithelium / E. M. Robles-Chillida et al. // J. Anat. 1981. - Vol. 133, Pt. 2. - P. 227-233.

136. Verkhratsky A. Purinoceptors on neuroglia / O. A. Krishtal, G. Burnstock // Mol. Neurobiol. 2009. - Vol. 39, N3. - P. 190-208.

137. Yamato S. Role of nitric oxide in lower esophageal sphincter relaxation to swallowing / S. Yamato, J. K. Saha, R. K. Goyal // Life Sci. 1992. - Vol. 50, N17.-P. 12631-272.

138. Yokochi C. Cytological study of human esophageal gland. Mucous or serous gland? / C. Yokochi, Y. Narita, A. Makino // Archivum Histologicum Japanicum. 1954. - N6. - P. 197-212.

139. Zhang Y. Nitric oxide contracts longitudinal smooth muscle of opossum oesophagus via excitation-contraction coupling / Y. Zhang, W. G. Paterson // J. Physiol.-2001.-Vol. 536, Pt. l.-P. 133-140.