Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам (НСБ). Получение, иммунохимический анализ, исследование гематоэнцефалического барьера

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам (НСБ). Получение, иммунохимический анализ, исследование гематоэнцефалического барьера"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

ГУРИНА

Ольга Ивановна

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКИМ АНТИГЕНАМ.

Получение, иммунохимический анализ, исследование проницаемости

гематоэнцефалического барьера. 03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

л

МОСКВА - 2005 г.

Работа выполнена в Государственном научном центре социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского

Научный консультант:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.П. Чехонин Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ашмарин И.П. Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Корочкин Л.И. Доктор медицинских наук, профессор Петрунин Д.Д. Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита состоится "__"_200_ г. в_часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.203.13 при Российском Университете Дружбы народов по адресу: 117198 Москва, ул Миклухо-Маклая, д.8, Медицинский факультет

С диссертацией можно ознакомиться в научно библиотеке Российского Университета Дружбы народов по адресу: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6

Автореферат разослан

200 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 212.203.13 канд.фарм.наук, доцент

j/wm

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Хорошо известно, что специфические свойства клеток нервной тканей в известной мере определяются структурой и функциями нейроспецифических белков (НСБ), посредством которых генетическая информация получает свое реальное воплощение [Березин В А, 1990;Чехопин ВП, 1989-2004, Edelman G.M, 1999, Engl, 1970-2000, Moore B.W, 1976-1982]. Несмотря на то, что за 40-летний период, появились сообщения о более чем 65 НСБ научное направление, связанное с их изучением, продолжает активно развиваться как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах [Eng L, 2000; Chekhonin VP, 2002, Sharp FR, 2002, Herrmann M., 2003; Ingebrigtsen Т., 2003; MarchiN, 2003; Sny-der-Ramos SA, 2003; Lamers К J, 2003; Verbeek M.M., 2003; Welzl H., 2003, Povlsen G К, 2003; Pineda J A , 2004; Bock E, 2004, KiryushkoD, 2004].

Основными методами идентификации НСБ, а также их качественного и количественного определения в биологических жидкостях и тканях являются методы иммунохимического анализа [Moore В W, 1982, Albrechsen М, Воск Е 1985, О 'Collagan J Р 1991, RovengrenL, 1994, Eng L, 2000, Чехонин В П, 2000, Ohta М, 2002, Ross G W, 2003, PetzoldA., 2004].

В этом аспекте, признавая роль поликлональных антител (AT), как инструмента обеспечившего и значительно расширившего концептуальное понимание механизмов функционирования клеток нервной ткани и нервной системы в целом, стало очевидным, что эффективность дальнейшего применения поликлональных AT ограничивается рядом недостатков, которых практически невозможно избежать как при исследовании спектра антигенов нервной ткани, так и при разработке методов диагностики и лечения. Даже иммунизация высо-коочищенными препаратами НСБ не может исключить присутствие в антисыворотках AT к антигенам, содержащихся в основном препарате в виде минорных примесей, не говоря об AT к различным эпитопам антигена [Drivsholm L , 1995; RosengrenLE, 1996, Sterk М, 1999; Eng L„ 2000; Chekhonin VP., 2002; Ross G.W., 2003, GurnettCA., 2003; Haghighi S„ 2004, PetzoldA., 2004].

Открытие в 1975 Kohler G и Milstein С. способа длительного культивирования Ig-секретируюших клеток, привело Гк созданиям даеэдМФГии получения

гибридом, способных продуцировать моноклоналъные AT, специфичные к одной антигенной детерминанте в неограниченных количествах Благодаря тщательному скринингу и отбору гибридомных клонов, участие моноклональных AT в перекрестных реакциях практически исключено, что объясняет высокую специфичность диагностических тест-систем на их основе, а также возможность их полноценной стандартизации.

Преимущества препаратов моноклональных AT перед поликлональными обусловлены, прежде всею, их уникальной гомогенностью и специфичностью Моноклоналъные AT, являясь продуктом одного клона гибридных клеток, абсолютно идентичны между собой и обладают способностью связывать только один эпитоп молекулы антигена, выявляя его в пикограммовых количествах. Очевидно, что эти свойства моноклональных AT окрывают новые перспективы не только в исследовании субмолекулярной структуры антигенов и эпитопов в частности, но и в разработке диагностических тест-систем [Price CP 1998, Laurino JP, 1999; Bock JL 2000], а также в создании диагностических и лекарственных препаратов направленного типа действия [von Mehren М, 1996, Ер-enetos A.A., 2001, Carter Р, 2001; Trikha М„ 2002; de Jong М, 2003].

Разработка способа получения моноклональных AT для каждого из НСБ, по сути дела, в каждом случае является самостоятельной научной проблемой, напрямую зависящей от природы антигена, его физико-химических свойств, клеточной локализации [St er к М, 1999; Ross G W, 2003; Haghighi S, 2004]. Невозможно использовать ранее известные методические подходы, применяемые в целях получения гомогенных препаратов одного НСБ, для выделения других НСБ, различающихся по химической структуре и свойствам [Eng L, 2000, Herrmann М., 2003, Ingebrigtsen Т., 2003, Lamers KJ„ 2003; Verbeek ММ, 2003, Wehl Н, 2003; Pineda J А., 2004; BockE, 2004].

Очевидно, что при видимом однообразии методических приемов получения гибридных клеток к тому и или иному антигену, получение моноклональных AT к конкретному НСБ является самостоятельной научной и биотехнологической задачей

С другой стороны, получение моноклональных AT к нейроспецифиче-скому белку по-новому формирует стратегии повышения его гомогенности ну-

тем очистки методами иммуноафинной хроматографии, анализа в биологических жидкостях, фундаментального и прикладного исследования субмолекулярной структуры и функций НСБ. Особый фундаментальный интерес представляет собой возможность создания банка моноклональных АТ для идентификации, биологического сравнения НСБ и стандартизации меюдов их детекции.

Очевидно, что разработка иммунохимических тест-систем анализа НСБ на основе соответствующих моноклональных АТ открывает перспективы изучения метаболизма НСБ в норме и при патологии, анализа функций гематоэн-цефалического барьера (ГЭБ) при заболеваниях, сопровождающихся нарушением его резистентности, а также роли анти-НСБ-АТ в патогенезе нервно-психических заболеваний.

Самостоятельное значение могут иметь научные направления, исследующие возможности применения моноклональных анти-НСБ-АТ как транспортирующих векторов для доставки диагностических и лекарственных препаратов к клеткам мишеням нервной ткани.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ:

Получить моноклональные анти-НСБ-антитела, исследовать функции ге-матоэнцефалического барьера с помощью иммунохимических тест-систем, разработанных на их основе, и оценить перспективы создания иммунолипосо-мальных систем транспорта к клеткам-мишеням нервной ткани.

В связи с этим были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Разработать способы получения препаратов йРАР, ^Е и МВР, степень гомогенности которых удовлетворяет критериям чистоты белковых препаратов, необходимых для получения моноклональных антител и создания иммунофер-ментных систем анализа;

2. Разработать способы получения моноклональных АТ к вРАР, и МВР;

3. Разработать и апробировать в клинико-лабораторной практике иммунофер-ментные тест-системы анализа ОБ АР, ИБЕ и МВР в биологических жидкостях на основе моноклональных АТ, пригодные для практического здравоохранения;

4. Провести иммуноферментный скрининг ОРАР, №Е и МВР в биологических жидкостях больных нервно-психическими, нейроонкологическими и со-

матическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемое™ ГЭБ;

5 Провести сравнительный анализ иммуноферментных тест-систем определения исследуемых НСБ на основе поликлональных и моноклональных АТ; 6. Изучшь клеточную специфичность СРАР, КЯЕ и МБР на срезах препаратов нервной ткани и культурах нейронов, астроцитов и олигодендроглиоцитов с применением тест-систем на основе моноклональных АТ;

7 Исследовать проницаемость ГЭБ в направлении кровь-мозг для меченных I123 моноклональных анти-НСБ-АТ в норме и при экспериментальной ишемии головного мозга крыс.

8 Исследовать перспективы применения моноклональных анти-НСБ-АТ как векторов для направленного транспорта лекарственных и диагностических препаратов к клеткам-мишеням нервной ткани.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Разработанные способы очистки препаратов нейроспецифических белков (СРАР, ИБЕ, МВР), позволили получить моноклональные АТ и создать имму-ноферментные и иммуногистохимические системы анализа НСБ в тканях и биологических жидкостях человека и животных

Модифицированная технология получения гибридных клеток на основе В-лимфоцитов селезенки мышей, предварительно иммунизированных очищенными препаратами НСБ (СРАР, №Е, МВР) и клетками миеломной линии 8р2/0 позволила получить моноклональные АТ к этим антигенам.

Впервые создан отечественный банк гомогенных препаратов нейроспецифических антигенов (СРАР, МЯЕ, МВР) и моноклональных АТ к ним, а также разработана стратегия их стандартизации

Впервые разработаны иммуноферментные тест-системы анализа СРАР, №!Е, МВР в биологических жидкостях и тканевых экстрактах на основе моноклональных АТ и проведена их стандартизация.

Впервые разработаны иммуногистохимические тест-системы, позволяющие высокоселективно визуализировать клетки нервной ткани, синтезирующие НСБ (СРАР, МВР).

Впервые осуществлена клинико-лабораторная апробация разработанных

иммуноферментных тест-систем анализа НСБ на основе моноклональных анш-НСБ-АТ в биологическом материале больных, в патогенезе заболеваний которых имеет место нарушение функций ГЭБ, а также проведен сравнительный анализ эффективности применения диагностических тест-систем на основе по-ликлональных и моноклональных АТ.

Впервые в эксперименте выявлен феномен прорыва через ГЭБ и селективного накопления в ткани мозга меченных I125 анти-НСБ-АТ после их внутривенного введения при индуцированном гипоксически-ишемическом поражении головного мозга крыс. Подобный феномен не наблюдался в случае инъекции соответствующих препаратов животным с нормальным ГЭБ.

Впервые разработана технология создания ГТЭГилированных иммунолипо-сомальных контейнеров направленного типа действия на основе моноклональных АТ к ОРАР и способных селективно захватываться лишь экспонированными на мембране антигенами соответствующих клеток-мишеней.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. 1 Создан отечественный банк стандартных гомогенных препаратов ОРАР, ЫБЕ и МБР, степень гомогенности которых позволяет получать гибридные клетки, продуцирующие моноклональные АТ к этим НСБ.

2. Разработана технология получения гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к ОРАР, №Е и МВР; проведена их стандартизация и создан отечественный банк гибридом, продуцирующих вышеуказанные моноклональные АТ.

3. Разработаны и внедрены в клинико-лабораторную практику иммунофер-ментные тест-системы анализа ОРАР, МЯЕ и МВР на основе моноклональных АТ к ним. Проведена апробация этих тест-систем в клинико-лабораторной практике для комплексного обследования больных, в патогенезе заболеваний которых имеет место нарушение функций ГЭБ. Выработаны рекомендации по применению диагностических тест-систем анализа нейроспецифических антигенов на основе моноклональных АТ в клинико-лабораторной практике.

4 Разработана технология получения ПЭГилированных иммунолипосомаль-ных контейнеров на основе моноклональных анти-НСБ-АТ, направленных к клеткам-мишеням нервной ткани.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ'

1. Разработанные способы очистки препаратов нейроспецифических белков (ОРАР, ЫвЕ и МБР), позволяют применять их для получения гибридных клеток продуцирующих соответствующие моноклональные АТ.

2. Модифицированная технология создания гибридных клеток на основе В-лимфоцитов селезенки мышей, предварительно иммунизированных очищенными препаратами НСБ (СБАР, ЫБЕ, МВР) и клеток миеломной линии 8р2/0, позволяет получать моноклональные АТ к этим антигенам.

3 Полученные препараты НСБ (ОРАР, ШЕ, МВР) и соответствующих мо-ноклональных АТ дают возможность разработать на их основе иммунофер-ментные и иммуногистохимические тест-системы анализа ОРАР, КБЕ и МВР, характеризующиеся общепринятыми стандартами параметров точности, воспроизводимости и надежности.

4. Иммуноферментный анализ НСБ на основе моноклональных АТ в сыворотке крови и ликворе, может быть применен для диагностики, мониторинга и контроля эффективности проводимой терапии больных нервными, психическими, онкологическими, инфекционными и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением функций ЕЭБ.

5. Дефинитивный гематоэнпефалический барьер непроницаем для препаратов меченных I125 анти-НСБ-АТ, введеных в кровоток. Еипоксически-ишемическое поражение головного мозга, индуцированное путем окклюзии ветви средней мозговой артерии, приводит к нарушению резистентности ГЭБ, сопровождающемуся феноменом прорыва и накопления в ткани мозга препаратов меченных I125 анти-НСБ-АТ. введеных в кровоток.

6. Разработанная технология получения ПЭЕилированных иммунолипосом на основе моноклональных анти-НСБ-АТ позволяет создавать микроконтейнеры направленного типа действия, способные селективно захватываться соответствующими антигенами мембран клеток-мишеней.

АПРОБАЦИЯ, ВНЕДРЕНИЕ, ПУБЛИКАЦИИ

Результаты диссертационной работы применяются в клинике нервных болезней Российского государственного медицинского университета и НИИ невролог ии РАМН. Различные аспекты диссертационной работы явились основа-

нием для планирования новых научных тем, продолжающих данное научное направление.

Основные положения были представлены и обсуждены на VIII International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems, Salt Lake City, Utah, February 1997; IH"rd European Meeting on glial cell function in health and disease, Greece, May 1998; 5 IBRO World Congress of Neuroscince, Jerusalem, Israel, 1999; IV European meeting on glial cell function in health and disease, Barcelona, may 2000; в материалах II Российского Конгресса по патофизиологии, Москва, 2000; XXII CINP Congress, Brussels, Belgium, July 2000; 3-rd International conference "Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs", Suzdal, May 2001; I Neurotoxicity meeting- mechanisms for neurodegenerative disorders, March 2001, Pucon, Chile; International Conference of Neurochemistry, September 2001, Yerevan; V European Meeting on glial cell function in health and disease, Rome, Italy, May 2002; II Российской конференции «Нейроиммунопатология», Москва, май 2002 г. на семинаре "Актуальные проблемы современной психиатрии", Томск, декабрь 2002 г., на заседаниях Проблемного Совета по биологическим основам психиатрии ГНЦССП им. В.П.СербскО! о, 2000-2003; VI IBRO World Congress of Neuroscince, July 10-15, 2003, Prague, Czech Republic; VI European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease Germany, Berlin, 2003.

По теме диссертации опубликовано 46 печатных работ, результаты диссертации включены в монографию «Иммунохимический анализ нейросдецифи-ческих антигенов» Москва, Медицина, 2000.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на_машинописных страницах; состоит из введения, 9 глав, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. В основных главах работы приведены данные обзора лишратуры, характеристика объекта, методов исследования, а также используемого материала, результаты собственных исследований и их обсуждение.

Диссертация иллюстрирована_рисунками и_таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнялась в период с 1996 г. по 2004 г. на базе лаборатории иммунохимии ГНЦССП им. В.П. Сербского.

Материалы и методы

Образцы дефинитивных органов и тканей человека получали из морга НИИ скорой помощи им Н.И.Склифосовского и судебно-медицинского морга № 6 ГУЗ г. Москвы в первые 6 часов после смерти.

Лабораторных животных (кролики, крысы, мыши) получали из Клиники лабораторных животных ГНЦССП им. В.П. Сербского.

Образцы сыворотки крови и ликвора больных были получены из клиник неврологии и детской неврологии, неонатологии, факультетской хирургии РГМУ, НИИ неврологии РАМН, Московского городского центра рассеянного склероза (11 ГКБ), отделения нейрохирур1 ии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, клинической психиатрической больницы № 1 им. H.A. Алексеева, областной клинической больницы № 1 г. Кемерово, отделений неврологии и нейрохирургии 2-й Областной клинической больницы г. Астрахань Образцы сыворотки крови доноров получали со станций переливания крови г. Москвы.

Образцы сыворотки крови и ликвора хранились при -70° С до момента проведения исследований.

Забор крови у кроликов проводили из краевой вены уха, у крыс при дека-питации, из бедренной или хвостовой вены Полученную из образцов крови животных сыворотку хранили до исследования при -70°С.

На различных стадиях получения высокоочищенных препаратов НСБ применяли методы препаративной белковой химии: фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хроматографию на DEAE-52 целлюлозе («Sigma-Aldrich», USA), гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе 4В («Sigma-Aldrich», USA), гель-фильтрацию TOYOPERL HW50 Fine TSK-Gel (Japan), биогеле A-0,5 («Bio-RAD», USA), сефакриле S-200 Superfine, сефадексах G-50, 100, 150, 200 («Sigma-Aldrich», USA), аффинную хроматографию - на конконавалин-А сефарозе («Pharmacia Biotech», Швеция), иммуноаффинную хроматографию с иммобилизованными на сефарозе 4В («Pharmacia Biotech», Швеция) НСБ или анти-НСБ-АТ, препаративный диск-электрофорез в полиакриламидном геле.

Для очистки GFAP от примесей сывороточного альбумина человека (ЧСА) применяли иммуноаффинную хроматографию на сефарозе 4В («Pharmacia Biotech», Швеция) с иммобилизованными анти-ЧСА-АТ.

Поликлональные анти-НСБ-АТ получали путем иммунизации кроликов очищенными препаратами изучаемых антигенов, применяя схему иммунизации, описанную Чехониным В П (1989)

Для получения моноклональных антител в работе были использованы самки мышей линии Babl/C в возрасте 2-6 месяцев.

Оценку степени чистоты получаемых препаратов НСБ, а также анализ AT к исследуемым белкам проводили с помощью различных модификаций имму-ноэлектрофореза; иммуноблотта, иммунодиффузионного анализа, иммунофер-ментного анализа, а также аналитического диск-электрофореза с додецил-сульфатом натрия и последующей окраской Кумасси G-250.

Очищенные препараты НСБ применяли для иммунизации кроликов с целью получения моноспецифических антисывороток и моноклональных AT.

Для получения гибридных клеток, продуцирующих моноклональные AT к НСБ (GFAP, NSE и МВР) применяли общепринятый протокол G Koler и С Milstein в нашей модификации. Моноклональные AT выделяли из асцитиче-ской жидкости с помощью иммунноаффинной хроматофафии на CNBr-сефарозе с иммобилизованными гомогенными препаратами соответствующих антигенов, согласно протоколу, предложенному Чехониным В П (1989)

Разрабо1Ку иммуноферментных тест-систем анализа НСБ и AT к ним проводили по методу Voller А (1976) в некоторой нашей модификации [Чехонин В П. и соавт, 1989-2002]. Конъюгацию антител с пероксидазой из хрена Vl-ro типа («Sigma-Aldrich», USA) проводили периодатным методом [Nakane Р и соавт., 1974].

Йодирование AT ,251 проводили хлорамидовым методом [Fraker Р, 1978]. Распределение 1251 меченных AT по органам и тканям экспериментальных животных оценивали путем сканирования соответствующих образцов в гамма-счетчике («1260 CompuGamma», LKB, Швеция).

Общий белок определяли при помощи бицинхониновой кислоты («BSA Protein Assay Reagent Kit», Pierce, USA) или по методу Bradford M (1976)

Количественный анализ ПСБ и соответствующих анти-НСБ-АТ в исследуемых образцах сыворотки крови и ликвора проводили методом «sandwich»-варианта иммуноферментного анализа [Voller А., 1976] в некоторой нашей модификации [Чехонин ВП и соавт, 1989-2002]. Определение оптимальных концентраций раствора AT для активации полистирольньгх планшет, а также оптимального разведения конъюгата AT с ферментом осуществлялось в каждом конкретном случае экспериментально. Стандартизацию разработанных имму-ноферментных тест-систем для определения НСБ и соответствующих анти-НСБ-АТ проводили в тестах надежности, точности, специфичности и воспроизводимости, используя критерии, адаптированные для иммуноферментного анализа В В Калашниковым (1986)

Препараты клеточных культур астроцитов и нейронов получали из ткани мозга эмбрионов крысы со сроком антенатального развития 13 дней по протоколу [Вагпеа А, 1999; Roberts J, 1999; Froes MM., 1999, Nakanishi К., 1999]\ препараты клеточных культур шванновских клеток получали из спи-нальных ганглиев плодов крысы со сроком гестации 16 дней по методу [Brookes J.P., 1979].

Иммуноцитологический и иммуногистохимический анализ НСБ проводили с использованием высокочувствительной иммунопероксидазной системы «ABC-Vectastain» («Vector Lab», USA). При окрашивании применяли протокол фирмы-изготовителя. Иммунофлюоресцентный анализ проводили, используя непрямой вариант по протоколу, предложенному Weller Т Н и Coons А.Н (1954).

Тестирование проводили на препаратах первичных культур астроцитов, нейронов и шванновских клеток, а также на срезах ткани головного мозга, печени, почки, легкого и сердца крысы. Перед забором образцов тканей органов, проводили перфузию сосудистого русла крыс 4% забуференным раствором па-раформальдегида. Образцы органов инкубировали в том же фиксаторе в течение суток, после чего приготавливали замороженные или парафиновые срезы. Замороженные срезы хранили при -20°С в антизамораживающем реактиве, состоящем из 30% этиленгликоля и 30% глицерина на 0,5 М натрий-фосфатном буфере (pH 7,4).

Приготовление ПЭГилированных липосом проводили по методу, предложеному Benzinger Р (2000) в нашей модификации. ПЭГилироваиные ли-поеомы с включенной в состав мембран флюоресцентной меткой Dil конъюги-ровали с моноклональными анти-СРАР-антителами малеимидно-сульфгидриль-иым методом rio DerksenJ. (1985).

При проведении эксперимента in vitro ПЭГилироваиные иммунолипосо-мы инкубировали с препаратами культуры эмбриональных астроцитов на протяжении 3, 6 и 9 часов.

Степень свя!ывания определялась по появлению специфического свечения, обусловленного индикатором Dil.

Статистический анализ проведен с помощью /-критерия Стьюдента, коэффициента корреляции Пирсона и U-критерия с использованием функции Фишера. Статистическая обработка результатов проведена при помощи программ «Prophet 5.0» и «Excel» из пакета приложений Microsoft Office ХР (Microsoft, США).

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение высокоочищенных препаратов НСБ и их характеристика

В соответствие с поставленной целью и задачами для увеличения степени иммунохимической чистоты и выхода конечного препарата были модифицированы общеизвестные способы выделения нейроспецифических антигенов GFAP, NSE и МВР (рисунки 1-3).

Препараты GFAP и NSE выделяли из постмортальной ткани головного мозга человека (не более 6 часов после смерти), МВР выделяли из препаратов спинного мозга быка, полученых не позднее 1 часа после гибели. Для получения высокоочищенных препаратов НСБ применяли сочетание солевого фракционирования, ионообменной, гидрофобной, аффинной хроматографии и гель-фильтрации, а так же препаративного диск-электрофореза в ПААГ. Реализация разработанных способов очистки препаратов исследуемых НСБ позволила получить препараты GFAP, NSE и МВР соответственно 97%, 96% и 95 % иммунохимической чистоты.

ГОМОГЕНАТ ТКАНИ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА

i

Первичная подготовка npenapaia

Водно-сочевая экстракция фракционирование сучьфатом амМинин

Ионообменная хроматография (DEAE-52 целлюлоза, «Sigma-Aldrich», США)

Отбира ш фракции э 7тирующиеся в диапазоне чинейного градиента концентрации NaCl от 0,25 до 0,40 М

Гидрофобная хромаю! рафия (Фенил-сефароза 4В, «Sigma-Aldrich», США)

Отбира чи фракции, эчюирующчеся в диапазоне чинейного градиента концентраций (NH4)2^04 от 0,78 М до 0 65 М

Аффинная хроматография (Соп-А-сефароза, «Pharmacia Biotech», Швеция)

Отбират фракции, не свяшвшиеся с носите leu

Гель-филы рация (сефадекс G-150, «Pharmacia Biotech», Швеция)

Отбират фракции, соответствующие мочеку-чярной массе 55 ± 10 кД

Препаративный диск-электрофорез (7,5 % ПААГ)

Отбирали фракцию, сооткетствующую лек-трофоретической подвижности al-гчобучинов

Иммуноаффинная хромато!рафия примесей сывороточного альбумина (CNBr-сефароза с иммобилизованными анти-ЧСА-анти телами)

i

;de.

1

[Фе1

i

n-A

i

кс С

i

иск-

i

*

GFAP

Рисунок I. Схема получения высокоочишеиного препарата GFAP.

Иммуиохимический анализ полученного препарата вРАР с коммерческими поликлопальными анти-ОРАР-антителами («Оако», США) продемонстрировал его полную иммунохимическую идентичность препарату ПРАР, применявшемуся для получения стандартных антисывороток («ГЭако». США) (рисунки 4А, 4В).

Сопоставление полученных нами препаратов моноклональных анти-СРЛР-АТ с антигенами дефинитивных тканей органов человека и сыворотки крови соматически здоровых доноров не выявило специфических реакций Им-муноферментный анализ моноклональных анти-ОРАР-антител с нейроспеци-фичсскими белками и антигенами миелина о^ВС, «2ОР, 8-100, Р0,

МОО, МБР, МАО, РЬР) так же не обнаружил специфического реагирования с эпитопами этих антигенов.

ГОМОГЕНАТ ТКАНИ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА ♦

Первичная подготовка препарата

; Водно-солевая экстракция, фракционирование сульфатом аммония

Ионообменная хроматография (DEAE-52 целлюлоза, «Sigma-Aldrich», США)

Т Отбирали фракции, элюирующиеся в диапазоне ^ линейного градиента концентрации NaCl от ▼ 0,15 до 0,22 М

Гидрофобная хроматография (Фенил-сефароза 4В, «Sigma-Aldrich», США)

♦ Отбирали фракции, элюирующиеся в диапазоне линейного градиента концентраций (NH^ßOt у от 0,78 М до 0 65 М

Гель-фильтрация (сефадекс G-150, «Pharmacia Biotech», Швеция)

; Отбирали фракции, соответствующие молекулярной массе 75 ± 10 кД

Изохроматофокусирование (РВЕ-гель, «Pharmacia Biotech», Швеция)

; Отбирали фракции, элюирующиеся в диапазоне концентраций pH от 4,6 до 5,3

NSE

Рисунок 2. Схема получения высокоочищеиного препарата NSE.

При иммуноблотт-анализе коммерческого препарата GFAP («Chemicon», США) с полученными нами моноклональными анти-GFAP-антителами, была выявлена характерная белковая зона, соответствующая молекулярной массе 50 ± 6,4 kD (рисунок 1 OA).

Иммунофлюоресцентный анализ культуры эмбриональных астроцитов в системе с полученными нами моноклональными анти-GF АР антителами позволил обнаружить специфическую флюоресценцию астроцитов, синтезирующих GFAP (рисунок 5).

Иммунохимический анализ полученного препарата NSE с коммерческими поликлональными («Dako», США) и моноклональными («Chemicon», США) анти-ЫБЕ-антителами продемонстрировал его полную иммунохимическую идентичность препарату NSE, применявшемуся для получения стандартных ан-

тисывороток («Dako», США) и моноклональных антител («Chemicon», США) (рисунки 6А, 6В).

ГОМОГЕНАТ ТКАНИ СПИННОГО МОЗГА БЫКА Первичная подготовка препарата

^ гомогенизация в дистиллированной воде

Делипидизация

Отбирали осадок после 3-кратного суспендиро-вания в хпороформ-метанольной смеси и 1-кратного суспендирования в ацетоне. Ресуспен-у зировали в дистиллированной воде

Кислотная экстракция

1 Доведение рИ суспензии до 3 0 при добавлении НС! до полного растворения, центрифугирование, отбор супернатанта

Ионообменная хроматография (CM-52-целлюлоэа, «Whatman», England)

I Отбирали фракцию, элюирующуюся стартовым X буфером

Гидрофобная хроматография (Фсиил-сефароза 4В, «Sigma-Aldrich», США)

1 Отбирали фракции, элюирующиеся в диапазоне линейного градиента концентраций (NH^iSOi от 0 8Мдо 0.6М

Гель-фильтрация (Toyopearl HW 50 Fine, Japan)

J Отбирали фракции, соответствующие молеку-X лярной массе 20,0 ±2,0 кД

МВР

Рисунок 3. Схема получения высокоочищенного препарата МВР.

Сопоставление полученных нами препаратов моноклональных анти-NSE-АТ с антигенами дефинитивных тканей органов человека и сыворотки крови соматически здоровых доноров не выявило специфических реакций,

Иммуноферментный анализ моноклональных анти-Ы8Е-антител с ней-роспецифическими белками и антигенами миелина (GFAP, cxiBG, a2BG, a2GP, S-100, Po, MOG, MBP, MAG, PLP) так же не обнаружил специфического связывания с эпитопами этих антигенов. Иммуноблотт-анализ коммерческою препарата NSE («Chemicon», США) с применением полученных нами моноклональ-ными анш-ЫБЕ-антител, позволил визуализировать белковую зону, соответствующую молекулярной массе 39,1 ±2,8 kD (рисунок 10В). 14

Рисунок 4А. Результаты днск-электрофоретичес-кого анализа выделенного препарата GFAP в 7,5% ПААГ с последующим иммунопроявлени-ем стандартной анти-СГАР-антисывороткой («Dako»).

а - диск-злекфофорефамма выделенною препарата GFAP в 7,5% 11ААГ,

b - иммуноэлекюфорефамма иммунопроявления препарата GFAP 10% моноспецифической an i нсывороткой

В

Рисунок 4В. Результаты иммуноблотт-анализа полученного препарата GFAP с иммунопроявлением ан-th-GFAP-aiiTHCbieopo i кой («Dako»).

1 Препарат GFAP фирмы «Chemicon»;

2 Препарат GFAP, полученный в соответствии с нашей модификацией

1 2

Рисунок 5. Результаты иммунофлюоресценшого анализа npenapaia культуры эмбриональных астроциюв с моноклональными aii in-GFAP-антнтелами D4.

1 картина световой микроскопии препарата культуры эмбриональных астроцитов крысы (х 100),

2 - картина иммунофлюоресцентной микроскопии препарата культуры эмбриональных астроцитов крысы (х 100). Препарат обработан моноклональными анти-GFAP-антителами D4 и конъюгатом антител к IgG мыши, меченных ФИТЦ ("Dako", USA),

3 - картина иммунофлюоресиентной микроскопии препарата культуры эмбриональных астроцитов крысы (х 100) Препарат обработан моноклональными антителами к NSE и конъюгатом антител к IgG мыши, меченных ФИТЦ ("Dako", USA) (отрицательный контроль).

Иммунофлюоресцентный анализ культуры эмбриональных нейронов с помощью полученных нами моноклональных анти-ЫБЕ-антител позволил об-

паружить специфическую флюоресценцию NSE-продупирующих клеток (рисунок 7).

В

Рисунок 6А. Резулыа1ы диск-электрофоретичес-кою анализа выделенного препарата \8Е в 7,5% ПААГ с последующим имчунопроявлениеч анти-^Е-антисывороткой («Рако», США)

а - диок-электрофореграмча выделенною препарата N88 в 7,5% ПААГ,

Ь - иммуноэлектофорефамма иммупопроявления препарата Ы8Ь 10% моноспецифической антисыворогкой

Рисунок 6В. Результаты имчуиоблотт-анализа полученного препарата 1М8Е с иммунопроявлением моноклинальными аши-1\8Е-АТ («СЬеппсоп», США).

1 - Препарат ^Е фирмы «СЬеписоп»,

2 Препарат К8Е, полученный в соответствии с нашей модификацией

Рисунок 7. Результаты иммунофлюореснентного анализа препарата культуры эмбриональных нейронов с чоноклональнычи анти-\ЧЕ-антителачи 5C4D12.

1 картина световой микроскопии препарата культуры эмбриональных нейронов крысы (х 100);

2 картина иммунофлюоресцентнои микроскопии препарата культуры )мбриональных нейронов крысы (V 100) Препарат обработан моноклональными анти-^Е-антителами 5C4D12 и конъюгатом антител к IgG мыши, меченных ФИТЦ ("Dako", USA),

1 картина иммунофлюореспентной микроскопии препарата кучыуры эмбриона'тьных нейронов крысы (х 100) Препарат обработан моноклональными антителами к GFAP и конъюгатом антител к IgG мыши, меченных ФИТЦ ("Dako", USA) (отрицательный контроль)^_

Иммуиохимический анализ полученного препарата МВР с коммерческими поликлональными («Dako», США) и моноклональными («RDI», США) анти-МВР-АТ продемонстрировал его полную иммунохимическую идентичность препарату МВР, применявшемуся для получения стандартных антисывороток («Dako», США) и моноклональных анти-МВР-АТ («RDI», США) (рисунок 8А, 8В).

Сопоставление полученных нами препаратов моноклональных анти-МВР-АТ с антигенами дефинитивных тканей органов человека и сыворотки крови соматически здоровых доноров, не выявило специфических реакций с антигенами тестируемых образцов. Иммуноферментный анализ моноклональных анти-МВР-антител с иейроспсцифическими белками и антигенами миелина (GFAP, NSE, a,BG, a2BG, a2GP, S-100, P0, MOG, MAG, PLP) так же не обнаружил специфического связывания с эпитопами этих антигенов.

Иммуноблотт-анализ коммерческого препарата МВР («Chemicon», США) с применением полученных нами моноклональными анти-МВР-антител, позволил визуализировать белковую зону, соответствующую молекулярной массе 18,2 ±2,3 kD (рисунок ЮС).

Иммунофлюоресцентный анализ культуры эмбриональных шванновских клеток с помощью препарата полученных нами моноклональных анти-МВР-антител позволил обнаружить специфическую флюоресценцию МВР-продуцирующих клеток (рисунок 9).

Детальный иммуиохимический анализ препаратов исследуемых НСБ позволил нам сделать вывод о том, что применение стадии препаративного электрофореза в ПААГ на заключительных этапах очистки НСБ, несомненно, оправдано, несмотря на ощутимые их потери при экстракции белков из ПААГ. Получение практически гомогенных препаратов НСБ позволило нам начать иммунизацию мышей линии BALB/C с целью исследования их способности сенсибилизировать В-лимфоциты.

Полученные препараты НСБ применяли при иммунизации мышей линии Balb/C для сенсибилизации B-лимфоцитов, используемых далее при получении гибридных клеток-продуцентов моноклональных анти-НСБ-АТ.

Рисунок 8А. Результаты диск-

электрофоретическою анализа вы {елейного препарата МВР в 7,5% ПААГ с последующим иммунопроявлением стандартной ан!и-МВР-антисыворогкой («Оако», США).

1 - диск-электрофореграчма выделенного препарата МВР (7,5% ПААГ).

2 - иммуноэлектофореграмма иммунопроявления препарата МВР 10% моносиецифическои антисыворогкой

В

I 2

Рисунок 8В. Результаты иммуноблот1-анализа полученного препарата МВР с иммунопроявлением моноклинальными аити-МВР-АТ («RDI», США).

1 - Препарат МВР фирмы «Chemicon»,

2 - Препарат МВР, полученный в соответствии с нашей модификацией

Рисунок 9. Результаты иммунофлюоресцентною анализа препарата культуры эмбриональных шванновских клеток с моноклональными анти-МВР-антителами F9.

1 - картина световой микроскопии препарата культуры эмбриональных шванновских клеток крысы (х 100),

2 картина иммунофлюоресцентной микроскопии препарата культуры эмбрионапьных шванновских клеток крысы (х 100) Препарат обработан моноклональными анти-МВР-антителами F9 и конъюгатом антител к IgG мыши, меченных ФИТЦ ("Dako", USA),

1 картина иммунофлюоресцентной микроскопии препарата культуры шбрионапьных шванновских клеток крысы (х 100) Препарат обработан моноклональными антитетами к NSE и конъюгатом антител к IgG мыши, меченных ФИТЦ ("Dako", USA) (отрицательный контроль);

2. Получение моноклональных анти-НСБ антител, их иммунохимическая характеристика и иммуноцитохимический анализ в препаратах клеточных культур.

Существующие способы иммунизации не позволили получить иммунного ответа, достаточного для формирования полноценного клона В-лифоцитов, продуцирующих анти-НСБ антитела. В связи с этим мы отказались от схемы иммунизации, основанной на 1 цикле иммунизации и применили оригинальную схему, включающую два цикла иммунизации с 3 месячным перерывом. Реализация данного подхода позволила выявить высокие концентрации анти-НСБ-АТ в сыворотке крови мышей, свидетельствующие о высоком уровне сенсибилизации В-лимфоцитов.

В случае получения моноклональных анти-НСБ-антител при оценке линий мисломиых клеток, мы остановились на линии Sp2/0-Ag 14; в качестве сшивающего агента пользовались препаратом «PEG Hybri-Max» («Sigma», США), представляющим 50 % раствор ПЭГ в 10 % растворе ДМСО в PBS. За основу протокола процедуры слияния был взят оригинальный способ Köhler G и Milstein С. (1975), адаптированный Harlow Е и Lane D (1988, 1998) и модифицированный нами Наша модификация заключалась в увеличении времени действия сшивающего агента до 1.5 минут и постепенном изменении его концентрации, путем капельного добавления среды DMEM в течение 10 минут. Указанные нюансы были весьма существенными и давали возможность расширить спектр клонов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные анти-НСБ-антитела.

Полученные анти-НСБ-АТ обладали высокой специфичностью к эпито-пам соответствующих антигенов и относились к классу Ig Gl, имели молекулярную массу 160 ± 2 kD и изоэлектрическую точку 6.8 ± 0.1 (таблица 1).

Как указывалось выше, иммуноблотт-анализ коммерческих препаратов GFAP, NSE, МВР («Chemicon», США) с применением полученных нами соответствующих моноклональных анти-НСБ-АТ, позволил визуализировать белковые зоны, соответствующие молекулярным массам 50,0 ± 6,4 kD - для GFAP, 39,1 ±2,8 kD - для NSE и 18,2 ± 2,3 kD -для МВР (рисунки 10А, 10В и 10С).

Препараты моноклоиальных АТ были использованы при разработке им-муноферментпых тест-систем анализа исследуемых антигенов (ОБАР, ^Е и МБР) в биологических жидкостях человека и животных

Таблица 1.

Физико-химическая характеристика моноклоиальных анти-НСБ-антител.

Характерный признак Характеристика

Лнги-СРАР-ЛТ Анти-^Е-АТ Анти-1\1ВР-АТ

04 08 5С5 5С4012 Р7 Р9

Класс 1ё01 ]ёС1 1ё01 1ё01

Молекулярная масса 162±7,6 кД 159+8.2 кД 160+7,5 кД 160±7,8 кД 161+6,6 кД 161+69 кД

Изоэлектричсская точка 6,7±0,3 6,7+0,4 6,7+0,4 6,7±0,2 6,8+0,2 6,6+0,3

Термостабильность при 56° С + + + + +

+ - наличие признака

А В С

12 3 12 3 12 3

Рисунок 10. Результаты иммуноблот-анализа препаратов вРАР, М8Е и МВР («СЬеткоп», США). А:

1 диск-электрофореграмма препарата ОРАР («СЬегтнсоп», США),

2 иммунопроявление с применением моноклоиальных анти-ОРАР-антител П4,

3 иммунопроявление с применением моноклоиальных анти-ОРАР-антител 08

В:

1 диск-электрофореграмма препарата NSE («СЬегшсоп», США),

2 иммунопроявление с применением моноклоиальных анти- -антител 5С5,

3 иммунопроявление с применением моноклоиальных анти- N515 -антител 5С4012

С:

1 диск-члектрофореграмма препарата МВР («СЬеттпсоп», США),

2 иммунопроявление с применением моноклоиальных анти-МВР-антител ¥1,

3 иммунопроявление с применением моноктональных анти-МВР-антител Р9

3. Разработка иммуноферментных тест-систем анализа НСБ и анти-НСБ антител в биологических жидкостях на основе моноклональных антител.

Несмотря на многочисленные сообщения в мировой научной литературе о применении иммуноферментной, радиоиммунной и иммуногистохимической детекции GFAP, NSE и МВР в биологических жидкостях, на парафиновых и замороженных срезах, а также в культурах антиген-продуцирующих клеток [А1-vord ЕС, 1991, Ahlsen G, 1993; Albrechisen М, 1995, DeGiorgio СМ, 1996, Correale J 1998, Ezgu FS, 2002, Anderson R.E, 2003, Petzold A„ 2004], до последнего времени отсутствовала информация о наличии коммерческих тест-систем их анализа. В настоящее время широкое юшнико-лабораторное применение получили иммуноферментные тест-системы анализа NSE для диагностики мелкоклеточного рака легкого, а также иммуногистохимические тест-системы анализа GFAP для морфологической верификации опухолей астрогли-ального происхождения.

Получение высококачественных препаратов анти-НСБ-АТ открыло перед нами перспективы разработки иммуноферментных систем анализа НСБ в биологических жидкостях человека и животных.

Разработанные нами диагностические иммуноферментные тест-системы анализа GFAP, NSE и МВР имели предел чувствительности 1 нг/мл и позволяли специфично, достоверно и надежно выявлять исследуемые НСБ в диапазоне концентраций от 1 до 128 нг/мл. Калибровочные кривые определения НСБ приведены на рисунке 11.

Анализ результатов применения иммуноферментной тест-системы определения GFAP продемонстрировал высокую специфичность, показав полное отсутствие перекрестных реакций с белками сыворотки крови, экстрактами из органов и тканей человека, крысы, собаки, крупного рогатого скота, а также нейроспецифическими и миелинассоциированными антигенами (NSE, ctjBG. a2BG, cc2GP, S-100, P0, MOG, MBP, MAG и PLP). Иммуноферментная тест-система определения NSF, была высокоспецифична в отношении препарата NSE и не имела перекрестных реакций с белками сыворотки крови, экстрактами из органов и тканей человека, крысы, собаки, крупного рогатого скота, а также нейроспецифическими и миелинассоциированными антигенами (GFAP. aiBG,

oc2BG, a2GP, S-100, P0, MOG, MBP, MAG и PLP). Сходные результаты были получены и при исследовании иммуноферментной тест-системы определения МВР, она также была высокоспецифична в отношении МВР, не обнаружила перекрестных реакций с белками сыворотки крови, экстрактами из органов и тканей человека, крысы, собаки, крупного рогатого скота, нейроспецифичес-кими и миелинассоциированными антигенами (NSE, GFAP, ccjBG, a2BG, a2GP, S-100, Po, MOG, MAG и PLP).

Анализ параметров точности, надежности и воспроизводимости, разработанных тест-систем иммуноферментного анализа СРАР, ЫБЕ и МВР продемонстрировал их полное соответствие требованиям Комиссии по наборам реагентов для иммуноферментного (неинфекционные), радиоиммунологического и других видов иммунохимического анализа Комитета по новой медицинской технике Минздрава РФ.

Разработанные иммуноферментные тест-системы были применены для скринингового исследования НСБ в сыворотке крови и СМЖ доноров, а также больных заболеваниями, сопровождающимися нарушением резистентности ГЭБ. Всего было исследовано 967 образцов сыворотки крови и 80 образцов СМЖ. В результате выявлено, что средняя концентрация СРАР, К8Р и МВР в 22

сыворо1ке крови здоровых людей составила соответственно 2,9 ±1,1 нг/мл, 6,2 ±5,7 и 1,6 ±0,4 нг/мл. Концентрации исследуемых НСБ в СМЖ доноров были несколько выше, чем в сыворотке крови и составили для ОРАР 11,4 + 4,6 нг/мл, для ИБЕ - 32,1 ± 9,8 нг/мл и для МБР - 4,7 ± 2,5 нг/мл.

Анализ результатов сопоставления данных, полученных при иммунофер-ментном анализе НСБ с применением поликлональных и моноклональных 1ест-систем показал, что иммуноферментные тест-системы на основе поликлональных АТ выявляли повышение уровня вРАР, №Е и МБР в сыворотке крови доноров выше установленных максимальных донорских концентраций соответственно в 3,9 %, 3,2 % и 3,7 % случаев. Данный факт наличия ложноположитель-ных результатов в случае использования поликлональных тест-систем, безусловно, свидетельствует в пользу большей диагностической эффективности им-мунофермешных тест-систем, разработанных на основе моноклональных антител (рисунок 12).

3,7 %

0,5----------—

- Анти-МВР-АТ

на основе моноклональных ан-

у

ти-НСБ-ан I и гел д на основе поликлональных ан-

ти-НСБ-антител

Рисунок 12. Сравнительный анализ полученных рсчультатов иммуноферментного определения НСБ с помощью 1ест-систем на основе поликлональных и моноклональных теет-систем.

Анализируя результаты диагностического скрининга НСБ в образцах сыворотки крови и СМЖ больных с заболеваниями, сопровождающимися прорывом ГЭБ, следует отметить, что эффект прорыва ГЭБ для GFAP и NSE был выявлен нами при критических состояниях, обусловленных гипертоксической шизофренией, острой алкогольной энцефалопатией и тяжелой нейролепсией. Элиминация этих НСБ в кровь и СМЖ обнаруживалась также при менингитах, энцефалитах, при черепно-мозговых травмах, при нарушениях мозгового кровообращения ишемического и геморрагическо1 о генеза, а также при опухолях головного мозга. В тоже время, наиболее высокие уровни МВР были зафиксированы в сыворотке крови и СМЖ больных демиелинизирующими заболеваниями (таблица 2).

Таблица 2.

Результаты количественного иммуноферментного скринига GFAP, _ NSE и МВР в сыворотке крови больных._______

Процен i положительных проб

GFAP NSE МВР

Ишемический инсульт 26 1 15.9 20 2

Геморрагический инсулы 39.4 18.3 19.7

Бактериальный менингит, гнойный 40.5 33.8 18.9

Бактериальный менингит, серозный 27.5 18 8 13.0

Вирусныи менингит 35.5 32 9 10.5

Рассеянный склероз в стадии обострения 36.5 34.1 87 8

Рассеянный склероз в стадии ремиссии 6.8 4.9 22.5

Черепно-мозговая травма, закрытая 41 1 21.4 11.9

Черепно-мозговая травма, открытая 57 1 33.2 8.9

Фебрильные судороги 1 42 6 21 2 17.0

Критические состояния при НМКI ст тяжести 32.6 19.2 19.2

Критические состояния при НМК II ст. тяжести 39 8 25.6 21.8

Критические состояния при НМК III ст. тяжести 50.5 32.9 29.4

В последнее время исследователи уделяют НСБ значительное внимание как объективным прижизненным маркерам функций ГЭБ в норме и при патологии [Barone FC, 1993, Fridriksson Т, 2000; Herrmann М., 2001; Chamczuk A J, 2002, Berger M, 2003; Ingebrigtsen T, 2003; Lima JE, 2004]. Наиболее изучены в

этом аспекте СРАР, ЫБЕ и МБР Хорошо известно, что СРАР и Ы8Е, будучи цитоплазматическими белками, могут обнаруживаться в сыворотке крови только при функциональном нарушении проницаемости ГЭБ или структурном нарушении тканевой архитектоники головного мозга. МБР является структурным белком миелина и его появление в сыворотке крови напрямую связывают с деструкцией миелина. Основные механизмы элиминации НСБ в кровь при патологических процессах в ЦНС сводятся к следующим процессам:

1. Поражение ГЭБ при энцефалитах, менингитах, критических состояниях, обусловленных фебрильной шизофренией, нейролепсией, острым алкогольным делирием обуславливается повреждением мембранных структур астроци-тов и эндотелиоцитов, формирующих ГЭБ, продуктами метаболизма клеток или эндо- и экзотоксинами бактерий и вирусов. Такой механизм повреждения чаще всего не приводит к грубым структурным нарушениям ГЭБ и чаще проявляется в функциональных изменениях белковых слоев мембран астроцитов, олигодендроглиоцитов и эндотелиоцитов. В тоже время, при пролонгированном воздействии повреждающего фактора (например, гипоксически-ишемическос повреждение, интоксикация вследствие бактериальной или вирусной инфекции и т.д.) происходит повреждение мембран нейронов, не формирующих непосредственно ГЭБ.

2 Несколько иной механизм появления НСБ в сыворотке крови отмечается при опухолях и травмах головного мозга, в процессе которых происходит грубое повреждение структуры нервной ткани, клеточных элементов, формирующих ГЭБ.

Подводя итог анализу результатов, полученных при иммуноферментном определении СРАР, ЫЯЕ и МВР, следует сделать вывод о том, что иммунофер-ментный скрининг этих антигенов может быть применен в качестве дополнительного диагностического теста оценки проницаемости ГЭБ при состояниях, связанных с его прорывом, а именно - при целом ряде нервных и психических заболеваний, при онкологических заболеваниях, при черепно-мозговых травмах, при нарушениях мозгового кровообращения различной степени тяжести. Количественный анализ уровня этих антигенов в динамике развития заболевания позволяет установить объективный контроль течения заболевания, кон-

троль эффективности проводимой терапии и прогнозировать возможный исход патологического процесса.

Таким образом, анализ результатов комплексного динамического имму-ноферментного определения НСБ позволяет подтвердить существующую точку зрения о том, что НСБ могут рассматриваться как надежные маркеры состояния ГЭБ в норме и при патологии Иммунофермснтные тест-системы анализа НСБ могут быть рекомендованы для применения в клинико-лабораторной практике в качестве дополнительных иммунохимических критериев диагностики и контроля эффективности проводимой терапии нервных и психических заболеваний, сопровождающихся нарушением проницаемости ГЭБ.

Нарушение резистентности ГЭБ приводит к элиминации в кровь НСБ, характеризующихся высокой антигенностью. Контакт этих белков с иммуноком-петентными клетками, как правило, сопровождается появлением активных клонов B-лимфоцитов и плазматических клеток, продуцирующих анти-НСБ-антитела. Анти-НСБ-антитела, в свою очередь, могут проникать через поврежденный ГЭБ и связываться с соответствующими антигенами в ткани мозга, где при посредничестве факторов комплемента происходит запуск неспсцифиче-ских острофазовых реакций, приводящих к аутоиммунному воспалению и характеризующемуся острым клеточным отеком [Sellebjerg F, 1998; Rewdl M, 1999, Mein! E, 2002; Berger T., 2003, Dharmasuroja P. 2003] При этом нарушение функции ГЭБ является, по всей видимости, вторичной реакцией, следствием выраженных метаболических нарушений в астроцитах и эндотелиоцитах капилляров головного мозга. Причина этих нарушений исходит из суммарного воздействия таких факторов, как гипоксия, ишемия, влияние токсических продуктов метаболизма клеток организма, активированных компонентов каллскре-ин-кининовой системы и т.п. Понимание роли анти-НСБ-антитсл в патогенезе некоторых нервно-психических заболеваний, в особенности сопровождающихся нарушением функций ГЭБ привела к необходимости разработки иммуно-ферментного метода определения анти-НСБ-антител в сыворотке крови и лик-воре.

Разработанные нами диагностические тест-системы анализа анти-НСБ-АТ позволяли надежно и воспроизводимо определять специфические анти-

ОРАР-, анти-ЫЯЕ- и анти-МВР-АТ диапазоне концентраций от 1 до 64 нг/мл. Калибровочные кривые определения анти-НСБ-антител приведены на рисунке 13.

(I о

Анти-МВР-АТ

| \нш-

! г;рлр-\т

Анти-Ы5Е-АТ

о

\ V ч- л л? -о „> л

концентрация ш мл

Рисунок 13. Калибровочные кривые иччунофермешиого амати 1а ати-вРАР-, аши-\ЧЕ- и а|пи-МВР-а1ии1сл.

Необходимо отмстить, что иммуноферментный скрининг анти-НСБ-АТ (на уровне чувствительности иммуноферментного метода) не позволил их обнаружить в образцах сыворотки крови здоровых доноров различных возрастных 1рупп (от 0 до 60 лег) Учитывая этот факт, следует сделать вывод о том, что НСБ на уровне донорских концентраций не обладают необходимомой антигенное 1ыо, способной вызвать антителообразовапие.

Феномен образования апти-НСБ-АТ был выявлен нами при критических состояниях, обусловленных психическими заболеваниями (анти-ОРАР-АТ определялись в 5,4 - 19,6 % случаев; анти-ИЗЕ-АТ - в 4,1 - 13,1 %), при нейроин-фекциях (анти-ОРАР-АТ были выявлены в 8,7- 15,7% случаев, анти-МЯЕ-АТ выявлялись у 8,6- 12,2% больных), при инсультах (анти-СРАР-АТ определялись в 14% случаев; анти-ЫЯЕ-АТ - в 7,2 - 16,9%; анти-МВР-АТ - в 7,2 -9,9 %), при черепно-мозговах травмах (анти-ОРАР-АТ были выявлены в 25,0 -

38,3 % случаев; анти-ЫБЕ-АТ - от 26,2 до 12,5 % и анти-МВР-АТ - в 3,9 % случаев), при фебрильиых судорогах (анти-СГАР-АТ - в 23,1 %; анти-Н5Е-АТ - 17,0 %; анти-МВР-АТ - только у 6,4 % пациентов). Наибольший процент выявления положительных проб, содержащих анти-МВР-АТ, был зафиксирован у пациентов с рассеянным склерозом. При этом антитела выявлялись как у пациентов, находящихся в стадии ремиссии (21,5 %), так и у больных в стадии обострения (48,7 %) (таблица 3).

Таблица 3.

Результаты количественного иммуноферментного скрининга анти-НСБ-АТ в сыворотке крови больных.

Процент положительных проб

Ahth-GFAP-АТ Анги-NSE-АТ Анти-МВР-АТ

Ишемический инсульт 86 7.2 72

Геморрагический инсульт 140 169 9.9

Бактериальный менингит, гнойный 149 122 14,8

Бактериальный менингит, серозный 4.0 8.6 8 7

Вирусный менингит 105 9.2 15.7

Рассеянный склероз в стадии обострения 17 1 29 2 48 7

Рассеянный склероз в стадии ремиссии 2.9 0 21.5

Черепно-мозговая травма, закрытая 38 1 26.2 3 96

Черепно-мозговая травма, открытая 25 0 12.5 3 8

Фебрильные судороги 23 1 170 6.4

Критические состояния при НМК 1 ст. тяжести 0 0 0

Критические состояния при НМК II ст. тяжести 103 2.6 5.1

Критические состояния при НМК III ст. тяжести 34 1 25.8 20 0

Понятно, что сам факт обнаружения анти-НСБ-АТ не дает оснований считать эти заболевания аутоиммунными и предполагать их возможную ауто-агрессию в мозг. Однако выявление антител позволяет сделать заключение об имевшем место ранее прорыве ГЭБ и забросе НСБ в кровь в концентрациях, достаточных для запуска процессов антителообразования. В связи с этим, обоснованным является проведение комплексного иммуноферментного определения НСБ и анти-НСБ-АТ При анализе динамики концентраций НСБ и антител 28

к ним (рисунки 14 и 15) выявлено, что кризисный период течения заболевания, сопровождающийся массированным прорывом ГЭБ и выходом НСБ в кровоток приходится на 7-12-е сутки от начала развития критического состояния или повреждения ткани мозга в результате гипоксического, ишемического, токсического или других видов воздействия.

с\тки от начата развития критического состояния

П Г.Р\Р при бтагоприятиоч тхо1е А при Гпагоприятном исхоте

О с.г\р при небтагопрнншом ис\01с « при небтагоприягном ИСХ01С

Рисунок 14. Динамика концешрании СРЛР и в сыворо!ке крови больных, нахо-1ЯШИХСЯ в критическом состоянии, обусловленном тяжелой неироленсией .

Именно в этот период обнаруживалась максимальная концентрация НСБ и начинали определяться анти-НСБ-АТ. Плавная поэтапная элиминация антигена и антител после достижения их максимальных значений (21-27-е сутки) сопутствовала улучшению клинического состояния, что косвенным образом свидетельствовало о восстановлении ГЭБ. В случае увеличения НСБ в сыворотке крови при отсутствии соответствующих антител к десятым суткам от начала развития критического состояния, или же одновременное увеличение концентрации НСБ и апти-НСБ-антител, косвенно свидетельствовало об отсутствии нормализации функции ГЭБ и сопровождалось ухудшением клинического состояния вплоть до гибели больного.

Анализ результатов комплексного динамического иммуноферментного определения НСБ и анти-НСБ-АТ позволяет рекомендовать его для клинико-лабораторной практики в качестве дополнительного иммунохимического метода диагностики, контроля эффективности проводимой терапии и прогностического критерия при нервно-психических заболеваниях, сопровождающихся прорывом ГЭБ.

с\тки 01 нача |а рашшия кригическою состинии -СЫЧЧЬ -О-лши-^Р-АТ

Рисунок 15. Динамическим мониториш копает рации ^Е и аши-ЧЯЕ-АТ в сыворо1ке крови больных в критическом состоянии, обусловленном нейролепсией.

Несмотря на то, феномен появления анти-НСБ-АТ в сыворотке крови больных заболеваниями, сопровождающимися нарушением резистентности ГЭБ досконально исследован, принципиальная задача, связанная с исследованием эффектов проникновения антител к нейроспсцифическим антигенам через ГЭБ в норме, а также при экспериментально моделированных патологических процессах, характеризующихся нарушением проницаемости ГЭБ до последнего времени не была решена.

В данном аспекте нами была предпринята попытка исследования резистентности ГЭБ для анти-М5Е-АТ в условиях экспериментально индуцированной ишемии головного мозга, приводящей к прорыву ГЭБ. 30

4. Исследование проницаемости ГЭБ для антител в эксперименте.

В процессе проведения эксперимента, препараты меченных 1251 монокло-нальных анти-МБЕ-АТ и сывороточных 1§01 мыши вводили крысам внутривенно сразу же после односторонней электрокоагуляции средней мозговой артерии по Вес1ег8оп J (1986), применяя модифицированный протокол ВапЪ IV (2002).

Через нормальный ГЭБ анти-ЫБЕ-АТ не проникали. В то же время был продемонстрирован эффект динамического увеличения радиоактивности ткани мозга крыс в полушарии, подвергшемся ишемии. Относительное содержание радиоактивной метки в ткани мозга (V%) крыс с окклюзией среднемозговой артерии через 3 часа после внутривенного введения как АТ к неспецифическим для ткани мозга антигенам, так и анти-^Е-АТ возросло более чем в 10 раз (рисунки 16 и 17).

Рисунок 16. Результаты определения величины относительной радиоактивности органов после внутривенного введения препарата 1251-1{гС1 крысам с ОСМА.

В тоже время, через 48 и 72 часа наблюдались выраженные различия в характере изменений радиоактивности в ткани мозга и других органах после введения препарата меченных 1251 сывороточных 1§С ] мыши (" 1251-1дС 1) и пре-

31

парата меченных 1251 моноклональных анти-Ы8Е-АТ (1251-МаЬ NSE). При введении 1251-МаЬ К8Е относительное содержание радиоактивной метки в ткани мозга возрастало в 1.5 раза через 48 часов и оставалось практически неизменным через 72 часа, тогда как в случае введения препарата 1251-^01, он не захватывался тканью мозга и через 72 часа У% достоверно снижалось более чем в два раза (рисунки 16 и 17).

Таким образом, применение меченных препаратов анти-НСБ-АТ позволило установить феномен их прорыва в паренхиму мозга крыс с экспериментальным ишемическим инсультом. Полученные данные об отсутствии проницаемости ГЭБ для АТ в норме и о снижении его резистентности при патологии, несомненно, способствуют развитию теории о роли аутоагрессии анти-НСБ-АТ в патогенезе заболеваний ЦНС сопровождающихся прорывом ГЭБ.

Результаты, демонстрирующие феномен прорыва анти-НСБ-АТ в направлении кровь-мозг позволяют подтвердить и целесообразность применения моноклональных анти-НСБ-АТ как векторов при создании систем направленно1 о

транспорта лекарственных и диагностических препаратов в клетки-мишени нервной ткани.

5. Перспективы направленного транспорта ПЭГилированных иммуноли-посом на основе моноклональных анти-GFAP-AT к клеткам-мишеням нервной ткани.

Проблема направленного транспорта лекарственных и диагностических препаратов является одной из привлекательнейших проблем современной фармакологии и биотехнологии [Banks WA., 2000-2004; Fricker G„ 2000-2002; Pan W, 1998-2004; Pardridge WM., 1998-2004, Scherrmann JM., 1999-2003;]. Уровень развития современной нейроиммунохимии позволил вплотную подойти к решению проблемы создания универсальных систем направленного транспорта лекарственных и диагностических препаратов на основе иммунолипосом, сферически экранированных от макрофагов периферической крови

В данном аспекте нами была создана ПЭГилированная иммунолипосо-мальная система на основе моноклональных анти-GFAP-AT. При этом препарат ПЭГилированных иммунолипосом получали по протоколу, предложенному Benzinger Р (2000). Эффект селективного ¡ахвата иммунолипосом исследовали in vitro в экспериментах с препаратом культуры эмбриональных астроцитов крысы.

Препарат ПЭГилированных иммунолипосом, меченных липидным флюоресцентным индикатором Dil, инкубировали с препаратом культуры эмбриональных астроцитов мозга крысы в течение 3, 6 и 9 часов. После тщательной отмывки не связавшихся с антигенами астроцитов иммунолипосомальных препаратов наблюдали эффект интенсивного красного свечения астроцитов, обусловленного флюоресценцией липидного индикатора Dil. Это свечение появлялось уже при минимальной применявшейся дозе препарата иммунолипосом и при минимальной (3-часовой) продолжительности их инкубации с клеточной культурой При этом увеличение дозы или длительности инкубации, не приводило ни к какому видимому усилению флюоресценции клеток (рисунок 18, В)

Следует подчеркнуть, что ни в одном i окрашивание астроцитов не наблюдалось (рис

з контрольных -опытов подобное

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ WOK ölCiMOTEICA

С. Петербург I М W in J „

т --' '

Рисунок 18. Результат исследования взаимодействия ПЭГилированных векторных aiiTH-GFAP-иммунолипосом с клетками культуры эмбриональных ас-I роии гов мозга крысы.

А - картина световой микроскопии препарата культуры эмбриональных астроци-тов крысы (увеличение 1 х 100);

В картина флюоресцентной микроскопии препарата культуры эмбриональных астроцитов крысы (увеличение 1 х 200) Препарат инкубировали с препаратом ПЭГилированных иммунолипосом, содержащих флуоресцентный индикатор Dil (без включения пептида) в течение 3 часов;

С картина флюоресцентной микроскопии препарата культуры эмбриональных астроцитов крысы (увеличение 1 х 200) Препарат инкубировали с препаратом ПЭГилированных невекторных липосом, содержащих флуоресцентный индикатор Dil (6es включения пептида) в течение 3 часов,

D картина флюоресцентной микроскопии препарата культуры эмбриональных астроцитов крысы (увеличение 1 х 200). Препарат культуты эмбриональных астроцитов был инкубирован с нативными моноклональными анти-GFAP-AT, а затем обработан ПЭГилированными иммунолипосомами, в качестве вектора которых использовали мо-ноклонапьные анти-GFAP-AT.

Важно отмстить, что преинкубация препаратов культуры эмбриональных астроцитов мозга крысы с анти-ОРАР-АТ полностью блокировала специфическую флюоресценцию астроцитов (рисунок 18, В). Этот факт подтверждает эффект специфического захвата анти-ОРАР-АТ, конъюгированных с ПЭГилированных липосомами непосредственно молекулами вРАР, экспонированными на мембране астроцитов.

Понятно, что в случае преинкубации анти-ОРАР-АТ связываются с соответствующими антигенами на поверхности астроцитов, не оставляя такой возможности для соответствующих иммунолипосом. В этом случае иммунолипо-сомы не захватываются препаратом культуры астроцитов и флюоресценции не наблюдается.

Таким образом, в результате проведения эксперимента была показана принципиальная возможность создания ПЭГилированных иммунолипосомаль-ных конструкций с мощными векторными свойствами. Дальнейшее развитие этого направления открывает широкие перспективы создания микроконтейнерных систем способных доставлять диагностические и лекарственные препараты к клеткам-мишеням нервной ткани.

Заканчивая анализ собственных результатов исследований, есть основания выделить те направления, развитие которых может иметь самостоятельное фундаментальное или же прикладное значение для решения фундаментальных и прикладных задач современной нейробиологии:

1. Поиск новых биологических активных соединений в клеточных и тканевых препаратах на основе иммунохимической селекции клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к исследуемом спектру антигенов.

2. Иммунохимический анализ антигенного спекгра гканей, расположенных за гистогематическими барьерами (ГГБ) с целью разработки тест-систем, способных давать объективную информацию о структуре и функции барьера.

3. Иммунохимический анализ АТ к антигенам клеток и тканей, расположенных за ГГБ с целью разработки подходов к изучению аутоиммунных аспектов патогенеза заболеваний, сопровождающихся нарушением резистентности ГГБ, и создания методологической и экспериментальной базы для изучения и испытания диагностических и лекарственных препаратов направленного типа действия.

4. Применение экстракорпоральной иммуноадсорбции АТ к антигенам клеток и тканей, расположенных за ГТБ с целью разработки адекватного способа защиты клеток и тканей от аутоантительной агрессии при заболеваниях, сопровождающихся выраженным нарушением функций ГТБ.

5. Разработка способов создания сферически экранированных иммуномик-роконтейнерных конструкций с целью разработки систем направленного типа действия в лечебно-диагностических целях.

ВЫВОДЫ

1. Способы очистки ОРАР, Ы5Н и МВР на основе комбинации солевого фракционирования, ионообменной, гидрофобной и иммуноаффинной хроматографии, гель-фильтрации и препаративного диск-электрофореза позволяют выделять высокоочищенные препараты этих НСБ. Полученные препараты ОРАР, МЯЕ и МВР могут быть использованы для получения моноклональных АТ и разработки иммуноферментных тест-систем их количественного определения.

2. Модифицированный способ иммунизации мышей высокоочищенными препаратами ОРАР, №Е и МВР позволяет получать В-лимфоциты селезенки, способные при конъюгировании с клетками миеломы Яр2/0 образовывать гибридные клетки, продуцирующие моноклональные анти-ОРАР-, анти-КБЕ- и ан-ти-МВР-АТ класса \gCj- Полученные препараты моноклональных анти-НСБ-АТ могут применяться для разработки иммуноферментных и иммунопатологических тест-систем количественного анализа НСБ.

3. Разработанные и апробированные в эксперименте и клинической практике тест-системы количественного иммуноферментного анализа ОРАР, №Е и МВР на основе соответствующих моноклональных АТ позволяют специфично, надежно, воспроизводимо и достоверно определять эти антигены в сыворотке крови и ликворе человека и животных.

4. Иммуноферментный анализ ОРАР, ЫБЕ и МВР на основе соответствующих моноклональных АТ в сыворотке крови и ликворе, может быть применен для диагностики, мониторинга и контроля эффективности проводимой терапии больных нервными, психическими, онкологическими, инфекционными и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением функций ГЭБ.

5. Сравнительный анализ результатов иммуноферментного скрининга ОРАР, №Е и МВР в сыворотке крови доноров и больных с заболеваниями, сопровождающимися нарушением резистентности ГЭБ, выполненного с помощью тест-систем на основе моноклональных и поликлональных АТ, позволил

выявить более высокую диагностическую эффективность для тест-систем на основе моноклональных антител. Процент ложноположительных результатов выявления НСБ при использовании тест-систем на основе поликлональных АТ составлял от 3,2 % до 3,9 %, в то время как применение иммуноферментных тест-систем на основе моноклональных АТ не выявило ложноположительных результатов

6 Иммуногистохимический анализ СтРАР, №Е и МВР на основе соответствующих моноклональных АТ позволяет специфически локализовать их в клс!-ках нервной ткани. При этом вРАР специфически локализуется в астроцитах нервной ткани, - в нейронах, а МВР - в олигодендроцитах, астроцитах и шванновских клетках.

7. Дефинитивный гематоэнцефалический барьер непроницаем для препаратов меченных I125 анти-НСБ-АТ, введеных в кровоток. Гипокси-ишемическое поражение головного мозга, индуцированное путем окклюзии средней мозговой артерии, приводит к нарушению резистентности ГЭБ, сопровождающемуся феноменом прорыва и накопления в ткани мозга препаратов меченных I125 ан-ти-НСБ-АТ, введеных в кровоток.

8. Технология получения ПЭГилированных иммунолипосом, базирующаяся на конъюгации тиолированных 2-иминотиоланом анти-СРАР-АТ с ПЭГилиро-ванными липосомами позволять создавать микроконтейнеры направленного типа действия, способные селективно захватываться астроцитами нервной ткани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанные способы получения гомогенных препаратов ПРАР, КЯР и МВР на основе комбинации солевого фракционирования, ионообменной, гидрофобной и иммуноаффинной хроматографии, гель-фильтрации и препаративного диск-электрофореза могут быть рекомендованы для создания иммуноферментных тест-систем их количественного определения

Полученные на основе модифицированного способа иммунизации высо-коочищенными препаратами НСБ моноклональныс анти-НСБ-АТ могут быть

рекомендованы для разработки иммуноферментных и иммуноцитологических тест-систем количественного анализа НСБ.

Иммуноферментный мониторинг вРАР, NSE и МВР на основе соответствующих моноклональных АТ в сыворотке крови и ликворе целесообразно применять для диагностики и контроля эффективное ги проводимой терапии больных нервными, психическими, онкологическими, инфекционными и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением функций ГЭБ.

Иммуноферментный анализ анти-НСБ-АТ в сыворотке крови может быть рекомендован для определения степени сенсибилизации организма по отношению к индивидуальным НСБ.

Технология получения ПЭГилированных иммунолипосом, базирующаяся на конъюгации тиолированных 2-иминотиоланом анти-НСБ-АТ с ПЭГилиро-ванными липосомами может применяться для создания микроконтейнеров направленного типа действия, способных селективно захватываться клетками-мишенями нервной ткани.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АГ - антиген АС - антисыворотка АТ - антитела

ГЭБ - гсмагоэнцефалический барьер

ЕАЕ - экспериментальный аллергический энцефаломиелит

ИФА - иммуноферментный анализ ПААГ - полиакриламидный гель РИА - радиоиммунный анализ

РС - рассеянный склероз СМЖ - спинномозговая жидкость ЦНС - центральная нервная система ЧСА - человеческий сывороточный альбумин

ОРАР глиофибриллярный кислый протеин

^Е - нейроспецифическая енолаза МВР - основной белок миелина ЯПЯ - додецил-сульфат натрия

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чехонин В П, Рябухии И А , Белопасов В.В., Гурина О.И и др // Имму-ноферментный анализ антител к нейроспецифичееким белкам в оценке состояния функции гематоэнцефаличсского барьера - Иммунология - 1996 - № 2 -стр. 67-69

2. Чехонин ВII, Рябухин И А, Гурина О И и др И Исследование проницаемости гематоэнцефаличсского барьера у новорожденных крысят в условиях индуцированных гипертермических судорог - Бюлл. Эксп. Биологии и медицины - 1997 - том 123 - N2 - с. 146-149

3. Чехонин В П, Рябухин И А , Гурина О.И. // Иммуноферменшый анализ антител к нейроспецифичееким белкам в диагностике нервно-психических заболеваний - Российский психиатрический журнал - 1997 -№.2 - стр. 52-56

4. Чехонин В П, Рябухин И А , Гурина О И и др //К вопросу о механизмах аутоагрессии антител к нейро-специфическим белкам через гематоэнцефа-лический барьер - Российский психиатрический журнал 1997, N 1, стр.43-45

5 Гусев ЕИ, Демина ТЛ, Беляева И А , Буглак А В, Бойко А II, Смирнова Л.Ф, Гурина О И., Чехонин В П. И Проницаемость гематоэнцефалического барьера и синтез противовоспалительных цитокинов клетками периферической крови больных рассеянным склерозом - В кн.: Нейроиммунология, нейроин-фекция, демиелинизация - 1997 - Санкт-Петербург - с 37-39

6. Чехонин ВП, Рябухин И А, Гурина О.И и др // Иммуноферментный анализ нейроспецифических белков и антител к ним в диагностике нервно-психических заболеваний - Новости науки и техники, реферативный сборник ВИНИ ГИ. Серия Медицина - Психиатрия. - № 7 - Москва - 1997 - с. ¡-уш

7. Чехонин В П., Кекелидзе ЗИ, Рябухин И А, Гурина О.И и др // Комплексный иммуноферментный анализ нейроспецифических белков как критерий оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера при нервно-психических заболеваниях. - Российский психиатрический журнал - 1998 - № 2 - стр. 49-54

8 Чехонин В П, Кекелидзе 3 И, Рябухш И.А , Турина О И и др И Твердофазная иммуносорбция антител к нейроспецифическим антигенам - Российский психиатрический журнал, № 6, 1998 - с. 22-30

9. Чехонин В П, Гурина О И. И Моноклональные антитела к глиофибрил-лярному кислому протеину - В кн.: Актуальные вопросы клинической и военно-морской медицины, 1998 — с.212

10 .Chekhonin VP, Rjabukhin IА , Gurina O.I et al // Immunochemical study of mechanisms of anti-GSP-antibodies autoagression across the BBB on glial cell function in healt and disease - 3-rd European Meeting - Greece - 1998 - May 6-10, p. 69

11 Чехонин В П, Кекелидзе 3 И, Рябухин И А., Лейкин Ю А , Гурина О И и др П Иммуноадсорбция антител к нейроспецифическим белкам в эксперименте и клинической практике - Новости науки и техники, реферативный сборник ВИНИТИ. Серия Медицина. - Психиатрия. - № 1 - Москва - 1999 - с. 2-12

\2.Chekhonin VP, Rjabukhin I A, Dmitrieva ТВ., Gurina O.I. // Immunoabsorption of the anti-NSA-antibodies in the complex therapy of patients suffering from hypertoxic schizophrenia - 5 IBRO WORDL CONGRESS OF NEUROSCIENCE -Jerusalem, Israel, 1999

13.Гусев E И, Чехонин В.П., Беляева И.А , Демина TJI, Бойко А.И, Буглак А В, Гурина О И И Клинико-иммунохимическая характеристика ремиттируще-го течения рассеянного склероза - Вестник Российской Академии Медицинских Наук - 1999 - 7 - с. 40-47

14. Гусев ЕИ, Чехонин В.П., Беляева И А.. Демина T.JI, Бойко А И, Буглак А В, Гурина О И Ч Сравнительный клинико-иммунохимический анализ ремит-тирующего и вторично-прогрессирующего рассеянного склероза. - Журн неврологии и психиатрии им С.С. Корсакова - 2000 - 6 - с. 51-57.

15 .Chekhonin VP., Rjabukhin I A., Gurina ОI et al H Neurotrophic effect of the hydrophobized conjugates of BDNF with anti-GFAP-antibodies in the therapy of experimental brain ischemia - IV European meeting on glial cell function in health and disease, Barcelona - may 24th-27lh 2000

16 Чехонин В П, Рябухин И A , Гурина О И и др Иммуноферментный анализ GFAP на основе моноклональных антител в оценке проницаемости гемато-

энцефалического барьера при нервно-психических заболеваниях. - Российский психиатрический журнал - № 1 - 2000 - стр. 14-18

17 .Chekhonin VP, Rjabukhin IA , Gurina ОI et al //Neuroprotective effect of the hydrophobized conjugates of BDNF with anti-GFAP-antibodies in the therapy of experimental brain ischemia - XXII C.I.N.P. Congress, Brussels, Belgium, 913 July 2000

18. Чехонин ВII., Жирков Ю A , Рябухин И А , Турина О И и др // Количественно-кинетические параметры элиминации нейроспецифических антигенов и антител к ним при некоторых нервно-психических заболеваниях - Российский психиатрический журнал, № 4, 2000, стр. 4-8

19. Чехонин ВП, Рябухин И А, Гурина О И и др И Иммуноферментный анализ нейроспецифической енолазы на основе моноклональных антител в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при нервно-психических заболеваниях. - Российский психиатрический журнал, № 4, 2000, стр. 15-19

20.Чехонин ВП, Дмитриева ТБ, Гурина О.И и др И Основной белок миелина. Строение, свойства, функции, роль в диагностике демиелинизирую-щих заболеваний Вопросы медицинской химии - 2000, том 46, № 6, с. 549-563

21 .Chekhonin VP, Dmitrieva ТВ, Gurina 01 et al. II ELISA of GFAP in the performance evaluation of the transplanted dopaminergic neurons in the therapy of 6-OHDA induced hemiparkinsonism - Neurotoxicity meeting: mechanisms for neurodegenerative disorders, March 16-18 - 2001 - Pucon, Chile

22 Чехонин ВП, Баклаушев В П, Дмитриева Т Б, Гурина О И и др // Иммуноферментный анализ GFAP в оценке функциональной активности трансплантатов клеточных препаратов эмбрионального вентрального мезенцефалона у крыс с экспериментальным гемипаркинсонизмом. - БЭБМ - 2001 - N 6 - с. 652-657

23 .Чехонин В П, Рябухин И А , Артемкина И, Гурина О И и dp II Имму-нохимический анализ глиоспецифических антигенов как критерий проницаемости ГЭБ крыс при острой интоксикации барбиталом натрия - БЭБМ - 2001 - N 5 - с.502-504.

24 Чехонин В П, Дмитриева Т Б, Гурина О И и др // Моноклональные ан-ги-GFAP антитела; получение характеристика и иммуноферментный анализ -БЭБМ-2001 - N 8-С.188-191.

25 Chekhonin VP, Baklaushev VP., Gurina ОI et al. 11 Immunoenzymatic analysis of GFAP to evaluate the effectiveness of embrional nervous tissue preparations transplantation - 3-rd International conference "Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs" - 15-18 May 2001 - Suzdal

26.Chekhonin VP., Galoyan A A , Rjabukhin I, Gurina ОI et al II Immunochemical study of the effect of neurotrophins on the GFAP synthesis in astrocyte culture - Biochemical and molecular-biological aspects of the brain immune system -Proceeding of the International Conference September, 15-19 - 2001 - Yerevan - pp 140-145

21.Chekhonin VP, Skurkovich S„ Boiko A., Beliaeva I, Buglak A , Alokseeva T, Smirnova N., Kulakova О, Gurina OI et al II Randomized study of antibodies to INF-y and TNF-a in secondary progressive multiple sclerosis - Multiple sclerosis -2001-V.7 - № 5 - pp 277-284

28.Любимова HВ., Томе М.Г, Шатрова ИН., Кушлинскш Н.Е, Гурина О И. идр II Биохимические показатели в диагностике и мониторинге нейроток-сичности противоопухолевых цитостатиков - БЭБМ - 2001 - N 11 - т. 132 - с. 561-565

29 .Чехонин В П, Гурина О И, Семенова А В и dp II Моноклональные антитела к основному белку миелина - Нейрохимия - 2001 - том 18 - № 4 - с. 310-314

30.Chekhonin VP., Zhirkov YuA, Belyaeva I.A., Gurina ОI et al. II Serum time course of two brain-specific proteins, a¡ brain globulin and neuron-specific enolase, in tick-bom encephalitis and Lyme disease Clínica Chimica Acta, 320 (2002) p. 117-125

31 .Чехонин ВП, Лебедев С В, Дмитриева ТЕ., Баклаушев ВП, Гурина О И и др. // Критерии эффективности трансплантации препаратов эмбриональной нервной ткани у крыс с гемипаркинсонизмом - Патологическая физиология и экспериментальная терапия - 2002 - т.З, стр. 19-22.

32.Chekhonin VP, Dmitriyeva ТВ, Gurina 01. et al // Immunoenzyme analysis of anti-MBP-antibodics in the diagnostics of multiple sclerosis - V EUROPEAN MEETING ON GLIAL CELL FUNCTION IN HEALTH AND DISEASE Rome, Italy 21-25, May 2002

33 .Chekhonin VP, Ryabukhin IA , Kashparov IA , Gurina ОI et al. // Neuroprotective effect of the conjugates of pegylated BDNF with artificially hydropho-bized complex of Fab fragments of 0X26 and anti-GFAP-antibodies in therapy of experimental brain ischemia. - TIFTH EUROPEAN MEETING ON GLIAL CELL FUNCTION IN HEALTH AND DISEASE Rome, Italy 21-25, May 2002

34. Чехонин В П, Гурина О И, Портном ТС и др И Моноклональные анти-NSE-антитела: получение, характеристика и иммуноферментный анализ - Вопросы медицинской химии 2002 г., Выпуск 5, т. 48, стр. 477-484

3 5. Чехонин В П, Лебедев С В, Дмитриева Т Б, Блинов Д В, Гурина О И и dp // Иммуноферментный анализ NSE и GFAP как критерий динамической оценки проницаемости гематоэнцефалического барьера крыс при перинатальном гипокси-ишемическом поражении ЦНС. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2003, - N 9, с.299-303

36.Chekhonin VP, Zhirkov Yu А , Gurina OI et al II Targeted transport of the stealth immunoliposomes to the brain astrocites - GLIA - 2003, Suppl 2 September - VI Furopean Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease, Berlin September 3-6 2003, P.l9

37.Чехонин ВП, Жирков Ю А , Рябухин ИЛ , Гурина ОН. и dp II ПЭГили-рованные иммунолипосомы, специфичные к астроцитам - Доклады РАН - серия: Биофизика и биохимия 2003; N 391, с. 236-239

38.Чехонин В Г[, Рогаткин СО, Блинов ДВ, Володин НИ, Гурина ОН и др. II Перспективы применения иммуноферментного анализа нейроспецифиче-ских антигенов в перинатальной неврологии - Вопросы гинекологии, акушерства и леринатологии - 2003, том 2, N 4, С. 9-14

39 .Чехонин В П, Мороз И Н, Гурина О И и dp II Характеристика клеточного и гуморального иммунитета у больных с различными формами астенических расстройств - Иммунология - 2003 - том 24, N 4, с.238-242

АО. Чехонин В П, Семенова А В., Гурина О И. и др. Миелинолигодендрог-лиоцитарный гликопротеин: Строение Функции. Роль в патогенезе демиелини-зирующих расстройств - Биомедицинская химия 2003, том 49, выпуск 5, стр. 411-423

41 .Chekhonin VP, Ryabukhin I., Gurina О et al. // Immunochemical Study of the Effect of Neurotrophins on the Glial Fibrillar Synthesis in Astrocyte Culture -Neurochemistry - 2003 - N3 - p. 179-183

42.Чехонин В П, Александровский Ю А , Мороз И Н, Гурина ОНИ Кли-нико-иммунологическая характеристика больных с астеническими расстройствами непсихотического уровня - Российский психиатрический журнал, 2003, № 3, с. 4-8

43.Чехонин ВП, Мороз И Н„ Гурина О И. и др. П Клинико-иммунологическая характеристика больных с различными формами психогенной астении и пути оптимизации лечения - Российский психиатрический журнал, 2003, №6, с. 9-13

44.Чехонин ВП, Александровский Ю А, Гурина О И. и др. // Клинико-иммунологическая характеристика больных с психогенной астенией и пути оптимизации лечения - Иммунология - 2003, том 24, N.6, с.341-345

45.Чехонин В П., Лебедев С В, Блинов ДВ., Гурина О.И и др. // Патогенетическая роль нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера для нейроспецифических белков при перинатальных гипоксически-ишемических поражениях центральной нервной системы у новорожденных - Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии - 2004, том 3, N 2, с. 50-61

46. Чехонин В.П, Лебедев СВ, Рябухин И А, Гурина и др. // Селективное накопление моноклональных антител к нейроспецифической енолазе в ткани мозга крыс с окклюзией средней мозговой артерии. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2004, N 10, с.388-392

«Моноклональные антитела к нейроспецифичееким антигенам. Получение, иммуиохимический анализ, исследование проницаемости гематоэнцефалического барьера»

Диссертационная работа посвящена исследованию функций ГЭБ с применением иммунохимических тест-систем, разработанных на основе моноклональных AT, исследованию перспектив проникновения анти-НСБ-АТ через ГЭВ в норме и при патологии а также изучению перспектив создания иммунолипосомальных систем транспорта к клеткам-мишеням нервной ткани

В процессе выполнения работы были получены высокоочищенные препараты нейроспецифических белков (НСБ) - GFAP, NSE и МВР, созданы гибридомы, продуцирующие моноклональные AT к этим антигенам и разработаны тест-системы иммуноферментного анализа НСБ и анти-НСБ-АТ При скрининге образцов сыворотки крови и тиквора было показано увеличение уровня НСБ и анта-НСБ-АТ при открытых черепно-мозговых травмах, фебрильных судорогах, нарушениях мозгового кровообращения тяжелой степени у взрослых и новорожденных детей Полу чекные результаты позволяют рекомендовать динамический иммуноферментный анализ НСБ и анти-НСБ-АТ в клинико-лабораторной практике для диагностики, дифференциальной диагностики, контроля эффективности проводимой терапии при нервно-психических заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций ГЭБ

При исследовании проницаемости ГЭБ для меченных 1251 анти-NSE-AT. было выявлено, что через нормальный ГЭБ AT не проникают В тоже время был продемонстрирован феномен прорыва ГЭБ и селективного накопления анти-NSE-AT в ткани мозга крыс с индуцированной ишемией головного моэга В работе проведено исследование перспектив применения анти-НСБ-АТ в качестве векторов при создании диагностических и лекарственных препаратов направленного типа действия Был продемонстрирован эффект взаимодействия ПЭГилированных иммунолипосоч с ати-GFAP-AT в качестве вектора с астроцитами Полученные в работе результаты могут иметь значение в решении фунтаментальных и прикладных задач нейро иммунохимии при поиске нейроспецифических белков путем иммунохимического отбора гибридомных клонов, продуцирующих специфические моноклональные антитела, иммуиохимическом исследовании функций ГЭБ в норме и при патологии, а также в разработке методологической и экспериментальной базы для создания диагностических и лекарственных препаратов направленного типа действия

«Monoclonal antibodies to neurospecific antigens.Purification, immunochemical analysis, study of the

blood-brain barrier permeability»

The thesis is devoted to the study of blood-bram barrier (BBB) functions using immunochemical test systems elaborated on the basic of monoclonal antibodies (AB), examination of perspectives. of the penetration of ami NSP-AB through BBB in the norm and pathology, and study of perspectives of the creation of immunoliposomal svstems of the transport to target cells of the ner\ ous tissue as well

Highly purified preparations of neurospecific proteins (NSP) - GFAP NSE and MBP were obtained, hvbndomas producing monoclonal AB's it these antigens were made and test systems of NSP and anti-NSP-AB immunoenzymatic analysis were elaborated m the process of the work being earned out In the screening analysis of biood serum and liquor a growth of NSP and anti-NSP-AB level in cranium-cerebral traumata, febrile seizure neuroinfections, disturbances of brain blood circulations of severe degree m adolescents and the newborns were discovered The findings allow to recommending dynamic иптшюептушайс analysis of NSP and anti-NSP-AB m climco-Iaboratorv practicc for diagnosis, differential diagnosis, control of the efficacy in neuro-psvchiatnc diseases, associated with BBB function disturbances

In the study of BBB permeability for the marked 125I anti-NSE-AB it was discovered that antibodies do not penetrate through the BBB in the norm At the same time the phenomenon of the BBB break through a selectn e anti-NSP-AB accumulation in rat bram tissue with the induced ischemia of the bram was demonstrated The studv of perspectives of anti-NSP-AB as vectors m elaboration of diagnostic and curative preparations of directed effect tvpe was earned out Effect f the interaction of the PEGxlated immunoliposomes with anti-GFAP-AB as the vector with astroevtes was demonstrated Findings of the study may be important to solve neurochemistrv fundamental and applied problems m search of hybndome clones producing specific monoclonal antibodies m immunochemical study of BBB functions in the norm and pathology as well as in the elaboration of methodological and expenmental basis for the creation of diagnostic and medicinal preparations of directed action tvpe

РНБ Русский фонд

о 'k Ш

^^ 2006-4

1926

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.991. Подписано к печати 27.12.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 2,75. Тираж 150 экз. Заказ 1258. Тел 939-3890,939-3891 Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Гурина, Ольга Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ИММУНОХИМИЧЕСКОМ АНАЛИ- 12 ЗЕ НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКИХ БЕЛКОВ

I. Нейроспецифические белки

Глиофибриллярный кислый протеин (ОБАР).

Нейроспецифическая еиолаза (ИЗЕ), или антиген 14-3-2.

Основной белок миелина (МВР).

II. Моноклональные антитела к нейроспсцифическим белкам и их клини-ко-лабораторное применение.

Современные представления о моноклональных антителах и способах их получения.

2.7. Приготовление ПЭГилированных липосом, конъюгированных с анти-НСБ-антителами

Моноклональные анти-ОРАР-АТ и их клинико-лабораторное применение

Моноклональные анти-МБЕ-АТ и их клинико-лабораторное применение

Моноклональные анти-МВР-АТ и их клинико-лабораторное применение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика исследуемого материала

2.2. Общие методы, применяемые при очистке нейроспецифических антигенов

2.3. Получение антисывороток к нейроспецифическим белкам, их анализ и стандартизация

2.4. Получение моноклональных антител к нейроспецифическим белкам и их характеристика

2.5. Методы иммунохимическиго анализа

2.6. Методы количественного определения белка

2.8. Статистическая обработка полученпых результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. Разработка способов получения нейроспецифических белков (GFAP,

NSE и МВР) высокой степени чистоты.

ГЛАВА 4. Получение моноклональных антител к нейроспецифическим белкам анти-GFAP-, анти-NSE- и анти-МВР-антител).

ГЛАВА 5. Разработка тест-систем иммуноферментного определения нейроспецифических антигенов и антител к ним в биологических жидкостях на основе моно- 190 клональных антител.

ГЛАВА 6. Комплексный иммуноферментный анализ нейроспецифических белков (GFAP, NSE, МВР) и антител к ним в биологических жидкостях больных, с забо- 201 леваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ.

ГЛАВА 7. Исследование резистентности ГЭБ для анти-КБЕ-антител в эксперименте

ГЛАВА 8. Исследование перспектив направленного транспорта ПЭГилированных иммунолипосом на основе моноклональных анти-GFАР-антител к клеткам- 236 мишеням нервной ткани.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам (НСБ). Получение, иммунохимический анализ, исследование гематоэнцефалического барьера"

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Хорошо известно, что специфические свойства клеток нервной ткани в известной мере определяются структурой и функциями нейроспецифических белков (НСБ), посредством которых генетическая информация получает свое реальное воплощение [6, 24, 175, 187, 359]. Несмотря на то, что за 40-летний период, появились сообщения о более чем 65 НСБ, научное направление, связанное с их изучением, продолжает активно развиваться как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах [118, 187, 246, 267, 282, 297, 320, 332,411, 414,461,476, 518, 538].

Основными методами идентификации НСБ, а также их качественного и количественного определения в биологических жидкостях и тканях являются методы иммунохимического анализа [15, 29, 187, 386, 391, 410,438, 440, 441].

В этом аспекте, признавая роль поликлональных антител, как инструмента обеспечившего и значительно расширившего концептуальное понимание механизмов функционирования клеток нервной ткани и нервной системы в целом, стало очевидным, что эффективность дальнейшего применения поликлональных антител ограничивается рядом недостатков, которых практически невозможно избежать как при исследовании спектра антигенов нервной ткани, так и при разработке методов диагностики и лечения. Даже иммунизация высокоочищенными> препаратами НСБ не может исключить присутствие в антисыворотках антител к антигенам, содержащихся в основном препарате в виде минорных примесей, не говоря об антителах к различным эпитопам антигена [118, 167, 187, 230, 234, 410, 440, 441 480, 484].

Открытие в 1975 Köhler G. и Milstein С. [288] способа длительного культивирования Ig-секретируюших клеток, привело к созданию технологии получения гибридом, способных продуцировать моноклональные антитела, специфичные к одной антигенной детерминанте в неограниченных количествах. Благодаря тщательному скринингу и отбору гибридомных клонов, участие моноклональных антител в перекрестных реакциях практически исключено, что объясняет высокую специфичность диагностических тест-систем на их основе, а также возможность их полноценной стандартизации.

Преимущества препаратов моноклональных антител перед поликлональны-ми обусловлены, прежде всего, их уникальной гомогенностью и специфичностью. 5

Продуцируясь одним клоном гибридных клеток моноклональные антитела абсолютно идентичны между собой и обладают способностью связывать только один эпитоп молекулы антиген, выявляя его в пикограммовых количествах [376, 394, 487, 502]. Очевидно, что эти свойства моноклональных антител окрывают новые перспективы не только в исследовании субмолекулярной структуры антигенов и эпитопов в частности, но и в разработке диагностических тест-систем [82, 303, 415], а также в создании диагностических и лекарственных препаратов направленного типа действия [109, 121, 190, 260, 270, 425, 441, 442, 506, 508, 522, 523].

Разработка способа получения моноклональных антител для каждого из НСБ, по сути дела, в каждом случае является самостоятельной научной проблемой, напрямую зависящей от природы антигена, его физико-химических свойств, клеточной локализации [49, 234, 441, 484]. Невозможно использовать ранее известные методические подходы, применяемые для получения гомогенных препаратов одного НСБ, для выделения других НСБ, различающихся по химической структуре и свойствам [187, 246, 267, 297, 411, 518, 538]. Очевидно, что при видимом однообразии методических приемов получения гибридных клеток К(ТОму и или иному антигену, получение моноклональных антител к конкретному НСБ является самостоятельной научной и технологической задачей.

С другой стороны, получение моноклональных антител к нейроспецифиче-скому белку по-новому формирует стратегии повышения его гомогенности путем очистки методами иммуноафинной хроматографии, анализа в биологических жидкостях, фундаментального и прикладного исследования субмолекулярной структуры и функций НСБ. Особый фундаментальный интерес представляет собой возможность создания банка моноклональных антител для идентификации, биологического сравнения НСБ и стандартизации методов их детекции.

Очевидно, что разработка иммунохимических тест-систем анализа НСБ на основе соответствующих моноклональных антител открывает перспективы изучения метаболизма НСБ в норме и при патологии, анализа функций гематоэнцефа-лического барьера ГЭБ при заболеваниях, сопровождающихся нарушением его резистентности, а также роли анти-НСБ-антител в патогенезе нервно-психических заболеваний.

Самостоятельное значение могут иметь научные направления, исследующие возможности применения моноклональных анти-НСБ-антител как транспорти6 рующих векторов для доставки диагностических и лекарственных препаратов к клеткам-мишеням нервной ткани.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ:

Получить моноклональные анти-НСБ-антитела, исследовать функции гема-тоэнцефалического барьера с помощью иммунохимических тест-систем, разработанных на их основе, и оценить перспективы создания иммунолипосомальных систем транспорта к клеткам-мишеням нервной ткани.

В связи с этим были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Разработать способы получения препаратов СБ АР, ^Е и МБР, степень гомогенности которых удовлетворяет критериям чистоты белковых препаратов, необходимых для получения моноклональных антител и создания иммунофермент-ных систем анализа;

2. Разработать способы получения моноклональных антител к СБ АР, ^Е и МБР;

3. Разработать и апробировать в клинико-лабораторной практике иммунофер-ментные тест-системы анализа СБ АР, ШЕ и МБР в биологических жидкостях на • основе моноклональных антител, пригодные для практического здравоохранения;

4. Провести иммуноферментный скрининг ОБ АР, ШЕ и МБР в биологических жидкостях больных нервно-психическими, нейроонкологическими и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением проницаемости ГЭБ;

5. Провести сравнительный анализ иммуноферментных тест-систем определения исследуемых НСБ на основе поликлональных и моноклональных антител;

6. Изучить клеточную специфичность СБ АР, ^Е и МБР на срезах препаратов нервной ткани и культурах нейронов, астроцитов и олигодендроглиоцитов;

7. Исследовать проницаемость ГЭБ в направлении кровь-мозг для меченных I125 моноклональных анти-НСБ-антител в норме и при экспериментальной ишемии головного мозга крыс.

8. Исследовать перспективы применения моноклональных анти-НСБ-антител как векторов для направленного транспорта лекарственных и диагностических препаратов к клеткам-мишеням нервной ткани.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Разработанные способы получения препаратов нейроспецифических белков (ОБАР, №Е, МВР), позволили получить моноклональные антитела и создать им-муноферментные и иммуногистохимические системы анализа НСБ в биологических жидкостях человека и животных.

Модифицированная технология получения гибридных клеток на основе В-лимфоцитов селезенки мышей, предварительно иммунизированных очищенными препаратами НСБ (ОБАР, ^Е, МВР) и клетками миеломной линии 8р2/0 позволила получить моноклональные антитела к этим антигенам.

Впервые создан отечественный банк гомогенных препаратов нейроспецифических антигенов (ОБАР, ИБЕ, МВР) и моноклональных антител к ним, а также разработана стратегия их стандартизации.

Впервые разработаны иммуноферментные тест-системы анализа СБАР, КБЕ, МВР в биологических жидкостях и тканевых экстрактах на основе моноклональных антител и проведена их стандартизация.

Впервые разработаны иммуногистохимические тест-системы, позволяющие £ высокоселективно визуализировать клетки нервной ткани, синтезирующие НСБ (ОРАР, ШЕ, МВР).

Впервые осуществлена клинико-лабораторная апробация разработанных иммуноферментных тест-систем анализа НСБ на основе моноклональных анти-НСБ-антител в биологическом материале больных, в патогенезе заболеваний которых имеет место нарушение функций ГЭБ, а также проведен сравнительный анализ эффективности применения диагностических тест-систем на основе поликло-нальных и моноклональных антител.

Впервые в эксперименте выявлен феномен прорыва через ГЭБ и селективного накопления в ткани мозга меченных I125 анти-НСБ-антител после их внутривенного введения при индуцированном гипоксически-ишемическом поражении головного мозга крыс. Подобный феномен не наблюдался в случае инъекции соответствующих препаратов животным с нормальным ГЭБ.

Впервые разработана технология создания ПЭГилированных иммунолипо-сомальных контейнеров направленного типа действия на основе моноклональных антител к ОБ АР, ЫБЕ и МВР, способных селективно захватываться лишь экспонированными на мембране антигенами соответствующих клеток-мишеней.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.

1. Создан отечественный банк стандартных гомогенных препаратов ОБ АР, ^Е и МВР, степень гомогенности которых позволяет получать гибридные клетки, продуцирующие моноклональные антитела к этим НСБ.

2. Разработана технология получения гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к ОБ АР, ЫБЕ и МВР; проведена их стандартизация и создан отечественный банк гибридом, продуцирующих вышеуказанные моноклональные антитела.

3. Разработаны и внедрены в клинико-лабораторную' практику иммуно-ферментные тест-системы анализа ОБ АР, ЫБЕ и МВР на основе моноклональных антител к ним. Проведена апробация этих тест-систем в клинико-лабораторной практике для комплексного обследования больных, в патогенезе заболеваний которых имеет место нарушение функций ГЭБ; Выработаны рекомендации по применению диагностических тест-систем анализа нейроспецифических антигенов на основе моноклональных антител в клинико-лабораторной практике. I

4. Разработана технология получения ПЭГилированных иммунолипосо-мальных контейнеров на основе моноклональных анти-НСБ-антител направленных к клеткам мишеням нервной ткани.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1 .Разработанные способы очистки препаратов нейроспецифических белков (вРАР, ЫБЕ и МВР), позволяют применять их для получения гибридных клеток продуцирующих соответствующие моноклональные антитела.

2.Модифицированная технология создания гибридных клеток на основе В-лимфоцитов селезенки мышей, предварительно иммунизированных очищенными препаратами НСБ (ОБАР, ^Е, МВР) и клеток миеломной линии 8р2/0, позволяет получать моноклональные антитела к этим антигенам.

3.Полученные препараты НСБ (ОБАР, ЫБЕ, МВР) и соответствующих моноклональных антител дают возможность разработать на их основе иммунофер-ментные и иммуногистохимические тест-системы анализа ОБ АР, ЫБЕ и МВР, характеризующиеся общепринятыми стандартами параметров точности, воспроизводимости и надежности.

4.Иммуноферментный анализ НСБ на основе моноклональных антител в сыворотке крови и ликворе, может быть применен для диагностики, мониторинга и контроля эффективности проводимой терапии больных нервными, психическими, онкологическими, инфекционными и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением функций ГЭБ.

5.Дефинитивный гематоэнцефалический барьер непроницаем для препара

125 тов меченных I анти-НСБ-антител, введеных в кровоток. Гипокси-ишемическое поражение головного мозга, индуцированное путем окклюзии ветви средней мозговой артерии, приводит к нарушению резистентности ГЭБ, сопровождающемуся

1 9 ^ феноменом прорыва и накопления в ткани мозга препаратов меченных I анти-НСБ-антител, введеных в кровоток.

6.Разработанная технология получения ПЭГилированных иммунолипосом на основе моноклональных анти-НСБ-антител позволяет создавать микроконтейнеры направленного типа действия, способные селективно захватываться соответствующими антигенами мембран клеток-мишеней.

АПРОБАЦИЯ. ВНЕДРЕНИЕ. ПУБЛИКАЦИИ

Результаты диссертационной работы используются в клинике нервных болезней Российского государственного медицинского университета и НИИ неврологии РАМН. Различные аспекты диссертационной работы явились основанием для планирования новых научных тем, продолжающих данное научное направление.

Основные положения были представлены и обсуждены на VIII International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems, Salt Lake City, Utah, February 1997; III rd European Meeting on glial cell function in health and disease, Greece, May 1998; 5 IBRO WORDL CONGRESS OF NEUROSCIENCE, Jerusalem, Israel, 1999; IV European meeting on glial cell function in health and disease, Barcelona, may 2000; в материалах II Российского Конгресса по патофизиологии, Москва, 2000; XXII C.I.N.P. Congress, Brussels, Belgium, July 2000; 3-rd International conference "Biological basis of individual sensitivity to psychotropic drugs", Suzdal, May 2001; I Neurotoxicity meeting: mechanisms for neurodegenerative disorders, March 2001, Pucon, Chile; International Conference of Neurochemistry, September 2001, Yerevan-, FIFTH EUROPEAN MEETING ON GLIAL CELL FUNCTION IN HEALTH AND DISEASE Rome, Italy, May 2002; II Российской конференции «Нейроиммуно-патология», Москва, май 2002 г. на семинаре "Актуальные проблемы современной

10 психиатрии", Томск, декабрь 2002 г., на заседаниях Проблемного Совета по биологическим основам психиатрии ГНЦ ССП им. В.П.Сербского, 2000-2003; SIXTH IBRO WORLD CONGRESS OF NEUROSCIENCE, July 10 - 15, 2003, Prague, Czech Republic, VI European Meeting on Glial Cell Function in Health and Disease Germany, Berlin, 2003.

По теме диссертации опубликовано 46 печатных работ, результаты диссертации включены в монографию «Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов» Москва, Медицина, 2003.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 319 машинописных страницах; состоит из введения, 9 глав, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. В основных главах работы приведены данные обзора литературы, характеристика объекта, методов исследования, а также используемого материала, результаты собственных исследований и их обсуждение.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гурина, Ольга Ивановна

выводы

1. Способы очистки GFAP, NSE и МВР на основе комбинации солевого фракционирования, ионообменной, гидрофобной и иммуноаффинной хроматографии, гель-фильтрации и препаративного диск-электрофореза позволяют выделять высокоочищенные препараты этих НСБ. Полученные препараты GFAP, NSE и МВР могут быть использованы для получения моноклональных антител и разработки иммуноферментных тест-систем их количественного определения.

2. Модифицированный способ иммунизации мышей высокоочищенными препаратами GFAP, NSE и МВР позволяет получать B-лимфоциты селезенки, способные при конъюгировании с клетками миеломы Sp2/0 образовывать гибридные клетки, продуцирующие моноклональные анти-GFAP-, анти-NSE- и анти-МВР-антитела класса IgG. Полученные препараты моноклональных анти-НСБ-антител могут применяться для разработки иммуноферментных и иммуногистологических тест-систем количественного анализа НСБ.

3. Разработанные и апробированные в эксперименте и клинической практике тест-системы количественного иммуноферментного анализа GFAP, NSE и МВР на основе соответствующих моноклональных антител позволяют специфично, надежно, воспроизводимо и достоверно определять эти антигены в сыворотке крови и ликворе человека и животных.

4. Иммуноферментный анализ GFAP, NSE и МВР на основе соответствующих моноклональных антител в сыворотке крови и ликворе, может быть применен для диагностики, мониторинга и контроля эффективности проводимой терапии больных нервными, психическими, онкологическими, инфекционными и соматическими заболеваниями, сопровождающимися нарушением функций ГЭБ.

5. Сравнительный анализ результатов иммуноферментного скрининга GFAP, NSE и МВР в сыворотке крови доноров и больных с заболеваниями, сопровождающимися нарушением резистентности ГЭБ, выполненного с помощью тест-систем на основе моноклональных и поликлональных антител, позволил выявить более высокую диагностическую эффективность для тест-систем на основе моноклональных антител. Процент ложноположительных результатов выявления НСБ при использовании тест-систем на основе поликлональных антител составлял от 3,2 % до 3,9 %, в то время как применение иммуноферментных тест-систем на основе моноклональных антител не выявило ложноположительных результатов.

6. Иммуногистохимический анализ вРАР, ^Е и МВР на основе соответствующих моноклональных антител позволяет специфически локализовать их в клетках нервной ткани. При этом ОРАР специфически локализуется в астроцитах нервной ткани, ^Е - в нейронах, а МВР - в олигодендроцитах, астроцитах и шванновских клетках.

7. Дефинитивный гематоэнцефалический барьер непроницаем для препа

1 91 ратов меченных I анти-НСБ-антител, введеных в кровоток. Гипокси-ишемическое поражение головного мозга, индуцированное путем окклюзии ветви средней мозговой артерии, приводит к нарушению резистентности ГЭБ, сопровождающемуся феноменом прорыва и накопления в ткани мозга препаратов мечен

19 Я ных I анти-НСБ-антител, введеных в кровоток.

8. Технология получения ПЭГилированных иммунолипосом, базирующаяся на конъюгации тиолированных 2-иминотиоланом анти-ОРАР-антител с ПЭГи-лированными липосомами позволять создавать микроконтейнеры направленного типа действия, способные селективно захватываться астроцитами нервной ткани.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанные способы получения гомогенных препаратов ОБ АР, ИБЕ и МБР на основе комбинации солевого фракционирования, ионообменной, гидрофобной и иммуноаффинной хроматографии, гель-фильтрации и препаративного диск-электрофореза могут быть рекомендованы для создания иммуноферментных тест-систем их количественного определения.

Полученные на основе модифицированного способа иммунизации высоко-очищенными препаратами НСБ моноклональные анти-НСБ-АТ могут быть рекомендованы для разработки иммуноферментных и иммуноцитологических тест-систем количественного анализа НСБ.

Иммуноферментный мониторинг ОБ АР, ЫЯЕ и МБР на основе соответствующих моноклональных АТ в сыворотке крови и ликворе целесообразно применять для диагностики и контроля эффективности проводимой терапии больных нервными, психическими, онкологическими, инфекционными и соматическими-заболеваниями, сопровождающимися нарушением функций ГЭБ.

Иммуноферментный анализ анти-НСБ-АТ в сыворотке крови может быть рекомендован для определения степени сенсибилизации организма по отношению' к индивидуальным НСБ.

Технология получения ПЭГилированных иммунолипосом, базирующаяся на конъюгации тиолированных 2-иминотиоланом анти-НСБ-АТ с ПЭГилированными липосомами может применяться для создания микроконтейнеров направленного типа действия, способных селективно захватываться клетками-мишенями нервной ткани.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Гурина, Ольга Ивановна, Москва

1. Антонова ОМ. Нейроспецифическая енолаза и ее роль в механизмах антительной агрессии в мозг: Дис. . канд. мед. наук. —М., 1997.

2. Абелев Г.И. Моноююнальные антитела // Соросовский образовательный журнал- 1998-№ 1 с. 16-20

3. Ашмарин И.П., Стукалова В.В. Нейрохимия. М.: 1996. С. 207-245.

4. Бадалян Л.О., Чехонин В.П., Бембеева Р.Ц. Специфические белки нервной ткани в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при коматозных состояниях у детей // Журн. невропатол. и психиатр. — 1997. — Т. 97., № 1. — С. 461 466.

5. Беляева И.А. Нейроспецифические белки в крови и ликворе при клещевой нейроинфекции (клинико-диагностические и прогностические аспекты) // Дис. . канд. мед. наук. — М., 1995.

6. Березин В.А., БеликЯ.В. Специфические белки нервной ткани. — Киев: Науко-ва думка, 1990. — 264 с.

7. Березов Т.Т., Яглова Н.В., Дмитриева Т.Б. и др. Направленный транспорт лекарственных средств с помощью липосом // Вестник Российской Академии медицинских наук 2004 - №. 5 - с. 42-47

8. Биктимиров Р.Г. Роль комплексного иммуноферментного определения ней-роспецифических белков в диагностике опухолей головного мозга: Автореф. дис. . канд. мед. наук. — М., 1993.

9. Бредбери М. Концепция гематоэнцефалического барьера. — М.: Мир, 1983.

10. Бурбаева Г.Ш. Физиологически активные белки мозга как возможные маркеры психиатрических заболеваний // Вестник РАМН, — 1992. — № 7. — С. 51 54.

11. Калашников В.В. Раково-эмбриональные белки человека: Дис. . д-ра. мед. наук. — М„ 1986.

12. Мак-Кей Р., Рэфф М., Рейхардт JI. Моноююнальные антитела к антигенам нервной ткани. — М.: Мир, 1984.

13. Семенова A.B. Основной белок миелина (получение моноклональных антител, разработка иммуноферментного анализа и клинико-лабораторное применение): Дис. . канд. мед. наук. — М., 2002.

14. Чехонин В.П. Специфические белки нервной ткани человека и животных (идентификация, выделение, физико-химическая характеристика и клинико274лабораторные исследования): Дис. . д-ра мед. наук. — М., 1989.

15. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Е., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ ней-роспецифических антигенов.- 2000 М.: Медицина - 416 с.

16. Чехонин В.П., Турина О.И., Портная Т.С. и др. Моноклональные анти-NSE-антитела: получение, характеристика и иммуноферментный анализ. // Вопросы медицинской химии 2002 - вып. 5 - т. 48 - с. 477-484.

17. Чехонин В.П., Рябухин И.А., Кашпаров H.A., Жирков Ю.А. Направленный транспорт психотропных средств через гематоэнцефалический барьер — В сб.: Социальная и судебная психиатрия: история и современность. — М.: РИО ГНЦССП им. В.П.Сербского, 1996.

18. Чехонин В.П., Турина О.И., Семенова A.B. и др. Основной белок миелина. Строение, свойства, функции, роль в диагностике демиелинизирующих заболеваний. // Вопросы медицинской химии 2000 - Т. 46 - № 6 - с. 549-563.

19. Чехонин В.П., Преображенская И.С., Яхно H.H. Проницаемость гематоэнце-' фалического барьера при болезни Альцгеймера и паркинсонизме с когнитивными нарушениями. // Ж. невр. и психиат. им. С.С. Корсакова 2001 - №5 - с. 30-33

20. Чехонин В.П., Турина О.И., Дмитриева Т.Е. и др. Моноклональные анти-GFAP антитела: получение характеристика и иммуноферментный анализ. // БЭБМ 2001- № 8 - с. 188-191

21. Чехонин В.П., Семенова A.B., Турина О.И. и др. Моноклональные антитела к основному белку миелина. // Нейрохимия 2001 - Т. 18 -№ 4 - с. 310-314

22. Чехонин В.П., Жирков Ю.А., Турина О.И. и др. ПЭГилированные иммунолипо-сомы, специфичные к астроцитам // Доклады РАН. Серия: Биофизика и биохимия 2003 -№391 - с. 236-239

23. Штарк М.Б. Мозгоспецифические белки (антигены) и функция нейрона. — М.: Медицина, 1985.

24. Abe M., Goto Т., Wolfenbarger D. et al. Novel immunization protocol and ELISA screening methods used to obtain and characterize monoclonal antibodies specific for humanlight chain variable-region subgroups. // Hybridoma. 1993 - V. 12(4) - P. 475-483.

25. Ahlsen G., Rosengren L., Belfrage M„ et al. Glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid of children with autism and other neuropsychiatric disorders // Biol. Psychiatry. — 1993. — V. 33. — P. 734-743.

26. Ainger K., Avossa D., Diana A.S. et al. Transport and localization elements in myelin basic protein mRNA. // J. Cell. Biol. 1997 -V. 138 - P. 1077-1087.

27. Aksamit A.J. Jr., Preissner C.M., Homburger H.A. Quantitation of 14-3-3 and neuron-specific enolase proteins in CSF in Creutzfcldt-Jakob disease. // Neurology. 2001 -V. 28 -№ 57 - P. 728-730.

28. Albrechtsen M., Bock E. Quantification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in human body fluids by means of ELISA employing a monoclonal antibody // J. Neuroimmunol.1985.—-V. 8, —P. 301 309.

29. Albrechtsen M., Massaro A., Bock E. Enzyme-linked immunosorbent assay for human glial fibrillary acidic protein using a mouse monoclonal antibody // J, Neurochem. — 1985.1. V. 44 —P. 560-565.

30. Albrechtsen M., Sorensen P.S., Gjerris F., Bock E. High cerebrospinal fluid concen-, tration of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in patients with normal pressure hydrocephalus. // J. Neurol. Sci. 1985 - V. 70 - P. 269-274.

31. Albrechtsen M., von Gerstenberg A.C., BockE. Mouse monoclonal antibodies react-! ing with human brain glial fibrillary acidic protein // J. Neurochem. — 1984. — V. 42, №1. — P. 86 93.

32. Alien T.M., Brandéis E., Hansen C.B. et al. A new strategy for attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes resulting in efficient targeting to cancer cells. // Bio-chim Biophys Acta 1995 - V. 1237 - P. 99-108.

33. Allinquant B., Staugaitis S.M., D'Urso D. et al. The ectopic expression of myelin basic protein isoforms in Shiverer oligodendrocytes: implications for myelinogenesis. // J. Cell. Biol. 1991 - V. 113 - P. 393-403.

34. AlvordE.C., Hruby S. Myelin basic protein and its free and and bound antibodies in cerebrospinal fluid. All three must be determined on each specimen. // Acta Neurol (Napoli). -1991 -V. 13(2)-P. 97-106.

35. Amaducci L., Forno K.L., Eng L.F. Glial fibrillary acidic protein in cryogenic lesions of the rat brain // Neurosci. Lett. — 1981. — V. 21. — P. 27 32.

36. Anderson R.E., Winnerkvist A., Hansson L.O. et al. Biochemical markers of cerebrospinal ischemia after repair of aneurysms of the descending and thoracoabdominal aorta. // J Cardiothorac Vase Anesth. 2003 - V. 17 - P. 598-603.

37. Arochena M, Anadon R., Diaz-Regueira S.M. Development of vimentin and glial fibrillary acidic protein immunorcactivities in the brain of gray mullet (Chelon labrosus), an advanced teleost. // J Comp Neurol. 2004 - V. 469(3) - P. 413-436.

38. Aurell A., Rosengren L.E., Karlsson B. et al. Determination of S-100 and glial fibrillary acidic protein concentrations in cerebrospinal fluid after brain infarction. // Stroke. — 1991 — V. 22-P. 1254-1258.

39. Back S.A., Luo N.L. et al. Late oligodendrocute coincide with the developmental window of vulnerability for human perinatal white matter injury. // J. Neurosci 2001 - V. 21(4)-P. 1302-1312

40. Banks W.A., Terrell B., Farr S.A. et al. Passage of amyloid beta protein antibody across the blood-brain barrier in a mouse model of Alzheimer's disease. // Peptides 2002 -V. 23(12)-P. 2223-2226.

41. Banks W.A., Farr S.A., Morley JE. Entry of Blood-Borne Cytokines into Central Nervous System: Effects on Cognitive Processes. // Neuroimmunomodulation. 2002-2003 -V. 10(6)-P. 319-327

42. Barbarese E., Koppel D.E., Deutscher M.P. et al. Protein translation components are colocalized in granules in oligodendrocytes. // J. Cell. Sci. 1995 - V. 100 - P. 2781-2790.

43. Barber P.C., Lindsay R.M. Schwann cells of the olfactory nerves contain glial fibrillary acidic protein and resemble astrocytes // Neuroscience. — 1982. — V. 7. — P. 3077 3090.

44. Barger S.W., Van Eldik J.J. SI00 stimulates calcium fluxes in glial and neuronal cells // J. Biol. Chem. — 1992. — V. 267. — P. 9689 9694.

45. Barnea A., Roberts J. A method for dissociation and aggregate culture of human fetal brain cclls in serum-free medium. // Brain Res. Protocols 1999 - V. 4 - P. 156-164.

46. Barone F.C., Clerk R K., Price W.J., et al. Neuron-specific enolase increases in cerebral and systemic circulation following focal ischemia // Brain Res. — 1993. — V. 1 — P. 71 82.

47. Basile A.M., Fusi C., Conti A.A. et al. S-100 protein and ncuron-specific enolase as markers of subclinical cerebral damage after cardiac surgery: preliminary observation of a 6-month follow-up study. // Eur Neurol. 2001 - V. 45(3) - P. 151-159.

48. Baumann N. Pham-Dinh D. Biology of Oligodendrocyte and Myelin in the Mammalian Central Nervous System. // Physiol. Rev. 2001 - V. 81 - P. 871-927.

49. Beach T.G., Walker R., McGeer E.G. Patterns of gliosis in Alzheimer's disease and aging cerebrum. // Glia 1989 - V. 2 - P. 420 - 436.

50. Beaudeux J.L., Leger P., Dequen L. et al. Influence of hemolysis on the measurement of S-lOObeta protein and neuron-specific enolase plasma concentrations during coronary artery bypass grafting. // Clin Chem. 2000 - V. 46(7) - P. 989-990.

51. Beaudry P., Cohen P., Brandel J.P. et al. 14-3-3 protein, neuron-specific enolase, and S-100 protein in cerebrospinal fluid of patients with Creutzfeldt-Jakob disease. // Dement Geriatr Cogn Disord. 1999 - V. 10 - P. 40-46.

52. Beemer F.A., Vlug A.M.C., et al. Isoenzyme patterns of enolase of childhood tumors // Cancer (Philadelphia). — 1984. — V. 54. — P. 293 296.

53. Beems T., Simons K.S., Van Geel W.J. et al. Serum- and CSF-concentrations of brain specific proteins in hydrocephalus. // Acta Ncurochir (Wien). 2003 - V. 145 - P. 37-43.

54. Bederson J.B., Pitts L.H., Tsuji M. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. // Stroke. 1986 - V. 17(3) - P. 472-476.

55. Bellini T., Rippa M., Matteuzzi M. A rapid method for purification of myelin basic protein. // J. Neurochem 1986 - V. 46 (5) - P. 1644-1646.

56. Benda P., Lightbody J., et al. Differentiated rat glial cell strain in tissue culture // Science. — 1968. — V. 161. — P. 370.

57. Bennet G.S., Tapscott S.J., Kleinbart F.A., et al. Different proteins associated with 10-nanometer filaments in cultured chick neurons and nonneuronal cells // Science 1981 - V. 212-P. 567-569.

58. Berger M, Shankar V, Vafai A. Therapeutic applications of monoclonal antibodies. // Med Sci.-2002-V. 324(1)-P. 14-30

59. Berger T., Rubner P., Schautzer F. et al. Antimyelin antibodies as a predictor of clinically definite multiple sclerosis after a first demyelinating event. // N Engl J Med. — 2003 — № 10-V. 349(2)-P. 139-145.

60. Berger R.P., Pierce M.C., Wisniewski S.R. et al. Neuron-specific enolase and S100B in cerebrospinal fluid after severe traumatic brain injury in infants and children. // Pediatrics. -2002-V. 109-P. E31.

61. Berry M. Regeneration in the central nervous system In: Smith W.T., Canavagh J.B. (eds.). Recent advances in neuropathology. // Edinburgh: Churchill Livingstone, 1979 — V. 1 -P. 67- 111.

62. Berteiii E., Regoli M., Gambelli F. et al. GFAP is expressed as a major soluble pool associated with glucagon secretory granules in A-cells of mouse pancreas. // J Histochem Cyto-chem. — 2000- V. 48(9)-P. 1233-1242.

63. Benzinger P., Martiny-Baron G., Reusch P. et al. Targeting of endothelial KDR receptors with 3G2 immunoliposomes in vitro. // Biochim. Biophys. Acta. 2000 - V. 1466. — No. 1-2, —P. 71-78.

64. Biddle R., March E. et al. // Research News. Mouse News Lett. 1973 V. 48 - P.24.

65. Bigbee J.W., Eng L.F. Glial fibrillary acidic protein synthesized in vitro using messenger RNA from Jimpy mouse spinal cord // Brain Res. — 1982. — V. 249. — P 383 386.

66. Bignami A., Dahl D. Astrocyte-specific protein and neuroglial differentiation. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic protein // J. Comp. Neurol. — 1974. — V. 153. — P. 27 38.

67. Bignami A., Dahl D. Astroglial protein in the developing spinal cord of the chick embryo // Develop. Biol. — 1975. — V. 44. — P. 204.

68. Bignami A., Dahl D. Differentiation of astrocytes in the cerebellar cortex and the pyramidal tracts of the newborn rat. An immunofluorescence study to a protein specific to astrocytes // Brain Res. — 1973. — V. 49. — P. 393 402.

69. Bignami A., Dahl D. Isolation of GFA protein from normal brain — a commcnt // J. Histochem. Cytochem. — 1979. — V. 27. — P. 693.

70. Bignami A„ Dahl D. The astroglial response to stabbing. Immunofluorescence studies with antibodies to astrocyte-specific protein (GFA) in mammalian and submammalian vertebrates // Neuropathol. Appl. Neurobiol. — 1976. — V. 2. — P. 99 111.

71. Bignami A., Eng L.F., Dahl D., Uyeda C.T. Localization of the glial fibrillary acidic protein in astrocytes by immunofluorescence // Brain Res. — 1972. — V. 43. — P. 429 435.

72. Bigner D.D., Bigner S.H., Ponten J., et al. Heterogeneity of genotypic and pheno-typic characteristics of fifteen permanent cell lines derived from human gliomas // J. Neuropathol. Exp. Neurol. — 1981. — V. 40. — P. 201 229.

73. Bishop A.E., Polak J.M., et al. Neuron specific enolase: a common marker for theendocrine cells and innervation of the gut and pancreas // Gastroenterology. — 1982. — V. 83.1. P. 902-915.

74. Bjorklund H., Dahl D., Seiger A. Neurofilament and glial fibrillary acid protein-related immunoreactivity in rodent enteric nervous system //Neuroscience. — 1984. — V. 12.1. P. 277-287.

75. Blennow K., Wallirt A., Ekman R. Neuron specific cnolase in cerebrospinal fluid: a biochemical marker for neuronal degeneration in dementia disorders? // J. Neural Transmission P-D Sect.. — 1994. — V. 8. — P. 183 191.

76. Blennow M., Hagberg H., Rosengren L. Glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid: a possible indicator of prognosis in full-term asphyxiated newborn infants? // Pediatr. Res. — 1995. — V. 37. — P. 260 264.

77. Blennow M., Rosengren L, Jonsson S„ Forssberg H., et al. Glial fibrillary acidic protein is increased in the cerebrospinal fluid of preterm infants with abnormal neurological findings // Acta Paediatr. — 1996 — V. 85. — P. 485 489.

78. Blennow M., Savman K., lives P. et al. Brain-specific proteins in the cerebrospinal fluid of severely asphyxiated newborn infants. // Acta Paediatr. 2001 - V. 90 - P. 1171-1175.

79. Blomstrand C., Johansson B., Rosengren B. Blood-brain barrier lesions in acute hypertension in rabbits after unilateral X-ray exposure of the brain // Acta Neurol. Scand. — 1995.1. V. 31. — P. 97- 102.

80. Bock E., DissingJ. Demonstration of enolase activity connected to the brain specific protein 14-3-2 // Scand. J. Immunol. — 1975. — Suppl. № 2. — P. 31 36.

81. Bock J.L. The new era of automated immunoassay. // Am J Clin Pathol. 2000 -V. 113 (5)-P. 628-646.

82. Bodey B, Bodey B Jr et al. Genetically engineered monoclonal antibodies for direct anti-neoplastic treatment and cancer cell specific delivery of chemotherapeutic agents. // Curr Pharm Des. 2000 - V. 6(3) - P. 261-276.

83. Bodhireddy S.R., Lyman W.D., Rashbaum W.K. Immunohistochemical detection of myelin basic protein is a sensitive marker of myelination in second trimester human fetal spinal cord. // J Neuropathol Exp Neurol 1994 - V. 53 (2) - P. 144-149

84. Bologa L„ Deugnier M.A. et al. Myelin basic protein stimulates the proliferation of astrocytes possible explanation for multiple - sclerosis plaque - formation. // Brain Res. -1985-V. 346-P. 199-203.

85. Bonhomme V., Hans P., et al. Neuron-specific enolase as a marker of in vitro neuronal damage. Part III. Investigation of the astrocyte protective effcct against kainate-induced neurotoxicity // J. Neurosurg. Anesthesiol. — 1993. — V. 2. — P. 9 22.

86. Borusiak P., Herbold S. Scrum neuron-specific enolase in children with febrile seizures: time profile and prognostic implications. // Brain Dev. 2003 - V. 25 - P. 272-274.

87. Bradbury M W., Deane R. Permeability of the blood-brain barrier to lead // Neuro-toxicology. — 1993. — V. 2-3. — P. 1 6.

88. Brady S.T., Lasek RJ. Nerve specific enolase and creatine phosphokinase in axonal transport: soluble protein and the axoplasmic matrix // Cell. — 1981. — V 23. — P. 515 520.

89. Brady G. W, Murthy N.S., Fein D.B. et al. The effect of basic myelin protein on multilayer membrane formation. // Biophys J 1981 - V. 34 - P. 345-350

90. Brennan M., Davison P.F., Paulus H. Preparation of bispecific antibodies by chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1 fragments. //'Science. 1985 - V. 229(4708)-№ 5-P. 81-83.

91. Brenner M, Lampel K„ Nakatani Y., et al Characterization of human cDNA and genomic clones for glial fibrillary acidic protein // Mol. Brain Res. 1990 - V. 7 - P. 277 - 286.

92. Brenner M. Structure and transcriptional regulation of the GFAP gene. //Brain Pathol. 1994 - V. 4 - P. 245 -257.

93. Brenner M., Messing A. GFAP Transgenic Mice. // Methods: A companion to methods in enzymology. 1996 -V. 10 - P. 351-364.

94. Brookes J.P., Fields P., Raff M.C. Studies on cultured rat Schwann cells. I. Establishment of purified populations from cultures of peripheral nerve. // Brain Res 1979 -V. 165-P. 105-118

95. Brokstad K.A., Page M., Nyland H. Autoantibodies to myelin basic protein are not present in the serum and CSF of MS patients. // Acta Neurol Scand 1994 - V. 89 (6) - P. 407411.

96. Brunngraber E., Susz J.P., et al. Binding of concanavalin A to the brain-specific proteins obtained from human white matter by affinity chromatography // J. Neurochem. 1975. — V. 24. — P. 805 - 806.

97. Burger P.C., Vogel S. The development of pathologic changes of Alzheimer's disease and senile dementia in patients with Down's syndrome. // Am. J. Pathol. — 1973 — V. 73 — P. 457- 476.

98. Bush T.G., Puvanachandra N., Homer C.H. et al. Leukocyte infiltration, neuronal degeneration, and neurite outgrowth after ablation of scarforming, reactive astrocytes in adult transgenic mice. // Neuron 1996 - V. 23 - P. 297-308.

99. Butterworth R.J., WassifW.S., Sherwood R.A. et al. Serum neuron-specific enolase, carnosinase, and their ratio in acute stroke. An enzymatic test for predicting outcome? // Stroke 1996 - V. 27(11) - P. 2064-2068.

100. Cai Z, Pang Y et al. Chronic ischemia preferentially causes white matter injury in the neonatal rat brain. // Brain Res. 2001 - № 13. - V. 898 (1) - P. 126-135

101. Calne D.B. II In: Neurodegenerative Diseases, ed. WB Saunders Philadelphia -1994.

102. Campagnoni A.T., Skoff R.P. The pathobiology of myelin mutants reveal novel biological functions of the MBP and PLP genes. // Brain Pathol. 2001 - V. 11(1) - P. 74-91.

103. Campbell I.L Transgenic mice and cytokine actions in the brain: bridging the gap between structural and functional neuropathology. // Brain Res. Brain Res. Reviews 1998 — V. 26-P. 327-336

104. Carrasco J., Hernandez J., Gonzalez B. et al. Localization of metallothionein-I and -III expression in the CNS of transgenic mice with astrocyte-targeted expression of interleukin 6. //Exp. Neurol. 1998-V. 153-P. 184-194.

105. Carney D.N., Marangos P.J., et al. Serum neuron-specific enolase: a marker for disease extend and response to therapy of small cell lung cancer // Lancet 1982 - V.i - P. 583-586

106. Carpenter M.K., Winkler C., Fricker R. et al. Generation and transplantation of EGF responsive neural stem cells. // Exp. Neurol. 1997 - V. 148 - P. 187-204.

107. Carter P. Improving the efficacy of antibody-based cancer therapies. // Nat Rev Cancer. 2001 - V. 1(2) -P. 118-129.

108. Cather J.C., Cather J.C., Menter A. Modulating T cell responses for the treatment of psoriasis: a focus on efalizumab. // Expert Opin Biol Ther. 2003 - V. 3(2) - P. 361-370.

109. Cerletti A., Drewe J., Fricker G. et al. Endocytosis and transcytosis of an immunoliposome-based brain drug delivery system. // J. Drug Target. 2000 - V8-N6-P. 435-446.

110. Cervos-Navarro J., Sampaolo S., Hamdorf G. Brain changes in experimental chronic hypoxia // Exp Pathol. — 1991. — V. 42. — P. 205-212.

111. Chamczuk A.J., Ursell M., O'Connor P. et al. A rapid ELISA-based serum assay for myelin basic protein in multiple sclerosis. // J Immunol Methods. 2002 - V. 1 - № 262 - P. 21-27.

112. Chan P.H., Huston J.S., Dahl D. Initial characterization of astroglial protein from bovine brain // Fed. Proc. — 1975. — V 34. — P. 224.

113. Cheifetz S., Moscarello M.A. Effect of bovine basic protein charge microheterogene-ity on protein-induced aggregation of unilamellar vesicles containing a mixture of acidic and neutral phospholipids. Biochemistry - 1985-V. 24-P. 1909-1914

114. Chekhonin VP., Kabanov A.V., Zhirkov Yu.A., Morozov G.V. Fatty acid acylated Fab-fragments of antibodies to neurospecific proteins as carriers for neuroleptic targeted delivery in brain//FEBS Letters. —1991. —V. 287, № 1-2, —P. 149- 152.

115. Chekhonin V.P., Ryabukhin LA., Zhirkov Yu.A., et al. Transport of hydrophobized fragments of antibodies through the blood-brain barrier //Ncuroreport. — 1995. — V. 7. — P. 129- 132.

116. Chekhonin V.P., Zhirkov Yu.A., Belyaeva LA. et al. Serum time course of two brain-specific proteins, ai brain globulin and neuron-specific cnolase, in tick-born encephalitis and Lyme disease. // Clinica Chimica Acta 2002 - V. 320 - P. 117-125.

117. Chekhonin V.P., Zhirkov Yu.A., Gurina O.L. et al. PEGylated immunoliposomes directed against brain astrocytes. // Drug Delivery 2005 - V. 12(1) - P. 1-6.

118. Chen W.J., Liem R.K. Reexprcssion of glial fibrillary acidic protein rescues the ability of astrocytoma cells to form processes in response to neurons. // J. Cell Biol. 1994 - V. 127 -P. 813-823.

119. Chester K., Pedley B., Tolner B. et al. Engineering antibodies for clinical applications in cancer. // Tumour Biol. 2004 - V. 25 (1-2) - P. 91-98.

120. Chevalier D., Allen B.G. Purification of myelin basic protein from bovine brain. -Protein Expr Purif- 2000 V. 18 (2) - P. 229-234.

121. Chignola R, Cestari T, Guerriero C et al. Expression of myelin basic protein (MBP) epitopes in human non-neural cells revealed by two anti-MBP IgM monoclonal antibodies. -Clin Exp Immunol 2000 - V. 122(3) - P. 429-436.

122. Chiu F.-C., Goldman J.E. Regulation of glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression in CNS development and in pathological states // J. Neuroimmunol. 1985. - V. 8. — P. 283 - 292.

123. Choi B.H., Kim R.C. Expression of glial fibrillary acidic protein by immature oligodendroglia and its implications // J. Neuroimmunol. — 1985. — V. 8. — P. 215 235.

124. Chung KF. Anti-IgE monoclonal antibody, omalizumab: a new treatment for allergic asthma. // Expert Opin Pharmacother. 2004 - V. 5(2) - P. 439-446.

125. Cicero T.J., Cowan W.M., Moore B.W. Changes in the concentration of the two brain specific proteins, SI00 and 14-3-2, during the development of the avian optic tectum. // Brain Res. — 1970. — V. 24. — P. 1 -10.

126. Cohen /., Shani Y., Schwartz M. Cloning and characteristics of fish glial fibrillary acidic protein: implications for optic nerve regeneration // J. Comp. Neurol. 1993 - V. 334 -P. 431 -443.

127. Colman D.R., Kreibich G., Frey A.B. et al. Synthesis and incorporation of myelin polypeptides into CNS myelin. // J. Cell. Biol. 1982 - V. 95 - P. 598-608

128. Condorelli DF., Nicoletti V.G., Barresi V. et al. Structural features of the rat GFAP gene and identification of a novel alternative transcript. // J. Neurosci. Res. 1999 - V. 56 - P. 219-228.

129. CorrealeJ., Rabinowicz A.L., Heck C.N. et al. Status epilepticus increases CSF levels of neuron-specific enolase and alters the blood-brain barrier. // Neurology. 1998 - V. 50 -P. 1388-1391.

130. Cruz M., Olsson T., Emerudh J. et al. Immunoblot detection of oligoclonal antimyelin basic protein IgG antibodies in cerebrospinal fluid in multiple sclerosis. // Neurology. -1987-V. 37(9)-P. 1515-1519.

131. Cuello A.C., Priestley J.V., Milstein C. Immunocytochemistry with internally labeled monoclonal antibodies. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 - V. 79(2) - P. 665-9.

132. Cumar F.A., Maggio B. et al. Neurotransmitter movements in nerve endings. Influence of substances that modify the interfacial potential. // Biochim. Biophys. Acta 1980 - V. 597-P. 174-182.

133. Cuzner M.L., Norton W.T. Biochemistry of demyelination. //Brain Pathol 19961. V.6(3)-P. 231-242.

134. Dahl D. The vimcntin-GFA protein transition in rat neuroglia cytoskeleton occurs at the time of myelination // J. Neurosci. Res. — 1981. — V. 6. — P. 741 748.

135. Dahl D„ Bignami A. Glial fibrillary acidic protein from normal and gliosed human brain. Demonstration of multiple related polypeptides // Biochim. biophys. Acta. 1975 — V. 386 —P. 41 -51.

136. Dahl D., Bignami A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties // Brain Res. — 1973. — V. 57. — P. 343.

137. Dahl D., Bignami A. Immunogenic properties of the glial fibrillary acidic protein // Brain Res. — 1976, — V. 116. —P. 150.

138. Dahl D., Rueger D.C., Bignami A., et al. Yimentin, the 57,000 molecular weight protein of fibroblast filaments, is the major cytoskeletal component of immature glia // Eur. J. Cell Biol. —1981. —V. 24, —P. 191 196.

139. Dahl D., Bjorklund H., Bignami A. Immunological markers in astrocytes. In: Fe-doroff S., Vernadakis A. (eds). Astrocytes. Cell biology and pathology of astrocytes. — Orlando: Acad. Press, 1986. — V. 3. — P. 1 - 25.

140. Dahl D., Chi N.H., Miles L.E., et al. Glial fibrillary acidic (GFA) protein in Schwann cells // J. Histochem. Cytochem. — 1982. — V. 30. — P. 912 918.

141. Dahl D., Crosby C.J., Sethi J.S., Bignami A. Glial fibrillary acidic (GFA) protein in vertebrates: immunofluorescence and immunoblotting study with monoclonal and polyclonal antibodies // J. Comp. Neurol. — 1985. — V. 239. — P. 75-88.

142. Dangond F. Disorders of myelin in the central and peripheral nervous systems. // Butterworth/Heinemann, Woburn. 2002.

143. Dauberschmidt R., Marangos P. J., Zinsmeyer J., et al. Severe head trauma and the changes of concentration of neuron-specific enolase in plasma and cerebrospinal fluid // Clin, chim. Acta. — 1983. —V. 131—P. 165 170.

144. Davies L., McLeod J.G., Muir A. et I. Diagnostic value of cerebrospinal fluid myelin basic protein in patients with neurological illness. // Clin Exp Neurol. — 1987 V. 24 - P. 5-10.

145. Dharmasaroja P. Specificity of autoantibodies to epitopes of myelin proteins in multiple sclerosis. // J Neurol Sci. 2003 - V. 15 - № 206 - P. 7-16.

146. Dearden C. Monoclonal antibody therapy of haematological malignancies. // BioDrugs. 2002 - V. 16(4) - P. 283-301

147. Debus E., Weber K., Osborn M. Monoclonal antibodies specific for glial fibrillary acidic (GFA) protein and for each of the neurofilament triplet polypeptides // Differentiation. — 1983, — V. 25, —P. 193 -203.

148. DeGiorgio CM., Gott P.S., Rabinowicz A.L. et al Neuron-specific enolase, a marker of acute neuronal injury, is increased in complex partial status epilepticus. // Epilepsia. 1996 -V. 37 - P. 606-609.

149. DeGiorgio C.M., Heck C.N., Rabinowicz A.L. et al. Serum neuron-specific enolase in the major subtypes of status epilepticus. // Neurology. 1999 - V. 10 - № 52 - P. 746-749.

150. Deibler G. E., R. E. Martenson, Kies M.W. Large scalcpreparationof myelin basic protein from central nervous tissue of several mammalian spccies // Preparative Biochemistry -1972-V. 2-P. 139-165.

151. Deibler G.E., Martenson R.E., Krutzsch H.C. et al. Sequence of guinea pig myelin basic protein. // J. Neurochemistry 1984 - V. 43 - P. 100-105;

152. Deibler G.E., Boyd L.F. et al. Enzymatic and nonenzymatic degradation of myelin basic protein.//Neurochem. Res. 1984-V. 9-P. 1371-1385.

153. Deibler G.E., Krutzsch H.C. Martenson R.E. A reinvestigation of the amino acid sequences of bovine, rabbit, monkey, and human myelin basic proteins. // J. Biol. Chem. 1985 -V. 260 (1) - P. 472-474;

154. Deibler G.E., Krutzsch H.C. et al. A new form of myelin basic protein found in human brain. // J. Neurochem. 1986-V. 47-P. 1219-1225.

155. Deibler G.E., Burlin T. V., Stone A.L. Three isoforms of human myelin basic protein: purification and structure. // J Ncurosci Res 1995 - V. 15 - № 41 (6) P. 819-827.

156. Delaney C.L., Brenner M., Messing A. Conditional ablation of cerebellar astrocytes in postnatal transgenic mice. // J. Neurosci. 1996 - V. 16 - P. 6908-6918.

157. Del Bigio M.R., Kanfer J.N., Zhang Y.W. Myelination delay in the cerebral white matter of immature rats with kaolin-induced hydrocephalus is reversible. // J Neuropathol Exp Neurol 1997-V. 56 (9)-P. 1053-1066.

158. Deshmukh D.S., Kuizon S., Brockerhoff H. Mutual stimulation by phosphatidyl-inositol-4-phosphate and myelin basic protein of thcr phosphorylation by the kinases solubilized from rat brain myelin. // Life Sci. 1984 - V. 34 - P. 259-264

159. Devlin J.J., Panganiban L.C., Devlin P.E. Random peptide libraries: a source of286specific protein binding molecules // Science. — 1990. — V. 249. — P. 404 406.

160. Dillman R.O. Monoclonal antibodies in the treatment of malignancy: basic concepts and recent developments. // Cancer Invest. 2001 - V. 19 - P. 833-841

161. Dotevall L., Rosengren L.E., HagbergL. Increased cerebrospinal fluid levels of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in Lyme neuroborreliosis // Infection. — 1996. — V. 24. — P. 125- 129.

162. Dotevall L., Hagberg L., Karlsson J.E. Astroglial and neuronal proteins in cerebrospinal fluid as markers of CNS involvement in Lyme neuroborreliosis. // Eur J Neurol. — 1999 -V. 6-p. 169-178.

163. Drivsholm L., Osterlind K., Cooper E.H.et al. Neuron-specific enolase (NSE) in scrum. Comparison of monoclonal versus polyclonal assay based on 392 blood samples. // Int J Biol Markers. 1995 - V. 10(1) - P. 1-4.

164. Dubois-Dalcq M, Behar Т., Hudson L. et al. Emergence of three myelin proteins in oligodendrocytes cultured without neurons. // J. Cell. Biol. 1986 - V. 102 - P. 384-392.

165. Duffy P.E, Rapoport M., Graf L. Glial fibrillary acidic protein and Alzheimer-type senile dementia. // Neurol. 1980 - V. 30 - P. 778-782

166. Dunker S., Sadun A.A., Sebag J. Neuron specific enolase in retinal detachment. // Curr Eye Res. 2001 - V. 23 - P. 382-385.

167. Dworschak M., Franz M., Czerny M. et al. Release of neuron-specific enolase and S100 after implantation of cardioverters/defibrillators. // Crit Care Med. 2003 - V. 31(8) - P. 2085-2089.

168. Dziewulska D, Jamrozik Z, Podlecka A. et al. Do astrocytes participate in rat spinal cord myelination? // J Folia Neuropathol 1999 - V. 37(2) - P. 81-86

169. Eddleston M„ Mucke L. Molecular profile of reactive astrocytes; implications for their role in neurologic diseases. // Neurosci. 1993 - V. 54 - P. 15 -36.

170. Edelman GM. Building a picture of the brain. // Ann N Y Acad Sci. 1999 - № 30 -V. 882-P. 68-89;

171. Egg R., Reindl M., Deisenhammer F. et al. Anti-MOG and anti-MBP antibody subclasses in multiple sclerosis. // Mult Scler. 2001 - V. 7 - P. 285-289.

172. Ehlers S., Kyllerman M, Rosengren L. Analysis of glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid of children investigated for encephalopathy //Neuropediatrics. — 1994.1. V. 25. — P. 129- 133.

173. Elimian A., Figueroa R., Patel K. et al. Reference values of amniotic fluid neuron-spccific enolase. // J Matern Fetal Med. 2001 - V. 10 - P. 155-158.

174. Eng L.F., Gerstl B., Vanderhaeghen J.J. A study of proteins in old multiple sclerosis plaques. // Trans. Amer. Soc. Neurochem. — 1970. — V. 1. — P. 42.

175. Eng L.F., Bond P., Gerstl B. Isolation of myelin proteins from disc acrylamide gels clectrophorescd in phenolformic acid-water. //Neurobiol. 1971 - V. 1 - P. 58-63.

176. Eng L.F., Vanderhaeghen J. J., et al. An acidic protein isolated from fibrous astrocytes. // Brain Res. — 1971. — V. 28. — P. 351.

177. Eng L.F. Glial fibrillary acidic protein: the major protein of glial intermediate filaments in differentiated astrocytes // J. Ncuroimmunol. — 1985. — V. 8. — P. 203 214.

178. Eng LF. Chemical characterization of the glial fibrillary acidic protein // Fed. Proc.1973, —V. 32.—P. 485.

179. Eng L.F., DeArmond S.J. Immunochemistry of the glial fibrillary acidic protein // Prog. Neuropathol. — 1983. — V. 5. — P. 19 39.

180. Eng L.F., Lee Y.L., Fukayama G. Isolation of glial fibrillary acidic (GFA) protein from bovine spinal cord // Trans. Amer. Soc. Neurochem. — 1979. — V. 10. — P. 126.

181. Eng L.F., Ghirnikar R.S., Lee Y.L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). //Neurochem Res. 2000 - V. 25 (9-10) - P. 1439-1451.

182. Engberg J., Yenidunya A.F., Clausen R. et al. Human recombinant Fab antibodies with T-cell receptor-like specificities generated from phage display libraries. //Methods Mol Biol. 2003 - V. 207 - P. 161 -777

183. Epand R.M. Structural, functional and clinical aspects of myelin proteins. // In: Neuronal and glial proteins: structure, function and clinical application. 1988 — P. 231-265

184. Epenetos A.A., Hird V., Lambert H. et al. Long term survival of patients with advanced ovarian cancer treated with intraperitoneal radioimmunotherapy. // Int J Gynecol Cancer.- 2000 V. 10 (SI) - P. 44-46.

185. Ergun R., Bostanci U., Akdemir G. et al. Prognostic value of serum neuron-specific enolase levels after head injury. // Neurol Res. 1998 - V. 20 - P. 418-420.

186. Ezgii F.S., Atalay Y., Gucuyener K. et al. Neuron-specific enolase levels and neuroimaging in asphyxiated term newborns. // J Child Neurol. 2002 - V. 17 - P. 824-829.

187. Farr S.A., Banks W.A., Uezu K. et al. Antibody to beta-amyloid protein increases acetylcholine in the hippocampus of 12 month SAMP8 male mice. // Life Sci. — 2003 — № 20 -V. 73(5) P. 555-562.

188. Fletcher L., Rider C.C., Taylor C.B. Enolase isoenzymes. III. Chromatographic and immunological characteristics of rat brain enolase. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - V. 452.1. P. 245-252.

189. Fraker P.J., Speck J.C.Jr. Protein and cell membrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide, l,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphrenylglycoluril. // Biochem Biophys Res Commun. 1978 -№ 28 - V. 80(4) - P. 849-857.

190. Friede R.L., Samorajski T. Myelin formation in the sciatic nerve of the rat. A quantitative electron microscopic, histochemical and redioautigraphic study. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1968 - V. 27 - P. 546-570.

191. Fridriksson T., Kini N. Walsh-Kelly C. et al. Serum neuron-specific enolase as a predictor of intracranial lesions in children with head trauma: a pilot study. // Acad Emerg Med. -2000-V. 7-P. 816-820.

192. Frikke M.J., Sechi B., Bell R.C.E. Monoclonal antibodies in human neuron-specific enolase reveal heterogeneity of the enzyme in neurons of the central nervous system // Brain Res. 1987. - V. 417. - P. 283 - 292.

193. Froes M.M., Correia A.H.P., Garcia-Abreu J. et al. Gap-junctional coupling between neurons and astrocytes in primary central nervous system cultures. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999 - V. 96 - P. 7541-7546.

194. Fukuyama R, Izumoto T, Fushiki S. The cerebrospinal fluid level of glial fibrillary acidic protein is increased in cerebrospinal fluid from Alzheimer's disease patients and correlates with severity of dementia. // Eur Neurol. 2001 - V. 46 - P. 35-38.

195. Galbreath E„ Kim S.J., Park K„ Brenner M. et al. Overexpression of TGF-beta 1 inthe central nervous system of transgenic mice results in hydrocephalus. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1995 - V. 54 - P. 339-349.

196. Galfre G., Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. // Methods in Enzymology 1981 - V. 73B - P. 3-46.

197. Galou M., Colucci-Guyon E., Ensergueix D. et al. Disrupted glial fibrillary acidic protein network in astrocytes from vimcntin knockout mice. // J. Cell Biol. — 1996 — V. 133 P. 853-863.

198. Gao F., Harris D.N., Sapsed-Byrne S. Time course of neurone-specific enolase and S-100 protein release during and after coronary artery bypass grafting. // Br J Anaesth. 1999 -V. 82(2) - P. 266-267.

199. Gao F., Harris D.N., Sapsed-Byrne S. et al. Nerve tissue protein S-100 and neurone-specific enolase concentrations in cerebrospinal fluid and blood during carotid endarterectomy. // Anaesthesia. 2000 - V. 55 - P. 764-769.

200. Garbay B., Heape A.M., Sargueil F. et al. — Myelin synthesis in the peripheral nervous system // Progress in neurobiology 2000 - V. 61 - P. 267-304

201. Gard A.L., White F.P., Dutton G.R. Extra-neural glial fibrillary acidic protein \ (GFAP) immunoreactivity in perisinusoidal stellate cells of rat liver // J. Neuroimmunol. — 1985. —V. 8. —P. 359- 375.

202. Ghirnikar R.S., Yu A.C., Eng L.F. Astrogliosis in eulture: III. Effect of recombinant retrovirus expressing antisenseglial fibrillary acidic protein RNA. // J. Neurosci. Res. 1994 -V. 38-P. 376-385.

203. Gibson B.W., Gilliom R.D., Whitaker J.N. Amino acid sequence of human myelin basic protein peptide 45-89 as determined by mass spectrometry. // J Biol Chcm 1984 - V. 25 -№259 (8)-P. 5028-5031.

204. Givogri M.I., Bongarzone E.R. et al. New insights on the biology of myelin basic protein gene: the neural-immune connection. // J. Neurosci. Res. 2000 - N 15 - V. 59(2) - P. 153-159.

205. Goldenberg D.M. Monoclonal antibodies in cancer detection and therapy // Am. J. Med. — 1993. — V. 94. — P. 297 311.

206. Goldenberg DM. Advancing role of radiolabeled antibodies in the therapy of cancer. // Cancer Immunol Immunother. 2003 - V. 52(5) -P. 281-296.

207. Goldenberg DM. Targeted therapy of cancer with radiolabeled antibodies. // J Nucl Med. 2002 - V. 43(5) - P. 693-713.

208. Goldman J.E., Schaumburg H.H., Norton W.T. Isolation and characterization of glial filaments from human brain. // J. Cell Biol. 1978 - V. 78 - P. 426^140.

209. Goldman R.D., Zackroff R.V., Steinert P.M. Intermediate filaments: overview. In: Goldman R.D., Steinert P.M. (eds). Cellular and molecular biology of intermediate filaments. — NY: Plenum, 1990. — P. 3 - 20.

210. Gomes F.C., Garcia-Abreu J., Galou M. et al. Neurons induce GFAP gene promoter of cultured astrocytes from transgenic mice. // Glia 1999 - V. 26 - P. 97-108.

211. Gomi H„ Yokoyama 71, Fujimoto K., et al. Mice devoid of the glial fibrillary acidic protein develop normally and are susceptible to scrapie prions // Neuron. — 1995. — V. 14. — P. 29-41.

212. Goodison K.L., ParhadI.M., White C.L. et al. Neuronal and glial gene expression in neocortex of Down's syndrome and Alzheimer's disease. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1993 -V. 52-P. 192-198.

213. Gould R.M., Freund C.M., Palmer F. et al. Messenger RNAs located in myelin sheath assembly sites. // J Neurochem. 2000 - V. 75(5) - P. 1834-1844.

214. Grasso A., Haglid K.J., et al. Localization of 14-3-2 protein in the rat brain by im-munoelectron microscopy // Brain Res. — 1977. — V. 122. — P. 582 585.

215. Grasso A., Roda G., et al. Preparation and properties of the brain specific protein 14-3-2 // Brain Res. — 1977. — V. 124. — P. 497 507.

216. Gratzl M., Langley K. (eds). Markers for neural and endocrine cells: molecular and cell biology, diagnostic applications. — Weinheim: VCH, 1991.

217. Green A.J., Thompson E.J., Stewart G.E. et al. Use of 14-3-3 and other brain-specific proteins in CSF in the diagnosis of variant Creutzfeldt-Jakob disease. // J Neurol Neuro-surg Psychiatry. 2001 - V. 70 (6) -P. 744-748.

218. Georgiadis D., Berger A., Kowatschev E. et al. Predictive value of S-lOObeta and neuron-specific enolase serum levels for adverse neurologic outcome after cardiac surgery. // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2000 - V. 119(1) - P. 138-147.

219. Grever W.E., Chiu F.C., Tricoche M. Quantification of myelin basic protein in thehuman fetal spinal cord during the midtrimester of gestation. // J Comp Neurol 1996 — V. 376 (2)-P. 306-314

220. Grejfe J., Lemoine P., Lacroix C. et al. Increased serum levels of neuron-specific enolase in epileptic patients and after electroconvulsive therapy—a preliminary report. // Clin Chim Acta. 1996- V. 31-№244-P. 199-208.

221. Guan W., Yang Y.L., Xia W.M. et al. Significance of serum neuron-specific enolase in patients with acute traumatic brain injury. // Chin J Traumatol. 2003 - V. 1 — № 6 — P. 218221.

222. Guez M., Hildingsson C., Rosengren L. et al. Nervous tissue damage markers in cerebrospinal fluid after cervical spine injuries and whiplash trauma. // J. Neurotrauma. 2003 -V. 20-P. 853-858.

223. Gurnett C.A., Landt M, Wong M. Analysis of cerebrospinal fluid glial fibrillary acidic protein after seizures in children. // Epilepsia. 2003 - V. 44 - P. 1455-1458.

224. Gutman R.L., Peacock G., Lu D.R. Targeted drug delivery for brain cancer treatment. // J. Control. Release. 2000 - V. 65 - N 1-2 - P. 31-41.

225. Haan E.A., Boss B.D., Cowan W.M. Production and characterization of monoclonal antibodies against the "brain-specific" proteins 14-3-2 and S100 //Proc. natl. Acad. Sci. USA. — 1982. — V. 79. — P. 7585 7589.

226. Haase CG, Schmidt S. Detection of brain-specific autoantibodies to myelin oligodendrocyte glycoprotein, SlOObeta and myelin basic protein in patients with Devic's neuromyelitis optica. //Neurosei Lett. -2001 V. 13 -№ 307 - P. 131-133.

227. Haghighi S., Andersen O., Oden A. et al. Cerebrospinal fluid markers in MS patients and their healthy siblings. // Acta Neurol Scand. 2004 - V. 109 - P. 97-99.

228. Hagiwara N. Imada S., Sueoka N. Cell type specific segregation of transcriptional expression of glial genes in the rat peripheral neurotumor RT4 cell lines. // J. Neurosei. Res. -1993-V. 36-P. 646-656.

229. Haimoto H., Takahashi Y., et al. Immunohistochemical localization of gamma-eno-lase in normal human tissues other than neurons and neuroendocrine tissues. // Lab. Invest. — 1985. — V. 52. — P. 257-263.

230. HallpikeJF., Adams C.WM„ Tourtellotte WW Multiple Sclcrosis. Pathology, diagnosis and management. // Williams & Wilkins: Baltimore. 1983.

231. Harauz G., Ishiyamaa N., Hilla C. et al. Myelin basic protein—diverse conformational states of an intrinsically unstructured protein and its roles in myelin assembly and multiple sclerosis. // Micron 2004 - V. 35 - P. 503-542

232. Harlow E„ Lane D. Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press. 1988-726 p.

233. Harlow E., Lane D. Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I Cold Spring Harbour Laboratory Press. 1998. - 495 p.

234. Harrington K.L., Lewanski C.R., Stewart S. W. Liposomes as vehicles for targeted therapy of cancer. Part.2: Clinical development. // Clin Oncol 2000 - V. 12 - P. 16-24.

235. Hatfield J.S., Skoff R.P., et al. The lens epithelium contains glial fibrillary acidic protein // J. Neuroimmunol. — 1985. — V. 8. — P. 347 357.

236. Herrmann M., Curio N. Jost S. et al. Protein S-100B and neuron specific enolase as early neurobiochemical markers of the severity of traumatic brain injury. // Restor Neurol Neu-rosci.- 1999-V. 14-P. 109-114.

237. Herrmann M, Ehrenreich H. Brain derived proteins as markers of acute stroke: their relation to pathophysiology, outcome prediction and neuroprotective drug monitoring. // Restor. Neurol. Neurosci. 2003 - V. 21 - P. 177-190.

238. Herrmann M„ Vos P., Wunderlich M.T. et al. Release of glial tissue-specific proteins after acute stroke: A comparative analysis of serum concentrations of protein S-100B and glial fibrillary acidic protein. // Stroke. 2000 - V. 31 - P. 2670-2677.

239. Herrmann M., Ebert A.D., Galazky I. et al. Neurobehavioral outcome prediction after cardiac surgery: role of neurobiochemical markers of damage to neuronal and glial brain tissue. // Stroke. 2000 - V. 31(3) - P. 645-650.

240. Higley H.R., McNulty J.A., Rowden G. Glial fibrillary acidic protein and SI00 protein in pineal supportive cells: an electron microscopic study // Brain Res. — 1984. — Vol. 304. — P. 117- 120.

241. Hill M.D., Jackowski G., Bayer N. et al. Biochemical markers in acute ischemic stroke // CMAJ 2000 - V. 18 - P. 162-168

242. Him M., Pierres M., Deagostini-Bazin II., et al. Monoclonal antibody against cell surface glycoprotein of neurons // Brain Res. — 1981. — V. 214, № 2. — P. 433-439.

243. Hofler H., Walter G.F., Denk H. Immunohistochemistry of folliculo-stellate cells in normal human adenohypophyses and in pituitary adenomas // Acta Neuropathol. — 1984. — V. 65. — P. 35-40.

244. Holland E.C., Varmus H.E. Basic fibroblast growth factor induces cell migration and. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998 - V. 95 - P. 1218-1223.

245. Hu Y., Doudevski I., Wood D. et al. Synergistic interactions of lipids and myelin basic protein. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2004 V. 101(37) - P. 13466-13471.

246. Huwyler J., Wu D., Pardridge W.M. Brain drug delivery of small molecules using immunoliposomes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 - V. 93 - P. 14164-14169.

247. Jankovic B.D. Neural tissue hypersensitivity in psychiatric disorders with immunologic features. // J. Immunol. 1985 - V. 135(2) - P. 8536-8575.

248. Joachim C.L., Morris J.H., Selkoe D.J. Diffuse senile plaques occur commonly in the cerebellum in Alzheimer's disease. // Am. J. Pathol. 1989 - V. 135 - P. 309-319.

249. Johnsson P., Blomquist S., Luhrs C. et al Neuron-specific enolase increases in plasma during and immediately after extracorporeal circulation. // Ann Thorac Surg. — 2000 — V. 69 P. 750-754.

250. Jauch E.C. Diagnosis of stroke: the use of serum markers. // Stroke 2000 — V. 31, №2781 -P.39-45.

251. J0rgensen O.S., Centervall G. Enolase in the rat: ontogeny and tissue distribution. // J. Neurochem. — 1982. — V. 39. — P. 537-542.

252. Jorgensen L.G., Lober J., Carlsen N.L. et al. Serum neuron specific enolase (S-NSE) reference interval evaluation by time-resolved immunofluorometry compared with a radioimmunoassay. // Clin Chim Acta. 1996 - V. 249(1-2) - P. 77-91.

253. Iida K., Takashima S. et al Immunohistochemical study of myelination and oligodendrocytye in infants with periventricular leucomalacia. // Pediatr. Neurol. Nov. 1995 -V. 13(4) - P. 296-304

254. Inouye H, Kirschner D.A. Folding and function of the myelin proteins from primary sequence data // J Neurosci Res. 1991 - V. 28 - P. 1 - 17.

255. Ingebrigtsen T, Romner B. Biochemical serum markers for brain damage: a short review with emphasis on clinical utility in mild head injury. // Restor Neurol Neurosci. 2003 — V. 21(3-4)-P. 171-176.

256. Kalistova H., Havrdova E., Uhrova J. et al. Myelin basic protein in multiple sclerosis and other neurological disorders. // J Neurol. 2003 - V. 250 - P. 874-875

257. Kalman M., Pritz M.B. Glial fibrillary acidic protein-immunopositive structures in the brain of a Crocodilian, Caiman crocodilus, and its bearing on the evolution of astroglia. // J. Comp. Neurol. 2001 - V. 431(4) - P. 460-480.

258. Kalofonos H.P., Karamouzis M.V., Epenetos A.A. Radioimmunoscintigraphy in patients with ovarian cancer. // Acta Oncol. 2001 - V. 40(5) - P. 549-557.

259. Kamps J.A.A.M, Konig G.A., Velinova M.J et al Uptake of long-circulating immu-noliposomes, directed against colon adenocarcinoma cells, by liver metastases of colon cancer. // J. Drug Targeting. — 2000. — V. 8. — No. 4. — P. 235-245.

260. Kanfer J., Parenty M., Goujet-Zalc C. et al Developmental expression of myelin proteolipid, basic protein and 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase transcripts in different rat brain regions. // J. Mol. Neurosci. 1989 -V. 1 - P. 39-46.

261. Kato K., Assai R. et al Immunoassay of three cnolase isoenzymes in human serum and in blood cells. // Clin. Chim. Acta. — 1983. — V. 127. — P. 353-358.

262. Kato K., Suzuki F., et al Developmental profile of three enolase isoenzymes in rat brain: determination from one cell embryo to adult brain. //Neurochem. Int. 1984. - V. 6.1. P. 81-84

263. Kellermann S.A., Green L.L. Antibody discovery: the use of transgenic mice to generate human monoclonal antibodies for therapeutics. // Curr Opin Biotechnol. 2002 - V. 13(6) -P. 593-597.

264. Kennett R.H. Hybridomas: a new dimension in biological analyses. // In Vitro. -1981 V. 17(12) - P. 1036-1050.

265. Kim S., Tuck M., Kim M. Myelin basic protein specific protein methylase I activity in Shiverer mutant mouse brain. // J. Neurosci. Res. - 1986 - V. 16 - P. 357-365.

266. Kipriyanov S.M., Le Gall F. Generation and production of engineered antibodies. // Mol Biotechnol. 2004 - V. 26(1) - P. 39-60.

267. Kira G., Deibler G„ Krutzsch H.C. et al. Aminoacid sequence of porcine myelin basic protein. // J Neurochemistry 1985 - V. 44 - P. 134-142.

268. Kiryushko D, Berezin V, Bock E. Regulators of neurite outgrowth: role of cell adhesion molecules. // Ann N Y Acad Sci. 2004 - V. 1014 - P. 140-154.

269. Kishimoto A., Nishiyama K, Nakanishi H. et al Studies of the phosphorilation of myelin basic protein by protein kinase C and adenosine 3':5'-monophosphate-dependet protein kinase. // J. Biol. Chem. 1985 - V. 260 - P. 12492-12499

270. Kleine T.O., Benes L., Zofel P. Studies of the brain specificity of S100B and neuron-specific enolase (NSE) in blood serum of acute care patients. // Brain Res Bull. — 2003 — V. 15 №61 -P. 265-279.

271. Kojke W.A., Konitzer P., Meng Q.C. The effect of apolipoprotein E genotype on neuron specific enolase and S-lOObeta levels after cardiac surgery. // Anesth Analg. 2004 - V. 99(5)-P. 1323-1325.

272. Kohlschutter A. Myelin basic protein in cerebrospinal fluid from children. // Eur. J. Pediatr.- 1978-№ 13-V. 127(3)-P. 155-161.

273. Kohlschutter C., Mosgoller W. Myelination deficits in brain of rats following perinatal asphyxia. II Life Sci. 2000 - № 29 - V. 67(19) - P. 2355-2368.

274. Köhler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Nature -1975 V. 256 - P. 495-497.

275. Kohira /., Tsuji T., Ishizu H. et al. Elevation of neuron-specific enolase in serum and cerebrospinal fluid of early stage Creutzfeldt-Jakob disease. // Acta Neurol Scand. 2000 - V. 102-P. 385-387.

276. Kordower J.H., Chen E.Y., Winkler C. et al. Grafts of EGF-responsive neural stem cells derived from GFAP-hNGF. // J. Comp. Neurol. 1997 - V. 387 - P. 96-113.

277. Kragh J., Bolwig T.G., Woldbye D.P., et al. Electroconvulsive shock and lidocaine-induced seizures in the rat activate astrocytes as measured by glial fibrillary acidic protein. // Biol. Psychiatry. — 1993. — V. 33(11-12) — P. 794-800.

278. Krams J. Recombinant antibodies for the diagnosis and treatment of cancer. // Mol Biotechnol. -2003 V. 25(1)-P. 1-17.

279. Lamers K.J.B., Van Engelen B.G.M., et al. Cerebrospinal neuron-specific enolase,

280. SI00 and myelin basic protein in neurological disorders // Acta Neurol. Scand. — 1995. — V. ^ 92.— P. 247 -251.

281. Lamers K.J., de Reus H.P., Jongen P.J. Myelin basic protein in CSF as indicator of disease activity in multiple sclerosis. // Mult Scler- 1998 -V. 4 (3) P. 124-126;

282. Landry C.F., Ivy G.O., Brown I.R. Developmental expression of glial fibrillary acidic protein mRNA in the rat brain analyzed by in situ hybridization //J. Neurosci. — 1990. — V. 25. —P. 194-203.

283. Lane, R.D. A short duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. // J. Immunol. Meth. 1985 - V. 81 -P. 223-228.

284. Lasic D.D., Papahadjopoulos D. Liposomes revisited // Science. 1995 - V. 2671. P.1275-1276.

285. Lassmann H, Bmnner C. et al. Experimental allergic encephalomyelitis: the balance between encephalitogenic T lymphocytes and demyelinating antibodies determines size and structure of demyelinated lesions. // Acta Neuropathol 1988 - V. 75 - P. 566-576.

286. Laubsher A., Pletsher A. et al. Shape change of blood platelets brought about bu myelin basic protein and other basic polypeptides. // Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol.- 1979-V. 310-P. 87-92.

287. Laurino J.P., Shi Q., Ge J. Monoclonal antibodies, antigens and molecular diagnostics: a practical overview. // Ann Clin Lab Sci. 1999 - V. 29(3) - P. 158-166.

288. Li Y., Wang X., Yang Z. Neuron-specific enolase in patients with acute ischemic stroke and related dementia. // Chin Med J (Engl). 1995 - V. 108(3) - P. 221-223.

289. Li Z„ Zhang Y., Li D. et al. Destabilization and mislocalization of myelin basic protein mRNAs in quaking dysmyelination lacking the QKI RNA-binding proteins. // J. Ncurosci. -2000 V. 20 (13) - P. 4944-53.

290. Liedtke W., Edelmann W, Biery P.L., et al. GFAP is necessary for the integrity of CNS white matter architecture and long-term maintenance of myelination //Neuron. — 1996.1. V. 17. —P. 607-615.

291. Liem R.K.H., Shelanski M.L. Identity of the major protein in "native" glial fibrillary acidic protein preparations with tubulin // Brain Res. — 1978. — V. 145. — P. 196.

292. Lima J.E., Takayanagui O.M., Garcia L.V. et al. Use of neuron-specific enolase for assessing the severity and outcome in patients with neurological disorders. // Braz J Med Biol Res. 2004 -V. 37 - P. 19-26.

293. Leibowitz S., Hughes R.A.C. Immunology of the nervous system. (Current topics in immunology.) — London: Edward Arnold, 1983. V 17 - 303 p.

294. Lewis S.A., Cowan N.J. Temporal expression of mouse glial fibrillary acidic protein mRNA studied by a rapid in situ hybridization procedure. // J. Neurochem. 1985 - V. 45 - P. 913-919.

295. Longatti P.L., Canova G., Guida F. et al. The CSF myelin basic protein: a reliable marker of actual cerebral damage in hydrocephalus. // J Neurosurg Sei. 1993 - V. 37(2) - P. 87-90.

296. Longatti P.L., Guida F., Agostini S. The CSF myelin basic protein in pediatric hydrocephalus. // Childs Nerv Syst 1994 - V. 10 (2) - P. 96-98;

297. Loy D.N., Sroufe A.E., Pelt J.L. et al. Serum biomarkers for experimental acute spinal cord injury: rapid elevation of neuron-specific enolase and S-100beta. // Neurosurgery. -2005 — V. 56(2)-P. 391-397.

298. Lundkvist J., Sundgren-Andersson A.K., Tingsborg S. et al. Acute-phase responses in transgenic mice with CNS overexpression of IL-1 receptor antagonist. // Am. J. Physiol. -1999 V. 276 - P. R644 - 651

299. Maatta J.A., Coffey E.T., Hermonen J.A. et al. Detection of myelin basic protein iso-forms by organic concentration // Biochem Biophys Res Commun 1997 - V. 238 (2) - P. 498502;

300. Magerkurth O. Nachweis von saurem glialen Faserprotein (GFAP) in humanem Serum und erste klinische Ergebnisse II Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin 2003 -München.

301. Macklin W.B., Weill C.L., Deininger P.L. Expression of myelin proteolipid and basic protein mRNAs in cultured cells. II J Neurosci Res 1986 - V. 6 - P. 203-217.

302. Malamud N. Neuropathology of organic brain syndromes associated with aging. // In: Aging and the Brain, Gaitz, C. (ed.) New York - pages 63-87.

303. Malmestrom C., Haghighi S., Rosengren L. et al. Neurofilament light protein and glial fibrillary acidic protein as biological markers in MS. // Neurology. 2003 - V. 23 - P.1720-1725.

304. Mancardi G.L., Liwnicz, B.H., Mandybur T.I. Fibrous astrocytes in Alzheimer's disease and senile dementia of Alzheimer's type. An immunohistochemical and ultrastructural study. // Acta Neuropathol. (Berl.) 1983 - V. 61 - P. 76-80.

305. Mann D.M.A. The pathological association between Down's syndrome and Alzheimer's disease. // Mech. Aging Dev. 1988 - V. 43 - P. 99 -136.

306. Marangos P.J., Campbell I.C., et al. Blood platelets contain a neuron specific enolase subunit. // J. Neurochem. — 1980. — V. 34. — P. 1254-1258.

307. Marangos P. J., Campbell I. C., Cohen R.M. (eds). Neuronal and glial proteins: Structure, function, and clinical application. — San Diego etc.: Acad. Press, 1988. — 398 p.

308. Marangos P.J., Zomzely-Neurath C., Goodwin F.K. Structural and functional properties of neuron specific protein (NSP) from rat, cat and human brain. // J. Neurochem. — 1977. — V. 28, —P. 1097-1107.

309. Marangos P.J., Zomzely-Neurath C., York C. Immunological studies of a nerve specific protein (NSP) // Arch. Biochem. Biophys. — 1975. — V. 170. — P. 289 293.

310. Marangos P.J., Parma A.M., Goodwin F.K. Functional properties of neuronal and • glial isoenzymes of brain enolase. // J. Neurochem. — 1978. — V. 31. — P. 727-732.

311. Marchi N, Rasmussen P, Kapural M et al. Peripheral markers of brain damage and blood-brain barrier dysfunction. // Restor Neurol Neurosci. 2003 - V. 21(3-4) - P. 109-121.e

312. Martens P. Serum neuron-specific enolase as a prognostic marker for irreversible brain damage in comatose cardiac arrest survivors. // Acad.Emerg Med. 1996 - V. 3(2) - P. 126-131.

313. Martens P., Raabe A., Johnsson P. Serum S-100 and neuron-specific enolase for prediction of regaining consciousness after global cerebral ischemia. // Stroke. 1998 — V. 29 -P. 2363-2366.

314. Maruyama K. In vivo targeting by liposomes. // Biol Pharm Bull 2000 - V. 23 — P. 791-799.

315. Matias-Guiu J., Martinez-Vazquez J., Ruibal A. Myelin basic protein and creatine kinase BB isoenzyme as CSF markers of intracranial tumors and stroke Acta Neurol Scand -1986-V. 73 (5)-P. 461-465;

316. McCall M.A., Gregg R.G., Behringer R.R. et al. Targeted deletion in astrocyte intermediate filament (Gfap) alters neuronal physiology. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 -V. 93-P. 6361-6366.

317. McKie E.A., Graham D.I., Brown S.M. Selective astrocytic transgene expression in vitro and in vivo from. // Gene Therapy 1998 - V. 5 - P. 440 -450.

318. Mecocci P., Parnetti L., Donato R. et al. Serum autoantibodies against glial fibrillary acidic protein in brain aging and senile dementias. // Brain Behav Immun. 1992 - V. 6(3)- P. 286-292.

319. Mecocci P., Parnetti L„ et al. Serum anti-GFAP and anti-SlOO autoantibodies in brain aging, Alzheimer's disease and vascular dementia // J. Neuroimmunol. — 1995. — V. 57.1. P. 165-170.

320. Meinl E, Hohlfeld R. Immunopathogenesis of multiple sclerosis: MBP and beyond. // Clin Exp Immunol. 2002 - V. 128 - P. 395-397.

321. Menet V., Prieto M., Privat A. et al. Axonal plasticity and functional recovery after spinal cord injury in mice deficient in both glial fibrillary acidic protein and vimentin genes. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 - V. 100(15) - P. 8999-9004.

322. Merluzzi S., Figini M., Colombatti A. et al. Humanized antibodies as potential drugs for therapeutic use. //Adv Clin Path. 2000 - V. 4(2) - P. 77-85.

323. Meynaar I.A., Straaten H.M., van der Wetering J. et al. Serum neuron-specific enolase predicts outcome in post-anoxic coma: a prospective cohort study. // Intensive Care Med. 2003 - V. 29 - P. 189-195.

324. Michetti F., Larocca L.M., Rinelli A. et al. Immunocytochemical distribution of S-100 protein in patients with Down's syndrome. // Acta Neuropathol. (Berl.) 1990 - V. 80 - P. 475-478

325. Milenic DE. Monoclonal antibody-based therapy strategies: providing options for the cancer patient. // Curr Pharm Des. 2002 - V. 8(19) - P. 1749-1764

326. Miller D B., Blackman C.F., O'Callaghan J.P. An increase in glial fibrillary acidic protein follows brain hyperthermia in rats // Brain Res. — 1987. — V. 415. — P. 371 374.

327. Milstein C., Cuello A.C. Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry //Nature (London). — 1983. — V. 305. —P. 537 540.

328. Missler U., Wiesmann M., Wittmann G. et al. Measurement of glial fibrillary acidic protein in human blood: analytical method and preliminary clinical results. // Clinical Chemistry - 1999 - V. 45 -№ 1 -P. 138-141.

329. Missler U., Wiesmann M., Friedrich C. et al. S-100 protein and neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators of infarction volume and prognosis in acute ischemic stroke. // Stroke. 1997 -V. 28(10) - P. 1956-1960.

330. Missler U., Orlowski N., Notzold A. et al. Early elevation of S-100B protein in blood after cardiac surgery is not a predictor of ischemic cerebral injury. // Clin Chim Acta. 2002 -V. 321(1-2)-P. 29-33.

331. Mito T., Becker L.E. Developmental changes of S100 protein and glial fibrillary acidic protein in the brain in Down syndrome. // Exp. Neurol. 1993 - V. 120(2) - P. 170-176.

332. Modak S., Cheung N.K. Antibody-based targeted radiation to pediatric tumors. // J Nucl Med.-2005-V. 46(1 Suppl), P. 157S-163S.

333. Modesti N.M., Barra H.S. The interaction of myelin basic protein with tubulin and the inhibition of tubulin carboxypeptidase activity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986 -V. 136-P. 482-489.

334. Monge M., Kadiiski D , Jacque C.M. et al. Oligodendroglial expression and deposition of four myelin constituents in the myelin sheath during development. An in vivo study. // Dev. Neurosci. 1986 - V. 8 - P. 222-226

335. Mori T., Morimoto K., Hayakawa T., et al. Radioimmunoassay of astroprotein (an astrocyte specific cerebroprotein) in cerebrospinal fluid and its clinical significance //Neurol. Med.-Chir. (Tokyo). — 1978. — V. 18. — P. 25 31.

336. Moore B.W. Brain-specific proteins, S100 protein, 14-3-2 protein and glial fibrillary protein // Advances in Neurochemistry. — 1976. — V. 1. — P. 137 155.

337. Moore B.W., McGregor D. Chromatographic and electrophoretic fractionation of soluble proteins of brain and liver. // J. Biol. Chem. — 1965. — V. 133. — P. 1647-1653.

338. Morell P., Greenfield S. et al. Changes in the protein composition of mouse brain myelin during development. // J Neurochem. 1972 - V. 19 - P. 2545-2554.

339. Morris S.J., Bradley D. et al. Myelin basic protein binds heme at a specific site nesr the tryptophan residue. // Biochemistry 1987 - V. 26 - P. 2175-2182.

340. Mucke L., Rockenstein E.M. Prolonged delivery of transgene products to specific brain regions by migratory astrocyte grafts. // Transgenics 1993 - V. 1 - P. 3-9

341. Murphy G.M., Eng L.F., Ellis W.G. et al. Antigenic profile of plaques and neurofibrillary tangles in the amygdala in Down's syndrome: a comparison with Alzheimer's disease. //Brain Res. 1990-V. 537-P. 102-108.

342. Murphy G.M., Jr., Murphy E., Greenberg B.D. et al. Alzheimer's disease: beta-amyloid precursor protein expression in plaques varies among cytoarchitectonic areas of the medial temporal lobe. // Neurosci. Lett. 1991 - V. 131 - P. 100 -104.

343. Moryama E., Salkman M„ Broadwell R.D. Blood-brain barrier alteration after microwave-induced hyperthermia is purely a thermal effect. 1. Temperature and power measurements // Surg. Neurol. — 1991. — V. 35. — P. 177-182.

344. Moscarello M.A., Chia L.S., Leighton D. et al. Size and surface charge properties of myelin vesicles from normal and diseased (multiple sclerosis) brain. // J Neurochem 1985 - V. 45 (2)-P. 415-421

345. Mussack T., Biberthaler P., Kanz K.G. et al. Immediate S-100B and neuron-specific enolase plasma measurements for rapid evaluation of primary brain damage in alcohol-intoxicated, minor head-injured patients. // Shock. 2002 - V. 18 - P. 395-400.

346. Muvajfak A, Hasirci N. The use of antibodies in diagnosis and therapy of cancer. // Adv Exp Med Biol. 2003 - V. 534 - P. 309-325

347. Nagdyman N., Komen W., Ko H.K. et al. Early biochemical indicators of hypoxic-ischemic encephalopathy after birth asphyxia. // Pediatr Res. 2001 - V. 49(4) - P. 502-506.

348. Nagdyman N. Grimmer I., Scholz T. et al. Predictive value of brain-specific proteins in serum for neurodevelopmental outcome after birth asphyxia. // Pediatr Res. 2003 - V. 54(2) - P. 270-275.

349. Nakagawa H., Yamada M., Kanayama T. Myelin basic protein in the cerebrospinal fluid of patients with brain tumors. // Neurosurgery 1994 - V. 34 (5) - P. 825-833;

350. Nakamura K., Takeda M., Tanaka T. et al. Glial fibrillary acidic protein stimulates proliferation and immunoglobulin synthesis of lymphocytes from Alzheimer's disease patients. // Methods Find Exp Clin Pharmacol. 1992 - V. 14(2) - P. 141-149.

351. Nakano 71, Nagata A. ELISAs for free light chains of human immunoglobulins using monoclonal antibodies: comparison of their specificity with available polyclonal antibodies. // J Immunol Methods. 2003 - № 1 - V. 275 (1-2) - P. 9-17.

352. Nakanishi K., Nakanishi M„ Kukita F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia coculture system. // Brain Res. Protocols 1999 - V. 4 — P. 105-114

353. Nakazato Y, Ishizeki J., et al. Localization of SI00 and glial fibrillary acidic protein-related antigen in pleomorphic adenoma of salivary glands // Lab. Invest. — 1982. — V. 46, —P. 621 -626.

354. Niebroj-Dobosz /., Rafalowska J., Lukasiuk M., et al. Immunochemical analysis of some proteins in cerebrospinal fluid and serum of patients with ischemic strokes // Folia Neuro-pathol. — 1994. — V. 34. — P. 182 186.

355. Nooijen P.T.G.A., Schoonderwaldt H.C., et al. Neuron-specific enolase, S100 protein, myelin basic protein and lactate in CSF in dementia // Dement. Geriatr. Cogn. Disord. — 1997. —V. 8, —P. 169- 173.

356. Norton W.T., Cammer W. Isolation and characterization of myelin. // In: "Myelin" (Ed. Morell P.) Premium press, N-Y 1984 - P. 147-195.

357. Noseworthy T.W., Anderson B.J., Noseworthy A.F. Cerebrospinal fluid myelin basic protein as a prognostic marker in patients with head injury. // Crit Care Med 1985 - V. 13 (9) -P. 743-746;

358. Nylen K., Karlsson J.E., Blomstrand C. et al. Cerebrospinal fluid neurofilament and , glial fibrillary acidic protein in patients with cerebral vasculitis. // J. Neurosci Res. 2002 - V.15.P. 844-851.

359. O'Callaghan J.P., Lavin K.L., Chess G., Clouet D.H. A method for dissection of discrete regions of rat brain following microwave irradiation // Brain Res. Bull. — 1983. — V. 11, —P.31 -42.

360. O'Callaghan JP. Quantification of glial fibrillary acidic protein: comparison of slot-immunobinding assays with a novel sandwich ELISA. // Neurotoxicol Teratol. 1991 - V. 13(3)-P. 275-281.

361. Oh S.H., Lee J.G., Na S.J. et al. The effect of initial serum neuron-specific enolase level on clinical outcome in acute carotid artery territory infarction. // Yonsei Med J. 2002 -V. 43 - P. 357-362.

362. Oh S.H., Lee J.G., Na S.J. et al. Prediction of early clinical severity and extent of neuronal damage in anterior-circulation infarction using the initial serum neuron-specific enolase level. // Arch Neurol. 2003 - V. 60 - P. 37-41.

363. Ohta M., Ohta K., Ma J. et al. Clinical and analytical evaluation of an enzyme immunoassay for myelin basic protein in cerebrospinal fluid. // Clin Chem. 2000 - V. 46 - P. 1326-1330.

364. Ohta M., Ohta K. Detection of myelin basic protein in cerebrospinal fluid. // Expert Rev Mol Diagn. 2002 - V. 2 - P. 627-633.

365. Ohta M., Ohta K., Nishimura M. et al. Detection of myelin basic protein in cerebrospinal fluid and serum from patients with HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis. // Ann Clin Biochem. 2002 - V. 39 - P. 603-605.

366. Onteniente B., Kimura H., Maeda T. Comparative study of the glial fibrillary acidic protein in vertebrates by PAP immunohistochemistry // J. Comp. Neurol. — 1983. — V. 215 -P. 427-436.

367. Orlino, E.N., Jr. Olmstead C.E., et al. An enzyme immunoassay for neuron-specificenolase in cerebrospinal fluid // Biochem. Molec. Med. — 1997. — V. 61. — P. 41 46.

368. Pachter J.S., de Vries H.E., Fabry Z. The blood-brain barrier and its role in immune privilege in the central nervous system. // J Ncuropathol Exp Neurol. 2003 - V. 62(6) - P. 593-604.

369. Pan W., Banks W.A., Fasold M.B. et al. Transport of brain-derived neurotrophic factor across the blood-brain barrier. // Neuropharmacology. 1998 - V. 37(12) - P. 1553-1561.

370. Payne G. Progress in immunoconjugate cancer therapeutics. // Cancer Cell. 2003 — V. 3(3)-P. 207-212

371. Palmio J., Peltola J., Vuorinen P. et al. Normal CSF ncuron-specific enolase and S-100 protein levels in patients with recent non-complicated tonic-clonic seizures. // J Neurol Sci.-2001 -V. 15-№ 183-P. 27-31.

372. Papasozomenos S., Shapiro S. Pineal astrocytoma report of a case, confined to the epiphysis, with immunocytochemical and electron microscopic studies // Cancer (Philadelphia). — 1981.—V. 47 —P. 99- 103.

373. Pardridge W.M. CNS drug design based on principles of blood-brain barrier transport//! Neurochem.— 1998, —V. 70. —P. 1781 1792.

374. Pardridge WM. Blood-brain barrier drug targeting: the future of brain drug development. // Mol Interv. 2003 - № 51 - V. 3(2) - P. 90-105

375. Park Y.S. Tumor-directed targeting of liposomes. // Biosci Rep. 2002 - V. 22(2) -P. 267-281

376. Parnetti L„ Palumbo B., Cardinali L. et al. Cerebrospinal fluid neuron-specific enolase in Alzheimer's disease and vascular dementia. // Neurosci Lett. 1995 - V. 2 — № 183 — P. 43-45.

377. Pedraza L., Fidler L„ Staugaitis S.M. et al. The active transport of myelin basic protein into the nucleus suggests a regulatory role in myelination. //Neuron 1997 - V, 18 — P. 579-589.

378. Pekny M, Leveen P., Pekna M. et al. Mice lacking GFAP display astrocytes devoid of intermediate filaments but develop and reproduce normally. // EMBO J. 1995 - V. 14 - P. 1590-1598.

379. Pekny M., Johansson C.B., Eliasson C. et al. Abnormal reaction to central nervous system injury in mice lacking glial fibrillary acidic protein and vimentin. // J. Cell Biol. — 1999 — V. 145-P. 503-514.

380. Petito C.K., Halaby I.A. Relationship between ischemia and ischemic neuronal necrosis to astrocyte expression of glial fibrillary acidic protein //Int. J. Dev. Neurosci. — 1993. — Vol. 11, № 2. — P. 239 247.

381. Petzold A., Keir G., Green A.J. et al. An ELISA for glial fibrillary acidic protein. // J. Immunol Methods. 2004 - V. 287 - P. 169-177.

382. Pineda J.A., Wang K.K., Hayes R.L. Biomarkers of proteolytic damage following traumatic brain injury. // Brain Pathol. 2004 - V. 14(2) - P. 202-209.

383. Polak M, Haymaker w., Johnson J.E., D 'Amelio J. Neuroglia and their reactions. In: Haymaker W., Adams R. (Eds.) Histology and histopathology of the nervous system. Springfield, III.: Thomas, 1982. — V. 1. — P. 363-480.

384. Povlsen G.K., Ditlevsen D.K., Berezin V. et al. Intracellular signaling by the neural cell adhesion molecule. // Neurochem Res. 2003 - V. 28(1) - P. 127-141.

385. Price C.P. Progress in immunoassay technology. // Clin Chem Lab Med. 1998 -V. 36 (6)-P. 341-347.

386. Quintana J.G., Lopez-Colberg I., Cunningham, L.A. Use of GFAP-lacZ transgenic mice to determine astrocyte fate in grafts of embryonic ventral midbrain. // Brain Res. Dev. Brain Res.-1998-V. 105-P. 147-151.

387. Raff M. C„ Williams B.P. Miller R.H. The in vitro differentiation of a bipotential glial progenitor cell // EMBO J. — 1984. — V. 3. — P. 1857-1864.

388. Ramer M.S., Kawaja M.D., Henderson J.T. et al. Glial overexpression of NGF enhances neuropathic pain and adrenergic sprouting into DRG following chronic sciatic constriction in mice. // Neurosci. Lett. 1998 - V. 251 - P. 53-56.

389. Rasmussen L.S., Christiansen M„ Eliasen K. et al. Biochemical markers for brain damage after cardiac surgery time profile and correlation with cognitive dysfunction. // Acta

390. Anaesthesiol Scand. 2002 - V. 46 - P. 547-551.

391. Rasmussen L.S., Christiansen M., Johnsen J. et al. Subtle brain damage cannot be detected by measuring neuron-specific enolase and S-lOObeta protein after carotid endartcrec-tomy. // J. Cardiothorac Vase Anesth. 2000 - V. 14(2) - P. 166-170.

392. Rasmussen L.S., Poulsen M.G., Christiansen M. et al. Biochemical markers for brain damage after carbon monoxide poisoning. // Acta Anaesthesiol Scand. 2004 - V. 48(4) - P. 469-473.

393. Rasmussen L.S., Christiansen M., Hansen P.B. et al. Do blood levels of neuron-specific enolase and S-100 protein reflect cognitive dysfunction after coronary artery bypass? // Acta Anaesthesiol Scand. 1999 - V. 43(5) - P. 495-500.

394. Rasmussen L.S., Christiansen M., Rasmussen H. et al. Do blood concentrations of neurone specific enolase and S-100 beta protein reflect cognitive dysfunction after abdominal surgery? ISPOCD Group. // Br J Anaesth. 2000 - V. 84(2) - P. 242-244.

395. Reeves S. A., Helman L J., Allison A., et al. Molecular cloning and primary structure of human glial fibrillary acidic protein // Proc. natl. Acad. Sci. — 1989. — V. 86. — P. 5178 -5182.

396. Reff M.E, Hariharan K., Braslawsky G. Future of monoclonal antibodies in the treatment of hematologic malignancies. // Cancer Control. 2002 - V. 9(2) - P. 152-166

397. Reindl M., Linington C., Brehm U. et al. Antibodies against the myelin oligodendrocyte glycoprotein and the myelin basic protein in multiple sclerosis and other neurological diseases: a comparative study. // Brain. 1999 - V. 122 - P. 2047-2056.

398. Ribotta M.G., Menet V., Privat A. Glial scar and axonal regeneration in the CNS: lessons from GFAP and vimentin transgenic mice, // Acta Neurochir Suppl. 2004 - V. 89 - P. 87-92.

399. Riccio P., Rosenbusch, et al. A new procedure for the isolation of the brain myelin basic protein in a lipid- bound form. // FEBS Lett. 1984 - V. 177 - P. 236-240

400. Riccio P., Fasano A., Borenshtein N. Multilamellar packing of myelin modeled by lipid-bound MB P. // J Neurosci Res 2000 - V. 15 - № 59 (4) - P. 513-521;

401. Rider C.C., Taylor C.B. Evidence for a new form of enolase in rat brain. // Biochem.

402. Biophys. Res. Commun. — 1975. —V. 66. — P. 814-820.

403. Ritter M.A., Ladyman H.M. Monoclonal antibodies. Production, engeneering and clinical application. 1995 - Cambridge University Press. - pp. 480.

404. Rodriguez-Nunez A., Cid E., Eiris J. et al. Neuron-specific enolase levels in the cerebrospinal fluid of neurologically healthy children. // Brain Dev. 1999 - V. 21 - P. 16-19.

405. Rodriguez-Nunez A., Cid E., Rodrigaez-Garcia J. et al. Cerebrospinal fluid purine metabolite and neuron-specific enolase concentrations after febrile seizures. // Brain Dev. — 2000-V. 22-P. 427-431.

406. Roque A.C., Lowe C.R., Taipa M.A. Antibodies and genetically engineered related molecules: production and purification. // Biotechnol Prog. 2004 - V. 20(3) - P. 639-654.

407. Rosen H., Sunnerhagen K.S., Herlitz J. et al. Serum levels of the brain-derived proteins S-100 and NSE predict long-term outcome after cardiac arrest. // Resuscitation. 2001 -V. 49 — P. 183-191.

408. Rosengren L.E., Ahlsen G., Belfrage M. et al. A sensitive ELISA for glial fibrillary acidic protein: application in CSF of children. // J. Neurosci Methods. 1992 — V. 44 - P. 113119.

409. Rosengren L.E., Lycke J., Andersen O. Glial fibrillary acidic protein in CSF of multiple sclerosis patients: relation to neurological deficit // J. Neurol. Sci. — 1995. — V. 133. — P. 61-65.

410. Rosengren L.E., Wikkelse C., Hagberg L. A sensitive ELISA for glial fibrillary acidic protein: application in CSF of adults // J. Neurosci. Methods. — 1994. — V. 51. — P. 197-204.

411. Ross JS, Gray K., Gray GS et al. Anticancer antibodies. // Am J Clin Pathol. 2003 - V. 119(4)-P. 472-485.

412. Ross J., Gray K., Schenkein D. et al. Antibody-based therapeutics in oncology. // Expert Rev Anticancer Ther. 2003 - V. 3(1) - P. 107-121.

413. Rozemuller J.M., Eikelenboom P., Stam F.C. et al. A4 protein in Alzheimer's disease: primary and secondary cellular events in extracellular amyloid deposition. // J. Neuropa-thol. Exp. Neurol. 1989 - V. 48 - P. 674 -691

414. RuegerR., Dahl D., Bignami A. Purification of a brain-specific astroglial protein by immunoaffinity chromatography // Ann. Biochem. — 1978. — V. 89. — P. 360.

415. Rutka J.T., Murakami M, Dirks P.B., et al. Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review // J. Neurosurg. — 1997. — V. 87. — P. 420 430.

416. Rutka J.T., Smith S.L. Transfection of human astrocytoma cells with glial fibrillary acidic protein complementary DNA: analysis of expression, proliferation, and tumorigenecity // Cancer Res. — 1993. — V. 53. — P. 3624 3641.

417. Ruutiainen J., Newcombe J., Salmi A. et al. Measurement of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and anti-GFAP antibodies by solid-phase radioimmunoassays. // Acta Neurol Scand. 1981 - V. 63 - P. 297-305.

418. Sakimura K. Kushiya E., et al. Molecular cloning and the nucleotide sequence of cDNA to mRNA for non-neuronal enolase (aa-enolase) of rat brain and liver // Nucleic Acids Res. — 1985. — V. 13. — P. 4365 4378.

419. Salm A.K., Hatton G.I., Nilaver G. Immunoreactive glial fibrillary acidic protein in pituicytes of the neurohypophysis // Brain Res. — 1982. — V. 236. — P. 471 476.

420. Sam L., Blanco B., Alvarez-Vallina L. Antibodies and gene therapy: teaching old 'magic bullets' new tricks. // Trends Immunol. 2004 - V. 25(2) - P. 85-91.

421. Schaumburg H.H., Powers J.M., Raine C.S. et al. Adrenoleukodystrophy. A clinical and pathological study of 17 cases. // Arch Neurol. 1975 - V. 33 - P. 577-591.

422. Schechter R., Yen S.-H.C., Terry R.D. Fibrous astrocytes in senile dementia of the Alzheimer type. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1981 - V. 40 - P. 95-101.

423. Schmechel D.E. Methods of localizing cell-specific proteins in brain. In: Marangos P.J., Campbell I.C., Cohen R.M. (Eds.) Neuronal and glial proteins: Structure, function, and clinical application. — San Diego etc.: Acad. Press, 1988. —■ P. 69-102.

424. Schmechel D.E., Brightman M.W., Marangos P.J. Neurons switch from nonneuronal (NNE) enolase to neuronal (NSE) enolase during development. // Brain Res. — 1980. — V. 190, — P. 195-214

425. Schmitt B., Bauersfeld U., Schmid E.R. et al. Serum and CSF levels of neuron-specific enolase (NSE) in cardiac surgery with cardiopulmonary bypass: a marker of brain injury? // Brain Dev. 1998 - V. 20 - P. 536-539.

426. Schmidt S., Haase C.G., Bezman L. et al. Serum autoantibody responses to myelin oligodendrocyte glycoprotein and myelin basic protein in X-linked adrenoleukodystrophy andmultiple sclerosis. // J Neuroimmunol. 2001 - № 3 - V. 119 (1) - P. 88-94.

427. Schnitzer J., Franke W. W., Schachner M. Immunocytochemical demonstration of vimentin in astrocytes and ependymal cells of developing and adult mouse nervous system // J. Cell Biol. — 1981. — V. 90. — P. 435 — 447.

428. Schoerkhuber W., Kittler H„ Sterz F. et al. Time course of serum neuron-specific enolase. A predictor of neurological outcome in patients resuscitated from cardiac arrest. // Stroke.- 1999-V. 30-P. 1598-1603.

429. Segovia J., Vergara P., Brenner M. Astrocytespecific expression of tyrosine hydroxylase after intracerebral gene transfer induces behavioral recovery in experimental Parkinsonism. // Gene Therapy 1995-V. 5-P. 1650-1655.

430. Seshi B„ Bell C.E. Preparation and characterization of monoclonal antibodies to human neuron-specific enolase. // Hybridoma. — 1985. — V. 4. — P. 13-25.

431. Sharp F.R., Liu J., Bernabeu R. Neurogenesis following brain ischemia. // Brain Res Dev Brain Res. 2002 - № 31 - V. 134(1-2) - P. 23-30.

432. Shirasaka Y. Lack of neuronal damage in atypical absence status epilepticus. // Epilepsia.-2002-V. 43-P. 1498-1501.

433. Seiwa Ch, Kojima-Aikawa K„ Matsumoto I. et al. CNS Myelinogenesis in Vitro: Myelin Basic Protein Deficient shiverer Oligodendrocytes. // J. Neurosci. Res. 2002 - V. 69 -P. 305-317.

434. Seshi B., Bell C.E. Preparation and characterization of monoclonal antibodies to human neuron-specific enolase // Hybridoma. — 1985. — V. 4. — P. 13-25.

435. SellebjergF., Christiansen M., GarredP. MBP, anti-MBP- and anti-PLP-antibodies, and intrathecal complement activation in multiple sclerosis. // Mult Scler 1998 - V. 4 (3) - P. 127-131;

436. SellebjergF., Christiansen M„ Nielsen P.M. Cerebrospinal fluid measures of disease activity in patients with multiple sclerosis. // Mult Scler 1998 - V. 4 (6) - P. 475-479;

437. Segovia J., Vergara P., Brenner M. Astrocytespccific expression of tyrosine hydroxylase after intracerebral gene transfer induces behavioral recovery in experimental Parkinsonism.//Gene Therapy 1995 -V. 5 -P. 1650-1655.

438. Sharkey R.M., Goldenberg D.M. Perspectives on cancer therapy with radiolabeled monoclonal antibodies. // J Nucl Med. 2005 - V. 46(1 Suppl) - P. 115S-127S.

439. Shibuki K., Gomi H., Chen L. et al. Deficient cerebellar long-term depression, im-311paired eyeblink conditioning, and normal motor coordination in GFAP mutant mice. // Neuron -1996-V. 16-P. 587-599.

440. Shine H.D., Readhead C., Popko B. Morphometric analysis of normal, mutant, anditransgenic CNS: correlation of myelin basic protein expression to myelinogenesis. // J. Neurochem 1992 - V. 58 (1) - 342-349.

441. Shults C.W., Whitaker J.N., Wood J.G. Myelin basic protein microheterogenity in subfractions of rat brain myelin J. Neurochemistry - 1978 - V. 30 - № 6 - P. 1543-1551

442. Singh V.K., Warren R., Averett R. et al. Circulating autoantibodies to neuronal and glial filament proteins in autism. // Pediatr Neurol. 1997 - V. 17(1) - P. 88-90.

443. Singh K.V., Kaur J., Varshney G.C. et al. Synthesis and characterization of hapten-protein conjugates for antibody production against small molecules. // Bioconjug Chem. 2004 -V. 15(1)-P. 168-173.

444. Slagel D.E., Wilson C.B., Simmons P.B. Polyacrylamide electrophoreses and immunodiffusion studies of brain tumor proteins //Ann. N.Y. Acad. Sci. — 1969. — V. 159: — P. 490 496.

445. Smith J.D., Sikes J., Levin A.J. Human apolipoprotein E allele-specific brain expressing transgenic mice. // Neurobiology of Aging 1998 - V. 19 - P. 407-413.

446. Snyder-Ramos S.A., Bottiger B. W. Molecular markers of brain damage clinical and ethical implications with particular focus on cardiac arrest. // Restor Neurol Neurosci. - 2003 -V. 21 (3-4)-P. 123-139.

447. Soderstrom M., Link H„ Xu Z. Optic neuritis and multiple sclcrosis: anti-MBP and anti-MBP peptide antibody-secreting cells are accumulated in CSF //Neurology 1993 - V. 43 (6)-P. 1215-1222;

448. Soler A., Federsppiel B.S., Karcher D„ Lowenthal A. Blood and cerebrospinal fluid anomalies in brain ageing and Alzheimer's disease. // Gerontology. 1987 - V. 33 - p. 193-196.

449. Sorg B., Agrawal D., Agrawal H. et al. Expression of myelin proteolipid protein and myelin basic protein in normal and dysmyelinating mutant mice. //J. Neurochem. 1986 - V. 46-P. 379-387.

450. Sporer B., Missler U., Magerkurth O. et al. Evaluation of CSF glial fibrillary acidic protein (GFAP) as a putative marker for HIV-associated dementia. // Infection. 2004 - V. 32(1)-P. 20-23.

451. Stalnacke B.M., Tegner Y„ Sojka P. Playing soccer increases serum concentrationsof the biochemical markers of brain damage S-100B and neuron-specific enolase in elite players: a pilot study. // Brain Inj. 2004 - V. 18(9) - P. 899-909.

452. Steinhoff B.J., Tumani H., Otto M. et al. Cisternal SI00 protein and neuron-specific enolase are elevated and site-specific markers in intractable temporal lobe epilepsy. // Epilepsy Res. 1999 - V. 36 - P. 75-82.

453. Sternberger N.H., Itoyama Y., Kies M.W. et al. Myelin basic protein demonstrated immunocytochemically in oligodendroglia prior to myelin sheath formation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978 - V. 75(5) - P. 2521-2524.

454. Sterk M., Oenings A., Eymann E.et al. Development of a new automated enzyme immunoassay for the determination of neuron-specific enolase. // Anticancer Res. 1999 - V. 19 (4A) - P. 2759-2762.

455. Stockwin LH, Holmes S. The role of therapeutic antibodies in drug discovery. // Biochem Soc Trans. 2003 - V. 31(2) - P. 433-436.

456. Strand T., Ailing C. Et al. Brain and plasma proteins in spinal fluid as markers for brain damage and severity of stroke. // Stroke 1984 - V. 15(1) - P. 138-44.

457. Strobel E.S., Fritschka E., Schmitt-Graff A. et al. An unusual case of systemic lupus erythematosus, lupus nephritis, and transient monoclonal gammopathy. // Rheumatol Int. 2000 -V. 19(6)-P. 235-241.

458. Su II.D., Kemp B.E. et al. Synthetic myelin basic protein peptide analogs are specific ingibitors of phospholipid/calcium-dependent protein kinase (protein kinase C). // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986 - V. 134 - P. 78-84.

459. Suenaga T., Hirano A., Llena J.F. et al. Modified immunocytochemical studies in cerebellar plaques in Alzheimer's disease. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1990 - V. 49 - P. 31-40.

460. Sun Y., Wu S., Bu G. et al. Glial fibrillary acidic protein-apolipoprotein E (apoE) transgenic. // J. Neurosei. 1998 - V. 18 - P. 3261-3272.

461. Suresh M.R., Cuello A.C., Milstein C. Advantages of bispecific hybridomas in one-step immunocytochemistry and immunoassays. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1986 V. 83(20) -P. 7989-7993.

462. Sutton L.N., Wood J.H., Brooks B.R. et al. Cerebrospinal fluid myelin basic protein in hydrocephalus. // J Neurosurg. 1983 - V. 59 (3) - P. 467-470.

463. Tanabe T., Suzuki S., Hara K. et al. Cerebrospinal fluid and scrum neuron-specificenolase levels after febrile seizures. // Epilepsia. 2001 - V. 42 - P. 504-507.

464. Tapia F.J., Polak J.M., et al. Neuron-specific enolase is produced by neuroendocrine tumours. // Lancet. — 1981. — V. i. — P. 808-812.

465. Tardy M., Fages C., Riol H., et al. Developmental expression of the glial fibrillary acidic protein mRNA in the central nervous system and in cultured astrocytes // J. Neurochem. -1989.-V. 52.-P. 162- 167.

466. Thomas D.G., Hoyle N.R., Seeldrayers P. Myelin basic protein immunoreactivity in serum of neurosurgical patients. // J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1984 - V. 47(2) - P. 173175.

467. Thompson S. Small-molecule-protein conjugation procedures. // Methods Mol Med. 2004 - V. 94 - P. 255-265.

468. Thomson A.J., Brazil J., Feighery C. CSF myelin basic protein in multiple sclerosis. // Acta Neurol Scand 1985 - V. 72 (6) - P. 577-583.

469. Terryberry JW, Thor G, Peter JB. Autoantibodies in neurodegenerative diseases: antigen-specific frequencies and intrathecal analysis. // Neurobiol Aging. 1998 - V. 19(3) - P. 205-216.

470. Tiainen M., Roine R.O., Pettila V. et al. Serum neuron-specific enolase and S-100B protein in cardiac arrest patients treated with hypothermia. // Stroke. 2003 - V. 34(12) - P. 2881-2886.

471. Timar J., Udvarhelyi N. Banfalvi T. et al. Accuracy of the determination of S100B protein expression in malignant melanoma using polyclonal or monoclonal antibodies. // Histo-pathology. 2004 - V. 44(2) - P. 180-184.

472. Torchilin V.P., Klibanov A.L., Huang L. et al. Targeted accumulation of polyethylene glycol-coated immunoliposomes in infarcted rabbit myocardium. // FASEB J 1992 - V. 6 -P. 2716-2719.

473. Torchilin V.P., Papisov M.I., Bogdanov A.A. et al. Molecular mechanissm of liposome and immunoliposome steric protection with poly(ethylene glycol) in: "Stealth Liposomes". D.Lasic, F.Martin (Eds) 1995 - P. 51-62.

474. Tort A.B., Portela L.V., Rockenbach I.C. et al. S100B and NSE serum concentrations in Machado Joseph disease. // Clin Chim Acta. 2005 - V. 351(1-2) - P. 143-148.

475. Trail P.A., King H.D., Dubowchik G.M. Monoclonal antibody drug immunoconju-gates for targeted treatment of cancer. // Cancer Immunol Immunother. 2003 - V. 52(5) - P. 328-337.

476. Trejo F., Vergara P., Brenner M. et al. Gene therapy in a rodent model of Parkinson's disease using differentiated C6 cells expressing a GFAP-tyrosine hydroxylase transgcne. // Life Sciences 1999 - V. 65 - P. 483^91.

477. Trikha M., Yan L., Nakada M.T. Monoclonal antibodies as therapeutics in oncology. // Curr Opin Biotechnol. 2002 - V. 13 (6) - P. 609-614.

478. Trojanowski J.Q., Lee V.M.-Y., Schlaepfer W.W. An immunohistochemical study of human central and peripheral nervous system tumors, using monoclonal antibodies against neurofilaments and glial filaments // Hum. Pathol. — 1984 — V. 15. — P: 248 257.

479. Tsukita S. Ishikawa H., Karokawa M. Isolation of 10 nm filaments from astrocytes in the mouse optic nerve. J. Cell Biol. — 1981 — V. 88. — P. 245 250.

480. Tullberg M, Rosengren L., Blomsterwall E. et al. CSF neurofilament and glial fibrillary acidic protein in normal pressure hydrocephalus. // Neurology 1998 - V. 50 - P. 11221127.

481. Tumani H., Otto M., Gefeller O. et al. Kinetics of serum neuron-spccific enolase and prolactin in patients after single epileptic seizures. // Epilepsia. 1999 — V. 40(6) - P. 713-718.

482. Uyeda C.T., Eng L.F., Bignami A. Immunological study of the glial fibrillary acidic protein // Brain Res. — 1972 — V. 37. — P. 81 89.

483. Van Engelen B.G., Lamers K.J., Gabreels F.J. Age-related changes of neuron-specific enolase, S-100 protein, and myelin basic protein concentrations in cerebrospinal fluid. // Clin Chem- 1992-V. 38 (6)-P. 813-816;

484. Van Geel W.J., de ReusH.P., Nijzing H. et al. Measurement of glial fibrillary acidic protein in blood: an analytical method. // Clin Chim Acta. 2002 - V. 326 - P. 151-154.

485. Van Reempts J.L.H., Borgers M. Structural damage in experimental ccrebral ischemia. // In: Schurr A., Rigor B.M. (eds). Cerebral ischemia and resuscitation. Boca Raton, Florida: CRC, 1990 — P. 235 - 257.

486. Varma S„ Janesko K.L., Wisniewski S.R. et al. F2-isoprostane and neuron-specific enolase in cerebrospinal fluid after severe traumatic brain injury in infants and children. //

487. J. Neurotrauma. 2003 - V. 20 - P. 781-786.

488. Verbeek M.M., De Jong D., Kremer H.P. Brain-specific proteins in cerebrospinal fluid for the diagnosis of neurodegenerative diseases. // Ann Clin Biochem. 2003 - V. 40 (Pt 1)-P. 25-40.

489. Verity A.N., Campagnoni A.T. Regional expression of myelin protein genes in the developing mouse brain. // J. Neurosci. Res. 1988 - V. 21 - P. 238-248.

490. Vijayan V., Geddes J.W., Anderson K.J. et al. Astrocyte hypertrophy in the Alzheimer's disease hippocampal formation. // Exp. Neurol. 1991 - V. 112 - P. 72-78.

491. Von Mehren M., Weiner L.M. Monoclonal antibody-based therapy. // Curr Opin Oncol. 1996 - V. 8(6) - P. 493-498.

492. Von Mehren M., Adams G.P., Weiner L.M. Monoclonal antibody therapy for cancer. // Annu Rev Med. 2003 - V. 54 - P. 343-369.

493. Wallin A., Blennow K., Rosengren L.E. Glial fibrillary acidic protein in the cerebrospinal fluid of patients with dementia // Dementia. — 1996. — V. 7. — P. 267 272.

494. Warren KG., Catz I. Increased synthetic peptide specificity of tissue-CSF bound anti-MBP in multiple sclerosis. //J Neuroimmunol 1993 - V. 43 (1-2) - P. 87-96;

495. Warren KG., Catz I. Autoantibodies to myelin basic protein within multiple sclerosis central nervous system tissue. // J Neurol Sci 1993 - V. 115 (2) - P. 169-176;

496. Warren K, Catz I. Johnson E. Anti-myelin basic protein and anti-proteolipid protein specific forms of multiple sclerosis. // Ann Neurol 1994 - V. 35 (3) - P. 280-289;

497. Warren K.G., Catz I. Relative frequency of autoantibodies to myelin basic protein and proteolipid protein in optic neuritis and multiple sclerosis cerebrospinal fluid. //J Neurol Sci 1994-V. 121(1)-P. 66-73;

498. Warren K.G., Catz I. Administration of myelin basic protein synthetic peptides to multiple sclerosis patients. // J Neurol Sci 1995 - V. 133 (1-2) - P. 85-94;

499. Warren K.G., Catz I, Steinman L. Fine specifity of the antibody response to myelin basic protein in the central nervous system in MS: the minimal B-cell epitope and a model of its features. // Proc. Natl. Acad. Sci 1995 - V. 92 - P. 11061 - 11065.

500. Warren KG., Catz I. An extensive search for autoantibodies to myelin basic protein in cerebrospinal fluid of non-multiple-sclerosis patients: implications for the pathogenesis of multiple sclerosis. // Eur Neurol 1999 - V. 42 (2) - P. 95-104; '

501. Wei L C, Shi M., Chen L. W. et al. Nestin-containing cells express glial fibrillary acidic protein in the proliferative regions of central nervous system of postnatal developing and adult mice. // Brain Res Dev Brain Res. 2002 - V. 139 (1) - P. 9-17.

502. Weidenheim K.M., Epshteyn I., Rashbaum W.K. Neuroanatomical localization of myelin basic protein in the late first and early second trimester human foetal spinal cord and brainstem. // J Neurocytol 1993 - V. 22 (7) - P. 507-516

503. Weidenheim K.M., Bodhireddy S.R., Rashbaum W.K. Temporal and spatial expresision of major myelin proteins in the human fetal spinal cord during the second trimester. // J Neuropathol Exp Neurol 1996 - V. 55 (6) - P. 734-745;

504. Weinstein D.E., Shelanski M.E Liem R.K Suppression by antisense mRNA demonstrates a requirement for the glial fibrillary acidic protein in the formation of stable astrocytic processes in response to neurons.//J. Cell Biol. 1991 -V. 112-P. 1205-1213.

505. Welzl H., Stork O. Cell adhesion moleculcs: key players in memory consolidation? // News Physiol Sci. 2003 - V. 18 - P. 147-150.

506. Wendling D., Toussirot E. Anti-TNF-alpha therapy in ankylosing spondylitis. // Expert Opin Pharmacother. 2004 - V. 5(7) - P. 1497-1507.

507. Wijnberger ED., Nikkels P.G., van Dongen A. J. et al. Expression in the placenta of neuronal markers for perinatal brain damage. // Pediatr Res. 2002 - V. 51 - P. 492-496.

508. Woertgen C., Rothoerl R.D., Holzschuh M. et al. Comparison of serial S-100 and NSE serum measurements after severe head injury. // Acta Neurochir (Wien). 1997 — V. 1391. P. 1161-1164i

509. Woertgen C, Albert R., Kohler M. et al. Ventricular tapping seems to have no influence on S-100B and NSE serum concentrations. // Neurosurg Rev. 2004 - V. 27 - P. 178-180

510. Biotechnol 1999 - V. 13 (1) - P. 17-19;

511. Wood D.D., Vella G.J. et al. Interaction between human myelin basic protein and lipophilin. //Neurochem. Res. 1984-V. 9-P. 1523-1531.

512. Wood D.D., Bilbao J.M., O'Connors P. Acute multiple sclerosis (Marburg type) is associated with developmcntally immature myelin basic protein. // Ann Neurol 1996 - V. 40 (1) - P. 18-24;

513. Wright S., Huang L. Antibody-directed liposomes as drug-delivery vehicles. // Advanced Drug Delivery Rev 1989 - V. 3 - P. 343-389.

514. Wu N.C., Ahmad F. Calcium and cyclic AMF-regulated protcin-cinases of bovine central-nervous-system myelin. // Biochem. J 1984 - V. 218 - P. 923-932

515. Wu D., Pardridge W.M. Neuroprotection with noninvasive neurotrophin delivery to the brain. // PNAS 1999 - № 5 - V. 96(1) - P. 254-259.

516. Yamamoto R., Kimura S., et al. Two-site column enzyme immunoassay for neuron-spccific enolase (NSE) in human serum using monoclonal antibodies I I J. Immunol. Methods. — 1986. —V. 94. —P. 51 -55.

517. Yamazaki Y., Yada K., Morii S. et al Diagnostic significance of serum neuron-spccific enolase and myelin basic protein assay in patients with acute head injury. // Surg Neurol 1995 - V. 43 (3) - P. 267-270;

518. Yen S.-H., Dahl D., et al. Biochemistry of the filaments of brain //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1976. — V. 73. — P. 529.

519. Yen S.H., Croue A., Dickson D.W. Monoclonal antibodies to Alzheimer's neurofibrillary tangles: identification of polypeptides // Am. J. Pathol. — 1985. — P. 282 291.

520. YongP.R., Vacante D.A., Synder W.R. Protein-induced aggregation of lipid vesicles. Mechanism of the myelin basic protein-myelin interaction. // J Am Chem Soc 1982 - V. 104 -P. 7287-7291

521. Yu A.C., Lee Y.L., EngL.F. Inhibition of GFAP synthesis by antisense RNAiin as318trocytes. // J. Neurosci. Res. 1991 - V. 30(1) - P. 72-79.

522. Yu A.C., Lee Y.L., Eng L.F. Astrogliosis in culture: I. The model and the effect of antisense oligonucleotides on glial fibrillary acidic protein synthesis. // J. Neurosci. Res. 1993 -V. 34-P. 295-303.

523. Zecevic N., Andjelkovic A., Matthieu J. Myelin basic protein immunoreactivity in the human embryonic CNS. // Brain Res Dev Brain Res 1998 - V. 14 - № 105 (1) - P. 97-108.

524. Zehetbauer B., Massacesi L. et al. Myelin basic protein in lipid-bound form induces experimental allergic ancephalomyelitis and demyelination in Lewis rat. // Acta Neurol — 1991 — V. 13(2)-P. 121-132.

525. Zeltzer P.M., Marangos P. J., Evans A.E. et al. Serum neuron-specific enolase in children with neuroblastoma. Relationship to stage and disease course. // Cancer. 1986 - V. 57(6)- 1230-1234.