Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к миоглобину человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к миоглобину человека"

ТАРТУСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЮРОНЕН Эркки Иванович

УДК 577.27:612.744.14

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К МИОГЛОБИНУ ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТАРТУ 19 8 8

Работа выполнена в НИИ обшей и молекулярной патологии Тартуского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук

А.-В.Н. ЫИКЕЛЬСААР

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

М.Ю. СААШ

кандидат медицинских наук

В.В. СВИРИДОВ

Ведущая организация:

ЦЕНТР АШ СССР

Защита состоится 1988 г. в, /Г .часов

на заседании Специализированного совета К.069.02.О? Тартуского государственного университета по адресу: 202400 ЭССР, г. Тарту, ул. Юликооли, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Тартуского государственного университета по адресу: 202400 ЭССР, г. Тарту, ул. Струве, I.

Автореферат разослан ^^' 1988 г.

Ученый секретарь У Лли^ш

Специализированного совета V

К.069.02.07 к.м.н. Л.С. УУСКША

Г/.*/.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Данная работа посвящена изучению возможностей получения гибридом,синтезирующих моноклинальные антитела (МКА) к миоглобину человека,эпитопному анализу миогло-бина и разработке метода иммуноферментного анализа миоглобина в сыворотке крови человека с помощью МКА.

Миоглобин как белок с хорошо изученной как первичной,так и пространственной структурой широко используется в качестве модельного белка для изучения многих фундаментальных проблем, в том числе реакций антиген-антитело. Миоглобин стал модельным объектом и для изучения антигенной структуры белка. Доказано существование на миоглобине кашалота двух типов антигенных детерминант или эпитопов: секвенциальных и топографических. Выявление у кашалота закономерностей антигенных свойств миоглобина вызывает вопрос об их специфичности и обшебиологи-ческом значении. В связи с этим представляет большой интерес молекулярно-иммунологическое исследование миоглобина и других животных, в том числе и человека. Тем более, что у человека такое исследование миоглобина имеет и чисто практическую ценность.

Являясь одним из основных белков скелетных и сердечных мышц и обладая небольшой молекулярной массой, миоглобин при патологических процессах легко проникает через поврежденные клеточные мембраны и попадает в общий кровоток, являясь отсюда полезным биохимическим маркером ряда заболеваний. Так, он служит одним из самых ранних маркеров некроза мышечных клеток, появляясь в крови раньше большинства ферментов и изофер-ментов, имеющих также диагностическую ценность. Ввиду этих причин в последние годы разработаны иммунологические методы определения содержания миоглобина в биологических жидкостях. Но все эти методы имеют ряд недостатков, которые усложняют их применение в клинической практике и производстве диагностику-мов для определения миоглобина.

Одним из путей преодоления этих трудностей является использование для создания диагностикумов моноклональных антител и иммуноферментного анализа. Это сочетание с большим успехом может быть использовано в разработке чувствительных ме-

тодов обнаружения и количественного измерения с клинической точки зрения важных веществ, в том числе и миоглобина.

Исходя из широкого использования гибридомной технологии в науке ясно, что именно МКА являются теми средствами, с помощью которых можно расширить наши знания об антигенных свойствах миоглобина у разных животных, а также решить вопрос о разработке оптимального иммунологического метода количественного определения миоглобина в сыворотке крови человека. Работа выполнена в рамках программы КПНТП СЭВ (задание 5.2.3.2.2).

¿Цель работы. Целью настоящей работы являлись:

- получить при помощи гибридомной технологии стабильные клеточные линии, продуцирующие МКА к миоглобину человека;

- изучить с помощью полученных МКА антигенную структуру миоглобина человека;

- разработать на основе МКА чувствительный, простой и быстрый иммуноферментный метод количественного определения миоглобина в сыворотке крови с использованием микротитрационных пластинок.

Научная новизна:

- получена панель моноклональных антител, связывающихся с б разными эпитопами молекулы миоглобина человека. Данные антитела направлены против двух секвенциальных и четырех топографических антигенных детерминантов (эпитопов);

- получены МКА к секвенциальным эпитопам путем использования в качестве иммуногена нативного миоглобина;

- обнаружен новый антигенный детерминант, в состав которого входят аминокислотные остатки 139-142;

- на основе МКА разработан чувствительный и простой иммуноферментный метод одноэтапного "сэндвича" для количественного определения миоглобина.

.Практическое значение. Полученную панель МКА к разным эпитопам миоглобина можно использовать для изучения ряда важных фундаментальных научных проблем, в том числе для.изучения строения антигенных детерминантов и реакции антиген-антитело, для изучения закономерностей возникновения иммунного ответа, для изучения биохимической эволюции и конформацион-ных изменений миоглобина. МКА к миоглобину можно также использовать для изучения локализации миоглобина в разных тканях и клетках - проблема,которая еше довольно плохо изучена.

Для практической клинической медицины большую ценность имеет разработанный иммуноферментный метод количественного определения миоглобина. Метод может быть использован для выявления больных с различными сердечными, мышечными и гормональными расстройствами, для оценки тяжести заболевания и наблюдения за эффективностью лечения. МКА к миоглобину можно использовать для диагностики опухолей мышечного происхождения.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 90 стр. машинописного текста, включая 8 таблиц и 14 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы (136 источников).

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференциях "Медицинские исследования в практике" (Тарту, 1984) и "Фундаментальные аспекты и практическое применение в медицине и сельском хозяйстве достижений биотехнологии" (Тарту-Кяэрику, 1984),на всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биология" (Ленинград, 1984), на I Всесоюзном конкурсе молодых патофизиологов (Москва, 1985), где представленная на конкурс работа "Моноклональные антитела к миоглобину человека и их использование для количественного определения миоглобина с помощью иммуноферментного анализа" была удостоена диплома I степени, на всесоюзной конференции "Актуальные вопросы биотехнологии" (Ленинград, 1987) и на научных семинарах НИИ общей и молекулярной патологии Тартуского госуниверситета и Института химической и биологической физики АН ЭССР.

Разработанный на основе полученных МКА одноэтапный иммуноферментный анализ практически используется для измерения уровня миоглобина в сыворотке крови больных инфарктом миокарда и другими заболеваниям в Тартуской клинической больнице. На основе материалов диссертации разработан диагности-кум для серийного выпуска.

По материалам работы опубликованы три статьи и трое тезисов.

Положения, выносимые на зашитую

- получена панель из МКА,связывающихся с 2 секвенциальными и 4 топографическими эпитопами миоглобина человека;

- МКА ЗС1.2 и 5С4.1 направлены против секвенциальных эпитопов миоглобина и связываются с миоглобином в по-

ложениях 74-83 и 139-142 соответственно;

- на основе МКА разработан чувствительный и простой им-муноферментный метод для количественного определения миоглобина, пригодный для использования в клинической практике.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение миоглобина и иммунизация мышей. Миоглобин человека выделяли из гомогената сердца или скелетных мышц человека методом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) 6000 (Merck, ФРГ) с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе Servacel 23SS (Serva, ФРГ) по ранее описанному методу (stone et al., 1975) или методом осаждения сульфатом аммония (Домбровский, Поверенный, 1981) с последующей очисткой гельфильтрацией на колонке HW-50 (Toyo SodaMíG,Япония).

Мышей линии balb/c иммунизировали препаратом миоглобина по следующей схеме: самкам мышей в 8-10-недельном возрасте вводили интраперитонеально миоглобин человека в полном адъго-ванте Фрейнда (0,5 мл) по 100 мкг в 0,5 мл забуференного фосфатами физиологическом растворе (ЗФР, 0,15М, pH 7,2). Повторные инъекции (всего 9) миоглобина без адъюванта проводили с интервалом 30 дней.Предпоследнюю иммунизацию в хвостовую вену делали за II дней, а последнюю - за 4 дня перед слиянием клеток (100 мкм миоглобина в 0,1 мл ЗФР).

Получение гибридом. Для гибридизации брали мышь с наивысшим титром антител, который определяли по "дот"-иммуно-ферментному методу (Hawkes et al., 1982).Слияние клеток всей селезенки и 2x10 клеток миеломы линии PAI (Stocker et al., 1982, любезно предоставленные M. Саарма, Институт химической и биологической физики АН ЭССР) осуществляли 50% раствором ПЭГ 4000 (Merck, фрг) По общепринятой методике (Köhler, Mil-stein, 1975) с модификациями. Гибридные клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5,6% COg в течение 10 дней в селективной среде ДМЭМ с 10% фетальной сыворотки теленка с добавлением ГАТ. Дальнейшее выращивание клеток проводилось в течение последующей недели в такой же среде без аминоптерина, а далее без добавки гипоксантина и тимидина. Выявление положительных к миоглобину человека клонов проводили при помощи "дот"-иммуноферментного метода на 10-й день после слияния клеток. На фильтры наносили чистый миоглобин фирмы Cappel

Л

X

laboratories, США. Положительные к миоглобину клоны замораживали и клонировали путем лимитирующего разведения на слое питательных клеток селезенки мыши.

Продуцирующие МКА клоны и субклоны гибридом хранятся в жидком азоте в банке клеток НИИ общей и молекулярной патологии Тартуского госуниверситета.

Очистка антител. Подклассы полученных МКА определяли в супернатанте культуры клеток, используя иммуноферментный метод и кроличьи антисыворотки против разных подклассов мышиных иммуноглобулинов (Miles, США) по ранее описанному методу (Othero, Kenneth,. 1984).

Антитела типа IgG выделяли из асцитной жидкости по методу ионообменной хроматографии на Cibaoron blue DEAE-TSK геле.Дл^пригбтовленйя^ионообменника краситель Cibaoron blue F3G-A связывали с ISK-гелем DEAE-Tоуopear1 650М (Toyо Soda MFG, Япония) по методу Дин (Dean, 1979). Асцитную жидкость диализовали против 20 мМ Tris-HCl буфера, pH 7,2, в течение ночи. После этого асцитную жидкость центрифугировали и фильтровали через стеклянные префильтры (Sohleicher&Sohüll, ФРГ) для удаления осадка и лип идо в.' Белки связывали с гелем в 20 мМ Tris-HCl буфере. Добавлением в буфер 25 мМ HaCi элюи-ровали трансферрин, 75 мМ НаД1 - антитела и I М Nací регенерировали колонку (Bruck et al., 1982). Очищенные антитела концентрировали при помощи ультрафильтрационных мембран СХ-30 (Millipore, США), добавляли 50$ глицерина и хранили при -20°С.

Конъюгирование антител с пероксидазой хрена. Синтез ко-нъюгата МКА с пероксидазой xpeka (Sigma Chemical Co., США и ВПО "Биохимреактив", Олайне) проводили методом периодатного окисления (Nakane, Kawaoi, 1974). Конъюгаты хранили в ЗФР с добавкой 5Üfo глицерина при -20°С.

Определение эпитопной специфичности МКА. Группировку МКА по узнаваемым ими эпитопам миоглобина проводили конкурентным иммуноферментным методом (Stählin et al., 1983). Для этого в лунки полистироловых пластинок для иммуноферментного анализа (Nuncion, Дания) связывали миоглобин человека в концентрации 100-200 нг/мл в ЗФР в течение ночи. Пластинки промывали трижды ЗФР с 0,05% Твин-20 (ЗФР-Твин) и в лунки добавляли в двух повторах 20, 40, 60, 80 и 100 мкл суперна-танта изучаемого клона. Добавлением среды культуры клеток объем раствора в лунках доводили до 100 мкл и добавляли 100 мкл коныогата МКА с пероксидазой в ЗФР (в рабочем тит-

2

5

ре) от клона, с которым сравнивали изучаемые клоны. Пластинки выдерживали 3 часа при комнатной температуре, промывали трижды ЗФР-Твин и в лунки вносили 20О икл субстратной смеси (0,5 мг/мл о-фенилендиамина и 0,03% HgOg в 0,1 М цитратфос-фатном буфере, рН 5,0). После 30-минутной инкубации в темноте при 37°С реакцию останавливали добавлением 25 мкл 12,5% серной кислоты. Интенсивность реакции оценивали при 490 нм на автоматическом спектрофотометре Microelisa Auto Reader MR 580 (Dynateoh Instruments, США).

Определение аффинности MKA. Аффинность MKA определяли по ранее описанному иммуноферментному методу (Friguet et al., 1985). Разные концентрации (от 3,57хЮ~9до I,I4xI0~7 М) ыиоглобина в ЗФР инкубировали 20 часов при комнатной температуре со 100 мкл раствора антител постоянной концентрации (в пределах от 1,2хЮ~10 до 3,85x1o-11 М) в ЗФР с Ш фе-тальной сыворотки. После инкубации 150 мкл смеси антигена с МКА переносили на другую пластинку, предварительно покрытую 150 мкл раствора миоглобина в концентрации I мкг/мл в ЗФР. Пластинку инкубировали 3 часа при комнатной температуре,промывали ЗФР-Твин и определяли количество связанного с миогло-бином МКА, используя связанные с пероксидазой козьие антимышиные антитела. Оптические плотности ферментной реакции определяли как описано выше. Исходя из полученных оптических плотностей рассчитывали аффинность МКА по уравнениям Скат-чарда или Клоца на микрокомпьютере Apple XI по программам, составленным М.Вийкмаа в НИИ общей и молекулярной патологии.

Проведение прямого иммуноферментного анализа с апомио-глобином и миоглобинами разных животных.Апомиоглобин был получен по ранее описанному методу fcrumpton, Wilkinson,1965), а миоглобин кашалота, лошади и собаки от Sigma Chemical Co., США. Для проведения иммуноферментного анализа в лунки полистироловых пластraoк добавляли растворы миоглобина и апомио-глобина в ЗФР (100 мкл, I мкг/мл). Пластинки выдерживали в течение ночи при комнатной температуре, промывали ЗФР-Твин и блокировали лошадиной сывороткой (1:4 в ЗФР) 30 мин при 37°С. После этого пластинки промывали ЗФР-Твин и в лунки добавляли МКА, связанные с пероксидазой в ЭФР-Твин. Пластинки выдерживали 90 мин при 37°С, промывали ЗФР-Твин и проводили ферментативную реакцию.

Фрагментация миоглобина и иммуноблоттинг. Апомиоглобин расщепляли по карбоксильной группе метиониновых остатков с помощью бромистого циана Marshall et al., 1974). 8.мг белка

растворяли в 0,5 мл 70% НС00Н и добавляли 30 мг бромистого циана. Расщепление проводили 27 часов при комнатной температуре в атмосфере аргона и затем лиофилизировали.

Расщепление апомиоглобина по пептидной связи на местах расположения остатков аргинина проводили по ранее описанному методу (Singhal, Atassi, 1977). Для этого апомиоглобин модифицировали - блокировали остатки лизина цитракониковым ангидридом (Pluka, Швейцария). Модифицированный миоглобин расщепляли с помощью трипсина 2 часа при 37°С. Гидролизат лиофилизировали.

Фрагменты миоглобина разделяли при помощи электрофореза в 8-25% градиентном полиакриламидовом геле с ДСН (Fling, Gre-gerson, 1986) и провели Вестерн-блоттинг на нитроцеллголозный фильтр (Towbin et al., 1979).Часть фильтра окрашивали на общий белок амидочерным Б (Harper et al., 1986), а остальная часть фильтра блокировали 2% раствором казеина в ЗФР. Иммунную реакцию проводили с супернатантами гибридомных клонов(20 часов при комнатной температуре) и с меченными пероксидазой козьими антимышиными антителами (3 часа при комнатной температуре).

Одноэтапный и двухэтапний иммуноферментный анализ типа "сэндвич". Количественный анализ содержания миоглобина в сыворотке крови человека проводили с антителами типа IgG1 продуцируемыми гибридомными клонами к разным эпитопам миоглобина. При одноэтапном иммуноферментном анализе типа "сэндвич" (ИФАС) для сорбции антител первого слоя в лунки полистироловых пластинок вносили 200 мкл раствора МКА (10 мкг/мл) в ЗФР и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.После этого раствор удаляли и пластинки промывали дважды ЗФР-Твин, в лунки добавляли одновременно в двух или трех повторах 20 мкл стандартных или изучаемых сывороток и 200 мкл раствора связанного с пероксидазой антитела в ЗФР-Твин, разведенного до рабочего титра. Пластинки инкубировали при 37°С, отмывали четырежды ЗФР-Твин и проводили ферментативную реакцию, добавляя 200 мкл раствора субстрата, как описано выше.

Двухэтапный ИФАС проводили как описано выше, но после инкубации МКА первого слоя с миоглобином пластинки промывали трижды ЗФР-Твин и только после этого в лунки добавляли раствор конъюгата.

Стандартные растворы миоглобина готовили в концентрациях от 0 до 1000 нг/мл в сыворотке крови человека, очищенной от миоглобина с помошью аффинной хроматографии на глутараль-

дегидактивйрованном rene"UXtrogel АсА 22 (1ВГ, Франция). Связывание МКА к аффинному носителю и последующая хроматография проводились по рекомендациям фирмы-изготовителя.

Все данные, получаемые от автоматического спектрофотометра, автоматически обрабатывались на Apple II по методам "линейного или логистического регрессионного анализов.Программы, составленные М. Вийкмаа в НИИ общей и молекулярной патологии, дают результаты регрессионного анализа стандартной кривой и содержание миоглобина в нг/мл в отдельных пробах,определяемое по регрессии стандартной кривой.

Определение концентрации миоглобина при помощи поликлона льных антител. Уровень миоглобина в сыворотках определяли при помощи козьих антител к миоглобину человека и их конъюга-тов с пероксидазой, любезно предоставленных. .Г».А¿Ермолиным (ВКНЦ АМН СССР), как описано выше при одноэтапном ИФАС.

Выявление ложно-положительных сывороток. Для выявления ложно-положительных- сывороток было изучено 330 сывороток больных инфарктом миокарда.Сыворотки были собраны в Тартуской клинической больнице и любезно предоставлены нам доктором М.М. Уускюла.Для выявления ложно-положительных ответов в лунках полистироловых пластинок связывали МКА 3CI.2 (10 мкг) мл в ЗФР) и во втором слое "сэндвича" использовали те же саше антитела, связанные с пероксидазой (Boscato, Stuart, 1986). Сыворотки считали ложно-положительными, если при добавлении субстрата пероксидазы после промывок наблюдали ферментативную реакцию (ОП при 490 была выше 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты гибридизации. В результате гибридизации получено и для хранения заморожено' в жидком азоте 54 гибридомных клона, которые продуцировали МКА к миоглобину человека. Из этих 54 первичных клонов удалось отобрать только 32 стабильных клона, сохранивших способность продуцировать антитела к миоглобину человека. 41% клонов в ходе работы потеряли свою синтетическую активность. Это хорошо согласуется с литературными данными. Показано, что приблизительно 50-70% первичных клонов теряют свойство продуцировать специфические МКА (Go~ ding, 1980).

Эпитопный анализ полученных МКА. Проведение конкурентного иммуноферментного эпитопного анализа показало, что получены антитела к 6 разным эпитопам миоглобина. Сущность этого анализа состоит в следующем: если два антитела узнают один и

тот же эпитоп, то они конкурируют за место связывания на поверхности миоглобина - связывание первого антитела с эпито-пом приводит к препятствию связывания второго антитела с этим эпитопом. Методически это выражается в виде снижения интенсивности иммуноферментной реакции. По описанному методу выявлено 6 разных эпитоп, с которыми связывались МКА от 28 разных клонов, 4 клона не были изучены. Эпотопы были обозначены номерам от I до б. Анализ показал,что к эпитопу I продуцируют МКА 3 клона, к эпитопу 2-7 клонов, к эпитопу 3 -5 клонов, к эпитопу 4-4 клона, к эпотопу 5-5 клона и к эпитопу 6-5 клонов; Для дальнейшей работы были выбраны следующие клоны:4А1.1 (I), 504.I (2), 308.5 (3), 408.11(4), ЗС1.2 (5) и 1Н3.2 (6).

У этих 6 антител были измерены константы аффинности,поскольку при проведении конкурентного иммуноферментного эпи-топного анализа можно получить правдивые результаты только в случае довольно близкой аффинности конкурирующих между собой антител. Результаты измерения показали,что все 6 антител обладают довольно сходной аффинностью: у 5 антител константы аффинности были в пределах только у МКА

1Н3.2 она была на порядок ниже, составляя 0,26x107КГ^ (см. таблица I).

Таблица I

Результаты измерения аффинности у шести разных МКА

МКА Аффинность (± )х107М~1

4А1.1 5,32±2,41

5С4.1 2,01±1,53

308.5 7,58±4,72

4C8.II 5,23±1,18

ЗС1.2 3,33-1,05

1Н3.2 0,26-0,24

Таким образом,данные о близких величинах аффинности изучаемых МКА позволяют считать правильным наш вывод о направленности этих антител к разным эпитопам миоглобина. Этот вывод подтверждается и другими данными, полученными в опытах по выбору подходящих антител для ®АС (см. таблицу 4), по связыванию МКА с апомиоглобином (см. таблицу 2), с миоглоби-нами разных видов (см. таблицу 3) и фрагментами миоглобина (см. рис. 1,2).

з 9

По литературным данным на молекуле миоглобина описано два типа антигенных детерминантов- секвенциальные и топографические. Топографические антигенные детерминанты присутствуют на поверхности миоглобина и построены из аминокислотных остатков, которые в первичной структуре удалены друг от друга, но в трехмерной структуре- расположены рядом. Описаны б МКА, имеющих высокое сродство к нативноыу миоглобину кашалота, но не связывающихся с его фрагментами, полученными при помощи бромистого циана (Berzofeky et al., 1980, 1982). Топографические антигенные детерминанты описаны и на миоглоби-не человека (Eaat et al., 1982).

Секвенциальные антигенные' детерминанты были выявлены с помощью поликлональных антисывороток. На молекуле миоглобина кашалота найдено 5 антигенных регионов,состоящих из 6-8 последовательно расположенных аминокислотных остатков, с которыми связывались приблизительно 99% антител (Atassi, 1975). Наличие таких антигенных детерминантов подтвердилось опытами с юлунизацией мышей синтетическими пептидами, ■ аминокислотный состав которых соответствовал этим 5 антигенным детерминантам (loung et al., 1983; Schmitz et al., 1983). Дальнейшие исследования выявили еше несколько секвенциальных эпитопов на миоглобине кашалота и других видов (Leach, 1983; Rodda et al., 1986).

Для более детальной характеристики эпитопной специфичности нами изучена способность МКА реагировать с апомиогло-бином, миоглобинами разных видов и фрагментами миоглобина.

При обработке миоглобина кислым ацетоном от миоглобина отделяется гем, происходит обратимая денатурация миоглобина, размеры молекулы увеличиваются вдвое (Atassi, 1977). В результате этого значительно изменяется конформация миоглобина: изменяются расстояния между цепями миоглобина, что может привести к разрушению топографических эпитопов. И действительно, наши данные показали, что 4 МКА из 6 связывались с апомиоглобином гораздо слабее, чем с миоглобином (см.таблицу 2). Можно предположить, что МКА 4AI.I, 3D8.5, 4C8.II и IH3.2 связываются с топографическими антигенными детерминантами на поверхности миоглобина. Этот вывод подтверждается и тем, что эти антитела не связываются с фрагментами, образующимися под воздействием бромистого циана (см. рис. I).

МКА 5C4.I и 3CI.2 связывались одинаково хорошо с миоглобином и апомиоглобином, что позволяет предположить их направленность против секвенциальных антигенных детерминантов.

Таблица 2

Оптические плотности при 490 нм прямого иммуноферментного анализа при связывании 6 разных МКА с миоглобином и апомиоглобином

МКА Миоглобин Апомиоглобин

3CI.2 >1,6 >1,6

4AI.I 1,461 0,361

4C8.II 0,568 0,239

3D8.5 1,018 0,171

IH3.2 0,385 0,052

5C4.I 1,275 0,953

Для проверки этой точки зрения нами изучена способность МКА реагировать с фрагментами расщепления миоглобина бромистым цианом (рис. I). На электрофореграмме (рис. I) ниже маркерного миоглобина видны три белковые зоны, которые должны соответствовать 4 фрагментам миоглобина: 76 аминокислотных остатков (фрагмент 56-1315,55 аминокислотных остатков (фрагмент 1-55) и третью зону образуют два фрагмента по II аминокислотных остатков (фрагменты 132-142 и 143-153), которые в данных условиях электрофореза не разделяются.На электрофоре-грамме видны тоже зоны агрегированного материала выше маркерного миоглобина. После проведения имцуноблоттинга выяснилось, что только МКА 3CI.2 связываются с данными фрагментами, точнее с фрагментом миоглобина 56-131 (рис.1). Остальные МКА, в том числе антитела 5C4.I, с фрагментами цианбрсмисто-го расцепления миоглобина не реагируют, но реагируют с агрегированным материалом. Из этого можно предположить, что в эпитоп, с которым связываются МКА 5G4.I, входит молекула ме-тионина, поскольку белки разрушаются под воздействием бромистого циана по карбоксиловой группе метиониновых остатков.

Для более точной характеристики эпитопа МКА 5C4.I проведено расщепление миоглобина при помощи трипсина по пептидной связи аргинина. При этом из миоглобина человека образуются три фрагмента с аминокислотными остатками I-3I, 32-139 и 140-153. На электрофореграмме (рис. 2) видны кроме этих трех фрагментов и другие белковые зоны, возникающие,наверно, при воздействии трипсина на самый длинный фрагмент из 108 аминокислотных остатков - одна зона видна за фрагментом 32139 и другая зона за фрагментом I-3I. После проведения имму-ноблоттинга выяснилось, что с данными фрагментами реагирует

3*

II

только МКА ЗС1.2, связывающееся с фрагментом 32-139.Антитела 5С4.1 реагировали только с продуктами неспецифического расщепления миоглобина с трипсином, возникавшими при некоторых опытах, но не связывались с фрагментами 1-31, 32-139 и

Рис. I

Иммуноблоттинг фрагментов, образующихся при воздействии бромистого циана:1,2 - электрофоре-грамма в 8-25% градиентном полиакриламидном геле с ДСН; 3,4 - картина иммуноблоттинга,окрашенном амидочерным Б; 510 - иммунореакция с МКА. 1,3 - миоглобин, 2,4 -фрагменты миоглобина,5 -клон 5С4.1, 6 - клон ЗС1.2, 7 - клон 4А1.1.8-клон 308.5, 9 - клон 4C8.II, 10'- клон 1Н3.2

Рис. 2

Иммуноблоттинг трипсино-вых фрагментов модифицированного цитракониковым ангидридом миоглобина.

»о „г^элвктрофореграмма в 8-25% градиентном полиакриламидном геле с ДСН; 3,4 - картина иммуноблоттинга, окрашенном амидочерным Б; 5.6 - им-мунореакция с МКА. 1,3 -миоглобин, 2,4 - трипси-новые фрагменты миоглобина, 5 - клон ЗС1.2,6 -клон 5С4.1

Эксперименты по изучению связывания антител с фрагментами миоглобина позволяют сделать некоторые предположения о структуре эпитопа МКА 5С4Л. Поскольку антитела 5С4.1 не связываются ни с одним из фрагментов, образующихся при рас-

щеплении миоглобина по месту расположения метионина и аргинина, то можно предположить, что один из трех остатков метионина и один из двух остатков аргинина входят в состав эпи-топа, с которым связываются МКА 5C4.I. По первичной структуре миоглобина человека видно, что он имеет в своем составе остатки аргинина и метионина,расположенные очень близко друг к другу: такими являются аргинин в положении 139 и метионин в положении 142 (Romero-Herrera et al., 1978).Следовательно, высока вероятность, что участок миоглобина с аминокислотными остаткам 139-142 входит в состав эпитопа, который связывает МКА 5C4.I.

Ранее секвенциальные зпитопы были изучены детально у миоглобина кашалота и выявлены следующие антителосвязывающие последовательности: 1-6, 15-22, 49-54, 94-99, II3-II9, 121127 и I45-I5I (Atassi, 1975; Schmitz et al., 1983; Rodda et al., 1986). Кроме того, на миоглобине быка были установлены два новых антигенных детерминанта: остатки 25-55 и 72-89 (Leach, 1983).

Из вышеизложенного видно, что участок миоглобина человека с аминокислотными остатками 139-142 входит в состав нового, ранее не описанного эпитопа миоглобинов.

Изучена и локализация эпитопа для антител 3CI.2.Результаты иммуноблоттинга показали, что МКА 3CI.2 связываются с фрагментами миоглобина 56-131 и 32-139 (см. рис.1 и 2). Следовательно, эпитоп находится на фрагменте 56-131. Для дальнейшей локализации этого эпитопа использованы данные видовой специфики МКА 3CI.2 (см. таблицу 3). Оказалось, что эти антитела связываются с миоглобином человека, лошади и собаки, но практически не связываются с миоглобином кашалота. Из литературных данных известно,что антитела вырабатываются в основном против участков миоглобина, отличающихся по аминокислотному составу от миоглобина хозяина (Leach, 1983; Соорег et al., 1984).

При изучении аминокислотного состава фрагмента 56-131 в миоглобине человека, лошади, собаки, кашалота и мыши вызывает интерес фрагмент 74-83, который входит в состав одного из ранее описанных антигенных детерминантов (Leach, 1983). Этот участок белка совершенно одинаков у человека, лошади и собаки, но в молекуле миоглобина кашалота в позиции 74 вместо глицина находится аланин (см. таблицу 4). Этим различием можно объяснить связывание МКА 3CI.2 с миоглобином человека, лошади и собаки, но не с миоглобином кашалота. Ранее показа-

но, что при замене в эпитопе лишь одного аминокислотного остатка на другой антитела утрачивают способность связываться с этим эпитопом (Berzofsky et al., 1982). Далее, между данными участками миоглобина человека и мыши имеются различия в трех позициях: 74, 81 и 83 (см. таблицу 4). Как указывалось выше, выработка антител идет в основном против разнородных с хо-" зяином регионов миоглобина, несмотря на возможность получения антител и против идентичных в антигене и белке хозяина участков (Kazim, Atassi, 1978; Twining et al., 1980). Исходя из изложенного, можно предположить, что МКА 3CI.2 связываются с миоглобином человека в регионе 74-83,

Таблица 3

Оптические плотности прямого иммуноферментного анализа при связывании б разных МКА с миоглобином человека, лошади, собаки и кашалота

Клоны Миоглобины -

4AI.I 5C4.I 3D8.5 4C8.II 3CI.2 IH3.2

человек 1,293 >1,6 ■ >1,6 0,262 >1,6 0,607

лошадь 0,869 1,418 0,169 0,0 >1,6 0,0

собака 0,835 1,209 0,146 0,0 >1,6 0,0

кашалот 0,741 0,108 0,155 0,0 0,384 0,0

Таблица 4

Аминокислотный состав фрагмента миоглобина 74-83 у человека, лошади, собаки, кашалота и мыши (по Romero-Herrera et al., 1978; Harria et al., 1985)

Вид Амин окис л о T a

74 75 76 77 78 79 80 81 82 83

человек Gly Не Leu Lys Lys Lys Gly His His Gly

лошадь GXy lie Leu LyB Lys Lys Gly His His Gly

собака Gly lie Leu Lys Lys Lys Gly His His Gly

кашалот Ala lie Leu Lys Lys Lys Gly His His Gly

мышь Thr He Leu Lys Lys Lys Gly Gin His Ala

Получение МКА, связывающихся с секвенциальными эпитопами миоглобина человека, представляет большой интерес.В литературе отсутствуют данные об одновременном (в одном и том же опыте) получении антител против секвенциальных и топографических эпитопов. Также отсутствуют данные о секвенциальных эпитопах

миоглобина человека. Кроме того, в литературе нет данных и о получении МКА против секвенциальных эпитопов в случае использования в качестве антигена нативного миоглобина,но имеются данные о получении МКА в случае использования в качестве антигена синтетических пептидов (Sohmitz et al., 1983; Young et al.,I983). Можно предположить, что лимфоциты, способные секретировать антитела как против секвенциальных, так и топографических эпитопов, возникли в нашем опыте в результате длительной иммунизации мышей, в ходе которой на формирование иммунного ответа смогли воздействовать и продукты катаболизма (фрагменты) миоглобина в организме мыши.

Большой интерес, несомненно, представляла бы и характеристика связывания полученных нами 4 МКА с топографическими эпитопами, но для такой работы у нас пока отсутствует подходящая методика.

Видовая специфичность полученных МКА. Ввиду большого сходства в аминокислотном составе миоглобинов разных видов животных (95 из 153 аминокислотных остатков не меняются от вида к виду, Kagen, 1973) антитела, полученные против миоглобина одного вида, могут перекрестно реагировать с миогло-бинами других видов, антигенные детерминанты которых имеют схожий аминокислотный состав (Leach, 1983, Cooper et al., 1984). Несмотря на это, нами получено три МКА (4C8.II, 3D8.5 и IH3.2), связывающихся только с миоглобином человека (см. таблицу 3), с его топографическими эпитопами.Если учитывать, что миоглобин человека по сравнению с миоглобинами лошади, собаки и кашалота менее плотно упакован и более асимметричен (Atassi, 1977), то легко объяснить, почему МКА, которые связываются только с миоглобином человека, реагируют с топографическими эпитопами.

Но, с другой стороны, МКА 4AI.I, также связывающиеся с топографическим эпитопом, одинаково хорошо реагируют с миоглобином человека, лошади, собаки и кашалота (см. таблицу 3). Можно предположить, что это антитело направлено против определенного консервативного региона на поверхности миоглобина, связанного с его функцией.

Оптимальные условия для проведения ИФАС. В ходе работы были выявлены оптимальные условия для проведения иммунофер-ментного анализа. Для оптимизации метода были изучены влияние активации полистироловых пластинок глутаральдегидом,концентраций МКА в первом слое "сэндвича",разных буферов связывания антител с пластинками и время инкубации на чувстви-

тельность метода и на пределы измеряемого количества миогло-бина.

Опыты показали, что предварительная активация пластинок глутаральдегидом не влияет на чувствительность определения ыиоглобина, хотя по литературным данным эта процедура повышает чувствительность определения антигена до 10 раз (Klasen et el., 1982).

Изучение влияния разных буферов на связывание антител с полистироловыми пластинками показала, что при длительном связывании МКА Св течение ночи) состав буфера (0,1 МKagCOg рН 9,0; ЗФР и I мМ ацетатного буфера, рН 5,0) мало влиял на определение миоглобина. Обычно при связывании антител и антигенов с полистироловыми носителями используются карбонатные буфера с рН 9,0-9,5. Наши исследования показывают, что для связывания МКА с микротитрационными пластинками вполне пригоден и ЗФР.

Изучение влияния времени инкубации на проведение тмуно-ферментного анализа показало, что удлинение времени инкубации с сыворотками и меченными пероксидазой антителами более 90 минут не влияет на чувствительность метода .'одинаковые результаты были получены как при инкубации 90, так и 120 минут (37°С). Однако при одинаковых условиях опыта чувствительность и стабильность метода значительно снижаются при 60-минутной инкубации.

Изучение влияния концентрации антител в первом слое "сэндвича" показало, что проведение имцуноферментного анализа зависит от используемых МКА и типа ИФАС (одно- или двухэтап-ный). В случае двухэтапного ШкС чувствительность метода не изменялась со снижением концентрации МКА 5C4.I от 6 до 2 мкг/мл, однако чем ниже была концентрация антител в первом слое, тем выше выявляемая концентрация миоглобина. Так, концентрация МКА 6 мкг/мл обеспечивает определение уровня миоглобина в сыворотке в концентрациях от 2 до 250 нг/мл.Снижение концентрации антител до 3 мкг/мл позволяет определить уровень миоглобина от 2 до 500 нг/мл и при концентрации антител 2 мкг/мл от 2 до 1000 нг/мл.

Было проведено сравнение чувствительности двух- и одно-этапного иммуноферментного анализов типа "сэндвич" (см. рис. 3). Оказалось, что стандартные кривые определения миоглобина двух- и одноэтапного ИФАС почти полностью совпадают.

Использование в одноэтапном ИФАС МКА 4AI.I в первом слое требовало более высоких концентраций антител для достижения

нужной точности определения миоглобина. В паре с МКА 4AI.I использовали конъюгированные с пероксидазой антитела 3CI.2.

икогловлн нг/ил млоглобми кг/мл

Рис. 3

Сравнение двухэтапного (I) и одноэтапного (2) ИФАС. Концентрация МКА 5C4.I 3 мкг/мл, титр МКА 4AI.I, конъюгиро-ванного с пероксидазой 1:1000. Коэффиценты корреляции 0,у83 (I) и 0,999 (2)

Рис. 4

Влияние концентрации МКА 4А1.1 в первом слое "сэндвича" на чувствительность определения миоглобина по методу одноэтапного МКА 30:

I'- концентрация МКА 30 мкг/мл № = 0,997)

2 - концентрация МКА 10 мкг/мл (г =0,999)

При концентрации антител 30 мкг/мл можно было определить концентрацию миоглобина от 2 до 500 нг/мл.Снижение концентрации МКА до 10 мкг/мл приводило к снижению чувствительности метода до 8 нг/мл, но верхний предел определяемой концентрации миоглобина повышался до 1000 нг/мл (рис. 4).

Полученные нами результаты показывают, что для определения миоглобина можно с успехом использовать метод одноэтапного ИФАС, при котором в лунки с предварительно связанными МКА одновременно добавляют изучаемые сыворотки и МКА, связанные с пероксидазой. Одноэтапный ®АС не уступает в чувствительности двухэтапному методу, хотя требует более высоких концентраций

антител в первом слое "сэндвича". По сравнению с двухэтапным методом одноэтапный ИФАС более простой и быстрый:вместо 9 промывок пластинок и двух 90-минутных инкубаций требуется только 6 промывок и одна 90-минутная инкубация,что позволяет всю процедуру определения концентрации миоглобина на одной пластинке провести за 2,5 часа вместо 4 часов. Ранее разработанные имму-ноферментные методы определения миоглобина более медленные, скорость проведения анализа колеблется от 5 часов (Porstmann, Porstmann, 1986) до более суток (Cloonan et al., 1979; Nishida et al., 1985).

Максимальная чувствительность предлагаемого нами метода 2 нг/мл (40 пкг миоглобина в одной лунке).Этой чувствительности вполне достаточно для точного измерения содержания миоглобина в норме и патологии. По литературным данным нижний предел концентрации миоглобина в сыворотке крови в норме не ниже 2 нг/мл (Hoxin, 1986). Чувствительность нашего метода выше многих других иммунологических методов определения концентрации миоглобина, например, радиоимцунологических методов (stone et al., 1975; Hurrell et al.,I98I),теста хемагглютинации (zea-na et al., 1982) и гемилюминесцентного иммунометода (оХззоп et al.,I984). Одноэтапный ИФАС с МКА по чувствительности близок с другими иммуноферментными методами с использованием поликло-нальных антител (Cloonan et al., 1979; Porstmann, Porstmann, 1986; Ермолин и др., 1986).

В клинической практике целесообразно при проведении ИФАС использовать концентрацию антител в первом слое "сэндвича" 10 мкг/мл, который позволяет определить уровень миоглобина в сыворотках в пределах от 8 до 1000 нг/мл, поскольку при некоторых заболеваниях концентрация миоглобина может повыситься до 1000 нг/мл и выше.

Выбор оптимального сочетания МКА для проведения ИФАС. Выбор подходяшего сочетания антител,пригодного для использования в ИФАС, проводился с 5 МКА: 4AI.I, 5C4.I,3d8.5, 3CI.2 и 4C8.II и их конъюгатами с пероксидазой. В первой серии опытов для выявления оптимальных комбинаций из двух антител брали парные комбинации из всех вышеперечисленных МКА. Для элиминации влияния факторов сыворотки на результаты опытов стандартные растворы миоглобина готовили в 1% овальбумине. Как видно из таблицы 5, наибольшее поглощение при концентрации шоглэбина I мкг/мл и антител в первом слое 10 мкг/мл,получено в случае 6 пар МКА. Эти 6 сочетаний антител были отобраны для второй серии опытов, где использовались стандартные растворы миоглобина, приготов-

ленные в сыворотке крови человека.Только комбинация МКА 4AI.I в первом слое и ЗС1.2-пероксидазы во втором слое "сэндвича" дала одинаковые результаты в 1% овальбумине и в сыворотке крови (таблица 6).

Таблица 4

Величины оптической плотности при 490 нм с использованием раствора миоглобина 1000 нг/мл в 1% овальбумине и разных комбинаций МКА

Коньюгаты МКА с перок-сидазой МКА, связанные с пластинкой

4AI.I 3D8.5 4C8.II 3CI.2 5C4.I

4AI.I 0,023 0,593 0,025 >1,6 0,559

3D8.5 0,578 0,0 0,012 >1,6 0,830

4C8.II 0,008 0,005 0,0 0,413 0,038

3CI.2 >1,6 >1,6 0,086 0,080 >1,6

5C4.I 0,110 0,140 0,005 0,611 • 0,082

То, что не каждое сочетание МКА пригодно для ИФАС, может быть обусловлено, в основном, двумя причинами:

I. Два разных эпитопа расположены слишком близко друг к другу или даже частично перекрываются, и связывание одного из МКА с эпитопом делает невозможным или частично препятствует связыванию другого МКА из-за стерических препятствий ( Berzof-sky et al., 1ЭЭ2).

Таблица 5

Величины оптической плотности при 490 нм при использовании растворов миоглобина 1000 нг/мл с 1% овальбумине и в сыворотке человека при разных комбинациях МКА

МКА на пластинке Конъюгат МКА с пероксидазой 1% овальбумин Сыворотка

3D8.5 3CI.2 >1,6 0,689

3CI.2 4AI.I >1,6 0,663

3CI.2 3D8.5 >1,6 0,892

5C4.I 3CI.2 >1,6 0,833

4AI.I 3CI.2 >1,6 1,548

5C4.I 3D8.5 0,830 0,516

2. Другим фактором, который может существенно влиять на проведение иммуноферментного анализа с разными МКА, является то обстоятельство, что в сыворотке крови приблизительно 5088% миоглобина связано с белком-носителем (Lathem, 1959; Ka-gen, 1973; Sakata et al., 1986). Присутствием такого белка

можно объяснять те различия^ которые возникли при проведении МАС в овальбумине и сыворотке. Связывание с белком-носителем, по-видимому, закрывает часть эпитопов, и с МКА связываются только свободные эпитопы и молекулы миоглобина.

После выбора подходящих условий и МКА для проведения им-муноферментного анализа была предложена следующая схема,определения миоглобина в сыворотке крови человека (рис. 5).

В лунках полистироловюс пластинок связывают антитела 4AI.X в концентрации 10 икг/мл я ЭФР в течение ночи при комнатной температуре«

Пластинку пропивают дважды

ЗФР-Твин

ffffff

В лунки вносят 20 мкл стандартных и изучаемых сывороток, добавляют 200 мкл кон-ыогата МКА J0I.2 с пер-оксидазой в ЗФР-Твин (IflOOO). Пластишсу инкубируют 90 мин при 57°С.

Пластинку промывают четырежды ЗФР-Твин.

Добавляют 200 икл субстратной смеси и инкубируют 50 мин при 37°0 в темноте, реакцию останавливают добавленном сорной кислоты и интенсивность реакции оценивают при ^90 нм.

Рис. 5, Схема проведения одноэтапного иммуноферментного анализа типа "сэндвич" для измерения концентрации миоглобина в сыворотке крови человека

Таблица 6

Точность и ошибка одноэтапного ИФАС для измерения миоглобина

I. Точность метода (количество анализов 6)

Количество добав- Средняя величина Среднее значение ленного миоглоби- ) измеренного (*б) открываемо-

на, нг/мл миоглобина, нг/мл сти в %

0 0 -

50 49,3 ± 3,3 98,7 ± 6,7

100 104,1 ± 6,4 104,1 ± 6,4

150 147,8 ± 19,0 98,5 ± 12,5

2. Ошибка метода (количество анализов на одной пластинке б, на разных пластинках 5)

Анализ Среднее содержанке (-6) миоглобина, нг/мл Коэффициент вариаций , %

На одной 1173,5 ± 62,2 5,3

плас- 117,8 ± 4,1 3,5

тинке 78,0 ± 3,0 3,9

57,3 - 3,8 6,8

На разных 1132,7 ± 64,0 5,7

плас- 113,8 ± 5,4 4,7

тинках 76,0 ± 3,2 4,2

57,0 ± 2,7 4,7

Точность и ошибка одноэтапного ИФАС.Для определения точ-

ности метода анализировали аффинноочищенные от миоглобина сыворотки, в которые добавляли известные количества миоглобина. Как видно из таблицы б, открываемость метода колебалась от 98,5 до 104%. Для определения ошибки метода по 4 образца сыворотки с различным содержанием миоглобина анализировали в многократных повторах на одной и на разных пластинках. Коэффициент вариации метода на одной пластинке колебался от 3,5 до 6,8% и на разных пластинках - от 4,2 до 5,7% (таблица 6). По этим показателям созданный метод не уступает и даже превосходит другие иммуноферментные методы с использованием по-ликлональных антител (Nishida et al., 1985; Ермолин и др., 1986; Porstmann, Porstmann, 1986).

Изучена корреляция между значениями концентрации миоглобина в 50 разных сыворотках, определенными одноэтапным ИФАС с использованием МКА и козьих поликлональных антител.Корреляция

между этими значениями концентрации миоглобина была высокой (г и 0,937), хотя данные, полученные при помощи поликлональ-ных антител, немного превышали таковые в случае МКА.

Ложно-положительные ответы. В работе изучены и вопросы, связанные с возможностью получения одноэтапным ИФАС ложно-положительных ответов. С этой целью проведен анализ 330 сывороток больных инфарктом миокарда с помощью одноэтапного ИФАС с использованием в первом и во втором слоях МКА 3CI.2. Было выявлено 7 сывороток, давших неспецифическую реакцию при проведении метода ИЭ5АС с МКА к одному эпитопу миоглобина. Следовательно, 2,1% изучаемых сывороток дали ложно-положительную реакцию с оптической плотностью при 490 нм от 0,063 до 0,263. Такие ложно-положительные ответы были обнаружены и другими авторами (Hunter et al., 1983; Boscato, Stuart, 1986). Уровень ложно-положительных сывороток удалось снизить до 4 при добавлении к конъюгату МКА с пероксидазой Ь% инактивированной сыворотки козы.

Преимущества прёдлагаемого метода. Предлагаемый нами од-ноэтапный ИФАС с МКА имеет ряд преимуществ перед радиоиммунологическими и иммуноферментными методами с использованием по-ликлональных антител, поскольку:

- метод не требует специальных лабораторий с дорогостоящей аппаратурой и средств защиты от радиационной опасности, результаты можно регистрировать при помощи спектрофотометра или визуально;

- метод одноэтапного "сэндвича" является простым и менее трудоемким по сравнению с обычным двухэтапным методом. В течение 3 часов можно анализировать 120 проб сыворотки;

- МКА можно подучить практически в неограниченных количествах, они очень специфичны, хорошо характеризуемы, их свойства стабильны. МКА и их конъюгаты с пероксидазой могут храниться долгое время без заметного снижения их активности.

ВЫВОДЫ

I. Создана панель моноклональных антител к 6 разным эпи-топам миоглобина человека, из которых 4 (связываются с антителами 4AI.I, 3D8.5, 4C8.II и IH3.2) являются топографическими и 2 (связываются с антителами 5C4.I и 3CI.2) секвенциальными эпитопами. Впервые в одном опыте гибридизации получены стабильные гибридомные линии, продуцирующие МКА как к секвен-

циальным, так и топографическим эпитопам.

2. Из б полученных МКА три антитела (3D8.5, 4C8.II и IH3.2), реагирующие с разными топографическими эпитопами,являются специфическими к миоглобину человека, остальные перекрестно реагируют и с миоглобинами других видов.

3. Обнаружен секвенциальный эпитоп миоглобина, в состав которого входят аминокислотные остатки 139-142 (связывается с МКА 5C4.I). Показано,что антитело 3CI.2 связывается с секвенциальным эпитопом,охватывающим аминокислотные остатки 7483.

4. На основе двух МКА, узнающих разные эпитопы миоглобина, разработан быстрый, точный и чувствительный одноэтап-ный метод иммуноферментного анализа типа "сэндвич" для количественного определения миоглобина в сыворотке крови.

Основное содержание диссертационной работы изложено в следующих публикациях:

1. Пийрсоо А.О., Юронен Э.И., Парик Ю.Я., Хальдре С.Ю., Ми-кельсаар А.-В.Н., Вийкмаа М.Г., Кринка А. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к миоглобину и изоэн-зиму ВВ-креатинфосфокиназы человека // Цитология.-1984. -Т. 26. - № 9. - С. 1077.

2. Пийрсоо А.О.,Юронен Э.И., Парик Ю.Я., Микельсаар А.-В.Н., Туусти A.M., Вийкмаа М.Г. Моноклональные антитела к миоглобину человека // Медицинские исследования в прантике: Тезисы конференции. - Тарту, 1984. - С. 55.

3. Юронен Э.И..Пийрсоо А.0..Микельсаар А.-В.Н..Вийкмаа М.Г., Парик Ю.Я. Моноклональные антитела к миоглобину и их использование для количественного определения миоглобина // Фундаментальные аспекты и практическое применение в медицине и сельском хозяйстве достижений биотехнологии. Тарту, 1986. - С. 19-23.

4. Юронен Э.И., Вийкмаа М.Г. Получение и применение в практике моноклональных антител к миоглобину человека // Актуальные вопросы биотехнологии. - М., 1987. - С. 121.

5. Юронен Э.И., Вийкмаа М.Г., Микельсаар А.-В.Н. Использование моноклональных антител для количественного определения миоглобина с помощью твердофазного иммуноферментного анализа типа "сэндвич" // Вопр. Мед. Хим. - 1988. - № 4,-С. 132-136.

6. Juronen E.I., Viikmaa M.H., Mikelsaar A.-V.N. Rapid,simple and sensitive antigen capture ELISA for the quantitation of myoglobin using monoclonal antibodies //J. Immunol. Methods. - 1988. - 111/1. - p. 109-115.

Ю р о н е н Эркки Иванович. МСНОШНАЛШЕ АНТИТЕЛА К МИОГЛОБИНУ ЧЕЛОВЕКА. Автореферат диссертации на соискание ученое степени кандидата биологических наук. На русском языке.

Тартуский государственный университет.

ЭССР, 202400, г.Тарту, ул.Юликооли, 18.

Подписано к печати 14.09.1988.

МВ 02844.

Формат 60x90/16.

Бумага писчая.

Машинопись. Ротапринт.

Учетно-издательских листов 1,32. Печатных листов 1,5.

оак&з л-Бесплатно.

Типография ТГУ, ЭССР, 202400, г.Тарту, ул.Тийги, 78.