Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование адсорбции белков и пептидов на модифицированных поверхностях окиси кремния

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование адсорбции белков и пептидов на модифицированных поверхностях окиси кремния"

ЛИТОВСКАЯ РЕСПУБЛИКА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

РУЗГАС Таутгирдас Альгевич

ИССЛЕДОВАНИЕ АДСОРБЦИИ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ НА МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОВЕРХНОСТЯХ ОКИСИ КРЕМНИЯ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВИЛЬНЮС - 1992

Работа выполнена в лаборатории химии Ферментов Института биохимии Литовской Республики.

Научный руководитель - доктор химических наук,, профессор.

член-корреспондент Литовской АН Ю- Кулис

Научный консультант - доктор химических наук

В. Разумас

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент Литовской АН А. Ясайтис " -- кандидат биологических наук М. Маурицас

Ведущая организация. - Институт биохимии им. А.Н. Баха

г. Мооква * .

Защита диооертащщ состоится '*££•' .1992 г. в и часов

на заседании специализированного совета К он.05.01. в Институте биохимии. Адрес: Литовская Республика. 2600 Вильнюс, ул. Моксли-нинку д. 12. _ 5 .

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института биохимии Литовской Республики.

Автореферат разослан О^/^ОМ^ээг г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

о<-' В.Ф. Зовите-Браженене

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА работы

Актуальность проблемы. Чрезвычайно важная роль белков как биологических объектов, общеизвестна, это ферменты - биокатализаторы всех химических реакции живой природы, гормоны - регуляторы метаболизма. антитела, обеспечивающие иммунитет к инфекциям и т.д.. Множество биохимических процессов при участии белков протекает на границе раздела Фаз, Например, синтез и гидролиз жиров, свйртыва-' ние крови. Функционирование мембранных белков так хе происходит на -разделе фаз вода/ масло, Поэтому для функциональных свойств как отдельных белков так и в целом биологических систем немаловажное значение имеет поверхностная активность белков, определяющая вклад , поверхностных явлений в происходящие на разделе фаз биохимические';., процессы. Посколку. биологическое значение поверхностной активнос-. ти белков далеко 'невыяснено. изучение таких поверхноотных явлении как ©армирование бислойных липидных пленок, взаимодействие биомолекул о жидкими и твердыми границами сред, адсорбция на этих гра— ■ ницах и т.д. составляет одно из Фундаментальных направлений современной биологии, физики и химии. Адсорбция белковых молекул ' на твёрдых поверхностях особую роль играет в перспективных областях науки и техники таких как биоэлектроника, культивирование клеток теплокровных, изучение искусственных нейронных сетей и т.д..

На практике адсорбция белков на твёрдых поверхностях встречается в разных областях деятельности человека« и в производстве медицинской техники, протезов и инплантируемых датчиков; 2) в производстве и хранении белковых лекарственных препаратов; з) в биотехнологических процессах; при производстве пищевых продуктов. Подавление нежелательных последствий адсорбции белков или целенаправленное использование этого процесса выдвигает необходимость . детального изучения механизма, адсорбции. Можно такае преяпологать. что изучение принципов взаимодействия белков о искусственными поверхностями позволит более глубоко понять роль межфазных явлении в .реальных биологических процессах. Из обзора литературного'материала следует, что довольно подробно изучены лишь формально-кинетические и термодинамические закономерности адсорбции индивидуальных белков, однако, влияние структуры белковых молекул и поверхности на процесс адсорбции, взаимодействие зясорсата с <жомолекулами в растворе, реакции антиген/антитело на поверхности и др. изучены

■ весьма мало. . '.

цель работы. Изучить кинетико-термодинамические закономерности адсорбции белков и пептидов на модифицированных поверхностях окиси кремния. Решение поставленной цели включает следующие задачи: и изучить влияние структуры биомолекул на процесс адсорбции на примере гем-содержащих пептидов МП-е. -ч и -и. миоглобина и гемоглобина 2) изучить влияние гидрофильно-гидрофобных свойств поверхностей кремния на адсорбцию миоглобина. гек глобина и бычьего сывороточного альбумина (БОА*); 3) исследовать закономерности последовательной адсорб^яи белков на примере г-интерферона ШНФ) и БСА; ^У исследовать закономерности взаимодействия антиген-антитело в межФазной области твердое тело/раствор и разработать иммуносеноор для определения ИНФ и человеческого сывороточного'альбумина (ЧСА).

• Научная новизна. Впервые изучена адсорбция гем-оодерж^щих пептидов мп-8, мп-? и мп-11. отличавшихся друг от друга на 1-з аминокислотных остатка. Показано, что скорость адсорбции не зависит от . состава их полипептидной цепи и определяется .взаимодействием гема о поверхностью. Количество адсорбированных пептидов определяется значением иэоэлектричеокой точки./ ' • . • '''•'.

Изучена последовательная адсорбция ИНФ и БСА. Показано, что на адсорбированном слое ИНФ адсорбируется монослой молекул БСА. Впервые показано, что плотность слоя адсорбированных белков, увеличивается при усилении их. электростатического взаимодействия. Устано-вленно. что в процессе последовательной адсорбции адсорбированный ИНФ вытесняется о поверхности молекулами БСА. Впервые показано, что скорость вытеснения уменьшается при усилении электростатического взаимодействия между молекулами ИНФ и БСА и, что обмен белков приводит к уменьшению плотности слоя адсорбата. .

Изучено взаимодействие ИНФ/ анти-ИНФ на поверхности кремнмя. Показано. .что во вэаимодейотвие о иммобилизованным ИНФ из смеси ИНФ ' о анти-ИНФ вовлекаются только свободные, не ассоциированные о ИНФ молекулы иммуноглобулина.

Практическое значение работы. Закономерности адсорбции гем-пеп-тидов. БСА и ИНФ могут быть использованы при-создании электрохимических и оптических.сенсоров. Результаты последовательной адсорб-. ции ИНФ и БСА использованы нами при создании иммунного сенсора для определения концентрации ИНФ. и. ЧСА в растворе.

Апробация работа. Материал диссертационной работы докладывался на уп всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" г.Москва (19?1) и в Тюбингедаком институте Физической и теоретической химии (Германия) во время научной командировки.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано э статей и тезисы одного доклада.

Обьём работы. Диссертация состоит.из введения, обзора литературы. описания штодов и результатов йсслёдовакии. выводов и списка литературы ( в4 источника). Работа изложена на иг страницах машинописного текста и иллюстрирована го рисунка^ и в таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

ь Обьект и методы исследований Объектами исследования явились - микропероксидазы мп-i i. мп-? и МП-а (Sigma). МИОГЛОбИН И ГеМОГЛОбИН лошади (Serva). БСА (Baeh-ringer Mannheim), реКОМбИНЭНТНЫЙ ЧвЛОВвЧеСКИЙ Г~ШФ ИЗ Escherichia

сои и моноклональный иммуноглобулин против инф (анти-инф) из мыши производства института Биотехнологии (Вильнюс), ЧСА (Reanai) и по-ликлональквя-- ишуноглооулиновая фракция против ЧСА (анти-чсА) из кроличьей сыворотки получена из НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Й.Ф, Гамалей (Москва). 4

Образцы МЛ-11 и МП-в, содержащие и eov. основного вещества соответствено. пропускали через колонку заполненную -сефадексом б-10 (Pharmacia), а МП-? содержащий 60у. основного вещества - через колонку, заполненную биогелем Р-6 (Bio'Rad Laboratories), ЧТО П03-воляет повысить степень чистоты этого препарата до 92-/.. гемоглобин дополнительно очищали пропуская через колонку о сефадексом g-7 5. Миоглобин. БСА. ИНФ содержащий более основного вещества, анти-ИНФ.- ЧСА и анти-ЧСА использовали без дополнительной очистки. '

Бычьий сывороточный альбумин (БСА*) и интерферон (инф*). меченные радиоактивным иодом 12э получали по методике остернап. ^вз.

' Адсорбцию белков и пептидов проводил!! на кремниевых пластинах марки КЭФ-1 с размерами 2,0x0,5x0,05 см. Пла'сттш получены из института полупроводников (Вильнюс). Характеристикой гидрофильно-ги-

дрофобных свойов поверхностей кремния являлся угол смачивания поверхности (б) водой. В работе использовали гидрофильные (е<а°) и гидрофобные пластины о е=з<н±з)° и б7(±б)°, а также модифицированные (Дарбре, 1989) фенилтрихлор- СФС) и' диметилдихлор- (ДМС) сила-нами (пегск) пластины обладающие е=9К±з)° и Ю2(±2)°. соответственно. иммобилизацию ИНФ проводили иопользуя>-глицидоксипропнл-триметоксисклан (ГПМС). а ЧСА - з-аминопропилтриэтоксисилан (АПЭО) (Aldr-ich) по методике (Mosbach, 1988). ПОСЛе ИММОбШШЗаЦИИ , ИНФ пластины выдерживали в растворе БСА с целью блокирования мест на поверхности незанятых молекулами ИНФ.

Толщину диффузного слоя изменяли меняя скорость вращения магнитной мешалки. Величину диффузного слоя определяли по электрохимической методике (Bard, 1980) используя кремниевые пластины, покрытые золотом. •

Концентрацию адсорбата (Г) рассчитывали из эллйпсометрическим методом (Аззам. i9ei) определенных толщины (ь, нм) и показателя

ПреЛОМЛеНИЯ (л) СЛОЯ аДСОрбата. ИСПОЛЬЗУЯ ОООТНОШеНИе (de Feijter,

1978): г(мг/м2)=0«(п-п0)-'(Дп/дс), где nQ=i,335 -показатель _ преломления буферного раствора. дл/дс*о,1в7 см3/г - изменение показателя преломления раствора белка при изменении его концентрации; В работе использовали модифицированный нуль-эллипсометр ЛЭФ-зм-i. содержащий гелий-неоновый лазер (к=бзг,в нм). поляризатор, компенсатор, иоследуемый образец и анализатор, ¿.модифицированном эллипсометре плоскость падения лазерного луча перпендикулярна к вертикально расположенной исследуемой поверхности, а угол падения равен 7о°, Измерения проводили в трапеэойдной кварцевой кювете обьбмом ■» см3. Образцы в кювете отмывали посредством проточной системы. Скорость потока жидкости равна 1бо см3/час.

* *

Количество адсорбированного БСА и ИНФ определяли используя »--счетчик.

В работе использовали фосфатный буферный раствор о низкой ионной силой (o,oi м фосфатный буферный раствор. pH 7,2), фосфатный буферный раствор о высокой ионной силой (o.oi м фосфатный буферный раствор, рн 7,2 содержащий о,is м Naci), карбонатный буферный раствор (о,о5 м карбонатный буферный раствор. pH ч,ь).

2- Закономерности адсорбции гем-содержащих пептидов

с целью выяснения роли строения'пептидов на их адсорбционные

свойства исследована адсорбция гем-содержащих пептидов мп-в, МП-1? , и МП-ч 1 рис.1). Адсорбцию проводили на гидрофильных кремневых пластинах, обладающих в меньше в°, и гидрофобных, углы смачивания которых были 34°, 67° и 102°.

Выдерживание кремниевых пластин в эо нм растворах пептидов в фосфатном буферном растворе (рн 7,2) высокой ионной Ьилы показало, ■что пептиды адсорбируются лишь на гидрофобных (е=ю2°), обработан-

11 К 1« 14 <• II 1? О II 1« II II

Уа1-01п-1_уэ-Су8-А1а-01п-Су8-Н1»-ТГ1г-Ув1-а1и-1-у9

но-сц

Рио.1. Структура гем-пеп-ТИДОВ МП-8, МП-' И МП-11. КШ-З содержит от 1ПО 21, МП-1? - ОТ 14 ПО 22 и МП-11 - от и по 21 аминокислотных остатка цитохрома с.

ных посредством дмс поверхностях, кинетика адсорбции мп-в, -9 и -11 представлена на рис.2. Адсорбцию пептидов можно описать уравнением необратимой адсорбции:

г=гмахи-е*р<кад-с'1/гмахп ' (1)

кай - константа скорости адсорбции, = - концентрация пептида, t -

время» Гмах - максимальная адсорбция. Рассчитанные |<ад и гмах приведены в таблице 1.

Гдшсль-см 2 30'

Рис.2, кинетика адсорбции гем-пептидов! (1) - мп-в. (2) - мп-9, (3) - мп-11 на гидрофобизированном посред -отвом ДМС кремнии. ФосФат-ный буферный раствор (рн 7.2) высокой ионной-силы.

Таблица 1. Параметры необратимой адсорбции гем-пелтидов МП-в. -11. на гидрофобном кремнии._'_1

Пептид кад.ю3,см'оек г^^.пмоль^см2 г^°?пмоль/ом2 з. нм2

_____ 2 .'8+0.1 21.2 20+2 0.4+0.9

Ш-9 2.9+0.2 27.1 25+2 6.7+0.7

МП-И .2.8+0.2 32.5 2В+3 5/9+0.7

Как видно скорость, адсорбции для всех гем-пептидов совпадает в пределах погрешности определения. Рассчитанные согласно ур. Арре-ниуса • ' -

ад""мах"

k„„^wr^.exp(-EaKT/RT) (2)

энергий актйвации <Еакт> адсорбции для этих пептидов близки 32 кДж/моль. Принимается, что kMax=iRT/2nf1)1/2 <Daniels. 1975), хпе п - газовая постоянная. т - абсолютная температура, м-, - молекулярная масса гем-пептида. Отсюда можно заключить, что кинетика адсорбции гем-пептид ов определяется взаимодействиями идентичных участков молекул с поверхностью. Таким'участком для вйех гем-пептидов является протопорфириновое кольцо (рис.1).

Рассчитанные площади поверхности (s, табл.1), занимаемые молекулой мп-е, -9 и -и- в 2,5 и более раз превышают площадь плоскости протопорфирнна (2,3В HM2, Kolpin, 1978).

для объяснения того факта, что Пептиды большей массы занимают меньшую s, более подробно изучена зависимость адсорбции МП-8 и МП-Ii от pH среды (рко.з). как видно, максимальная адсорбция для МП-Ii наблюдается в области pH близкой к его газоэлектрической точке (pi=4,75, Wilson, 1977) и уменьшается с увеличением положитель-

Глмоль-см 3 40

20

О

О 4 8 pH

. Рио.з, зависимость максимальной адсорбции МП-в <1) и МП-11 (2) от рН среды. Продолжительность адсорбции зо мин.' отмывка зо мин. Концентрация пептидов - 150 нм. Фосфатный Аг-^ буферный раствор высокой ионной силы.

иого или отрицательного заряда гем-пептида. pi для МП-в неизвеот-

,.на. однако отсутствие в его структуре лизина-13 должно сдвигать её

в кислотную область рК. где и наблюдается максимальная адсорбция

данного пептида. При pH=pi молекулы пептидов незаряжены и плошадь

2 2 занимаемая молекулой мп-и равна нм (гмах*зв пмоль/см ), а

- для МП-8 - з.з нм2 ^цах"50 пмоль/см2). Изменение р№ приводит к образованию избытка положительного или отрицательного заряда на молекуле, действие которого проявляется на раотоянии радиуса ионной атмосферы, близком к о.а нм (Bard. i98o). максимальная площадь для молекулы на поверхности, обусловленная электростатическим отталкиванием. далжна наблюдаться, когда ионные атмосферы соседних молекул не перекрываются. Для МП-и она равна 1з,7 нм2. что соответствует Г = 12.2 ПМОЛЬ/СМ2. а ДЛЯ МП-8 - 11,7 НМ2 И 14,2 ПМОЛЬ/ ом2, соответственно, Так как адсорбция при рН2 для МП-и и МП-з (рис.з) больше рассчитанных следует, что при понижении pH уменьшение адсорбции может быть объяснено межмолекулярным электростатическим отталкиванием гем-пептидов на поверхности..

Влияние электростатического отталкивания можно оценить исходя из величин рка аминокислотных остатков пептидов, мп-в содержит два аминокислотных остатка, которые могут быть заряжены положительно (гистндин-10. рКа=б,о; c-NH2-rpynna цистеина-1<», рКа=в,з), мп-9 -три (гиотидин-18, рка=б.о; c-nh2-группа цистеина-14. рка= а.з; е-мн2-группачЛТОИна-22, рка=ю.5) и мп-и - три'(гистидин-1э. рка= 6.о; o-nh2-группа валина-и, рка=9,^>; <c-nh2-группа лизина-is, рка= ю.5% из сравнения рКа аминокислотных остатков, присутствующих в молекулах МП-в, .МП-? и МП-и. следует, что депротониэация положительно заряженных групп в МП-в происходит в более кислотной области pH по сравнению о депротонизацией в МП-"?, тоже самое справедливо и при сравнении МП-"? и МП-и. Следовательно наибольшее электростатическое отталкивание при рН7,2 претерпевают адсорбированные молекулы МП-8, меньшее - молекулы МП-"? и ещб меньшее - МП-и. Как следствие sMn_8>sMII_9>sMn_11 (табл.1),

В области pH < ei гем-пептидов уменшение адсорбции МП-и сим-батно уменьшению Г МП-э (рис.з). в кислых растворах диссоциируют только карбоксильцые группы протопорфирина. они и опеделяют одинаковое уменьшение адсорбции МП-в и МП-и при низких рн.

Электростатическим отталкиванием, однако; не может быть обьяо-нена низкая адсорбция в области высоких pH. МП-8 и -и в щелочных растворах Образуют ассоциаты (Baldwin, 19а?: Wilson, 1977) и, ES-

роятно. этот процесо обуславливает, низкую адсорбцию гем-пептидов. j. Кинетические закономерности адсорбции миоглобина и гемоглобина

Для изучения влияния структуры белков на адсорбцию была исоле-дована адсорбция миоглобина и гемоглобина, которые, как и гем-пептиды. содержат прот.опорфириновое кольцо. Молекула гемоглобина состоит из двух а и двух fi субьединиц. Суоьединица г* близка по структуре к молекуле миоглобина.

R отличии от гем-пептидов миоглобин адсорбируется на ггдрофиль-ной поверхности кремния (риси). это различие указывает на то. что наличие 8-п аминокислотных остатков в молекулах гем-пептидов недостаточно для удержания гидрофобного гема на гидрофильной поверхности кремния.

Рис и. Адсорбция миоглобина на поверхности кремния (в меньше е°). Концентрация мио-

ГЛООИНЗ 0,35 (1), 0,55 (2), 1,4 (3) и 2,8 мкм (4). фосфатный буферный раствор (рН Л 2) высокой ионной силы. Кривые .смоделированы используя параметры табл.2, и ур.<з>. Перемешивание магнитной дисковой мешалкой - зоо ос/мин.

Адсорбция удовлетворительно описывается ленгмюровским уравнением обратимой адсорбции!

1/К *с LM3X

К - равновесная константа адсорбции, равная отношению констант скоростей адсорбции (*ад) и десорбции *кДРСЛ

Рассчитанная на основе размеров молекулы максимальная поверхностная концентрация миоглобина в монослоа Гмон=ю,э пмоль/см". Экспериментальная пмоль/см"' и составляет is* от теоре-

тической для плотной упаковки. Возможно, что наличие на поверхности глобулы МИОГЛОбИНЯ ГИЛр.О'1-ОбНЫХ участков (Ногеley, I7B7) ОШЗЕЗДТ wmWsr* на гидрофильной поверхности кремния, показатель прелом-

ГдШСЛЬ-СМ 2

4 т

7~А_

-А—-А-

/

П/

-в-

43

О 10 20 twm

ленил адсорбированных слоёв миоглобина и,зав ю.ощ указывает на отсутствие глубокой денатурации данного белка на поверхности.

Таблица 2. параметры адсорбции миоглобина и гемоглобина._

Свойства поверх- '«„•ю15. Г,.„т. гмах

ад _ * д"С_2 Мс1А 2 '

ности кремния см-сек моль-см сек пмоль'см1 *мон___

МИОГЛОбИН

гидрофильная 6 + 1 3,7+0,8 1,9+0,2 18 + 2

гидрофобная 10Э±23 0,3*0,2 3,7*0,5 35 + 5

Гемоглобин

гидрофильная 37+5 ' 1,410,1 2,7+0,5 ьо±ю

гидрофобная 690+70 0,7+0,1 1,6+0,1 33+2

*

гмон ~ п°веРХностная концентрация- плотного монослоя белка.

Адсорбция миоглобина на гидрофобной поверхности протекает подобно как на гидрофильной и экспериментальные данные описываются ур.(з). скорбеть адсорбции миоглобина на гидрофобной поверхности в 17.5 раз больше по сравнению с гидрофильной (табл.2). Уменьшение энергии активации адсорбции (ЛЕакт> в результате гидрофобпзаиии гидрофильной поверхности, рассчитанное используя ур, Аррештуса (2) при 2о°с, для миоглобина равно 7,о(+о,7> кДж/моль. Величина показателя преломления слоя миоглобина на гидрофобной поверхности' кремния составляет 1,ззв±о,ооз, что указывает на отсутствие глубокой денатурации адсорбированного белка.

Адсорбция гемоглобина на гидрофильной и гидрофобной поверхностях кремния протекает подобно миоглобину с табл.2). Однако, скорость адсороции гемоглобина, на гидрофильной поверхности больше, по-видимому, потому, что молекула гемоглобина способна образовать больше связей с поверхностью.

Как и в случае миоглобина. для гемоглобина наблюдается уменьшение энергия активации на ь.н±о,з> кДж/моль при его адсороции на гидрофобной поверхности, однако, эта величина несколько меньше леакт для миоглобина. Более низкий эффект уменьшения эктивашчедно-го барьера в случае гидрофосизации поверхностей кремния для гемоглобина может быть обусловлен: и диффузионным ограничением переноса гемоглобина к поверхности: 21 денатурацией или распадом тет-рамерного гемоглобина на мономеры: з> взаимодействием с поверхностью молекулы гемоглобина посредством другого участка глобулы но

сравнению с миоглобином. . ■

Массоперенос гемоглобина не является лимитирующим процессом, посколку скорость его адсорбции на гидрофобной поверхности одинакова при толшине диффузного слоя 1"?о, 46 и зо мкм.

Величина показателя преломления слоя гемоглобина на гидрофобной поверхности составляет 1,зза+о,оо2 и противоречит представлениям о денатурации белка в мехфазной области. Насыщение гемоглобином гидрофобной поверхности составляет всего зз•/. и близка к заполнению данной поверхности миоглооином. Близкие значения заполнения поверхности и констант-окорооти десорбции для миоглобина и г могловина указывают на то. что нативная молекула гемоглобина при адсорбции на гидрофобной поверхности распадается на мономеры, энергия, затраченная на разрыв связей между оуоьединииами, , может увеличить энергию активации адсорбции гемоглобина на данной поверхности.

ч-Влияние гидрофильно-гидрофобных свойств кремниевых поверхностей на адсорбцию БСА и иге

Для выяснения влияния гидрофильно-гидрофобных свойств поверхностей на вдсорбцию белков'была исследована адсороция БСА и ИНФ на гидрофильных (е<а°) и гидрофобизированных посредством ФС (е=91°) или ДМС (е-п'-'г0) кремниевых пластинах..

Количество адсорбированного БСА и ИНФ-на гидрофильных и гидрофобных кремниевых пластинах зависит от продолжительности адсорбции и осьёмной концентрации белка, параметры адсорбции, согласно уравнению обратимой адсорбции (з). приведены в табл.з.

Таблица з. Параметры адсорбции БСА и ИНФ на кремниевых поверхностям Свойства в Бе- кад'10 ' кдес'10 1 к'10 ' гмах.

2 3 2

поверхности град лок см/сек моль'см сек см /моль мг/м

Гидрофильная <а° БСА 28116 60130 0,50±0,04 1,104,07 Гидрофобная 102° БСА 1600 + 1600 2,212,3 730170 О.в9±,02 Гидрофобная 102° ИНФ 80+30 1,510,6 5414 0,99*,09

Концентрация плотно упакованного монослоя БСА в паралельной их ориентации составляет 2,1 мг/м2. На гидрофильной поверхности Гмах « 1,1а мг/м2 (табл.з). что составляет 56-/. от плотно упакованного монослоя. Причиной этого различия, вероятно, является денатурация белка на поверхности. Г,,,,,, для БСА на гидрофобной поверхности на

237. меньше по.сравнению о Гмах на гидрофильной, что возможно является следствием более глубокой денатурации белка на данной поверхности.

Гидрофобизация кремниевых пластин увеличивает скорость адсорбции БСА в 5в раз и уменьшает скорость десорбции в 27 раз по сравнению с гидрофильной поверхностью, (табл.з). что указывает на увеличение сродства селка к гидрофобизированной поверхности, Скорость адсорбции БСА на гидрофобных поверхностях 20 раз больше по сравнению со адсорбцией молекул ИНФ. Возможно, это обусловлено способностью белковой молекулы БСА. обладающей большей молекулярной массой. образовать больше связей с поверхнось».

При исследовании равновестных процессов адсорбции, наблюдается монотонный рост количества адсорбированного БСА от его концентра -ции в растворе (рис.5). при концентрации белка больше i мг/смг количесво адсорбированного БСА значительно увеличивается, повидн-

РИС.З. Изотермы адсорбции БСА на гидрофильных (а) и гидро-Фоб'изированных посредством (21 дмс и (з) фс поверхностях кремния, фосфатный буферный раствор (рН 7,2) высокой йон-И"3 ной силы.

С. МГ-СМ

мому. это обусловлено тем. что на поверхности формируется упорядоченный слой нативных молекул. Подобного рода изотермы наблюдались

ранее при адсорбции БСА на полистироле (Fair, i9so),

• * *

При исследовании адсорбции меченных йодом БСА и ИНФ . закономерности адсорбции от введения радиоактивной метки не менялись.

з. Закономерности последовательной адсорбции ИНФ и БСА на гидрофобных кремниевых поверхностях

Последовательную адсорбцию БСА проводили на гидрофобизированных посредством ДМС кремниевых пластинах, содержащих предварительно

адсорбированный ИНФ. Условия адсорбции и соотав адсорбата по окончании последовательной адсорбции представлены в табл.*.

Таблица 1. условия адсорбция* и состав адсорбата при последовательной адсрбции инф и БСА на гидрофобных поверхностях кремния

Буферный раствор при адсорбции: Состав адсорбата, мг/м2

ИНФ МКГ/СМ3) БСА (72 МКГ/СМ3) ИНФ+БСл ИНФ* БСА*

1. фосфатный низкой .фосфатный низкой ИОННОЙ СИЛ1' ионной оилы 1,810,1 0,7+0,1 1,110.2

2. фосфатный низкой фосфатный высокой ионной оилы ионной оилы 2,0+0,1 0,4+0,1. 3 ,510,6

3, Карбонатный ■фосфатный высокой ионной силы 1,8+0,1 0,2±0,1 2,6+0,4

1 Продолжительность адсорбции ИНФ - зо мин. БСА - ьо мин. количество адсорбированного ИНФ составляет ьос±о,1) мг/м2.

Как видно, независимо от условий адсорбции ИНФ и состава раствора БСА. альбумин адсорбируется на слое ИНФ.' Количество оставшегося ИНФ на пластицэх меньше его начальной концентрации (Г= 1.02 мг/м2). Следовательно ИНФ десорбируется о поверхности пластин. Количество абсорбированного ичф составляет зг, 59 и ез-/. в зависимости от условии адсорбции как ИНФ так и БСА.

' Зависимость показателя преломления и толшины слоя адсорбата от поляризационных углов л и у. непосредствено измеряемых в экспериментах, отражена нанограммой на рис.6, из сравнения эксперимен-

Рис.б. Изменение эллипсомет-рических углов в ходе последовательной адсорбции ИНФ и БСА. Кривые 1. 2, з - экспериментальные зависимости соответствующие условиям адсорбции. 1, 2, з в табл.?. а. в, с - рассчитанные при п равных 1,6, 1,35 и 1,3378, соответо-тветотвенно. и - углы поолз адсорбции ИНФ. •

Д7 156

тальной зависимости ¿-у с расчетными следует, что в при адсорбции БСА из раствора низкой ионной силы (кривая 1) Формируется слой на поверхности с изменяющимся « в пределах 1,35-1,6, эхо указывает на образование плотно упакованного слоя белкового адсорбата. В процессе адсорбции БОА п уменьшается (кривая 1 сдвигается от« к в), что. по всей вероятности, обусловлено разрыхлением слоя адсорбата из-за десорбции ИНФ.

Адсррбция Бел из фосфатного буферного раствора высокой ионной силы только в начальный период времени (кривая г) вызывает увеличение слоя с п больше 1,33, в дальнейшем п уменьшается. Следовательно. на поверхности формируется рыхлый слой белка. Поскольку в этом случае происходит более существенная десорбция инф о поверхности (до 39-/.) по сравнению с раствором низкой ионной силы (десорбция 32%). можно заключить, что более рыхлая структура адсорбата образуется ег случее более интенсивной десорбции инф с поверхности.

Сравнивая результаты опытов адоорбции БСА из буферных растворов высокой и низкой ионной силы на поверхностях с ИНФ адсорбированным из фосфатного буферного раствора и принимая во внимание, что при рН. 7,2 молекулы БСА <р! *.*»> заряжены отрицательно, а ИНФ <р1 9,5) положительно, мохно предположить, что в растворах низкой ионной силы эффективное электростатическое взаимодействие между БСА и ИНФ препятствует вытеснению последнего с поверхности.

слой, образующийся при адсорбции ЕС/ из фосфатного буферного раствора высокой ионной силы на слое КНФ. предварительно сформированном в карбонатном буферном растворе, обладает еще более низким л (кривая з) по сравнению с показателем прел ощенил слоя, образующегося на пластинах содержащих ИНФ адсорбированный из фосфатного буферного раствора, это указывает на еще более слабое взаимодействие между молекулами ИНФ и БСА на поверхности, поскольку из карбонатного раствора адсорбированный ИНФ десорбируетоя быстрее (взх за 1 ч) по сравнению с десорбцией ИНФ адсорбированного из фосфатного буферного раствора (59-/. за 1 ч). следует, что в этих двух случаях интерферон на поверхности имеет различную ориентацию. Можно предположить. что в случае его адсорбции из карбонатного раствора положительно заряженные и способные к электростатическому взаимодействию с БСА аминокислотные • остатки интерферона ориентированы к поверхности кремния.

ь. закономерности взаимодействия антиген-антитело

на кремниевой поверхности .

Для изучения взаимодействия антиген-антитело на поверхности в качестве антигена использовали иммобилизованный интерферон, а в качестве антитела - моноклональный иммуноглобулин и <анти~ИНФ>. На рис.7 представлены изотермы адсорбции атти-ИНФ на пластинах пооле иммобилизации ИНФ обработанных раствором бса (кривая 1) или растворами бса и т^.ина-20 (кривая 2), концентрационные зависимости ад-

Г,

лмоль-см

.-2

О

/ ©

/ ©

О

0.2

мкМ

Рис.7. изотермы адсорбции ан-ти-ИНФ на кремниевые пластинах содержащих иммобилизированный ИНФ. После иммобилизации пластины обработаны! и> - раствором БСА. (2) - растворами БСА и твина-2о. фосфатный буферный раствор высокой ионной силы; Время определения Г- 4о мин.

сорбции анти-ИНФ описываются уравнением изотермы обратимой адсорбции:

Гмяу'санти-ИНФз0

1/к + санти-ИНФз.

гмах* санти-ИНФз0 и К

максимальная поверхностная и объемная концентрации. и равновесная константа адсорбции анти-ИНФ» соответственно.

определенные константы ассоциации (К. табл.5) иНФ/анти-ННФ на поверхности в 57 и зо раз меньше константы асооциасии в растворе. Возможно, это'связано о неспецифическим взаимодействием и стери-ческими ограничениями вследотвии иммобилизации ИНФ на поверхности. Увеличение К пооле обработки пластин твином. по-видимому, связано с блокированием мест неспецифичеокой адсорбции. Это подтверждается отсутствием адсорбции на этих пластинах из смеси анти-ИНФ о ИНФ при концентрациях ИНФ значительно -больше анти-ИНФ. ■

Таблица э, Параметры адоорбции анти-ИНФ на кремниевых пластинах -содержащих иммобилизированный ИНФ. Условия нак длярио.7. Обработка'поверхности после '

иммобилизации ИНФ_;_.К»ю~7. гмах. пмоль/см2

Раствор БОА . 2,0(±0,4) 2,6(±0,2)

Растворы БСА и твина-20 v 2,7<+o,6> i.,k±o,i)

На рис.а представлены данные адсорбции из смеси анти-ИНФ о ИНФ на плаотинах. содержащих иммобилизованный ИНФ и обработанных раствором БСА. При высоких концентрациях ИНФ Г составляет о,« пмоль/ . 2 -

см и. по всей вероятности, обусловлена неспецифической адсорбцией антитела. Снияение концентрации ИНФ в смеси может .увеличить Г благодаря увеличению свободного анти-ИНФ и комплекса ИНФ-иммуноглобу-лин (анти-ИНФ-ИНФ) так как в растворе устанавливается равнойе- * сие»

-к ' • к*

2инф + анти-ИНФ,—>ИНФ + анти-инФ«инФ<~;>инФ'анти-инФ-инФ. (5)

где Ка.К*- константы ассоциации ИНФ о анти-ИНФ в растворе.. При взаимодействии иммобилизованного ИНФ с анти-ИНФ и с анти-ИНФ-ИНФ изотерма специфической адсорбции выражается ур.(б) (Bard,i980)S Гма:г'К-санти-И1}Ф5 - r|Jax-KK-с анти-ИНФ-ИНФз

1 + к-санти-щш + кк-с,фгги-инФ-инФ5 гмах* Кк " мэксимальнзя поверхностная концентрация и равновесная константа ассоциации комплекса с иммобилиэированным ИНФ.

Рис.а. зависимость адсорбции

г _2 -

,ПМй\Ь'СМ анти-ИНФ на пластинах содер-

аащих иммобилизированный ИНФ от концентрации ИНФ в раст-

1

О

воре, содержащем 12э нп анти-

\ \ ИНФ 11). Другие условия как

для рис.7. расчётные согласно ур.(4) и (з) зависимости в ~ ® случае адсорбции свободного

'S1.

v 2

анти-ИНФ и комплекса

—--.-----1-—- анти-ИНФ-ИНФ (2) и только

О 0.2 0.4 С. МКМ свободного анти-ИНФ (3).

Адсорбция согласно ур.«0 характеризуется двумя крайними слу-

чаями. В первом, когда и анти-ИНФ и анти-ИНФ-ИНФ одинакого взаимодействуют о иммобилизованным ИНФ. т.е. к= кк=2.ю7 м-1. г^ах должен превышать Гма1 из-за большей-(на 10,57.) массы анти-ИНФ-ИНФ. в этом случае зависимость. Г от концентрации ИНФ в смеои изображается кривой 2 (рис.8).

Во-втором случае, если комплеко, по сравнению о свободным анти-ИНФ. взаимодействует о иммобилизованным ИНФ значительно слабее. (Кк=х>) зависимость Г от концентрации ИН* в омеси изображается кривой з (рис.в). сравнивая экспериментальную кривую о раоочбтными можно заключить, что ассоциация комплекса анти-ИНФ-ЙНФ о молекулами ИНФ на поверхности затруднена и процесс специфической адсорбции обусловлен в основном овободным антителом в растворе.

7. применение эллипсометричеокого метода для определения г-интерферона и альбумина

Зависимость конкурентной адсорбции анти-ИНФ на поверхности кремния, содержащей иммобилизованные ИНФ от концентрации ИНФ показана на рис.'. шц видно, до 15о нм ИНФ в смеси наблюдается линейное соотношение (коэффициент корреляции г=о,ччв) между адсорбцией анти-ИНФ и концентрацией (с.ню интерферона в растворе:

Г(МГ/М2)= 3,01+0,6) -0,010(±0,007).с (7)

2

Так как адсорбцию (Г) можно регистрировать о точностью до о,1мг/м (доверительный интервал '57.), .тогда нижний предел определения ИНФ составляет 15 нМ.

-Г,МГМ

г-2

с, мкМ

Рис.1?» Зависимость количества адсорбированного анти-ИНФ от концентрации ИНФ в смеси ИНФ/анти-ИНФ (1) и анти-чсд от концентрации ЧСА в смеои чоА/анти-ЧСА (2). концентрации анти-ИНФ и анти-ЧСА равны 125 нм 'И зо мг/см3. соответственно. фосфатный буферный раствор высокой йонной силы. Продолжительность адсорбции - «о мин.

при концентрации ИНФ выше iso нм аяоорбция более не зависит от его концентрации. Остаточная адсорбция анти-ИНФ по сравнению, с адсорбцией в отсутствии ИНФ. 'составляет зо-/. (Г=о,? мг/м2). Это обусловлено неспецифическими взаимодействиями анти-ИНФ с модифицированной поверхностью. ' -

Зависимость адсорбции анти-ЧСА. на кремниевой поверхности, со-, держащей иммобилизованный ЧСА от концентрации ЧСА в смеси анти-ЧСА /ЧСА показана кривой 2на рио.?. До концентрации ЧСА нМ наблюдается линейное соотношение (г=о,95з) между адсорбцией и концентрацией Сс.нМ) ЧСА: .

ГСМГ/М2) - 2.4(±0,6) - О,037(±0,050)«с (8)

Нижний предел обнаружения составляет 2,6 им. Остаточная адсорбция (0.2 мг/м2) определяемая неопецифическим взаимодействием, составляет ву. от величины адсорбции при отсутствии ЧСА в растворе', следовательно на'пластинах о иммобилизированным ЧСА в большей степени реализуется специфическое взаимодействие антиген-антитело.

ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние структуры белковых молекул на их адсорбцию, обмен и межмолекулярные взаимодействия на границе фаз твёрдое тело/раствор. . .

г. скорость адоорсции гем-оодержаших пептидов мп-в. МП-1? и МП-и определяемся взаимодействием гема о кремниевой поверхностью. Количество адсорбированнопо пептида зависит от электростатического взаимодействия между адсорбированными молекулами пептидов и максимально при рН равном газоэлектрической точке гем-пептида. .

3. скорость адсорбции миоглобина и гемоглобина определяется скоростью взаимодействия с поверхностью. На гидрофобной поверхности гемоглобин диссоциирует на мономеры.

4. гидрофобизация поверхности кремния увеличивает скопооть адсорбции миоглобина. гемоглобина и БСА. Количество адсорбированного белка на гидрофобной поверхности моевт быть как больше так и меньше по сравнению о адсорбцией на гидрофильной поверхности и зависит от структуры белка.

5. при последовательной адсорбции И® и.БСА на адсорбированном слое инф адсорбируется слой БСА. Плотнооть слоя адсорбата увеличивается при усилении электростатического-взаимодействия ыегау молекулами инф и БСА.. ■ '

ь. Адсорбированные на гидрофобной поверхности молекулы ИНФ вытесняются молекулами БСА при его последовательной адсорбции. Скорость обмена уменьшается при усилении электростатического взаимодействия между адсорбированным ИНФ и растворимым БСА. п процессе обмена адсорбированных молекул ИНФ молекулами БСА плотнооть слоя адсорбата уменьшается.

7. при ковалентной иммобилизации ИНФ константа его ассоциации о аити-инф уменьшается в эо раз по сравнению о константой ассоциации "в растворе. Во взаимодействии а тлмобилизированным ИНФ принимает участие только; свободные молекулы анти ЛНФ.

е. результаты исследований адсорбции ИНФ, бса. чса и иммуноглобулинов на модифицированных поверхностях кремния использованы при создании эллипсометрического иммунного сенсора для определения ИНФ и чса. Нижний предел обнаружения ИНФ и чса составляет 13 и 2,«, нм. соответственно. ■

... ............s

Основное содержание'диссертации опубликовано "в следующих работах:

1.Ruzgas Т., Razumas V,, Kulys J. El 1ipsometric determination of protein adsorption on silicon plates // Eksperimentine biologi-Ja.-1991 ,-N. 3 .P. 50-63.

2.Ruzgas Т., Razumas V., Kulye J. Sequential adsorption of )—interferon and. bovine serum albumin on hydrophobic; silicon surfaces //J. Col 1. Interface Sci .-1992.-V. iso .N. 2.- P .,386- 39.3.

3.руэгао Т.. Разумао В.. Кулио Ю. эллипсометрическое изучение взаимодействий антиген-антитело в межфазной области твердое тело/раствор // Биофизика.-1992.-т.37,-вып. 1. c.s6-6i.

4.Рузгао Т., Разумао В.. Кулио Ю. Эллипсометрическое определение ^-интерферона //Тезисы докладов vii всесоюзного симпозиума "Инженерная энэимология" г.Москва.-1"1.-С.104,

5.Ruzgas Т., Razumas V., Kulys J. El1ipsometric immunosensors Jor the determination of y-inte'rferon and human serum albumin // Biosensors & Bioelectronics.-1992.-V.7.-P. 401-407.

6. Razumas V.. Kazlauskaite J., Ruzgas Т., Kulys J. Bioelectrochemistry of microperoxidases // Bioelectrochemistry & Bioenergetics. - 1992.-V.27. - N. 2.-p. 123-1,41.