Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конкурентная адсорбция белков плазмы крови человека на поверхность биоматериалов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Конкурентная адсорбция белков плазмы крови человека на поверхность биоматериалов"

Г ! 0 U; 1

. 1 С OKI :

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

Тремсина Юлия Сергеевна

КОНКУРЕНТНАЯ АДСОРБЦИЯ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА НА ПОВЕРХНОСТЬ БИОМАТЕРИАЛОВ 03 00.02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 1996.

Ш'

Работа выполнена в НИИ трансплантологии и искусственных органов

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Севастьянов Виктор Иванович Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Гольдберг Владимир Михайлович кандидат физико — математических наук, доцевт Перевозчиков Николай Филиппович.

Ведущая организация:

НИИ Физических проблем, Государственный научный центр РФ.

Защита состоится С1Сиф>{<т г. в /^час. мин. иа заседании Специализированного совета К.06Э.91.10.

при Московском Физико—Техническом институте по адресу. 141700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, д9, МФТИ.

Автореферат разослан -25'1996 г.

Ученый секретарь

Специализированного ученого совета Киреев В.Б.

кандидат физико—математических наук, доцент

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Конкурентная адсорбция белков играет важную ром. во многих процессах, происходящих на границе раздела чужеродной поверхности с биологическими средами, такими, как ткань, кровь, лимфа и т.п. Особый интерес представляют исследования механизма адсорбции белков, являющейся первичной стадией взаимодействия чужеродной поверхности с кровью, при нахождении взаимосвязи между физико-химическими и гемосовместимыми свойствами различных изделий и устройств медицинского назначения.

Впервые эффехт конкурентной адсорбции белков, заключающийся в замещении адсорбированного на поверхности стекла фибриногена человека (ФГЧ) высокомолекулярным кинипогеном, был обнаружен Вроманом (Leo Vroman) в 1978 г. с использованием метода связывания антигена антителом. Данный эффект замещения адсорбированного белка другим белком с большей молекулярной массой, названный впоследствии эффектом Вромана, был подтвержден рядом исследователей прц регистрации радиоизотопным методом кинетики адсорбции ФГЧ из плазмы на поверхность материалов различной природы. На кинетической кривой адсорбции фибриногена это сопровождается появлением локального максимума.

Информативным методом регистрации кинетики адсорбции белков плазмы крови на поверхность твердого тела является флуоресценция полного внутреннего отражения (ФПВО). В отличие от ранее использованных.методов исследования конкурентной* адсорбции, включая радноизотопный, ФПВО позволяет проводить измерения в потоке и реальном масштабе временя. В Центре по исследованию гемосовместимых бноматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов методом' ФПВО был проведен цикл работ по изучению кинетики адсорбции белков из однокомпонентногхз раствора на поверхность кварца и различных полимерных материалов медицинского назначения. Изучение адсорбции того пли иного белка из многокомпонентных белковых растворов, в Которых происходит конкуренция за места адсорбции, является следующим шагом в фундаментальных исследованиях механизма взаимодействия чужеродной поверхности с кровью vi другими биологическими средами.

Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению методом флуоресценции полного внутреннего отражения механизма конкурентной адсорбции белков на поверхность полидиметилсилоксана (ПДМС), гексадецилтрихлорси —

лана (ГДТС) и аморфною кварца (КУ) из модельных растворов, разбавленной сыворотки и плазмы крови человека.

Задачи црсделования. Исходя из поставленной цели, основные задачи исследования сводились к следующему:

1. изучение механизма адсорбции сывороточного альбумина человека (САЧ) и гамма — глобулина человека (1ТЧ) из бинарных растворов друг с другом и фибриногеном (ФГЧ), а также из тройных систем с ФГЧ;

2. изучение механизма адсорбции САЧ и ГГЧ из разбавленной плазмы и сыворотки крови человека на аморфный кварц;

3. построение схемы конкурентной адсорбции белков из многокомпонентных систем.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые, с помощью метода ФПВО 'исследована конкурентная адсорбцию белков, меченных изотноцианатом флуоресцеина (ФИТЦ), нз модельных белковых растворов, разбавленной сыворотки и плазмы на поверхность кварца и полимерных материалов. При адсорбции САЧ и ГТЧ из бинарных растворов на поверхность кварца, ПДМС и ГДТС обнаружен эффект, противоположный эффекту Вромана, а именно, показано, что при определенных концентрациях белков может происходит замещение адсорбированных молекул белка большой молекулярной массы (ГГЧ) молекулами белка с меньшей молекулярной массой (САЧ). Предложена схема конкурентной адсорбции двух белков, различной молекулярной массы и структуры, учитывающая конкуренцию белков за центры адсорбции, процессы замещения и десорбции и объясняющая механизм появление локального максимума на кинетических кривых адсорбции исследованных белков на поверхность ПДМС, ГДТС и КУ из модельных растворов, плазмы и сыворотки. На примере поверхности кварца доказана возможность вытеснения адсорбированного на поверхности САЧ непосредственно ФГЧ без промежуточного участия ГГЧ. Показано, что при конкурентной адсорбции из многокомпонентных белковых сред ФГЧ, по сравнению с другими белками крови, играет наиболее активную роль в процессе вытеснения адсорбированных молекул САЧ в 1 ГЧ.

Понимание механизма адсорбции белков на чужеродную пг¡ерхность необходимо для целенаправленного синтеза биосовместимых полимеров, а также при разработке различных медицинских изделий* и устройств (биосенсоры, полимерные системы пролонгированного действия, искусственные органы).

;. Материалы работы докладывались на конференции

Американского общества искусственных органов (ASAIO) "Cardiovascular Science and Technology", Washington, декабрь 1994; симпозиуме "Биопротезы в сердечно — сосудистой хирургии", Кемерово, октябрь 1995; семинаре Центра по исследованию гемосовместимых биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов, Москва, июль 1996.

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в б печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, содержит dстраниц ^ н список литературы из

Исследование конкурентной адсорбции белков проводили на поверхности ПДМС и кварца, используемых ранее при изучении кинетики адсорбции САЧ и ГТЧ из однокомпонентных растворов методом ФПВО. Для выявления роли аффинности поверхности к САЧ в механизме конкурентной адсорбции была выбрана поверхность стекла, модифицированная гексадецилтрихлорсиланом (ГДТС), метальные группы которого специфичны к адсорбции САЧ. Данная часть работы проводилась совместно с труппой Dr. М. Foster (Институт полимеров Акронского университета, штат Огайо, США).

Белки САЧ и ГТЧ (Sigma, США) метили флуоресцеин изотноционатом (Serva, Швеция) по стандартной методике. Кинетику адсорбции САЧ —ФИТЦ и ГТЧ —ФИТЦ из модельных растворов, растворов плазмы и сыворотки в фосфатном буфере (ФБ), рН = 7.35 измеряли методом ФПВО. Эксперимент проводили при 25°С при сдвиговой скорости у поверхности 4800 с-1 (ламинарный поток, кинетический режим адсорбции). Для исследования конкурентной адсорбции только один из белков (САЧ или ГТЧ) метился ФИТЦ. Концентрация меченого белка составляла 0.1 мг/мл, содержание второго (немеченого) белка варьировалось в ФБ от 0.01 до 0.5 мг/мл. Концентрации ФГЧ в бинарных и тройных системах составляла 0.02 и 0.04 мг/мл при исследовании конкурентной адсорбции САЧ-ФИТЦ; от 0.05 до 0.2 мг/мл для ГГЧ-ФИТЦ.

При проведении исследований конкурентной адсорбции из плазмы и сыворотки, которые содержат САЧ в достаточно большой концентрации (около

наименований.

Содержание работы

1.

40 мг/мл|, сначала была определены концентрации немеченого САЧ (степень разведения плазмы или сыворотки), при которых наблюдается линейность зависимости полученного сигнала (при концентрации САЧ —ФИТЦ в среде 0.1 мг/мл) от реального количества адсорбированного белка. Было установлено, что отношение меченого альбумина к немеченому должно быть не меньше 1.0.

Эксперименты по десорбции САЧ и ГГЧ проводили при исходной концентрации белков в ФБ 0.1 мг/мл. Предварительно проводили адсорбцию при стандартных условиях в течение 10 — 20 минут и далее десорбировали белок ФБ. .

. 2. Экспериментальные результаты

Для всГех трех поверхностей (рис.п1 — пб, см. Приложение) было обнаружено, что с увеличением концентрации немеченого ГТЧ в растворе, количество. адсорбированного САЧ —ФИТЦ монотонно падает. Отличием является концентрация адсорбированного белка на поверхность, которая наибольшая для ПДМС и наименьшая для ГДТС. Также следует отметить, что в отличие от кварца и ПДМС на кинетической кривой адсорбции из индивидуального раствора на ГДТС наблюдается снижение первоначально адсорбированного САЧ — ФИТЦ с течением времени.

Конкурентная адсорбция ГГЧ — ФИТЦ носит более сложный характер. Сначала наблюдается снижение количества адсорбированного белка с добавлением низких концентраций немеченою САЧ в раствор, но затем происходит рост концентрации ГТЧ на поверхности. Когда концентрация САЧ становится достаточно большой (для ПДМС 0.1 мг/кл) на кинетических кривых наблюдается локальный максимум адсорбции. Этот эффект наиболее ярко наблюдается для ПДМС. Для кварца локальный максимум адсорбции появляется только при концентрации САЧ в растворе 0.5 мг/мл. Для ГДТС при концентрации САЧ 0.01 мг/мл кривая адсорбции идет выше кривой адсорбции из индивидуального раствора и наблюдается локальный максимум.

При исследования конкурентной адсорбции белков следующим шагом было введение в систелу третьего белка — фибриногена человека (ФГЧ), который является одним из основных белков плазмы крови и фактором II свертывающей системы крови. Для обоих меченых белков обнаружено (рис.п7 — п10, см. Приложение), резкое снижение количества адсорбированного белка по сравнению с адсорбцией из индивидуального раствора в 10—100 раз. На всех

кривых наблюдался локальный максимум адсорбции, который для ГТЧ — ФИТЦ был более ярко выражен, чем для САЧ — ФИТЦ.

При исследовании конкурентно/1 адсорбции на поверхность кварца в диапазоне наиденного разведения плазмы (от 1240 до 200) для обоих белков обнаружены максимумы адсорбции на кинетических кривых (рис.п! 1 — п14, см. Приложение). Для 1ТЧ они более ярко выражены.

В отличие от плазмы при адсорбции из сыворотки, где отсутствует ФГЧ для обоих белков при разведении 1:1700 (концентрации общего белка 0.05 мг/мл) вообще не наблюдается снижение концентрации перзоначально адсорбированного белка. При этом же разведении практически нет различий между количеством адсорбированных белков из разбавленной сыворотки и индивидуального раствора.

3. Схема конкурентной адсорбции

Для объяснения полученных результатов была предложена гипотетическая схема конкурентной адсорбции двух белков, отличающихся по молекулярной массе ММ (коэффициенту диффузии О), основанная на ранее разработанной модели энергетически неоднородного взаимодействия поверхности с белком для однокомпонснтных растворов. Предложенная модель учитывает влияние на характер кинетических кривых адсорбции'белков процессов их обмена и замещения на поверхности и основывается на следующих предположениях (рис. 1):

. а) возможность существования белка на поверхности в двух конформа — ционных формах (состояние "1" и "2"), причем в состоянии "1" адсорбированная молекула белка занимает меньшую площадь поверхности, по сравнению с состоянием "2";

б| возможность десорбции молекулы белка из состояния "1";

г.) наличие конкуренции за центры адсорбции на поверхности между двумя белками;

г) наличие обменных процессов п процессов замещения

Молекулы белка адсорбируются на поверхность твердого тела в состояние "1" и с течением времени мог/т претерпеть коиформациоиные изменения и. перейтй в состояние "2", которое является необратимым для процессов десорбции и обмена. Кинетика адсорбции белка-из бинарного раствора опреде —

лястся как конкуренция между белками за свободные центры адсорбции, так и процессами замещения. Замещение может происходить двумя способами: молекула второго белка встраивается в обменные процессы первого белка В состоянии "I" или вытесняет хонформационно измененную молекулу первого белка в состоянии "2", И в том и в другом случае происходит удаление молекул первого белка с поверхности.

Рис 1. Схема конкурентной адсорбции белков.

В общем случае, характер регистрируемой методом ФПВО кинетики адсорбции меченного белка определяется сравнительной интенсивностью двух процессов: во —первых, собственно, конкурентной адсорбцией с немеченым белком за свободные места связывания и, во —вторых, замещением его в адсорбированном состоянии немеченым белком. Получаемая в результате "эксперимента кинетическая кривая является суперпозицией этих процессов. Если роль второго (немеченого) белка сводится, главным образом, к конкуренции за свободные центры адсорбции, то с увеличением его концентрации в растворе адсорбция меченного белка будет убывать, а соответствующие кинетические кривые будут иметь вид монотонных кривых. Когда в конкурентной адсорбции начинают заметную роль играть процессы замещения адсорбированного меченного белка немеченым, то на кинетической кривой обнаруживается локальный максимум, появление и величина которого зависят от концентрации второго белка.

4- Теоретическая интерпретация полученных экспериментальных результатов

В рамках предложенной модели можно сделать следующие выводы по полученным экспериментальным данным: при адсорбции САЧ —ФИТЦ на

ПДМС, ГДТС и кварц из бинарного раствора реализуется случай, когда про—

у

исходит конкуренция за центры адсорбции между молекулами САЧ —ФИТЦ и ГГЧ, в результате чего происходит снижение количества адсорбированного САЧ.

Напротив, при адсорбции ГГЧ —ФИТЦ из бинарных растворов процессы замещения меченного ГТЧ присутствующими в растворе молекулами САЧ игра ют значительную роль в адсорбционных процессах. При концентрациях САЧ в растворе более 0.1 мг/мл для ПДМС, 0.01 мг/мл для ГДТС и 0.5 мг/мл для кварца происходит замещение адсорбированных молекул белка большой молекулярной массы (ГГЧ) молекулами белка меньшей молекулярной массы (САЧ), другими словами данный эффект противоположен эффекту Вромана! Вытеснение адсорбированного ГГЧ —ФИТЦ с поверхности приводит к появлению локального максимума на кинетической кривой.

Рассмотрим более детально процессы адсорбции ГТЧ —ФИТЦ на ПДМС из бинарных растворов. Молекула ГТЧ имеет сложную структуру, что приводит, к, значительным конформационным изменениям в адсорбированном состоянии и (или) к переориентации молекулы из состояния "1" в состояние "2", что характеризуется существенным увеличением 'занимаемых молекулой центров адсорбции. В состоянии "2" молекула ГТЧ занимает 15 центров, молекула САЧ только 1.5. Схема молекулярного механизма адсорбции ГТЧ с учетом переориентации молекул представлена на рис.2.

При низкой концентрации САЧ 0.01 мг/мл его еще достаточно мало п растворе, и на поверхности остается достаточно мест связывания для переориентации молекул ГТЧ в состояние "2", что исключает ГТЧ —ФИТЦ из процессов замещения (б). В диапазоне концентраций САЧ от 0.01 до 0.03 мг/мл роль альбумина сводится к конкуренции с ГГЧ—ФИТЦ за места адсорбции. Чем больше концентрация САЧ, тем меньше центров остается для переориентации • ГТЧ—ФИТЦ, и тем больше данный белок находится в состоянии "1" на' поверхности (в). В результате чего, во —первых, увеличивается поверхностная концентрация ГГЧ, так как каждая молекула занимает только один центр, а не 15, во —вторых, ГТЧ в таком состоянии может вытесняться с поверхности, что и наблюдается при дальнейшем увеличении концентрации САЧ в растворе..На

кинетических кривых адсорбции появляется максимум -с одновременным снижением количества адсорбированного ГГЧ—ФИТЦ (г).

) ГЯн? У 9тг?

№

99 >9?У >99?

Рис.2 Схема адсорбция ГТЧ (молекула "Б") в присутствии САЧ (молекула "А") в соответствии с экспериментальными кинетическими кривыми: а — адсорбция ГТЧ из однокомпонентиого раствора преимущественно в состоянии "2"; б — конкуренция между молекулами САЧ и ГГЧ за свободные центры адсорбции; в — адсорбция ГТЧ преимущественно в состояние "1"; г — замещение адсорбированного ГГЧ в состоянии "1" молекулами САЧ из раствора.

Для подтверждения предложенной схемы были проведены исследования десорбции молекул ГТЧ—ФИТЦ с поверхности ПДМС в фосфатный буфер после предварительной адсорбции (концентрация ГГЧ —ФИТЦ 0.1 мг/мл), что соответствует случаю а) предложенной схемы, и после адсорбции из бинарного раствора, содержащего меченный (0.1 мг/мл) ГТЧ и немеченый (0.3 мг/мл) САЧ, что соответствует случаю г).

Тот факт, что десорбция ГТЧ —ФИТЦ после его предадсорбции из индивидуального раствора незначительна —7 % (таблица 1), свидетельствует о необратимости адсорбция Оелха оря данных условиях эксперимента, то есть в терминах предложенной! модели, молекулы ГТЧ находятся главным образом в состоянии "2".

Таблица 1. Сравнительные характеристика десорбции ГТЧ —Ф1ТГЦ мг/мл после предадсорбции на поверхность ПДМС из индивидуального раствора и из смеси с САЧ С™ =0.3 мг/мл.

Предадсорбция" ^ГЧ-ФИТЩадс при 1= 800 с перед началом десорбции, мкг/ см2 через 250 сек десорбции, мкг/ см2 Снижение [ГГЧ-ФИТЦ]адс %

Индивидуальный раствор ГГЧ-ФИТЦ 0.44 ± 0.07 0.41 ± 0.07 7%

Бинарный раствор с САЧ . [САЧ] =0.3 мг/мл 0.13 ± 0.02 0.08 ± 0.01 35%

Во втором случае, молекулы достаточно легко десорбируются с поверхности — 35 % (таблица 1), особенно на начальных стадиях, т.е. действительно значительная часть белка находится и обратимо адсорбированном состоянии — состоянии "1" .

Аналогичные процессы происходят и на ГДТС. Только переориентация молекул ГТЧ происходит уже при 0.01 мг/мл САЧ.

Поверхность ГДТС представляет собой монослой с алкильной цепью — (СН2),5-СН3. ПДМС также имеет СН3- группу на конце. САЧ активно вытесняет ГТЧ на обеих поверхностях, о чем свидетельствует наличие локальных максимумов на кинетиках адсорбции (рис.п2,п4). Было сделано предположение об аффинности САЧ к СН3— группам. Согласно литературным данным, при адсорбции на такую поверхность САЧ последовательно образует несколько гидрофобных "карманов" и необратимо связывается с поверхностью. В отличие от кварца, где после переориентации САЧ занимает 1.5 центра, при образовании гидрофобии* карманов САЧ занимает существенно большую площадь поверхности. Это предположение было подтверждено экспериментами по десорбции с поверхности ГДТС и кварца, который не обладает специфической аффиностью к САЧ. Для ГДТС быХо обнаружено, что при большем времени

предадсорбции 1200 секунд десорбция САЧ на 20 % ниже и происходит с меньшей скоростью, чем при предадсорбции 200 секунд (таблица 2).

Таблица 2. Параметры десорбция САЧ —ФИТЦ с поверхности кварца и ГДТС*

Поверхность ГДТС ГДТС Кварц Кварц

Время предадсорбции, с t=200 t** 1200 1=200 1=1000

(САЧ-ФИТЦ1.Д,. перед 12.7// 12.5// 42.8// 79.6//

началом десорбции, иг/ см1 1.93 1.90 6.48 12.07

//10~4мкмоль/см1

Время десорбции, с 1700 1700 1000 1000

[САЧ-ФИТЦ]^ после

десорбции, иг/ см2// 6.7// 9.2// 19.3// 39.5//

10~4 мкмоль/см1 0.99 1.40 2.92 5.98

Д (САЧ), % 52% 73% 45% 49%

Скорость десорбции. 2140-е 7-10-« l.OS'lO"* 1.49-10" 4

мкг/(с* см2)

* Максимальная ошибка измерений составляла 1S %.

Эксперименты по десорбции -с ГДТС свидетельствует о том, что САЧ образует арочные связи с поверхностью и переходит в необратимо адсорбированную форму. Для кварца различие в десорбции при разных временах предадсорбции альбумина не было обнаружено. Наличие снижения количества адсорбированного САЧ при адсорбции из индивидуального раствора на ГДТС связано с вытеснением соседних молекул при образовании гидрофобных "карманов" САЧ.

Аналогичные эксперименты по десорбции для ГГЧ — ФИТЦ показали, что поверхность ГДТС не имеет специфических центров адсорбции для ГГЧ, так как после 170 секунд предадсорбции ГГЧ, в отличие от САЧ (таблица 2), полностью десорбяруется с поверхности (таблица 3). После 1400 секунд предадсорбции, когда, по —видимому, происходит переориентация ГГЧ, приводящая к увеличению количества необратимо адсорбированного белка, десорбнруется лишь 20

% (таблица 3). Для кварца влияние времени предадсорбции на параметры десорбции ГТЧ —ФИТЦ не обнаружено.

Таблица 3. Параметры десорбция ГГЧ—ФИТЦ с поверхности кварца а ГДТС*

Поверхность ГДТС ГДТС Кварц Квари

Время предадсорбции, с Г= 170 1=1400 1= 150 1>=1000

(ГГЧ-ФИТЦ]ЖДС перед нача- 26// 26// 106// 138//

лом десорбции, нг/ см1// 1.7 1.7 7.1 9.2

10~4 мхмоль/см2

Время десорбции, с 1200 1200 1000 1000

|ГГЧ -ФИТЩад. после де-

сорбции, нг/ см2 0.0// 20.8// 42.7// 73.2//

/АЮ~* мкмоль/см3 0.0 1.4 2.8 4.9

А |ГГЧ], % 0% 80% 41%

Скорость десорбции 106.5-10-® 5.38'10-в 9.60-10"4 7.87'Ю-4

мкг/(с* см3)

* Максимальная ошибка измерений составляла 16 %.

Анализ исследования конкурентной адсорбции САЧ и ГГЧ и > систем, содержащих ФГЧ, не подтвердило предположение, выдвинутое ранее рядом авторов, о том, что процесс вытеснения белков с поверхности из многокомпонентных растворов носит строго последовательный характер. Предполагалось, что из плазмы сначала адсорбируется САЧ, имеющий наибольшую концентрацию и коэффициент диффузии, затем САЧ замещается ГГЧ, который в последствие вытесняется ФГЧ.

Исследование систем САЧ- ФИТЦ с ФГЧ и САЧ-ФИТЦ с ГГЧ и ФГЧ показали, что такая последовательность событий необязательна. САтт вытесняется фибриногеном и в отсутствии в растворе гаммаглобулнна (рис.п8). При адсорбции САЧ-ФИТЦ из бинарного раствора с ГГЧ. как уже отмечалось, вытеснения на кинетических кривых адсорбции не наблюдалось. Происходило лишь последовательное снижение поверхностной концентрации САЧ-ФИТЦ, то есть определяющим являлась конкуренция белков за цептры связывания. При

наличии ФГЧ в среде на кинетических кривых появлялся локальный максимум, который свидетельствует о замещении САЧ — ФИТЦ на поверхности кварца молекулами фибриногена.

Как показали исследования, среди исследуемых белков молекулы ГТЧ оказались наиболее вытесняемыми с поверхности кварца. Фибриноген вытесняет ГТЧ —ФИТЦ при более низкой концентрации в растворе и гораздо эффективней, чем САЧ. В данном случае ФГЧ участвует именно в процессе вы — теснения ГТЧ —ФИТЦ с ■ поверхности, а не конкуренции, так как "обладает меньшей диффузионной способностью. В результате для ГТЧ —ФИТЦ не наблюдается переориентации и, следовательно, роста поверхностной концентрации с повышением объемной концентрации ФГЧ в растворе от 0.05 до 0.2 мг/мл.

Результаты исследований адсорбции САЧ и ГГЧ на поверхность кварца из плазмы и сыворотки также подтвердили наибольшую вытесняемостъ ГГЧ. В процессах замещения САЧ и ГГЧ, конкуренции за центры адсорбции участвуют и др)тие белки плазмы и сыворотки крови, о чем свидетельствуют более ярко выраженные лохальные максимумы на кинетиках адсорбции. Однако наиболее, активным из всех белков плазмы крови оказался ФГЧ. В растворе сыворотки эффект вытеснения САЧ и ГТЧ с поверхности кварца гораздо ниже по сравнению с плазмой, а при сильном разведении сыворотки (1:1700, рис.п13,п14) вообще отсутствует.

Для математического описания процессов конкурентной адсорбции белков (см.рис.1) предложена система дифференциальных уравнений, учитывающая конкуренцию, конформационные изменения адсорбированных молекул белка, десорбцию и замещение на поверхности. К сожалению, из — за сложности ме — ханизма конкурентной адсорбции белков задача является многопараметриче — ской, и в настоящее время решение системы найти не удается. Строгое описание полученных экспериментальных результатов требует создание нового математического .подхода и является следующим шагом исследований, предполагающим теоретическое моделирование кинетики процессов адсорбции из многокомпонентных белковых растворов.

Выводы

1. Доказала принципиальная возможность исследовать методом ФПВО конкурентную адсорбцию белков на поверхность кварца к полимерных материалов из модельных растворов, разбавленной сыворотки и плазмы. •

2. При адсорбции САЧ и ГГЧ из бинарных растворов на поверхность кварца, ПДМС и ГДТС обнаружен эффект, противоположный эффекту Вромана, а именно, при определенных соотношениях концентраций САЧ и ГГЧ происходит замещение адсорбированных молекул белка большой молекулярной массы (ГГЧ) молекулами белка с меньшей молекулярной массой (САЧ).

3. В экспериментах по адсорбции и десорбции белков для бинарных растворов подтверждено наличие аффинности САЧ к поверхности ПДМС и к СНз — концевой группе углеводородной цепи, иммобилизованной на поверхности стекла. В отличие от САЧ, адсорбция ГГЧ на ГДТС характеризуется отсутствием необратимо адсорбированных молекул белка на начальной стадии адсорбции.

4. Сравнительный анализ параметров кинетических кривых адсорбции САЧ - ФИТЦ и ГГЧ - ФИТЦ из бинарных а тройных систем с ФГЧ показал возможность вытеснения адсорбированного иа поверхности САЧ непосредственно ФГЧ без промежуточного участия ГГЧ.

5. Показано, что при конкурентной адсорбции белков иа поверхность кварца из многокомпонентных белковых сред ФГЧ, по сравнений с Другими белками крови, играет наиболее активную роль в процессе вытеснения адсорбированных САЧ и ГГЧ.

6. Предложена схема конкурентной адсорбции двух белков с различной молекулярной массой, объясняющая появление локальных максимумов иа кинетических кривых адсорбции белков из бинарных и многокомпонентных белковых растворов.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. V.l. Sevastianov, Y.S. Tremsina, R.C. Eberhart, S.W. Kim "Effect of Protein Competition on Surface Adsorption—Density Parameters of Polymer —Protein Interfaces" / ed. T.Horbett, J.Brash, ASC Symposium Series 602, Proteins at Interfaces , American Chemical Society, Washington, 14, cc.195-209 (1995).

2. Ю.С. Тремсина, В.И. Севастьянов. "Конкурентная адсорбция альбумина и глобулина человека из модельного раствора на поверхность полидиметилси ~ локсана" / Биосовместимосгь, том 3, стр. 115— 123 (1995).

3. Yu.S. Tremsina, V.l. Sevastianov "Conlpatitive adsorption of human albumin and globulin onto polydimethylsiloxane from a model solution" / J. Biomaterial — living System Interactions, Vol.3, № 3 - 4, 115-123 (1995).

4. В.И. Севастьянов, И.В. Друыляк, K.H. Котов, Ю.С. Тремсина, Р. Эберхарт, С В. .Ким "Влияние цредадсорбцин белков на адсорбцию альбумина на поверхность гемосовместимых полимеров" / Биосовместимость, том 2, №2, стр. 59 — 69 (1994),

5. V.l. Sevastianov, I.V. Drushlyai., K.N. Kotov, ,Y.S. Tremsina, R.C. Eberhart,. S.W. Kim "Effect of Protein Preadsorptlon Onto Albumin Adsorption on Blood Compatible •Polymers on. Quartz" / J. Biomaterial—living System Interactions, Vol.2, №2, 53-63 (1994).

6. V.l. Sevastianov, I.V. Durshlyak, Yu.S. Tremsina / ASAIO Cardiovascular Science' and Technology Conference, Washington, C..94 (1994).

ПРИЛОЖЕНИЕ. Экспериментальные кинетические кривые

конкурентной адсорбции белков.

Рис п1. Адсорбция САЧ-ФИТЦ С/*4 " 0.1 мг/мл иа поверхность полидиметилсилаксан из индивидуального раствора (кривая I) и из смеси с ГТЧ с концентр»циями: 2 - Счггч - 0 01 мг/мл; 3 - С,'™ - 0.02 мг/мл; Ч - С,ггч - 0.1 мг/мл ; 5 - Суггч - 0.2 мг/мл .

I,««

Рис п2 Адсорбция ГГЧ-ФИТЦ С,1"™ - 0.1 мг/мл яа поверхность палядиметнлснлахсана из индивидуального раствора (кривая 1) к из смеси с САЧ с концентрациями: 2 - СуСАЧ - 0.01 мг/мл; 3 - С^4 « 0.02 мг/мл ; 4 - СуСАЧ = 0 03 мг/мл ; 5 - СуСАЧ - 0.1 мг/мл ; в - СуСлч » 0.2 мг/мл ; 7 - СуСАЧ - 0.3 мг/мл .

1, сек

Рис пЗ. Адсорбция САЧ-ФИТЦ СуСАЧ = 0.1 мг/мл на поверхность гексадецилтрихлорсилана из индивидуального раствора (кривая 1) и из смеси с ГГЧ с концентрациями:

2 - СуГГЧ = 0.01 мг/мл ; 3 - С/™ = 0.05 мг/мл ; 4 - С/1"4 «= 0.1 мг/мл ; 5 - С/1"4 0.3 мг/мл .

Ц сек

Рис п4. Адсорбция ГГЧ-ФИТЦ С,1™ = 0.1 мг/мл на поверхность гексадецилтрихлорсилана из индивидуального раствора (кривая 1) и кз смеси с САЧ с концентрациями:

2 - Суслч = 0.01 мг/мл ; 3 - СУСАЧ = 0.05 мг/мл ; 4 - СуСА4 •= 0.1 мг/мл ; 5 - СуСАЧ = 0.2 мг/мл ; 6 - СуСАЧ = 0.3 мг/мл .

Рис п5. Адсорбция САЧ-ФИТЦ СуСАЧ «»0.1 мг/мл на поверхность кварца из индивидуального раствора (хривая 1) и из смеси с ГГЧ с концентрациями: 2 - Суггч - 0.01 мг/мл ; 3 • С/™.» 0.02 мг/мл ; 4 - С/™ - 0.1 мг/мл ; 5 - С/™ « 0.2 мг/мл; б - С»1™ - 0.3 мг/мл.

Рис пб. Адсорбция ГГЧ-ФИТТД Су"4 - 0.1 мг/мл на поверхность кварца из индивидуального раствора (кривая 1) а из смеси с САЧ с концентрациями: 2 - Су"4 » 0.01 мг/мл ; 3 - Суслч - 0.05 кг/мл ; 4 - Су"4 = 0.1 мг/мл ; 5 - СуСАЧ « 0.2 мг/мл; в - Су0*4 = 0.3 мг/мл ; 7 - СуСАЧ » 05 мг/мл

"Рис п8. Адсорбция САЧ-ФИТЦ С,САЧ = 0.1 мг/мл на поверхность кварца из бинарных растворов с ФГЧ с концентрациями: кривая 1 - Су0™ - 0.02 мг/мл ; кривая 2 - Суфгч '0.04 мг/мл .

I, сек

Рис п7. Адсорбция САЧ-ФШТД с концентрацией сл,САЧ"фити = 0.1 мг/мл на поверхность кварца из тройных растворов, содержащих ГГЧ с концентрацией СуГГЧ = 0.02 мг/мл н ФГЧ с концентрациями: кривая 1 - Суфгч = 0.02 мг/мл ; кривая 2 - С,ФГЧ = 0.04 мг/мл.

Рис п9. Адсорбция ГТЧ-ФИТЦ с концентрацией Стггч"<!м'ггг( => 0.1 мг/мл на поверхность кварца из тройных растворов, содержащих САЧ с концентрацией С,слч 0.05 мг/ма в ФГЧ с концентрациями: кривая 1 - С*ФГЧ - 0.05 мг/мл ; кривая 2 - С»ФГЧ - 0.1 мг/мл.

t, сок

Рис 1(10. Адсорбция ГТЧ-ФИТЦ С,п"ч-фитЧ - 0.1 мг/мл яа

поверхность кварца из бинарных растворов с ФГЧ с

концентрациями:

кривая 1 - С»фгч - 0.05 мг/мл ;

кривая 2 - СуФГЧ » 0.1 мг/мл;

кривая 3 - Су«" - 0.2 мг/мл.

0,04 1

0,03 1 •

t

й s 0,02 2

ó 0,01 3

о.со с

200 400 600 ООО 1000 1, сек 1200 1400 1600 1800

Рис tili. Адсорбция САЧиз растворов разбавлений плазмы на Поверхность аморфного кварца (СУСАЧ"ФИТ1* = 0.1 мг/мл): кривая 1 - разведение 1:1240 С¡¡ц - 0.05 мг/мл ; кривая 2 - разведение 1:620 Со6 = 0.1 мг/мл ; кривая 3 - разведение 1:310 СсЛ — 0.2 мг/мл .

Рис п12. Адсорбция ГГЧ из растворов разбавлений плазмы на

поверхность аморфного кварца (с/гч-фитц = 0.1 мг/мл):

кривая 1 - разведение 1:1240 С0а ~ 0 05 мг/мл ;

кривая 2 - разведение 1:620 С^ - 0.1 мг/мл ;

кривая 3 - разведение 1:310 Сов = 0.2 мг/мл .

кривая 4 - разведение 1:200 С0б — 0.31 мг/мл .

1,0«

Рис п!3. Адсорбция САЧ из растворов разбавлений сыворотки на поверхность аморфного кварца ^Слч-фитц ^ о. 1 мг/ил): кривая I • разведение 1:1700 Сов ™ 0.05 мг/мл; кривая 2 • разведение 1:850 Сов «■ 0.1 мг/мл ; кривая 3 - разведение 1:425 Сов " 0-2 мг/мл .

I сек

Рис п!4. Адсорбция ГГЧ нз растворов разбавлений сыворотки на

поверхность аморфного кварца (СУГГЧ'ФИТЧ »« 0.1 мг/мл):

кривая 1 - разведение 1:1700 С,л — 0.05 мг/мл.;

кривая 2 - разведение 1:850 С^ " 0.1 мг/ил ;

кривая 3 - разведение 1:425 С^ «• 0.2 мг/мл .

кривая 4 - раззедение 1:212 С^ «» 0.31 мг/мл .