Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адсорбция альбумина человека на поверхность биоматериалов с различными физико-химическими и гемосовместимыми свойствами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Адсорбция альбумина человека на поверхность биоматериалов с различными физико-химическими и гемосовместимыми свойствами"

РГ8 Од

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

Друшляк Ирина Викторовна

АДСОРБЦИЯ АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА НА ПОВЕРХНОСТЬ БИОМАТЕРИАЛОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМИ И ГЕ-МОСОВМЕСТИМЫМИ СВОЙСТВАМИ (03.00.02 - Биофизика)

Автореферат

диссертация на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в НИИ трансплантологии и искусственных органов

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Севастьянов Виктор Иванович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Новикова Светлана Петровна, кандидат физико-математических наук, доцент Заико Валерий Михайлович.

Ведущая организация:

НИИ Физических проблем, Государственный научный центр РФ.

Защита состоится "-47' 1997 г. в/^час.££мин.

на заседании Специализированного совета К.063.91.10. при Московском Физико-Техничесхом институте по адресу: 141 700, Московская область, г. Долгопрудный, Институтский переулок, д.9, МФТИ.

Автореферат разослан 1997 г.

Учёный секретарь

Специализированного учёного совета кандидат физико-математических наук

КиреевВ.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из фундаментальных вопросов в области создания медицинских изделий, контактирующих с кровью (искусственное сердце, аппараты искусственного и вспомогательного кровообращения, сосудистые протезы и т.д.) является изучение взаимосвязи между физико-химическими и гемосовместимыми свойствами биоматериалов.

Известно, что адсорбция белков является первым этапом взаимодействия крови с чужеродной поверхностью. Хотя большинство исследований гемосовмести-мых свойств биоматериалов связано с выяснением процессов образования адсорбционного белкового слоя и изменения его свойств со временем, до настоящего времени данные о влиянии физико-химических свойств материалов (химический состав, аморфность и кристалличность структуры, гидрофильность или гидрофобности поверхности и др.) на характер адсорбционно-десорбционных процессов белков достаточно противоречивы. Так, нет единого мнения о химическом составе, структуре и энергетических и адсорбционных свойствах материала, которые бы обеспечивали необходимую гемосовместимость изделия.

К моменту начала данной работы в Центре по исследованию гемосовмести-мых биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов был разработан метод флюоресценции полного внутреннего отражения (ФПВО), позволяющий в условиях потока и реальном масштабе времени исследовать кинетику адсорбции белков на поверхность различных материалов. Информативность метода ФПВО и предложенной модели энергетически неоднородного взаимодействия поверхности с белком была доказана в серии работ на примере кварца, полидиметилсилоксана и двух гемо-совместимых полимерных материалов: гидрофобного силоксана и гидрофильного мультиблоксополимера. Однако, из-за малого количества исследованных поверхностей вопрос о сравнительной роли физико-химических свойств материалов в их гемо-совместимости на стадии адсорбции белков остался не решенным.

Целью работы явилось исследование методом ФПВО взаимосвязи адсорбционных, физико-химических и гемосовместимых свойств материалов медицинского назначения.

Задачи исследования. Для достижения указанной цели были поставлены следующие основные задачи:

- провести сравнительный анализ адсорбционных и гемосовместимых свойств полиэфируретавов, отличающихся степенью гидрофилыюсти поверхности;

- исследовать влияние кристаллической и аморфпой структуры материалов на их адсорбционные и гемосовместимые свойства;

- исследовать влияние пассивации белками крови человека поверхности гемосовместимых материалов на их адсорбционно-энергетические свойства.

Научная новизна

1. Показано, что вероятность гемосовместимости гидрофильных поверхностей выше, по сравнению с гидрофобными, что связано со значительно меньшими изменениями адсорбционных характеристик гидрофильных материалов в первые минуты контакта с кровью.

2. Доказано, что независимо от физико-химических свойств материала, повышение его гемосовместимости в результате предварительной альбуминизации поверхности сопровождается снижением количества центров адсорбции и одновременным увеличением доли центров с низкими значениями констант скоростей адсорбции.

3. Доказано, что сближения адсорбционно-энергетических характеристик поверхности материалов с различной химической природой, структурой и гидрофильно-стыо после предадсорбции различными белками зависит от состава и концентрации пассивирующего раствора белков.

4. Показано, что плоскость монокристалла лейкосанфира с максимальным значением свободной поверхностной энергии (ус) адсорбирует большее количество белков плазмы крови и тромбоцитов по сравнению с плоскостью с минимальным значением ус.

5. Установлено, что изменяя электронную структуру и состав аморфных угле-родсодержащих покрытий, можно существенно варьировать их адсорбционные и гемосовместимые свойства.

Практическая значимость.

Доказана правомерность использовать распределение плотности центров адсорбции относительно констант скоростей адсорбции белков в качестве одного из критериев гемосовместимости в условиях in vitro материалов различной природы.

Установлено, что проведение пассивации белком поверхноста медицинских изделий в условиях близких к тем, которые реализуются при контакте материала с кровью (обработка поверхности сывороткой, плазмой крови, повышение концентрации белков в модельных растворах), значительно больше увеличивает их гемосовме-

стимость на стадии адсорбции белков, по сравнению с обработкой поверхности раствором альбумина.

Показано, что создание гемосовместнмых гидрофильных материалов медицинского назначения является более перспективным направлением, по сравнению с разработкой гемосовместнмых гидрофобных материалов.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на конференции Американского общества искусственных органов (ASAIO) «Cardiovascular Science and Technology», Вашингтон, США, декабрь 1994; семинаре Центра по исследованию гемосовместнмых биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов, Москва, апрель 1997.

Публикации.

Основные результаты диссертации опубликованы в б печатных работах в отечественных и зарубежных журналах.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, выводов и практических рекомендаций. Изложена на W2 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков, 8 таблиц и список цитированной литературы из 120 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 .Материалы и методы

1.1. Материалы и реагенты. Объектами исследования были выбраны аморфный кварц (КУ-1, 14-й класс шероховатости); две пластины из монокристалла AI2O3 с ориентацией [0001] и [1011] и степенью шероховатости 3,6-4,0 А, Российский федеральный ядерный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной физики, г. Саров; гемосовместимый гидрофильный мультиблоксополи-мер биомер-полиэтиленоксид-гепарин (БПГ), Центр химических веществ с контролируемым действием, Университет штата Юта, Солт-Лейк-Сити, США; гемосовместимый гидрофобный поливинилметилсилоксан-метил-1-этанол силоксаиа ("гидроксилированный" силоксан, ГС), Юго-Западный Медицинский центр, Техасский университет, Даллас, США; гемосовместимые сегментирование полиуретаны (СПУ), содержащих гидрофильный пояиоксиэтиленгликол (СПУ/ПЭГ) или гидрофобный полидиметилсилоксандиол (СПУ/ПДМС), НПО "Полимерсинтез", г. Владимир; алмазоподобное аморфное углеродное покрытие на кварцевых подложках, Московский Государственный университет; аморфное карбиновое покрытие на кварцевых

пластинках, Чебоксарский Государственный университет; азотсодержащие аморфное углеродные покрытия на кварцевых пластинках при соотношении углерода к азоту равное 1:1, 3:1, 1:3, Московский авиационно-технолошческий университет.

Исследовали кинетику адсорбция сывороточного альбумина человека (САЧ) (лиоф., фракция 5, Sigma, США), меченого флюоресдеин изотиоцианатом (ФИТЦ, изомер 1, Serva, Швеция) согласно стандартной методике. Уровень мечения был равным 7-10 молекул красителя на 10 молекул белка.

Для пассивации исследуемых поверхностей использовали растворы у-глобулина человека (ГГЧ, "Serva", Щвеция); лактоферрина человека (ЛФ, "Serva", Швеция); белки плазмы (БП) крови человека, Coagulation Control, Level I, "Sigma", США.

1.2. Методы. Измерение адсорбции САЧ-ФИТЦ методом ФПВО из раствора фосфатного буфера (ФБ) при рН=7,35 и температуре 250С проводили на субнаносе-кундном спектрофлюориметре CJIM-4800C (SLM Instrument, Urbana, IL, США) в тер-мостатируемой кювете ФПВО с термостатируемой платформой и юстировочным столиком в проточном режиме при скорости сдвига 4800 с '.

Для калибровка флюоресцентного сигнала сопоставляли амплитуду флюо-

131

ресцентного сигнала с интенсивностью гамма-излучения САЧ, меченого I.

Спектрофотометрический метод применяли для определения концентрации белка и уровня его мечения.

Процедура пассивации заключалась в предадсорбции в условиях потока в ячейке ФПВО немеченых белков из раствора на поверхность исследуемого материала в течение 10 мин. с последующей 10-минутной десорбцией в ФБ слабосвязанных с поверхностью молекул.

Для теоретического анализа экспериментальных результатов использовали ранее разработанную модель энергетически неоднородного взаимодействия поверхности с белком. При определенных допущениях модель позволяет по кинетическим кривым адсорбции вычислять вид распределения плотности центров адсорбции (р) по логарифму константы скорости адсорбции (ка) по формуле:

р(ка) =(l/(RT))dC

где Сщс - количество адсорбированного белка, R - универсальная газовая постоянная, Т - абсолютная температура, С0 - концентрация белка в растворе.

Форма кривых распределения центров адсорбции в зависимости от вида кинетических кривых. Вид кинетических зависимостей исследован в трёх типах координат:

1. Спрямляемость адсорбционных кривых в координатах Садс -*- ln(t) соответствует логарифмическому характеру адсорбции. При лаком характере адсорбции вид кривой распределения будит прямоугольным:

р= р„= Const

2. Спрямляемость в координатах ln((Cuc""c - С.деУС.дс""') -*-1 свидетельствует о Лэнгмюровском характере адсорбции. При таком характере адсорбции вид кривой распределения будет близок к гауссовому.

р= p0exp(-Inka/k,cp)2/n)

3. Спрямляемость в координатах 1п(Саяс) -'- ln(t) свидетельствует о Фрейндли-ховском характере адсорбции - C,sc=At"" При таком характере адсорбции вид кривой распределения будит носить экспоненциальный характер:

- In(*ra )/л

Р = Рйе

Для оценки гемосовместимости использовали следующие стандартные методы in vitro:

- методом сканирующей электронной микроскопии (Jeol JSM Т-ЗЗО, Япония) анализировали поверхность образцов до и после инкубации (30 мин, 37оС) с тромбо-цигарной плазмой человека (5* 108 клеток/мл) без контакта с воздухом;

- фотоколориметрический метод для определения степени активации комплемента сыворотки человека поверхностью материала по изменению ее гемолитической активности (время инкубации 60 мин., 37°С). Количественной критерий - относительная константа скорости индуцированной активации комплимента:

(кикд)

КинД

(к™Гвл ^Аз")

(ки„д)' =------------------, i=o6p„ сганд, cm'V,

S«t

где t1/2', t1/2k - время полулизиса эритроцитов барана комплементом сыворотки после инкубации с образцом и в контрольной кювете (без образца) соответственно, сек; (к„„д)°6р, (к,вд )ст"ш - константы скорости индуцированной активации системы ком-

племента образца и стандарта, соответственно. В качестве стандарта использовали поверхность гидратцеллюлозной мембраны Купрофана. Чем меньше Кивд, тем больше вероятность гсмосовместимости тестируемого материала;

- радиоизотопный метод для измерения количества адгезированных тромбоцитов, меченных Cr, на поверхности материала (время инкубации 60 мин., 37°С).

Количественный критерий - относительный показатель адгезированных тромбоцитов (ОПАТ): OnAT=N06p/N,tlKT, где N0ep , Nlf>1„ - у- активность тестируемого и контрольного образцов за время инкубации. В качестве контроля было выбрано стекло. Чем меньше значение ОПАТ, пропорциональное количеству адгезированных тромбоцитов, тем выше вероятность гемосовместимости данной поверхности на стадии адгезии тромбоцитов;

- спектрофотометрический метод для определение гемолиза, индуцированного водным экстрактом из образца.

Количественный критерий - относительное значение гемолиза (аг) в %, определяем по следующей формуле:

аг = (D„6p -1),) / (Dioo - DK), V= 545 iim

где Dogp- оптическая плотность пробы с водным экстрактом из образца; D. -оптическая плотность после инкубации крови с физиологическим раствором (положительный контроль) - ' . Dioo - оптическая плотность

крови после 100% гемолиза дистиллированной водой (отрицательный контроль).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Адсорбционные свойства плёнок СПУ с различной гидрофильностью поверхности. Для-подтверждения определяющей роли энергетических свойств поверхности в характере адсорбционно-десорбционных процессов белков плазмы крови были выбраны образцы из одного класса полиуретановых эласгомерных материалов медицинского назначения, отличающихся только природой мягкого блока (ПЭГ или ПДМС), но имеющих различную гидрофильность поверхности.

Значения углов смачивания по воде (85±4)° - для СПУ/ПЭГ и (103±1)° - для СГГУ/ПДМС. В дальнейшем, СПУ/ПЭГ мы будем называть гидрофильным, а СПУ/ПДМС - гидрофобным полиуретаном.

Для доказательства гемосовместимости пленок СПУ/ПЭГ и СПУ/ПДМС были использованы методы определение гемолитической активности образцов по относительной величине гемолиза (а,, %) и количества адгезированных тромбоцитов (по ве-

личине ОПАТ). Полученные значения ОПАТ и а для поверхностей удовлетворяли критериям отбора гемосовместимых материалов по данным параметрам: ОПАТ <1,00 ±0,15 и аг < 2,0 ± 0,2%. Для СПУ/ПДМС аг = 0.10, а для СПУ/ПЭГ аг=0.34. Однако заметим, что по критерию ОПАТ гидрофобная поверхность СПУ/ПДМС (ОПАТ=1,0±0,20) уступает по гемосовмесгимости гидрофильному СПУ/ПЭГ (ОПАТ 0,60±0,12) при отсутствии гемолитической активности в обоих случаях.

Для гидрофобного СПУ/ПДМС (рис. 1) и гидрофильного СПУ/ПЭГ (рис. 2) с

САЧ

увеличением концентрации САЧ в растворе (С0 ) наблюдается рост поверхностной

сач

концентрации САЧ (С ). Однако, при одних и тех же концентраций САЧ в растворе на гидрофильной поверхности СПУ/ПЭГ адсорбируется меньше белка, чем на гидрофобном СПУ/ПДМС. Это соответствует ранее полупенным данным о том, что на гидрофильной поверхности адсорбируется меньше белка, чем на гидрофобной.

Теоретические кривые распределения плотности центров адсорбции системы САЧ/поверхносгь от константы скорости адсорбции, построенные из соответствующих

САЧ

кинетических кривых, представлены на рис. 3 и 4. Видно, что уменьшение С0 при-

САЧ

водит к снижению значений С>дс , а увеличение - вызывает сдвиг распределений в сторону меньших констант скоростей адсорбции.

Вид распределения гидрофильной поверхности СПУ/ПЭГ характеризуется низкими значениями к и низкой плотностью центров адсорбции, а форма распределения близка к экспоненциальному распределению. Напротив, гидрофобная поверхность СПУ/ПДМС имеет узкое распределение по константам скорости адсорбции в сочетании с большими значениями к и большой плотностью центров адсорбции. Форма рас-

адс

пределения близка к распределению Гаусса в полулогарифмических координатах.

Предварительная адсорбция белка на поверхность СПУ приводит к уменьшению количества адсорбированного САЧ, по сравнению с адсорбцией на исходные поверхности СПУ. Соответствующие теоретические кривые распределения плотности центров адсорбции САЧ от константы скорости адсорбции для пассивированных раствором САЧ поверхностей шдрофильного СПУ/ПЭГ и гидрофобного СПУ/ПДМС представлены на рис. 5 и 6. Следует заметить, что не наблюдается существенного сдвига распределения по к"де для альбуминизированной гидрофильной поверхности

Ста, мкг/сьй

I, сек

Рис. 1. Кинетические кривые адсорбции САЧ на поверхности СПУ/ПДМС. С=1,0 мг/мл (кривая 1), 0,1 мг/мл (кривая 2), 0,01 мг/мл (криваяЗ).

Спов. МКГ/СМ2

сек

Рис. 2. Кинетические кривые адсорбции САЧ на поверхности СПУ/ПЭГ. С=1,0 мг/мл (кризая 1), 0,1 мг/мл (кривая 2), 0,01 мг/мл (кривая 3).

рЯТ, МКГ/ш2

Кадс, мл/мг-с

Рис. 3. Кривые распределения плотности центров адсорбции для САМ по эффективной константе скорости адсорбции на поверхности СПУ/ПДМС. 01,0 мг/мл (кривая 1), 0,1 мг/мл (кривая 2), 0,01 мг/мл (кривая 3).

рНТ, мкг/см2

Кадс. мл/мг-с

Рис. 4 . Кривые распределения плотности центров адсорбции для САЧ по эффективной константе скорости адсорбции на поверхности СПУ/ПЭГ. С=1,0 мг/мл (кривая 1), 0,1 мг/мл (кривая 2), 0,01 мг/мл (кривая 3).

рЯТ, МКГ/СМ2

«аде. мл/мг.с

Рис. 5 . Кривые распределения плотности центров адсорбции по эффективной константе скорости адсорбции на исходную (криаая 1) и пассивированную САЧ (кривая 2) поверхность СПУ/ПДМС.

рЯТ, мкг/см2

к адС1 мл/мг-с

Рис. 6 . Кривые распределения плотности центров адсорбции по эффективной константе спорости адсорбции на исходную (кривая 1) и пассивированную САЧ (кривая 2) поверхность СПУ/ПЭГ.

СГГУ/ПЭГ по сравнению с исходной, в отличие от гидрофобной поверхности СПУ/ПДМС. Кривые распределения центров адсорбции альбуминизированной СПУ/ПДМС смещены влево относительно аналогичного распределения для исходных поверхностей. Таким образом, предварительная альбуминизация поверхности делает гидрофобные (СПУ/ПДМС) и гидрофильные (СПУ/ПЭГ) полимерные материалы практически одинаковыми относительно распределения плотности центров адсорбции по кда, существенно уменьшая количество центров адсорбции и значения кадс. Однако, изменение адсорбционных параметров гидрофильного СПУ в результате предварительной пассивации его поверхности белком выражено более ярко, по сравнению с гидрофобным ПУ, что соответствует известным данным для гемосовместимых материалов различной природы.

2. Влияние предадсорбции белков на адсорбцию альбумина на поверхность гемосовместимых полимеров и кварца. Целью данной части исследования явился сравнительный анализ изменений адсорбционных параметров кварца, БПГ и ГС относительно альбумина после пассивации их поверхности растворами САЧ, ГГЧ, ЛФ и плазмы крови.

Рассчитанные по полученным кривым кинетики адсорбции распределения центров адсорбции относительно к1дс на кварце, БПГ и ГС изображены на рис. 7, 8 и 9. Для пассивированных растворами САЧ, смесью САЧ и ГГЧ или плазмы крови поверхностей кварца (рис. 7) сохраняется "прямоугольное распределение", но с заметным снижением плотности центров адсорбции, по сравнению с исходной поверхностью. Напротив, пассивация кварца растворами ГТЧ и ЛФ заметно изменяет форму распределения с "прямоугольного" (исходная поверхность) на "нормальное" (при пассивации ГГЧ) и экспоненциальное (при пассивации ЛФ). В то же время небольшое уменьшение ширины распределения плотности центров адсорбции, главным образом, в области больших значений кадо (центры необратимой адсорбции, или "жёсткие" центры ), примерно одинаково для всех пассивированных поверхностей кварца (рис. 7). Обнаружено полное совпадение распределений плотности центров адсорбции САЧ для альбуминизированной и пассивированной белками плазмы поверхности БПГ, имеющие как и исходная поверхность БПГ, экспоненциальный характер, но с небольшим сдвигом в сторону меньших значений калс и меньшой шириной распределения (рис. 8). Для пассивированных поверхностей ГС (рис. 9) все кривые распределения центров адсорбции САЧ заметно смещены влево в сторону меньших значений к>дс. Такое заполнение пассиви-

рующим белком преимущественно "жёстких" центров, приводит к уменьшению значений средней константы адсорбции САЧ от 10 мл/(мг»с) исходной поверхности ГС до 0,32 для альбуминизированного и 0,15 мл/мг, для пассивированного другими растворами белков. Значение к которому соответствует максимальная плотность распреде-

.2

ления центров адсорбции, равно (5-6)10 мл/(мг»с) для альбуминизированного ГС и (1,5-2,0)102 мл/(мг«с) для остальных пассивированных поверхностей ГС. Пассивация ГС растворами КП, ГТЧ, ЛФ, смесью САЧ с ГГЧ ещё более сближает адсорбционные свойства гемосовместимых гидрофобного ГС и гидрофильного БПГ относительно САЧ. Такое поведение пассивированных ГС подтверждает отсутствие специфичности центров необратимой адсорбции к определённому белку. Заполнение "жёстких" центров на стадии предадсорбции ГС при фиксированной концентрации пассивирующего раствора 0,01 мг/мл зависит не столько от сложности его состава, сколько от количества в нём молекул белка (случай низкомолекулярного ЛФ) или присутствия в растворе молекул белка, способного занять несколько центров адсорбции (растворы с ГГЧ). Так, молекула ГГЧ на поверхности кварца в необратимо адсорбированном состоянии занимает в 10 раз больше центров адсорбции, чем САЧ. Однако, заметим, что ГС, пассивированный смесью САЧ и ГГЧ, имеет меньшую плотность центров адсорбции САЧ по сравнению не только с раствором САЧ 0,01 мг/мл, но и с раствором ГГЧ той же концентрации (см. рис. 9). По-видимому, определённая доля центров необратимой адсорбции на поверхности ГС преимущественно заполняется САЧ. Неспецифическими "жёсткими" центрами адсорбции на поверхности ГС могут быть молекулы ацетата ртути, появляющиеся в результате реакции "оксимеркурирования-демеркурирования" при получении ГС (поливинилметилсилоксан-метил-1-этанол силоксана) из циклического тетрамера винилметилсилоксана. Вероятно, адсорбция белка на эти центры сопровождается инициированием ацетатом ртути разрыва внутримолекулярных дисульфидных связей, что приводит к образованию мультислоёв белка, связанных межмолекулярными дисульфидными мостиками. Данное предположение требует дальнейших экспериментальных обоснований.

Таким образом, абсолютные значения количества адсорбированного САЧ и характер распределения плотности центров адсорбции этого белка на поверхности кварца, гидроксилированного силоксана и блоксополимера биомер-полиэтиленоксид-гепарин зависят от природы материала, состава и концентрации пассивирующего раствора.

рЯТ, мкг/см2 0.030'

0.025

0.020

0.015

0.010

0.005

0.000

0,001

>оо

о

о

о о о о

« О

ч

о

о о

г

9

о 0

% О

со

«V 0 ж

щлди¿^э»^

э ©

о ©ветзэ

0,01 0,1 1 Кадс, мл/мг с

10

Рис. 7,. Распределение плотности центров адсорбции на поверхности кварца для

САЧ по эффективной константе скорости адсорбции:

® -исходная поверхность; поверхность, пассивированная раствором:

ф- ГГЧ (0,1 мг/мл); о - ЛФ (0,1 мг/мл); # - смесью САЧ (0,05 мг/мл) и ГГЧ (0,05

мг/мл); 4- САЧ (0,1 мг/мл); В - БП (0,1 мг/мл).

рет, мкг/см2

Кадс. мл/мг С

Рис. 8. Распределение плотности центров адсорбции на поверхности БПГ для СА по эффективной константе скорости адсорбции:

® - исходная поверхность; А - альбуминизированная; в - пассивированная Б (концентрация бета в пассивирующих растворах 1,0 мг/мл)

pRT, мкг/см2 0.120

0.100

0.080

0.060

0.040

0.020

0.000

0,001

в •

9 9

в о

о ©

©

о

о

е

о

ПВ-

0,01

0,1

Кадс, мл/мг с

10

Рис. ' 9. Распределение плотности центров адсорбции на поверхности ГС для САЧ по эффективной константе скорости адсорбции (в скобках- концентрация белка в растворе, мг/мл):

о - исходная поверхность, САЧ (0,01); поверхность, пассивированная раствором: Д-САЧ (0,01); Я- БП (0,01); 0- ГГЧ (0,01); о - ЛФ (0,01); $ - смесью САЧ (0,005) и ГГЧ (0,005).

о

о

о

о

9

1

3 Влияние кристаллической структуры поверхности на её адсорбционные и гемосовместимые свойства.

Было предположено, что биосовместимые свойства А1203 зависят от вида плоскости монокристалла. В связи с этим целью работы явилось изучение адсорбционных свойств поверхности монокристалла А1203 двух ориентации [0001] и [10Tl], которые имеют соответственно максимальное (6600 эрг/см2) и минимальное

(3500 эрг/см2) значение свободной поверхностной энергии среди семейств плоскостей монокристалла лейкосапфира.

Поверхность лейкосапфира [0001] адсорбирует немного больше САЧ

(0,16 мкг/см2) по сравнению с плоскостью [10И] (0,10 мкг/см2) за время адсорбции 1000 сек. (рис. 10) Однако, в первом случае кинетическая кривая 1 не выходит на насыщение за время регистрации, в отличие ог кривой 2. Можно предположить, что при изучении адсорбции поверхностей сапфира из плазмы, вероятность мультислойной адсорбции белков будет выше для более высокоэнергетической плоскости. Кинетические кривые (Ги 2') на исследуемые поверхности после предварительной пассивации их этим же белком практически совпадают. Уменьшение количества адсорбированного САЧ после пассивации значительней для плоскости [0001], имеющей большее значение свободной поверхностной энергии по сравнению с [lOll], Найденные закономерности совпадают с имеющимися экспериментальными данными по положительной корреляции значения свободной поверхностной энергии и количеством адсорбированного белка.

Пассивация поверхностей монокристалла А1203 приводит к уменьшению центров адсорбции и средних значений констант скоростей адсорбции САЧ для пластин обеих ориентации (рис.11). Заметим, что несмотря на гидрофильность, поверхность сапфира из-за высоких значений свободной поверхностной энергии имеет характер распределений центров адсорбции, свойственный гидрофобной поверхности. Максимальное значение распределения плотности центров адсорбции после альбуминизации,

по сравнению с исходной изменяется от 0,05 мкг/см2 до 0,03 мкг/см2 для поверхности

лейкосапфира с ориентацией [0001] и от 0,03 мкг/см2 до 0,02 мкг/см2 для ориентации [1011]. Значения средне-взвешанных констант скорости адсорбции кда совпадают для обеих ориентаций сапфира как до, и так после пассивации, изменяясь при этом с 0,25 до 0,15 мл/(мг»с).

Слов. МКГ/сМ*

1, сек

Рис. 10. Кинетика адсорбции САЧ-ФИТЦ (Со=0,1 мг/мл) на исходные (1,2) и пассивированные раствором САЧ в ФБ с концентрацией 0,1 мг/мл (1', 2') поверхности монокристалла лейкосапфира различной ориентации: 1 - [0001]; 2 -[1011]; Г-[0001]; 2'-[1011].

рПТ, мкг/см2

клцс, м.а'мг. с

Рис. 11. Распределение плотности центров адсорбции по эффективной константе скорости адсорбции на исходные (1,1') и пассивированные САЧ (2,2') поверхности А120з различной ориентации:

1 - [0001]; 2 - [10Т1]; 1' - [0001]; 2' - [1011].

Это свидетельствует об одинаковой энергетической неоднородности взаимодействия исследованных поверхностей с САЧ в модельном растворе, несмотря на их различие в значении свободной поверхностной энергии.

Электронно-микроскопические исследования двух плоскостей лейкосапфира, визуально имеющих одинаковую морфологию поверхности, выявили после инкубации с тромбоцитарной плазмой человека их существенное отличие. На плоскости [0001] хорошо видны участки с заметными отложениями белка, что подтверждает предположение о мультислойном неравномерном характере адсорбции белков плазмы крови, с незначительным количеством адгезированных тромбоцитов. На поверхности А^С^ с ориентацией [10П] видимых белковых отложений и адгезированных клеток не обнаружено, что свидетельствует в пользу формирования монослоя белка. Известно, что условие минимизации адсорбции белков и сплошность (однородность) белкового покрытия являются условиями гемосовместимости поверхности. Можно предположить, меньшая гемосовместимость для ориентации [0001], по сравнению с [1011], обусловлена неоднородным распределением белка на фоне мультислойного режима адсорбции.

4. Адсорбционные и гемосовместимые характеристики аморфных структур. Для исследования адсорбционных и гсмосовместимых свойств аморфных структур были выбраны аморфные углеродные покрытия, полученные методом ионно-плазменного осаждения, с различным типом гибридизации электронных орбиталей в углероде.

Краевые углы смачивания по воде для углеродсодержащих покрытий находятся в пределах 70°-95°, т.е. данные покрытия относятся к умеренно гидрофобным материалам.

Распределение центров адсорбции САЧ для всех углеродных покрытий, в отличие от прямоугольного распределения для кварц, имеет вид нормального распределения и лежит в диапазоне от 10"2 до 4 мл /(мг»с). Максимум распределения плотности центров адсорбции САЧ (рЫ11[С) наибольший у азотсодержащего углеродного покрытия (3:1) и практически совпадает с аналогичной величиной для кварца, а наименьший - у азотсодержащего углеродного (1:1) покрытия. Как и максимальное количество адсорбированного САЧ (Сма>с) и начальная скорость адсорбции САЧ (Унач), максимум распределения плотности центров адсорбции САЧ на кварце, азотсодержащих углеродных покрытиях (3:1) и (1:3) на порядок выше по сравнению со значением ршк

на алмазоподобном, карбиновом и азотосодержащем углеродном (1:1) покрытиях (Таблица).

Константа адсорбции (кши), соответствующая максимуму распределения (рМ1И.) у алмазоподобного, карбинового и азотосодержащих углеродных (3:1 и 1:3) покрытиях примерно одинаковая и составляет 0,12+0,03 мл/(мг»с) ( см. таблицу). Распределение плотности центров адсорбции СЛЧ для азотсодержащего углеродного покрытая (1.1) сдвинуто влево относительно распределений плотности центров адсорбции для других поверхностей, что свидетельствует об увеличении доли «мягких» центров - центров с низкими значениями констант скоростей адсорбции САД. Значение кМ11х для этого покрытия имеет наименьшую величину (0,04мл/мг«с) по сравнению с другими углеродными покрытиями.

Из условия минимизации адсорбции белка (монослойный режим адсорбции), как одного из критерия гемосовместимости для гидрофильных поверхностей, следует, что алмазоподобное, карбиновое и азотсодержащее углеродное (1:1) покрытия будут иметь лучшие гемосовместимые свойства по сравнению с азотосодержащимн углеродными (3:1 и 1:3) покрытиями.

Ранее было показано, что гемосовместимость материалов, имеющих экспоненциальное или нормальное распределение центров адсорбции СЛЧ относительно логарифма констант скоростей адсорбции, увеличивается при сдвиге распределения в область низких значений кад£. С этой точки зрения, можно предположить большую гемосовместимость азотсодержащего углеродного покрытия (1:1) по сравнению с гемо-совместимыми алмазоподобным и карбиновым покрытиями.

Гемосовместимость углеродных покрытий оценивали по индуцированной ими активации системы комплемента сыворотки человека ( см. Таблицу ). Действительно, для азотсодержащих углеродных покрытий наименьшая активация системы комплемента выявлена при соотношении С6НП:Ы2=1:1 (см. таблица), что говорит о лучшей гемосовместимости азотсодержащего покрытия (1:1) по критерию к^, по сравнению с двумя другими гемосовместимыми углеродными покрытиями.

Таблица.

Основные параметры адсорбции САЧ для углеродсодержащих покрытий

Тип углеродного V Н1Ч> С , макс Р макс 1г ^ияд

покрытия мкг/(см2*с) мкг/см мл/(мг»с) мкг/см2

кварц ю-3 0,076 - 0,03 -

Азотсодержащее 1,6.10"3 0,027 0,15 0,031 2,1+0,2

углеродное

покрытие С6И12: N2= 1:3

Азотсодержащее 2,5.10"4 0,18 0,1 0,083 1,2+0,1

углеродное

покрытие С6Н12:М2 = 3:1

Азотсодержащее ю'5 0,00255 0,04 0,0009 0,6+0,05

углеродное

покрытие С6Н12:Мг=1:1

Алмазоподобное 3,75.10"5 0,00455 ОД 0,0018 0,6710,04

углеродное

покрытие

Карбиновое 1,67*105 0,003 0,09 0,0012 —

покрытие

ВЫВОДЫ

1. Увеличение гидрофильности поверхности сегментированных полиуретанов приводит к уменьшению количества адсорбированного белка, изменению формы распределения и к сдвигу максимального значения распределения в сторону меньших констант скоростей адсорбции. Данный эффект сопровождается повышением гемо-совместимости поверхности на стадии адсорбции белков и адгезии тромбоцитов.

2. Пассивация альбумином поверхности гемосовместимых сегментированных полиуретанов приводит к сближению их адсорбционных свойств. Наблюдаемое при этом сужение ширины распределения плотности центров адсорбции относительно констант скоростей адсорбции с одновременным сдвигом распределения в сторону

меньших значений к,лс может являться одним из критериев гемосовместимости материалов медицинского назначения на стадии адсорбции белков.

3. Доказано, что варьируя состав пассивирующего раствора, удаётся добиться существенного сближения адсорбционно-энергетических характеристик (относительно альбумина) гемосовместимых гидрофобного гидроксилированного силоксана и гидрофильного блоксополимера биомер-полиэтиленоксид-гепарин.

4. Исследованные плоскости монокристалла лейкосапфира и аморфные угле-родсодержащие покрытия имеют нормальное распределение центров адсорбции альбумина относительно логарифма констант скоростей адсорбции.

5. Ориентация монокристалла лейкосапфира а-А120з с максимальным значением свободной поверхностной энергии в ряду семейств плоскостей адсорбирует большее количество белков плазмы крови и тромбоцитов человека. При этом мультис-лойная адсорбция белка сопровождается неравномерным его распределением на поверхности кристалла.

6. Установлена зависимость между параметрами кинетики адсорбции альбумина на поверхность углеродсодержащих покрытий и их гемосовместимостью. Одинаковое количество углерода и азота в углеродсодержащих покрытий приводит к увеличению вероятности их гемосовместимости, что сопровождается сдвигом распределения плотности центров адсорбции в область низких значений к,дс.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Характер распределения плотности центров адсорбции САЧ относительно его констант скоростей адсорбции можно использовать в качестве одного из критериев гемосовместимости материалов различной природы в условиях in vitro.

2. Для повышения гемосовместимости медицинских изделий целесообразно проводить пассивацию поверхности сывороткой, плазмой крови, модельными растворами белков с физиологическими концентрациями, что значительно больше улучшает их биологические свойства, по сравнению с широко используемой в настоящее время обработкой поверхности раствором альбумина.

3. Учитывая существенно меньший характер изменения адсорбционно-энергетических свойств гидрофильной поверхности, по сравнению с гидрофобной, создание гемосовместимых гидрофильных материалов медицинского назначения является более перспективным направлением, по сравнению с разработкой гемосовместимых гидрофобных материалов.

Список опубликованных работ.

1. В.И. Севастьянов, И.В. Друшляк, К.Н. Котов, Ю.С. Тремсина, Р. Эберхарг, С.В. Ким "Влияние предадсорбции белков на адсорбцию альбумина на поверхность гемосовместимых полимеров" /Биосовместимость, том 2, №2, стр. 59-69 (1994).

2. V.l. Sevastianov, I.V. Drushlyak, K.N. Kotov, Y.S. Tremsina, R.C. Eberhart, S.W. Kim "Effcct of Protein Preadsorption Onto Albumin Adsorption on Blood Compatible Polymers on Quartz" / J. Biomaterial - Living System Interactions, Vol.2, №2 p. 53-63 (1994).

3. V. I. Sevastianov, I.V. Drushlyak, Yu.S. Tremsina, R.C. Eberhart, Ph.D., S.W. Kim, Ph.D. «Protein passivation and competition for surface adsorption sites as measured by total internal reflectance-fluorescence.»/ ASAIO Cardiovascular Scicnce and Technology Conference, Washington, c.94 (1994).

4. М.Э. Бузоверя, A.M. Подурец, И.В. Друшляк, C.JI. Васин, В.И. Севастьянов "Ориентация кристаллической решётки монокристалла лейкосапфира и адсорбция белков" / Биосовместимость, том 3, №3-4, стр. 125-132 (1995).

5. М.Е. Buzoverya, A.M. Podurets, I.V. Drushlyak, S.L. Vasin and V.l. Sevastianov. Orientation of single crystal alumina and protein adsorption." / J. Biomaterial -Living System Interactions, Vol.3, №3-4, p. 111-117 (1995).

6. V.l. Sevastianov, I.D. Drushlyak, R.C. Eberhart, S.W. Kim «Blood compatible biomaterials: hydrophilicity vs. hydrophobicity.» / Macromolecular Symposia, Polymers and Medicin, Vol. 103, pp.1-4. (1996).