Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование мезанизма адсорбции белков плазмы крови с поверхности кварца и полимеров медицинского назначения методом флуоресценции полного внутреннего отражения

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование мезанизма адсорбции белков плазмы крови с поверхности кварца и полимеров медицинского назначения методом флуоресценции полного внутреннего отражения"



Т?^* ^ ч^ V*

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО ОБРАЗОВАНИЯ КЙСР

В

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ШАШНИ «ИЗИКО-ШЕИЧЕСКШ ИНСТИТУТ

На главах рукошсй Уда/678.7-9:615^-77/: /678.01:514.183. СО: Б47.98/

ЮТИК Эдуард Анатольевич

нсслвд0ваш5е механизма АДСОРБЦШ БЕЛКОВ ПМЖ1 КРОВИ па поБЕЕХнооти тшАРЦА и полипов ш-дгщщжого назначения етодш злуотящвди полюго вниреннего оташш .

/03.00.02. - Биофизика/

АВТОРЕФЕРАТ, диссертации на соискание укжоа стешни каддндэтз финко-натэматиескшс наук

Иосква - 1991

Работа выполнена в Научно-Есоаэдоваггельскон институте трансплантологии ж искусстввниык органов Минздрава СССР

.. . , г ; , ,

Надчанв р/даводитльг доктор йиологичаснрг наук В.И. СЕВАОТШЮВ

Официагьш» ошюдаиты:

доктор vaamaasx. наук А.Л. ИОРДАНСКИЯ

кандидат физико-иатвмапгшских ваук Н.Ф. ПЕРЕВОЗЧИКОВ

Ведущая организахдая: Научно-иссдвдоватэльскиа физико-хшичэския институт им. Л.Я. Караова

Защита диссертации состоится

часов на заседании специализированного ученого совета < К. 063.31. Ш )хфи Иосковско* фшико-тегническои институте /141700, г. Долгопрудный. Московской обл.» йастигутскиа гор., д.9.

С доссергациаа коано сгнавошггься в библиотеке МФТИ.

л

Авторефералг рзаослан 1ЛЫ?>Л<£ - два! г.

Ученые секретарь стциалвзировааного совета л,

кандидат физякр-маггемагичвоки* наув 4 /В.Б.Кцреев/

I.Общая характеристика работы.

, Актуальность темы. Взаимодойствш белков с поверхностью тверди ол интенсивно исследуется в последние годы в свяаи с широким недрениш различных материалов в биоло^ю, биотехнологию и эдицину. Возкиктая в конце 60-х годов новая область науки -изико-химия медицинских псшмэрсв в качеств? основной задача эссматриваот проблему создания полимерных материалов с заданными здшга-тохничаскими свойства?^, решониэ которой невозможно без этального изучения процессов, протека:зщих на граница рпздола зтеркал/биоткань. Выполнение этих работ предускотрэно Общесоюзно« эучно-техничвекой программой 0G9.II.04 "Разработать и внедрить з зактику биосовместимые полимеры с ззданяыш и рогулируемыми зоДстваш", а также мэжправительствонким см дошенюм СССР-СПА Разработка и исследование исскуствоиного сердца" ("биоматориалы").

Адсорбция сывороточных белков крови является горвей стадией гаимодэаствия кроЕИ с поверхностью чудародпого материала. Механизм 5разования адсорбированного бе^лсового слоя,структура и состав кото-)го существенно ъ-тяы на гомосоьиьста^ыэ свойства имплантируемых даяиа, в настонщоо время на ясон. Предложенные гопретичоекпэ но->.ш, как правило, основаны на предположении одзородпссти ловерхнос-I, баз учета неоднородности адсорбционного взггаюдейстшя белок/ )ворхность. Поэтому, разработанные на сегодняшний день физнко-мичвекиз и адсорбционные критерии гэмосовкестаюсти построены на гализе усредненных поверхностных характеристик. Однако, в радо давних работ показано, что гемосовшстамые свойства материалов висят от характера микрофэзвого разделения структу]« их поьерхнос-[, размера доменов, наличия кжфопршесей и иикровмочекий и т.д..

Широко используемый в настошре время котод радиоактивных дикаторсв, несмотря на его простоту и надошюсть, таоот сущоствен-й недостаток - неприменимость к исследованию обратило адсорбирую-хся молекул балка. Подобного недостатка .тлел лродяожонный недавно тод флуорэецэшдаи полного знутрепного отражения (0ПВО),позволяющий гистрировать адсорбционные процессы в рэальяом масштабе зрэмени.

Цэдю настогсцзй работы является эксгоримойтэльнэе и оротичоскоо исследование механизма неоднородности адсорбционного ашодэяствия белков плазмы крови с поверхностью бшмзтериалов.

Для достикеиия указаной дели были поставлены следующие новныэ задачи:

- разработать метод ФПВО дяя исследования в реальном масштабе вреуеви процессов взьинодэйствил бемков с поверхностью оптически прозрачных бисмате риалов-.

- методом ФПВО изучить изотермы и кинетики адсорбцонно-десорбционных процессов альбумина и ганмаглобулина' на поверхности кварца, силокса-нов и блоксополим^ров ыодицилского назначения;

- разраоотать теоретическую модель адсорбции, учитывающую неодаород-ность взаимодействия белок/поверхность;

- проанализировать взаимосвязь адсорбционных, физико-химических и гемосовмост/мых свойств исследованшл: биоматериалов.

Научкэл новигла. В работе впервые:

1. Методом ФПВО получены изотермы и кинетические кривые адсорбции и десорбции сывороточных белков крози на поверхности полимеров медицинского назначения.

2. Предложена теоретическая модоль адсорбции, учитывающая неоднородность взаоодойствия белок/поверхность и структурные изменеым в адсорбированном болксвом слое.

3. В рамках разработанной модели получены вида распределений цэзтр адсорбции по логарифму констант скорости адсорбции ка и десорбции рассмотрен механизм адсорбции балков на исследованным материалах.

4. Обнаружена взаимосвязь мевду гэмосовшстимостью поверхности и пэраме1рами подученных распределения.

Практическая значимость. Разработан метод флуоросцэяции полного внутреннего отражокия для исследования в реальном масштабе времени процессов взаимодействия белков шазш крови с поверхностью оптически прозрачных биоматериэлов. Зарегистрировано 3 рационализаторских предложения по конструкции кюваты и платформы ФПВО. Исследован хараювр адсорбции и строение адсорбированного белкового слоя на ловэрхиости новых и широко .применяемых био материалов. В рамках предлагаемого теоретического подхода установлена корреляция между гзмосозьостимостью материалов к характером адсорбционного взаимодействия белок/поверхность.

Апробация работа. Материалы диссертации докладывались на научных конференциям КФГИ в 1988, 1989 гт, на американо-советском симпозиуме по системам вспомогательного кровообращени и по бяомзтериалам (Хьюстон.США,1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, даз работы приняты в печать.

Структура диссертации. Диссертация состоюг из введения, i глаз, выводов, списка цитируемой литературы из 117 наименования и приложения (список сокращений и обозначений). Материалы диссертации, включая 71 рисунок и 14 таблиц изложены на 150 страницах.

Основное содержание работы.

Материалы и метода. I. Материалы и реагенты. В качестве объектов исследования были выбраны: аморфный кварц ( КУ-Г, 14 класс полиронки), шлвдиь.етил-силоксан (Щ1МС,"serva".Швеция), полиуретан Биомвр, (CLhtcor, inc. , СИА),блоксополимеры: БИОМЕР-Полиэтшенсксед-ГепариЕ (БПГ) и ДДМС-<Полиэтиленоксид-Гепарин)2. <ППГ) (оба из center for controlled

Chemical Delivery, University Research Park, Salt Lake City. USA), гнцроксилированяый ПОЛИДИМвТИЛСКЛОКОЭЛ (ГО) (University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas. USA). КаНбСеНИИ ПОЛИШрНЬК

пленок производилось из разбавленных, растворов (0.1-1%). Средняя толщина получаемых полимерных пленок зависела от типа шликера и изменялась в проделах от 20 до 80 им.

Была исследована адсорбция сывороточного альбумина человека (ЧСА), фракция 5, мол.вес.- 69000/ "serva" и иммуноглобулина э человека (ИГ), мал.вое.-150000/ 'TerwT.

2. Метод ФПВО для исследозагтия адсорбции белков. 2.1. Принцип метода. Если .угол падения луча света a ль оптичэс-1си болеэ плотной среда "I" в оптически кенее плотпур среду "2" прэвышает критическое значение:

а " arcsinCn^gJ (I)

, где п13 - относительный показатель преломления, то луг света полностью отражэзтея от границы раздела сред, причем в среду "2" проникает экспоненциально затухающая электромагнитная волна с интенсивностью i:

1=1 f»xpC-2z/d Э (2)

о ^ р *

, гдо i.0 - интенсивность волны на границе раздала сред, z -координата.нормальная к плоскости раздела срод, а - характерная глубина проникновения (д.1«! границы раздела фаз кварц/вода в ввдимои диапазоне сьота значение глубины проникновения порядка 100 нн). Следовательно, при наличии в раствора флуоресцирует:?« молекул возбуждаются только те из них, которые находятся в тонном

приповерхностной слое, т.е. в основном адсорбированные молекулы.

2.2. Экспериментальная установка. Нз базе субнаносекундного сгоктрофлуоршетра "а-м 4аоо- была собрана установка для регистрации флуорасцзнции белка в режиме полного внутреннего отражения. Были изготовлены: тормостатируокая кювета ФПВО и термостатированная платформа с юстировочнь'ы столиком. Установку позволяет регистрировать флуоресцентные параметры (сшктры, поляризацию) адсорбированного балка в проточных условиях проведения зкслериненга. Чувствительность установки без применения поляризаторов около I нг/см~ адсорбированного белка (по внешней флуоресценции).

2.3. Мэччниз бэмов флуоресцентной меткой. Нюсмотря на то, что использованные в настоящая работе белки обладают собственной флуоресценцией в качестве флуорофора использовали внешнюю метку, что позволило увеличить на порядок чувствительность метода и избежать облучонмя молекул белка ультрафиолетовым излучением. Центральными вопросами при использовании метки ячляется:

- изменяются .та адсорбционные свойства белка при его мечешад;

- достаточно ли крепко метка присоединяется к бе л су.

Было исследоззно образование коныогата альбумина с 4 метками: изошоцчанатэми (¡цуорвсцэина, родамина, тэтраметилродамдаа и сульфородамшюм хлорида. Показано, что при использовании методики мечеиия в щелочной среда рН = 8.2 , только изотаэцианаты Си5уоресцэина <ЧТЩ) и мэтилродамада полностью специфически связываются с белком и не открепляются от него в процессе адсорбции. Показана пропорциональность максимального сигнала флуоресценции коныогата ЙГ-ИТЦФ уровню его мочения <в диапазоне от О до 1.5 молзкуды метка на иолэадлу белка), что свидетельствует о независимости адсорбционшх свояст балса от адсорбционных свойств метки. 1о, что сама процедура мечения не влияет на адсорбционные свойства бежа следует из одинакового (в пределах экспериментальной ошибки) хараклера кинетических кривых адсорбции неиэчошюго ЧСЛ <по собственной флуоресценции) и ЧСА-ИТЦФ (по флуоресценции метки).

2.4. Калибровка метода ФПВО. Калибровка флуоресцентного сип!ала проводилась путем сопоставления флуоресцентного сигнала с интенсивностью гамма-игдучения белков, меченных .

2.5. Экс_гвриментальная процедура измерения кинетических кривых. При использовании метода ФПВО необходимо выделять из обшого сигнала " флуоросцздции сигнал, соответствующий объемной флуоресценции. В

i а стоящей работе предложен просто» алгоритм Евдоления объемного зигиала, состоящий в следующе". В кювету запускали раствор дякстрэпа, юченного ИТЦФ < ДФ,молекулярный вое 70000) при заданном значения сдвиговой скорости г у поверхности. Так как декстран присгачески не адсорбируется на поверхности кварца и его коэффициент диффузии -•лизок к коэффициенту диффузии альбумина, регистрируемая кинетика ¿луораацвниш декстрана моделирует кинетику формирования сбгстаго сигнала бежа, адсорбирующегося п истинно кинетическом р^кимэ. Эпредэляли вромя tQ за которое смывается 80-85 % максимального сигнала флуоресценции ДФ. О качестве сх1ьемного сигнала при рэгист-рацга адсорбции белка брали изменение интенсивности флуоресценции раствора белок-метка ь точении первых t-0 секунд дзеорбг^м в раствор Еюмбчпнпого бе.яка (самый меддэшшй процесс). Обработка экстюримен-гальнш кривых адсорбции белка происходила в два эгапз: вычитание объемного сигнала и сдвиг начального иомечта адсорбции нэ tQ.

При постановке метода ФПВО исследовалась воспроизводимость вида кинетических кривых адсорбции. При одних и тек т условиях эксперимента исследовали кинетические зависимости адсорбции ЧОА на 15 образцах кварц&вых плсстин ь 7 пленках Биомэра, нанесенных на кварцевые пластины. Относительная ошибка определения максимального флуоресцентного сигнала при адсорбции. па поверхность кварца составляла около 15* для обьомной коздэнтрации (Сп) 0.03 мг мл и уменьшалась до 10 Ж при увеличении CQ до I мг мл. Ня поверхности Биотрг omxSxa определения максимальной конг$эвтраиии составляла около 17 %. Вашым условиег воспроизводимости результатов при адсорбции на поверхности блоксополимэров является необходимость предварительной гидратации шверюшепг в растворе используемого фосфатного буфера 'рН=7.35). Для используемых бло^опо.янмороз обнаружено изменение адсорбционных свойств в течении порют 6П минут гидратации. Подобный эффект является следствием переориентации гибких цепей полиэтилэноксида в водной фазе.

2.6.Ражим адсорбции белков. Предельная, даффузжтко-.пвпгга-рувмэя скорость адсорбции для плоско-паралэлытоя проточной области определяется согласно уравнению:

Cy/CD 1ЭЭ D с CdVd°MaKC=-TT-5" <3)

ГС ЙЗУЗ

, где С - поверхностная кенцэнтращя балка, Г - гамма-функция.

г - величина сдвиговое скорости, з - длина проточной области до участка измерения, о - коэффициент диффузии белка. На рисунке Г показано максимальное отноыениэ начальной скорости адсорбции к теоретический продельной, рэсчиганноа по уравнения (3), для всех пар белок/поверхность. Только на поверхности ГС адсорбция проходит в даМузиото-контрол'лруемом ро-ьиме. Адсорбционвко зависимости на других поверхностях можно считать кинетически лимитируемыми.

1,2

0,8

0,4 0,0

ея- ж

ЧСА

Й

„.'Т^П — ГЧ8"

ОЯ

Гр 7

кварц 1ШГ БЕГ Еио ГС 1ЩС мер '

Рис Л. Максимальное отношение начальной к

диффузионно-лимитируемой скорости адсорбции.

3. Другие метода исследования. Кроме штода СПВО в настоящей работе применяли ешктрофотомзтрический способ определения С0 и уровня мечен®? белка, Ш спектроскопию многократного полного внутроннего отражения для исследования пленок полшера, а также радаоиЕотопнна мотпд изучения адсорбции белков в проточных условиях проведения эксперимента.

Теоретическая кодэль энергетически неоднородного взаимодействия белок/поверхность.

I. Метод "контролирующей полоса!". Дяя анализа кинетических зависимостей с учетом неоднородности адсорбционного взаимодействия использован метод "контролирующей полосы", устанавливающий вид кинетической зависимости по известному вицу распределения плотности .шатров адсорбции по энергии активации адсорбции р(£а):

К Т Ьп(С0 С )

С. ^ р(Еа) оь;а (4)

( ЕгЛ'вд

, гдэ 1-° - предокспопвнциалъныя множитель, к -универсальная газовая постоянная, т-абсолотная теншратурэ. Коррэктпость применения прийлгакшия "коктролирующэа полосы" определяете« слодуп'адаи неравенствами:

^эк-^иГ'1'8 гсеал/иоль или кНс'ко/кмип >1Г) (5>

Для того, чтобы по виду кинетической кривое определить екд распределяют ивобходога продифференцировать урзвпвню (5) по логарифму времени:

р(ка) = (]>сг; ТО2 йС^О/МСЦ'.СО.Э

(В)

?,. Теоретическая схема адсорбции белков. Прэдлои^па тзорэти-

чеекзя кодэль адсорбции белков, основанная на сладуквдк допущениях:

а) существование неоднородности взаимодорствия белок поверхность-.

б) наличие нонфоря анионных и струт-урных изменений в адсорбированном бОЛКОВОН слов;

в) кинетическая .лимггируомость адсорбционного процесса. Предполагается, что существуют независим.» центры адсорбции, которыо отличаются величинами констант скорости адсорбции к Для км-дого га этих центров есть два -пета состоянии белковой молекулы "I" и "2", различающуюся копфорнациой и ориентацией белка относительно поверено ста. 1-влак, адсорбированный первоначально в состоянии "I" с константой скорости перехода )<п может шроходить в состояние "Я", которое отличается от состояния "I" количеством занимаемых дан ."ров адсорбции Константа и константа десорбции может зависеть от типа центра. Кинетические уравнения имеют след/кидай вид:

овС!)1^ = с0 - ^ 6(1) )<1 - 6(1) - «*в(2) ) - кд 6(1) (7) ав(2ГМь = 0(1) (Г - 0(1) - а10(2) ) (3)

и

= к м1 оа)1 + в(й)1) (9)

, где 6(1} п 6(2) - доли занятых центров адсорбцш в состоянии "I" и "2", N - сб^.сэ количество центров адсорбции, « - количество занятых Г;о;ггров в состоянии "2" ( «=1 для "I" ), х - пш центров адсорбции.

3. Модель адсорбции белков в приЗлижеяии "контролирующей полосы". Адсорбция бежа на поверхность твердого тела, описываемая уравнениями (7-9), подразумевает суммирование нвлэнгмюровских зависимостей, являющихся решениями уравнений (7,8). Однако, как показано в настоящая работе, разница между этими зависимостями л оптимально подобранными лангмюровскими кривыми может быть несущественна при наличии шлрокоа ноодлоропдосгк гаашрдействия белокмюверхность.

4. Анализ частных случаев энергетической неоднородности взаимодействия белок/доверхность. Предположим, что адсорб!дюнное

взаимодзгствле характеризуется широким распределением по величинам •-д. Ввгжгфируемая экспоримонтальная кривая отражает характер эффективного распределения центров адсорбции по эффективным 1а, вид которого мокло определить то уравнению (6). Возникает вопрос - как связаны ы=«вду собой истинное распределение и эффективное? В работе показано, что эффективное распределение может сущэственно отличаться от истинного доя центров с к1/йа- Однако, при

кд/к^ог*^ и а »опзъ вид эффективного распределения совпадает с видом истинного распределения, ширина хитораго не изменяется. Наличие структурные изменений в адсорбированном болковом слое сводится к равномерному уменьшению плотности цонтров адсорбции и к сдвигу всего распределения в сторону больших значений эффективной скорости адсорбции. Вид кинетической зависимости при известном виде распределения р(Ед) будет:

* £ ип<со ка *<со» сп<^>= еыакс<°о> ^ Р<Еа) ¿Еа (Ю)

Параметры бмакс и ф зависят от физически определенных параметров: 0о, « и кп ла, Для исследования применимости уравнения (10) была числоннс исследована зависимость формы "контролирующей полосы" от величины парзматров « и )с1/(1саС0>. Показано, что ширина "контролирующая полосы" не изменяется при изменении величин эгах. параметров Следовательно критэрий применимости уравнения (10) аналогичен критерию (5).

Результаты и ик обсуздалия.

I. Адсорбция белков на поверхности аморфного квзрца.

1.1. ^однородность взаимодействия белок/кварц. Кинетические зависимости адсорбции ЧСА на поверхности кварца спрямляется в полу-

логарифмических координатах. Так как длительный логарифмический характер полученных адсорбционных зависимостей может объясняться как неоднородностью взаимодействия белок/псверхкость так и электростатическим отталкиванием адсорбированных милекул, был проведен контрольный эксгоримэнт, разграничивающие влияние этих эф^ктов. Радиоизотопным методом исследовали десорбцию 1311-ЧСА па поверхности кварца в проточных условиях (г=2000 сек-1-). Результаты эксперимента, свидетельствуют о том, что белок, адсорбированный в первые 200 сек адсорбции практически в три раза медяепяеа дэсорбируется о поверхности кварца, чем белок, адсорбирований в последующие G00 секунд. Следовательно, десорбирующаяся молекула белка "помнит" последовательность адсорбции, что соответствует неоднородности взаиуодрвствия белок/поверхность по константам и «с .

1.2. Адсорбционные зависимости и их тепратичэское приближенна. Для детального объяснения вида адсор5цио;шхх зчвисикасгвй была использована модель, учтывавдая неоднородность взаииодзяствия белок/поверхность. Был выбран следувдиа вид распределений плотности цэнтров адсорбции:

Для ЧСА р = i ' 0 макс ' Емта (II)

VI'

tE : Е

макс ' мин

to* Ж /0. Б 0 tЕКЗК0 ; Е^ J

Е е СЕмин : Екр }

Е е 1Екр EMaKCJ <я=1> <12> Значения параметров модели сведены в Таблице I.

Таблица I. Параметры адсорбции белков на .поверхности кварца.

параметр белок . тип распределения PjRT p?RT молокул/мхм2 .макс .кр а а мл/<мг сек) Vka а мл/ыг

ЧСА прямоугольный азо — 1.7 0,23 1,5

КГ прямоугольный ступенчатая 360 150 1,1 , 0,03 0,01 15,0

Можно выделить три группы параметров по степени ¡зависимости их от природы адсорбирующегося белка: а) <* и к1/ ка ~ ьакболвв зависим^

Е

от свойств белка; б) I.д - определяется и белком и поверхностью в) и прямоугольный характер распределения связаны главным образом с природой поверхности. Существенное различие между параметрами « и ку/ Для ЧСА и ИГ объясняется тем, что молекулы ИГ с одной стороны способны к значительным ковформационным изменениям в адсорбированном состоянием, а с другой стороны переориентация молекул ИГ из положения "оп вы- в положение "оп як!«- должна сопровождаться существенным увеличением эффективно занимаемой площади поверхности. Переориентация молекул ЧСА, по видимому, на сказывается на величине параметра «, в виду слабо выраженной пространственной анизатрошш а.яьбу/йзша. Следовательно, молекулы ЧСА, адсорбируясь ка поверхность кварца претерпевает быстрые (относительно большое значение параметра кдЛд), но незначительные изменения конформациэнного состояния.

1.3. Температурные зависимости адсорбции альбумина. На рисунке 2 показаны кинетические кривые адсорбции ЧСА на поверхности кварца ври трех различны* температурах (15,25 и 45°С). В левом верхнем углу рисунка продставлены распределения, расчитанные по уравнению (6).

Оценочные значения прадзкслонвнциаяьЕОГО мнонигеля - 180 мл/(мг сек), Е^щ - 2.5 ккал/шль. Увеличение плотности центров адсорбции при увеличении температуры до 45°С, по-видимому, связано с тремя различными причинами: I) изменением конформационного состояния белка в объема2) ростом энтрогмаи^х взаимодействий при увеличении температуры: 3) уменьшением параметров или К п/ к .

Рис.2. Кинетические зависимости адсорбции ЧСА на покорности кварца для 15°С{кривая 3), 25°С(кривая 2), 4Б°С(кривэя I) в полулогарифмических. координатах и распределения плотности адсорбционных центров по анергиям активации- адсорбции.

10

время, сак

2. Адсорбция белков на поверхности полимеров.

2.1. Кипетичэасте кривые адсорбции и десорбции белков. Обнаружеп фрейлдлиховскии харахгер кинетических кривых адсорбции на поверхностях блоксополимеров. Кинетические кривые адсорбцш: ЧСЛ на поверхности ДЦМС спрмляются в Лэнгмюровских коордопатах. Лля поверхости Биомера исследована воспроизводимость форны кипе гичоской кривой для адсорбции альбуклна. Показано, что в лзпгкюровених координатах килетическа кривая адсорбции на Биоморо ишет лебольшуу) вогнутость, природа появления которое обсувдзна в сладу кярк параграфе. Количество адсорбированного альбумина и иммуноглобулин на поверхности ПДМС и ГС превышает минимальную концентрацич образования мопослоя болкэ в дегидратированном состоянии. Адсорбция альбумша

на поверхности Биомера, ППГ и БПГ характеризуется величмшми Сп близкими к монослою. Концентрация ИГ на поверхности ШГ, БГГГ и Биомера соответствует менее, чем лтоиослойному покрытию.

2.2. Теоретическая интерпретация адсорбционнъз зависимостей. На рисунках За и 36 представлены эффективные распределения

плотности центров адсорбции по логарифму констант скорости

I- Бкомер, 2- ПДМС, 3- ППГ, 4- БПГ, 5- кварц

Рис.За. Распределения плотности центров адсорбции по логарифму эффективной 1еа для ЧСА (дг.я максимальной

Со>-

Адсорбционное взаимодействие белок/поверхность чмеет неоднородный характер для следующих систем: ЮУПЛГ, ЧСА/ППГ, ИУЕПГ.ЧСА/БПГ (экспоненциальные распределения по логарифму ка), КГ/Бгамер, ИГ/ЦЩЙС ("гауссово" распределение по логарифму ><а), что объясняется микрогэте-ротшостно поверхностей и неоднородностью состава используемого ИГ. Адсорбционное взаимодействие ЧСА на поверхности ПДМС имеет однородный характер.

адсорбции.расчитаняыа по уравнению (6).

Рис.36. Распределения плотности центров адсорбции по логарифму эффективной кд для ИГ (для максимальной С0).

I - Биомер, 2 - ЦЩ5,

3 - ППГ, 4 - БПГ,

5 - кварц

НГХ 1,0 га/(мг сек)

200 400 600 - вре:,'Я, сек

800

Параметры: Модель Лзапларз:

Завкситка

Рис.4. Экспериментальные зависимости адсорбции ЧОА на поверхности Биомера (КрИВЯ 1,Со=0,01' МГ/М1) и Щ?.1С (кривя 2,со=0,003 мг/ал) и ш

теоретическое приЗлижение лэнгмировской моделью (пуюггирная линия) и моделью с диффузионным гарэраспределевием адсорбированного белка (сплошная линия).

.-I

ЦЩХ: к-о.9 ыг/(мл сек), N=0,26 мсг/см2. Бюиер: к =0,5 ыг/(кл сек), N=0,21 »¡кг/см2. - Биокер: кд=0,7 мг/(мл сек), * ..--0,65 сек' центры (13-15).: «д. =0.07 ккг/си2. »2=0,47 ккг/сгА

Гажеглч'зажв ¡фюъэ адсорбции ЧСА на поверхности Биокара описываются моделью, учигаоакщэа поверхностное перераспределение адсорбированного белка посредством латеральной диффузии (зависимые цекмры адсорбции). Предположи, что существует большая груша цритров ка гг'>5®ргкоста Бкомера (назовек кх цзатрамк "I"), которые

быстро заполняются та объема и затем, посредством латеральной диффузии перераспределяются на другой тип участков (центры "2"), характеризующийся относительно медленной константой заполнения из объема. Такому механизму адсорбции соотвотствует система уравнений:

= кI с0 (I - 6(1)) - ХдаффбШ<1-6<2>) (13)

<19(2)^ = кдеМ) 9(1) (1-0(2)) (14)

Сп= ыгв<1)+м29(2) (15)

, где 9(1),0(2) - степени заполнения центров I и 2, кдифф - константа скорости латеральной диффузии, и количество типов центров I и 2. На рисунке 4 показаны наилучшие приближения кинетики адсорбции ЧСЛ на поверхности Бисмора.

2.3. Теоретическая интерпретация дьсорЗциониых зависимостей. На рисунках Ь, 56 представлены эффективные распре деления плотности центров адсорбции по логарифму констант скорости десорбции.

- Еиомер, 2 - ЦДМС,

- ППГ, 4 - Б13Г,

- кварц, 6 - ГС

Рис. 5а. Распределения

плотности цс1пров адсорбции по логарифму кд для Ж1 (максимальная объемная концентрация ). .

д, сек -

Критерий широты распределений (5) справад»ив дая всех показанных распределений. Вид подученных распределении по логарифму кспстапт •скорости десорбции близок к прямоугольному во всех случаях, кроме систем с силоксан содержащими полимэрами.

2.4. Структурыо изменения в адсорбированном слое белка. Учитывая узость исследованных участков изотерм эдеорбцж, для интерпретации подсученных зависимостей не применяли опти*шацио\.ную модель. Каиестн«иные выводы об иитэ'хгассту; структурных изменпла представлены в таблице 4:0- кет длстоверцшг , 0,25 - мала» (а < 2), 0,5 -ерэдниэ , I - значительные структурные'изменения (с* > 10).

Рис.50.

Распределения плотности центров адсорбции по логарифму кд для ЧСЛ (максимальная объемная концентрация ).

I » Биомар, 2 - ЦДМС, 3 ->ШГ, 4 - БПГ, ,0 5- кварц, 6 - ГС

д*

С9К

3, Физико-хкмичоские, адсорбцжнтакв и гемосовместшые свойства. исследуемых материалов.

З.Т.Энэргетичэскйэ свойства поверхностей исследуемых материалов. Детально расскотреш описанныо в литературе энергетические свойства исойдуо^ых полимеров: углы натекания и гистерезис угла смачивания для нешцрзтировакпого и предварительно ги.дратируемого (12 часов в фосфатном буфере) состояния полимерной поверхности.

3.2. Поляризация флуоресценции необратимо адсорбированного ЯГ. Дзнныо по поляризации флуорасцепцад слоя необратимо адсорбированного КГ представлены в Таблица 2. В работе показано, что при отсутствии угла мевду диполем испускания I! поглощения, поляризация зависит, в шрвую очередь, от падежное™ $щуорафора.

Таблица 2. Параметры поляризации (ашзатрспия) необратимо адсорбированного иг,доля плотно упакованного слоя белка (х/С ) и угол натекания (а) вода/гвдрзтирозаынш (12 часов) полккер.

Полимер ГЩМС га Биомор БПГ ппг

Анизотропия 0,351 0,346 0,303 0,279 0,242

Сп, мкг/см2 0,491 0,607 0,092 0,01В 0,С83

Х/0 , %. 100 87 76 61 41

градусы ГСЗ 7 100 "У 53

В приближении простейшей модели, учитывающей два состония необратимо адсорбированного бежа - плотное (малая подвижность, случая 17ДМС и ГС) и неплотное (большая ш/гвьжкость, случая- молекул белка п растворе) в Таблице 2 свэдены значешм доли гаотно адсорбированных молекул - х/0п. На поверхноста Еиомепа при небользой обцей поверхностной концентрации доля х/сц велика, что свидетельствует о ),эравяомерном, "островкозом" покрытии белком поверхности Бконера.

Другая вероятная причина изменения подвижности флуорофора -"жесткость" адсорбционных связей - определяется физико-химическими свойствами поверхности. Действительно, при увеличении щлрофобности гццратированного полимэра происходит увеличение ааизатропии фяуорес-цэнции (Габл.2). Более детальное разграничение вкладов в изменение Р "жесткости" адсорбционных связен и характера чежбелховых взаимодействий требует дополнительных исследований структуры белкового - слоя и деполяризации флуоресцотрм.

3.3. Механизм адсорбции белков. На основании представленных в, литературе данных по гистерезису угла скачивания и полученных адсорбционных парметроз поверхностей рассмотрен механизм адсо1«5вди альбумина я гаммзглобулила на исследуемых поверхностях (Таблица 3):

Кварц. Адсорбция болков на наиболэа щцроЛчлвнук« поверхность кварца характеризуется предельны;« количеством адсорбированных бачков, не превышающим монослоя. Взаимодействие белок/кварц - существе^о неоднородно. Так как для поверхности кварца гистерезис угла смачи- : вания отсутствует, рэзкер неоднородности, определял*" эа Рид адсорбционных зависимостей, кенез 0,1 ккл. Геометрические неоднородности, мнкровкляченкя, ьшфопримеси,поверхностью и приповерхностные дефекты являются наиболее вероятной причиной обнаруженной пеоднородноста взаимодействия белок/поверхность. При здцорбцга белков на поверхность кварца имеют кесто структурные изменения в адсорбированном белковом слое, причем шлеясизность структурных изменений ¡рш ЯГ на порядок больше интенсивности изменена для слоя ЧСА.

ГЩУС. Намоле© гидрофобная поверхность ПДЫО характеризуется большим количеством адсорбированного ЧСА и ЯГ, свидетэльствуккзэм о вероятном образовании второго слоя адсорбированного белка. Даннда по гистерезису угла смачивания, а тага® та.итческзя однородность зтей поверхности соответствуют обяаружзткжу в настоящей работе однородному взаимодействию ЗДМС/ЧСА. Неоднородность адсорбционного взаимодействия ИГ с поверхность» ДПМС, по-Евдимому, связана с неоднородностью структуры и состава ИГ.

Таблица О. Адсорбционное взаимодействие белок/поверхность.

Режим адсорб ции т ^=4800 с""1

Характер Вид расп- Струкгрурныа Системы

взакмо- роделения изменения белок/

действия по и> с к ■> адсорбирован- поверхность

ного бежа

кжштичееки лимитируемый

о

л <атг

неоднородный

5нс1го1.эн-

циальныа:

кмакс/кмив>>1Б р=р

налью

ППГ7ИГ БПГ/ЧСА БПГ/ИГ ППГ/ЧСА

прямоугольный:

значитолъ-ные

Кварц/ЧСА Кварц/ИГ

неоднородней; только при

О >0,1 ИГ/МЛ

кИ9КСлШН>15

л а

"гауссов"

С1лСк /У. Э/ЪЭ"

средние

Биомер/ИГ ЦЭДС/Йг

однородный кет неоднородный с зависимыми центрами

кмакс/кмин=15

а с)

средние

пдао/чсА Биомер/ЧСА

Диффузионно лимитируемый

значительные

ГС/ЧСА ГС/ИГ

ГС. Анализ адсорбции белков на порерхности ГС показал, что гвдроксшшрованиэ увеличивает аффинность белков к силоксану, которое выражается з значительном увеличении и степени необратимости адсорбции, в сравнении с ЦЦМС. Нет оснований предполагать существование неоднородности этой поверхности (с размером более 0,1 мкм) при взаимодействии ее с белками, о чем свидетельствует малый гистерезис угла смачивания. Пидроксилирование приводит к существенному

увеличений доли десорбируемого белка с большими значениями константы скорости десорбции. Особенно ярко этот эффект проявляется для адсорбированного альбумина. Адсорбция бе.тков на поверхности ГС сопровождается существенными конформациошшмя изменениями.

Биомер. Физико-химические исследования пэверхкосп* Биомэра свидетельствуют о существовании неоднородности с характерным размером,превышающим 0,1 кчм, природа которой заключается в значительной степени микрофазного разделения структуры поверхности этого полиуретана. Согласно полученным результатам, мягкие (гидрофобные) и жесткие (гидрофильные) блоки пошуретанг различно адсорбируют белки. ЧСЛ первоначально адсорбируется на гадрофшндаэ сегмены и затем, посредством латэралыюй да]ч>узии перемещается да гицрофобные. Система ИГ/ПДМС характеризуется незначительной неоднородностью, что может быть связано, как и в случае ДПМС, с неоднородностью состава ИГ. Нот оснований считать, что ИГ перераспределяется по поверхности, так как при малой повэрхностной концентрации наблюдается большая величина поляризации флуорэсцевции слоя адсорбированного белка, свидетельствующая о "плотной упаковке" адсорбированного ИГ.

ППГ и БПГ. Анализ адсорбционных зависимостей и ИГ показал, что обе поверхности бдоксополимеров не являются однородными но ка и кВся поверхность БПГ покрыта слоек» палиэтиленокоида (ПЭО) (при 1рекени гидратации поверхности более часа), так что на распределениях плотности адсорбционных прнтров отсугствует участок с болы'^ми константами адсорбции, соответствущш Бкомэру ( для БПГ). Частичное шрэкрыпанив распределений зафиксирована для системы ИГ/ГЩМС и ИГ/ГШГ. Это объясняется том, что на поверхности ППГ, по-видимому, присутствует небольшое количество слабо экранированных ГОО участков ПДМС, которые проявляют болъшуп аффинность к адсорбции КГ. Различным типам адсорбционных цотгров могут соответствовать участки с различным соотношением ИЗО и Биомэра (для БИТ) или ЗДМС (дин ППГ), существование которых вероятно ввиду негшачтгольяого микрофазного разделения структуры поверхности блоксогалимзров.

3.4. Анализ корреляции м&мцу адсорбционными и гечосовмэстимьцкй споястопми материалов. Результаты сопоставления адсорбционных и двтни-по описаны,а в литературе юмосовместамых (время оишьи, т.о. времени тромбировэния сосудов малого диаметра) свойств поверхностей представлена в Таблице 4.

Таблица 4. Адсорбционные и гемосовместимыэ параметры поверхностей.

Кварц пдас ГС Биомер ППГ БПГ

0.2 <*а <0.02 (кд,мл/(мг сек) ЧСА ИГ - + - + + + + +■ - + + + +

макс макс Сп (ЧСА) / Сп (ИГ) 0,61 0,60 0.61 1,64 1,51 3,44

Сп (ЧСА) / Сп (ИГ) 0,37 1,2 0,61 2,1 2,6 5,5

интенсивность структурой изменений в адсорбированном слое ЧСА ИГ 0,25 I 0,5 0,5 I I 0,25 0,25 0 I 0,25 0,25

Бремя окклюзии, ш 3 12 ? 45 196 182

Сформулирован огедпощш эмпирический критерий гешсоЕместимости: ге^.осовместимые свойства поверхности высоки, если адсорбционное взаимодействие ее с ЧСА и ИГ харакгеризуется распредо.шнием по константам скорости адсорбции, не попадающим в интервал от 0,02 до 0,2 мл/(мг сек) (ППГ, БПГ, ГС). Хорошие гемосовшстиныв свойства имеют те поверхности, распределение которых для альбумина не попадает в этот интервал (ДВДС, Бкомзр). Наконец, если распределение для обеих белков характеризуется существенной долей центров с ка (0,3 : 0,02 мл/(нг сок) 1, можно предположить низкие гемосовместимыо свойства такой поверхности (кварц). При рассмотрении часто используемого критерия - отношение количества адсорбированного ЧСА к КГ было обнаруййно, что лучшая корреляция наблюдается между гемосов-местностью и эти.« параметром, если учитывать только часть распределения с (Таблица 4). Отмечено, что при увеличении интенсивности структурных изменений в адсорбированном слое ЯГ наблюдается саихшив гадгасовмэстимоети (Таблица 4).

ВЫВОДЫ.

1. Разработан метод флуоресценции полного внутреннего отражения ' для исследования в реальном масштабе врэмени процэссов . взаимодействия белкоз нлазш крови с поверхностью оптически прозрачных биоматериалов.

2. Обнаружено, что вид кинетических кривых адсорбции альбумина и гаммаглобулика имеет фрейндлиховсккй характер для блоксогюлимеров, логарифмический - дяя кварца, лангмюровскиа- для адсорбции альбумияа на поверхности полидиметилсилоксана (ДЩЗ), диффузионно-лимитируемый - для гвдроксилированного ЦЦМС.

3. Предложена и экспериментально обоснована теоретичоскап модель адсорбции, уплывающая неоднородность взагаодействия белок/ поверхность и возможность структурных изменения п адсорбированном белковом слое.

4. В рамках разработанной модели получены характеристические параметры адсорбции и десорбции бежав (виды распределении центров адсорбции по логарифму констант скорости адсорбции и десорбции кд, степень структурных изменений в адсорбированном слое) для проведения сравнительного анализа адсорбционного взаимодействия белок/поверхность.

5. Tía основании температурных зависимостей адсорбции альбумина на поверхности кварца овеноны термодинамические параметры распределения центров адсорбции: минимальная знергия активации - 2,5 ккзл/моль, предзкопопенциалькый множитель - 180 мл/(мг сек). Обнаружено увеличение плотности адсорбщонвых цзнтроз при увеличении температуры с 45°С.

6. Показано, что кинетические кривые адсорбции атьбумина на поверхности Биомера описываются моделью, учитывающей поверхностное перераспределение адсорбированного белка посредством латеральной диффузии (зависимые центры адсорбции).

7. Обнарушно увеличение анизотропии флуоресценции необратимо адсорбированного слоя гаимаглобулина при уменьшении степени падрофильноспг прэдваригзльно пщпатированной поверхности поликеров. Выдвинуто предположение о зависимости величины айизотропии флуоресценции от характеристик поверхностного распредоленил адсорбированного белка.

8. Показана взаимосвязь характеристических параметров распределит«! адсорбционных центров с гемосовместамыки свойствами исследованных биоматериалов.

Список работ, опубликованы! по ма-: зриалам диссертации:

I. А.Н. Асанов, Э.А. Кулик, В.И. Севастьянов . Энергетическая неоднородность поверхности твердых тол при взаимодействии с белками. ДАН ЛН СССР, 296, 3, 735-740, 1037.

?.. Э.А. 1Сулик. Метод флуоресценции полного внутреннего отражения длг, исследования адсорбции белков. Груды МФТИ, 15С-Ш, 1988.

3. И.Л. Калинин, Э.А. Кулик, В.И. Севастьянов. Адсорбция сывороточно; альбумина чесловека на катимую и альбуминизированную поверхность аморфного кварца. Биофизика, 38, 2, 271-275, 1991.

4. Э.А. Кулик, И.Д. Калинин, В,И. Севастьянов. Кинетики адсорбции альбумина на поверхность КЕарца. ШФХ, 05, 8, 2230-2234, 1991.

Б. 3.А. Кулик, В.И. Севастьянов. Энергетическая неоднородность взаимодействия белок/поверхность и структурные изменения в адсорбированном белковом слое. К(ФХ, 65, 8, 2235-2239 , 8, 1991.

6. Sevastif.nov V. I.JCulik Е. A. .Kalinin I. D. The model of continuous heterogeneity of prolein/surface interactions for human serum albumin and human i minunoy 1 ©bul i n—G adsorption onto

quartz/^J. Colloid Interface Sci., 1SQ1 , in press.

7. Kulik E. A. , ICali ni n I.D. ,Sevastianov V.I. Energetic heterogeneity of protêtn/surface interactions and structural alterations of adsorbed protein// Artif. Organs. , N10, 1991. in press.

Ротапринт MiTH Зак. 1/300 тир. ЮОэкз. 10.07.91