Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный анализ ГФИ-дефицитного клонального гематопоэза в пароксизмальной ночной гемоглобинурии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лякишева, Анна Владимировна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия: Клиническая картина

1.2. Клеточный фенотип в ПНГ.

1.3. Комплемент-опосредованный гемолиз.

1.4. Биосинтез ГФИ-якоря и PIG-A ген.

1.5. ПНГ как результат клональной экспансии ГФИ-дефицитных клеток.

1.5.1. Стволовые клетки в ПНГ обладают внутренним ростовым преимуществом, которое не обусловлено мутацией гена PIG-А.

1.5.2. Гипотеза клеточной селекции и "иммунного побега" в ПНГ.

1.5.3. Устойчивость к апоптозу.

1.5.4. Возникнование дополнительных изменений в репертуаре клеточной активации неоходимо для развиия ПНГ.

2. Материалы и Методы.

2.1. Материалы.

2.1.1. Химические вещества и реагенты.

2.1.2. Буферные и др растворы.

2.1.3. Бактериальные штаммы, векторы для клонирования и плазмиды

2.1.4. Олигонуклеотиды и праймеры.

2.1.5. Линии эукариотических клеток.

2.1.6. Ферменты.

2.1.7. Антитела.

2.1.8. Другие материалы.

2.1.9. Наборы.

2.1.10. Лабораторное оборудование.

2.2. Методы.

2.2.1. Модификация ДНК.

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.3. Выделение РНК.

2.2.4. Выделение геномной ДНК.

2.2.5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.2.6. ОТ-ПЦР.

2.2.7. Выделение и очистка ПЦР продуктов и ДНК фрагментов из агарозного геля.

2.2.8. Определение концентрации нуклеиновых кислот.

2.2.9. Осаждение нуклеиновых кислот.

2.2.10. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот.

2.2.11. Щелочной блоттинг РНК.

2.2.12. Нозерн блот анализ.

2.2.13. Клонирование.

2.2.14. Трансформация Е. coli.

2.2.15. ДНК секвенирование.

2.2.16. Культивирование эукариотических клеток.

2.2.17. Получение Т-клеточных линий из пациентов с ПНГ.

2.2.18. Выделение мононуклеарных клеток и гранулоцитов.

2.2.19. ПЦР-основаный фингерпринтинг РНК.

2.2.20. Гибридизация с панелью кДНК.

2.2.21. Анализ на проточном цитофлуориметре (FACS).

2.2.22. In vitro стимуляция гранулоцитов.

2.2.23. Флуоресцентный in situ гибридизационный анализ (FISH).

3. Результаты.

3.1. Идентификация генов, дифференциально экспрессирующихся в ГФИ-положительных и ГФИ-отрицательных клетках при ПНГ.

3.1.1. Получение ГФИ-положительных и ГФИ-отрицательных ПНГ клонов.

3.1.2. Гибризация с Atlas кДНК панелью экспрессии генов.

3.1.3. PCR-основанный дифференциальный скрининг - РНК фингерпринтинг.

3.1.4. Гены с модулированной экспрессией в ГФИ-дефицитных ПНГ клетках.

3.2. EGR-1 и TAXREB107: изучение экспрессии.

3.2.1. Пациенты, исследованные в этой работе.

3.2.2. Получение EGR-1 и р-актин проб.

3.2.3. Экспрессия EGR-1 в ПНГ гранулоцитах.

3.2.4. Экспрессия в гранулоцитах пациентов с другими гематологическими заболеваниями.

3.2.5. Получение TAXREBlOZ-специфических проб.

3.2.6. Экспрессия TAXREB107 в гранулоцитах ПНГ пациентов и пациентов с родственными гематологическими заболеваниями

3.3. Оверэкспрессия Egr-1 и измененный уровень цитокинов.

3.4. EGR-1: анализ up-stream транскрипционных факторов.

3.4.1. Пробы, использованные в Northern блот анализе.

3.4.2. Анализ экспрессии регуляторов транскрипции EGR-1 - SRF,

STAT5a и STAT5b.

3.5. Анализ хромосомной организации EGR-1, структуры гена и транскрипта.

3.5.1. Исследование промоторной области EGR-1 гена.

3.5.2. Исследование кодирующего региона EGR-1.

3.5.3. FISH анализ.

4. Обсуждение.

4.1. Клональная экспансия в ПНГ: следствие иммунологической селекции или дополнительных генных изменений?.

4.2. Дифференциальная экспрессия генов в ПНГ.

4.3. TAXREB107.

4.4. EGR-1.

4.5. Молекулярные изменения в ПНГ.

5. Список сокращений.

6. Список производителей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярный анализ ГФИ-дефицитного клонального гематопоэза в пароксизмальной ночной гемоглобинурии"

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) - приобретенный ютональный дефект гематопоэтических стволовых клеток, характеризующийся появлением клеток периферической крови, имеющих дефицит гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ) - заякоренных поверхностных белков. Такими белками являются ингибиторы активации комплемента CD55 и CD59, недостаток которых и вызывает гиперчувствительность эритроцитов ПНГ пациентов к комплементу, приводящую к интраваскулярному гемолизу. Причиной ГФИ-дефицита являются мутации в гене PIG-A, продукт которого является одним из ключевых ферментов в биосинтезе ГФИ-якоря.

Однако механизм, позволяющий ГФИ-дефицитным гематопоэтическим стволовым клеткам при ПНГ доминировать в костном мозге и вносить значительный вклад в гематопоэз, до сих пор остается необъясненным. Показано, что мутации гена PIG-A не являются достаточным условием для клональной экспансии и развития ПНГ. В ПНГ, также как в А А и МДС, были обнаружены генетическая нестабильность и увеличенная частота мутации. Поэтому представляется вероятным наличие дополнительных генетических изменений, мутаций или дифференциальной экспрессии генов, приводящих к клональной экспансии ГФИ-дефицитных гематопоэтических стволовых клеток костного мозга в ПНГ.

Б связи с вышеизложеным цель настоящего исследования состояла в изучении молекулярных основ клональной экспансии в ПНГ и идентификации генов, дифференциально экспрессированных в нормальных и ГФИ-дефицитных клетках ПНГ пациентов, анализе найденных генов, подтверждении их дифференциальной экспрессии и их характеристика в ПНГ.

1. Обзор литературы

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лякишева, Анна Владимировна, Ганновер

1. Armstrong, C J. Schubert, E. Ueda, J. J. Knez, D. Gelperin, et al. (1992). "Affected paroxysmal nocturnal hemoglobinuria T lymphocytes harbor a common defect in assembly of N-acetyl-D-glucosamine inositol phospholipid corresponding to that in class A Thy-1- murine lymphoma mutants." Biol Chem 267(35): 25347-

2. Bastisch, I., A. Tiede, M. Deckert, A. Ziolek, R. E. Schmidt, et al. (2000). "Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-deficient Jurkat T cells as a model to study functions of GPI-anchored proteins." Clin Exp Immunol 122(1): 49-

3. Bessler, M. and P. Hillmen (1998). "Somatic mutation and clonal selection in the pathogenesis and in the control of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Semin Hemntol 35(2): 149-

4. Bessler, M., P. Hillmen, L. Longo, L. Luzzatto and P. J. Mason (1994). "Genomic organization of the X-linked gene (PIG-A) that is mutated in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria and of a related autosomal pseudogene mapped to 12q21." Hum Mol Genet 3(5): 751-

5. Bessler, M., P. Mason, P. Hillmen and L. Luzzatto (1994). "Somatic mutations and cellular selection in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria." Lancet 343(8903): 951-3. 96

6. Brodsky, R. A., M. S. Vala, J. P. Barber, M. E. Medof and R. J. Jones (1997). "Resistance to apoptosis caused by PIG-A gene mutations in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Proc Nntl Acad Sci USA 94(16): 8756-

7. Cao, X. M., R. A. Koski, A. Gashler, M. McKiernan, C. F. Morris, et al. (1990). "Identification and characterization of the Egr-1 gene product, a DNAbinding zinc finger protein induced by differentiation and growth signals." Mol Cell Biol 10(5): 1931-

8. Chomczynski, P. (1992). "One-hour downward alkaline capillary transfer for blotting of DNA and RNA." And Biochem 201(1): 134-

9. Coffer, P. J., L. Koenderman and R. P. de Groot (2000). "The role of STATs in myeloid differentiation and leukemia." Oncogene 19(21): 2511-

10. Consalez, G. G., A. Cabibbo, A. Corradi, C. Alii, M. Sardella, et al. (1999). "A computer-driven approach to PCR-based differential screening, alternative to differential display." Bioinformntics 15(2): 93-

11. Cosimi, A. В., Peters, D. Harmon and L. Ellman (1982). "Treatment of severe aplastic anemia with a prolonged course of anti-thymocyte globulin." Transplant Proc 14(4): 761-

12. Cosman, D., J. Mullberg, C. L. Sutherland, W. Chin, R. Armitage, et al. (2001). "ULBPs, novel MHC class I-related molecules, bind to CMV glycoprotein UL16 and stimulate NK cytotoxicity through the NKG2D receptor." Immunity li{2): 123-33. 97

13. Dameshek, W. (1967). "Riddle: what do aplastic anemia, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) and "hypoplastic" leukemia have in common?" Blood 3Q{2): 251-

14. Davitz, M. A., M. G. Low and V. Nussenzweig (1986). "Release of decayaccelerating factor (DAF) from the cell membrane by phosphatidylinositolspecific phospholipase С (PIPLC). Selective mociification of a complement regulatory protein." Exp Med 163(5): 1150-61. de Belle, L, R. P. Huang, Y. Fan, С Liu, D. Mercola, et al. (1999). "p53 and Egr-1 additively suppress transformed growth in Htl080 cells but Egr-1 counteracts p53-dependent apoptosis." Oncogene 18(24): 3633-

15. Dinkel, A., K. Warnatz, Б. Ledermann, A. Relink, P. F. Zipfel, et al. (1998). "The transcription factor early growth response 1 (Egr-1) advances differentiation of pre-B and immature В cells." Exp Med 188(12): 2215-

16. Dunn, D. E., P, Tanawattanacharoen, P. Boccuni, S. Nagakura, S. W. Green, et al. (1999). "Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria cells in patients with bone marrow failure syndromes." Ann Intern Med 131(6): 401-

17. Dunn, D. E., R. E. Ware, C. J. Parker, H. O. Mishoe and N. S. Young (1999). "Research directions in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Immunol Torfy 20(4): 168-

18. Eid, M. A., M. V. Kumar, K. A. Iczkowski, D. G. Bostwick and D. J. Tindall (1998). "Expression of early growth response genes in human prostate cancer." Cancer Res 58(11): 2461-8. 98

19. Frickhofen, N., J. P. Kaltwasser, H. Schrezenmeier, A. Raghavachar, H, G. Vogt, et al. (1991). "Treatment of aplastic anemia with antilymphocyte globulin and methylprednisolone with or without cyclosporine. The German Aplastic Anemia Study Group." N Engl J Med 324(19): 1297-

20. Gashler, A. and V. P. Sukhatme (1995). "Early growth response protein 1 (Egr-1): prototype of a zinc-finger family of transcription factors." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 50:191-

21. Gashler, A. L., S. Swaminathan and V. P. Sukhatme (1993). "A novel repression module, an extensive activation domain, and a bipartite nuclear localization signal defined in the immediate-early transcription factor Egr-1." Mol Cell Biol 13(8): 4556-

22. Gluckman, E., A. Devergie, A. Poros and P. Degoulet (1982). "Results of immunosuppression in 170 cases of severe aplastic anaemia. Report of the European Group of Bone Marrow Transplant (EGBMT)." Br Hnciimtol 51(4): 541-

23. Hall, S. E. and W. F, Rosse (1996). "The use of monoclonal antibodies and flow cytometry in the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Blood 87(12): 5332-

24. Ham, T. H. and J. H. Dingle (1939). "Studies on destruction of red blood cells. II. Chronic hemolytic anemia with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: certain immunological aspects of the hemolytic mechanism with special reference to serum complement." Clin Invest 18: 657-72. 99

25. Heaney, M. L. and D. W. Golde (1999). "Myelodysplasia." N Engl Med 340(21): 1649-

26. Hertenstein, В., В. Wagner, D. Bunjes, С Duncker, A. Raghavachar, et al. (1995). "Emergence of CD52-, phosphatidylinositolglycan-anchor-deficient T lymphocytes after in vivo application of Campath-IH for refractory B-cell non-Hodgkin lymphoma." BZoorf 86(4): 1487-

27. Hillmen, P., S. M. Lewis, M. Bessler, L. Luzzatto and J. V. Dacie (1995). "Natural history of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." N Engl Med 333(19): 1253-

28. Holguin, M. H., L. R. Fredrick, N. J. Bernshaw, L. A. Wilcox and C. J. Parker (1989). "Isolation and characterization of a membrane protein from normal human erythrocytes that inhibits reactive lysis of the erythrocytes of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Clin Invest 84(1): 7-

29. Hong, Y., K. Ohishi, R. Watanabe, Y. Endo, Y. Maeda, et al. (1999). "GPIl stabilizes an enzyme essential in the first step of glycosylphosphatidylinositol biosynthesis." Biol Chem 274(26): 18582-

30. Horejsi, v., M. Cebecauer, J. Cerny, T. Brdicka, P. Angelisova, et al. (1998). "Signal transduction in leucocytes via GPI-anchored proteins: an experimental artefact or an aspect of immunoreceptor function?" Immunol Lett 63(2): 63-73. 100

31. Inoue, N., T. Izui, M. Kuwayama, J.-I. Nishimura, K. Kurokawa, et al. (2001). "HMGl-C, a Candidate Protein Involved in Clonal Expansion of PNH cells." Blood 98(11): 221a. Issaragrisil, S., A. Piankijagum, S. Chinprasertsuk and M. Kruatrachue (1986). "Growth of mixed erythroid-granulocytic colonies in culture derived from bone marrow of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria without addition of exogenous stimulator." Exp Heinntol 14(9): 861-

32. Iwamoto, N., T. Kawaguchi, K. Horikawa, S. Nagakura, T. Kagimoto, et al. (1996). "Preferential hematopoiesis by paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clone engrafted in SCID mice." Blood 87(12): 4944-

33. Iwanaga, M., K. Furukawa, T. Amenomori, H. Mori, H. Nakamura, et al, (1998). "Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria clones in patients with myelodysplastic syndromes." BrJHnemntol 102(2): 465-

34. Karadimitris, A. and L. Luzzatto (2001). "The cellular pathogenesis of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria." Leukemin 15(8): 1148-

35. Karadimitris, A., J. S. Manavalan, H. T. Thaler, R. Notaro, D. J. Araten, et al. (2000). "Abnormal T-cell repertoire is consistent with immune process underlying the pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Blood 96(7): 2613-

36. Karadimitris, A., R. Notaro, G. Koehne, I. A. Roberts and L. Luzzatto (2000). "PNH cells are as sensitive to T-cell-mediated lysis as their normal 101

37. Kawagoe, K., D. Kitamura, M. Okabe, I. Taniuchi, M. Ikawa, et al. (1996). "Glycosylphosphatidylinositol-anchor-deficient mice: implications for clonal dominance of mutant cells in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Blood 87(9): 3600-

38. Keller, P., G. Tremml, V. Rosti and M. Bessler (1999). "X inactivation and somatic cell selection rescue female mice carrying a Piga-null mutation." Proc Natl Acad Sci USA 96(13): 7479-

39. Khachigian, L. M. and T. Collins (1998). "Early growth response factor 1: a pleiotropic mediator of inducible gene expression." Mol Med 76(9): 613-

40. Killick, S. В., V. Сох, J. Marsh, E. Gordon-Smith and F. M. Gibson (2000). "Mechanisms of bone marrow progenitor cell apoptosis in aplastic anaemia and the effect of anti-thymocyte globulin: examination of the role of the Fas-Fas-L interaction." Br Haematol 111(4): 1164-

41. Krishnaraju, K., B. Hoffman and D. A. Liebermann (1998). "The zinc finger transcription factor Egr-1 activates macrophage differentiation myeloblastic leukemia cells." Blood 92(6): 1957-

42. Krishnaraju, K., B. Hoffman and D. A. Liebermann (2001). "Early growth response gene 1 stimulates development of hematopoietic progenitor cells along the macrophage lineage at the expense of the granulocyte and erythroid lineages." Blood 97(5): 1298-

43. Lewis, S. M. and J. V. Dacie (1967). "The aplastic anaemia-paroxysmal nocturnal haemoglobinuria syndrome." Br Haematol 13(2): 236-51. in Ml 102

44. Lin, J. X. and W. J. Leonard (1997). "The immediate-early gene product Egr-1 regulates the human interleukin-2 receptor beta-chain promoter through noncanonical Egr and Spl binding sites." Mol Cell Biol 17(7): 3714-

45. Liu, J., L. Grogan, M. M. Nau, C. J. Allegra, E. Chu, et al. (2001). "Physical interaction between p53 and primary response gene Egr-1." hit J Oncol 18(4): 863-

46. Low, M. (2000). Structure and function of GPI-specific phospholipases. PNH and the GPI-linked Proteins. N. Young and J. Moss. San Diego, Academic Press: 239-

47. Luzzatto, L. and M. Bessler (1996). "The dual pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Ciirr Opin Hemntol 3(2): 101-

48. Luzzatto, L., M. Bessler and B. Rotoli (1997). "Somatic mutations in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: a blessing in disguise?" Cell 88(1): 1-

49. Luzzatto, L. and K. Nafa (2000). Genetics of PNH. PNH and the GPI-linked Proteins. N. Young and J. Moss. San Diego, Academic Press: 21-

50. Maciejewski, J. P., C. Rivera, H. Kook, D. Dunn and N. S. Young (2001). "Clinical features of the relationship between aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Br Haematol in press. Maciejewski, J. P., E. M. Sloand, T. Sato, S. Anderson and N. S. Young (1997). "Impaired hematopoiesis anemia is not in paroxysmal with a nocturnal selective hemoglobinuria/aplastic associated 103

51. Meyyappan, M., K. Wheaton and K. T. Riabowol (1999). "Decreased expression and activity of the immediate-early growth response (Egr-1) gene product during cellular senescence." Cell Physiol 179(1): 29-

52. Miyata, Т., J. Takeda, Y. lida, N. Yamada, N. Inoue, et al. (1993). "The cloning of PIG-A, a component in the early step of GPI-anchor biosynthesis." Science 259(5099): 1318-

53. Miyata, Т., N. Yamada, Y. lida, J. Nishimura, J. Takeda, et al. (1994). "Abnormalities of PIG-A transcripts in granulocytes from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." N Engl j Med 330(4): 249-

54. Mora-Garcia, P. and K. M. Sakamoto (2000). "Granulocyte colony- stimulating factor induces Egr-1 up-regulation through interaction of serum response element-binding proteins." Biol Chem 275(29): 22418-

55. Muthukkumar, S., S. S. Han, V. M. Rangnekar and S. Bondada (1997). "Role of Egr-1 gene expression in В cell receptor-induced apoptosis in an immature В cell lymphoma." Biol Chem 272(44): 27987-

56. Nafa, K., P. J. Mason, P. Hillmen, L. Luzzatto and M. Bessler (1995). "Mutations in the PIG-A gene causing paroxysmal nocturnal hemoglobinuria are mainly of the frameshift type." Blood 86(12): 4650-

57. Nagata, K., K. Ohtani, M. Nakamura and K. Sugamura (1989). "Activation of endogenous c-fos proto-oncogene expression by human T-cell leukemia virus 104

58. Nair, P., S. Muthukkumar, S. F. Sells, S. S. Han, V. P. Sukhatme, et al. (1997). "Early growth response-1-dependent apoptosis is mediated by p53." Biol Chem 272(32): 20131-

59. Nakakuma, H., S. Nagakura, T. Kawaguchi, K. Horikawa, N. Iwamoto, et al. (1997). "Markedly high plasma erythropoietin and stimulating factor levels in patients with granulocyte-colony nocturnal paroxysmal hemoglobinuria." IntJHemntol 66(4): 451-

60. Nguyen, H. Q., B. Hoffman-Liebermann and D. A. Liebermann (1993). "The zinc finger transcription factor Egr-1 is essential for and restricts differentiation along the macrophage lineage." Cell 72(2): 197-

61. Nicholson-Weller, A., J. P. March, S. I. Rosenfeld and K. F. Austen (1983). "Affected erythrocytes of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria are deficient in the complement regulatory protein, decay accelerating factor." Proc Nntl Acnd Sci USA 80(16): 5066-

62. Nishimura, J., Y. Murakami and T. Kinoshita (1999). "Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: An acquired genetic disease." Am Hemntol 62(3): 175-

63. Nissen, C A. Genitsch, S. Sendelov, V. Dalle Carbonate and A. WodnarFilipowicz (2000). "Cell cycling stress in the monocyte line as a risk factor for progression of the aplastic anaemia/paroxysmal nocturnal haemoglobinuria syndrome to myelodysplastic syndrome." Acta Hnemntol 103(1): 33-

64. Novitzky, N., R. Mohamed, J. Finlayson and C. du Toit (2000). "Increased apoptosis of bone marrow cells and preserved proliferative capacity of 105

65. Oni, S. В., В. О. Osunkoya and L. Luzzatto (1970). "Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: evidence for monoclonal origin of abnormal red cells." Blood 36(2): 145-

66. Ostendorf, Т., Nischan, J. Schubert, T. Grussenmeyer, C. Scholz, et al. (1995). "Heterogeneous PIG-A mutations in different paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Blood 85(6): 1640-6. cell lineages in Parker, C. J. (1996). "Molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Stem Cells 14(4): 396-

67. Pende, D., С Cantoni, P. Rivera, M. Vitale, R. Castriconi, et al. (2001). "Role of NKG2D in tumor cell lysis mediated by human NK cells: cooperation with natural cytotoxicity receptors and capability of recognizing tumors of nonepithelial origin." Eur Immunol 31(4): 1076-

68. Perez-Castillo, A., C. Pipaon, I. Garcia and S. Alemany (1993). "NGFI-A gene expression is necessary for T lymphocyte proliferation." Biol Chem 268(26): 19445-

69. Porcelli, S. A. and R. L. Modlin (1999). "The CDl system: antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids." Awni Rev Immunol 17: 297-

70. Prince, G. M., M. Nguyen, H. M- Lazarus, R. A. Brodsky, L. W. Terstappen, et al. (1995). "Peripheral blood harvest of unaffected CD34+ CD38- hematopoietic precursors in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Blood 86(9): 3381-6. 106

71. Rolli, M., A. Kotlyarov, K. M. Sakamoto, M. Gaestel and A. Neininger (1999). "Stress-induced stimulation of early growth response gene-1 by p38/stress-activated protein kinase 2 is mediated by a cAMP-responsive promoter element in a MAPKAP kinase 2-independent manner." Biol Chem 274(28): 19559-

72. Rosti, v., G. Tremml, V. Soares, P. P. Pandolfi, L. Luzzatto, et al. (1997). "Murine embryonic stem cells without pig-a gene activity are competent for hematopoiesis with the PNH phenotype but not for clonal expansion." Clin Invest 100(5): 1028-

73. Rotoli, В., R. Robledo and L. Luzzatto (1982). "Decreased number of circulating BFU-Es in paroxysmal nocturnal heiTioglobinuria." Blood 60(1): 157-

74. Rotoli, В., R. Robledo, N. Scarpato and L. Luzzatto (1984). "Two populations of erythroid cell progenitors in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Blood 64(4): 847-

75. Sakamoto, K. M., C. Bardeleben, K. E. Yates, M. A. Raines, D. W. Golde, et al. (1991). "5 upstream sequence and genomic structure of the human primary response gene, EGR-1/TIS8." Oncogene 6(5): 867-

76. Schofield, L., M. J. McConville, D. Hansen, A. S. Campbell, B. Fraser-Reid, et al. (1999). "CDld-restricted immunoglobulin G formation to GPI-anchored antigens mediated by NKT cells." Science 283(5399): 225-9. 107

77. Schubert, J., T. Ostendorf and R. E. Schmidt (1994). "Biology of GPI anchors and pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." hnvmnol Today 15(7): 299-

78. Schwachtgen, J. L., С J. Campbell and M. Braddock (2000). "Full promoter sequence of human early growth response factor-1 (Egr-1): demonstration of a fifth functional serum response element." DNA Seq 10(6): 429-

79. Smithgall, T. E. (1998). "Signal transduction pathways regulating hematopoietic differentiation." Pharmacol Rev 50(1): 1-

80. Socle, G., J. Y. Mary, A. de Gramont, B, Rio, M. Leporrier, et al. (1996). "Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria: long-term follow-up and prognostic factors. French Society of Haematology." Lancet 348(9027): 573-

81. Sodroski, J. G., С A. Rosen and W. A. Haseltine (1984). "Trans-acting transcriptional activation of the long terminal repeat of human T lymphotropic viruses in infected cells." Science 225(4660): 381-

82. Striibung, P. (1882). "Paroxysmale Hamoglobinurie." Dtsch Med Wodienschr 8(1-3): 18-

83. Takahashi, M., J. Takeda, S. Hirose, R. Ну man, N. Inoue, et al. (1993). "Deficient biosynthesis of N-acetylglucosaminyl-phosphatidylinositol, the first intermediate of glycosyl phosphatidylinositol anchor biosynthesis, in cell lines established from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Exp Med 177{2): 517-21. 108

84. Taniguchi, M. and T. Nakayama (2000). "Recognition and function of Valphal4 NKT cells." Semin Immunol 12(6): 543-

85. Tian, S. S., P. Tapley, C. Sincich, R. B. Stein, J. Rosen, et al. (1996). "Multiple signaling pathways induced by granulocyte colony-stimulating factor involving activation of JAKs, STATS, a n d o r STAT3 are required for regulation of three distinct classes of immediate early genes." Blood 88(12): 4435-

86. Varnum, B. C R. W. Lim, D. A. Kujubu, S. J. Timer, S. E. Kaufman, et al. (1989). "Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and tetradecanoyl phorbol acetate induce a distinct, restricted subset of primaryresponse TIS genes in both proliferating and terminally myeloid cells." Mol Cell Biol 9(8): 3580-

87. Ware, R. E., S. E. Hall and W. F. Rosse (1991). "Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria with onset in childhood and adolescence." N Engl J Med 325(14): 991-

88. Ware, R. E., J. Nishimura, M. A. Moody, С Smith, W. F. Rosse, et al. (1998). "The PlG-A mutation and absence of glycosylphosphatidylinositol-linked proteins do not confer resistance to apoptosis in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria." Blood 92(7): 2541-

89. Watanabe, R., Y. Murakami, M. D. Marmor, N. Inoue, Y. Maeda, et al. (2000). "Initial enzyme for glycosylphosphatidylinositol biosynthesis requires PIG-P and is regulated by DPM2." EMBO J 19(16): 4402-11. differentiated 109

90. Welsh, J., K. Chada, S. S. Dalai, R. Cheng, D. Ralph, et al. (1992). "Arbitrarily primed PCR fingerprinting of RNA." Nucleic Acids Res 20(19): 4965-

91. Yamaguchi, M., T. Machii, Y. Azenishi, J. Nishimura, M. Shibano, et al. (2000). "Detection of small populations of CD59-deficient erythrocytes in patients with aplastic anemia or myelodysplastic syndrome and normal individuals." Blood Cells Mol Dis 26(3): 247-

92. Young, N. S. (1992). "The problem of clonality in aplastic anemia: Dr Damesheks riddle, restated." Blood 79(6): 1385-

93. Young, N. S. and J. P. Maciejewski (2000). "Genetic and environmental effects in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: this little PIG-A goes "Why? Why? Why?"." J Clin Invest 106(5): 637-4\. 110