Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования"

На правах рукописи

ПАНЬКОВА Виктория Владимировна

АЛЛОЗИМНЫЕ СПЕКТРЫ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТ ИЗОМЕРАЗЫ У ПОЛИДОРИД (РОЬУСНАЕТА: вРЮЫЮАЕ) И ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИХ ФОРМИРОВАНИЯ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2006

Работа выполнена в Институте биологии моря имени А. В. Жирмунского ДВО РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Манченко Геннадий Петрович

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН

доктор биологических наук Булгаков Виктор Павлович

доктор биологических наук Балакирев Евгений Станиславович

Ведущая организация: Институт биологических проблем севера

ДВО РАН

Защита состоится « o^-d* » — 2006 г. в «. » часов

на заседании диссертационного совета Д 005.008.01 при Институте биологии моря имени А. В. Жирмунского ДВО РАН Адрес: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17 Факс: (4232) 31-09-00 E-mail: ¡nmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря имени А. В. Жирмунского ДВО РАН

Автореферат разослан «р -/г _» С^^пл^/ъЛ.—2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук ^сил^е^н^о м- А- ВаЩенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изоферменты - множественные молекулярные формы одного и того же фермента, давно и успешно используются в качестве маркеров генов в различных областях биологии и медицины. Наиболее широкое применение они нашли в популяционной генетике для исследования генетической изменчивости природных популяций и видов. Ключевым моментом в использовании изоферментов как маркеров генов является ясная генетическая интерпретация результатов ферментного электрофореза. Однако, в литературе описано много необычных изофер-ментных спектров, не нашедших обоснованного и убедительного объяснения. К числу таких случаев относится недавно описанный необычный электрофоретический спектр димерного фермента глюкозо-6-фосфат изомеразы (ГФИ) у полихеты Ро!удога Ьгем'ра1ра (Ро1усЬае1а: БрютсЗае) (МапсЬепко, 2001). Анализ таких спектров, трудных для традиционной интерпретации, представляется важным и своевременным.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в выяснении молекулярных механизмов формирования изофермент-ных спектров ГФИ у полидорид (Ро1усЬае1а: Зрюгис1ае).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать изоферментные спектры ГФИ у десяти видов полидорид (Ро1усИае1а: ЭрюшсЗае).

2. Исследовать сопряженность экспрессии изофермента ГФИ-2 с полом у десяти видов полидорид.

3. Исследовать тканеспецифичность экспрессии изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2.

Научная новизна работы. Проведено электрофоретическое исследование изоферментных спектров глюкозо-6-фосфат изомеразы (ГФИ) у десяти видов полидорид родов Ро/ус/ога и 0)ро/ус/ога (Ро1усЬае1а: Брюгн-с1ае), ранее не исследованных в этом отношении. Установлено, что у всех исследованнных видов полидорид экспрессируется два изофермента (ГФИ-1 и ГФИ-2), один из которых (ГФИ-2) экспрессируется только у самцов. Проведено исследование тканеспецифичности экспрессии изоферментов ГФИ. Показано, что изофермент ГФИ-1 экспрессируется преимущественно в соматических тканях у особей обоих полов и в незначительных количествах в диплоидных сперматогенных клетках самцов. Изофер-

мент ГФИ-2 экспрессируется в диплоидных сперматогенных клетках самцов. Установлен факт гибридизации изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у всех исследованных видов. Показано, что у каждого из исследованных видов полидорид, среди особей, экспрессирующих оба изофермента, преобладают те, которые имеют идентичные аллозимные спектры ГФИ-1 и ГФИ-2. Впервые сделана оценка доли таких особей у 10 исследованных видов.

Впервые получены данные, свидетельствующие в пользу гипотезы о том, что альтернативный сплайсинг (АС) способен генерировать изофер-менты, которые на электрофоретических гелях могут быть неотличимы от классических изоферментов, определяемых разными генными локусами.

Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные данные, говорящие о том, что изоферменты ГФИ полидорид генерируются АС, послужат важной предпосылкой для формулирования положений новой концепции изоферментов, учитывающей важную роль АС в их генерировании. Это составит основу для ясной генетической интерпретации электрофоретических данных и подтвердит для изоферментов статус надежных генных маркеров.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы докладывались на IV Региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 2001); Международной конференции: «Evolution, Genetics, Ecology and Biodiversity» (MAPEEG) (Владивосток, МБС «Восток», 2001), VII Дальневосточной молодежной школе - конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, МЭС ТИБОХ, 2003) и ежегодных научных конференциях Института биологии моря (Владивосток, 2004, 2006). По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 209 ссылок. Диссертация изложена на 108 страницах, содержит 4 таблицы и 43 рисунка.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю Г.П. Манченко за руководство, помощь и поддержку при выполнении работы, В.И. Радашевскому за помощь в сборе материала и определении видов, А.И. Пудовкину и В.А. Брыкову за ценные замечания и рекомендации при написании и оформлении работы, а также всему коллективу Лаборатории генетики ИБМ ДВО РАН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Были исследованы выборки особей десяти видов полижет родов Ро!ус1ога и О/ро/ус/ога семейства Эрютс1ае (Таблица 1). Все виды были собраны в заливе Восток (залив Петра Великого) Японского моря в период с 2001 по 2006 год, за исключением Р. 1Ысо1а и Р. согпМа, которые были собраны в бухте Золотой Рог (Амурский залив (залив Петра Великого)) в 2004 году.

Особей Р. Ьж1ра1ра, О. и О. сагипсиШа собирали из разби-

тых раковин гребешка М'^иЬоре^еп уеггоелз/г; Р. д)усутепса - из раковин 0!усутеп8 уегзоепг/з; Р.са1сагеа, Р. тапсЬепко! и О. соттепваНз - из раковин Сгур^паИса /алМюэКУпа, заселенных раками-отшельниками. Особей Р. согпиЬа и О. сагбаНа извлекали из илистых трубочек, собранных на глубине 3-4 м, на заиленных песчаных грунтах, в районе МБС Восток ИБМ ДВО РАН. Исследованная выборка Р. //т/со/а собрана из обрастаний, сформировавшихся на судах, простоявших не менее 6 месяцев в бухте Золотой Рог. Пол червей определялся путем визуального исследования содержимого их гонад под бинокуляром.

Таблица 1. Виды полидорид и число исследованных особей.

Вид Число исследованных особей

1. Ро!уёога Ьгемра!ра 1051

2. Р. са/сагеа 321

3. Р. согпШа 33

4. Р. д1усутепса 43

5. Р. Нт'со1а 71

6. Р. тапсЬепко'! 83

1. 0:ро!ус1ога Ыdentata 107

8. О. сагбаИа 37

9. О. сагипсиШа 73

10. О. соттепваИэ 250

Для электрофореза использовали стандартную аппаратуру (Короч-кин и др., 1977). При исследовании состава изоферментных спектров и характера аллозимной (аллельной) изменчивости ГФИ, в качестве образцов для электрофореза использовали гомогенаты целых особей. Для определения тканеспецифичности экспрессии изоферментов ГФИ использовали препараты соматических тканей (головная часть, не несущая го-над), а также препараты половых продуктов самцов и самок, которые собирали из зрелых (наполненных) гонад путем их надрыва и сбора текучей спермы или яйцеклеток вместе с морской водой с помощью пипетки. Сперму и яйцеклетки отделяли от морской воды центрифугированием при 12000 д в течение 1 мин.

Электрофорез проводили в горизонтальном блоке 14% крахмального геля (195 х 140 х 3 мм) при температуре 3-4 С0 и силе тока 10-15 тА. Для геля, а также для катодного и анодного отсеков электрофоретической камеры, использовали модифицированную непрерывную трис-ЭДТА-боратную буферную систему (рН 8,4) (МапсЬепко, 2003, р. 550). Длительность электрофореза составляла 12-13 часов. По окончании электрофореза блок геля разрезали пополам на две пластины толщиной 1,5-2 мм. Нижний срез окрашивали на ферментативную активность, используя проявляющую смесь для фермента глюкозо-6-фосфат изомеразы (К.Ф. 5.3.1.9; ГФИ) (МапсГюпко, 2003).

Для оценки значимости различий между видами по доле идентичных фенотипов ГФИ-1 и ГФИ-2 и выявления однородных групп видов по этому признаку использовали стандартный Х*-критерий (Урбах, 1964):

~ Мц

где N1] - фактическое число ¡-ых фенотипов ко вида, N4 - ожидаемое их число при справедливости нулевой гипотезы.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Электрофоретические исследования изоферментных и аллозимных спектров ГФИ показали, что:

1) У всех исследованных видов электрофоретический спектр ГФИ представлен двумя изоферментами - ГФИ-1 и ГФИ-2. ГФИ-1 экспрессиру-ется у всех особей, а ГФИ-2 только у самцов. Таким образом, у самок спектр ГФИ представлен только изоферментами ГФИ-1, а у самцов ГФИ-1 и ГФИ-2. (см. рис.1, А).

2) У всех исследованных видов изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 демонстрируют аллозимную изменчивость, типичную для димерных ферментов. Аллозимные спектры гомозигот представлены одной зоной, а спектры ге-терозигот - тремя.

3) Исследование тканеспецифичности экспрессии изоферментов ГФИ у самцов пяти видов полидорид (Р. Ьге\/1ра1ра, Р. са/сагеа, Р. д!усутвпса, О. Ь;с/ел?а/а, О. соттепзаНз) показало, что изофермент ГФИ-1 экспрессируется преимущественно в соматических тканях и в незначительных количествах в сперматогенных клетках самцов. Изофермент ГФИ-2 экспрессируется только в сперматогенных клетках, где он практически полностью замещает изофермент ГФИ-1. (рис.1, А, Б). Трехполосные спектры изофермента ГФИ-2 у гетерозиготных самцов, свидетельствуют о том, что аллельные изоформы этого фермента формируют гибридные молекулы, а следовательно, их экспрессия сопряжена в пространстве и времени. Это в свою очередь свидетельствует о том, что экспрессия изофермента ГФИ-2 происходит в диплоидных сперматогенных клетках (сперматогониях или сперматоцитах I), где в каждой отдельной клетке экспрессируются продукты обоих аллелей (Панькова и Манченко, 2003). Если бы изофермент ГФИ-2 экспрессировался в гаплоидных клетках (сперматоцитах II, сперматидах, или сперматозоидах), то экспрессия разных аллелей была пространственно разобщена на клеточном уровне, и гибридных аллозимов не формировалось. Однако мы не исключаем, что ГФИ-2, синтезируемый в диплоидных клетках остается функциональным и в сперматозоидах.

Одинаковая тканеспецифичность экспрессии изофермента ГФИ-2 у всех пяти исследованных в этом отношении видов полидорид, которые относятся и к роду Ро!ус!ога и 0>ро1ус1ога, дает основания утверждать, что

(А)

! 2.3.3. 5 6 7 8 9 10 .11

(-) ГФИ-2

Гибриды

ГФИ-1/ГФИ-2

(Б)

МНШ

-СТАРТ-

ГФИ-1

ШТИИИ 2

Рис. 1. Зимограммы ГФИ Ро/ус/ога Ьгеу^рафа (А) и Р. са/сагеа (Б), демонстрирующие тканеспецифичность экспрессии изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 и формирование гибридов ГФИ-1/ГФИ-2.

(А): Дорожки 1,2- препараты одной самки: 1 - соматические ткани (головная часть не несущая гонад), 2 - яйцеклетки. Дорожки 3, 4 - препараты одного самца: 3 - соматические ткани, 4 - сперма. Дорожки 5-9 - 99:10,11 -

(Б): Дорожка 1-е?- Дорожки 2, 3 - препараты одного самца: 2 - соматические ткани (головная часть, не несущая гонад), 3 - сперма. Дорожки 4, 5 - препараты другого самца: 4 - соматические ткани, 5 - сперма.

у всех видов этих двух родов изофермент ГФИ-2 экспрессируется в диплоидных сперматогенных клетках.

Анализ тканеспецифичности экспрессии изоферментов ГФИ у самок показал, что и в соматических тканях и в яйцеклетках у них экспрессируется изофермент ГФИ-1 (рис.1, А).

4) У всех исследованных видов в электрофоретических спектрах ГФИ, выявляемых у особей, экспрессирующих оба изофермента, обнаруживаются межизоферментные гибриды ГФИ-1/ГФИ-2. Спектры гибридных изоферментов подвержены качественной и количественной индивидуальной изменчивости, что, вероятно, определяется состоянием гонад сам-цов(рис.1, Б).

5) Большинство особей каждого из исследованных видов демонстрировали согласованную аллозимную изменчивость изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 (имели идентичные аллозимные спектры изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 (рис.2)), и только редкие особи демонстрировали несогласованную аллозимную изменчивость (имели разные аллозимные спектры (рис.3)). Доля особей с идентичными аллозимными спектрами варьирует от 55 -100% (Табл. 2). Х2-тест показал, что различие между видами по доле идентичных фенотипов ГФИ-1 и ГФИ-2 очень существенно: X2 (с1( = 9) = 348.4, р< 0.001. По этой доле исследованные виды разделяются на три однородные группы (Табл. 3).

Таблица 2. Доля идентичных аллозимных фенотипов ГФИ-1 и ГФИ-2 у 10 видов полижет.

Вид Количество особей с ГФИ-1 и ГФИ-2 Количество особей с идентичными спектрами ГФИ-1 и ГФИ-2. Доля особей с идентичными аллозимными спектрами ГФИ-1 и ГФИ-2

Ро!убога Ьгеу1ра1ра 542 535 98%

Р. са/сагеа 172 98 57%

Р. согпМа 16 14 88%

Р. д1усутепса 39 36 92%

Р. Нт1со1а 31 17 55%

Р. тапсЬепко/ 33 33 100%

ОУро/ус/ога Ыdentata 57 56 98%

О. сагёаНа 24 24 100%

О. сагипсиШа 48 48 100%

О. соттепэаНз 125 125 100%

(А)

(Б)

»*

- СТАРТ

ГФИ-2

1 3 14 5

ГФИ-1

Рис. 2. Зимограммы ГФИ 0:ро!ус1ога сагипсиШа (А) и О. сагйаНа (Б), демонстрирующие согласованность аллозимной изменчивости изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2. (А): Дорожки 1-27 - <?<?, 28-31 - ?$; (Б): Дорожки 1-3-$$, 4-8 - Ж

На зимограммах видно, что у каждого из исследованных самцов О. сагип-сиШа и О. сагйаНа аллозимные спектры ГФИ-1 идентичны аллозимным спектрам ГФИ-2. Если изофермент ГФИ-1 имеет гомозиготный фенотип, то ГФИ-2 имеет точно такой же гомозиготный фенотип (см. например, А: дорожки 1-5; Б: дорожки 4-6). Если ГФИ-1 имеет гетерозиготный фенотип, то ГФИ-2 имеет точно такой же гетерозиготный фенотип (см. например, А: дорожки 6, 8, 11, 12; Б: дорожки 7, 8).

(Б)

1 2 3 1 5 6 7 8

(-) ГФИ-2

гибриды

- СТАРТ -

ГФИ-1

(+)

(В)

Рис. 3. Зимограммы ГФИ, демонстрирующие несогласованность аллозимной изменчивости изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у Dipolydora bidentata (А), Р. calcarea (Б) и Р. brevipalpa (В).

(A): Дорожки 1-7 - 8-14 - <?<?

(Б): Дорожки 1, 2, 4-6, 8 - <3<5 Р. са/сагеа; 3,7 - $<$ Р. manchenkoi. Р. calcares и Р. manchenkoi являются близнецовыми видами, которые неотличимы по внешним признакам, поэтому они представлены на одной зимограмме.

(B): Дорожки 1. 2 - 9$, 3-5 - <3<?

На зимограммах видно, что некоторые из самцов D. bidentata, Р. calcarea и Р. brevipalpa имеют разные аллозимные спектры изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2. Изофермент ГФИ-1 имеет гомозиготный фенотип, а ГФИ-2 - гетерозиготный (А: дорожка 10; Б: дорожка 5; В: дорожка 4), или наоборот (Б: дорожки 4, 6, 8).

Таблица 3. Три группы видов полижет, различающихся по доле идентичных фенотипов ГФИ-1 и ГФИ-2.

Вид Усредненная доля особей с идентичными аллозимными спектрами ГФИ-1 и ГФИ-2 (результаты X1 - теста на гомогенность)

Р. са/сагеа Я. 1Ысо1а 56,7% {X3I) = 0,05 <Х7.0,5 (1) = 3.84)

Р. согтЛа Р. д/усутеп'са 90, 9 % (X2 (<1/= 1) = 0,32 < Х>.0,5 (!) = 3.84)

Р. Ьгеу'фа1ра Р. тапсЬепко/ О. Ы<ЗШа1а О. сагс1аНа О. сагипсиЫа О. соттвПБаИэ 99, 0 % = 5) = 3,24 <Х>.0,5 (с!/= 5) = 11,07)

ОБСУЖДЕНИЕ

1. Трудности интерпретация изоферментных спектров ГФИ полидорид с применением общепринятой концепции изоферментов.

Выявленные электрофоретические спектры ГФИ у полидорид можно попытаться объяснить, придерживаясь традиционной интерпретации. При этом представляется разумным рассмотреть две модели генетического контроля: 1) один генный локус ГФИ, продукты которого претерпевают посттрансляционную модификацию, 2) два независимых генных локуса ГФИ-1 и ГФИ-2. Однако, как первая, так и вторая интерпретации встречаются со значительными трудностями.

1) Один генный локус ГФИ.

Согласованная аллозимная изменчивость изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у 100% особей может быть объяснена, исходя из представления, что оба изофермента являются продуктами одного гена, т.е. один из них

(ГФИ-1) является первичным изоферментом, а другой (ГФИ-2) - вторичным изоферментом, возникшим в результате посттрансляционной модификации молекул первичного изофермента ГФИ-1. Однако эта интерпретация маловероятна, поскольку: во-первых, изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 разделены на геле необычно большим расстоянием. При использующихся условиях проведения электрофореза это расстояние составило 2-4 см. Такое большое электрофоретическое различие в подвижности ГФИ-1 и ГФИ-2 нехарактерно для ситуации посттрансляционного происхождения изофермента ГФИ-2. Как правило, первичные и вторичные изоферменты отстоят друг от друга на расстоянии, обусловленном различием молекул в единицу заряда. Такое расстояние соответствует минимальному расстоянию между электрофоретически выявляемыми аллельными вариантами фермента - аллозимами и, как правило, не превышает 0,5 см.

Во-вторых, между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2 выявлялись гибридные молекулы, чего не должно бы быть - богатый опыт электрофоре-тических исследований свидетельствует о том, что первичные и вторичные изоферменты олигомерных ферментов никогда не образуют гибридов. Это соответствует общепринятому мнению, что посттрансляционные модификации происходят уже после ассоциации субъединиц в олигомер-ные каталитически активные молекулы (Harris, Hopkinson, 1976) и что оли-гомерные молекулы, однажды образовавшись, уже никогда не диссоциируют и не реассоциируют in vivo снова (Serov et al., 1979).

В-третьих, против того, что ГФИ-1 и ГФИ-2 являются первичным и вторичным изоферментами, свидетельствует разная тканевая и половая специфичность их экспрессии. Согласно общепринятой концепции изо-ферментов первичные и вторичные изоферменты, определяемые одним геном, выявляются в одних и тех же клетках и одновременно, поскольку посттрансляционным модификациям подвергается только часть молекул первичного изофермента (Uy and Wold, 1977; Poly, 1997).

2) Два независимых генных локуса ГФИ-1 и ГФИ-2.

Эта модель не может дать убедительного объяснения возникновению и сохранению согласованной аллозимной изменчивости в двух независимых генных локусах у подавляющего большинства особей каждого из исследованных видов. Вероятность этого чрезвычайно мала, и практически нереальна для большого числа аллелей в каждом из генных локусов, даже если допустить их тесное сцепление.

Кроме того, если придерживаться традиционной интерпретации, то создается впечатление, что у близких видов полидорид система ГФИ может иметь разные генетические механизмы. У одних видов система изоферментов ГФИ представлена одним генным локусом, у других — двумя. При этом генетические основы системы изоферментов ГФИ оказываются одинаковыми у видов разных родов (Polydona и Dipolydora), и в то же время принципиально разными у видов одного и того же рода. Трудно найти объяснение тому, как в процессе эволюции двух групп близких видов для детерминации одинаковой системы изоферментов, характеризующихся одинаковой дифференциальной экспрессией, могли возникнуть две разные генетические системы.

Таким образом, полученные результаты не могут найти удовлетворительного объяснения с позиций общепринятой концепции изоферментов.

2. Альтернативный сплайсинг — механизм, способный генерировать изоферментные спектры ГФИ, наблюдаемые у полидорид.

Трудности интерпретации полученных нами данных по изофермент-ным спектрам ГФИ у полидорид на основании общепринятой концепции изоферментов дали нам основание предположить, что в этом случае мы имеем дело с изменчивостью, обусловленной действием механизма АС1. Хорошо известно, что АС является одним из основных генераторов белковых изоформ у эукариот. Благодаря АС с одного структурного гена, обладающего экзон-интронной структурой, может считываться несколько структурно (Andreadis et al., 1987; Schmucker et al., 2000) и функционально (Kriventseva et. al.; 2003) отличающихся белковых изоформ. Альтернатив-

1Использование альтернативных сайтов инициации и терминации транскрипции также может приводить к появлению структурно отличающихся изоформ одного и того же белка, за счет изменения его 5' и 3' концов, соответственно. Однако, учитывая то, что и альтернативная инициация (множественные сайты инициации) и альтернативная терминация (множественные сайты поли-аденилирования) транскрипции, протекают в тесной связи с АС и принципиально не отличаются от него по своему действию на структуру и электрофоретиче-ские свойства белковых изоформ, а также принимая во внимание, что некоторые авторы (Апйгеасйз е1 а)., 1987) рассматривают их в качестве событий АС, в данной работе они рассматриваются вместе и объединены общим названием -АС.

ные изоформы одного белка, как правило, характеризуютсядифференци-альной экспрессией во внутриклеточном и тканевом про-странстве организма, а также во времени его онтогенеза (Lopez, 1998, Graveley, 2001; Maniatis and Tasic, 2002). К настоящему времени имеются экспериментальные данные об участии АС в экспрессии 270 ферментов Metazoa (Манченко и Панькова, неопубликованные данные). Многие из этих генов кодируют ферменты, которые вовлечены в электрофоретически й анализ и их изоферменты широко используются в качестве генных маркеров. В общей сложности события АС описаны для 85 таких ферментов, что составляет 20% всех ферментов, для которых разработаны методы получения зимограмм (Manchenko, 2003). Таким образом, изоферменты каждого пятого фермента, исследуемого электрофоретически, могут быть продуктом АС.

Согласованная и несогласованная аллозимная изменчивость изо-ферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 может быть объяснена различным уровнем полиморфизма в последовательностях конститутивных и альтернативных экзонов гена ГФИ (Manchenko, 2001). Под альтернативным экзоном мы понимаем любой кодирующий участок пре-мРНК, который вовлечен в механизм АС. В одном случае альтернативный экзон является обычным экзоном, и после прохождения всех стадий сплайсинга и созревания мРНК входит в состав мРНК, соответственно - транслируется в часть белковой молекулы. В другом случае, в процессе сплайсинга альтернативный экзон может удаляться как интрон. В результате он не входит в состав мРНК и не транслируется. Конститутивные экзоны - кодирующие участки пре-мРНК, которые всегда входят в состав мРНК. Согласованная аллозимная изменчивость изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 будет наблюдаться в том случае, если в процесс АС вовлечен электрофоретически мономорфный экзон. Как можно видеть из рисунка 4 (А) в процессе АС молекул пре-мРНК гена ГФИ образуется две формы молекул мРНК (мРНК ГФИ-1 и мРНК ГФИ-2) - альтернативные изоформы мРНК, определяющие соответственно изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2. Одна из форм (мРНК ГФИ-2) содержит альтернативный экзон, другая (мРНК ГФИ-1) - нет. Отсутствие электрофоретически мономорфного альтернативного экзона в молекулах аллельных мРНК ГФИ-1, изменяет заряд соответствующих аллельных изоферментов ГФИ-1 на одинаковую величину и их элекгрофоретическая

А

В

Гр~ -И—н—н—и-

пре-мРНК 2~ гена ГФИ

| АС

Аллельныв ' варианты

мРНК ГФИ-2 2Щ*ЮЕ]

Аллельныв ' варианты мРНК ГФИ-1 г

ГФИ-2

ГФИ-1

Аллельныв варианты про-мРНК I. гена ГФИ

Аллельныв < варианты мРНК ГФИ-2 2

| АС

1 2 3 о

Ф ГФИ-2

1 2 3 В

Аллельныв 1 ¡ЦЦКЩ | варианты мРНК ГФИ-1 2

ГФИ-1

Альтернативные Электрофоретические Альтернативные Электрофоретические

изоформы мРНК фенотипы изоформы мРНК фенотипы

гена ГФИ иэоферментов ГФИ гена ГФИ изоферментов ГФИ

Рис. 4. Схема, отображающая влияние мономорфного (А) и полиморфного (В) альтернативных экзонов на характер аллозимной изменчивости изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2. Конститутивные экзоны показаны черными прямоугольниками, альтернативные экзоны - серыми. Интроны изображены в виде сплошной линии, соединяющей экзоны. Треугольником (▼) отмечены экзоны, несущие замещения, обуславливающие различия аллельных изоформ фермента (алло-зимов) (см. описание в тексте).

подвижность относительно друг друга не меняется. Поэтому изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 имеют одинаковые аллозимные спектры (рис. 4А).

Несогласованная аллозимная изменчивость будет наблюдаться в том случае, если в процесс АС вовлечен электрофоретически полиморфный экзон в гетерозиготном состоянии (рис. 4В). На рисунке видно, что в состав молекул мРНК ГФИ-2 входит полиморфный альтернативный экзон, поэтому изофермент ГФИ-2 имеет гетерозиготный фенотип. Различия аллельных вариантов изофермента ГФИ-2 обусловлены замещениями, присутствующими в альтернативном экзоне. В молекулах мРНК ГФИ-1 таких замещений нет, т.к. в них отсутствует альтернативный экзон, поэтому изофермент ГФИ-1 имеет гомозиготный фенотип. Таким образом, изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 имеют разные аллозимные спектры.

Аллельные варианты пре-мРНК гена ГФИ

| АС

Аллельные 1 варианты мРНК ГФИ-2 2

12 3 4

ГФИ-2

Аллельные

варианты__

мРИК ГОИ-1 2 ШЖМД т ГФИ-1

Альтернативные Злектрофоретические изоформы мРНК фенотипы

гена ГФИ изоферментов ГФИ

Рис. 5. Схема, отображающая влияние полиморфных альтернативного и конститутивного экзонов на характер аяпозимной изменчивости. Конститутивные экзоны показаны черными прямоугольниками, альтернативные экзоны -серыми. Интроны изображены в виде сплошной линии, соединяющей экзоны. Треугольником (Т) отмечены экзоны, несущие замещения, обуславливающие различия аллельных изоформ фермента (аллозимов). (см. описание в тексте).

В том случае если полиморфным является не только альтернативный экзон, но и конститутивные экзоны, особь будет демонстрировать разные гетерозиготные фенотипы по изоферментам ГФИ-1 и ГФИ-2 (рис. 5). На рисунке видно, что отличия аллельных изоформ ГФИ-2 обусловлены замещениями и в альтернативном, и в конститутивном экзонах, тогда как различия аллельных изоформ ГФИ-1 - только замещениями в конститутивном экзоне. Отсутствие полиморфного альтернативного экзона в молекулах мРНК-ГФИ-1 приводит к изменению заряда аллельных изоформ фермента ГФИ-1 и их электрофоретической подвижности относительно друг друга. Поэтому аллозимные спектры изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 будут разными (рис. 5).

Имеются данные, что альтернативные экзоны, как правило, представляют собой более короткие последовательности по сравнению с

Аллельныв варианты прв-мРНК гена ГФИ

| АС

Аллельныв 1 варианты мРНК ГФИ-2 г

1 2 3 шя

4P ГФИ-2

1 2 3 Ш

Аллельныв 1 варианты мРНК ГФИ-1 2

ГФИ-1

Альтернативные Элекгрофоретические иэоформы мРНК фенотипы

гена ГФИ иэофермвнтов ГФИ

Рис. 6. Схема, отображающая влияние полиморфного конститутивного экзона на характер аллозимной изменчивости. Конститутивные экзоны показаны черными прямоугольниками, альтернативные экзоны - серыми. Интроны изображены в виде сплошной линии, соединяющей экзоны. Треугольником (▼) отмечены экзоны, несущие замещения, обуславливающие различия аллельных изоформ фермента (аллозимов). Из схемы видно, что если полиморфным является только конститутивный экзон изоферменты ГФИ-1 и ГФИ-2 будут иметь идентичные аплозимные спектры. Это объясняется тем, что молекулы мРНК ГФИ-1 и мРНК ГФИ-2 отличаются по признаку наличие/отсутствие альтернативного экзона, который является мономорфным и не влияет на характер аллозимной изменчивости (см. обсуждение выше).

конститутивными экзонами (Stamm et al., 2000). У высших эукариот средний ген с экзон-интронной структурой имеет 5-6 экзонов, из которых, как правило, только один является альтернативным (Fedorova and Fedorov, 2003). Из этого следует, что по своему общему размеру конститутивные экзоны среднего гена в несколько раз превышают размер его альтернативного экзона. Следовательно, если вероятность возникновения нукпео-тидных замещений одинакова и в конститутивных, и в альтернативных эк-зонах, то замещения чаще будут затрагивать именно конститутивные экзоны. Таким образом, среди конспецифичных особей будут преобладать те, которые имеют идентичные аллозимные спектры альтернативных изоферментов (рис. 6). Это подтверждается результатами, полученными

для димерной глицерол-3-фосфат дегидрогеназы дрозофилы (Wright and Shaw, 1969; Bewley et al.,1974; Cook et al., 1988) и тетрамерной пируватки-назы грызунов (Peters et al., 1981; Noguchi et al., 1986). Анализ данных, полученных независимыми исследованиями, показал, что в двух этих случаях изоферменты, демонстрирующие согласованную аллозимную изменчивость, генерируются АС. При этом, как и в нашем случае, изоформы пиру-ваткиназы формируют гибридные молекулы. Все приведенные выше данные свидетельствуют в пользу гипотезы о происхождении изофермента ГФИ-2 у полидорид в результате альтернативного сплайсинга молекул пре-мРНК, считываемых с одного гена Gpi.

Необычно большое расстояние на зимограммах между ГФИ-1 и ГФИ-2 легко объясняется значительными структурными различиями, ожидаемыми для изоферментов, генерируемых АС. Показано, что 80% всех событий АС у человека являются событиями разноразмерного АС, который приводит к образованию белковых изоформ, существенно отличающихся по своим размерам и молекулярной массе (Mironov et al., 1999; Stamm et al., 2000). Такие структурные различия альтернативных изоформ белка должны обуславливать их ярко выраженные электрофоретические различия, что и наблюдается в нашем случае.

Тканеспецифичная экспрессия изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 также может быть объяснена участием АС в экспрессии гена ГФИ. Многочисленные примеры свидетельствуют о том, что, как правило, альтернативные изоформы белка характеризуются дифференциальной экспрессией. Среди этих примеров есть и такие, которые демонстируют специфичную экспрессию альтернативных изоформ ферментов в сперматогенных клетках (Manky, 1997). К ним относятся ДНК-лигаза III (Manky, 1997) и аденозин деаминаза мыши (Meng et al., 1997), гексокиназа мыши (Mori et al., 1998) и человека (Andreoni et al., 2000).

АС также легко объясняет наличие гибридов между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2. Гибридизация полилептидов ГФИ, синтезируемых на об-лигатных и альтернативных мРНК, вполне возможна, если такие матрицы образуются в одних и тех же клетках, в одних и тех же компартментах, а структурные различия синтезируемых полипептидов не препятствуют их олигомеризации. Ярким примером способности альтернативных изоформ формировать гибриды служит гибридизация изоферментов пируваткиназы крысы (Noguchi et al., 1986).

Таким образом, предположение об участии АС в генерировании изоферментных спектров ГФИ легко снимает все трудности, связанные с интерпретацией их генетического контроля.

3. Возможное ретропозонное происхождение изофермента ГФИ-2.

Известны примеры, когда в сперме животных обычные ферментные формы часто замещены уникальными изоформами, часть которых генерируется AC (Mori et al., 1998, Manky, 1997), а часть определяется независимыми генами, представляющими собой безинтронные ретротранспозо-ны (Hendriksen et al., 1997). Если кДНК, скопированная с процессирован-ной мРНК с помощью обратной транскриптазы, вставляется в ядерный геном, в область промотора, специфичного для сперматогенных клеток, то возникает функциональный безинтронный ген, экспрессируемый в сперме. В связи с этим мы не исключаем возможность того, что в случае независимой аллозимной изменчивости изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 Р. calcárea и P. limicola, характерной для изоферментов, определяемых разными генами, мы имеем дело с ситуацией, когда изофермент ГФИ-2 определяется независимым структурным геном ретропозонного происхождения. Хотя более вероятным представляется наличие одного гена ГФИ полидорид, экспрессия которого сопряжена с механизмом АС.

ВЫВОДЫ

1. У всех десяти исследованных видов полидорид {Ро!убога brвvipalpa, Р. са/сагеа, Р. согпи*а, Р. д1усутепса, Р. //т/со/а, Р. тапсЬепко!, О/-ро!ус!ога ЫбеШа1а, О. сагс1аНа, О. сагипсиШа, О. соттепваНз (Ро1у-сЬае1а: Sp¡onidae)) у самцов выявлено два изофермента ГФИ - ГФИ-1 и ГФИ-2, у самок - только один ГФИ-1.

2. Изофермент ГФИ-1 у всех исследованных видов экслрессируется в соматических тканях, а ГФИ-2 - в сперме.

3. У всех исследованных видов полидорид выявлены гибридные зоны между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2, что свидетельствует о том, что изофермент ГФИ-2 не может иметь посттрансляционное происхождение. Об этом же свидетельствует и большое электрофорети-ческое различие между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2.

4. Согласованная полиаллельная аллозимная изменчивость изофер-ментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у большинства особей у всех исследованных видов полидорид свидетельствуют против того, что эти изофермен-ты определяются разными генными локусами.

5. Своеобразие спектров ГФИ полидорид - согласованная аллозимная изменчивость двух гибридизующихся изоферментов у большинства исследованных особей наряду с наличием редких особей с несогласованной аллозимной изменчивостью и разная тканеспецифичность экспрессии этих изоферментов - может быть объяснено участием альтернативного сплайсинга в экспрессии одного гена ГФИ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Manchenko G.P., Pankova V.V. Sex-linkage of a gene responsible for the expression of alternative isozyme of glucose-6-phosphate isomerase in Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) // GFI Bull. 2001. Vol. 34. P. 55.

2. Pankova V.V., Manchenko G.P. Individual variation of sets of hybrid isozymes of glucose-6-phosphate isomerase in Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) // Evolution, Genetics, Ecology and Biodiversity. Abstr. Intern. Confer. (MAPEEG), Vladivostok-Vostok Marine Biological Station, 2001. P. 21.

3. Панькова В.В., Манченко Г.П. Исследование альтернативных изофермен-тов глюкозо-6-фосфат изомеразы Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) // IV Региональная конференция по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии: Тезисы докладов: Владивосток: Изд-во ДВГУ, 2001. С. 92-94.

4. Панькова В.В., Манченко Г.П. Ген, ответственный за экспрессию спермий-специфичного изофермента ГФИ-2 Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae), локализуется в псевдоаутосомальной области поповых хромосом // VII Дальневосточная молодежная школа - конференция по актуальным проблемам химии и биологии: Тезисы докладов: Владивосток: ДВО РАН, 2003, с. 41.

5. Панькова В.В., Манченко Г.П. Сцепление генов, ответственных за определение пола и экспрессию спермий-специфичного изофермента глюкозо-6-фосфат изомеразы, у полихеты Polydora brevipalpa // Генетика. 2003. Т. 39, № 8. С. 1106-1110.

6. Manchenko G.P., Radashevsky V.I., Pankova V.V. Obligatory and male-specific GPI isozymes of Polydora limicola (Polychaeta: Spionidae) form unexpected hybrids in females II GFI Bull. 2003. Vol. 36. P. 34 .

7. Pankova V.V., Pudovkin A.I., Manchenko G.P. Allozymic variation determined by alternatively spliced exon of the GPI gene in Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) // GFI Bull. 2004. Vol. 37. P. 30.

8. Pankova V.V., Radashevsky V.I., Manchenko G.P. Coordinated allozyme variation of two hybridizing isozymes of glucose-6-phosphate isomerase in polydorids (Polychaeta: Shionidae) // GFI Bull. 2005. Vol. 38. P. 27.

9. Radashevsky V.I. and Pankova V.V. The morphology of two sibling sympatric Polydora species (Annelida: Spionidae) from the Sea of Japan // The Journal of Marine Biological Association of United Kindom» (JMBA). 2006. V. 86. P. 245-252.

ПАНЬКОВА Виктория Владимировна

АЛЛОЗИМНЫЕ СПЕКТРЫ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТ ИЗОМЕРАЗЫ У ПОЛИДОРИД (РОЬУСНАЕТА: БРЮЫЮАЕ) И ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИХ ФОРМИРОВАНИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Зак. №>185п. Формат 60x84 '/„. Усл. п. л. 1,0 Тираж 100 экз. Подписана в печать 13.10.2006 г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО "ДАЛЬПРИБОР* 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел. 32-70-49

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Панькова, Виктория Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общепринятая концепция изоферментов.

2.1.1. Аллельные изоферменты.

2.1.2. Изоферменты, определяемые разными генами.

2.1.3. Гибридные изоферменты.

Ь 2.1.4. Вторичные изоферменты.

2.2. Новые механизмы генерирования множественности белковых изо-форм.

2.2.1. Альтернативный сплайсинг.

2.2.2. Использование альтернативных сайтов инициации транскрипции и полиаденилирования.

2.2.3. Редактирование мРНК.

2.2.4. Альтернативная инициация трансляции.

2.3. Альтернативный сплайсинг ферментных генов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Изоферментные спектры ГФИ полидорид.

4.1.1. Polydora brevipalpa.

4.1.2. Polydora calcarea.

4.1.3. Polydora manchenkoi.

4.1.4. Polydora limicola.

4.1.5. Polydora glycymerica.

4.1.6. Polydora cornuta.

4.1.7. Dipolydora commensalis.

4.1.8. Dipolydora bidentata.

4.1.9. Dipolydora carunculata. ъ 4.1.10 Dipolydora cardalia.

4.2. Доля идентичных аллозимных спектров ГФИ-1 и ГФИ-2.

ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Трудности интерпретации изоферментных спектров ГФИ полидорид с позиций общепринятой концепции изоферментов.

5.1.1. Характер аллозимной изменчивости изоферментов ГФИи ГФИ-2.

5.1.2. Сопряженность экспрессии изофермента ГФИ-2 с полом и тканепецифичность экспрессии изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2.

5.1.3. Большое электрофоретическое различие изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2.

5.1.4. Формирование межлокусных гибридов ГФИ-1/ГФИ-2.

5.2. Альтернативный сплайсинг - механизм, способный генерировать изоферментные спектры ГФИ, наблюдаемые у полидорид.

5.2.1. Согласованность аллозимной изменчивости альтернативных изоферментов.

5.2.2. Большое электрофоретическое различие альтернативных изоферментов.

5.2.3. Тканеспецифичность экспрессии альтернативных изоферментов и возможная роль альтернативного сплайсинга в детерминации пола полидорид.

5.2.4. Гибридизация альтернативных изоферментов.

5.3. Возможное ретропозонное происхождение изофермента ГФИ-2.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аллозимные спектры глюкозо-6-фосфат изомеразы у полидорид (Polychaeta: spionidae) и возможные механизмы их формирования"

Изоферменты - множественные молекулярные формы одного и того же фермента, экспрессируемые в одном организме и обладающие сходной функцией. Сочетая гелевый электрофорез ферментсодержащих препаратов с последующим окрашиванием электрофоретических гелей на специфическую ферментативную активность можно выявлять изоферменты в виде окрашенных зон. Благодаря тому, что изоферменты проявляются кодоминантно, т.е. один аллель не маскирует другой, и о генотипе особи мы можем судить по выявляемому изо-ферментному спектру, они являются удобными маркерами генов, и давно используются в различных областях биологии и медицины. Наиболее широкое применение они нашли в популяционной генетике для исследования генетической изменчивости природных популяций и видов.

Генетическая концепция изоферментов, используемая как основа для генетической интерпретации результатов ферментного электрофореза, была сформулирована еще в 70-е годы, и на протяжении более трех десятилетий существует в неизменной виде (Harris and Hopkinson, 1976; Корочкин и др., 1977). Эта концепция выделяет три основные причины электрофоретически выявляемой множественности ферментов. Во-первых, это генные дупликации, ведущие к возникновению независимых генных локусов, определяющих разные изоформы одного фермента, которые и рекомендовано называть изоферментами. Во-вторых, это генные мутации, приводящие к возникновению множественных вариантов одного генного локуса, определяющих аллельные варианты одного фермента, получивших название «аллозимов». В-третьих, это поспрансляционные модификации ферментных молекул, которые приводят к возникновению вторичных изоферментов, имеющих негенетическую, модификационную природу.

Ясная генетическая интерпретация изоферментных спектров является ключевым моментом в использовании изоферментов как маркеров генов, однако она всегда имела определенные проблемы. Значительная часть этих проблем относится к разряду методических и выражается в недостаточно четком разделении зон ферментной активности на специфически окрашенных электрофоретических гелях - зимограммах. Однако другая часть включает проблемы, связанные с несовершенством концепции и недостаточностью наших знаний о природе изофер-ментов и механизмах их формирования. В литературе описано много необычных изоферментных спектров, не имеющих обоснованной и убедительной генетической интерпретации. К числу таких случаев относится недавно описанный необычный электрофоретический спектр димерного фермента глюкозо-6-фосфат изомеразы (ГФИ) у полихеты Polydora brevipalpa (Manchenko, 2001а). Было выявлено два изофермента ГФИ: ГФИ-1 и ГФИ-2. Анодный изофермент ГФИ-1 вы* являлся у всех особей, а катодный ГФИ-2 - только у самцов. Необычность спектра состояла в том, что изоферменты проявляли согласованную аллозимную изменчивость (имели идентичные аллозимные спектры) и формировали гибриды. Способность образовывать гибриды in vivo присуща только изоферментам, определяемым дуплицированными генными локусами, а способность проявлять согласованную аллозимную изменчивость - только вторичным изоферментам, образующимся из первичных молекул в результате постгрансляционных модификаций (Корочкин и др., 1977; Moss, 1982; Филиппович и Коничев, 1987). Таким образом, общепринятая концепция изоферментов не могла дать удовлетворительной генетической интерпретации согласованной аллозимной изменчивости гибридизующихся изоферментов. Для объяснения необычных изоферментных спектров ГФИ Polydora brevipalpa Манченко (Manchenko, 2001а) предложил меf ханизм альтернативного сплайсинга (АС). Известно, что АС пре-мРНК транс-криптов, считываемых с одного структурного гена, может давать несколько структурно отличающихся белковых изоформ (Andreadis et al., 1987). Для обозначения изоферментов, генерируемых АС, был предложен новый термин «альтернативные изоферменты» (Manchenko, 2001а). Согласованная аллозимная изменчивость изоферментов и их способность формировать гибриды были расценены как веские аргументы в пользу участия АС в генерировании изоферментов ГФИ P. brevipalpa (Manchenko, 2001а). Однако предварительные данные свидетельствовали о том, что у близких видов полидорид P. ciliata sp.l и P. limicola * изоферменты ГФИ проявляют несогласованную аллозимную изменчивость, характерную для изоферментов, определяемых двумя разными генами (Manchenko and Radashevsky, 1993,1998).

Цель настоящей работы заключалась в выяснении молекулярных механизмов формирования изоферментных спектров ГФИ у полидорид (Polychaeta: Spi-onidae).

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1) Исследовать изоферментные спектры ГФИ у десяти видов полидорид (Polychaeta: Spionidae).

2) Исследовать сопряженность экспрессии изофермента ГФИ-2 с полом у десяти видов полидорид.

3) Исследовать тканеспецифичность экспрессии изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2.

Научная новизна работы. Проведено электрофоретическое исследование изоферментных спектров глюкозо-6-фосфат изомеразы (ГФИ) у десяти видов полидорид родов Polydora и Dipolydora (Polychaeta: Spionidae), ранее не исследованных в этом отношении. Установлено, что у всех исследованных видов полидорид экспрессируется два изофермента (ГФИ-1 и ГФИ-2), один из которых (ГФИ-2) экспрессируется почти исключительно у самцов. Проведено исследование тканеспецифичности экспрессии изоферментов ГФИ. Показано, что изофер-мент ГФИ-1 экспрессируется преимущественно в соматических тканях у особей обоих полов и в незначительных количествах в диплоидных сперматогенных клетках самцов. Изофермент ГФИ-2 экспрессируется в диплоидных сперматогенных клетках самцов и в следовых количествах у самок. Установлен факт гибридизации изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у всех исследованных видов. Показано, что у каждого из исследованных видов полидорид среди особей, экспрессирую-щих оба изофермента, преобладают те, которые имеют идентичные аллозимные спектры ГФИ-1 и ГФИ-2. Впервые сделана оценка доли таких особей у 10 исследованных видов.

Впервые получены данные, свидетельствующие в пользу гипотезы о том, что альтернативный сплайсинг способен генерировать изофермента, которые на электрофоретических гелях могут быть неотличимы от классических изоферментов, определяемых разными генными локусами.

Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные данные, говорящие о том, что изоферменты ГФИ полидорид генерируются АС, послужат важной предпосылкой для формулирования положений новой концепции изо-ферментов, учитывающей важную роль АС в их генерировании. Это составит основу для ясной генетической интерпретации электрофоретических данных и подтвердит для изоферментов статус надежных генных маркеров.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на IV Региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 2001), Международной конференции: «Evolution, Genetics, Ecology and Biodiversity» (MAPEEG) (Владивосток, МБС «Восток», 2001), VII Дальневосточной молодежной школе - конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, МЭС ТИБОХ, 2003) и ежегодных научных конференциях Института биологии моря (Владивосток, 2004,2006).

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 209 ссылок. Диссертация изложена на 108 страницах, содержит 4 таблицы и 43 рисунка.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Панькова, Виктория Владимировна

ВЫВОДЫ

1. У всех десяти исследованных видов полидорид (Polydora brevipalpa, P. cal-carea, P. cornuta, P. glycymerica, P. limicola, P. manchenkoi, Dipolydora biden-tata, D. cardalia, D. carunculata, D. commensalis (Polychaeta: Spionidae)) у самцов выявлено два изофермента ГФИ - ГФИ-1 и ГФИ-2, у самок-только один ГФИ-1.

2. Изофермент ГФИ-1 у всех исследованных видов экспрессируется в соматических тканях, а ГФИ-2 - в сперме.

3. У всех исследованных видов полидорид выявлены гибридные зоны между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2, что свидетельствует о том, что изофермент ГФИ-2 не может иметь посттрансляционное происхождение. Об этом же свидетельствует и большое электрофоретическое различие между изоферментами ГФИ-1 и ГФИ-2.

4. Согласованная полиаллельная аллозимная изменчивость изоферментов ГФИ-1 и ГФИ-2 у большинства особей у всех исследованных видов полидорид свидетельствуют против того, что эти изоферменты определяются разными генными локусами.

5. Своеобразие спектров ГФИ полидорид - согласованная аллозимная изменчивость двух гибридизующихся изоферментов у большинства исследованных особей наряду с наличием редких особей с несогласованной аллозимной изменчивостью и разная тканеспецифичность экспрессии этих изоферментов - может быть объяснено участием альтернативного сплайсинга в экспрессии одного гена ГФИ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Панькова, Виктория Владимировна, Владивосток

1. Корочкин Л.И., Серов O.JL, Пудовкин А.И., Аронштам А.А., Боркин Л.Я.,

2. Малецкий С.И., Полякова Е.В., Манченко Г.П. Генетика изоферментов. М. Наука. 1977.278 с.

3. Basnakian A.G., Singh A.B., Shah S.V. Identification and expression of deoxyribo-nuclease (DNase) I alternative transcripts in the rat // Gene. 2002. V. 289. P. 87-96.

4. Major transcript of the frameshifted coxll gene from tripanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA // Cell. 1986. V. 46. P. 819-826.

5. Caceres J.F., Kornblihtt A.R. Alternative splicing: multiple control mechanisms and involvement in human disease // Trends Genet. 2002. V. 18. P. 186 193.

6. Chaloupka J.A., Bullock S.A., Iourgenko V., Levin L.R., Buck J. Autoinhibitoryregulation of soluble adenylyl cyclase // Molecular Reproduction and Development. 2006. V. 73. P. 361 -368.

7. Chessler S.D., Lernmark A. Alternative splicing of GAD67 results in the synthesis of a third form of glutamic-acid decarboxylase in human islets and other non-neural tissues // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 5188 5192.

8. Cooper A.J.L. The role of glutamine transaminase К (GTK) in sulfur and a-keto acid metabolism in the brain, and in the possible bioactivation of neurotoxicants // Neurochemistry Internationa. 2004. V. 44. P. 557 577.

9. Cramer P., Pesce C.G., Baralle F.E., Kornbliht A.R. Functional association betweenpromoter structure and transcript alternative splicing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 11456 11460.

10. Crombie Т., Swaffield J.C., Brown A.J. Protein folding within the cell is influenced by controlled rates of polypeptide elongation // J. Mol. Biol. 1992. V. 228. P. 7 12.

11. Dayton J.S., Lindsten Т., Thompson C.B., Mitchell B.S. Effects of human Tlymphocyte activation on inosine monophosphate dehydrogenase expression // J. Immunol. 1994. V. 152. P. 984 991.

12. Delaloy C., Lu J., Houot A.M., Disse-Nicodeme S., Gasc J.M., Corvol P., Heunemaitre X. Multiple promoters in WNK1 gene: one controls expression of a kidney specific kinase-defective isoform // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 9208 9221.

13. De Luis 0., del Mazo J. Gene expression of mouse Ml and M2 pyruvate kinaseisoenzymes correlates with differential polyA. tract extension of their mRNAs during the development of spermatogenesis // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1396. P. 294-305.

14. De Maria A., Arruti C. Bovine DNase 1: gene organization, mRNA expression, andchanges in the topological distribution of the protein during apoptosis in lens epithelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 312. P. 634 641.

15. DeglTnnocenti D., Marzocchini R., Malentacchi F., Ramazzotti M., Raugei G.,

16. Ramponi G. ACYP1 gene possesses two alternative splicing forms that induce apoptosis // IUBMB Life. 2004. V. 56. P. 29 33.

17. Dikic I., Schlessinger J. Identification of a new Pyk2 isoform implicated in chemokine and antigen receptor signaling // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 14301 14308.

18. Doyen N., Dandon M.F., Bentolila L.A., Nguyen Q.T., Rougeon F. Differential splicing in mouse thymus generates 2 forms of terminal deoxynucleotidyl transferase // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 1187-1191.

19. V. 272. P. 32715-32718. Fedorova L., Fedorov A. Introns in gene evolution // Genetica. 2003. V. 118. P. 123-131.

20. Gott J.M., Emeson R.B. Functions and mechanisms of RNA editing // Annu. Rev.

21. Genet. 2000. V. 34. P. 499 531. Graveley B.R. Alternative splicing: increasing diversity in the proteomic world //

22. Harris H., Hopkinson D.A. Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetics.

23. Hellen C.U., Sarnow P. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules //

24. Hirono A., Beutler E. Molecular cloning and nucleotide sequences of cDNA for human glucose-6-phosphate dehydrogenase varriant A(-) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 3951 -3954.

25. Houdebine L.M., Attal J. Internal ribosome entry sites (IRESs): reality and use // Transgenic Research. 1999. V. 8. P. 157 177.

26. Jen C.-H., Michalopoulos I., Westhead D.R., Meyer P. Natural antisense transcriptswith coding capacity in Arabidopsis may have a regulatory role that is not linked to double-stranded RNA degradation // Genome Biology. 2005. V. 6. P. 51.

27. Jin P., Fu G.K., Wilson A.D., Yang J., Chien D., Hawkins P.R., Au-Young J., Stuve

28. L. PCR isolation and cloning of novel splice variant mRNAs from known drug target genes // Genomics. 2004. V. 83. P. 566 571.

29. Johnson J.M., Castle J., Garrett-Engele P., Kan Z., Loerch P.M., Armour C.D.,

30. Santos R., Schadt E.E., Stoughton R., Shoemaker D.D. Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays // Science. 2003. V. 302. P. 2141-2144.

31. Kessler R., Eschrich K. Splice isoforms of ubiquitous 6-phosphofructo-2kinase/fructose-2,6-bisphosphatase // Molecular Brain Research. 2001. V. 87. P. 190- 195.

32. Kim J.E., Kim K.H., Lee S.W., Seol W., Shiba K., Kim S. An elongation factorassociating domain is inserted into human cysteinyl-tRNA synthetase by alternative splicing // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 2866 2872.

33. Kim H., Klein R., Majewski J., Ott J. Estimating rates of alternative splicing in mammals and invertebrates // Nature Genetics. 2004. V. 36. P. 915 916.

34. Kimura S., Kotani Т., McBride O.W., Umeki K., Hirai K., Nakayama Т., Ohtaki S.

35. Human thyroid peroxidase: complete cDNA and protein sequence, chromosome mapping, and identification of two alternately spliced mRNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 5555 5559.

36. Kinnaird J.H., Revell D.F., Connerton I.F., Hasleham I. Fincham J.R.S. Alternativemodes of messenger-RNA processing in a 3' splice site mutant of Neurospora crassa И Curr. Genet. 1992. V. 22. P. 37 40.

37. Kitagawa H.T. Molecular cloning, sequencing and alternative splicing of the acidphosphatase (Acph) gene from Drosophila virilis IIDNA Sequence. 2003. V. 14. P. 135 -139.

38. Kobayashi Y., Dokiya Y., Sugita M. Dual targeting of phage-type RNA polymerase to both mitochondria and plastids is due to alternative translation initiation in single transcripts // Biochim. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 289. P. 1106 1113.

39. Kochiwa H., Itaya M., Tomita M., Kanai A. Stage-specific expression of Caenorhabdi-tis elegans ribonuclease HI enzymes with different substrate specificities and bivalent cation requirements // FEBS Journal. 2006. V. 273. P. 420 429.

40. Kohtz J.D., Jamison S.F., Will C.L., Zuo P., Luhrmann R., Garcia-Blanco M.A.,

41. Manley J.L. Protein-protein interactions and 5'-splice-site recognition in mammalian mRNA precursors // Nature. 1994. V. 368. P. 119 124.

42. Kolb V.A. Cotranslational protein folding // Mol. Boil. 2001. V. 35(4). P. 584 590.

43. Kondrashov F.A., Koonin E.V. Origin of alternative splicing by tandem exon duplication // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 2661 2669.

44. Konno R Rat D-amino-acid oxidase cDNA: rat D-amino-acid oxidase as anintermediate form between mouse and other mammalian D-amino-acid oxidases //Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1395. P. 165 -170.

45. Koslowski M., Tureci O., Bell C., Krause P., Lehr H-A., Brunner J., Seitz G., Nestle F.O., Huber C., Sahin U. Multiple splice variants of lactate dehydrogenase С selectively expressed in human cancer // Cancer Research. 2002. V. 62. P. 6750 -6755.

46. Kountikov E., Wilson M., Miller N., Clem W., Bengten E. Organization and expression of thirteen alternatively spliced exons in catfish CD45 homologs // Developmental and Comparative Immunology. 2004. V. 28. P. 1023 1035.

47. Kozak M. The scanning model for translation: an update // J. Cell. Biol. 1989. V. 108. P. 229-241.

48. Kravchenko E., Chumakov P.M. Alternative transcripts of POLRMT gene coding for nuclear RNA polymerase IV // Mol. Biol. 2005. V. 39. P. 58 61.

49. Kriventseva E.V., Koch I., Apweiler R, Vingron M., Bork P., Gelfand M.S.,

50. Malek О., Knoop V. 7><my-splicing group II introns in plant mitochondria: the complete set of ш-arranged homologs in ferns, fern allies, and a hornwort // RNA. 1998. V. 4. P. 1599-1609.

51. Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) // Biochem. Genet. 2001b. V. 39. P. 285-288.

52. Manchenko G.P. Handbook of detection of enzyme on electroforetic gels // CRC Press. 2003.514 р.

53. Manchenko G.P. and Pankova V.V. Sex-linkage of a gene responsible for the expression of alternative GPI isozyme in Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) // Gene Families and Isozymes Bulletin. 2001. V. 34. P. 55.

54. Maniatis Т., Tasic B. Alternative pre-mRNA splicing and proteome expansion in metazoans // Nature. 2002. V. 418. P. 236 243.

55. Manley J.L., Tacke R. SR proteins and splicing control // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1569-1579.

56. Mao G.F., Kunapuli S.P., Rao A.K. Evidence for two alternatively spliced forms ofphospholipase C-f5 2 in haematopoietic cells // Brit. J. Haematol. 2000. V. 110. P. 402-408.

57. Mar S.S., Mori H., Lee J.H., Fukuda K., Saburi W., Fukuhara A., Okuyama M.,

58. Chiba S., Kimura A. Purification, characterization, and sequence analysis of two a-amylase isoforms from azuki bean, Vigna angularis, showing different affinity towards P-cyclodextrin sepharose // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. V. 67. P. 1080-1093.

59. Marie J., Simon M.-P., Dreyfus J.-C., Kahn A. One gene, but two messenger RNAs encode liver L and red cell L' pyruvate kinase subunits // Nature. 1981. V. 292. P. 70 72.

60. Marrs K.A., Walbot V. Expression and RNA splicing of the maize glutathione Stransferase Bronze 2 gene is regulated by cadmium and other stresses // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 93 102.

61. Meng J-P., Zang F-P., Huhtaniemi I., Pakarinen P. Characterization and developmental expression of a testis-specific adenosine deaminase mRNA in the mouse // J. An-drol. 1997. V. 18. P. 88-95.

62. Miller P.W., Schmidt R.R. Precursor messenger-RNA alternative splicing yieldsmultiple chloroplastic, NADP-specific glutamate dehydrogenase isoenzymes // Plant Physiol. 1993. V. 102. P. 70 79.

63. Miller S.W., Hayward D.C., Bunch T.A., Miller D.J., Ball E.E., Bardwell V.J.,

64. Zarkower D., Brower D.L. A DM domain protein from a coral, Acropora mille-pora, homologous to proteins important for sex determination // Evolution and development. 2003. V. 5. P. 251 258.

65. Miranda-Vizuete A., Spyrou G. Genomic organization and identification of a nowelalternative splicing variant of mouse mitochondrial thioredoxin reductase (TrxR2) gene // Mol. Cell. 2002. V. 13. P. 488 492.

66. Miro X., Casacuberta J.M., Gutierrez-Lopez M.D., de Ladnazuri M.O., Puigdomenech P. Phosphodiesterases 4D and 7 A splice variants in the responce of HUVEC cells to TNF-a // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 274. P. 415 421.

67. Mironov A., Fickett J., Gelfand M. Frequent alternative splicing of human genes // Genome Res. 1999. V. 9. P. 1288 1293.

68. Miwa M., Hanai S., Poltronieri P., Uchida M., Uchida K. Functional analysis ofpoly (ADP-ribose) polymerase in Drosophila melanogaster II Mol. Cell. Biochem. 1999. V. 193. P. 103-107.

69. Montoya G.E., Vernot J.P., Patarroyo M.E. Comparative analysis of CD45 proteins in primate context: owl monkeys versus humans // Tissue Antigens. 2004. V. 64. P. 165- 172.

70. Morgan B.A., Johnson W.A., Hirsh J. Regulated splicing produces different forms of dopa decarboxylase in the central nervous system and hypoderm of Drosophila melanogaster // EMBO J. 1986. V. 5. P. 3335 3342.

71. Moss D.W. Isoenzymes, Chapman and Hall Ltd. London. 1982.204 pp.

72. Mukai F., Ishiguro K., Sano Y., Fujita S.C. Alternative splicing isoform of tau protein kinase/glycogen synthase kinase 3(5 //J. Neurochem. 2002. V. 81. P. 1073 -1083.

73. Murphy R.W., Sites J.W.,Jr., Buth D.G., Haufler C.H. Proteins: isozyme electrophoresis. In: Molecular Systematics (D.M. Hillis, C. Moritz, B.K. Mable, eds.). Sinauer. Sunderland. 1996. P. 51 120.

74. Murray K.D., Isackson P.J., Jones E.G. iV-methyl-D-aspartate receptor dependenttranscriptional regulation of two calcium/calmodulin-dependent protein kinase type II isoforms in rodent cerebral cortex // Neuroscience. 2003. V. 122. P. 407 -420.

75. Niesel D.W. Bewley G.C., Miller S.G., Armstrong F.B. Purification and structuralanalisis of the soluble sn- glycerol-3-phosphate dehydrogenase isozymes in Dro-sophila melanogaster II J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 4073 4080.

76. Noguchi Т., Inoue H., Tanaka T. The Ml and M2-type isozymes of rat pyruvate kinase are produced from the same gene by alternative RNA splicing //J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 13807-13812.

77. Noh S.A., Kwak M.S., Lee H.S., Huh G.H., Liu J.R., Shin J.S., Bae J.M. Genomicorganizations of two small subunit ADP-glucose pyrophosphorylase genes from sweet potato // Gene. 2004. V. 339. P. 173 180.

78. Ohno S., Kawasaki H., Imajoh S., Suzuki K., Inagaki M. Yokokura H., Sakoh Т.,

79. Hidaka H. Tissue-specific expression of three distinct types of rabbit protein kinase С // Nature. 1987. V. 325. P. 161 166.

80. Ono Y., Kurokawa Т., Fujii Т., Kawahara K., Igarashi K., Kikkawa U., Ogita K.,

81. Nishizuka Y. Two types of complementary DNAs of rat brain protein kinase С // FEBS Letters. 1986. V. 206. P. 347 352.

82. Ortiz D.F., Strommer J.N. The Mul maize transposable element induces tissue-specificaberrant splicing and polyadenylation in two Adhl mutants // Mol. Cell. Biol. 1990. V. 10. P. 2090-2095.

83. Pan S.S., Han Y.S., Farabaugh P., Xia H. Implication of alternative splicing for expression of a variant NAD(P)H:quinone oxidoreductase-1 with a single nucleotide polymorphism at 465C>T // Pharmacogenetics. 2002. V. 12. P. 479 488.

84. Pankova V.V., Pudovkin A.I., Manchenko G.P. Allozymic variation determined byalternatively spliced exon of the Gpi gene in Polydora brevipalpa (Polychaeta: Spionidae) // GFI Bulletin. 2004. V. 37. P. 30.

85. Papadopoulou D., Louis C. The glutamate dehydrogenase gene of Drosophilamelanogaster: molecular analysis and expression // J. Neurogenet. 2000. V. 14. P. 125-145.

86. Peters J., Nash H.R., Eicher E.M., Bulfield G. Polymorphism of kidney pyruvate kinase in the mouse is determined by a gene, Pk-3, on chromosome 9 // Biochem. Genet. 1981. V. 19. P. 757-769.

87. Poly W.J. Nongenetic variation, genetic-environmental interactions and altered geneexpression. III. Posttranslational modifications // Сотр. Biochem. Physiol. 1997. V. 118. P. 551 -572.

88. Pourter L.D., Ibrahim H., Taylor L., Curthoys N.P. Complexity and species variation of the kidney-type glutaminase gene // Physiological Genomics. 2002. V. 9. P.157 -166.

89. Pozzoli U., Sironi M. Silencers regulate both constitutive and alternative splicing events in Mammals // Cellular and Molecular Life Sciences. 2005. V. 62. P. 1579 -1604.

90. Quest A.F.G., Eppenberger H.M., Wallimann T. Two different B-type creatine kinase subunits dimerize in a tissue-specific manner // FEBS Letters. 1990. V. 262. P. 299-304.

91. Radashevsky V.I., Pankova V.V. The morphology of two sibling sympatric Polydora species (Annelida: Spionidae) from the Sea of Japan // The Journal of Marine Biological Association of United Kindom» (JMBA). 2006. V. 86. P. 245-252.

92. Ranson H., Collins F., Hemingway J. The role of alternative splicing in generatingheterogeneity within the Anopheles gambiae class I glutathione ^-transferase family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 14284 14289.

93. Raymond C.S., Shamu C.E., Shen M.M., Seifert K.J., Hirsch В., Hodgkin J.,

94. Zarkower D. Evidence for evolutionary conservation of sex-determining genes // Nature. 1998. V. 391. P. 691 -695.

95. Richardson B.J., Baverstock P.R., Adams M. Allozyme electrophoresis: A handbook for animal systematics and population studies. Academic Press. Sydney. 1986. 410 pp.

96. Rider M.H., Vandamme J., Lebeau E., Vertommen D., Vidal H., Rousseau G.G.,

97. Vandekerckhove J., Hue L. The two forms of bovine heart 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase result from alternative splicing // Biochem. J.1992. V. 285. P. 405-411.

98. Ross V.L., Board P.G. Molecular-cloning and heterologous expression of an alternatively spliced human Mu class glutathione-S-transferase transcript // Biochem. J.1993. V. 294. P. 373-380.

99. Rueter S.M., Emeson RB. Adenosine-to-Inosine conversion in mRNA. In: (Grosjean H., Benne R., eds.) Modification and Editing of RNA. Washington, DC; ASM Press. 1998. P. 343-361.

100. Rueter S.M., Dawson T.R., Emeson R.B. Regulation of alternative splicing by RNA editing //Nature. 1999. V. 399. P. 75 80.

101. Sabina R.L., Ogasawara N., Holmes E.W. Expression of three stage-specific transcripts of AMP deaminase during myogenesis // Mol. Cell. Biol. 1989. V. 9. P. 2244 -2246.

102. Salmon A., Erb C., Meshorer E., Ginzberg D., Adani Y., Rabinovitz I., Amitai G.,

103. Soreq H. Muscarinic modulations of neuronal anticholinesterase responses // Chemico-Biological Interactions. 2005. V. 157. P. 105 113.

104. Sanford J.R., Bruzik J.P. Developmental regulation of SR protein phosphorylation and activity // Genes Dev. 1999. V. 13. P. 1513 1518.

105. Schmucker D., Clemens J.C, Shu H., Worby C.A, Xiao J., Muda M., Dixon J.E,

106. Zipursky S.L. Drosophila DSCAM is an axon guidance receptor exhibiting extraordinary molecular diversity // Cell. 2000. V. 101. P. 671 684.

107. Schutt C., Nothiger R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipterian insects // Development. 2000. V. 127. P. 667 677.

108. Setoyama C., Tamaoki H., Nishina Y., Shiga K.O., Miura R. Functional expression of two forms of rat acyl-CoA oxidase and their substrate specificities // Biochem. Bioph. Res. Commun. 1995. V. 217. P. 482-487.

109. Sharov A.A., Dudekula D.B., Ко M.S.H. Genome-wide assembly and analysis of alternative transcripts in mouse // Genome Research. 2005. V. 15. P. 748 754.

110. Shaw C.R. Electrophoretic variation in enzymes // Science. 1965. V. 149. P. 936 943.1. J^"

111. Shaw-Lee R., Lissemore J.L., Sullivan D.T., Tolan D.R. Alternative splicing of fructose -1,6-bisphosphate aldolase transcripts in Drosophila melanogaster predicts 3 isozymes // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 3959 3967.

112. Shi H., Xiong L., Stevenson В., Lu Т., Zhu J-K. The Arabidopsis salt overly sensitive 4 mutants uncover a critical role for vitamin B6 in plant salt tolerance // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 575-588.

113. Shin D., Park C. iV-terminal extension of canine glutamine synthetase created bysplicing alters its enzymatic properties // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 1184 -1190.

114. Shiokawa D., Matsushita Т., Kobayashi Т., Matsumoto Y., Tanuma S.I. Characterization of the human DNAS1L2 gene and the molecular mechanism for its transcrip-f tional activation induced by inflammatory cytokines // Genomics. 2004. V. 84. P.95. 105.

115. Siaterli M.Z., Vassilacopoulou D., Fragoulis E.G. Cloning and expression of human placental L-Dopa decarboxylase // Neurochemical Research. 2003. V. 28. P. 797 803.

116. Sikorav J.-L., Duval N., Anselmer A., Bon S., Krejci E., Legay C., Osterlund M.,

117. Reimund В., Massoulie L. Complex alternative splicing of acetylcholinesterase transcripts in Torpedo electric organ; primary structure of the precursor of the glycolipid-anchored dimeric form // EMBO J. 1988. V. 7. P. 2983 2993.

118. Singh R. RNA-protein interactions that regulate pre-mRNA splicing // Gene Expression. 2002. V. 10. P. 79 92.

119. Siqueira S.F., Dias S.M.G., Hardouin P., Pereira F.R.S., Lejeune В., de Souza A.P.

120. Transcription of succinate dehydrogenase subunit 4 (sdh4) gene in potato: detection of extensive RNA editing and co-transcription with cytochrome oxidase sub-unit III (сохЗ) gene // Curr. Genet. 2002. V. 41. P. 282 289.

121. Slavov D., Gardiner K. Phylogenetic comparison of the pre-mRNA adenosinedeaminase ADAR2 genes and transcripts: conservation and diversity in editing site sequence and alternative splicing patterns // Gene. 2002. V. 299. P. 83-94.

122. Soldati Т., Schafer B.W., Perriard J.C. Alternative ribosomal initiation gives rise tochicken brain-type creatine kinase isoproteins with heterogeneous amino termini // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 4498 4506.

123. Stamm S., Zhu J., Nakai K., Stoilov P., Stoss O., Zhang M.Q. An altemative-exon database and its statistical analysis // DNA Cell Biol. 2000. V. 19. P. 739 756.

124. Stamm S., Ben-Ari S., Rafalska I., Tang Y.S., Zhang Z.Y., Toiber D., Thanaraj

125. T.A., Soreq H. Function of alternative splicing // Gene. 2005. V. 344. P. 1 20.

126. Stromberg P., Hoog J.O. Human class V alcohol dehydrogenase (ADH5): a complex transcription unit generates C-terminal multiplicity // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 278. P. 544 549.

127. Stuart K., Panigrahi A.K. RNA editing: complexity and complications // Mol. Microbiol. 2002. V. 45. P. 591 -596.

128. Su D., Gladyshev V.N. Alternative splicing involving the thioredoxin reductase module in mammals: a glutaredoxin-containing thioredoxin reductase 1 // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 12177-12188.

129. Tailor P., Gilman J., Williams S., Mustelin T. A novel isoform of the low molecular weight phosphotyrosine phosphatase, LMPTP-C, arising from alternative mRNA splicing // Eur. J. Biochem. 1999. V. 262. P. 277 282.

130. Takahara K., Hayashi N., Fujitasagawa K., Morishita Т., Hashimoto Y., Noda A.

131. Alternative splicing of bovine terminal deoxynucleotidyl transferase С DNA // Biosci. Biotech. Bioch. 1994. V. 58. P. 786 786.

132. Takenaka M., Noguchi Т., Sadahiro S., Hirai H., Yamada K., Matsuda Т., Imai E.,

133. Tanaka T. Isolation and characterization of the human pyruvate kinase M gene // Eur. J. Biochem. 1991. V. 198. P. 101 106.

134. Cancer. 2001. V. 32. P. 222 235. Uy R., Wold F. Posttranslational covalent modification of protein // Science. 1977. V. 198. P. 890-896.

135. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W. et al. (274-coauthors). The sequence of the human genome // Science. 2001. V. 291. P. 1304 -1351. Visvikis A., Pawlak A., Accaoui M.J., Ichino K., Leh H., Guellaen G., Wellman M.

136. Structure of the 5' sequences of the human y-glutamyltransferase gene // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 317-325. Wahle E., Riiegsegger U. З'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes // FEMS

137. Weiss С., Zeng Y., Huang J.M., Sobocka M.B., Rushbrook J.I. Bovine NAD(+)dependent isocitrate dehydrogenase: alternative splicing and tissue-dependent expression of subunit 1 //Biochemistry. 2000. V. 39. P. 1807- 1816.

138. Wiens M., Koziol C., Batel R., Muller W.E.G. Prolidase in the marine sponge Suberites domuncula: Enzyme activity, molecular cloning, and phylogenetic relationship // Mar. Biotechnol. 1999. V. 1. P. 191 199.

139. Wilanowski T.M., Hayward D.C., Gibson J.B. Nucleotide sequence and expression of the 5«-glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene in Locusta migratoria II Bio-chimica and Biophysica Acta. 1998. V. 1443. P. 414 418.

140. Wirz Т., Soldati Т., Hissle J.P., Perriard J.C. A unique chiken В crestine kinase gene gives rise to 2 В - creatine kinase isoproteins with distinct N - termini by alternative splicing // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 1656 -1666.

141. Wright D.A., Shaw C.R. Genetics and ontogeny of a-glycerophosphate dehydrogenase isozymes in Drosophila melanogaster И Biochem. Genet. 1969. V. 3. P. 343 -353.

142. Wright R.M., Vaitaitis G.M., Wilson C.M., Repine T.B., Terada L.S., Repine J.E.cDNA cloning, characterization, and tissue-specific expression of human xanthine dehydrogenase/xanthine oxidase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 10690-10694.

143. Yamaguchi S., Nakanishi S. Regional expression and regulation of alternative forms of mRNAs derived from two distinct transcription initiation sites of the rat mGluR5 gene // J. Neurochem. 1998. V. 71. P. 60 68.

144. Yang X.L., Liu F.M., Skene R.J., McRee D.E., Schimmel P. Crystal structure of an

145. EMAP-II-like cytokine released from a human tRNA synthetase // Helvetica Chimica Acta. 2003. V. 86. P. 1246 1257.

146. Ye D.J., Lee C.H., Queener S.F. Differential splicing of Pneumocystis carinii f. sp.carinii inosine 5'-monophosphate dehydrogenase pre-mRNA // Gene. 2001. V. 263. P. 151 158.

147. Yoshimura K., Yabuta Y., Ishikawa Т., Shigeoka S. Identification of a cis element for tissue-specific alternative splicing of chloroplast ascorbate peroxidase pre-mRNA in higher plants // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 40623 40632.

148. Zheng Y., Zhou Z.M., Min X., Li J.M., Sha J.H. Identification and characterization of the BGR-like gene with a potential role in human testicular develop-ment/spermatogenesis // Asian Journal of Andrology. 2005. V. 7. P. 21 32.

149. Zhou Z., Licklider L.J., Gygi S.P., Reed R. Comprehensive proteomic analysis of the human spliceosome // Nature. 2002. V. 419. P. 182 185.

150. Zhu F., Zhang M. DNA polymerase zeta: new insight into eukaryotic mutagenesis and mammalian embryonic development // World Journal of Gastroenterology. 2003. V. 9. P. 1165- 1169.

151. Zwicky R., Muntener K., Csucs G., Goldring M.B., Baici A. Exploring the role of5' alternative splicing and of the 3'-untranslated region of cathepsin В mRNA // Biol. Chem. 2003. V. 384. P. 1007 1018.