Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изоферменты щелочной фосфатазы в сыворотке крови крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изоферменты щелочной фосфатазы в сыворотке крови крупного рогатого скота"

Государственный комитет Российской Федерации по высшему образован™

Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина

На правах рукописи

ЮРЬЕВА ЕЛИЗАВЕТА ВАСИЛЬЕВНА

ИЗСЖРМЕНТЫ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 1997 г.

Работа выполнена в Чувашском отделе Научно-исследовательского ветеринарного института Нечерноземной зоны Российской Федерации

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, Григорьева Т.Е. кандидат ветеринарных наук, Иванов Г.И.

доктор ветеринарных наук, профессор, зав.кафедрой биохимии КГАВМ Хазипов Н.З.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник "СПИД"-центра МЗ РТ Коксин В.П.

♦

Ведущая организация: Чувашский государственный университет

Защита состоится " УкУи^ 1997 года на заседании

Диссертационного Совета К. 053.29.19 при Казанском государственном университете им. В.И.Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, ул.Ленина 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан .70■ 1997 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета А, ^ ЛЛ&^С— Аскарова А.Н.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

1.1, Актуальность темы. Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) -ЩФ - группа ферментов, катализирующих гидролиз эфиров ортофос-форной кислоты и различных органических соединений, как алифатических, так и ароматических (н.н.Рвгп1ву , 1971; 7.р. Но11аи<1вг» 1971). Распространенность в природе (бактерии, растительные и животные ткани) свидетельствует о том, что фермент ответственен за фундаментальные биохимические процессы. Фермент присутствует практически во всех органах и тканях и особенно высока его активность в костной ткани, паренхиме печени, почек, слизистой кишечника, предстательной и молочной железах. Активность ЩФ обнаруживается и в сыворотке крови. По данным разных авторов, з сыворотке крови крупного рогатого скота присутствует от одного до трех изоферментов 1ЦФ. Сведения об изорерментном спектре ЩФ у крупного рогатого скота в зависимости от возраста и беременности носят фрагментарный характер. Изучение активности и изофер-ментного состава ЩФ сыворотки крови разных возрастных групп крупного рогатого скота в зависимости от физиологического состояния и уровня обмена веществ может открыть новые возможности для ветеринарной медицины з диагностике нарушения обмена и функции внутренних органов.

1.2, Цель и задачи исследований. Целью исследования явилось изучение изоферментного спектра и активности изоферментов 1ЦФ сыворотки крови крупного рогатого скота з динамике роста и развития, беременности и после родов, уровня минерального и белкового обменов.

Задачи исследований:

- изучить изоферментный спектр и активность изоферментов

ЩФ сыворотки крови телят 3-х, 12-, 18-месячного возрастай

- изучить изоферментный спектр и активность изоферментов ЩФ сыворотки крови нетелей и коров в зависимости от сроков беременности и после родов;

- изучить возможные взаимосвязи активности изоферментов ЩФ и уровня общего кальция для вышеуказанных животных;

- изучить возможные взаимосвязи активности изоферментов ЩФ и уровня неорганического фосфора;

«• изучить частому выявления и относительную активность отдельных изоферментов И® в зависимости от уровня белков (как показателя функциональной активности печени);

- изучить активность изоферментов ЩФ нетелей с нарушениями минерального обмена.

Исследования выполнены в.соответствии с планом научно-исследовательских работ, утвержденных Отдедением ВАСХНИЛ по Нечерноземной зоне {№ Госрегистрации научно-технического задания 01.9.ТО 027738, шифр 0021).

1»3, Научная новизна. Изучен изоферментный состав и активность изоферментов ЩФ сыворотки крови крупного рогатого скота черно-пестрой породы в динамике роста и развития (телята 3-х. 12-, 1&-месячного возраста), физиологического состояния (нетели и коровы в зависимости от сроков беременности и в течение 2-х месяцев после родов), нетелей с нарушениями минерального обмена. Получены новые данные корреляционной связи активности костной фракции ЩФ2 с уровнем неорганического фосфора разных возрастных групп и физиологического состояния; печеночной фракции с уровнем альбуминов и альбумин-глобулинового коэффициента. В сравнительном аспекте дана характеристика изоферментов ЩФ в зависимости от возраста, физиологического состояния и уровня обме-

на веществ.

1.4. Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы как биохимические критерия нормы и патологии у крупного рогатого скота черно-пестрой породы а диагностических целях ветеринарной медицины.

Кроме того, полученные результаты могут быть использованы в ветеринарной биохимии как исходные для крупного рогатого скота черно-пестрой породы, для оценки минерального обмена и функционального состояния органов и тканей.

1.5. На защиту выносятся следующие основные полонения диссертации;

у

- основные фракции изоферментов ЩФ у крпного рогатого скота в зависимости от возраста и физиологического состояния;

- активность изоферментов ЩФ и уровень общего кальция и неорганического фосфора у крупного рогатого скота в зависимости от возраста и физиологического состояния}

- активность изоферментов ЩФ и уровень белкового обмена у крупного рогатого скота в зависимости от возраста и физиологического состояния;

- сравнительный анализ изоферментов ЩФ у крупного рогатого скота в зависимости от возраста, физиологического состояния и обмена веществ.

1.6. Реализация результатов исследований. По итогам проведенных исследований получено 1 авторское свидетельство $ 1720637 "Способ диагностики субклинической остеодистрофии у нетелей" заявка № 479890, приоритет 26.02.90.

1.7. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: Всеосюзном симпозиуме "Микроэлементозы человека", М., 15-17 ноября 1989; Конференции "Проблемы диагностики, профилак-

тики и лечения сельскохозяйственных животных в Нечерноземной зоне", Низший Новгород, 1992; Всесоюзной научно-производственной конференции "Гигиена, ветсанитария и экология животноводства", Чебоксары, 22-24 сентября 1994; Научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов, посвященной 65-^яетию основания ЧГСХА 19-22 марта 1996, Чебоксары. 1996; Юбилейной научной и учебно-методической конференции, посвященной 70-летин _ факултета ветеринарной медицины Воронежского государственного аграрного университета им, К,Д.Глинки, Воронеж, 21-23 октября 1996.

Основные научные положения и практические рекомендации используются в Республиканской ветеринарной лаборатории для диагностики патологии минерального обмена веществ у животных,

1.8, Публикация результатов исследований. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 7 печатных работах,

1.9, Объем и структура диссертации« Диссертация изложена на 148 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов, практических предложений, списка литературы и приложения; иллюстрирована 45 таблицами и 11 рисунками. Список литературы включает 212 источника, в том числе 147 иностранный,

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика групп животных. Экспериментальные исследования проводились в лабораториях Чувашского отдела Научно-исследовательского ветеринарного института Нечерноземной зоны Российс-

кой Федерации и производственных условиях хозяйств Чувашской Республики: СХПК "Канат" Канашского, "Заветы Ильича" Ядринского и "Чебоксарский" ..Чебоксарского районов. Группы животных подбирались по принципу аналогов с учетом породности, пола, возраста, количества лактаций, сроков беременности. 3 опытах использованы телята в возрасте 3, 12, 18 месяцев, нетели в динамике беременности 5-9 месяцев, первотелки после родов в течение 2-х месяцев, коровы 2-4 лактаций продуктивностью 3500-4000 кг молока в год в динамике беременности 6-9 месяцев и после родов в течение 2-х месяцев. В группах нетелей в отдельную подгруппу выделялись животные с нарушениями минерального обмена. Для экспериментальных исследований подбирали крупный рогатый скот черно-пестрой породы, исследования проведены в стойловый период содержания. Группы отбирались комиссионно научными сотрудниками Чувашского отдела и специалистами хозяйств.

Материалы и методы. Материалом исследования слуаила кровь крупного рогатого скота. Всего исследовано 879 проб сыворотки крови, из них: телята в возрасте 3 месяда - 6, 12 месяцев - 6, 18 месяцев - 13; нетелей в динамике беременности - 179; первотелок в течение 2-х месяцев после родов - 108; коров в динамике беременности - 202; коров в течение 2-х месяцев после родов -365.

Во всех пробах крови определяли активность изоферменты ЩФ, содержание общего кальция и неорганического фосфора, общего белка и белковых фракций с расчетом альбумин/глобулинового (А/Г) коэффициента.

Для решения поставленных задач использовались следующие методы исследования:

1. Общую активность Щ5 (ОЩФ) определяли по гидролизу р-нитро фенидфосфата оптимализованным методом с использованием наборов реактивов фирмы "ДАХЕШ" (Чешская Республика).

2. Белковые фракции определяли методом электрофореза на ацетатцеллюлозных мембранах на трис-глициновом буфере с последующим окрашиванием амидочерным 10 В и количественной оценкой после элюирования в смеси 1н №0Н : 0,1 н трилон Б : Н20 в соотношении 5,0:0,5:5,0 (Пушкарев И.А., Зариньш Э.В. и др., 1977).

3. Общий белок определяли рефрактометрическим методом.

4. Неорганический фосфор определяли по методу В.Ф.Коромыс-ловой и Л.А.Кудрявцевой.

5. Общий кальций определяли комплексонометрическим титрованием.

6. Раделение изоферментов проводили методом электрофоре-

♦

за в пластинчатом 7 % полиакриламидном геле в трис-глициновой буферной системе рН 8,3 на аппарате для вертикального электрофореза марки ПЭЗД. с использованием камеры для пластинчатых гелей марки АНГЭ № 1 ("Химифил" РК "ХИЙУ КАЛУР" Эстонская Республика). Проявляли изоферменты методом одновременного азосочета-ния с использованием в качестве субстрата 2-нафтилфосфат и в качестве солей диазония - краситель синий прочный В. Количественную оценку изоферментов проводили на микрофотометре ММ и активность рассчитывали исходя из общей активности.

Предварительно в качестве метода выбора для разделения изоферментов ЩФ был опробирован также электрофорез в 1 % агаровом геле, в процессе которого было выявлено, что в агаровом геле отдельные фракции ЩФ частично перекрываются и метод в дальнейшем не использовался, как не имеющий достаточную разрешающую способность.

Результаты исследований обрабатывали методами вариационной статистики, для чего определяли среднее выборки, ошибку средней, достоверность различий между группами, коэффициент корреляции, коэффициенты линейной регрессии; применяли также метод оценки и сравнения бинарных отношений с использованием меры Кульбака.

3. РЕЗУЖСАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1, Основные изосберментц ШФ крупного рогатого скота.

У крупного рогатого скота в сыворотке крови обнаружено от 1 до 3 основных фракций изоферментов Ш с относительной электрофорети-ческой подвижностью по отношении к альбуминам: ШФ^ - 0,50-0,52 (печеночный), ЩФ2 - 0,36-0,38 (костный) и ЩФ3 - 0,30-0,32 (кишечный). Кроме основных фракций в процессе исследования также бшги выделены изоферменты с иной электрофоретической подвижностью, которые были названы "минорными" вследствии их редкой встречаемости и недоминирушщей активности. "Минорные" фракции присутствовали совместно с основными фракциями.

Из выделенных изоферментов Щ$2 присутствовала в сыворотке крови всех обследованных животных, ЩФ^ и ЩФд - у части животных. Частота выявления ЩФ] зависела от возраста и физиологического состояния. Появление ЩФд не носила выраженной возрастной и физиологической зависимости. Изоферменты ЩФ|, ЩФд и "минорные" фракции не являлись постоянными для сыворотки крови, появление их было или эпизодическим, или более постоянным, активность их, % содержание от общей активности и длительность сохранения активности колебались в широких пределах.

3.2. Изоферменты ШФ крови крупного рогатого скота в зави-

димости ру возраста и физиологического состояния.

3.2.1. Изофермэнты ЩФ телят. У телят в возрасте 3 я 12 месяцев ЩФ сыворотки крови состояла из одного изофврмента ЩФ2. Изофермэнты ЩФ^ и П®2 на были обнаружены. В сыворотке крови телят в возрасте 18 месяцев было выявлено от I до 2 изоферментов ЩФ: ЩФ2 с Щ&2: % случаев), ЩФ2 с ЩФ3 (23,1 % случаев) или один изо-фермент П®2 (61,5 % случаев). Активности общей ЩФ (ОВД) и изофер-мента Щ&2 имели возрастную зависимость: ЩФ2 телят в 3 месяца равнялась 124,1±Ю,6 Е/л, в 12 месяцев - 81,1±6,9 Б/л и в 18 месяцев - 71,4±9,2 Е/л. Активность IliSj и Щ53 у телят в возрасте 18 месяцев равнялись соответственно 8,3±3,1 Е/л и 5,6±1,6 Е/л. Возрастная зависимость активности ОЩФ и костного изоэнзима подтвер-вдается многочисленными литературными данными, имеет, по всей вероятности, общебиологический принцип, связана с высокой активностью остеобластов и в растущем организме поддерживается влиянием гормона роста ( L.C.Clark, Е. Beck, 1950;M.S. Raben, 1963; j.Stepan, J.Marek 'et al., 1979).

3.2.2. Изофермэнты ЩФ нетелей и первотелок. В сыворотке крови нетелей я первотелок обнаружено от 1 до 3 изоферментов Щ>, Во все сроки беременности и после родов в большинстве случаев (более 50 %) ¡Щ> сыворотки крови состояла из одного изофврмента 1®2. Частота выявления двух изоферментов ЩФ}-+ЩФ2 у нетелей зависела

от сроков беременности - наибольшее число случаев было выявлено в 8 месяцев (32,0 %), к концу сроков беременности наблюдали снижение числа случаев выявления Пфр Три изофврмента ЩФ^ЩФ^Пфд и два изофврмента ЩФ2+ЩФд выявлялись эпизодически. У одной"нетели была обнаружена "минорная" фракция с электрофоретической подвижностью 0,18 в комбинации о ЩФ2 и относительной активностью 6,7 %. У первотелок частота выявления двух изоферментов ЩФ1+Щ2

зависела от сроков после родов, была минимальной в течение суток посла родов (6,7 % случаев), затем частота выявления постепенно нараотала а через 11-20 дней была максимальной (30,4 %), в последующем вновь постепенно снизилась и через 1,5 и 2,0 месяца выявлялась соответственно в 12,5 в 16,7 % случаев. Активность ОЩВ и его. изоферментов в сыворотке крова нетелей и первотелок колебалась в широких пределах - 01® от 12,5 до 248,0 Е/л, ЩФ^ -от 1,7 до 77,3 Е/л, Щ2 ~ 0т 10«8 197»2 Е/л» ^3 "" от 1,3 д0 40,0 Е/л со статистически достоверными различиями 0Щ5 и в зависимости от сроков беременности и послеродового порода (табл.1). Активность ОН® у нетелей была самой низкой в 6 месяцев ¿временности - 51,5±6,2 Е/л, в последующем, о увеличением сроков беременности, активность ОЩ постепенно нарастала. Динамика изменения активности более выраженной - при активности П$2 в 6 месяцев 44,0±б,9 Е/л к концу беременности ее активность повысилась до 65,5±6,9 Е/л (Р ^ 0,01). Через 2-3 дня после родов у первотелок активность 0110} и ИФ2 снизилась (Р ^ 0,01). В последующем, на 4-Ю дни 01® и вновь возросла. Затем активность Щ2 снизилась через П-20 дней до 31,5±2,4 Е/л (Р < 0,01) и в последующем в течение наблюдаемого периода была практически на одном уровне. Активность 0Щ5 на 4-10 день также возросла до 50,2*5,0 Е/л (Р ^ 0,05), повторное онижение активности 0Щ& наблюдали только через 40-50 дней (37,2±3,3 Е/л; Р <. 0,05). Различие в динамике изменения активности 0Щ5 и Щ$2 в послеродовом периоде связано с тем, что о 4-Ю дня увеличивается частота появления Щ&1 и что вносят свою долю в активность ОЩВ.

В сыворотке крови нетелей и первотелок о двумя и более изо-ферментами № соотношение их активностей колебалась в широких пределах: - от 3,0 до 81,8 % от активности 0Щ5, Щ&3 - от

Таблица I

Активность азофермвнтов ЩФ крови нетелей и первотелок в динамике беременности ъ после родов

Сроки, дни

Кол-во

проб М*м щ 1Й1 И№3 м*м ОВД М*ы

а) до родов •

150 36 47,3*13,8 59,9*7,2 2,9*1,7 70,6*9,2

180 38 24,0±5,3 44,0*3,9 2,3 51,1*6,2

210 48 28,9*6,2 49,4*2,8 - 55,8*6,8

240 25 28,2*7,6 48,0*6,8 40,0 57,9*6,8

260-270 16 44,4-18,0 58,1*11,9 17,8 67,5*11,9

2-10 дней до родов 12 44,2*17,6 63,2*7,8 - 70,5*11,5

в течение суток до родов 6 - * 65,5*6,9 — 65,5*6,9

б) после родов

в течение суток 15 30,0 64,1*9,7 26,7 66,1*8,9

2-3 16 16,7*11,1 32,5*3,9 - 35,6*3,9

4-10 26 21,5*5,5 43,0±5,2 15,6 50,2*5,0

11-20 23 38,5*11,5 31,5*2,4 14,0 45,5*6,0

21-30 14 27,6*7,9 37,9*4,5 - 45,7*4,5

40-50 8 15 ^4 30,5*3,3 - 37,1*3,3

60-70 6 3,0 32,3*4,9 - 33,5*4,9

1,2 до 52,6 %, статистически не отличаясь от сроков беременности в юслв родов, но в 9 месяцев беременности относительная активность ни у одной нетели не превышала 48,1 %.

3.2.3, Изофермэнтн ЩВ коров в динамике беременности и после родов. 7 коров в динамике беременности ЩЬ сыворотки крови в бо-

лее чем 50 % случаев состояла из одного изофермента Щ52» Изофер-менг 11^2 выявлялся совместно с Щ$2 и частота обнаружения его зависела от сроков беременности, достигая пика в 8 месяцев -41,5 % случаев. К концу беременности частота выявления И№д- снизилась и в течение суток до родов была минимальной - 16,7 % случаев. выявлялся совместно о ЩФ2 на 210-270 дни и в одном случае - совместно о и П^« После родов Щф сыворотки крови коров также в более чем 50 % случаев состояла из одного изофермента Щ3>2« Частота обнаружения двух изоферментов ЩВ^Щ^ постепенно нарастала с 25,7 % случаев в течение суток после родов до 42,3 % случаев через 21-30 дней. Частота выявления ¡Щ>3 носил эпизодический характер, не зависел от сроков послеродового периода и присутствовал в крови совместно с и Щ$2 или только с Щ>2 в 1»9-4»5 % случаев. Кроме основных фракций изоферментов в сыворотке крови были обнаружены от I до 4 "минорных" фракций у 4,0 % коров второй половины беременнооти и у 4,9 % - после родов в разных комбинациях о основными фракциями. У двух коров второй половины беременности и у одной коровы после родов "минорная" фракция была расположена в зоне с электрофоретической подвижность» 0,44, в остальных случаях минорные фракции имели электрофоретичеокую подвижность более низкую, чем основные фракции. В большинстве случаев относительная активность "минорных" фракций была ниже, чем основных. Однако у одной коровы после родов относительная' активность "минорной" фракции с электрофоретической подвижностью 0,12 составляла 57 % и у одной коровы были обнаружены совместно о Щ&2 4 "минорные" фракции о относительной активностью 7,0, 28,0, 21,0 и ^34,0 %. Органное происхождение "минорных" фракций не идентифицировала, часть из кото-£нх могут быть собственно не изоферментами, а изоформами, пред-

ставленными комплексами И£& о молекулярными или надмолекулярными структурами, например, о фрагментами клеточных мембран, особенно это касается фракций о низкой эдектрофоретической подвижностью.

Соотношение активностей изоферментов в пробах с двумя и более изоферменташ колебалась в широких пределах: - от 3,0 до 90,0 %, Щфд - от 3,0 до 29,0 отатистичеоки не отличаясь как в динамике беременнооти, так и после родов.

Активность 0Щ$ и №2 коров зависела от сроков беременности я послеродового периода (табл.2).

Активность 01® в Щб^ в течение 6-8 месяцев беременности была практически на одном уровне. За 2-Ю дней до родов активности ОЩф и Щ>2 начали повышаться ввдень родов достигли максимального уровня - соответственно 61,5^3,1 Е/л (Р 0,001) и 55,5±4,6 Е/л (Р 0,001). После родов активность 0Щ$ и в течение суток снизилась в среднем соответственно до 47,7*5,1 Е/л (Р 0,05) и 40,2*4,6 Е/л (Р 0,05). В последующем, активность 011® продолжала снижаться в течение всего наблюдаемого периода, а активность №2 снижалась до 40-50 дней (Р <0,001). Таким образом, по нашим данным, изменение активности'ОЩЬ в зависимости сроков беременности в после родов происходит, в основном, за счет изменения активности изофермента Щ52 и динамика изменения активности ОЩЬ и Щ&2 у нетелей и коров и первотелок и коров различны, Повышение активности ОЩ перед родами я снижение активяооти после родов согласуются данными ряда исследований (A.T.Peter, W.T.K.Boau et al., 1987; А.М.Бадалян, А.О.Манаоенич и др., 1989), которое авторы связывали о усилением глюконеогенеза в печени и метаболических процессов в связи о увеличением потребности в глюкозе. По нашему мнению, поскольку увеличение активности Щф происходит за счет

Таблица 2

Активность язоферментов ЩВ крови коров в динамике беременности я после родов

Сроки, дни Кол-во___Активнооть. Е/л_____

ПРО<3 щ2 ОЩ&

М*м М*м М*м М*м

а) до родов

а/ ¿^дия 180 29 35,0*8,2 36,0*4,2 44,8*4,6

210 53 37,1*8,3 35,9*1,7 3,2*0,4 43,3*2,7

240 53 33,7*5,5 36,7*3,1 2^7 49,2*4,5

260-270 27 25,9*12,6 со 5,4 41,9*4,4

2-Ю дней до родов 26 38,8*10,4 43,8*5,8 16,8*12,3 58,8*4,7

в течение суток до родов 12 18,0*8,5 55,5*4,6 - 61,5*3,1

б) после родов

в течение суток 33 29,0*9,7 40,2*4,6 - 47,7*5,1

2-3 39 34,1*5,9 34,9*3,8 11,2 47,1*3,6

4-10 51 28,9*3,7 31,4*2,4 6,4*3,5 44,1*3,5

11-20 64 30,3*4,0 31,2*1,9 8,5*4,5 44,7*3,5

21-30 41 28,8*5,3 30,6*1,7 1^0 45,5*4,2

40-50 46 23,5*4,4 25,9*1,8 1,9 38,742,6

60-70 51 24,4*5,2 29,2*0,8 4,5*1,3 36,8*2,3

костного изоэнзима механизм увеличения активности может быть связан также о повышением продукции параггормона и калы® тони на перед родами (К.Ноуе, 1987), что в свою очередь активирует осте-областичеокие'процессы о увеличением активности (Р.Марри, Д.Геннер и др., 1993) и, вероятно предположение, также может являться поставщиком фосфора для покрытия потребностей синтеза макроэрги ческях соединений.

3.3. Активность изоферментов 1® а уровень общего кальция и неорганического фосфора крови крупного рогатого скота.

3.3.1. Активность изофермента и уровень кальция и фосфора телят. Манду активностью П$2 и уровнем неорганического фосфора определялась корреляционная зависимость с коэффициентом корреляции в зависимости от возраста от г « 0,735 (Р 0,05) в 3 месяца до 0,873 (Р -¿0,001) в 18 месяцев. Между активностью изоферментов и уровнем общего кальция не выявлено определенной взаимосвязи и лишь у телят в возрасте 18 месяцев в подгруппе с двумя изоферментами и Щ!^ уровень кальция в крови был ниже, чем в крови телят аналогичного возраста с одним изоферментом П$2 (соответственно 2,13*0,19 и 2,58*0,12 ммоль/л).

3.3.2. Активность_взоферментов и уровень кальция и фосфора крови нетелей и первотелок. нетелей в 5 и 6 месяцев беременности между уровнем неорганического фосфора и активностью Щ3>2 определялась высокая корреляционная связь, равная соответственно

г* = 0,704 (Р <¿0,001) Я г = 0,848 (Р ^0,001), средней - в 210-270 дней и за 2-Ю дней до родов (от г = 0,391 до г = 0,631) и отсутствие таковой в течение суток'до родов. После родов корреляционная связь между активностью Щ2>2 и уровнем неорганического фосфора оценивалась, в основном, как средней и только через 60-70 дней после родов - высокой. В то же время, динамика изменения активности Щ&2 н уровня неорганического фосфора в зависимости от сроков беременности и послеродового периода не были синхронными. В отличие от Щ^з, уровень неорганического фосфора в течение суток до родов (1,73*0,13 ммоль/л) статистически не отличалась от уровня в течение всего наблюдаемого периода беременности; после родов через 2-3 дня снизилась до 1,41*0,06 ымоль/л, а в последующем, через 21-30 дней возросла до 1,80*0,06 ммоль/л (Р -¿0,001).

Между уровнем кальция и активностью азоферментов № не выявлено какой либо взаимосвязи как в динамике беременности, так и после родов; с колебаниями от 2,58*0,04 ммоль/л в б месяцев до 2,77*0,15 ымоль/л в течение суток до родов и от 2,47*0,06 ммоль/л через 2-3 дня после родов до 2,61*0,06 ммоль/л через 21-30 дней после родов и последующим снижением через 40-50 дней (2,28*0,06 ммоль/л; Р 0,001).

3.3.2.1. Изоферменты 1И в уровень кальция и фосфора нетелей с нарушением минерального обмена. У нетелей второй половины беременности с клиническими проявлениями нарушения минерального обмена по сравнению с клинически здоровыми выше активность ОЩФ (89,6*7,1 и 43,2*4,9 Е/л; Р ^0,001), Щ&2 (75,4*6,0 и 41,7*4,9 Й/л; Р 0,001), чаще выявлялись два изофермента Itfïj+II^ ^ против 13,9 % случаев) или три изофермента ЩФ^Щ^+Щ^з (4,7 % против 0). У нетелей с двумя и более изоферментами"выше активность IIJïj (43,6*4,5 и 15,4*2,4 Е/л; Р ^ 0,001); выше уровень неорганического фосфора (1,91*0,03 и 1,80*0,02 ммоль/л; Р<0,01). Исходя из проведенных исследований, для прогнозирования болезней нарушения минерального обмена у нетелей второй половины беременности предложен способ диагностики субклинической остеодистрофии по активности изофермента IP2 U.C. № 1720637 от 26.02.90), основанный на том, что при активности ВНШ9 90 Е/л в % случаев диагностировалась остеодиотрофия, что повышает также, по нашим данным, специфичность теста до 100 %.

3.3.3. Активность язоферментов Ш и уровень кальция я фосфора коров в динамике беременности и после родов. У коров в зависимости от сроков беременности и послеродового периода выявлена в разной степени выраженная корреляционная связь между активностью 1Щ>2 и уровнем неорганического фосфора, оцениваемая как

высокой в 260-270 беременности (г = 0,751; Р <-0,001), в течение суток до родов (г = 0,959; Р <¿-0,01) и через 4-10 дней после родов (р = 0,713; Р ¿0,001). В остальные сроки корреляционные отношения оценивались как средние. В то хе время не наблюдали достоверного изменения уровня неорганического фосфора в зависимости от сроков беременности. После родов в течение суток уровень неорганического фосфора снизился с 1,84*0,04 до 1,62*0,03 ммоль/л (Р <0,001), в последующем, с небольшими колебаниями показатель

Шж.ДУ УрОВНбМ КЭЛЬЦИЯ И ЭКТИВНОСТЫО ИЗОфер-

ментов Щф не выявлено какой либо значимой корреляционной связи. По нашим "данным, уровень кальция с увеличением сроков беременности снизился с 2,62*0,04 ммоль/л в 6 месяцев до 2,47*0,02 ымоль/л (Р < 0,001) за 2-Ю дней до родов. После родов уровень кальция в течение суток снизился до 2,30*0,04 ымоль/л, в последующем, через 21-30 дней наблюдали повышение показателя (2,50*0,04 ммоль/л; Р 0,001). Таким образом, по нашим данным, внутри каждого, выделенного физиологического состояния и возраста существует определенная взаимосвязь между уровнем неорганического фосфора и активностью ПЗ^, связанная у молодняка и нетелей, по всей вероятности, формированием костного ыатрикса, при котором функции ЩФ, по данным одних авторов-(НЛвюь, w.p. Neumaa, 1961), сводится к удалению органических полифосфатов, подавляющих рост кристаллов, по данным других (:н.С»Anderson, 1973) - способствует увеличению концентрации неорганичеокого фосфора и образованию кристаллов фосфата кальция. У коров и нетелей в динамике беременности и после родов данная связь частью может быть связана с ростом плода, родами, лактацией и являться фактором адаптационного синдрома, частью - как у молодняка, так и взрослых животных - следствием нарушения минерального обмена разной степени выраженности.

3.4. Изоферментный спектр И и белковый статус крови крупного рогатого скота. Для оценки функциональной активности печени у животных с изоферментом исследовала белковые фракции сыворотки крови, как один из интегральных показателей гомеостаза с определением концентрации альбуминов и расчетом альбумин-гло-будинового коэффициента (А/Г) в связи с тем, что альбу-

мины являются одним из плазмаспецифяческих белков, синтезирующихся в печени, а А/Г коэффициент - может быть использован как отражение мезенхимальной реакции, связанное с увеличением иммуноглобулинов. Учитывая, что активность печеночного изофермента Пф^ и белков сыворотки крови не имеют прямой зависимости, а зависимость может носить достаточно сложный характер, использовали метод оценки и сравнения бинарных отношений, для чего весь диапазон измерений квантовался на две градации с относительно высокой

больше 50 %) - группа В я низкой (ЩЗ^ меньше 50 %) - группа А относительной активностью по уровню альбуминов и А/Г коэффициента - выше и низа медианы. Рассчитывали абсолютную и относительную частоту встречаемости признака, вклад каждой градации в величину (меру Кульбака), оценивающую различие между гистограммами. В отдельную группу были выделена животные с одним изоферментом Щ&2*

3.4.1. Изоферменгы Щ и белковый статус крова_яэтелеЗ и первотелок. В результате проведенных исследований у нетелей и первотелок выявлена разной степени репрезентативности обратная корреляционная связь между относительной активностью ЩЗ^ и уровнем альбуминов и А/Г коэффициентом, равная соответственно у нетелей

- г> = -0,576 (Р <■ 0,001) и г = -0,523 (Р <0,001); у первотелок

- Г- = -0,398 (Р < 0,05) и Г = -0,530 (Р <0,05). В крови нетелей с одним изоферментом уровень альбуминов (35,05*0,2 г/л) и

А/Г коэффициент (0,97*0,01) не огличался от аналогичных показателей группы А (35,37*0,72 г/л и 0,95*0,03) и достоверно нике были показатели в группе В (31,50*0,89 г/л; Р -¿.0,001 и 0,75*0,04 Р 0,001). У первотелок во всех трех группах уровень альбуминов статистически не отличался, А/Г коэффициент был нике в группе В (соответственно 1,01*0,01; 1,01*0,06 и 0,85*0,04; Р <0,05). Информативность признака по Кульбаку у нетелей и первотелок для альбуминов был практически на одном уровне - 16,4 и 15,3, а для А/Г коэффициента - выше у нетелей (23,8) по сравнению о показателем у первотелок (10,9).

3.4.2. Изоферменты Щ и белковый статус крови коров второй доловины беременнооти и посла родов. Проведенными исследованиями установлена репрезентативная обратная корреляционная связь у коров второй половины беременности и в течение двух месяцев после родов между относительной активностью я уровнем альбуминов (соответственно \г « -0,86; Р < 0,01 и г = -0,72; Р <0,01) и А/Г коэффициентом (соответственно г « -0,86; Р <0,01 и г: = -0,66; Р <0,01). У коров второй половины беременности с одним изофер-ментом Щ®2 уровень альбуминов (37,97*0,32 г/л) и А/Г коэффициент (0,94*0,01) не отличался от показателей группы А (соответственно 36,58*0,70 г/л и 0,85*0,04) в достоверно отличался от показателей группы В (31,93*0,69 г/л; Р -¿0,001 и 0,69*0,03; Р <0,001). У коров после родов о одним изоферментом уровень альбушнов (38,33*0,25 г/л) в А/Г коэффициент (1,00*0,01) выше аналогичных показателей группы А (35,94*0,54 г/л; Р < 0,01 и 0,85*0,02; Р -¿0,001), а показатели коров группы А выше показателей группы В (соответственно 33,78*0,58 г/л; Р <0,01 в 0,75*0,02; Р<0,01). Информативность признака по Кульбаку для альбушнов выше у коров второй половины беременнооти (47,2) по сравнению с показателем

после родов (18,2), для А/Г коэффициента - выше у коров после родов (37,2), чем у коров второй половины беременности (28,7). Таким образом, по нашим данным, существует взаимосвязь между относительной активностью lUSj и показателями белкового статуса крови, как маркеров функциональной активности печени и гомеоота-за в целом, зависящая также от физиологического состояния и возраста.

3.5. Сравнительный анализ изоферментов Dg в зависимости от возраста и физиологического соотошгия., Установлена зависимость изоферментного спектра и активности 0Щ5 и П®2 от возраста и физиологического состояния. 7 телят о 3 месячного возраста до 18 месячного возраста активнооть Щ&2 сыворотки крови снизилась в 1,8 раза. Щ сыворотки крови телят состоит из одного изофермента Щ1>2 - костной фракции, которая также подтверждается данными других авторов (С.Антонов, М.Малчевски, 1983). Динамика изменения активности 0Щ$ и отдельных изоферментов у нетелей и коров второй половины беременности и после родов имела свои особенности: у нетелей 0Щ5 и ЩФ2 начала повышаться за 11-20 дней, у коров - за 2-Ю Дней до родов. После родов активнооть №2 у первотелок начала "снижаться через 2-3 суток, у коров - сразу после родов и активность Щ$2 первотелок в течение суток после родов была выше (Р 0,05). Активность ОВД и Щ$2 в° ВС9 сроки беременности была выше у нетелей, что, по всей вероятности, связано с тем, что у нетвлей не закрыты оствогенные зоны и продолжается формирование костного скелета.

Проведенные исследования показали, что у молодняка и взрослых особей крупного рогатого скота взаимосвязь активности Щ52 я уровня неорганического фосфора зависит тайге от возраста, сроков беременности и послеродового периода. Уравнения регрессии, рассчи-

танные для групп аналогов по срокам беременности коров и нетелей з групп аналогов коров в первотелок после родов, отличались (табл.3). Высокая корреляционная связь между активностью ЩВ2 и уровнем неорганического фосфора являлась характерной, в основном, для молодняка.

Таблица 3

Коэффициенты линейной регрессии связи уровень неорганического фосфора - активность Щ$2 групп аналогов

Сроки беременности Нетали и_пе£вотелки___Коровы _

и после родов, дни ~~а " ~а ~ ~ ь ~ ~

а) беременные животные

260-270 1,59 0,0042 1,37 0,0Ц

2-Ю дней до родов 1,43 0,0091 1,49 0,0086

б) после родов

в течение суток 1,30 0,0041 1,34 0,007

40-50 1,49 0,0108 1,22 0,0146

Таким образом, можно предположить, что для каждого физиологи ческого состояния существуют определенные механизмы регуляции гомеостаза неорганического фосфора и Щ&2.

Выявлены также различия белкового статуса крови и активности для разных возрастных групп (нетели и коровы) и физиологического состояния (беременные и после родов). Наиболее выражено снижение уровня альбуминов и Л/Г коэффициента при повышении относительной активнооги выше 50 % у коров, чем у нетелей и первотелок, на что указывает более внсокая информативность по Кульбаку для нетелей более характерным является изменение соотношения белковых фракций, нежали альбуминов, для коров второй половины

беременности - альбуминов.

■Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что изоферменгы ЩФ сыворотки крови, равно как их индивидуальная активность, так и изоферментный спектр зависят от многих причин и, в первую очередь, от возраста I физиологического состояния, связанного с рвпр»дуктивн»й функцией, от состояния минерального, белкового обменов, функции внутренних органов и тканей. Изменения активности изоферментов 11® и изоферментного спектра ¡115 сыворотки крови протекают не изолированно, а в комплексной многомерной взаимосвязи с функцией органов, обменом веществ на фоне изменения уровня других показателей гомеостаза. Метод анализа изоферментного спектра дает возможность вполне определенно идентифицировать тканевой источник повышения активности. Кроме того, данные могут помочь в диагностике расстройств тканей, комбинированных заболеваний печени, костной патологии и другиз тканей, связанных с метаболическими нарушениями; заболеваний, при которых активность 011$ сыворотки крови не выходит за пределы нормальных значений,

ВЫВОДЫ

1» В сыворотке крови крупного рогатого скота выявляется от одного до трех изоферментов щелочной фосфатазы: ЩФ^ - печеночный изофермент, №>2 ~ костный изофермент, Шд - кишечный изофермент. Из них Ш$2 выделяется у всех животных независимо от возраста и физиологического состояния. Кроме указанных изоферментов у части животных выявляются дополнительные фракции, названные "минорными" вследствии их редкой встречаемости и недоминирующей активности.

2. Число изоферментов и их активность в сыворотке крови зависят:

а) ог возраста - ЩФ^ наш обнаружена не у всех возрастных групп, у телят 3-х и 12-месячного возраста не выявлено, выделена у части телят 18-месячкого возраста, нетелей и коров; активность ЩФ^ не имеет возрастной зависимости;

- выявляется у всех животных, имеет выраженную воз- . растную зависимость, при активности ЩФ2 У телят 3-месячного возраста 124,1*10,6 Е/л, к 16 месячному возрасту снижается до 71,7-9,2 Е/л, а у коров через два месяца после родов - 29,2*0,8 Е/л;

- ЩФд - выявляется эпизодически, какой либо выраженной возрастной зависимости не обнаружено;

б) от физиологического состояния - ЩФ] - частота обнаружения в сыворотке крови зависит от сроков беременности и послеродового периода , чаще выявляется в 8 месяцев беременности и через 11-20 дней после родов, частота выявления снижается перед родами и в течение 2-3 дней после родов;

- Щ1>2 - активность 11$2 повышается перед родами и снижается в послеродовом периоде, при атом активность ЩФ2 У нетелей перед родами и в течение 2-3 дней после родов выше, чем у коров.

3. Между активностью Щ$2 и уровнем неорганического фосфора установлена разной степени репрезентативности корреляционная связь, более выраженная у телят, нетелей в 5-6 месяцев беременное ти, у коров за сутки до родов и через 4-10 дней после родов,

4. У нетелей с нарушениями минерального обмена активность ЩФ сыворотки крови повышается за счет костного изофермента ЩФ2 (Р <0,001) и при активности выше 90,0 Е/л в 100 % случаев диаг-

ностируется остеодистрофия.

5. Между повышением относительной активности ЩФ-j и уровнем альбуминов и А/Г коэффициента выявлена обратная корреляционная связь, более выраяенная у норов второй половины беременности и после родов, чем у нетелей и первотелок.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В целях совершенствования методов лабораторной диагностики болезней, связанных с нарушением минерального обмена веществ у крупного рогатого скота, определение изоферментного спектра и активности кзоферментов щелочной фосфатазн использовать как биохимический критерий нормы и патологии.

2. Результаты исследований, изложенные в диссертации, рекомендуются для использования в учебном процессе, а также при написании учебников и учебных пособий по биологии, физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов Г.И., Григорьева Т.Е.» фьева Е.В. Микроэлементо-зы у нетелей в условиях Чувашской АССР // Микроэлементозн человека: Материалы Всеосюзного симпозиума. - М., 1989. - С. 126127.

2. A.C. № 172063? СССР А 61 В 10/00 Способ диагностики субклинической остеодистрофии у нетелей / Авторы Т.Е.Григорьева,

Г.И.Иванов, Е.В.Юрьева. Приоритет от 26.02.1990 г.

3. Григорьева Т.Е., Юрьева Е.В., Иванов Г.И. Изоферментвдй состав щелочной фосфатазы сыворотки крови крупного рогатого скота в зависимости от возраста и физиологического состояния животных // С.-Х.биология. Серия биология животных. - 1991. - № 4.

- С.40-43.

4. Юрьева Е.В. Изоферменты щелочной фосфатазы и уровень белков сыворотки крови крупного рогатого скота // Тезисы докладов конф. Проблемы дигностики, профилактики и лечения сельскохозяйственных животных в Нечерноземной зоне. - Нижний Новгород, 1992.

- С.55.

5. Иванов Г.И., Юрьева Е.В., Григорьева Т.Е. Биохимические показатели крови при субклинической остеодистрофии у нетелей // Гигиена, ветсанитария и экология животноводства: Материалы Все-

российской научно-производственной конференции. - Чебоксар, 1994. - С.160-161.

6. Юрьева Е.В. "Минорные" фракции изоферментов щелочной фосфатазы крови крупного рогатого скота // Гигиена, ветсанитария и экология животноводства: Материалы Всероссийской научно-производственной конференции. - Чебоксар, 1994. - С. 160-161.

7. Юрьева Е.В, Динамика активнооти изоферментов щелочной фосфатазы у коров до и после родов в зоне минеральной недостаточности // Экологический вестник Чувашии. - 1996. - & 17, часть 2. - С.70-71.