Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные возможности генотипирования антигенов тромбоцитов человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные возможности генотипирования антигенов тромбоцитов человека"

На правах рукописи

Макарик Татьяна Викторовна

I

Молекулярные возможности генотипирования антигенов тромбоцитов

человека.

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Судариков Андрей Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Хамаганова Екатерина Георгиевна; доктор медицинских наук Лапенков Михаил Иванович.

Ведущая организация- Институт биологии гена Российской академии наук

Защита состоится « _2005г., в /7 часов на

заседании диссертационного совета Д 001.042 02 в Гематологическом научном

центре РАМН (125167, г.Москва, Новозыковский пр-д, д. 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан «/{у ■>

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Зыбунова Е.Е

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы диссертации. Антигены тромбоцитов человека (НРА) включают 16 известных на сегодняшний день биаллельных систем. Каждый аллоантиген, как было показано, является результатом изменения единичного нуклеотида в последовательности ДНК, приводящего к замене аминокислоты на белковом уровне. Это приводит к изменению третичной структуры мембранных гликопротеинов и, соответственно, возникновению разных эпитопов - мишеней для трансфузионной аллоиммунизации. Аллоиммунизация к антигенам тромбоцитов может вызывать пост-трансфузионную пурпуру и рефрактерность к трансфузиям тромбоцитов, кроме того, при беременности аллоиммунизация может быть причиной тромбоцитопении новорожденного Необходимым компонентом диагностики и последующего лечения пациентов с этими синдромами является возможность быстрого и точного типирования антигенов тромбоцитов. Традиционно, при определении фенотипа тромбоцитов используют аллоиммунную сыворотку человека, однако, не ко всем антигенам системы НРА получены антитела. Кроме того, в случаях заболеваний системы крови, низкий уровень тромбоцитов у значительной части пациентов ограничивает возможность серологического типирования тромбоцитов,

В последнее время для типирования НРА применяют методы, основанные на ДНК-диагностике, такие как полимеразная цепная реакция с последующей рестрикцией полиморфных фрагментов (РСК-ЯРЬР) и секвенирование ДНК. Эти методы достаточно сложны и дорогостоящи В отличие от них новый подход с использованием в полимеразной цепной реакции сиквенс-специфичных праймеров представляет собой технически простой и экономичный метод генотипирования НРА. Эффективная амплификация возможна только тогда, когда 3'конец праймера комплементарен последовательности сайта аллельной вариации. Используя серию праймеров, каждый из которых специфично амплифицирует только один аллель НРА, можно сделать вывод о присутствии или отсутствии соответствующих антигенов.

Частоты аллоантигенов тромбоцитов человека различаются между расами и этническими группами. Недавние популяционные исследования показали существенные различия в распределении НРА у представителей европеоидной и монголоидной рас. Получены данные о встречаемости НРА-генов в выборках жителей России. Изучение частота аллелей НРА позволяет сделать вывод о перемещении генов и получить важную иммуногенетическую характеристику популяции. Практическое значение генотипирования НРА в первую очередь проявляется

тромбоцитов человека методом полимеразной цепной реакции позволит проводить трансфузии тромбоцитов с учетом их антигенной структуры у донора и реципиента

Цель работы. На основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфичных праймеров разработать тест-систему для изучения распределения пяти клинически важных антигенов тромбоцитов (НРА 1-5) у кадровых доноров компонентов крови.

Задачи исследования.

1. Оптимизация тест-системы на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров; сравнение результатов генотипирования, полученных с помощью модифицированной нами тест-системы и тест-системы фирмы «РК.ОП*АЫ8».

2 Использование модифицированной тест-системы для генотипирования кадровых доноров компонентов крови по системе НРА.

3. Изучение иммуногенетических параметров НРА у кадровых доноров компонентов крови и представителей некоторых этнических групп России

4 Оценка целесообразности организации банка типированных доноров, необходимого для обеспечения НРА-совместимых трансфузий.

Научная новизна. Разработана модифицированная тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров для генотипирования антигенов тромбоцитов человека Рассчитаны иммуногенетические параметры НРА у кадровых доноров компонентов крови, а также получены ориентировочные данные о распределении частот аллелей и генотипов в двух генетически отдаленных этнических группах (армяне и хакасы) Предложен подход к формированию контингента НРА-типированных доноров в России.

Практическое значение работы. Предложенная в работе модифицированная тест-система на основе полимеразной цепной реакции рекомендуется к использованию для генотипирования антигенов тромбоцитов доноров и реципиентов с целью предотвращения посттрансфузионных осложнений и создания контингента типированных по НРА кадровых доноров компонентов крови

Основные положения, выносимые на защиту. Разработана отечественная тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфичных праймеров для НРА-генотипирования. Определены основные иммуногенетические параметры НРА у кадровых доноров г Москвы, частота аллелей и генотипов НРА у представителей некоторых этнических групп Создана математическая модель для оценки

величины когорт НРА-типированных доноров, необходимых для пациентов с заболеваниями системы крови.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 19-й Европейской конференции по иммуиогенетике и гистосовместимости (Стамбул, 2005г.) и на 28-й конференции «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2005г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 74 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 8 рисунков, 3 диаграммы и 14 таблиц. Список цитированной литературы включает 78 наименований.

Работа выполнялась в лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (зав.лаб, к.б.н. Судариков А.Б.). Раздел работы по иммуногенетике, иммунологии тромбоцитспецифических антигенов системы НРА, расчет иммуногенетических параметров НРА выполнен в лаборатории иммуногематологии ГНЦ РАМН под руководством зав лаб , к.м.н. Головкиной Л.Л. Раздел работы по определению величины контингента типированных доноров выполнен совместно с зав.лаб. биостатистики ГНЦ РАМН, к.ф.-м.н. Куликовым С М

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы.

Образцы и выделение ДНК. Всего обследовано 287 человек. Образцы крови были получены у 197 кадровых доноров компонентов крови станции переливания крови Гематологического научного центра РАМН (благодарим за сотрудничество гл.врача СПК ГНЦ РАМН Орлову Г.К. и зам.гл.врача, к м.н Шумилову Л.Л.), а также у 32 представителей армянской национальности (выражаем благодарность в подборе материала ведущему научному сотруднику, к.м.н. Меликян А.Л, отделение Поликлиники ГНЦ РАМН). Кроме того, проанализировано 28 образцов ДНК, выделенной из лейкоцитов крови представителей хакасской национальности (материал любезно предоставлен зав лаб. Иммунологии ГНЦ РАМН Зарецкой Ю.М.). 30 образцов ДНК с известным генотипом любезно предоставлены зав лаб.иммуногематологии, к.м.н. Головкиной Л.Л.

ДНК выделяли из лейкоцитов по модифицированному «солевому» протоколу. Эритроциты лизировали добавлением 30 мл буфера для лизиса эритроцитов (1хЯСЬВ: 1мМ ЫЦСОз, 115мМ N11)01) к 10 мл крови (9 мл цельной крови, 1 мл 4% цитрата натрия). Суспензию центрифугировали при 1200 об/мин 10 минут, осадок ресуспендировали в 4 мл

буфера (1х88С- 150мМ КаС1, 15мМ КазСбН507х5Н20) и центрифугировали при 1200 об/мин 5 мин Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 600 мкл лизирующего буфера (1х\УСЬВ: ЮОмМ Тпв-О , рН7.6, 40мМ ЕОТА, 50мМ ИаС1, 0,2% вБв, 0,05% №N3), затем добавляли 200 мкл насыщенного раствора ЯШЛ, тщательно перемешивали на вортексе и центрифугировали при 12000 об/мин 5 минут. Супернатант аккуратно отбирали в другую пробирку с 800 мкл изопропанола, перемешивали на вортексе, затем ДНК переносили в пробирку с 1 мл 80% этанола и центрифугировали на максимуме 10 минут. Осадок растворяли в 200 мкл дистиллированной воды. Концентрацию ДНК анализировали на спектрофотометре (Весктап 011-64), в реакцию брали 100 нг.

Полимеразная цепная реакция с использованием модифицированных сиквенс-специфических праймеров. Последовательности олигонуклеотидных праймеров приведены в таблице 1. Для каждого аллельного гена НРА использовали два сиквенс-специфичных праймера, различающихся одним нуклеотидом на 3' конце, последовательность которых соответствовала последовательности геномной ДНК, кодирующей искомые белки. Нами были модифицированы праймеры для НРА-3, -5 локусов. Это было сделано с целью оптимизации условий и температурного режима амплификации, чтобы все праймеры специфично работали при температуре отжига 68°С

Таблица 1. Последовательности праймеров для НРА 1-5 локусов.

НРА Специфичность Последовательность* (5'-3') Размер праймера Размер амплификата

НРА 1 1а 1Ь общий tcaggtcacagcgaggtgagcgca tcaggtcacagcgaggtgagcgcg ctgcaggaggtagagagtcgccatag 24 24 26 90

НРА 2 2а 2Ь общий (^ссшцу^йсс^ас gcccccagggctcctgat ^ксаП^Ьх^са^сса 18 18 20 258

НРАЗ За ЗЬ общий gaatgggggaggggctggggc сЬхяасОДййасаЬхЯёга 21 21 24 230

НРА 4 4а 4Ь общий §с1^ссассса§а^с£ gctggccacccagatgca caggffl^ttttogagggcct 18 18 19 120

НРА 5 5а 5Ь общий agtggcagagtctacctgtttactatcaaag agtggcagagtctacctgtttactatcaaaa cgaagacctctcatggaaaatggcagta 30 30 28 246

Полож. контр. Фактор роста 1£сс«сссаассайсссИа 22 26 434

•Для подбора сиквенс-специфичных праймеров использовали данные литературы и ОепВапк.

Комбинация каждого специфичного праймера с общим праймером позволяет

получать специфическую амплификацию индивидуальных НРА аллелей. Каждую реакцию

4

контролировали включением пары праймеров, которые ампли фицировали фрагмент размером 434 н п гена фактора роста человека. Это обеспечивало положительный контроль для каждой реакции амплификации Для каждого образца ДНК выполняли десять отдельных реакций В каждой пробирке ТТЦР реакции присутствовали сиквенс-специфичный праймер, общий праймер и пара праймеров внутреннего положительного контроля.

В каждую пробирку для амплификации (15 мкл) добавляли 100 нг ДНК в дистиллированной воде; 1,5 мкл 10*PCR буфера (500 мМ KCl, 100 мМ Tris HCl, pH 9, 1% Triton XlOO, 25 мМ MgCb); 200 мкМ смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP); по 2рМоль аллель-специфичных и общего праймеров и 1рМоль контрольных праймеров , 8 мкл дистиллированной воды, 1 ед Taq ДНК полимеразы Для одновременного генотапирования нескольких человек использовали 96-луночные планшеты. Планшеты с разведенными праймерами (2рМоль в 7,5 мкл) готовили заранее и хранили при -20°С Программа амплификации была адаптирована для прибора Perkin Elmer- 95°С, 5 минут, 25 циклов. 95°С, 30 секунд; 68°С,1 минута, 72°С, 45 секунд.

Анализ результатов осуществлялся методом электрофореза в 2% агарозном геле. Статистическая обработка данных. Расчет частот НРА-генов проводили по формуле' Р - D + Dd/2, где Р _ частота гена, D - частота гомозиготных особей по первому гену, Dd - частота гетерозиготных особей

На основе эмпирически полученных генных частот рассчитывали частоты генотипов по формуле' p2AA+2pqAB+qíBB=l, где р2АА - количество лиц, гомозиготных по первому гену; q2BB - количество лиц, гомозиготных по второму гену; 2pqAB - количество лиц, гетерозиготных по обоим генам диаллельной системы.

Количество особей гомозиготных по первому гену вычисляли по формуле AA=p2xN; гомозиготных по второму аллельному гену - по формуле' BB=q2xN, частоту гетерозиготных особей - по формуле- AB=2pqxN, где N - количество исследованных лиц, р - частота первого аллельного гена, q - частота второго аллельного гена

Степень достоверности существующего распределения генов в популяции устанавливали при сравнении экспериментально полученных и расчетных данных путем определения показателя jj2 (хи-квадрат) по формуле. х2= ЦО - Е)2 /Е, где О - эмпирические данные, Е - расчетные данные Вероятность Р для отклонения от ожидаемого значения высчитывали по таблице значения (таблица Фишера) с соответствующей степенью свободы. Для 5%-го уровня значимости при одной степени свободы j^=3,84, при двух степенях свободы ^=5,991

Для таблицы 2x2 или при степени свободы v=l использовали поправку на ошибку группировки Йетса (/О - Е/ - 0,5)2 / (a+b)(c+d)(a+c)(b+d).

Полученные значения генных частот применяли для определения частоты гаплотипов и величины гаметной ассоциации Экспериментальные частоты гаплотипов НРА-1, -3 определяли по результатам НРА-генотипирования. Ожидаемую частоту указанных гаплотипов рассчитывали по формуле: Н=р1 хрг + Д, где Р1 и рг - ожидаемые частоты аллелей генов в популяции, Н - частота гаплотипа при свободной рекомбинации, Д -величина неравновесного сцепления или гаметная ассоциация.

Величину неравновесного сцепления Д вычисляли по формуле: Д=\'<Ш -где Ъ, с - количество индивидов с одним из рассматриваемых генов, й -количество индивидов без обоих генов, а - количество людей с обоими генами, N - сумма данных по таблице 2x2 или а+Ы-с+ё.

Коэффициент корреляции вычисляли по формуле' где N - сумма данных по

таблице 2x2 или а+Ы-с+сЗ, хЦа<1-Ьс)2х№ [(а+сХс+с!Ха+сХЬ+с1)].

Генетическую дистанцию между народами (популяциями) рассчитывали по формуле: ¿и = V Е ( р! _ Р2)2/п, где (¡и - генетическая дистанция между популяциями 1 и 2, р] и рг -частота аллеля в популяциях, п - количество сравниваемых пар аллелей.

Вычисляли значение критерия г-статистики (с учетом поправки на аппроксимацию биноминального распределения нормальным) по формуле: т= (/Р - Рр/ - 1/2п) / тр, где Р -относительная частота, наблюдаемая в выборке; значение р вычисляли по значению г при помощи программы ВЮБТАТ.

Для оценки размера необходимого донорского контингента были сделаны следующие допущения:

1 Доноры и реципиенты однородны в генетическом аспекте, то есть принадлежат одной расово-национальной популяции. В нашем конкретном случае - это жители Москвы.

2. Совместимость реципиента и донора определялась по локусам НРА 1,2,3, 5 по следующему правилу: а) гомозиготный по гену конкретного локуса реципиент совместим только с гомозиготным по тому же аллельному гену донором, гетерозиготный по аллельным генам конкретного локуса реципиент совместим (по этому локусу) с донором, имеющим ген в гомо- или гетерозиготном состоянии, б) донор и реципиент должны быть совместимы по всем клинически значимым генам локусов НРА (НРА- 1,2,3, 5).

3 Организация контингента НРА-типированных доноров считалась практически целесообразной, если удавалось подобрать необходимую для курса терапии группу доноров для одного реципиента с 90% вероятностью (в 9 случаях из 10).

4. Для обеспечения курса трансфузионной терапии одному больному с заболеванием системы крови (апластической анемией) необходимо в среднем не менее 100 потенциальных доноров, количество которых было взято с учетом вероятного отказа донора от изъятия у него тромбоцитов или его временной недосягаемости.

Для обозначения генотипа донора/реципиента использовали следующую форму: G = gi,g2,g3,g5, где g¡-генотип по i-локусу, т.е. g,= {aa,ab,bb}, ¡={1,2,3,5}

Весь список возможных комбинаций генотипа по 4 локусам выглядел следующим образом- Gi=aa аа аа аа, G¿ ab аа аа аа, G3=bb аа аа аа, G4=aa ab аа аа ... Ggi=bb bb bb bb.

Пусть Р={рь P2, ..., peí} - распределение вероятности генотипа в исследуемой популяции Вероятность НРА совместимое ги реципиента с генотипом Gt и случайного

S1

донора вычисляли по формуле' Sk~^pl-dkl , где р, - вероятность генотипа G„ diu -

i-i

индикатор совместимости генотипа реципиента G* и генотипа донора G, (то есть. =1, если генотипы совместимы, ¿4, = 0 - в противном случае).

Считали, что доноры в банк доноров отбираются из популяции случайно, те. нет плановой селекции доноров, основанной на генотипе. В этом случае распределение генотипов в донорском пуле, такое же как и в группе реципиентов - популяционное.

Вероятность того, что в банке доноров объема N число совместимых с генотипом Gk меньше чем т, вычисляли в соответствии с биноминальным распределением [11].

як =b(m,N,St)=\ )"""', где S^ - условная вероятность совместимости с

W

генотипом реципиента Gk вычисляемая по формуле (2).

Если реципиенты выбираются из той же популяции, что и доноры, общая вероятность неудачи подбора необходимого числа m доноров из пула объема N будет складываться из

si

вероятностей частных неудач для конкретных генотипов (G]¡): W = ^рк-лк

к-1

Зависимость вероятности неудачи подбора НРА доноров рассчитывали для различных объемов банка доноров с помощью формул, в которые, вместо теоретического распределения {рьк=1, ,81} , подставляли полученные нами значения частот генотипов у доноров станции переливания крови ГНЦ РАМН.

Результаты и обсуждение.

НДР с использованием модифицированных сиквеис-специфичиых праймеров.

Условия проведения ПЦР отрабатывали на образцах ДНК доноров с известным генотипом, который определяли с помощью тест-системы фирмы "РЯОТКАКв" Последовательности аллель-специфичных праймеров для амплификации локусов ИРА были взяты из разных источников:

1) праймеры для НРА-1, -2, -4, -5 были разработаны Э. Сауашцф й а1. (1996);

2) праймеры для НРА-3 были разработаны 1аи-У1 Ьуои й а1. (2003).

В первом случае отжиг праймеров авторы предлагали проводить в следующей последовательности: 5 циклов при температуре 70°С, 20 циклов при температуре 65°С, 8 циклов - 55°С. Во втором случае - отжиг праймеров предлагали проводить при температуре 61°С. Нами были модифицированы праймеры для амплификации локусов НРА-3, -5 к 5'-концу последовательности праймеров добавили несколько нуклеотидов (Таблица 2).

Таблица 2. Модификация праймеров для амплификации локусов НРА-3 и НРА-5.

НРА Специфичность Последовательность (5'-3'> Размер праймер а

За (ваа*) 'ёёёёё^ВёеЕ^ё^ 21

НРАЗ ЗЬ 21

общий (ctcc)йacctgctctacatcctgga 24

НРА 5 5а 5Ь общий (agtggcag)agtctacctgtttactatcaaag (agtggcag)agtctacctgtttactatcaaaa (с£аайас)<асЬя^евааяа1а;са81а 31 31 28

♦Скобками выделены добавленные нуклеотиды.

Это позволило проводить амплификацию всех пяти локусов НРА при одной температуре -68°С. 197 доноров были протестированы по НРА 1-5 локусам методом полимеразной цепной реакции с использованием аллель-специфичных праймеров. Примеры результатов, полученных этим методом показаны на рисунке 1.

а)

б)

Знутоекний коитпочь НРА прод\ кты

Внглжннкй контооль НРА про tvкты

12345 678 9 10

Рисунок 1. Генотипирование НРА 1-5 локусов методом сиквенс-специфичной ПЦР.

Дорожки 1 - НРА 1 а, 2 - НРА Ib, 3 - НРА2а, 4 - НРА2Ь, 5 - НРАЗа, 6 - НРАЗЬ, 7 - НРА4а, 8 - НРА4Ь, 9 - НРА5а, 10 - НРА5Ь Внутренний контроль - гормон рос га человека (HGH), 434 н п.

а) - донор с генотипом НРА-laa, - 2аа, -Заа, -4аа, -5аа, б) - донор с генотипом НРА - lab, -2аа, - ЗаЬ, -4аа, -5аа

Амплификаты имели ожидаемые размеры для НРА-1 - 90 н п, для НРА-2 - 258 н п , для НРА-3 - 230 н п, для НРА-4 - 120 н п и для НРА-5 - 246 н п Размер амплификата положительного контроля составил 434 н п

Нами проведено сравнение модифицированной тест-системы и аналогичной тест-системы фирмы "PROTRANS" Генотипирование «слепым» методом 30 образцов ДНК (любезно предоставленных зав лаб иммуногематологии к м н Головкиной Л Л ) с известным генотипом показало полное совпадение результатов

Иммуногенетические параметры тромбоцит-специфических антигенов у кадровых доноров компонентов крови г. Москвы и у представителей армянской и хакасской национальностей. Распределение аллелей и генотипов НРА 1-5 у кадровых доноров компонентов крови представлено в таблице (Таблица 3) Частоты аллелей НРА-1а и НРА-1Ь составили 96,95% и 24,87%,соответственно Аллели НРА-2а и -2Ь встречались с частотой 97,46% и 25,38%, соответственно Аллели НРА-За и -ЗЬ встречались приблизительно с одинаковой частотой - 82,23% и 72,59% Частота аллелей НРА-5а и -5Ь составила 98,48% и 14 21%, соответственно Аллельный ген НРА-4а встречался у всех обследованных лиц, доноров с геном НРА-4Ь не выявлено

Таблица 3. Распределение аллелей и генотипов у кадровых доноров г.Москвы.

ПРА Частота аллелей ( %)* Частота генотипов (%)*

а b аа ab bb

НРА-1 96,95 (191) 24,87 (49) 75,13 (148) 21,83 (43) 3,05 (6)

НРА-2 97,46 (192) 25,38 (50) 74,62 (147) 22,84 (45) 2,54 (5)

НРА-3 82,23 (162) 72,59 (143) 27,92 (55) 54,31 (107) 11,77 (35)

НРА-4 100 (197) 0 100 (197) 0 0

НРА-5 98,48 (194) 14,21 (28) 87,31 (172) 11,17 (22) 1,52 (3)

п=197

* В скобках указано количество лиц, имеющих соответствующий ген.

Установлены следующие частоты генотипов: НРА-1а/а - 75,13%, НРА-la/b - 21,83%,

HPA-lb/b - 3,05%; НРА-2а/а - 74,62%, НРА-2а/Ь - 22,84%, HPA-2b/b - 2,54%; НРА-За/а -

27,92%, НРА-За/b - 54,31%, НРА-ЗЬ/Ь - 11,77%; НРА-5аУа - 87.31%, НРА-5а/Ь - 11,17%,

HPA-5b/b - 1,52% Генотипы НРА-4а/Ь и HPA-4b/b не были выявлены из-за низкой частота

аллеля 4b у белой расы.

Наблюдаемая частота генотипов НРА-1 у кадровых доноров составила в процентах:

1а/а =75,13%, 1 b/b = 3,05%, la/b=21,83%. Ожидаемые частоты генотипов НРА-1 отличались

незначительно: 1а/а =73,96%, 1 b/b = 1,96%, la/b=24,08%. По результатам генотипирования

исследуемых людей рассчитывали наблюдаемые (экспериментальные) частоты генов 1а и 1Ь'

они составили 0,86 и 0,14, соответственно. Ожидаемые частоты генов 1а и 1Ь полностью

совпали с экспериментально полученными данными

Наблюдаемые частоты генотипов 2 а/а, 2 a/b, 2b/b составили 74,62%, 22,84%, 2,54%,

соответственно (Таблица 4) Ожидаемые частоты генотипов 2 а/а и 2b/b оказались меньше -

73,96% и 1,96%, соответственно. Ожидаемая частота генотипа 2 а/b - больше (24,07%).

Наблюдаемая и ожидаемая частоты генов 2а и 2Ь полностью совпали' 0,86 и 0,14,

соответственно. Генотипы 3 а/а, 3 а/b, ЗЬ/Ь имели частоту 27,92%, 54,31%, 17,77%, а по

расчетным данным - 30,35%, 49,49%, 20,15%, соответственно. Генотипы 5 а/а, 5 а/Ь, 5 b/b

имели частоту 87,31%, 11,17%, 1,52%, а по расчетным данным - 86,29%, 13,19%, 0,50%,

соответственно Экспериментальные частоты генов За, ЗЬ и 5а, 5Ь полностью совпали с

ожидаемыми и составили 0,55, 0,45 и 0,929, 0,271, соответственно Степень достоверности

существующего распределения генов в популяции устанавливали при сравнении

экспериментально полученных и расчетных данных путем определения показателя х2. Во

всех случаях этот показатель не превышал значения 3,84 для 5%-го уровня значимости при

одной степени свободы, что говорит о корректно выполненном исследовании.

Таблица 4. Расчет ожидаемых генных частот НРА у кадровых доноров компонентов крови г. Москвы.

НРА Наблюдаемая Ожидаемая Наблюдаемая Ожидаемая Критерий

частота частота частота частота согласия

генотипов, % генотипов, % генов генов распр. генов

1 а/а 75,13 73,96 1а = 0,860 1а = 0,860 < = 0,29

1 а/Ь 21,83 24,08 1Ь = 0,140 1Ь = 0,140 ¿=1,78

1 ЫЬ 3,05 1,96

2 а/а 74,62 73,96 2а = 0,860 2а = 0,860 ¿ = 0,29

2 а/Ь 22,84 24,07 2Ь = 0,140 2Ь = 0,140 ¿ = 1,78

2ЫЬ 2,54 1.96

За/а 27,92 30,35 За = 0,550 За = 0,550 ¿ = 0.90

3 а/Ь 54,31 49,49 ЗЬ = 0,450 ЗЪ = 0,450 ¿ = 1,37

ЗЬ/Ь 17,77 20,15

5 а/а 87,31 86,29 5а = 0,929 5а = 0,929 ¿ = 0,27

5 а/Ь 11,17 13,19 5Ь = 0,071 5Ь = 0,071 ¿"0,01

5ЫЬ 1,52 0,50

Чтобы вычислить экспериментальные частоты галлотипов НРА-1, НРА-3, сначала определяли количество лиц с определенными сочетаниями генотипов локусов НРА-1 и НРА-3 Все возможные сочетания аллельных генов локусов НРА-1 и НРА-3 были представлены полностью в исследуемой группе кадровых доноров г.Москвы Часто встречающимися оказались варианты, гомо- и гетерозиготные по «а» и «Ъ» аллелям локуса НРА-1 и гетерозиготные по аллелям локуса НРА-3: сочетания 1ааЗаЬ и 1аЬЗаЬ. Реже встретились сочетания 1аЬЗЬЬ, 1ЬЪЗаЬ, 1ЬЬЗаа и 1ЬЬЗЬЬ Сочетания 1ааЗаа, 1ааЗЬЬ и 1аЬЗаа заняли промежуточное положение.

Оказалось, что самым распространенным гаплотипом является «1аЗа» - он встречается в 47,54 % случаев (Таблица 5). Вторым по встречаемости - 34,50% случаев - гаплотип «1аЗЬ». Гаплотипы «1ЬЗа» и «1ЬЗЬ» встретились приблизительно одинаково: 9,51% и 8,45% случаев, соответственно Сочетание НРА-1 аЬЗаЬ для вычисления частот галлотипов не учитывалось, поскольку частоту этого сочетания можно оценить только гз семейных исследований. При проведении семейных исследований было показано наследование аллельных генов НРА-1 и НРА-3 гатшотипами, что обусловлено их локализацией в одном сегменте 17-ой хромосомы [Головкина Л.Л и др., 2004].

Таблица 5. Определение частоты гаплотипов аллельных генов локусов НРА-1 и НРА-3 (п = 197).

Сочетания генотипов I Количество человек [

аллельных генов I с указанными | Гаплотипы локусов НРА-1, НРА-3 'сочетаниями генотипов!-1_

1аЗа 1ЬЗа 1аЗЬ 1ЬЗЬ

1ааЗаа 37 74 0 0 0

lab ЗаЬ 55 - - - -

1ааЗЬЬ 20 0 0 40 0

lbb 3bb 3 0 0 0 6

lbb Заа 3 0 6 0 0

Iab3aa 15 15 15 0 0

Iaa3ab 46 46 0 46 0

t ab 3bb 12 0 0 12 12

lbb ЗаЬ 6 0 6 0 6

Абсолютное количество (197-55)х2-284 135 27 98 24

гаплотипов

Процентное количество 100 47,54 9,51 34,50 8,45

гаплотипов

Ожидаемые частоты гаплотипов рассчитывали с учетом величины гаметной ассоциации (Таблица 6).

Таблица 6. Сравнительные данные по экспериментально рассчитанной и ожидаемой частоте гаплотипов у кадровых доноров компонентов крови г.Москвы (п=197).

Гаплотипы Экспериментальная частота гаплотипов Ожидаемая частота гаплотипов

НРА-1 я/За 0,4754 0,4860

НРА-1 а/ЗЬ 0,3450 0,3750

НРА-1 Ь/За 0,0951 0,0708

На основании литературных и экспериментально полученных нами данных было проведено сравнение распределения генных частот НРА у кадровых доноров г Москвы (здесь кадровые доноры г Москвы представляют смешанную популяцию России) и других народов (по литературным данным представителями разных народов являются доноры крови и ее компонентов) Наши данные о частоте генов НРА схожи с соответствующими данными в европейских популяциях Не найдено достоверных отличий в распределении генов НРА-1, НРА-3, НРА-5 между донорами г Москвы и представителями (донорами) Дании, Германии, Финляндии и Словении

Однако, частота гена НРА-2 у кадровых доноров г Москвы достоверно отличается от генной частоты у австрийских доноров (Р = 0,036, г = 2,094) Кроме того, нами выявлены статистически достоверные различия в распределении частот генов НРА-1 и НРА-3 у кадровых

Таблица 7. Генные частоты НРА у представителей разных народов.

Генные частоты, % К-во исслед. лиц

НРА-1 НРА-2 НРА-3 НРА-4 НРА-5 Ссылка

а Ь а b а Ь а ь а Ь

Россия 0,86 0,14 0,86 0,14 0,55 0,45 1,00 0,00 0,93 0,07 197 Наши данные

Польша 0,87 0,13 0,90 0,10 0,59 0,41 1,00 0,00 0,94 0,06 - Drzewek et al. (1998)

Финляндия 0,86 0,14 0,91 0,09 0,59 0,41 - - 0,95 0,05 200 Kekomaki et al. (1995)

Словения 0,81 0,19 0,89 0,11 0,59 0,41 0,99 0,003 0,93 0,07 152 Rozman et al. (1999)

Канн 0,85 0,15 0,93 0,07 0,55 0,45 1,00 0,00 0,90 0,10 200 Simsek et al. (1993)

Австрия 0,85 0,15 0,92 0,08 0,61 0,39 - - 0,89 0,11 900 Holensteiner et al. (1995)

Англия 0,82 0,17 0,90 0,10 0,61 0,39 1,00 0,00 0,90 0,10 392 Seilers et al. (1999)

Германия 1 0,82 0,18 0,92 0,08 0,63 0,37 - - 0,90 0,10 54 Legleretal. (1996)

Испания 0,81 0,19 0,90 0,10 0,65 0,35 1,00 0,00 0,88 0,12 Muniz-Diaz et al. (1998)

Италия 0,84 0,16 0,89 0,11 - - - - - - razzari etal. (1998)

Норвегия 0,87 0,13 0,94 0,06 0,47 0,53 1,00 0,00 0,93 0,07 105 Randen I. et al. (2003)

Франция (север) 0,99 0,01 0,99 0,01 - - - - 0,99 0,01 800 Merieux et al. (1997)

Франция (Прованс) 0,83 0,17 - - 0,65 0,35 - - 0,87 0,13 Revirón et.al. (1992)

Берберы (Марокко) 0,75 0,25 0,82 0,18 0,68 0,32 1,00 0,00 0,86 0,14 110 Ferrer et al. (2001)

Афроамериканцы 0,92 0,08 0,82 0,18 0,63 0,37 1,00 0,00 0,79 0,21 100 Kim et al. (1995)

Таиланд 0,98 0,02 0,94 0,06 0,51 0,49 1,00 0,00 0,96 0,04 137 Shih et al. (2003)

Филиппины 0,98 0,02 0,97 0,03 0,53 0,47 0,99 0,005 0,97 0,03 100 Shih et al. (2003)

Индонезия 0,99 0,01 0,93 0,07 0,51 0,49 1,00 0,00 0,99 0,005 107 ähih et al. (2003)

Тайвань 0,99 0,01 0,96 0,04 0,59 0,40 0,99 0,001 0,98 0,02 566 Shih et al. (2003)

Корея 0,99 0,01 0,87 0,13 0,67 0,33 0,99 0,01 0,97 0,03 200 Seo et al (1998)

Китай 0,99 0,01 0,98 0,02 0,52 0,48 1,00 0,00 0,96 0,04 100 Chang et al. (1998)

Гонг-Конг 0,99 0,01 0,98 0,02 0,53 0,47 1,00 0,00 0,97 0,03 100 □lang et al. (1998)

Япония 0,99 0,01 - - - - 0,99 0,01 - - 331 Tanaka et al. (1996)

Бразилия (индейцы) 1,00 0,00 0,96 0,04 0,71 0,29 1,00 0,00 0,% 0,04 95 Chibaetal. (2000)

Бразилия (доноры) 0,93 0,07 0,87 0,13 0,63 0,37 - - 0,87 0,13 Chiba et al. (2000)

Австралия (аборигены) 0,99 0,01 1,00 0,00 0,93 0,07 1,00 0,00 0,75 0,24 185 Bennet et al. (2002), Venan et al. (2000)

доноров г Москвы и марокканских берберов: для локуса НРА-1 значение «Р» составило 0,024 (z = 2,253); для локуса НРА-3 значение «Р» составило 0,035 (z = 2,105), Население севера Франции достоверно ( Р = 0,000) отличается от доноров г. Москвы по частоте трех аллельных генов НРА -1,-2,-5 (для локуса НРА-3 нет данных в литературе).

Как видно из таблицы 7, существуют значительные отличия между кадровыми донорами г Москвы (представителями белой расы) и представителями монголоидной расы. Нами выявлены достоверные отличия по локусу НРА-2 между кадровыми донорами г.Москвы и донорами Тайваня, Филиппин, Китая (значение «р» равно 0,0; 0,011; 0,029; соответственно). Кроме того, частота гена НРА-3 отличается у кадровых доноров г Москвы и доноров Кореи и Бразилии (0,019 и 0,013, соответственно). Австралийские аборигены достоверно отличаются от кадровых доноров г.Москвы по всем локусам НРА Афроамериканцы, которых причисляют к негроидной расе, имеют достоверные отличия от кадровых доноров г.Москвы только по гену НРА-5.

На основании полученных нами данных о распределении генных частот НРА у кадровых доноров г Москвы и найденных в литературе частот генов НРА у представителей других народов рассчитывали величину генетической дистанции (Таблица 8) Наименьшее различие по величине генетической дистанции имели представители Польши, Финляндии, Словении, Дании (d < 0,05) Жители Англии и Австрии стоят на одинаковом «расстоянии» от жителей России (d = 0,0591) Величина генетической дистанции между российскими донорами и донорами Таиланда, Филиппин, Тайваня, Кореи и Китая была приблизительно одинаковой (чуть больше 0,1). Величина генетической дистанции для представителей Бразилии (индейцы) и Австралии (аборигены) оказалась достаточно высокой: 0,1646 и 0,3245, соответственно.

Таблица 8. Величина генетической дистанции между кадровыми донорами г.Москвы и представителями других стран.

Страна Величина Страна Величина

генетической генетнческ

дистанции ой

дистанции

Польша 0,0367 Филиппины 0,1149

Финляндия 0,0424 Китай 0,1241

Словения 0,0474 'Тайвань 0,1257

Дания 0,0479 США (черные) 0,1267

Австрия 0,0591 Корея 0,1283

Англия 0,0591 Марокко (берберы) 0,1349

Германия 0,0755 Франция (север) 0,1525

1ИЯ 0,0892 Бразилия (индейцы) 0,1646

Таиланд 0,1044 Австралия (абориг.) 0,3245

Индонезия 0,1134

На основании результатов генотипирования 32 представителей армянской национальности нами получены предварительные данные о распределении аллелей и генотипов в выборке армян (Таблица9)

Таблица 9. Распределение аллелей и генотипов НРА среди армян.

НРА •Частота аллелей, % •Частота генотипов, %

а b аа ab bb

НРА-1 93,75 (30) 50 (16) 50 (16) 43,75 (14) 6,25 (2)

НРА-2 96,88 (31) k38 (11) 65,62 (21) 31,25 (10) 3,13 (1)

НРА-3 87,5 (28) 62,5 (20) 37,5 (12) 50 (16) 12,5 (4)

НРА-4 100 (32) 0 100 (32) 0 D

НРА-5 100 (32) 15,62 (5) 84,37 (27) 15,62 (5) 0

N=32

* В скобках указано количество тестированных лиц.

Группу наблюдения составили те лица, для которых этническая принадлежность прослеживалась в 3-х поколениях.

Аллели 1а и 1Ь встречались с частотой 93,75% и 50%, соответственно. Частоты генотипов составили: 1а/а -50%, 1а/Ъ - 43,75%, lb/b - 6,25%. Аллели 2а и 2Ь имели частоту 96,88% и 34,38%, соответственно. Частоты генотипов для локуса НРА-2: 2а/а -65,62%, 2а/Ь -31,25%, 2b/b - 3,13%. Частоты генотипов для локуса НРА-3: За/а -37,5%, ЗаЛ - 50%, ЗЬ/Ь -12,5%; частоты аллелей - 87,5% и 62,5% (для За и ЗЬ, соответственно). Аллели НРА-4а и НРА-5а встречались в 100% случаев; аллель 5Ь - в 15,62% случаев. Частота генотипов 5а/а и 5а/Ь составила 84,37% и 15,62%, соответственно.

Нами протестировано 28 образцов ДНК представителей хакасской национальности. Предварительные данные о частотах аллелей и генотипов НРА представлены в таблице (Таблица 10).

Таблица 10. Распределение аллелей и генотипов у представителей хакасской национальности.

НРА * Частота аллелей, % •Частота генотипов, %

а b аа ab bb

НРА-1 100 (27) 11.11 (3) 88,88 (24) 11,11 (3) 0

НРА-2 100 (27) 11,11 (3) 88,88 (24) 11,11 (3) 0

НРА-3 57,14 (16) 78,57 (22) 59,25 (16) 40,74 (11) 40,74 (И)

НРА-4 100 (27) 0 100 (27) 0 0

НРА-5 100 (27) 3,70 (1) 96,30 (26) 3,70 (1) 0

N=27

* В скобках указано количество людей.

Аллели НРА-1а, -2а, -4а и -5а присутствовали во всех случаях. Аллели HPA-lb, -2Ь имели одинаковую частоту - 11,11%. Частоты аллелей За и ЗЬ составили 59,25% и 81,48%, соответственно. Частоты встречаемости генотипов для локусов НРА-1, -2 оказались одинаковыми- а/а - 88,88%, a/b - 11,11%; для локуса НРА-3 составили- За/а - 59,25%, За/b -40,74%, ЗЬ/Ь - 40,74% По нашим данным наблюдалось отсутствие гомозигот по аллелю b в НРА-1, -2, -4, -5. Гетерозиготы НРА-5а/Ь имели частоту 3,70%.

На основании экспериментально полученных данных вычисляли достоверность отличий частот аллелей и генотипов в исследуемых группах

Частоты аллелей НРА-1 а, -2а, -2Ь, -ЗЬ, -5а, -5Ь не имели значимых отличий во всех сравниваемых группах (Таблица 11) Нами выявлены достоверные различия частоты аллеля «Ь» в локусе НРА-1 между кадровыми донорами (смешанная российская популяция) и представителями армянской национальности (Р = 0,007), а также между хакасами и армянами (Р = 0,004)

Частота генотипа la/a у представителей армянской национальности оказалась в 1,5 раза меньше соответствующей частоты у кадровых доноров г Москвы (50% против 75,13%), в то время как частота генотипа 1а/Ь - в два раза больше (43,75% против 21,83%)

Среди представителей армянской национальности очень высокой оказалась частота аллеля «Ь» локуса НРА-1 (50%), в то время как в смешанной российской популяции (кадровые доноры г.Москвы) частота этого аллеля равна 24,87%. Полученные нами данные об отличиях в распределении генных частот НРА у кадровых доноров и представителей армянской национальности можно объяснить принадлежностью к различным этническим группам

Среди представителей хакасской национальности не встречались гомозиготы по аллелю «Ь» в локусах НРА-1, -2, -4, -5 Частоты гетерозигот в локусах НРА-1, -2, -5 имели более низкие значения, чем соответствующие частоты генотипов в смешанной российской популяции Аллели НРА-1а, -2а, -4а и -5а встречались в 100% случаев

По литературным данным хакасы представлены несколькими субпопуляциями с различным расовым происхождением Исходя из полученного нами распределения частот алеллей НРА, изучаемая группа относится к монголоидной расе (кызыльцы, качинцы, хойбалы). Кроме того, найдены достоверные отличия частоты аллеля «а» в локусе НРА-3-между кадровыми донорами и представителями хакасской национальности, между хакасами и армянами (значение «Р» составило 0,012 и 0,029, соответственно).

При сравнении частот генотипов найдены статистически достоверные отличия между кадровыми донорами и представителями армянской национальности в локусе НРА-1 (Р = 0,014, = 8,551), а также между хакасами и армянами (Р = 0,006, = 10,368).

Таблица 11. Критерий различия аллельных частот у кадровых доноров г.Москвы, представителей армянской и хакасской национальностей.

Этнические группы НРА-1 НРА-2 НРА-3 НРА-5

доноры и хакасы XV = 2,736 Р = 0,255 X « = 2,844 Р = 0,241 Р- 0,016 X© = 1,916 Р = 0,384

доноры и армяне ХЮ-8,551 Р = 0,014 Х©=1,15 Р = 0,563 X2 (2) =1.407 Р = 0,495 Хга= 0,979 Р = 0,613

хакасы и армяне Э^г,-10,368 Р = 0,006 X® =4,578 Р = 0,101 ОО 00 Ч- "Т. ' ? X® = 1Д60 Р = 0,281

Как видно из таблицы 12, достоверно отличается частота генотипа НРА-3 у кадровых доноров и представителей хакасской национальности в (Р = 0,016, = 8,239). Частоты генотипов НРА-2 и НРА-5 ие отличаются между всеми исследуемыми группами

Таким образом, при выборочном обследовании найдены статистически значимые отличия в распределении частот аллелей и генотипов между кадровыми донорами г.Москвы, представителями армянской и хакасской национальности. Полученные данные позволяют предложить формирование локальных (национальных) когорт доноров.

Таблица 12.Сравнение частот аллельных генов между кадровыми донорами, представителями армянской и хакасской национальностей (по критерию г).

Аллели НРА доноры и хакасы [доноры и армяне шсасы и армяне

НРА-1а Р = 0,776 Р = 0,693 Р- 0,549

-1Ь Р = 0,179 Р = 0ДЮ7 Р = 0,004

НРА-2а Р = 0,886 Р = 0,685 Р = 0,930

-2Ь Р = 0,163 Р = 0,394 Р = 0,074

НРА-За Р = 0,012 Р = 0,630 Р- 0,029

-ЗЬ Р = 0,453 Р = 0,338 Р = 0,188

НРА-5а Р- 0,978 Р = 0,891 Р = 0,932

-5Ь Р = 0Д22 Р = 0,952 Р =* 0,281

Полученные данные о частоте генов, генотипов и гаплотипов полиморфных локусов НРА-1, -2, -3, -5 позволяют рассчитать все иммуногенетические параметры (частоту генов, генотипов, гаплотипов, величину неравновесного сцепления и генетическую дистанцию), а также необходимую численность когорты типированных доноров для обеспечения трансфузий тромбоцитов реципиентов с любым генотипом.

По данным частотных распределений генотипов в исследованой группе доноров была сделана оценка необходимого объема банка НРА типированных доноров. На рисунке 2 приведена расчетная зависимость вероятности неудачи в подборе 100 НРА совметимых доноров для одного случайного реципиента.

Рисунок 2. Расчетная зависимость вероятности неудачи в подборе 100 НРА соместимых доноров для одного случайного реципиента в зависимости от объема банка доноров.

Если задаться пороговым уровнем неудачи в подборе группы из 100 доноров равным 10% процентам, то из графика видно, что такой уровень обеспечивается банком объема примерно 1300 доноров. Отсюда можно сделать вывод о том, что организация банка НРА типированнных доноров может считаться практически целесообразной, если в нем не менее 1500-2000 доноров. Тогда в 90% случаев удастся сформировать группу НРА совместимых доноров достаточного объема для продолжительного курса трансфузионной терапии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Использование комбинации сиквенс-специфических праймеров, каждый из которых специфично амплифицирует только один аллель НРА, позволяет сделать вывод о присутствии или отсутствии соответствующего гена всех пяти локусов НРА: НРА-1, НРА-2, НРА-3, НРА-4 и НРА-5. Кроме того, добавление в каждую пробирку дополнительной пары праймеров, амплифицирующей фрагмент гена фактора роста человека, обеспечивает положительный контроль для каждой реакции амплификации. Генотипирование «слепым» методом образцов ДНК показало полное совпадение результатов, полученных с помощью предлагаемой нами тест-системы и тест-системы фирмы "PROTRANS"

Использование модифицированных нами праймеров для НРА-3, -5 локусов позволяет проводить специфическую амплификацию всех пяти локусов НРА при одинаковой температуре (68°С) В аналогичных тест-системах предлагается проводить отжиг праймеров

для разных локусов НРА в нескольких температурных режимах.

18

С помощью модифицированной нами тест-системы получены данные о частоте аллелей и генотипов НРА у 197 жителей России (кадровые доноры крови и ее компонентов). На основании этих данных рассчитана необходимая численность контингента типированных по НРА доноров - 1500 человек с 90% вероятностью подбора для обеспечения НРА-совместимых трансфузий.

Отличительной особенностью исследуемой группы кадровых доноров г.Москвы выявлена увеличенная частота гена НРА-2Ь - 25,38%, в то время как средний показатель для лиц белой расы -13,2%.

Определение величины неравновесного сцепления генов с учетом частоты аллелей НРА выявило незначительную гаметную ассоциацию между генами НРА-1а и НРА-За, а также между генами НРА-Ib и НРА-ЗЬ.

Иммуногенетические параметры НР А-генов у кадровых доноров г.Москвы указывают на выраженный полиморфизм локусов НРА-1, -2, -3, -5 Поэтому трансфузии тромбоцитов должны проводиться с учетом их антигенной структуры у донора и реципиента. Это является важным для предотвращения аллоиммунизации больных, развития у них посттрансфузионной тромбоцитопенической пурпуры и иммунологической рефрактерности к трансфузиям тромбоцитов.

Получены предварительные данные о распределении генов и генотипов в двух этнических группах' у 32 представителей армянской национальности и 28 представителей хакасской национальности (национальность устанавливали путем опроса с учетом этнической принадлежности не менее чем в 3-х поколениях). Выявлены достоверные различия частот аллелей и генотипов в выборках кадровых доноров г Москвы, представителей армянской и хакасской национальностей.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров для генотипирования антигенов тромбоцитов человека Генотипирование «слепым» методом 30 образцов ДНК показало полное совпадение результатов, полученных с помощью предлагаемой нами тест-системы и тест-системы фирмы "PROTRANS".

2 В результате генотипирования 197 кадровых доноров компонентов крови г.Москвы получены данные о распределении частот генов и генотипов НРА, которые оказались сопоставимы с соответствующими литературными данными по генотипированию представителей европейских государств Отличительной особенностью исследуемой группы кадровых доноров является увеличенная частота аллеля НРА-2Ь - 25,38%, в то время как средний показатель для лиц белой расы - 13,2%.

3. Разработанная тест-система была верифицирована на двух изолированных этнических группах (представители армянской и хакасской национальностей) Выявлено статистически достоверное отличие частоты аллеля «Ь» локуса НРА-1 у представителей армянской национальности и смешанной российской популяции (кадровые доноры г Москвы) - 50% и 24,87%, соответственно Среди представителей хакасской национальности гомозиготы по аллелю «Ь» в локусах НРА-1, -2, -4, -5 не обнаружены.

4. Установлены количественные критерии контингента НРА-типнрованных доноров, необходимого для обеспечения НРА-совместимых трансфузий Величина кошиш ента НРА-типированых доноров с 90% вероятностью подбора составляет 1500 человек.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Макарик Т.В , Головкину Л Л, Орлова Г К, Шумилова Л.Л, Судариков А Б Генотипирование антигенов тромбоцитов человека методом полимеразной цепной реакции с использованием аллель-специфических праймеров Проблемы гематологии и переливания крови. 2004,3:27-31

2 Головкина ЛЛ, Макарик ТВ., Судариков А Б. Иммуногенетические параметры тромбоцитспецифических антигенов (НРА) у россиян - основа для формирования контингента нитрованных доноров. Проблемы гематологии и трансфузиологии 2005, 1-29.

3. Головкина Л.Л., Зотиков Е.А., Макарик ТВ., Судариков А Б Распространенность тромбоцитспецифических антигенов у россиян как основа формирования контингента типированных доноров. Сборник «Актуальные проблемы трансфузиологии и клинической медицины», г.Киров. 2005,145-148.

4 Golovkina L L., Makarik Т, Sudarikov А В Distribution of HP A-genes and genotypes in the population of Russian unrelated donors. "Genes & Immunity: genetics, genomics and function" 19-th European Immunogenetics & Histocompatibility Conference 23-26 April 2005, Istambul-Turkey. 2005, V.6 supplement 1, S.22, poster 36.

Благодарности.

За помощь и поддержку в проведении работы выражаем искреннюю благодарность сотрудникам Гематологического Научного Центра РАМН, зав лаб иммуногематологии, к м н. Головкиной Л.Л,, зав лаб. к.ф -м.н. Куликову С.М, вед н.с., к.м.н. Меликян А Л, зав. лаб., чл.корр РАЕН Зарецкой ЮМ., гл.врачу СПК Орловой Г.К., зам.гл.врача, к.м.н. Шумиловой Л. Л, сотрудникам лаборатории молекулярной гематологии.

1 9 4 67

РНБ Русский фонд

2006-4 17675

Принято к исполнению 14/10/2005 Заказ № 1127

Исполнено 17/10/2005 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш, 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ra

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Макарик, Татьяна Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Серологические и молекулярные методы типирования тромбоцитспецифических антигенов системы нра человека.

1.1.1. Иммуносерологические методы.

1.1.2. Методы, основанные на ДНК-диагностике.

1.2. иммуногенетика антигенов тромбоцитов человека.

1.2.1. Параметры иммуногенетики.

1.2.2. Особенности распределения антигенов среди представителей различных рас и этнических групп.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров.

2.3. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Полимеразная цепная реакция с использованием модифицированных сиквенс-специфических праймеров.

3.2 Иммуногенетические параметры тромбоцит-специфических антигенов у кадровых доноров компонентов крови г. Москвы и у представителей армянской и хакасской национальностей.

3.2.1. Иммуногенетические параметры НРА у кадровых доноров компонентов крови г. Москвы.

3.2.2. Частоты аллелей и генотипов HP А среди представителей армянской национальности.

3.2.3. Частоты аллелей и генотипов среди представителей хакасской национальности.

3.2.4. Сравнение частоты аллелей и генотипов HP А в обследованных выборках разных этнических групп.

3.3. Частота аллелей генов тромбоцитспецифических антигенов среди жителей России как основа формирования контингента типированных доноров.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные возможности генотипирования антигенов тромбоцитов человека"

Ф Антигены тромбоцитов человека (HPА) включают 16 известных на сегодняшний день биаллельных систем [Ouwehand W. et al., 2000]. Каждый аллоантиген, как было показано, является результатом изменения единичного нуклеотида в последовательности ДНК, приводящего к замене аминокислоты на белковом уровне. Это приводит к изменению третичной структуры мембранных гликопротеинов и, соответственно, возникновению разных эпитопов - мишеней для трансфузионной аллоиммунизации [Norton A. et al., 2004]. Кроме НРА на тромбоцитах локализуются антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). По некоторым данным трансфузия концентратов тромбоцитов без примеси лейкоцитов не вызывает первичную аллоиммунизацию к HLA [Novotny V.M.J, et al., 1995]. Аллоиммунизация к антигенам тромбоцитов может вызывать пост-трансфузионную пурпуру и рефрактерность к трансфузиям тромбоцитов, кроме того, при беременности аллоиммунизация может быть причиной тромбоцитопении новорожденного [Waters А.Н. et al., 1992, Murphy M.F. et al., 1999, Kekomaki S. et al., 1998]. Необходимым компонентом диагностики и последующего лечения пациентов с этими синдромами является возможность быстрого и точного типирования антигенов тромбоцитов. Традиционно, при определении фенотипа тромбоцитов используют аллоиммунную сыворотку человека,

Ф однако, не ко всем антигенам системы НРА получены антитела [Simsek S. et al., 1994]. Кроме того, в случаях заболеваний системы крови низкий уровень тромбоцитов у значительной части пациентов ограничивает возможность серологического типирования тромбоцитов.

В последнее время для типирования НРА применяют методы, основанные на ДНК-диагностике, такие как полимеразная цепная реакция с последующей рестрикцией полиморфных фрагментов (PCR-RFLP) и секвенирование ДНК [Newmen P.J. et al., 1994]. Эти методы достаточно сложны и дорогостоящи. В отличие от них новый подход с использованием в 5 полимеразной цепной реакции сиквенс-специфичных праймеров представляет собой технически простой и экономичный метод генотипирования НРА. Эффективная амплификация возможна только тогда, когда 3" конец праймера комплементарен последовательности сайта аллельной вариации. Используя серию праймеров, каждый из которых специфично амплифицирует только один аллель НРА, можно сделать вывод о присутствии или отсутствии соответствующих антигенов.

Частоты аллоантигенов тромбоцитов человека различаются между расами и этническими группами. Недавние популяционные исследования показали существенные различия в распределении ЕРА у представителей европеоидной [Simsek S. et al., 1993, Kekomaki S. et al.,1995, Kim H. et al., 1995, Covas D. Et al., 1997, Drzewek K. Et al., 1998] и монголоидной рас [Seo D. et al., 1998, Chang Y.et al., 1998, Chiba A. et al., 2000]. Получены данные о встречаемости НРА-генов в выборках жителей России [Зотшсов Е.А. и др., 2003, Головкина Л.Л. и др., 2004, Golovkina L. et al., 2004]. Изучение частоты аллелей НРА позволяет сделать вывод о перемещении генов и получить важную иммуногенетическую характеристику популяции. Практическое значение генотипирования НРА в первую очередь проявляется в трансфузиологии, поскольку лица белой расы с выраженным полиморфизмом генов НРА-1, -2, -5 являются «реактивными» донорами для реципиентов монголоидной расы, для которой полиморфизм указанных генов не характерен.

Генотипирование антигенов тромбоцитов человека методом полимеразной цепной реакции позволит проводить трансфузии тромбоцитов с учетом их антигенной структуры у донора и реципиента.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

На основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфичных праймеров разработать тест-систему для изучения распределения пяти клинически важных антигенов тромбоцитов (НРА 1-5) у кадровых доноров компонентов крови.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Оптимизация тест-системы на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров; сравнение результатов генотипирования, полученных с помощью модифицированной нами тест-системы и тест-системы фирмы «PROTRANS».

2. Использование модифицированной тест-системы для генотипирования кадровых доноров компонентов крови по системе ЕРА.

3. Изучение иммуногенетических параметров НРА у кадровых доноров компонентов крови и представителей некоторых этнических групп России.

4. Вычисление величины контингента НРА-типированных доноров, необходимого для обеспечения НРА-совместимых трансфузий.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Разработана модифицированная тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров для генотипирования антигенов тромбоцитов человека. Впервые в России рассчитаны все иммуногенетические параметры НРА у кадровых доноров компонентов крови, а также получены ориентировочные данные о распределении частот аллелей и генотипов в двух генетически отдаленных этнических группах (армяне и хакасы). Предложен подход к формированию контингента НРА-типированных доноров в России.

ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ТЕОРИИ И ПРАКТИКИ.

Предложенная в работе модифицированная тест-система на основе полимеразной цепной реакции рекомендуется к использованию для генотипирования антигенов тромбоцитов доноров и реципиентов с целью предотвращения посттрансфузионных осложнений и создания контингента типированных по НРА кадровых доноров компонентов крови.

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликованы 4 работы. Результаты диссертации доложены на 19-й Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместимости (Стамбул, 2005г.) и на 28-й конференции «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2005г.).

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 74 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 8 рисунков, 3 диаграммы и 14 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Макарик, Татьяна Викторовна

выводы.

1. Разработана тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров для генотипирования антигенов тромбоцитов человека. Генотипирование «слепым» методом 30 образцов ДНК показало полное совпадение результатов, полученных с помощью предлагаемой нами тест-системы и тест-системы фирмы "PROTRANS".

2. В результате генотипирования 197 кадровых доноров компонентов крови г.Москвы получены данные о распределении частот генов и генотипов НРА, которые оказались сопоставимы с соответствующими литературными данными по генотипированию представителей европейских государств. Отличительной особенностью исследуемой группы кадровых доноров является увеличенная частота аллеля НРА-2Ь - 25,38%, в то время как средний показатель для лиц белой расы -13,2%.

3. Разработанная тест-система была верифицирована на двух изолированных этнических группах (представители армянской и хакасской национальностей). Выявлено статистически достоверное отличие частоты аллеля «Ь» локуса НРА-1 у представителей армянской национальности и смешанной российской популяции (кадровые доноры г.Москвы) - 50% и 24,87%, соответственно. Среди представителей хакасской национальности гомозиготы по аллелю «Ь» в локусах НРА-1, -2, -4, -5 не обнаружены.

4. Установлены количественные критерии контингента НРА-типированных доноров, необходимого для обеспечения НРА-совместимых трансфузий. Величина контингента НРА-типированых доноров с 90% вероятностью подбора составляет 1500 человек.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Макарик Т.В., Головкина JLJL, Орлова Г.К., Шумилова JI.JL, Судариков А.Б. Генотипирование антигенов тромбоцитов человека методом полимеразной цепной реакции с использованием аллель-специфических праймеров. Проблемы гематологии и переливания крови. 2004, 3:27-31.

2. Головкина Л.Л., Макарик Т.В., Судариков А.Б. Иммуногенетические параметры тромбоцитспецифических антигенов (НРА) у россиян основа для формирования контингента типированных доноров. Проблемы гематологии и трансфузиологии. 2005,

3. Головкина JI.JI., Зотиков Е.А., Макарик Т.В., Судариков А.Б. Распространенность тромбоцитспецифических антигенов у россиян как основа формирования контингента типированных доноров. Сборник «Актуальные проблемы трансфузиологии и клинической медицины», г.Киров. 2005, 145-148.

4. Golovkina L.L., Makarik Т., Sudarikov А.В. Distribution of HPA-genes and genotypes in the population of Russian unrelated donors. "Genes & Immunity: genetics, genomics and function" 19-th European Immunogenetics & Histocompatibility Conference. 23-26 April 2005, Istambul-Turkey. 2005, V.6 supplement 1, S.22, poster 36.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

4.1. Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров.

Использование комбинации сиквенс-специфических праймеров, каждый из которых специфично амплифицирует только один аллель НРА, позволяет сделать вывод о присутствии или отсутствии соответствующего гена всех пяти локусов НРА: НРА-1, НРА-2, НРА-3, НРА-4 и НРА-5. Кроме того, добавление в каждую пробирку дополнительной пары праймеров, амплифицирующей фрагмент гена фактора роста человека, обеспечивает положительный контроль для каждой реакции амплификации. Генотипирование «слепым» методом образцов ДНК показало полное совпадение результатов, полученных с помощью предлагаемой нами тест-системы и тест-системы фирмы "PROTRANS".

Предлагаемая нами тест-система на основе полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров имеет несколько отличий от аналогичных зарубежных систем.

Во-первых, использование модифицированных нами праймеров для НРА-3, -5 локусов позволяет проводить специфическую амплификацию всех пяти локусов НРА при одинаковой температуре (68°С). В аналогичных тест-системах предлагается проводить отжиг праймеров для разных локусов НРА в нескольких температурных режимах [Cavanagh G. et al., 1996, Jau-Yi Lyou et al., 2003].

Во- вторых, применение 96-луночных планшет с праймерами позволяет одновременно генотипировать 9 образцов ДНК, а также значительно сокращает время постановки реакции.

Полимеразная цепная реакция с использованием сиквенс-специфических праймеров является достаточно простой процедурой, которая включает только два пост-амплификационных шага - электрофорез и визуальную интерпретацию [Kluter Н. et al., 1996, Kroll H. et al., 1998, Darke C. et al., 1996]. Кроме того, существует возможность применения метода Real-time (полимеразная цепная реакция в реальном времени) для генотипирования НРА, преимуществом которого является отсутствие пост-амплифшсационных шагов.

Таким образом, техника полимеразной цепной реакции с использованием сиквенс-специфических праймеров является недорогим, простым и точным методом генотипирования системы НРА как для клинических исследований, так и для создания регистра доноров крови [Sellers J. et al., 1999].

4.2. Иммуногенетические параметры тромбоцит-специфических антигенов у жителей России.

Ранее было показано, что большие расы и локальные популяции населения Земного шара различаются по частоте НРА-генов [Simsek S. et al., 1993, Kekomaki S. et al., 1995, Kim H.O. et al., 1995, Covas D.T. et al., 1997, Drzewek K. et al., 1998]. С помощью модифицированной нами тест-системы получены данные о частоте аллелей и генотипов НРА у 197 жителей России (кадровые доноры крови и ее компонентов). Эти данные позволили рассчитать все иммуногенетические параметры: частоты аллелей, генов и генотипов НРА, величину неравновесного сцепления и генетическую дистанцию. Кроме того, на основании этих данных можно рассчитать необходимую численность контингента типированных по НРА доноров, обеспечивающую возможность иммунологически неконфликтной трансфузии для любого реципиента.

Сведения о частоте аллелей и генотипов НРА у жителей России, полученные путем прямого подсчета, оказались сопоставимы с соответствующими частотами генов в европейской популяции. Так частоты НРА-la, -2а, -2Ь, -За, -ЗЬ, -5а и -5Ь не отличались заметно от

61 соответствующих данных в Австрии [Holensteiner A. et al., 1995], Финляндии [Kekomaki S. et al., 1995], Германии [Simsek S. et al., 1993] или Польше [Drzewek К. et al., 1998]. Аллель HPA-4b отсутствовал как по нашим данным, так и по данным для других популяций (Дания, Германия, Польша) [Simsek S. et al., 1993, Steffensen R. et al., 1996, Unkelbach K. et al., 1995, Legler T.J. et al., 1996].

Отличительной особенностью исследуемой группы кадровых доноров г.Москвы выявлена увеличенная частота гена НРА-2Ь - 25,38%, в то время как средний показатель для лиц белой расы - 13,2%.

Отсутствие расхождений между ожидаемыми и расчетными данными свидетельствовало о корректности проведенного исследования и о нахождении популяции в равновесии с законом Харди-Вайнберга. Генные частоты «а» и «Ь» аллелей НРА определены как 0,86 и 0,14 для локусов НРА-1 и НРА-2; 0,55 и 0,45 для локуса НРА-3; 0,93 и 0,07 для локуса НРА-5. Частота гена НРА-4а составила 1,0.

Частоту гаплотипов НРА-1, -3 вычисляли непосредственно по реультатам генотипирования. Наиболее часто встречались гаплотипы НРА-1 а/3 а и НРА-1а/ЗЬ. Определение величины неравновесного сцепления генов с учетом частоты аллелей НРА выявило незначительную гаметную ассоциацию между генами НРА-1а и НРА-3 а, а также между генами НРА-lb и НРА-ЗЬ.

Изучение генетической дистанции между народами показало близость российских жителей к европейскому населению. Так величина генетической о дистанции между жителями России и Польши составила d=3,6xl0", а между жителями России и Финляндии - d=4,2xl0"2, что подтверждает ранее полученные данные при сопоставлении генных частот HLA-системы [Зарецкая Ю.М., 1983].

Иммуногенетические параметры НРА-генов у кадровых доноров г.Москвы указывают на выраженный полиморфизм локусов НРА-1, -2, -3, -5.

Поэтому трансфузии тромбоцитов должны проводиться с учетом их антигенной структуры у донора и реципиента. Это является важным для предотвращения ал л оимму низ ации больных, развития у них посттрансфузионной тромбоцитопенической пурпуры и иммунологической рефрактерности к трансфузиям тромбоцитов.

4.3. Частота аллелей и генотипов НРА в выборках из некоторых этнических групп.

Учитывая различия в распределении частот НРА-генов и необходимость подбора НРА-совместимых доноров, а также неоднородность российской популяции, изучение частот аллелей и генотипов НРА в некоторых этнических группах представляет несомненный интерес.

Нами получены предварительные данные о распределении генов и генотипов в двух этнических группах: у 32 представителей армянской национальности и 28 представителей хакасской национальности (национальность устанавливали путем опроса с учетом этнической принадлежности не менее чем в 3-х поколениях). Рассчитать все иммуногенетические параметры, а именно частоты генотипов, гаплотипов и генетическую дистанцию, оказалось невозможным в виду недостаточного объема исследуемых выборок.

На основании полученных нами данных выявлены достоверные различия частот аллелей и генотипов в выборках кадровых доноров г.Москвы, представителей армянской и хакасской национальностей (р < 0,05).

Полученные данные позволяют предложить формирование локальных (национальных) когорт доноров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макарик, Татьяна Викторовна, Москва

1. Азимов А., Бойд У. Расы и народы. Генетическая мутация и эволюция человека. М.: Центрполиграф. 2003.

2. Головкина JI.JL, Зотиков Е.А. Антигены тромбоцитов (обозначения, молекулярные основы построения, частота встречаемости в популяциях). Клиническая лабораторная диагностика. 2002, 3: 23-35.

3. Головкина Л.Л., Кутьина P.M., Зотиков Е.А. и др. Полиморфизм генов НСРА и его значение при миелотрансплантации от HLA-идентичного сибса. Гематология и трансфузиология. 2004, 49(1): 11-15.

4. Головкина JI.JI., Зотиков Е.А., Февралева И.С. и др. Распространенность генов НОРА в российской популяции. Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии, С.-Петербург, 2004, с. 141.

5. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология. М.: Мир. 1993, т.З.

6. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика. М.: Медицина. 1983, с.39.

7. Зарещсая Ю.М., Абрамов В.Ю. Новые антигены тканевой совместимости человека. М.: Медицина. 1986, с.100-114.

8. Зотиков Е.А., Бабаева А.Г., Головкина JI.JI. Тромбоциты и антитромбоцигарные антитела. М., Монолит, 2003.

9. Красникова Н.А., Пореппша Л.П., Головкина Л.Л. и др. Антитела, реагирующие с тромбоцитами. Клиническая лабораторная диагностика. 2000, 5: 40-45.

10. Кузнецов А.И., Идельсон Л.И., Мазуров А.В. Определение антитромбоцитарных антител на поверхности тромбоцитов с различными формами иммунной тромбоцитопении прямым радиоиммунным методом. Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. 1991, 6: 641-643.

11. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применениепакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа Сфера, 2002 (1-е изд.), 2003 (2-е изд.), 312 с.

12. Скобелев С.Г., Чжан Тайсян, Шомалаев А.П. Роды фуюйских кыргызов. Россия и Хакасия: 290 лет совместного развития. Абакан. 1998, с. 76-79.

13. Стентон Гланц. Медико-биологическая биостатистика. М.: Практика. 1999.

14. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека. Проблемы и подходы. М.: Мир. 1989, т.1, с. 151.

15. Drzewek К., Brojer Е., Zupanska В. The frequency of human platelet antigen (HPA) genotypes in the Polish population. Transfusion Medicine. 1998, 8: 339342.

16. Ferrer G., Muniz-Diaz E., Aluja M.P. et al. Analisis of human platelet antigen system in a Moroccan Berber population. Transfus. Med. 2002, 12: 49-54.

17. Ficko Т., Galvani V., Rupreht R. et al. Real-time PCR genotyping of human platelet alloantigens НРА-1, НРА-2, НРА-3, HPA-5 is superior to the standard PCR-SSP method. Transfusion Medicine. 2004, 14: 425-432.

18. Fisher L., Van Belle G. Biostatistics: a methodology for the healh sciences. A Wiley-Interscience Publication, New York, 1993.

19. Fujiwara K., Tokunaga K., Isa K. et al. DNA-based typing of human platelet antigen systems by polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism method. Vox Sanguinis. 1995, 69: 347-351.

20. Garner S.F., Smethurst P.A., Merieux Y. et al. A rapid one-stage whole-blood

21. НРА-la phenotyping assay using a recombinant monoclonal IgGl anti-HPA-la. Br. J. Haematology. 2000, 108(2): 440-447.

22. Golovkina L.L.HPA genes at inhabitans of Russia. In: Abstracts book of 8-th European symposium on platelet an granulocyte immunobiology, Rust, 13-16 May 2004, Post. 18:19.

23. Holensteiner A., Walchshofer S., Adler A. et al. Human platelet antigen frequencies in theAustrian population. Haemostasis .1995, 25: 133.

24. Jau-Yi Lyou, Ying-Ju Chen, Hui-Yu Hu et al. PCR with sequence-specific primer-based simultaneous genotyping of human platelet antigen-1 to -13w. Transfusion .2002, 42:1089-1095.

25. Kekomaki S., Koskeda S., Laaes M. et al. Neonatal thrombocytopenia in two of six human platelet alloantigen (HPA) 5a-positive children of an HPA-5a-immunized mother. Transfiis. Med. 2000, 10(1): 71-75.

26. Kekomaki S., Partanen J., Kekomaki R. Platelet alloantigens HPA-1, -2, -3, -5 and -6b in Finns. Transfusion Medicine. 1995, 5:193-198.

27. Kiefel V., Santoso S., Weisheit M. Monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens (MAIPA): a new tool for the identification of platelet-reactive antibodies. Blood. 1987, 70 (Suppl. 6): 1722-1726.

28. Kiefel V., Vicariot M., Giovangrandi Y. et al. Alloimmunization against Iy, a low-frequency antigen on platelet glycoprotein Ib/IX as a cause of severe neonatal alloimmune Thrombocytopenic purpura. Vox Sang. 1995, 69(3): 250254.

29. Kim H.O., Jin Y., Kickler T.S. et al. Gene frequencies of the five major platelet antigens in African Americans, white and Korean populations. Transfusion1995, 35:863-867.

30. Kluter H., Fehlau К., PanzerS. et al.Rapid typing for human platelet antigen systems-1, -2, -3, and -5 by PCR amplification with sequence specific primers.: Vox Sanguinis. 1996, 71: 121-125.

31. Kroll H., Kiefel V., Santoso S. Clinical aspects and typing of platelet alloantigens. Vox Sanguinis .1998, 74 (Suppl. 2): 345.

32. Legler T.J., Kohler M., Maur W.R. et al. Genotyping of the human platelet antigen systems 1 through 5 by multiplex polymerase chain reaction and ligation-based typing. Transfusion. 1996, 36(5): 426-431.

33. McFarland J.C., Aster R.H., Bussel J.B. et al. Prenatal diagnosis of neonatal alloimmune tlirpmbocytopenia using allele-specific oligonucleotide probes. Blood. 1991, 78: 2276-2282.

34. Merieux Y., Debost M., Bernaud J. et al. Human platelet antigen frequencies of platelet donors in the French population determined by polymerase chain reaction with sequence-specific primers. Pathol.Biol. (Paris). 1997, 45(9):697-700.

35. Metcalfe P. & Waters A.H. HPA-1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP): a rapid and simple technique. British Journal of Haematology. 1993, 85: 227-229.

36. Morel-Kopp M.C., Daviet L., McGregor J. et al. Drawbacks of the MAIPA technique in characterizing human antiplatelet antibodies. Blood Coagul. Fibrinolysis. 1996, 7: 144-146.

37. Mueller-Eckhardt C., Santoso S. & Kiefel V. Platelet alloantigens molecular, genetic, and clinical aspects. Vox Sanguinis. 1994, 67 (Suppl.3): 89-93.

38. Mullis K.B.The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold oligodeoxyribonuclear fusion. PCR Methods Appl. 1991 Aug;l(l):l-4.

39. Muniz-Diaz E., Martinez C., Arilla M. et al. Frecuencia de los antigenos plaquetarios especificos de los sistemas HPA-1, -2, -3, -4, -5 у -6 en poblacion espanola. Haematologic. 1998, 83(2)ed. esp.

40. Murphy M.F., Verjee S., Greaves M. Inadequacies in the postnatal management of fetomaternal alloimmune thrombocytopenia. Br. J. Haematol. 1999, 105: 123-126.

41. Newman P.J. Nomenclature of human platelet alloantigens: a problem with the HPA system. Blood.1994, 83:1447-1451.

42. Norton A., Allen D.L., Murphy M.F. Review: platelet alloantigens and antibodies and their clinical significance. Immunohematology. 2004, 20(2): 89102.

43. Novotny V. M.J., Van Doopn R., Witvliet M.D. et al. Occurrence of allogeneic

44. HLA and non-HLA antibodies after transfusion of prestorage filtered platelets and red Wood cells: a prospective study. Blood. 1995, 85: №7:1736-1741.

45. Ouwehand W., Navarette C. The molecular basis of blood cell alloantigens in molecular haematology. In: Molecular Haematology(eds Provan D., Gribben J.) Oxford, Blackwell Science, 2000: 182-197.ф 47 Porcelijn L. & von dem Borne, A.E.G.K. hnmunemediated

46. Thrombocytopenias: basic and immunological aspects. Baillieres Clinical Haematology. 1998, 11: 331-341.

47. Rachel J.M., Sinor L.T., Tawfik D.W. et al. A solid-phase red cell adherence test for platelet crossmatching. Med. Lab.Sciences. 1985, 42: 194-195.

48. Randen I., Sorensen K., Killie M.K. et al. Rapid and reliable genotyping of human platelet antigen (HPA) -1, -2, -3, -4 and -5 a/b and Gov a/b by meltingcurve analisis. Transfusion. 2003, 43: 445-450.

49. Reviron D., Mercier P., Dabanian C. et al. Platelet group polymorphism in Provence. Comparison with the frequencies of platelet-specific allo-antigens observed in other populations. Rev. Fr. Transfus. Hemobiol. 1992, 35(1): 2532.

50. Rozman P. Platelet antigens. The role of human platelet alloantigens (HPA) in blood transfusion and transplantation. Transplantation Immunology. 2002, 10: 165-181.

51. Santoso S. & Kiefel V. Human platelet-specific alloantigens: update. Vox Sanguinis. 1998, 74(2): 249-253.

52. Santoso S. & Kiefel V. Human platelet-specific alloantigens: update. Vox Sanguinis. 1998, 74 (Suppl. 2): 249-253.

53. Santoso S., Amrheim J., Hoftnan H.A. et al. A point mutation Thr799Met on the alpha 2 integrin leads to the formation of new human platelet alloantigen Sita and affects collagen-induced aggregation. Blood. 1999, 94(12): 4103-4111.

54. Santoso S., Kiefel V., Mueller-Eckhardt C. Blood group A and В determinants are expressed on platelet glycoproteins Ha, Ilia and lb. Thromb. Haemost. 1991, 65(2): 196-201.

55. Sellers J., Guttridge M.G. & Darke C. An imprived method of PCR-SSP HPA-1 typing. European Journal of Immunogenetics. 1995, 22: 102.

56. Sellers J., Thompson J., Guttridge M.G. et al. Human platelet antigens: typing by PCR using sequence-specific primers and their distribution in blood donorsresident in Wales. Eur.J. Immunogenet. 1999, 26: 393-397.

57. Seo D.H., Park S.S., Kim D.W. et al. Gene frequencies of eight human platelet specific antigens in Koreans. Transfusion Medicine .1998, 8:129-132.

58. Shih M.C., Liu T.C., Lin I.L. et al. Gene frequencies of the HPA-1 to HPA-13, Oe and Gov platelet antigen alleles in Taiwanese, Indonesian, Filipino and Thai populations. Int. J. Mol. Med. 2003, 12: 609-614.

59. Shuh A.C., Watkins N.A., Nguyen Q. et al. A tyrosine 703 serine polymorphism of CD 109 defines the Gov platelet alloantigens. Blood. 2002, 99(5): 1692-1698.

60. Simsek S., Borne A.E.G.Kr. Molecular genetics of human platelet antigens. Infusionstherapie Transfusionsmedicin. 1994, 21: 29-33.

61. Simsek S., Faber N.M., Blecker P.M. et al. Determination of human platelet antigen frequencies in the Dutch population by immunophenotyping and DNA (allele-specific restriction enzyme) analysis: Blood .1993, 81:835-840.

62. Skogen В., Bellissimo D.B., Hessner M.J. et al. Rapid determination of platelet alloantigen genotypes by polymerase chain reaction using allele-specific primers. Transfusion. 1994, 34: 955-960.

63. Steffensen R., Kaczan E., Vanning K. et al. Frequency of platelet-specific alloantigens in a Danish population. Tissue Antigens. 1996, 48(2): 93-96.

64. Tanaka S., Ohnoki S., Shibata H. et al. Gene frequencies of human platelet antigens on glycoprotein Ilia in Japanese. Transfusion. 1996, 36: 813-817.

65. Tanaka S., Taniue A., Nagao N. et al. Simultaneous DNA typing of human platelet antigens, 2, 3 and 4 by an allele-specific PCR method. Vox Sanguinis. 1995, 68: 225-230.

66. Tazzari P.L., Cirillo D., Bontandini A. et al. Flow cytometry immunophenotyping and polymerase chain reaction-site-specific primers genotyping for HPA-1 alloantigens in an Italian blood donor population. Vox1. Sang. 1998, 74(1): 42-45.

67. Tijhuis G.J., Klaasen R.J., Modderman P.W. et al. Quantification of platelet-bound immunoglobulins of different class and subclass uing radiolabeled monoclonal antibodies: assay conditions and clinical application. Br.J. Haematology. 1991, 77: 93-101.

68. Tsao K.S., Sun C.F., Lai N.C. The phenotype and gene frequencies of human platelet specific antigens among Chinese in Taiwan. Chung Hua Min Kuo Wei Sheng Wu Chi Mien I Hsueh Tsa Chih. 1992, 25(1): 48-55.

69. Unkelbach K., Kalb R., Santoso S. et al. Genomic RFLP typing of typing of human platelet alloantigens Zw (P1A), Ко, Bak and Br (HPA-1,2,3,5). Br.J. Haematol. 1995, 89: 169-176.

70. Urwijitaroon Y., Barusrus S., Romphruk A. et al. Frequency of human platelet antigens among blood donors in northeastern Thailand. Transfusion. 1995, 35(10): 868-870.

71. Verran J., Grey D., Bennett J. et al. HP A 1, 3, 5 genotyping to establish a typed platelet donor panel. Pathology. 2000, 32: 89-93.

72. Viller S., Dykes D., Polesky H. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleated Acids Research .1988, 16:1215.

73. Von dem Borne A.E., von Riesz E., Verheught F.W. et al. Baka, a new platelet-specific antigen involved in neonatal alloimmune thrombocytopenia. Vox Sanguinis. 1980, 39:113-120.

74. Wang L., Juji Т., Shibata Y. et al. Sequence variation of human platelet membrane glycoprotein Ilia associated with the Yuk/Yuk alloantigen system. Proceedings of the Japan Academy. 1991, 67(1): 102-106.

75. Waters A.H., Autoimmune thrombocytopenia: clinical aspects. Semin. Hematol. 1992, 2: 18-25.

76. Watkins N.A., Armour K.L., Smethurst P.A. et al. Rapid phenotyping of HPA-la using either diabody-based hemagglutination or recombinant IgGl-based assays. Transfusion. 1999, 39(7): 781-789.