Молекулярные основы некоторых путей развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе, стрессе и вирусной инфекции

Замятнин, Андрей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные основы некоторых путей развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе, стрессе и вирусной инфекции
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные основы некоторых путей развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе, стрессе и вирусной инфекции"

На правах рукописи

ЗАМЯТНИН Андрей Александрович

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НЕКОТОРЫХ ПУТЕЙ РАЗВИТИЯ ПРОГРАММИРУЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ ПРИ МОРФОГЕНЕЗЕ,СТРЕССЕ И ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.01.03 - молекулярная биология 03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

005538302

Москва - 2013

005538302

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования« Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

Официальные оппоненты:

Вейко Владимир Петрович, доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории молекулярной инженерии, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, профессор.

Лукашев Александр Николаевич, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярной биологии, Федеральное государственное бюджетное учреждение« Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» Российской академии медицинских наук.

Ребриков Денис Владимирович, доктор биологических наук, заведующий Центром коллективного пользования « Генетический полиморфизм» ОБН РАН, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук.

Защита диссертации состоится 12 декабря 2013 г. в П. часов 30 минут на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетным образовательным учреждении высшего профессионального образования« Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться -в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова ( Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Программируемая клеточная смерть (ПКС) является особой формой гибели клетки, инициированной внутриклеточной программой. Разные формы ПКС встречаются практически у всех эукариотических организмов, включая одноклеточные. Апоптоз является одним из трех основных типов клеточной смерти, встречаемых у животных. В сравнении с двумя другими основными типами клеточной смерти у животных - аутофагией и регулируемым некрозом - процессы апоптоза к настоящему времени исследованы лучше всего как с биохимической, так и с морфологической точек зрения. Классический апоптоз сопровождается характерными морфологическими признаками: округлением погибающей клетки, снижением клеточного объема, конденсацией хроматина, сегментацией ядра и очень небольшими ультраструктурными модификациями цитоплазматических органелл. Кроме того, наблюдается сморщивание плазматической мембраны, которая, однако, не теряет непроницаемости до финальных стадий процесса клеточной смерти, а также разделение погибающей клетки на части, известные как апоптотические тельца. В конце процесса такие апоптотические тельца поглащаются фагоцитами и деградируют внутри них с помощью лизосом.

В отличие от животных у растений, как и у многих представителей других царств живых организмов, как минимум, по двум причинам по определению не может быть «классического» апоптоза: (i) из-за наличия плотной клеточной стенки, что делает невозможным образование апоптотических телец; (ii) из-за отсутствия у растений клеток, способных к фагоцитозу (van Doom et al., 2011).

Интенсивные исследования ПКС в течении последних 30-ти лет выявили большое разнообразие в типах развития клеточной смерти, встречающихся даже у одного и того же организма. Многие из них описаны морфологически, в то время как данные об их биохимических механизмах пока охарактеризованы очень не полно. Для того, чтобы унифицировать критерии для определения разных типов клеточной смерти у животных, был создан комитет по номенклатуре клеточной смерти, который периодически публикует и обновляет рекомендации по использованию терминов в данной области. При этом, по мере накопления новых данных о молекулярных механизмах развития процессов ПКС рекомендуется переходить от морфологических определений к биохимическим (Galluzzi et al., 2012). Аналогичная работа по классификации типов клеточной смерти проводится сообществом исследователей, изучающих ПКС в растениях (van Doom et al., 2011).

Каспазы являются идеальными эффекторами для обеспечения процессов ПКС по трем причинам. Во-первых, каспазы конститутивно экспрессируются в виде неактивного зимогена. Таким образом, некоторое их количество постоянно присутствует в клетке и после активации может выполнить свою функцию в достаточно сжатые сроки. Во-вторых, реакции протеолитического расщепления, катализируемые каспазами, являются необратимыми. В третьих, существенным преимуществом является определенная полиспецифичность каспаз, что обусловливает расщепление, с одной стороны, многих субстратов, а с другой — нерасщепление абсолютно всех белков. У представителей царства животных каспазы достаточно консервативны, однако их количество и типы могут сильно варьировать у разных организмов.

Несмотря на то, что феномен ПКС характерен для всех видов живых организмов, представители семейства каспаз встречаются только у представителей царства животных. После публикации полноразмерных геномов резушки (Arabidopsis thaliana L.) и риса (Oryza sativa L.) стало окончательно очевидно, что у растений (по крайней мере, у этих двух видов) нет генов каспаз, которые можно было бы идентифицировать с помощью простых инструментов поиска гомологичных генов. Тем не менее, накопление многочисленных данных о том, что в процессах развития ПКС у растений детектируется каспазо-подобная активность (Bonneau et al., 2008), стимулировало исследователей примененить специальные биоинформатические методы, которые позволили обнаружить у растений очень отдаленных родственников протеиназ, относящихся к семейству каспаз, -метакаспазы (Uren et al., 2000). Кроме того, к настоящему времени охарактеризовано еще несколько протеиназ, активность которых, как считается, необходима при развитии некоторых видов ПКС у растений. Такими протеиназами являются: вакуолярный процессирующий фермент (VPE), представитель субтилизин-подобного семейства протеиназ, названный фитаспазой, а также еще две сериновые протеиназы SAS-1 и SAS-2 (Chichkova et al., 2010; Coffeen and Wolpert 2004; Hatsugai et al., 2004). Несмотря на то, что у животных известно более тысячи природных субстратов каспаз (Crawford et al., 2013), у растений к настоящему времени охарактеризован единственный природный субстрат протеиназ, обеспечивающих развтите ПКС в растениях. Им является субстрат фитаспазы - белок VirD2, но его расщепленее фитаспазой скорее всего не связано с процессами развития ПКС (Chichkova et al., 2010).

В условиях хронического стресса энодоплазматического ретикулума (ЭПР), индуцированного переполнением люмена ЭПР несвернутыми или неправильно свернутыми белками, часто развиваются процессы ПКС. В дополнение к функции, направленной на запуск механизмов, восстанавливающих гомеостаз ЭПР -процесса, названного ответом на несвернутый белок (ОНБ; unfolded protein response), способствующего выживанию клетки, - существуют сигнальные пути развития ОНБ, приводящие к развитию ПКС (Sano and Reed 2013). Вирусные патогены, продуцирующие большие количества вирус-специфических белков, значительная часть из которых является мембранными, используют различные стратегии для использования процессов ОНБ в целях обеспечения максимально продуктивной инфекции (Zhang and Wang 2012). Стресс ЭПР и развитие ОНБ являются базовыми реакциями, свойственными всем эукариотическим организмам. Недавно было показано, что инфекция, вызываемая X вирусом картофеля (ХВК) у растений, а также вирус-специфический гидрофобный транспортный белок ТБГЗ ХВК способны индуцировать стресс ЭПР, ОНБ и, в некоторых условиях, последующее развитие ПКС (Ye et al., 2011; 2013). Несмотря на активные исследования, проводимые в последние годы, механизмы, используемые вирусами для осуществления тонких настроек фундаментальных процессов развития ОНБ для обеспечения собственной продуктивной инфекции, до сих пор остаются, во-многом, не ясными (Zhang and Wang 2012).

Цель работы. Настоящая работа была направлена на выявление новых молекулярных механизмов развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе, стрессе и вирусной инфекции.

Задачи исследования.

1. Охарактеризовать функциональную роль метакаспазы растений mcII-Pa в процессах развития ПКС при морфогенезе и в условиях стресса.

2. Выявить и охарактеризовать природный субстрат метакаспазы растений mcII-Pa. Исследовать влияние протеолитического расщепления природного субстрата, инициируемого mcII-Pa, на его функциональные свойства.

3. Выявить гомологи субстрата, расщепляемого mcII-Pa, у животных. Исследовать возможность протеолитического расщепления такого гомолога в процессе развития апоптоза.

4. Исследовать внутриклеточную локализацию гидрофобных белков ТБГЗ и цистеин богатого белка вируса курчавости верхушек картофеля. Определить функциональную роль белка ТБГЗ в процессах транспорта вирусов растений.

5. Исследовать возможность индукции стресса ЭПР и последующего развития ПКС при экспрессии гидрофобных белков вирусов растений.

6. Исследовать особенности экспрессии гидрофобных белков вируса курчавости верхушек картофеля при развитии вирусной инфекции.

Научная новизна н практическая ценность работы. В настоящей работе впервые биохимически охарактеризована метакаспаза растений mcII-Pa. В результате проведенных работ показано, что в отличие от каспаз животных, представляющих из себя аспартат-специфичные цистеиновые протеиназы, mcII-Pa является аргинин/лизин-специфичной цистеиновой протеиназой. Также впервые показано, что протеолитическая активность mcII-Pa является необходимой у растений для развития ПКС при морфогенезе и ответе на стресс. Несмотря на особенную субстратную специфичность, функция mcII-Pa является аналогичной функциям каспаз: на начальных этапах ПКС mcII-Pa локализуется в цитоплазме, а при развитии ПКС она транслоцируется в ядро и инициирует его деградацию. В настоящей работе также впервые показано, что эволюционно-консервативный многофункциональный белок TSN является неизменным компонентом деградома как у растений, так и у животных. Выявлено, что у растений протеолитическое расщепление TSN в ходе развития ПКС осуществляется метакаспазой, в то время как у животных протеолитическое расщепление TSN в процессе развития апоптоза осуществляется каспазой-3, причем это протеолитическое расщепление TSN негативно влияет на его функциональную активность. Кроме того, в работе показано, что эволюционно-консервативный многофункциональный белок TSN является необходимым фактором выживаемости как у растительных, так и у животных клеток.

При выполнении настоящей работы была создана модельная система для изучения транспорта вирусов растений, содержащих тройной блок генов (ТБГ). Показано, что продукт экспрессии ТБГ, мембранный белок ТБГЗ вируса курчавости верхушек картофеля (ВКВК; Potato mop-top virus; PMTV), индуцирует образование из мембран ЭПР телец-включений на клеточной периферии, образование которых необходимо для осуществления внутриклеточного и межклеточного транспорта РНК-связывающего белка ТБГ1. В то же время в настоящей работе продемонстрировано, что именно белок ТБГЗ индуцирует стресс ЭПР, следствием которого является ОНБ. Такой ответ, имеющий целью компенсировать функциональные повреждения ЭПР, вызывает клеточную смерть при условии длительного воздействия факторов, приводящих к стрессу ЭПР. При

выполнении данной работы выяснилось, что аналогичным потенциалом индуцировать стресс ЭПР обладает еще один мембранный, богатый цистеином белок, экспрессируемый ВКВК. Проведенные в настоящей работе исследования особенностей экспрессии мембранных белков ВКВК выявили молекулярные механизмы, с помощью которых вирусы снижают уровень экспрессии белков, способных индуцировать развитие ПКС.

При исследовании интегральных мембранных белков был разработан новый оригинальный метод определения топологии таких белков в живых клетках.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместном семинаре отдела сигнальных путей клетки и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» 15 мая 2013 года. Материалы работы докладывались на всероссийских и международных конференциях: 7th Aschersleben Symposium 'New Aspects of Resistance Research on Cultivated Plants', (Ашерслебен, Германия, 1999 г.), IXth Conference on Virus Diseases of Gramineae in Europe, (Йорк, Великобритания, 2001 г.), III-ий Всероссийский биохимический съезд, (Санкт-Петербург, 2002 г.), VHIth International Congress of Plant Pathology (Крайстчерч, Новая Зеландия, 2003 г.), 11th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions (Санкт-Петербург, 2003 г.), Conference "Cell Biology of Nitric Oxide and Cell Death in Plants" (Ялта, Украина, 2004 г.), XXII SPPS Congress (Умео, Швеция, 2005 г.), Научно-практическая конференция «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства» (Коренево, Моск. обл., 2008) Научно-практическая конференция «Современные тенденции и перспективы инновационного развития картофелеводства» (Чебоксары, 2011 г.).

Публикации. По результатам работы опубликовано 17 статей в рецензируемых научных изданиях. Основные результаты и теоретические обобщения опубликованы в ведущих журналах, входящих в список журналов, рекомендованных ВАК, и/или индексируемых базами данных Web of Science и Scopus (Биохимия, Current Drug Targets, Journal of General Virology, Molecular Plant-Microbe Interactions, Nature Cell Biology, Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America, The Plant Journal), а также в международных журналах (Beiträge zur Züchtungsforschung и NATO Science Series I: Life and Behavioural Sciences).

Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы».

Работа изложена на 233 страницах, содержит 28 рисунков и 2 таблицы. Список литературы содержит ссылки на 444 литературных источника.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Метакаспаза растений шс11-Ра является аргинин/лизин-специфичной

цистеиновой протеиназой.

Роль программируемой клеточной смерти (ПКС) сложно преувеличить в процессах развития многоклеточных эукариотических организмов, а также в их системах защиты, в том числе, от патогенов. У животных в большинстве процессов ПКС (в том числе, при апоптозе) участвуют представители семейства каспаз, которые относятся к цистеиновым протеиназам (Earnshaw et al., 1999). В растениях близких гомологов каспаз обнаружено не было. Удалось обнаружить только отдаленные гомологи, которые назвали метакаспазами (Uren et al., 2000). Метакаспазы были обнаружены у бактерий, представителей Archaea и практически у всех эукариот за исключение представителей Metazoa (Uren et al., 2000; Vercammen et al., 2007). Обнаружение метакаспаз в растениях активизировало исследования, в которых метакаспазы рассматривались в качестве аналогов каспаз у животных. Действительно, в некоторых случаях каспазная активность, измеряемая с помощью флуоресцентных субстратов каспаз, возрастает в условиях оверэкспрессии метакаспаз и снижается при снижении экспрессии метакаспаз (Suarez et al., 2004). Также следует отметить, что у растений имеется целый ряд представителей других семейств протеиназ, вносящех свой вклад в развитие некоторых видов ПКС у растений. Одной из таких протеиназ является вакуолярный процессирующий фермент (VPE). К настоящему времени известно, что VPE принимает участие в ПКС, возникающей в процессе развития гиперчувствительного ответа, индуцированного вирусом табачной мозаики в растениях табака, несущих ген N (Hatsugai et al., 2004). Еще одной протеиназой, вовлеченной в процессы развития ПКС у растений, неожиданно оказался представитель субтилизин-подобного семейства протеиназ, названный в соответствии с выявленной функцией и проявляемой активностью фитаспазой (Chichkova et al., 2010). Кроме того, опубликованы данные еще о двух возможных функциональных аналогах каспаз животных у растений (SAS-1 и SAS-2), оба из которых обладают высокой, похожей на каспазы субстрат специфичностью, но так же, как и фитаспаза, являются сериновыми протеиназами и относятся к семейству субтилаз (Coffeen and Wolpert 2004).

Несмотря на то, что у животных известно более тысячи природных субстратов каспаз (Crawford et al., 2013), у растений охарактеризован единственный природный субстрат протеиназ, обеспечивающих развитие ПКС в растениях. Им является субстрат фитаспазы - белок VirD2 из патогенной бактерии растений Agrobacterium tumefaciens. VirD2 ответственен за доставку фрагмента бактериальной ДНК в ядро зараженной клетки. Его процессинг, осуществляемый фитаспазой, в результате которого VirD2 лишается С-концевого сигнала локализации в ядро, может являться проявлением систем активной защиты клетки растений от нежелательной трансформации (Chichkova et al., 2010). Однако данная активность фитаспазы не связана с процессами развития ПКС. К настоящему времени также охарактеризовано по одному субстрату метакаспаз у дрожжей и у мицелиальных грибов. Ими являются белки GAPDH и PARP, соответственно (Silva et al., 2011; Strobel and Osiewacz 2013). Интересно, что у животных их гомологи

являются субстратами каспаз, из чего, скорее всего, следует, что процессы развития ИКС по составу деградома имеют достаточно высокую степень консервативности.

2.1.1. Метакаспаза ели норвежской mcII-Pa и каспазы обладают различной субстрат-специфичностью.

Для проведения работы рекомбинантная метакаспаза ели норвежской mcII-Pa (Suarez et al., 2004) была экспрессирована в бактериальных клетках. Оказалось, что выделяемый после экспрессии зимоген mcII-Pa аутокаталитически процессируется в 2-х сайтах: (i) после Arg-188, отделяя таким образом р20 каспаза-подобную субединицу от линкера, специфичного для метакаспаз, тип II, и (п) после Lys-269, разделяя линкер и рЮ каспаза-подобную субъединицу (Рис. 1. А). Для исследования субстрат-специфичности метакаспазы mcII-Pa были поставлены тесты in vitro с использованием синтетических флуоресцентных пептидных субстратов (Рис. 1. Б). Несмотря на то, что рекомбинантная mcII-Pa была способна расщеплять субстраты и с Arg, и с Lys в позиции PI, активность метакаспазы при расщеплении субстратов, содержащих Arg, была в 25-50 раз выше, чем для

Рис. 1. Метакаспаза ели норвежской гас11-Ра является аргинин/лизин-специфичной иистеиновой протеиназой. (А) Схематическое изображение метакаспазы ели норвежской mcII-Pa. Зимоген mcII-Pa состоит из р20 каспаза-подобной субъединицы, содержащей каталитический Cys-139, линкерного региона и р 10 каспаза-подобной субъединицы. Аутокаталитический протеолиз рекомбинантной mcII-Pa расщепляет белок в двух местах: после Arg-188 и Lys-269. (Б) Исследование субстрат-специфичности рекомбинантной mcII-Pa с помощью пяти различных синтетических флуоресцентных субстратов, содержащих Arg, Lys или Asp в позиции Pl. (В) Вестерн-блот, иллюстрирующий аутокаталитический протеолиз mcII-Pa и отсутствие аутокаталитического протеолиза у мутанта mcII-Pa С139А. Биохимические особенности mcII-Pa: влияние Са2+ (Г), pH (Д), Zn2+ (Е) на активность mcII-Pa, а также определение действия различных ингибиторов протеиназ на активность фермента (Ж). Вертикальные отрезки на гистограммах -стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

субстратов, содержащих Lys (Рис. 1. Б). Интересно, что ни один из протестированных субстратов, обычно расщепляемых каспазами (Asp в позиции Р1), не расщеплялся mcII-Pa (Рис. 1. Б), что подтверждает тот факт, что метакаспазы у растений имеют субстрат-специфичность отличную от каспаз (Vercammen et al., 2004; Watanabe et al., 2005). Несмотря на то, что активность каспаз, как правило, не зависит от концентрации ионов Са + (Stennicke et al., 1997), в проведенных экспериментах выяснилось, что для аутоактивации метакаспазы mcII-Pa необходимо присутствие миллимолярных концентраций Са2+ (оптимум при 50 мМ Са2+; Рис. 1. Г). mcII-Pa, подобно каспазам животных, обладает наибольшей протеолитической активностью при нейтральных рН, но, в отличие от каспаз, более чувствительна к наличию ионов Zn2+ (Рис. 1. Д, Е). Протеолитическая активность метакаспазы mcII-Pa не может быть ингибирована с помощью специфических ингибиторов каспаз, но в то же время активность mcII-Pa может быть ингибирована леупептином, Ыа-тозил-Ь-лизин-сшк, а также специально синтезированным ингибитором для mcII-Pa - H-EGR-cmk (Рис. 1. Ж). Мутантный белок mcII-Pa С139А, содержащий в первичной структуре аминокислотный остаток Ala вместо каталитического Cys, свойственного всем представителям суперсемейства цистеиновых протеиназ, не обладал протеолитической активностью при расщеплении Вос-ЕСЯ-амидо-4-метил кумарина, который наиболее эффективно расщеплялся метакаспазой дикого типа. Таким образом, можно сделать вывод о том, что метакаспаза ели норвежской mcII-Pa является аргинин/лизин-специфичной цистеиновой протеиназой.

2.2. Протеолитическая активность метакаспазы растений mcII-Pa

необходима для развития ПКС.

2.2.1. Протеолитическая активность mcII-Pa необходима для эмбриогенеза.

У всех голосеменных суспензор эмбриона состоит из нескольких слоев терминально дифференцированных клеток. Клетки суспензора образуются за счет асимметричного деления клеток эмбриональной массы, которая является функциональным аналогом эмбриона покрытосеменных (Bozhkov et al., 2005; Singh, 1978). Клетки суспензора не проходят деление, т.к. в них сразу начинают развиваться процессы ПКС. В клетках, расположенных ближе к эмбриональной массе, только начинают развиваться процессы ПКС, в то время как в более отдаленных от эмбриональной массы клетках суспензора развиваетие ПКС происходит все сильнее и сильнее, образуя своего рода градиент из клеток, в которых прогрессируют различные стадии развития ПКС (Рис. 2.). В итоге базальные клетки суспензора представляют собой только остатки клеточной стенки (Bozhkov et al., 2005; Smertenko et al., 2003). Таким образом, эмбрион ели является уникальной модельной системой, в которой можно наблюдать сразу все стадии развития ПКС (Рис. 2.). Более того, учитывая положение отдельной взятой клетки в суспензоре, можно судить о стадии развития ПКС в этой клетке.

Для исследования роли метакаспаз в регуляции ПКС при морфогенезе была использована модель соматического эмбриогенеза P. abies. Система соматического эмбриогенеза повторяет нормальное развитие зиготы. При этом с помощью

факторов роста при соматическом эмбриогенезе можно синхронизировать этапы развития эмбрионов, что удобно при проведении экспериментов (Goldberg et al., 1994; Filonova et al., 2000). Ранее было показано, что снижение экспрессии метакаспазы с помощью РНК-интерференции в процессе развития соматического эмбриогенеза ели норвежской приводит к увеличенной пролиферации эмбриональной массы, но в то же время блокирует дифференцировку суспензора (Suarez et al., 2004). В настоящей работе степень развития ПКС оценивалась по количеству клеток с фрагментированной ядерной ДНК (Рис. 3. А). Полученные данные показывают, что степень развития ПКС в линии со сниженной экспрессией метакаспазы в 4 раза ниже, чем в линии дикого типа. В этой линии Arg-специфичная протеолитическая активность также была значительно снижена

Ядро

TUNEL-позитивные, дольчатые и сегментированные ядра Аппарат Гольджи

Пропластиды

Аутофагасомы и

литические вакуоли Актиновые филаменты

Микротрубочки

MAP-65-связанные микротрубочки

Рис. 2. Развитие ПКС при эмбриогенезе ели норвежской (справа налево). От эмбриональной массы (ЭМ; стадия 0) до базального полюса суспензора располагаются клетки суспензора, находящиеся в разных стадиях развития ПКС (стадии 1-У) (по ВогИкоу е/ ей., 2005).

(Рис. 3. А), что, вероятно, указывает на возможное наличие других активированых А^-специфичных протеаз в используемой модельной системе. Интересно, что аналогичное снижение количества ТИЫЕЬ-позитивных клеток и снижение Ащ-специфичной протеолитической активности наблюдалось также и в ранее охарактеризованной линии (РПопоуа ег а/., 2000), в которой не происходит дифференцировка суспензора (Рис. 3. Б). Также интересно, что в данной линии не удавалось выявить продукты аутокаталитического расщепления метакаспазы с помощью вестерн-блота с использованием антител к тс11-Ра (Рис. 3. Б). Вероятно, эта линия обладает некоторым дефектом, связанным с активностью тсП-Ра. Обобщая полученные результаты, можно сделать вывод о том, что развитие ПКС в модельной системе соматического эмбриогенеза зависит от протеолитической активности метакаспазы шсП-Ра.

Зимоген- -

Линкер ♦ рЮ-j p20-á

¡I е-

!§3-

5 10 15

Время(мин)

2 3

г s 6

5 10 Время[мин)

Линкер * р10— —

Рис 3. Развитие ПКС зависит от активности метакаспазы mcII-Pa. (А) Исследование количества TUNEL-позитивных клеток, вестерн-блот с использованием анти-гпсП-Ра антител и исследование «EGR-азной» активности при соматическом эмбриогенезе ели норвежской дикого типа и линии, в которой экспрессия гена mcII-Pa была снижена с помощью системы умолкания генов (сайленсинг mcII-Pa). (Б) Количество TUNEL-позитивных клеток, вестерн блот с использованием анти-шсП-Ра антител и исследование «EGR-азной» активности при соматическом эмбриогенезе ели норвежской дикого типа и для ранее охарактеризованной линии (Filonova et al., 2000), в которой не происходит дифференцировка суспензора (неразвивающаяся линия). Вертикальные отрезки на гистограммах - стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

2.2.2. Метакаспаза mcII-Pa накапливается в ядрах отмирающих клеток.

В экспериментах с соматическими эмбрионами ели норвежской наблюдалось изменение внутриклеточной локализация метакаспазы mcII-Pa в зависимости от степени развития ПКС. Для одновременного мониторинга степени фрагментации ДНК образцы кроме окраски с помощью антител к mcil-Pa также окрашивались DAPI и TUNEL, окрашивающими ядра и фрагментированную ДНК, соответственно. Метакаспаза mcII-Pa обнаруживалась во всех клетках эмбриона (Рис. 4. А). Однако в TUNEL-позитивных клетках суспензора прокрашивание с помощью антител к mcII-Pa выявляло значительно более высокий уровень сигнала по сравнению с уровнем детектируемого сигнала в клетках эмбриональной массы

(Рис. 4. А). Дальнейший анализ эмбрионов с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии приводил к идентификации двух различных типов иммунолокализации шсП-Ра, которые также коррелировали со степенью ядерной деградации в клетках суспензора (Рис. 4. Б). В клетках с фрагментированной ДНК, но все еще обладающих интактной ядерной оболочкой, тс11-Ра детектировалась на периферии ядра и в околоядерной цитоплазме, в то время как в клетках с деградированной ядерной оболочкой шсП-Ра детектировалась, в основном, внутри ядра (Рис. 4. Б).

Для дальнейшей проверки феномена ядерной локализации метакаспазы шсП-Ра во время развития ПКС был использован метод иммуноэлектронной микроскопии с частицами коллоидного золота. В клетках эмбриональной массы, клетках суспензора, в которых только начинаются процессы ПКС, и в клетках из средней части суспензора частицы коллоидного золота обнаруживались как в цитоплазме, так и в ядре (клетки с более развитым процессом ПКС не анализировались, т.к. в этих клетках практически не остается цитоплазмы, а весь

A DAPI TUNEL Анти-mcll-Pa Суперпозиция Б к DAPI TUNEL Анти-mcll-Pa

Рис 4. Метакаспаза mclI-Pa колокализуется с фрагментированной ДНК в клетках суспензора. (А) Флуоресцентная микроскопия целого эмбриона, окрашенного DAPI (синий канал), с помощью TUNEL (красный канал) и с помощью антител к шсП-Ра (зеленый канал). (Б) Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эмбриональной массы (верхний ряд), морфологически интактных клеток суспензора (средний ряд) и клеток суспензора с деградированной ядерной оболочкой (нижний ряд). Масштабная линейка — 100 мкм (А) и 10 мкм (Б).

клеточный объем заполнен вакуолями). При этом, количество золотых частиц относительно единицы анализируемой площади увеличивалось в клетках с более выраженными проявлениями ПКС. Более того, соотношение количества частиц коллоидного золота в ядре относительно количества частиц в цитоплазме увеличивалось по мере развития ПКС: от 0,6 в клетках эмбриональной массы, доходя до 1,7-2,0 в клетках из средней части суспензора (Рис 5.). В цитоплазме клеток суспензора, частицы были сосредоточены вокруг ядерной оболочки, тогда как практически все частицы золота в ядрах были связаны с электронно-плотными

участками хроматина (Рис 5.)- В то же время частицы коллоидного золота не обнаруживались в аутофагических вакуолях, которые являются типичными органеллами аутофагической ПКС. Такой результат хорошо согласуется с наблюдениями о том, что для катализа метакаспазе тс11-Ра требуются условия с нейтральным или близким к нейтральным рН, в то время как содержимое вакуоли, как правило, имеет кислый рН. Таким образом, полученные данные по локализации метакаспазы тс11-Ра в развивающемся эмбрионе указывают на то. что в процессе развития ПКС метакаспаза тс11-Ра транслоцируется из цитоплазмы в ядро.

Цитоплазма Ядро

Рис. 5. Метакаспаза mcII-Pa в процессе развития ПКС в клетках суспензора эмбриона ели норвежской транслоцируется из цитоплазмы в ядро. Репрезентативное изображение эмбриона ели норвежской (левая фотография, масштабная линейка - 100 мкм), использованного для иммуноэлектронной микроскопии с антителами к mcIi-Pa (центральная панель фотографий). Верхний ряд центральной панели - иммуноэлектронная микроскопия эмбриональной массы. Нижний ряд центральной панели - суспензор. Масштабная линейка на микрофотографиях, иллюстрирующих ультраструктуру клеток -5 мкм; на микрофотографиях, иллюстрирующих ультраструктуру ядра и цитоплазмы -200 нм. Гистограмма (справа) - количество частиц коллоидного золота в ядре и цитоплазме клеток эмбриональной массы, начальной и средней частей суспензора. Вертикальные отрезки на гистограммах - стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов, п - ядро, v - вакуоль, звездочкой отмечена аутофагосома.

2.2.3. Протеолитически активная метакаспаза mcll-Pa индуцирует деградацию ядра.

Основываясь на полученных данных о том, что метакаспаза mcll-Pa необходима при индукции процессов ПКС in vivo, а также о том, что метакаспаза mcll-Pa накапливается в ядрах погибающих клеток (см. выше), было решено проверить влияние метакаспазы mcll-Pa на сохранение интактности ядра in vitro. Для этого была разработана специальная бесклеточная система. При этом использовались клеточные ядра, выделенные из линии, в которой не происходит дифференцировка суспензора (Filonova et al., 2000). Инкубация таких ядер с клеточными экстрактами, приготовленными из эмбриональных клеток линии

дикого типа не приводила к увеличению количества ядер с фрагментированной ДНК (Рис. 6. А). Однако добавление активной рекомбинантной метакаспазы значительно увеличивало количество Т1ЖЕЬ-позитивных ядер, в то время как присутствие в реакционной смеси ингибитора метакаспазы Н-ЕОК-стк значительно снижало эффект, индуцированный метакаспазой тс11-Ра (Рис. 6. А). В то же время как и предполагалось, количество ядер, содержащих фрагментированную ДНК, не увеличивалось по сравнению с контролем при добавлении в реакционную смесь неактивного мутанта тс11-Ра С139А (Рис. 6. А).

В ходе экспериментов в бесклеточной системе также было выявлено, что фрагментация ДНК сопровождается характерными для ПКС изменениями в морфологии ядер. Такие изменения морфологии обычно происходят в три стадии: (О ядро становится дольчатым, (и) происходит конденсация хроматина, (ш) происходит полная ядерная деградация (Шопоуа е1 а1., 2000). Для визуализиции этих стадий использовался краситель ОАР1 (Рис. 6. Б). При наличии активной

£ норма дольчатое конденсация деградация

DAPI

клеточный экстракт — + + + +

mcll-Pa — — + + —

H-EGR-cmk — — — + —

mcll-Pa С139А — — — — +

TUNEL

дольчатое

ч 2

клеточный экстракт mcll-Pa H-EGR-cmk mcll-Pa С139А

конденсация хроматина

деградация

2.5

■Jíé^ÍÍIL

+ + + + — + + —

Рис. 6. Метакаспаза шс11-Ра индуцирует деградацию ядер в бесклеточной системе. В

всех экспериментах использовались ядра, выделены из линии, в которой не происходит дифференцировка суспензора. (А) Количество ядер, содержащих фрагментированную ДНК, при их инкубации с клеточным экстрактом из линии дикого типа, с рекомбинантной mcll-Pa в присутствии или отсутствии ингибитора H-EGR-cmk, а также с мутантом mcll-Pa С139А. (Б) Репрезентативные примеры нормального изолированного клеточного ядра и ядер проходящих три стадии деградации: дольчатое ядро, ядро с конденсированным хроматином и деградированное ядро при двойной окраске с помощью DAPI и TUNEL. (В) Количество ядер проходящих три стадии деградации при их инкубации с клеточным экстрактом линии дикого типа, с рекомбинантной mcll-Pa в присутствии или отсутствии ингибитора H-EGR-cmk, а также с мутантом mcll-Pa С139А. Вертикальные отрезки на гистограммах - стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

метакаспазы шс11-Ра в бесклеточной системе, как выяснилось, в разы увеличивается количество ядер, проходящих каждую из трех стадий деградации по сравнением с контролями (Рис. 6. В). Этот эффект значительно снижался при добавлении ингибитора метакаспазы Н-НОК-сшк (Рис. 6. В). Использование в бесклеточной системе неактивного мутанта тс11-Ра С139А, как и ожидалось, не приводило к увеличению количества деградирующих ядер и не отличалось по этому параметру от контрольных экспериментов (Рис. 6. В).

2.3. Белок TSN является консервативным компонентом деградома растений и животных.

2.3.1. Белок PaTSN расщепляется метакаспазой шс11-Ра in vitro.

Для поиска возможных природных субстратов метакаспазы mcII-Pa использовалась база данных белков, кодируемых геномом Arabidopsis thaliana L. Алгоритм поиска включал в себя определение наличия в аминокислотных последовательностях кандидатов сайтов протеолиза mcII-Pa. Одним из найденных с помощью такого поиска потенциальных кандидатов оказался многофункциональный белок TSN (Tudor staphylococcal nuclease; tudor-sn; SND1; plOO). Белок TSN является высококонсервативным белком, который экспрессируют самые разнообразные живые организмы, включая бактерии, протистов, грибы, растения и животных. Для проверки гипотезы о том, что TSN может являться природным субстратом метакаспазы mcII-Pa, была клонирована кДНК TSN из ели норвежской и получен рекомбинантный белок (PaTSN). В ходе проведенного протеолиза белка PaTSN с помощью метакаспазы mcII-Pa in vitro выяснилось, что mcII-Pa способна гидролизовать PaTSN. При этом при полном расщеплении белка PaTSN образуется пять фрагментов (Рис. 7.). Ингибитор метакаспазы H-EGR-cmk, как и ожидалось, блокировал процесс протеолиза PaTSN метакаспазой. Гидролиз PaTSN также не катализировался с помощью мутанта метакаспазы mcII-Pa С139А (Рис. 7. А). Определение аминокислотных последовательностей N-терминальных областей фрагментов PaTSN с помощью белкового сиквенирования позволило определить точные положения четырех сайтов расщепления. Как выяснилось, все определенные сайты содержат Arg или Lys в позиции PI (Рис. 7. Б).

2.3.2. Белок PaTSN является субстратом шс11-Ра при развитии ПКС в ходе эмбриогенеза.

Для исследования процесса расщепления PaTSN метакаспазой mcII-Pa in vivo была использована модельная система развития ПКС в ходе эмбригенеза ели норвежской. Перед началом эксперимента дополнительно была охарактеризована активность метакаспазы mcII-Pa при прохождении эмбрионом основных четырех стадий развития: стадии недифференцированных эмбриональных клеток, стадии раннего эмбриона, стадии позднего эмбриона и стадии зрелого эмбриона (Рис. 8. А, Б). Наивысшая активность метакаспазы mcII-Pa детектировалась на стадии раннего эмбриона, состоящего из эмбриональной массы и отмирающего суспензора.

108.8

Рис. 7. Белок PaTSN расщепляется метакаспазой mcII-Pa in vitro. (А)

Электрофореграмма, иллюстрирующая результат инкубирования PaTSN с рекомбинантной mcII-Pa, с рекомбинантной mcII-Pa в присутствии ингибитора метакаспазы H-EGR-cmk или в присутствии каталитически неактивного мутанта метакаспазы mcII-Pa С139А. Молекулярные массы полученных фрагментов PaTSN рассчитывались, исходя из результатов пептидного сиквенирования. Справа схематически представлены полноразмерный PaTSN и его фрагменты, образуемые в процессе протеолитического расщепления, катализируемого метакаспазой mcII-Pa (Б) Схематическое изображение доменной структуры PaTSN и отображение четырех сайтов протеолиза (стрелки).

Наименьшая активность метакаспазы mcII-Pa детектировалась в зрелых эмбрионах, которые уже практически не содержат отмирающих клеток (Рис. 8. Б). Протеолиз нативного PaTSN, определяемый in vivo с помощью поликлональных антител к PaTSN, полностью коррелировал с детектируемой активностью метакаспазы mcII-Pa (Рис. 8. Б). В наибольшей степени протеолиз белка PaTSN наблюдался в ранних эмбрионах, в то время как в зрелых эмбрионах продукты протеолиза PaTSN не выявлялись (Рис. 8. Б). В серии экспериментов с развивающимися эмбрионами детектируемые фрагменты PaTSN соответствовали по молекулярным массам фрагментам PaTSN, полученным при расщеплении белка с помощью метакаспазы mcII-Pa in vitro (Рис. 7. А; Рис. 8. Б). Таким образом, можно сделать вывод о том, что метакаспаза mcII-Pa протеолитически расщепляет PaTSN, распознавая одни и те же сайты как in vivo, так и in vitro.

Далее проводился анализ активности метакаспазы шсН-Ра и анализ продуктов расщепления РаТЗЫ в хирургически разделенных эмбриональных массах и суспензорах. Проведенные эксперименты показали, что активность метакаспазы в отмирающих суспензорах в 10 раз выше, чем в живых клетках эмбриональной массы (Рис. 8. В). Соответственно, и продукты расщепления РаТ8К детектировались только в суспензорах, в то время как в эмбриональной массе

•О

Б у 600

1 ¡ 400 _

gl 300. I

ü1 5 200 tÉ I ■

Ii Hl.

с: л 0 И И И И

/М,(К) S а с п

47.740.6"

ЭМ Суспензор

< ?

¿ § 600

i i

M,(K) 108.8-168.247.740.631.1-

100 о

f г

Tí s =

М,(К) '

17.2--

Рис. 8. Белок PaTSN является субстратом шсН-Ра при развитии ПКС в ходе эмбриогенеза. (А) Схематическое изображение типичного синхронизированного развития соматического эмбриона Picea abies L. Пролиферация эмбриональных клеток запускается факторами роста (ауксин и цитокинин; GF). Дальнейшее развитие раннего эмбриона индуцируется отсутствием в среде факторов роста. Ранние эмбрионы состоят из живой эмбриональной массы и отмирающего суспензора. Поздний эмбриогенез и окончательное созревание зрелого эмбриона происходит в присутствии абсцизовой кислоты (ABA). В процессе позднего эмбриогенеза суспензор окончательно отмирает. (Б-Г) Расщепление эндогенного PaTSN (вестерн-блоты с использованием поликлональных антител к mcIl-Pa) коррелирует с активностью mcII-Pa (гистограммы). Активность метакаспазы измерялась с помощью АМС-конъюгированного FESR-пептида. (Б) Образцы отбирались через 7 дней после начала инкубирования культуры с факторами роста (эмбриональные клетки), через 7 дней после окончания инкубирования с факторами роста (ранние эмбрионы), еще через 7 дней (поздние эмбрионы) и через 35 дней (зрелые эмбрионы) после начала инкубирования с абсцизовой кислотой. (В) Анализ образцов после хирургического разделения эмбриональной массы (ЭМ) и суспензора раннего эмбриона. (Г) Анализ образцов дикого типа и двух линий, в которых экспрессия mcII-Pa была снижена с помощью РНК-интерференции (РНКи mcII-Pa 1 и РНКи mcII-Pa 2). Вертикальные отрезки на гистограммах - стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

обнаруживался только полноразмерный PaTSN (Рис. 8. В). Расщепление PaTSN в линиях, в которых экспрессия метакаспазы mcII-Pa была снижена с помощью РНК-интерференции, происходило менее эффективно, чем в линии дикого типа, и коррелировало со детектируемой протеолитической активностью mcII-Pa (Рис. 8. Г). Таким образом, можно сделать вывод о том, что PaTSN расщепляется in vivo метакаспазой mcII-Pa, а также о том, что PaTSN является компонентом деградома при развитии ПКС, происходящей во время эмбриогенеза.

2.3.3. Белок PaTSN является субстратом mcII-Pa при развитии ПКС, индуцированной стрессом.

Для проверки того, является ли PaTSN частью деградома ПКС, индуцированной стрессом, эмбриональные клетки ели норвежской обрабатывались перекисью водорода в присутствии факторов роста, блокирующих формирование эмбриона и развитие ПКС, связанной с эмбриогенезом. В таком эксперименте активность метакаспазы увеличивалась в течении 12 часов после начала эксперимента, а потом плавно снижалась, параллельно с развитием ПКС (Рис. 9.). Увеличению активности mcII-Pa сопутствовало увеличение степени расщепления эндогенного PaTSN. При этом, детектируемые фрагменты оказались аналогичными по молекулярной массе фрагментам, выявленным при расщеплении PaTSN in vitro, а также фрагментам, наблюдаемым при расщеплении PaTSN в процессе развития ПКС при эмбриогенезе. Таким образом, можно заключить, что PaTSN является частью деградома как в случае ПКС, развивающейся в процессах морфогенеза, так и в случае ПКС, индуцированной стрессом.

"í £

tZ CD

С/3 ю

LU !=

LL 2

¡¡

<D 5

s £

0> 3

3 5

£ c

nj ^

800.

600

400

200

Ir ill

■ ■ ■ □ Контроль

И I И I И I И инд

6 12 24 48 Время (ч)

мг(К) 108.8 4

Время (ч)

0 6 12 24 48

Рис. 9. Белок PaTSN является субстратом ш с11-Ра при развитии ПКС, индуцированной стрессом. Активность метакаспазы тс11-Ра (гистограмма) и уровень расщепления РаТБЫ (вестерн-блот) в процессе развития ПКС, индуцированной стрессом. Факторы роста, ингибирующие развитие ПКС, связанной с эмбриогенезом, и перекись водорода добавлялись в точке 0. Далее образцы отбирали и анализировали через 0, 6, 12, 24 и 48 часов после начала эксперимента. Активность метакаспазы измерялась с помощью АМС-конъюгированного РЕ8К-пептида. Вертикальные отрезки на гистограммах -стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

2.3.4. Белок человека HsTSN расщепляется каспазой-3 in vitro.

При анализе аминокислотной последовательности TSN человека (HsTSN) была выявлена последовательность DAVD 790, которая является известным сайтом, распознаваемым и расщепляемым ферментами, относящимися к семейству каспаз. В первичной структуре белка HsTSN последовательность DAVD располагается между последовательностью домена TUDOR и последовательностью пятого домена стафилококковой нуклеазы SN5 (Рис. 10. А). При проведении реакции in vitro выяснилось, что рекомбинантный HsTSN расщепляется каспазой-3 на два фрагмента с молекулярными массами примерно 90 и 10 кДа (Рис. 10. Б). Определение N-терминальных аминокислотных последовательностей изолированных белковых фрагментов с помощью белкового секвенирования подтвердило, что HsTSN процессировался каспазой-3 в месте расположения DAVD 790 мотива.

-В- 10.7 ►

Рис. 10. Белок HsTSN расщепляется каспазой-3 in vitro. (А) Схематическое изображение доменной структуры HsTSN. Мотив DAVD, распознающийся каспазой-3, располагается между доменами TUDOR и SN5. (Б) Расщепление HsTSN in vitro. HsTSN инкубировался отдельно (Буфер), в присутствии каспазы-3, или в присутствии каспазы-3 и ингибитора каспазы-3 DEVD-CHO. Белки разделялись с помощью ПААГ и окрашивались кумасси. Молекулярные массы были рассчитаны на основе данных, полученных с помощью N-терминального белкового сиквенирования.

2.3.5. Белок HsTSN расщепляется при развитии ПКС, индуцированной различными агентами, в культурах клеток человека.

При индукции апоптоза в культуре клеток карциномы человека НСТ116 с помощью флуороурацила (5ри) детектировалось увеличение активности каспазы-3

(Рис. 11. А). В то же время наблюдалось увеличение количества расщепленного эндогенного HsTSN, что было выявлено путем детекции с помощью поликлональных антител к HsTSN двух фрагментов, которые были аналогичны по молекулярной массе фрагментам, наблюдаемым при расщеплении рекомбинантного HsTSN в экспериментах in vitro (Рис. 11. А, Рис. 10. Б). Такой эффект оказался неспецифичным по отношению к конкретной клеточной линии или к определенному индуктору апоптоза, т.к. он воспроизводился в модельной системе, в которой использовалась культура клеток HeLa, а индуктором апоптоза являлся камптотецин (СРТ; Рис. 11. Б). Однако в модельной системе с индуцированным апоптозом в клетках HeLa продукты протеолиза не детектировались при эксперессии мутантного HsTSN D790E, или в случае, когда экспрессировался белок HsTSN дикого типа, но клетки были дополнительно

СРТ - -

zVAD-fmk

мг(К)

99.7-'

89.0-

Мс( К) »L99.7 -89.0

а z

10.7-

Рис. 11. Белок HsTSN расщепляется при развитии ПКС, индуцированной различными агентами, в культурах клеток человека. (А) Воздействие флуороурацила (5FU; 50 мкг/мл) на культуру клеток карциномы человека НСТ116 приводит к активации активности каспазы-3 (гистограмма) и индуцирует фрагментацию эндогенного HsTSN (вестерн-блот с использованием поликлональных антител к TSN). (Б) zVAD-fmk (15 мкМ) блокирует фрагментацию HsTSN. Вестерн-блот белковых экстрактов из культуры клеток HeLa и из этой же культуры, обработанной камптотецином (СРТ; 5 мкМ), с использованием анти-TSN поликлональных антител. (В) Мутация Asp 790 ингибирует расщепление HsTSN. Вестерн-блот с использованием анти-FLAG антител экстрактов из культуры клеток HeLa, трансфецированных эксперессионным вектором, не содержащим экспрессируемого гена, содержащим ген HsTSN, слитым с FLAG, или содержащим ген мутантного белка HsTSN D790E, слитым с FLAG. В слитных белках FLAG находился на N-конце. Вертикальные отрезки на гистограммах - стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

обработаны ингибитором каспаз zVAD-флуорометилкетоном (zVAD-fmk; Рис. 11. Б, В). Данные об отсутствии протеолиза мутантного HsTSN D790E говорят в пользу того, что HsTSN дикого типа действительно процессируется в сайте DAVD 790, в то время как данные об отсутствии протеолитического расщепления в присутствии каспазного ингибитора zVAD-fmk указывают на то, что при индукции апоптоза белок HsTSN дейстивтельно гидролизуется при участии протеолитической активности каспаз. Таким образом, можно заключить, что в проведенных экспериментах был впервые выявлен новый компонент деградома ПКС в клетках человека, которым оказался белок HsTSN.

2.3.6. Белок HsTSN необходим для поддержания выживаемости клеток.

Физиологическое значение HsTSN в процессах выживания и апоптоза клеток исследовалось с помощью культур клеток человека, трансфецированных экспрессионным вектором, содержащим ген мутантного нерасщепляемого HsTSN D790E. Экспрессия HsTSN D790E в стандартных условиях приводила к усилению пролиферации клеток в культуре опухолевых клеток (HeLa) и в эмбриональной культуре клеток (НЕК293) по сравнению с контрольными культурами или культурами, трансфецированными экспрессионным вектором, содержащим HsTSN дикого типа (Рис. 12. А, Б; Р < 0.05). Индукция апоптоза с помощью СРТ показала, что клетки линии HeLa, экспрессирующие мутантный HsTSN D790E, выживают значительно лучше, чем контрольные (Рис. 12. В).

После получения данных о том, что нерасщепляемый HsTSN D790E стимулирует пролиферацию клеток и защищает клетки от апоптоза, была разработана система с использованием коротких интерферирующих РНК (siRNA; киРНК) к HsTSN. Такие киРНК были использованы для снижения уровня экспрессии эндогенного HsTSN в клетках HeLa. Клетки со сниженным уровнем экспрессии HsTSN оказались гораздо более чувствительны к индукции апоптоза с помощью СРТ. Апоптоз в этих клетках сопровождался резким увеличением активности каспазы-3 (в 7,9±2,9 раз), что приводило к увеличению детектируемых количеств расщепленного PARP и ламина-А (в 3,7±0,5 раз и 6,7±2,9 раз, соответственно) (Рис. 12. Г). Более того, снижение уровня экспрессии белка HsTSN приводило к индукции апоптоза даже без наличия СРТ. Детекция маркеров апоптоза, таких как процессировання каспаза-3, фрагментированный PARP и фрагментированный ламин-А, показала их резкое увеличение в 7,7±1,9, 6,1±1,3 и 11±1,9 раз, соответственно (Рис. 12. Г). Таким образом, исходя из полученных данных можно сделать вывод о том, что экспрессия белка HsTSN является необходимым условием, обеспечивающим выживаемость по крайней мере некоторых клеток человека.

2.3.7. Белок PaTSN необходим для поддержания выживаемости клеток развивающегося эмбриона ели.

Обработка ранних эмбрионов ели норвежской pdTp (3% 5'-дезокситимидин бисфосфат, ингибитор нуклеазной активности SN; Scadden, 2005) приводила к увеличению количества клеток в эмбриональных массах, содержащих

О 24 48 Время (ч)

ш III

о <)

ст> О)

г- N.

о С О

о г г о / X

СО СО (О СО

1- (- X 1- 1-

сл <Л о (Л У)

X X X X

— —^Пад-НэТЭМ ——Нсзрню

24 ч

48 ч

Flag-HsTSN вЗРИЮ

Г" Контрольная киРНК + - + -

ГЭЛ/киРИК - + + +

ОМЭО + + - -

СРТ - - + +

НвТБЫ

1 Процессированная каспаза-3, 19К

Фрагмент РАКР, 89К ттт Фрагмент яамина-А, 28К

вЗРИО

Рис. 12. Экспрессия белка HsTSN необходма для поддержания выживаемости клеток.

(А, Б) Экспрессия мутантного белка НвТЗЫ 0790Е увеличивает пролиферацию клеток. (А) Количество клеток линии НеЬа, трансфецированных указанными конструкциями. Только клетки, трансфецированные ШТ8К В790Е, пролиферировали лучше, чем контрольные (/><0,05). Для полуколичественного определения экзогенного Е^ТБЫ в образцах использовался вестерн блот с анти-Р^ антителами. Для нормирования нанесения экспериментальных образцов использовалось полуколичественное определение вЗРОН. (Б) Рост клеток линии НЕК293 после трансфекции экспрессионными векторами содержащими ген белка НвТЗЫ или его мутанта НзТЗЫ Э790Е. Вестерн блот с анти-РЬАО антителами иллюстрирует количество экзогенного НвТБЫ в образцах. Определение

TUNEL

DAPI

Контроль pdTp dTp

Рис. 13. Нуклеазная активность белка PaTSN необходима для обеспечения выживаемости клеток эмбриональной массы в развивающихся эмбрионах ели норвежской. Культивирование ранних эмбрионов на стадии отмены факторов роста проводилось в присутствии специфического ингибитора стафилококковой нуклеазы pdTp (500 мкмМ) или в присутствии неактивного аналога dTp (500 мкМ). Через четыре дня после начала культивирования проводился анализ клеток на наличие фрагментированной ДНК с помощью TUNEL. (А) Пример эмбриональной массы, содержащей TUNEL-позитивные клетки. Масштабная линейка - 50 мкм. (Б) Частота встречаемости TUNEL-позитивных клеток в эмбриональных массах. Эмбриональная масса считалась TUNEL-позитивной при наличии, как минимум, двух TUNEL-позитивных ядер. Вертикальные отрезки на гистограммах - стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

фрагментированную ДНК (Рис. 13.). Из этого эксперимента можно сделать вывод о том, что функциональный РаТБЫ, обладающий свойственной ему нуклеазной активностью, является необходимым при обеспечении выживаемости клеток в эмбриональной массе развивающегося эмбриона ели норвежской.

2.3.8. Протеолиз TSN эффекторнымн протеиназами ПКС снижает нуклеазную активность белка.

Как было показано, в первую очередь, для животных, TSN является мультифункциональным белком. Белок Т8М способен активировать транскрипцию,

Рис. 12. (продолжение подписи) G3PDH проводилось для нормирования при нанесении других образцов. (В) Экспрессия мутантного белка HsTSN D790E ослабляет развитие процессов апоптоза. Гистограмма отражает данные о выживании клеток линии HeLa, трансфецированных указанными конструкциями, через 24 часа после индукции апоптоза с помощью СРТ (5 мкМ). (Г) Снижение экспрессии HsTSN с помощью киРНК активирует процессы апоптоза. Вестерн-блоты с использованием антител к TSN, каспазе-3, PARP и ламину-А. Определение G3PDH проводилось для нормирования образцов при нанесении. Вертикальные отрезки на гистограммах — стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

белок является активатором сплайсинга, а также, являясь компонентом РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC) и стрессорных гранул, белок TSN посредством нуклеазной активности участвует в деградации инозин-содержащих дуплексов РНК, включая микроРНК предшественники, отредактированные белками из семейства аденозиновых деаминаз ADAR (Caudy et al., 2003; GarciaLopez et al., 2013; Scadden, 2007; VSlineva et al., 2005; Yang et al., 2002; 2007). Для проверки того, влияет ли фрагментация TSN на функциональные свойства белка был проведен опыт, направленный на определение нуклеазной активности белка TSN, а также его фрагментов, полученных после протеолитического расщепления белка HsTSN с помощью каспазы-3, или белка PaTSN с помощью метакаспазы mcll-Pa. В качестве субстрата была использована одноцепочечная РНК (оцРНК; Рис. 14.). При проведении этого эксперимента было также выявлено, что рибонуклеазная активность HsTSN и PaTSN может быть ингибирована pdTp (3', 5'-дезокситимидин бисфосфат), который является известным ингибитором стафилококковой нуклеазы (SN), но не зависит от присутствия в реакционной смеси dTp (З'-дезокситимидин монофосфат; Caudy et al., 2003; Scadden, 2005; Рис. 14.). Расщепление белка HsTSN с помощью каспазы-3 снижало нуклеазную активность полученных фрагентов примерно на 50% (Рис. 14. А). Расщепление белка PaTSN метакаспазой mcll-Pa приводило к снижению активности полученных фрагментов PaTSN из ели норвежской на 90% (Рис. 14. Б). Более сильное снижение нуклеазной активности фрагментов, полученных при протеолизе белка TSN ели, может объясняться тем, что PaTSN расщепляется метакаспазой mcll-Pa в четырех местах (см. раздел 2.3.2.). При этом, один из сайтов расщепления находится внутри второго домена стафилококковой нуклеазы SN2 (Рис. 7.). В отличие от белка PaTSN, протеолиз HsTSN с помощью каспазы-3 происходит только в одном

1.6

llLLiI

S Буфер + + + + + + + HsTSN - + + + - + + pdTp -- + ---dTp - - - + Каспаза-3 ---- + + + DEVD-CHO ------ +

Буфер + + + + + + + +

PaTSN - + + + - + + +

pdTp - - + - -

dTp - -- +- -- -

mcll-Pa - -- - + + + -

EGR-cmk - -__-- + -

mcll-Pa C139A - -- -- -- +

Рис. 14. Протеолиз TSN эффекторными протеиназами ПКС снижает нуклеазную активность белка. Рекомбинантный НбТЗЫ (А) или рекомбинантный РаТБЫ (Б) инкубировался в буфере, содержащем указанные компоненты, после чего добавлялся субстрат (оцРНК). Нуклеазная активность измерялась флуориметрически (гистограммы) или с помощью электорофореза (нижние фотографии). Вертикальные отрезки на гистограммах - стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

месте и не затрагивает ни один из доменов, гомологичных доменам стафилококковых нуклеаз, содержащихся в последовательности белка HsTSN (см. раздел 2.3.4. и Рис. 10.).

2.4. Отдельные молекулярные пути развития ПКС являются неизменными у представителей различных царств живых организмов.

В современной литературе широко обсуждаются эволюционные аспекты появления механизмов развития ПКС. Например, широко обсуждается возможность того, что многие прототипы белков-участников процессов клеточной смерти изначально выполняли функции, связанные с развитием и дифференцировкой организмов, и только позже приобрели функцию эффекторов клеточной смерти (Dick and Megeney 2013). Кроме того, уже давно разные исследователи указывали на то, что существует не так много типов ПКС, и, более того, что основные типы клеточной смерти имеют очень много общих морфологических и биохимических черт, несмотря на то, что они при этом могут быть присущи различным живым организмам. Появление методик, позволяющих массово определять субстраты эффекторных протеиназ клеточной смерти привело к появлению обширной информации о белках, подвергающихся протеолизу во время развития ПКС. Такая информация пока получена только для представителей царства животных (для человека, мыши, Drosophila и С. elegans) и требует дальнейшей биоинформационной обработки, но, тем не менее, уже сейчас можно сделать вывод о том, что наборы субстратов эффекторных протеиназ ПКС очень консервативны (Crawford et al., 2012). Очень показательно, что у мыши и у человека большинство субстратов каспаз совпадают, а также то, что в этих субстратах сайты протеолиза в большей степени одинаковы (Crawford et al., 2012). Однако при сравнении более эволюционно отдаленных организмов прослеживается, с одной стороны, четкая тенденция к снижению количества субстратов-ортологов, в то время как, с другой стороны, возрастает число альтернативных сайтов расщепления в оставшихся субстратах-ортологах (Crawford et al., 2012). Естественно, что чем эволюционно дальше отстоят друг от друга сравниваемые организмы, тем больше увеличивается количество уникальных белков-субстратов у каждого. Однако некоторые такие белки, участвующие в каком-либо функциональных процессе у одного организма, тем не менее, можно сравнить с негомологичными участники аналогичного функционального процесса другого организма, в том случае, если они также являются мишенями каспаз. Т.е. в этом случае мишенями протеолитических ферментов ПКС является не конкретный белок, а определенный процесс, на который можно воздействовать, протеолитически расщепляя различных его участников (Crawford et al., 2012).

Тем более интересно, что в нашей работе был охарактеризован эффекторный фермент ПКС у растений. Оказалось, что этот фермент — метакаспаза mcII-Pa — обладает активностью отличной от активностей каспаз животных. Как выяснилось, вместо неизменного практически для всех за редким исключением каспаз Asp в позиции Р1 субстрата для метакаспазы предпочтительным в данной позиции является Arg или Lys (см. выше). Тем более интересным оказывается тот факт, что первый охарактеризованный природный субстрат метакаспазы mcII-Pa - белок PaTSN — имеет относительно близкого гомолога у животных, включая человека, и

этот гомолог — белок HsTSN - является субстратом каспаз во время развития апоптоза (см. выше). Несмотря на различие в субстрат-специфичности каспаза-3 и метакаспаза mcII-Pa расщепляют HsTSN и PaTSN, соответственно, что в обоих случаях приводит к снижению ферментативной активности белка-субстрата. На данный момент PaTSN является единственным охарактеризованным природным субстратом метакаспаз, а также каких-либо других эффекторных протеиназ, обеспечивающих развитие ПКС у растений, расщепление которого происходит во время развития ПКС. Совсем недавно появились сообщения о том, что охарактеризованы один субстрат метакаспазы дрожжей и один субстрат метакаспазы мицелиальных грибов, расщепление которых происходит во время развития ПКС у этих организмов (Silva et al., 2011; Strobel and Osiewacz 2013). Примечательно, что и в этих двух случаях у субстратов были обнаружены близкие гомологи у млекопитающих, которые во время развития апоптоза являются мишенями каспаз. Таким образом, исходя из имеющихся данных, можно заключить, что процессы ПКС являются очень консервативными и многие элементы клеточной гибели остаются неизменными даже у представителей разных царств живых организмов.

2.5. Белок ТБГЗ направляет внутриклеточный и межклеточный транспорт вирусов, содержащих ТБГ.

Наличие у растительных клеток плотной клеточной стенки приводит к тому, что фитовирусы вынуждены использовать особенную стратегию для распространения инфекции по организму растения. В отличие от вирусов животных и бактериофагов, которые лизируют клетки и таким образом оказываются во внешней среде- или в межклеточном пространстве, или же у которых вирусные частицы отпочковываются от внешней мембраны клетки и, таким образом, оказываются снаружи, фитовирусы используют специальные механизмы, с помощью которых вирусный геном способен передаваться от клетки к соседней через каналы, соединяющие клетки растений - плазмодесмы (ПД). Для осуществления такого межклеточного транспорта фитовирусы экспрессируют специальные транспортные белки, функцией которых является осуществление перемещение вирусного генома от места репликации к ПД и через ПД в соседнюю клетку. У вируса табачной мозаики (ВТМ) транспортную функцию выполняет один ЗОК белок. В отличии от ВТМ и других представителей рода Tobamovirus значительное количество альфа-подобных вирусов растений, относящихся к различным семействам, кодируют в своем геноме консервативный модуль -тройной блок генов (ТБГ), ответственный за транспортную функцию.

ТБГ состоит из трех перекрывающихся генов, кодирующих белки ТБГ1, ТБГ2 и ТБГЗ. ТБГ у разных вирусов можно отнести к четырем различным группам: гордеи-подобные, потекс-подобные, бени-подобные и ТБГ вируса зеленой пятнистости гибискуса (ВЗПГ; Solovyev et al., 2012). Белок ТБГ2 является наиболее консервативным белком среди белков ТБГ и обладает наивысшей степенью гомологии при сравнении двух белков ТБГ2, относящихся к различным группам ТБГ. Исключение составляет белок ТБГ2 ВЗПГ, у которого центральный сегмент только отдаленно напоминает центральную последовательность ТБГ2, характерную для представителей других трех групп. Белки ТБГ1 у потекс-

подобных вирусов содержат домен, относящийся к суперсемейству хеликаз 1. Белки ТБГ1 у гордеи-подобных вирусов в дополнение к хеликазному домену имеют дополнительный N-терминальный домен, содержащий, как правило, хотя бы один участок, содержащий несколько положительно заряженных аминокислотных остатков. Бени-подобные белки ТБГ1 также состоят из хеликазного домена и дополнительного N-терминального домена. В то же время первичная структура хеликазного домена белка ТБГ1 ВЗПГ наиболее блика к аминокислотной последовательности хеликазного домена репликаз у представителей рода Benyvirus, и имеет наименьшее сходство с первичной структурой других белков ТБГ1 (Solovyev et al., 2012). Гордеи-подобные и бени-подобные ТБГЗ, а также белок ТБГЗ ВЗПГ имеют в своей структуре по два гидрофобных сегмента, однако, являясь гомологами внутри каждой из трех групп, представители ТБГЗ из разных групп при сравнении между собой не оказываются гомологами. Потекс-подобные белки ТБГЗ содержат всего один гидрофобный сегмент. Также следует отметить, что потекс-подобный ТБГ недостаточен для осуществления транспортной функции. Для обеспечения полноценного вирусного транспорта также требуется участие белка оболочки (БО; Chapman et al., 1992). На основании данных о неполной первичной структуре белков ТБГ вируса мозаики Nicotiana velutina, в которой отсутствует часть данных для белка ТБГЗ (Randies and Rohde, 1990), можно утверждать, что в природе существует более, чем четыре класса ТБГ, а также то, что эволюция ТБГ происходила с помощью сложных и многоступенчатых процессов.

2.5.1. Белок ТБГ1 ПЛВМ обладает сиквенс-неспецифичной РНК-связывающен активностью.

Вирусный межклеточный транспорт обычно предполагает образование рибонуклеопротеида, содержащего геномную нуклеиновую кислоту и транспортные белки. Исследуя гордеи-подобный ТБГ полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ), с помощью проведенных экспериментов было выявлено, что белок ТБГ1 ПЛВМ способен связывать РНК (Рис. 15.). Кроме геномной РНК ВТМ, как было показано с помощью опытов, направленных на выявление РНК-связывающих свойств белка (Рис. 15.), ТБГ1 ПЛВМ также оказался способным связывать геномную РНКР ПЛВМ, геномную РНКр вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ), а также химерный участок генома X вируса картофеля (ХВК), содержащий слитный в одной рамке трансляции ген ТБГ1 ХВК и ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Таким образом, в проведенных экспериментах последовательность РНК не влияла на РНК-связывающие свойства ТБГ1 ПЛВМ (данные не приводятся). Из этого можно сделать вывод о том, что РНК-связывающая активность ТБГ1 ПЛВМ не является сиквенс-специфичной. Интересно также, что, как было показано, сиквенс-неспецифичной РНК-связывающей активностью обладает также белок ТБГ2 вируса мозаики бамбука (ВМБ) (Hsu et al., 2009). Таким образом, как минимум, два компонента ТБГ могут обладать РНК связывающей активностью.

Рис. 15. Белок ТБГ1 ПЛВМ обладает сиквенс-неспецифичной РНК-евязывающей активностью. Атомно-силовая микроскопия (А) препарата РНК ВТМ, (Б) препарата белка ТБГ1 ПЛВМ и (В) комплексов, образуемых РНК ВТМ и белком ТБГ1 ПЛВМ. Стрелки указывают на нити, выступающие из шарообразных комплексов. Масштабная линейка (А, Б) - 100 нм, (В) - 50 нм. (Г) Анализ РНК-связывающих свойств белка ТБГ1 ПЛВМ с помощью нозерн-вестерн блота. Очищенный рекомбинантный белок ТБГ1 разделялся электрофоретически и переносился на нитроцеллюлозную мембрану. Связанный с мембраной белок денатурировли в буфере, содержащем 6М мочевину и 0,1% Tween, после чего ренатурировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,2 г/л БСА, 0,2 г/л фикола и 0,2 г/л поливинпиролидона, после чего мембрану инкубировали с РНК ВТМ, содержащей радиоактивный 3 Р. Окраска белка на мембране производилась с помощью Ponceau S.

2.5.2. Белок ТБГ1 с помощью белков ТБГ2 и ТБГЗ транслоцируется к клеточной периферии, проникает в ПД и, модифицируя их, транспортируется в соседние клетки.

Для проведения следующей серии экспериментов была проведена попытка возможности создания из минимального количества компонентов модельной системы, обеспечивающей межклеточный транспорт, индуцируемый ТБГ. Для визуализации использовался слитный белок, содержащий аминокислотные последовательности GFP и белка ТБГ1 вируса курчавости верхушек картофеля (ВКВК). ТБГ которого, также как и ТБГ ПЛВМ, относится к классу гордеи-подобных ТБГ. Слитный ген, содержащий в своей последовательности слитные открытые рамки трансляции GFP и ТБГ1, был клонирован в экспрессионный вектор под контроль 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Временная экспрессия в эпидермальных клетках листьев Nicotiana benthamiana проводилась с помощью трансфекции клеток путем их бомбардировки частицами вольфрама, на которые предварительно сорбировалась ДНК экспрессионных генетических конструкций. Визуализация с помощью флуоресцентной микроскопии показала, что внутриклеточная локализация слитного белка GFP-ТБП не отличается от локализации свободного GFP (Рис. 16. А, Б). Слитный белок GFP-ТБП, как и свободный GFP, локализовался диффузно в цитоплазме и в несколько большем количестве внутри ядра трансфецированных клеток (Рис. 16. А, Б). В результате кобомбардмента экспрессионного вектора, содержащего ген GFP-ТБП совместно с экспрессионными векторами, содержащими гены ТБГ2 ВКВК или ТБГЗ ВКВК было выявлено, что коэкспрессия GFP-ТБП с еще одним белком, кодируемым

ТБГ, никак не влияет на внутриклеточную локализацию GFP-ТБП (Рис. 16. В и данные не приводятся). В то же время коэкспрессия GFP-ТБП с ТБГ2 и ТБГЗ выявила резкое изменение во внутриклеточной локализации GFP-ТБП. В условиях такой коэкспрессии с двумя другими белками ТБГ GFP-ТБП стал локализоваться в тельцах включений, расположенных на клеточной периферии, а также в ярких точечных структурах внутри клеточной стенки (Рис. 16. Г, Д). Такие точечные структуры неоднократно наблюдались другими авторами при экспрессии слитных с GFP белков, локализующихся в ПД (Escobar et al. 2003, Oparka and Roberts, 2001).

Более того, при использовании более высокой интенсивности лазерного излучения для возбуждения флуорофора GFP выяснилось, что GFP-ТБП при коэкспрессии с ТБГ2 и ТБГЗ транспортируется в соседние клетки (Рис. 16. Е). Интересно, что немодифицированные ПД способны пропускать белки с молекулярной массой не более 50 кДа (Oparka et al., 1999). Молекулярная масса GFP-ТБП составляет примерно 78 кДа. Таким образом, можно сделать вывод о том, что белки ТБГ ВКВК совместно способны модифицировать ПД, повышая их пропускную способность. Примечательно также, что локализация GFP-ТБП в клетках, соседних с трансфецированной, повторяло локализацию GFP-ТБП при его экспрессии отдельно от белков ТБГ2 и ТБГЗ или же при его коэкспрессии только с одним из этих белков (Рис. 16. А, Е), что позволяет сделать вывод о том, что белок ТБГ2 и/или белок ТБГЗ не способны транспортироваться в соседнюю клетку.

Для проверки функциональной активности GFP-ТБП была модифицирована полная инфекционная копия ВКВК, в которой ген ТБГ1 был замещен геном GFP-ТБП. Транскриптами, полученными с помощью модифицированной полной инфекционной копии ВКВК, содержащей ген GFP-ТБП, были инокулированы растения N. benthamamiana. Через три дня после инокуляции с помощью флуоресцентной микроскопии можно было наблюдать локусы инфекции (Рис. 16. 3), которые значительно разрастались к 5 дню после инокуляции (Рис. 16. И). Таким образом, можно сделать вывод о том, что наличие дополнительного участка, содержащего последовательность GFP, в структуре ТБГ1 ВКВК не затрагивает его функции транспортного белка.

Обобщая полученные данные, можно сделать вывод о том, что РНК-связывающий белок ТБГ1 с помощью белков ТБГ2 и ТБГЗ транслоцируется к клеточной периферии, проникает в ПД и, модифицируя их, транспортируется в соседние клетки.

2.5.3. Гетерологичные белки ТБГ2 и ТБГЗ частично транслоцируют белок ТБГ1 из ядра и цитоплазмы в тельца включений, расположенных на клеточной периферии, но не в ПД.

При коэкспрессии белка GFP-ТБП ВКВК с гетерологичными белками ТБГ2 и ТБГЗ гордеи-подобного ТБГ ПЛВМ или потекс-подобного ТБГ ХВК выяснилось, что GFP-ТБП только частично транслоцируется из ядра и цитоплазмы в тельца включений, расположенных на клеточной периферии, но не детектируется в ПД (Рис.17.). Замена белков ТБГ2 или ТБГЗ обратно на соответствующий белок

Рис. 16. Белок СРР-ТБГ1 с помощью белков ТБГ2 и ТБГЗ транслоцируется к клеточной периферии, проникает в ПД и, модифицируя их, транспортируется в соседние клетки. (А) Локализация ОРР в эпидермальной клетке N. Ъеп1Ьат1апа, визуализированная с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. (Б, Ж) Локализация ОРР-ТБГ1 ВКВК в эпидермальной клетке N. ЬеШИат^апа. (Б) Вынесенный участок - один оптический срез, проходящий через середину ядра клетки. Флуоресцентная микроскопия клеток, коэкспрессирующих белки ОРР-ТБГ1 и ТБГЗ (В) вРР-ТЕП, ТБГ2 и ТБГЗ (Г, Д, Е). (Е, Ж) Для визуализации флуоресценции в этих случаях использовалась высокая интенсивность лазерного излучения (примерно в 10 раз выше, чем для обычной визуализации внутриклеточной локализации белков, слитных с ОРР). (3, И) Визуализация с помощью флуоресцентоной микроскопии локусов инфекции ВКВК, экспрессирующего ОРР-ТБГ1. Масштабные линейки (Е, Ж) - 20 мкм, (3, И) — 100 мкм, остальные - 10 мкм.

ВКВК в экспериментах по коэкспрессии ничего не изменяла и не приводила к полной транслокации ОГР-ТБГ1 в тельца включений, расположенных на клеточной периферии, а также в ПД (Рис. 17.) в отличие от системы, в которой все три белка ТБГ принадлежали ВКВК (см. п. 2.5.2.). Также ни в одном из описанных случаев не удалось обнаружить транспорт белка ОРР-ТБГ1 в соседние клетки, направляемый белками ТБГ2 и ТБГЗ. Таким образом, можно заключить, что для транспорта белка ТБГ1 в ПД и в соседние клетки требуются специфичные взаимодействия между всеми тремя белками ТБГ. Поэтому транспорт белка ТБГ1 не осуществляться даже в том случае, если один из белков (ТБГ2 или ТБГЗ) не принадлежит к ТБГ. к которому относится белок ТБГ1.

2.5.4. Белок ТБГЗ способен сиквенс-неспецифично транслоцировать ТБГ2 в тельца включений на клеточной периферии.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальных клеток N. ЬеШИат^апа, экспрессирующих слитный с ОРР белок ТБГ2 ВКВК и белок

СРР-ТБГ1 + ПЛВМ ТБГ2 + ПЛВМ ТБГЗ

ЭРР-ТЕП + ВКВК ТБГ2 + ПЛВМ ТБГЗ

СРР-ТБП + ПЛВМ ТБГ2 + ВКВК ТБГЗ

СРР-ТБП + ХВК ТБГ2 + ХВК ТБГЗ

СРР-ТБП + ВКВК ТБГ2 + ХВК ТБГЗ

СРР-ТБГ1 + ХВК ТБГ2 + ВКВК ТБГЗ

Рис. 17. Гетерологичные ТБГ2 и ТБГЗ частично транслоцируют СГР-ТБГ1 из ядра и цитоплазмы в тельца включений, расположенные на клеточной периферии, но не в ПД и не в соседние клетки. Микрофотографии результатов конфокальной лазерной сканирующей микроскопии эпидермальных клеток N. ЬепЛаппапа, коэкспрессирующих указанные белки. Масштабная линейка - 10 мкм.

ТБГ2 ХВК, показала, что белки ТБГ2 локализуются в структурах, морфология которых позволяет сделать заключение о том, что белки ассоциированы с мембранами эндоплазматического ретикулума (ЭПР; Рис. 18. А, Д). В то же время конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальных клеток N. Ьеп1Иат1апа, экспрессирующих слитный с ёзЯес! белок ТБГЗ ПЛВМ, выявила, что ёэКеё-ТБГЗ ПЛВМ, в отличие от белка ТБГ2, локализуется на клеточной периферии в тельцах включений (Рис. 18. Б). Более того, с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии клеток, коэкспрессирующих сЬКеё-ТБГЗ ПЛВМ и ОРР-ТБГ2 ПЛВМ, были получены данные о том, что оба белка (ТБГ2 и ТБГЗ) при коэкспрессии детектировались в тельцах включений на клеточной периферии. При этом детектируемые флуоресцентные сигналы были полностью колокализованы (Рис. 18. Б-Г). Флуоресцентная микроскопия клеток, коэкспрессирующих ОГР-ТБГ2 и ТБГЗ ХВК, также как ОГ Р-ТЫ 2 и ТБГЗ ВКВК позволила детектировать ОГР-ТБГ2 также в тельцах включений на клеточной периферии (Рис. 18. Е для ХВК и 18. Ж для ВКВК). Таким образом, можно заключить, что при экспрессии в клетках табака белок ТБГ2 ассоциирован с мембранами кортикального ЭПР, в то время как белок ТБГЗ локализуется в тельцах включений на клеточной периферии. Коэкспрессия этих белков приводит к транслокации белка ТБГ2 в структуры на периферии клеток. Тот факт, что ТБГЗ ПЛВМ оказался способен транслоцировать ТБГ2 ВКВК (Рис. 18. 3), а также некоторые другие белки вирусов растений, не содержащих ТБГ (например, 6К мембранный белок вируса желтухи свеклы (ВЖС) и предполагаемый транспортный белок вируса некротической желтухи фасоли), в тельца включений (Рис. 18. 3 и данные не приводятся), указывает на то, что транслокация других белков с помощью белка ТБГЗ происходит сиквенс-неспецифично.

2.5.5. Периферические тельца включений, образование которых индуцируется ТБГЗ, являются производными ЭПР.

Для выявления природы структур, образуемых экспрессией в эпидермальных клетках N. Ьеп1кат1апа белка ТБГЗ, слитный белок скКеё-ТБГЗ ПЛВМ был коэкспрессирован с ОКР, локализующимся в ЭПР (СНР-ГК; ОБР, слитый с

Рис 18. Белок ТБГЗ способен транслоцировать белок ТБГ2 в тельца включений на клеточной периферии. (А) Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальной клетки N. Ьеп1Иат1апа, экспрессирующей слитный белок ОРР-ТБГ2 ВКВК. (Б-Г) Визуализация коэкспресии слитного белка с)5Кес1-ТБГЗ ПЛВМ (Б) и слитного белка ОРР-ТБГ2 ПЛВМ (В). (Г) наложение (Б) и (В). (Д) Микрофотография клетки, экспрессирующей слитный белок ОРР-ТБГ2 ХВК. (Е) Флуоресцентная микроскопия клетки, экспрессирующей слитный белок ОРР-ТБГ2 ХВК и белок ТБГЗ ХВК. (Ж) Визуализация коэкспресии слитного белка ОРР-ТБГ2 ВКВК и белка ТБГЗ ВКВК. (3) Визуализация коэкспресии слитного белка ОРР-ТБГ2 ВКВК и белка ТБГЗ ПЛВМ. Масштабная линейка - 10 мкм.

лидерной последовательностью хитиназы из ЛаНапа, направляющей

белок в полость ЭПР, и С-концевым сигналом задержки в ЭПР; Воеутк е? а/., 1998), а ОЕР-ТБГЗ ХВК совместно с ТБГЗ ХВК были коэкспрессированы с УРР. локализующимся в ЭПР (УЕР-ЕЯ). Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия выявила, что приферические тельца включений, образуемые белком ТБГЗ, колокализуются со структурами ЭПР (Рис. 19.). При этом, в клетках, экспрессирующих только ОЕР-ЕЯ, какие-либо специфические новые образования на периферии клеток не детектировались (Рис. 19.). Таким образом, можно заключить, что тельца включений, образование которых индуцирует белок ТБГЗ на периферии трансфецированной клетки, являются структурами, произошедшими от ЭПР. Коэкспрессия белков ТБГ ВКВК вЕР-ТЕП, ТБГ2 и ТБГЗ совместно с УРР-ЕЯ показала, что периферические тельца включений, в которые при коэкспрессии с белками ТБГ2 и ТБГЗ транслоцируется слитный белок ОЕР-ТБГ1, также являются структурами, произошедшими от ЭПР.

Таким образом, можно заключить, что в процессе вирусного транспорта, обеспечиваемого белками гордеи-подобного или потекс-подобного ТБГ, белок

вРР-ТБГЗ ХВК + ТБГЗХВК + УРР-ЕР*

вРР-ТБИ ВКВК + ТБГ2 ВКВК + ТБГЗ ВКВК +УРР-ЕР

/ -ЧУ * ИИ

—

Рис. 19. Периферические тельца включений, образование которых индуцируется белком ТБГЗ, являются производными ЭПР. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальных клеток N. ЬеШИатгапа, экспрессирующих вРР-ЕЯ (верхняя микрофотография), коэкспрессирующих слитный белок с№е(1-ТБГЗ ПЛВМ и белок ОГРЕЙ. (второй ряд сверху; микрофотографии слева направо: детекция сЫ1е<1-ТБГЗ, ОГР-ЕЯ, наложение зеленого и красного каналов), коэкспрессирующих белки ОРР-ТБГЗ ХВК, ТБГЗ ХВК и УГР-ЕЯ (третий ряд сверху; микрофотографии слева направо: детекция ОРР-ТБГЗ, УГР-ЕЯ и наложение двух микрофотографий) и коэкспрессирующих белки ОБР-ТБГ1 ВКВК, ТБГ2 ВКВК, ТБГЗ ВКВК и УБР-ЕЯ (нижний ряд; микрофотографии слева направо: детекция ОРР-ТБГ1, УБР-ЕЯ и наложение двух микрофотографий). Масштабная линейка - 10 мкм.

ТБГЗ индуцирует образование новых структур на клеточной периферии из мембран ЭПР и сиквенс-неспецифично транслоцирует в них белок ТБГ2. Транслокация в эти структуры гордеи-подобного белка ТБГ1 уже является сиквенс-специфичным процессом, требующим участия белка ТБГ2. Оказавшись на клеточной периферии, гордеи-подобный белок ТБГ1 транслоцируется в ПД, увеличивает их пропускную способность и транспортируется в соседнюю клетку. В отличии от гордеи-подобных ТБГ, у потекс-подобных ТБГ транспорт вирусного генома от места репликации к ПД и в соседнюю клетку происходит не в виде РНП, образуемого белком ТБГ1 и вирусной геномной РНК, а в виде РНП, образованного белком ТБГ1, белком оболочки и геномной РНК (УегсЬоЬЬиЫсг е/ а!., 2010). Тем

не менее, можно заключить, что основной движущей силой, обеспечивающей внутриклеточный и межклеточный транспорт, является белок ТБГЗ.

2.6. Мембранные белки ТБГЗ и циетеин богатый белок ВКВК вызывают стресс ЭПР, приводящий к ПКС.

2.6.1. Гордеи-подобный белок ТБГЗ индуцирует стресс ЭПР.

Дальнейшие микроскопические исследования влияния экспрессии ТБГЗ на ЭПР в эпидермальных клетках N. benthamiana выявили, что экспрессия белка ТБГЗ может приводить к дезинтеграции ЭПР. Такая дезинтеграция ЭПР проявляется в везикуляции мембран ЭПР, приводящей к потере мембранами ЭПР характерной для них морфологии, и может быть легко визуализирована с помощью микроскопии (Рис. 20. А, Б).

Накопление в ЭПР существенных количеств несвернутых или неверно свернутых белковых молекул, избытка мембранных белков, а также другие причины вызывают стресс ЭПР (Xu et al., 2005), следствием которого является так называемый «ответ на несвернутый белок» (ОНБ), имеющий целью компенсировать функциональные повреждения ЭПР, но вызывающий, при условии длительного воздействия факторов, приводящих к стрессу ЭПР, клеточную смерть (Xu et al., 2005; Zhang et al., 2006). В клетках растений, также как и в клетках всех эукариотических организмов развитие ОНБ связано с повышением уровня ряда белков ЭПР, участвующих в сворачивании полипептидных цепей, таких как белок BiP, протеиндисуфидизомераза, кальретикулин и кальмодулин (Oh et al., 2003, Urade, 2009).

Недавно было показано, что потекс-подобный белок ТБГЗ, кодируемый ХВК, вызывает стресс ЭПР в условиях высокого уровня накопления данного белка в клетках растений (Ye et al., 2013). Было обнаружено, что белок ТБГЗ активирует транскрипционный фактор bZIP60, необходимый для индукции экспрессии целого ряда белков ЭПР, обеспечивающих процессы развития ОНБ, а также белка SKP1, являющегося компонентом ЕЗ-убиквитин-лигазного комплекса (Ye et al., 2011; 2012; 2013). Развитие процессов ОНБ в ответ на стресс ЭПР, индуцированный белком ТБГЗ, приводит к клеточной смерти, сопровождающейся повышением уровня активных форм кислорода и фрагментацией ДНК (Ye et al., 2013), однако молекулярный механизм индукции клеточной смерти в результате стресса ЭПР и развития реакций ОНБ остается неизвестным (Tabas and Ron, 2011). Для выяснения молекулярных механизмов развития ПКС при экспрессии гордеи-подобного белка ТБГЗ мы использовали митохондриально-адресованный антиоксидант SkQl (Ю-(б'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний), который эффективно подавлял развитие ПКС у растений, индуцированную через каскад митоген-активируемых киназ. В этом случае использовалась модельная система индукции ПКС при развитии гиперчувствительного ответа растений табака, содержащих ген N, в ответ на экспрессию элиситора гиперчувствительного ответа, кодируемого ВТМ (данные не приводятся). Подавление ПКС в такой экспериментальной системе с помощью Bcl-xL указывает на то, что супрессия развития ПКС происходит на уровне митохондрий (данные не приводятся). В то же время, как выяснилось,

использование 8к()1 никак не влияло на развитие стресса ЭПР, вызываемого гордеи-подобным ТБГЗ ПЛВМ (Рис. 20. Б, В). Такой результат хорошо согласуется с данными, полученными для потекс-подобного белка ТБГЗ ХВК. В экспериментах Уе и соавторов (2013) Вс1-хЬ не был способен супрессировать ИКС, индуцируемую ТБГЗ ХВК. Можно заключить, что несмотря на существенные различия в структуре и потекс-подобный, и гордеи-подобный белки ТБГЗ индуцируют стресс ЭПР, приводящий к развитию ПКС, которое не затрагивает сигнальные каскады, проходящие с участием митохондрий.

Рис. 20. Гордеи-подобный белок ТБГЗ индуцирует стресс ЭПР. (А) Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальной клетки N. ЬетИат1апа, экспрессирующей белок ОРР-ЕЯ. (Б) Микрофотография эпидермальной клетки N. Ьеыкатгапа, коэкспрессирующей ОРР-ЕЯ и ТБГЗ ПЛВМ. (В) Микрофотография эпидермальной клетки N. Ьешкаггйапа, коэкспрессирующей ОРР-ЕЯ и ТБГЗ ПЛВМ в условиях инкубировании с БкО!. Масштабная линейка - 20 мкм.

2.6.2. Цистеин богатый белок ВКВК индуцирует развитие стресса ЭПР и развитие ПКС.

При исследовании внутриклеточной локализации еще одного мембранного 8 кДа цистеин-богатого белка (ЦББ), кодируемого ВКВК, выяснилось, что он также способен индуцировать дезинтеграцию структур ЭПР (Рис. 21.). Поэтому неудивительно, что результатом экспрессии ЦББ с помощью гетерологичного экспрессионного вектора в растениях N. Ьеп1кат1апа явилась полная некротизация верхушек растения (Рис. 21.). Таким образом, ВКВК кодирует как минимум два мембранных белка, способных индуцировать стресс ЭПР, приводящий к развитию ПКС.

Рис. 21. Цистеин богатый мембранный белок (ЦББ) ВКВК индуцирует развитие стресса ЭПР и развитие ПКС. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальной клетки N. Ьеп1Ьат1апа, коэкспрессирующей слитный белок ОБР-ЦББ и УРР-ЕЯ (верхний ряд микрофотографий; зеленый канал - визуализация ОБР-ЦЕБ; красный канал - визуализация УБР-ЕЯ; правая микрофотография - наложение зеленого и красного каналов). Масштабная линейка - 20 мкм. (Нижний ряд) N. ЬепЖат^апа, инфицированная ХВК, экспрессирующим ЦБР ВКВК через 10 дней после заражения (слева). N. ЬепЛатгапа, инфицированная ХВК.

2.7. Вирусы растений используют специальные механизмы для снижения уровня экспрессии вирус-специфических белков, которые могут вызывать развитие ПКС.

Очевидно, что вирусу невыгодно экспрессировать белок, который индуцирует ПКС. Поэтому логично предположить, что в случае с белками ТБГЗ и ЦББ, вирусу выгодно, чтобы их экспрессия была на минимальном уровне. Действительно, на протяжении многих лет осуществлялись безрезультатные попытки детектировать белок ТБГЗ при вирусной инфекции, и только недавно появилось сообщение о том, что ТБГЗ ПЛВМ детектируется в малых количествах во время вирусной инфекции (ЗЬетуакша ег я/., 2011). В наших экспериментах ЦББ детектировался, хотя его детекция также была затруднена низким уровнем экспрессии белка (данные не приводятся).

Анализ генома ВКВК (Рис. 22. А) показывает, что для экспрессии всех белков, кодируемых открытыми рамками трансляции, вирусу необходимо дополнительно продуцировать субгеномные РНК (сгРНК) для экспрессии следующих белков: 13К ТБГ2, 21К ТБГЗ и 8К ЦББ, в то время как продукты RT 206К и RT 91К экспрессируются за счет проскока рибосомой соответствующих терминальных кодонов. Нозерн-блот тотальной РНК, выделенной из зараженного растения, с использованием пробы к консервативной 3'-терминальной области, присутствующей во всех трех геномных РНК ВКВК, позволил детектировать только одного потенциального кандидата для сгРНК, который по своему размеру может соответствовать сгРНК для экспрессии ТБГ2 (Рис. 22. Б). Однако следует учитывать то, что более низкомолекулярные РНК при электрофорезе могут хуже концентрироваться, чем высокомолекулярные фрагменты, что снижает чувствительность метода. Для проведения анализа другим методом, а также для картирования 5'-концевых областей сгРНК, был использован метод удлинения праймера при проведении реакции обратной транскрипции. В этом эксперименте в качестве матрицы также использовалась тотальная РНК, выделенная из зараженных растений. Для постановки реакции олигонуклеотиды ЕХТ-ТБГ2, ЕХТ-ТБГЗ и ЕХТ-ЦББ подбирались таким образом, чтобы они были комплементарными к участкам последовательности РНКЗ ВКВК, расположенным с 3'-конца от инициаторных кодонов генов ТБГ2, ТБГЗ и ЦББ. Реакции обратной транскрипции, проведенные с олигонуклеотидами ЕХТ-ТБГ2 и ЕХТ-ЦББ выявили места обрыва полимеразной реакции (Рис. 22. В, Г), в то время как реакция, проведенная с олигонуклеотидом ЕХТ-ТБГЗ на интересуемом участке, не выявила наличие обрыва цепи (данные не приводятся). Два или три следующих друг за другом обрыва реакции удлинения праймера при обратной транскрипции указывают на то, что такие РНК содержат КЭП (White and Mackie 1990). Таким образом, можно заключить, что для экспрессии ТБГ2 и ЦББ ВКВК синтезирует специальные сгРНК, в то время как ТБГЗ транслируется с использованием сгРНК для ТБГ2. Такое возможно за счет проскока рибосомой в ходе сканирования AUG-кодона ТБГ2 и альтернативной инициации трансляции с помощью инициаторного кодона ТБГЗ. Примечательно, что между инициаторными кодонами ТБГ2 и ТБГЗ нет никаких других AUG-кодонов.

Такие данные хорошо согласуются с данными, полученными для потекс-подобного ТБГ: как было показано, белки ТБГ2 и ТБГЗ ХВК транслируются с использованием одной бицистронной сгРНК в качестве матрицы (Morozov et al., 1991; Verchot et al., 1998). Для проверки аналогичной возможности экспрессии ТБГЗ у гордеи-подобного ТБГ была проведен эксперимент, включавший в себя коэкспрессию слитного белка GFP-ТБП и белков ТБГ2 и ТБГЗ ВКВК, для которого был сконструирован специальный экспрессионный вектор, содержащий перекрывающиеся гены белков ТБГ2 и ТБГЗ и повторяющий соответсвующий участок генома ВКВК. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия выявила, что в этом эксперименте слитный белок GFP-ТБП полностью транслоцировался в периферические тельца включений и в ПД (Рис. 22. Д). Слитный белок GFP-ТБП также транспортировался в соседние клетки (данные не приводятся). Из этих данных можно сделать вывод о том, что белок ТБГЗ способен транслироваться с бицистронной матрицы in vivo, т.к. для обеспечения полной транслокации белка ТБГ1 в перефирические структуры экспрессии одного ТБГ2 недостаточно (см. п. 2.5.2.). Более того, из данного эксперимента следует, что даже

РНК1

148К

ет 206К

-Уа!

РНК2 _[Ж

13191К

-Уа!

РНКЗ

51К | | 21К | 4-[1Ж]

В С А Т С

РНК2 и 3

- сгРНК

Г вАТС

- А (1706) А С

е с

А С А А

и и й

-А (2373)

б А

С и

в и в с с

1 1С 20 30 40 50 60

тоас! MERRFIVYYKCS[X^CGRYVSSLLTMSGЛYУ^^УCУCIУFFII,VYLSSCYNMRУLGF1.RVCIYLYKI,CR □ УЕЗВГ1УУУКСЗРСАСССУУ35ЬЬТУГСАСУМ1С.'УС 1У РЕ*У1.УУЬ56,'--"УМГ^УЬ£Г1ВУС1 УЬУКЬСВ

054-10 VERRFIVYY^•CSDCACGCYV55LLTVFGfiCVNICУCIУFFILVУLS6CYNMRУLGFIRVCIYLYKLCR Э54-15 VERRFIVYY^•CSDCACGCYVSSLLTVFGДCVNICVCIУFFILVYLSGCYHMRУLGFXRУCIYLYKLCR 054-19 VERRFIVYY^•CSDCACGCYVS5I,LTVFGACVHУCVCIУFFILVУLSGCYNMRVLGFXRVCTYLYKLCR

Рис. 22. ВКВК использует специальные механизмы для снижения уровня экспрессии мембранных белков, которые приводят к развитию стресса Э11Р и могут вызывать индукцию процессов ПКС. (А) Схематическое изображение генома ВКВК. (Б) Нозерн-блот с использованием радиоактивного зонда к 3'-терминальной консервативной области РНК1, 2 и 3 ВКВК. Левая дорожка - электрофоретическое разделение тотальной РНК, выделенной из здоровых растений. Правая дорожка - электрофоретическое разделение тотальной РНК, выделенной из растений, зараженных ВКВК. (В и Г) Продукты реакций обратной транскрипции, проведенной с помощью олигонуклеотидов ЕХТ-ТБГ2 (В) и ЕХТ-ЦББ (Г), используя тотальный экстракт РНК, выделенной из растений, зараженных ВКВК (правые дорожки). Реакция секвенирования по Сэнгеру (дорожки й, А, Т, С) с

небольшого количества белка ТБГЗ достаточно для обеспечения внутриклеточного и межклеточного транспорта белка ТБГ1.

Примечательно, что при анализе нуклеотидных последовательностей различных изолятов ВКВК было обнаружено, что многие из них в своей последовательности не содержат инициаторный кодон у гена, кодирующего ЦББ, который заменен на триплет GUG (Рис. 22. Е). Также известно, что у представителей рода Allexvirus ген белка ТБГЗ не содержит инициаторного AUG кодона. Известно, что инициация трансляции с использованием неканонических инициаторных возможна, но ее эффективность, как минимум, на порядок ниже, чем трансляции, инициируемой с помощью канонического AUG-кодона (Ivanov et al., 2011). Таким образом, можно заключить, что вирусы растений используют специальные механизмы для снижения уровня экспрессии мембранных белков, которые приводят к развитию стресса ЭПР и могут вызывать развитие процессов ПКС.

К настоящему времени накопилось много данных о развитии стресса ЭПР в клетках млекопитающих, индуцированного вирусными инфекциями (Jordan et al., 2002; Baltzis et al., 2004; Netherton et al., 2004; Sun et al., 2004; Tardif et al., 2005). В процессе продуктивной вирусной инфекции синтезируется значительное количество вирус-специфических белков, среди которых может быть также большое количество мембранных белков, что определяется клеточными сенсорами стресса ЭПР, как переполнение люмена ЭПР несвернутыми или неправильно свернутыми белками (Kim et al., 2008). В результате, в инфицированных клетках активированные сенсоры стресса ЭПР индуцируют развитие процессов ОНБ, целью которых является восстановление гомеостаза ЭПР. У животных к настоящему времени охарактеризовано три основных сигнальных каскада развития ОНБ, которые инициируются сенсорами стресса ЭПР PERK, IRE1 и ATF6 (Zhang and Wang 2012). Для восстановления гомеостаза ЭПР процессы развития ОНБ включают в себя механизмы супрессии трансляции, в результате чего в ЭПР перестают поступать новые белки, требующие осуществления фолдинга. С другой стороны, инициируются сигнальные пути приводящие к активации ЭПР-ассоциированной деградации белков. И, наконец, инициируются процессы, увеличивающие уровень экспрессии генов шаперонов ЭПР, что, в свою очередь, должно приводить к усилению молекулярного аппарата ЭПР, осуществляющего фолдинг, и увеличению его «пропускной способности» (Zhang and Wang 2012). Однако в случае, при котором стресс ЭПР приобретает хронический характер, клетка индуцирует запуск механизмов, осуществляющих развитие процессов ПКС (Sano and Reed 2013).

Рис. 22. (продолжение подписи) помощью олигонуклеотидов ЕХТ-ТБГ2 (В) и ЕХТ-ЦББ (Г), проведенная с использованием полноразмерной ДНК копии РНКЗ ВКВК в качестве матрицы. (Д) Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия эпидермальной клетки N. ЬетИапиапа, коэкспрессирующей слитный белок ОБР-ТЕП и белки ТБГ2 и ТБГЗ. Для коэкспрессии белков ТБГ2 и ТБГЗ в данном эксперименте использовалась бицистронная экспрессионная конструкция, содержащая перекрывающиеся гены белков ТБГ2 и ТБГЗ и повторяющая соответствующий участок геномной РНКЗ ВКВК. Масштабная линейка - 10 мкм. (Е) Выравнивание аминокислотных последовательностей ЦББ разных изолятов ВКВК. Подчеркнут гидрофобный сегмент.

Многие вирусы млекопитающих эволюционировали таким образом, чтобы приспособить сигнальные пути ОНБ хозяина для обеспечения максимально эффективной репликации и транскрипции вирусного генома, трансляции и обеспечения фолдинга вирус-специфических продуктов, а также для повышения вероятности выживания вируса в инфицированной клетке. С одной стороны, активный синтез вирус-специфических продуктов часто приводит к стрессу ЭПР и активирует сенсоры стресса ЭПР, что приводит к развитию ОНБ со всеми, в том числе и негативными для вируса эффектами. С другой стороны, восстановление функций ЭПР часто является необходимым условием для обеспечения нормальной репликации вируса, а также для обеспечения фолдинга вирус-специфических продуктов (Не, 2006; Zhang and Wang 2012). Естественно, ингибирование синтеза белка, к которому приводит сигнальный каскад, инициированнный одним из сенсоров стресса ЭПР PERK, также негативно влияет на синтез, в том числе, и вирус-специфических продуктов, что является нежелательным при развитии продуктивной вирусной инфекции. И, наконец, возможное развитие ПКС также является нежелательным процессом для продукции вируса. Поэтому вирусы животных приобрели специальные механизмы, которые способны манипулировать молекулярными механизмами развития ОНБ с целью обеспечения максимально комфортных условий для вирусной репродукции (Zhang and Wang 2012).

У растений, как и у всех эукариотических организмов, в ответ на переполнение люмена ЭПР несвернутыми или неправильно свернутыми белками, также может развиваться стресс ЭПР, индуцирующий сигнальные каскады ОНБ, целью которых является восстановление гомеостаза ЭПР. Интенсивные исследования, проведенные в последние десятилетие, позволили выявить у растений, как минимум, два сигнальных пути развития ОНБ. IREl-зависимый путь развития ОНБ у растений по особенностям молекулярных механизмов во многом аналогичен соответствующему сигнальному каскаду у животных, в то время как bZIP17 и Ь71Р28-зависимый путь развития ОНБ у растений напоминает ATF6-зависимый сигнальный каскад у животных (Iwata and Koizumi, 2012).

К настоящему времени практически ничего не известно о пересечении молекулярных путей развития инфекционных процессов, вызываемых фитовирусами с молекулярными путями развития процессов ОНБ, вызванного стрессом ЭПР, у растений. Тем не менее, недавно было продемонстрировано, что потекс-подобный белок ТБГЗ, кодируемый ХВК, в условиях оверэкспрессии вызывает стресс ЭПР (Ye et al., 2013). Более того, как было показано, в таких условиях белок ТБГЗ ХВК активирует транскрипционный фактор bZIP60, необходимый для индукции экспрессии целого ряда белков ЭПР, обеспечивающих процессы развития ОНБ, а также белок SKP1, который является компонентом ЕЗ-убиквитин-лигазного комплекса (Ye et al., 2011; 2012; 2013). Кроме того, ответом на стресс ЭПР, индуцированный оверэкспрессией белка ТБГЗ, является развитие процессов ПКС (Ye et al., 2013).

В наших экспериментах было показано, что стресс ЭПР может быть также индуцирован функциональным гомологом белка ТБГЗ ХВК — белком ТБГЗ ПЛВМ. Кроме того, стресс ЭПР индуцируется экспрессией мембранного ЦББ ВКВК и, более того, оверэкспрессия ЦББ ВКВК приводит к развитию ПКС (см. пп. 2.6.1. и 2.6.2.). Однако все известные примеры индукции стресса ЭПР и развивающихся вследствие этого феномена процессов наблюдались у растений только в искусственных экспериментальных системах, в которых была значительно

увеличена экспрессия индукторов стресса ЭПР по сравнению с уровнями экспрессии таких белков-индукторов стресса ЭПР, характерными для вирусной инфекции (Ye et al., 2013 и см. выше). Полученные данные о том, что при вирусной инфекции специальные вирус-специфичные молекулярные механизмы регуляции экспрессии белков ТБГЗ и ЦББ направлены на значительное снижение уровня экспрессии этих двух вирус-специфических продуктов, позволяют сделать вывод о том, что в случае с этими мембранными белками фитовирусы используют специальную стратегию снижения их уровня экспресии, которая позволяет миновать процессы развития стресса ЭПР и последующего развития ПКС, т.е. процессов, которые являются нежелательными для эффективной вирусной репродукции.

2.8. Разработка метода определения топологии мембранных белков in vivo.

Более чем 30% от общего числа белков эукариот являются трансмембранными белками (Wallin and von Heijne, 1998). Исследователи, изучающие такие мембранные белки, обычно сталкиваются с тем, что нет данных об их пространственной структуре. Стандартные методы, такие как кристаллография, достаточно трудоемки в случаях, когда предметом исследования является мембранный белок. По сравнению с растворимыми белками технические трудности с трансмембранными белками обычно возникают на всех этапах получения данных о пространственной структуре таких белков: при экспрессии, рефолдинге и кристаллизации. Кроме того, разрешенная структура обычно не несет информации о том, в какой компартмент транслоцированы растворимые части трансмембранного белка. Для предсказания топологии мембранных белков на основе их первичной структуры существуют алгоритмы и соответствующие программы. Однако они не всегда способны обеспечить получение достоверного результата (van Geest and Lolkema, 2000).

В ходе исследований мембранных белков вирусов растений нами был разработан новый метод определения топологии мембранных белков, разработанный на основе феномена бимолекулярной флуоресцентной комплементации (БиФК; Ghosh et al., 2000; Hu et al., 2002). БиФК основана на том, что две части флуоресцентного белка, коэкспрессированные в одной клетке, способны взаимодействовать, образовывая при этом правильную пространственную структуру флуоресцентного белка, что приводит к созреванию хромофора и, соответственно, к возможности поглощать излучение определенной длины волны и испускать флуоресценцию. Сразу после открытия феномена БиФК на его основе был предложен метод определения белок-белковых взаимодействий (Hu et al., 2002).

В наших экспериментах при коэкспрессии YN и YC (фрагменты YFP: YN содержал 1-154 аминокислотные остатки последовательности полноразмерного YFP, в то время как YC - 155-239 аминокислотные остатки) после бомбардмента или агроинфильтрации N. benthamiana с помощью флуоресцентной микроскопии детектировались флуоресцентные клетки (Рис. 23. Б, Д), из чего можно сделать вывод о том, что при коэкспрессии фрагменты YFP способны взаимодействовать и образовывать структуру YFP. При коэкспрессии YN-ER и YC-ER (соответствующие фрагмены YFP, слитые с лидерной последовательностью,

направляющей их в полость ЭПР, и С-концевым сигналом задержки в ЭПР HDEL) в обеих экспрессионных системах с помощью флуоресцентной микроскопии также детектировались флуоресцирующие клетки (Рис. 23. В, Е). При этом можно было наблюдать структуры, по морфологии характерные для структур ЭПР. При коэкспрессии YN и YC-ER также в обеих экспрессионных системах наблюдались флуоресцирующие клетки (Рис. 23. Г и Ж). При этом флуоресценция наблюдалась в ядре и цитоплазме, что позволяет предположить, что из-за неправильной транслокации в полость ЭПР часть YC-ER остается в цитоплазме и образует комплекс с YN. При анализе коэкспрессии YN-ER и YC образцы не отличались от контроля (трансфекция экспрессионным вектором, не содержащим какого-либо гена) и обнаружить флуоресцирующих клеток не удалось (Рис. 23. 3, И и данные не приводятся). Белковые экстракты из листьев, временно экспрессирующих все четыре варианта в присутствии или отсутствии супрессора сайленсинга НсРго, который использовался для повышения уровня экспресии, анализировались флуориметрически и вестерн-блотом, используя поликлональные антитела к YFP (Рис. 23. К, Л). Как и следовало ожидать, при флуориметрическом анализе наибольший сигнал детекировался в образцах, полученных из листьев, экспрессирующих YN-ER и YC-ER, а также YN и YC. Детектируемый флуоресцентный сигнал в образцах, полученных из листьев, экспрессирующих YN и YC-ER, был существенно ниже, в то время как флуоресцентный сигнал в образцах, полученных из листьев, экспрессирующих YN-ER и YC практически не отличался от базовой линии, соответствовавшей уровню аутофлуоресценции контроля (Рис. 23. К). Вестерн-блот образцов с использованием поликлональной сыворотки к YFP выявил, что YN и YC, экспрессированные по отдельности, не детектируются, что, вероятно, происходит из-за их быстрой деградации в цитоплазме (Рис. 23. Л). В отличие от YN и YC YN-ER и YC-ER при раздельной экспрессии детектировались, что предполагает их способность накапливаться в полости ЭПР (Рис. 23. Л). Примечательно, что в образцах из листьев, коэкспрессирующих YN и YC, а также YN-ER и YC-ER, несмотря на классическую процедуру денатурации, предшествующую электрофорезу, детектировалась зона, соответствующая полноразмерному YFP или YFP, слитному с двойным повтором последовательности локализации в ЭПР, что позволяет сделать вывод о высокой стабильности YFP, образованного из двух фрагментов. Таким образом, пара белков YN-ER и YC накапливаются в ЭПР и цитоплазме, соответственно, и из-за локализации в разных клеточных компартментах не могут взаимодействовать друг с другом и образовывать YFP.

Согласно предсказанию, сделанному с помощью биоинформатического пакета программного обеспечения ТМНММ (Krogh el al, 2001), белок ТБГ2 содержит два трансмембранных сегмента, а его N- и С-терминальные части транслоцированы в цитоплазму, в то время как петля, соединяющая гидрофобные участки, ориентирована в полость ЭПР (Рис. 24. А). Для проверки правильности этого предсказания in vivo, была сконструирована серия экспрессионных векторов, в которых ген белка ТБГ2 ВКВК был слит в одной рамке трансляции с YN или YC в трех вариантах: последовательности, кодирующие фрагменты YFP YN и YC встраивались таким образом, чтобы транслируемый белок содержал один из фрагментов YFP на N-конце, С-конце или внутри петли, соединяющей трансмембранные сегменты белка ТБГ2 (Рис. 24. Б). Полученные

УМ + УС

к 2000

1500

с ф

а Ф 1000 ы <п

О 5

500 .1

* УЫ + УС Ш - УЫ-ЕР + УС-ЕР а •> УМ + УС-ЕР!

в УМ-ЕРЗ + УС ш Уейог

г о > >-

а.

а. а. о + се

ш ш > + ш

г 6 г г

>- > > >

ос о ш >

о >-

сс ш

I и о.

УРР-

УМ -

УС-

о а. сг о

Рис. 23. У1М-ЕК и УС накапливаются в ЭПР и цитоплазме, соответственно, и из-за локализации в разных клеточных компартментах не могут взаимодействовать. (А)

Схематическое изображение использованных экспрессионных векторов. (Б-Г) Временная коэкспрессия белков УЫ и УС (Б), УЫ-ЕЯ и УС-ЕЯ (В), а также УЫ и УС-ЕЯ (Г) в эпидермальных клетках N. ЬешИатгапа после бомбардмента соответствующими экспрессионными векторами, визуализированная с помощью флуоресцентной микроскопии. (Д-И) Флуоресцентная микроскопия листьев N. ЬемИатшпа, экспрессирующих белки УЫ и УС (Д), УТЧ-ЕЯ и УС-ЕЯ (Е), УЫ и УС-ЕЯ (Ж), УЫ-ЕЯ и УС (3), или листа, трансфецированного вектором не несущим какого-либо гена. (К) Флуориметрический анализ белковых экстрактов из листьев, коэкспрессирующих указанные белки. (Л) Вестерн-блот образцов, полученных из листьев, экспрессирующих указанные белки. Масштабная линейка - 20 мкм. Вертикальные отрезки на гистограмме -стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

генноинженерные конструкции использовались для кобомбардмента совместно с соответствующими экспрессионными векторами, кодирующими

YN-TGBp2 i'-- ■ YC-TG8p2

TGBp2-YN >» i. TGBP2-YC >«

TG<YN>Bp2 >» '

□E

TG<YC>Bp2 гаг' > r

1500

о а о к

>r & $ S &

z o v Д O

>■ o "

Л i- ?r

■ а — / к YN-TG8p2 » YC

в TG<YC>Bp2 . YN-ER ЕЯ TG<YC>8p2 » YN-ER

а TGBP2-YN * YC Н v ... TGBp2-YN » YC

ER lumen

Cytoplasm

YN-6K

YC-6K 1'л ■ YC 6K

6K-YN ш 6K-YC »s

•«<! YN :

К YC

8 iooo i

S 500

Cytoplasm

Рис. 24. Разработка метода определения топологии интегральных мембранных белков in vivo. (А) Результат предсказания топологии белка ТБГ2с помощью алгоритмов ТМНММ (Krogh et al., 2001). (Б) Схематическое изображение экспрессионных кассет, использованных для кобомбардмента и агроинфильтрации с YN-ER и YC (Рис. 23. А). Микрофотографии, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии эпидермальных клеток N. benthaniana, экспрессирующих белки YN-TBG2 и YC (В), TG<YC>Bp2 и YN-ER (Г), а также TBG2-YN и YC (Д). Микрофотографии, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии клеток, экспрессирующих белки YN-TBG2 и YC (Е), TG<YC>Bp2 и YN-ER (Ж), а также TBG2-YN и YC (3). (И) Флуориметрический анализ белковых экстрактов из листьев N. benthamiana, коэкспрессирующих указанные белки. (К) Схематическое изображение ориентации белка ТБГ2 в мембране ЭПР in vivo, как следует из проведенных экспериментов. (Л). Схематическое изображение ориентации 6К. ВЖС в мембране ЭПР в соответствии с данными литературы (Peremyslov et al., 2004). (М) Схематическое изображение экспрессионных векторов, использованных для агроинфильтрации листьев N. benthaniana совместно с YN-ER или YC (Рис. 23. А). Флуориметрический анализ белковых экстрактов из листьев N. benthamiana, коэкспрессирующих указанные белки. Масштабные линейки (В-Д) - 20 мкм, (Е-3) - 5 мкм. Вертикальные отрезки на гистограмме - стандартная ошибка среднего, рассчитанная при анализе результатов трех независимых экспериментов.

комплементирующие фрагменты УБР — УЫ-ЕК или УС. Флуоресцентная микроскопия позволила выявить наличие флуоресцирующих клеток после кобомбардмента У1М-ТОВ2 и УС, ТО<УС>Вр2 и УМ-Г.Я, а также ТВ02-УЫ и УС

(Рис. 24. В-Д). Конфокальная микроскопия таких клеток показала, что флуоресценция локализовалась в структурах, морфологически характерных для структур ЭПР (Рис. 24. Е-3). При анализе результатов кобомбардмента YC-TGB2 и YN-ER, TG<YN>Bp2 и YC, а также TGB2-YC и YN-ER с помощью флуоресцентной микроскопии, выявить флуоресцирующие клетки не удавалось (данные не приводятся). Флуориметрический анализ белковых экстрактов из листьев N. benthamiana, коэкспрессирующих все шесть возможных вариантов подтвердил данные экспериментов с кобомбардментом: флуоресцентный сигнал наблюдался только в образцах из листьев, коэкспрессирующих YN-TGB2 и YC, TG<YC>Bp2 и YN-ER, а также TGB2-YN и YC (Рис. 24. И). Таким образом, можно сделать вывод о том, что белок ТБГ2 располагается в мембране ЭПР клеток таким образом, что его N- и С-концевые участки ориентированы в цитоплазму, в то время как внутренняя петля, соединяющая трансмембранные сегменты, транслоцирована в люмен ЭПР (Рис. 24. К).

Для проверки применимости разработанного метода была протестирована возможность его применения к белку 6К вируса желтухи свеклы (ВЖС), для которого ранее было показано, что он принадлежит к типу III трансмембранных белков (Peremyslov et al., 2004; Рис. 24. JI). Для коэкспрессии с YN-ER и YC была также сконструирована серия экспрессионных векторов, содержащих гены слитных белков YN-6K, YC-6K, 6K-YN и 6K-YC (Рис. 24. М). Флуориметрический анализ белковых экстрактов из листьев N. benthamiana, коэкспрессирующих четыре возможных варианта выявил, что сигнал детектировался в только образцах из листьев, коэкспрессирующих YC-6K и YN-ER, а также 6K-YN и YC (Рис. 24. Н). Таким образом, можно сделать вывод о том, что 6К ВЖС N-концевым участком ориентирован в полость ЭПР, в то время как С-концевой участок транслоцирован в цитоплазму. Такие данные хорошо согласуются с литературными данными о том, что 6К ВЖС относится к типу III интегральных мембранных белков (Peremyslov et al., 2004). Таким образом, можно обобщить, что успешно разработан и апробирован новый метод на основе БиФК, который применим для определения топологии интегральных мембранных белков in vivo.

выводы

1. Протеолитическая активность метакаспазы растений mcII-Pa необходима для развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе и в условиях стресса.

2. На начальных этапах программируемой клеточной смерти mcII-Pa локализуется в цитоплазме, в то время как при развитии программируемой клеточной смерти mcII-Pa транслоцируется в ядро и инициирует его деградацию.

3. Эволюционно-консервативный многофункциональный белок TSN является необходимым фактором выживаемости клеток у растений и у животных. Протеолитическое расщепление TSN негативно влияет на функциональную активность белка.

4. У растений протеолитическое расщепление TSN осуществляет аргинин/лизин-специфичная метакаспаза. У животных протеолитическое расщепление TSN осуществляет аспартат-специфичная каспаза-3.

5. Вирусный белок ТБГЗ обеспечивает внутриклеточный транспорт белков ТБГ1 и ТБГ2 в периферические мембранные структуры, являющиеся производными кортикального эндоплазматического ретикулума. Образование таких структур необходимо для транспорта белка ТБГ1 в плазмодесмы и в соседние клетки.

6. Вирусные интегральные мембранные белки ТБГЗ и цистеин богатый белок вируса курчавости верхушек картофеля индуцируют стресс эндоплазматического ретикулума, приводящий к развитию программируемой клеточной смерти.

7. Вирусы растений используют специальные молекулярные механизмы для снижения уровня экспрессии интегральных мембранных белков, вызывающих развитие программированной клеточной смерти.

8. С помощью специально разработанного нового метода определена топология некоторых вирусных интегральных мембранных белков in vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК и/или индексируемых в базах данных Web of Science и Scopus.

1. Kalinina, N.O., Rakitina, D.A., Yelina, N.E., Zamyatnin, A.A. Jr., Stroganova, T.A., Klinov, D.V., Prokhorov, V.V., Ustinova, S.V., Chernov, B.K., Schiemann, J., Solovyev, A.G., Morozov, S.Yu. RNA-binding properties of the 63 kDa protein encoded by the triple gene block of poa semilatent hordeivirus. // Journal of General Virology. -2001.-T. 82. - №. 10.-C. 2569-2578.

2. Zamyatnin, A.A. Jr., Solovyev, A.G., Sablina, A.A., Agranovsky, A.A., Katul, L., Vetten, H.J., Schiemann, J., Hinkkanen, A.E., Lehto, K., Morozov, S.Yu. Dual-colour imaging of membrane protein targeting directed by Poa semilatent virus movement protein TGBp3 in plant and mammalian cells. // Journal of General Virology. - 2002. -T. 83. — №. 3. — C. 651-662.

3. Gorshkova, E.N., Erokhina, T.N., Stroganova, T.A., Yelina, N.E., Zamyatnin, A.A. Jr., Kalinina, N.O., Schiemann, J., Solovyev, A.G., Morozov, S.Yu. Immunodetection and fluorescent microscopy of transgenically expressed hordeivirus TGBp3 movement protein reveals its association with endoplasmic reticulum elements in close proximity to plasmodesmata. // Journal of General Virology. — 2003. — T. 84. — №.

4. - C. 985-994.

4. Savenkov, E.I., Germundsson, A., Zamyatnin, A.A. Jr., Sandgren, M., Valkonen, J.P.T. Potato mop-top virus: the coat protein-encoding RNA and the gene for cysteine-rich protein are dispensable for systemic virus movement in Nicotiana benthamiana. // Journal of General Virology. - 2003. -T. 84. -№. 4. - C. 1001-1005.

5. Zamyatnin, A.A. Jr., Solovyev, A.G., Savenkov, E.I., Germundsson, A., Sandgren, M., Valkonen, J.P.T., Morozov, S.Yu. Transient coexpression of individual genes encoded by the triple gene block of Potato mop-top virus reveals requirements for TGBpl trafficking. // Molecular Plant-Microbe Interactions. - 2004. - T. 17. - №. 8. - C. 921-930.

6. Schepetilnikov, M.V., Manske, U., Solovyev, A.G., Zamyatnin, A.A. Jr., Schiemann, J., Morozov, S.Yu. The hydrophobic segment of Potato virus X TGBp3 is a major determinant of the protein intracellular trafficking. // Journal of General Virology. - 2005. - T. 86. - №. 8. - C. 2379-2391.

7. Lukhovitskaya, N.I., Yelina, N.E., Zamyatnin, A.A. Jr., Schepetilnikov, M.V., Solovyev, A.G., Sandgren, M., Morozov, S.Yu., Valkonen, J.P.T., Savenkov, E.I. Expression, localization and effects on virulence of the cysteine-rich 8 kDa protein of Potato mop-top virus. // Journal of General Virology. - 2005. - T. 86. - №. 10. — C. 2879-2889.

8. Bozhkov, P.V., Suarez, M.F., Filonova, L.H., Daniel, G., Zamyatnin, A.A. Jr., Rodriguez-Nieto, S., Zhivotovsky, В., Smertenko, A. Cysteine protease mcll-Pa executes programmed cell death during plant embryogenesis // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2005. - T. 102. - №. 40. — C. 14463-14468.

9. Zamyatnin, A.A. Jr., Solovyev, A.G., Bozhkov, P.V., Valkonen, J.P.T., Morozov, S.Yu., Savenkov, E.I. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. // The Plant Journal. - 2006. - T. 46. - №. 1. - C. 145-154.

10. Антоненко Ю.Н., Аветисян A.B., Бакеева Jl.E., Черняк Б.В., Чертков В.А., Домнина Л.В., Иванова О.Ю., Изюмов Д.С., Хайлова Л.С., Клишин С.С.,

Коршунова Г.А., Лямзаев К.Г., Мунтян М.С., Непряхина O.K., Пашковская A.A., Плетюшкина О.Ю., Пустовидко A.B., Рогинский В.А., Рокицкая Т.И., Рууге Э.К., Сапрунова В.Б., Северина И.И., Симонян P.A., Скулачев И.В., Скулачев М. В., Сумбатян Н.В., Свиряева И.В., Ташлицкий В.Н., Васильев Ю.М., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С., Замятин A.A. (мл.), Скулачев В.П. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения 1. Катионные производные пластохинона: синтез и исследование in vitro. // Биохимия. -2008. -Т.73. -№ 12.-С. 1589-1606.

11. Sundstrom, J.F., Vaculova, A., Smertenko, А.Р., Savenkov, E.I., Golovko, A., Minina, E., Tiwari, B.S., Rodriguez-Nieto, S., Zamyatnin, A.A. Jr., Valineva, Т., Saarikettu, J., Frilander, M.J., Suarez, M.F., Zavialov, A., Stahl, U., Hussey, P.J., Silvennoinen, O., Sundberg, E., Zhivotovsky, В., Bozhkov, P.V. Tudor staphylococcal nuclease is an evolutionarily conserved component of the programmed cell death degradome. // Nature Cell Biology. - 2009. - Т. 11. - №. 11. - С. 1347-1354.

12. Замятнин A.A. (мл.), Лямзаев К.Г., Зиновкин P.A. А—»^-редактирование РНК: вклад в многообразие транскриптома и развитие организмов. // Биохимия, — 2010.-Т. 75.-№ 11.-С. 1489-1498.

13. Skulachev, M.V., Antonenko, Yu.N., Anisimov, V.N., Chernyak, B.V., Cherepanov, D.A., Chistyakov, V.A., Egorov, M.V., Kolosova, N.G., Korshunova, G.A., Lyamzaev, K.G., Plotnikov, E.Yu., Roginsky, V.A., Savchenko, A.Yu., Severina, I.I., Severin, F.F., Shkurat, T.P., Tashlitsky, V.N., Shidlovsky, K.M., Vyssokikh, M.Yu., Zamyatnin, A.A. Jr., Zorov, D.B., Skulachev, V.P. Mitochondrial-targeted plastoquinone derivatives. Effect on senescence and acute age-related pathologies. // Current Drug Targets. - 2011. - T. 12. - №. 6. - C. 800-826.

14. Богданов A.A., Зиновкин P.A., Замятнин A.A. (мл.). Редактирование РНК: нарушая догму.//Биохимия,-2011.-Т. 76.-№8.-С. 1061-1063.

15. Соловьева А. Д., Фролова О.Ю., Соловьев А.Г., Морозов С.Ю., Замятнин A.A. (мл,). Влияние митохондриально-адресованного антиоксиданта SkQl на программируемую клеточную смерть, индуцированную вирусными белками в растениях табака // Биохимия. - 2013. - Т. 78. - № 9. - С. 1284-1292.

Статьи в других международных научных изданиях

16. Solovyev, A.G., Stroganova, Т.А., Zamyatnin, A.A. Jr., Schiemann, J., Morozov, S.Yu. Functional interaction of triple gene block movement proteins: cooperative subcellular sorting of poa semilatent virus membrane proteins. // Beiträge zur Züchtungsforschung. - 2000. - Т. 6. - №. 3. - С. 106-110.

17. Zamyatnin, A.A. Jr., Yelina, N.E., Lukhovitskaya, N.I., Solovyev, A.G., Germundsson, A., Sandgren, M., Morozov, S.Yu., Valkonen, J.P.T., Savenkov, E.I. High-Scale Analysis of Pathogenicity Determinants of Potato mop-top virus. // NATO Science Series, I: Life and Behavioural Sciences. - 2006. - T. 371. - C. 320-324.

Избранные тезисы устных и стендовых докладов

18. Erokhina, T.N., Strogonova, Т.А., Zamyatnin A.A. Jr., Yelina, N.E., Solovyev, A.G., Schiemann, J., Morozov, S.Yu. Monoclonal antibodies againist Poa smilatent virus movement protein: in vivo detection and subcellular localization of the triple gene block-enoded betaC protein. // Programme and Abstracts of IXth Conference on Virus Diseases of Gramineae in Europe, York, UK. -21-23 May 2001.

19. Замятины А.А. (мл.), Савенков Е.И. Валконен Я., Соловьев А.Г., Морозов С.Ю. Внутриклеточный транспорт белков тройного блока генов вируса курчавости верхушек картофеля. // Тезисы научных докладов Ш-го съезда биохимического общества, СПб., - 26 июня - 1 июля 2002 года. - С. 76-77.

20. Соловьев А.Г., Замятнин А.А. (мл.), Морозов С.Ю. Внутриклеточный транспорт мембранных белков, кодируемых вирусами растений. // Тезисы научных докладов Ш-го съезда биохимического общества, СПб., - 26 июня - 1 июля 2002 года.-С. 113.

21. Zamyatnin, А.А. Jr., Solovyev, A.G., Savenkov, E.I., Morozov, S.Yu., Valkonen, J.P.T. Intracellular trafficking of the proteins encoded by the triple gene block of Potato mop-top virus. // Offered papers of Vlllth International Congress of Plant Pathology, Christchurch, New Zealand. - 2-7 February 2003.

22. Zamyatnin, A.A. Jr., Yelina, N.E., Savenkov, E.I., Solovyev, A.G., Germundsson, A., Sandgren, M., Morozov, S.Yu., Valkonen, J.P.T., Studies on Potato mop-top virus 8-kDa protein. // Volume of Abstracts of 11th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St. Petersburg, Russia. - 18-27 July 2003. - PI83.

23. Solovyev, A.G., Schepetilnikov, M.V., Zamyatnin, A.A. Jr., Schiemann, J., Morozov, S.Yu. Membrane trafficking of triple gene block-encoded virus movement proteins. // Volume of Abstracts of 11th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St. Petersburg, Russia. - 18-27 July 2003. - P190.

24. Kalashnikova, S.V., Klinov, D.V., Prokhorov, V.V., Demin, V.V., Kalinina, N.O., Rakitina, D.A., Yelina, N.E., Zamyatnin, A.A. Jr., Stroganova, T.A., Chernov, B.K., Schiemann, J., Solovyev, A.G., Morozov, S.Yu. Atomic-Force Microscopy of RNA-protein complexes. // Proceedings of Scanning Probe Microscopy-2003, - Nizhny Novgorod, Russia. - 2-5 March 2003. - P. 268.

25. Zamyatnin, A.A. Jr., Yelina, N.E., Lukhovitskaya, N.I., Solovyev, A.G., Germundsson, A., Sandgren, M., Morozov, S.Yu., Valkonen, J.P.T., Savenkov, E.I. High-Scale Analysis of Pathogenicity Determinants of Potato mop-top virus. // BMC Plant Biology. - 2005. - T. 5. - №. Suppl 1. - C. S39.

26. Zamyatnin, A.A. Jr., Solovyev, A.G., Bozhkov, P.V., Valkonen, J.P.T., Morozov, S.Yu., Savenkov, E.I. Assessment of the integral membrane protein topology in living plant cells. // Abstract Book of XXII SPPS Congress, Umel Sweden. - 16-19 June 2005.

27. Кравченко Д.В., Усков A.M., Замятнин A.A. мл. Оптимизация процесса получения оздоровленных микрорастений картофеля из меристематических эксплантов с использованием препарата SkQl. // Материалы научно-практической конференции и координационного совещания «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства», РАСХН, ВНИИКХ М., - 2008. - Т.1. -С. 330-337.

28. Долгих Ю.И., Степанова А.Ю., Чичкова Н.В., Соловьев А.Г., Замятнин А.А. мл., Вартапетян А.Б., Морозов С.Ю. Инновационное исследование влияния соединения SkQl на регенирацию каллусов и программируемое отмирание тканей у картофеля и других сельскохозяйственных растений. // Материалы научно-практической конференции и координационного совещания «Научное обеспечение и инновационное развитие картофелеводства», РАСХН, ВНИИКХ М., - 2008. - Т. 1,-С. 338-348.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК — активные формы кислорода

БиФК - бимолекулярная флуоресцентная комплементация БО - белок оболочки

ВЗПГ — вирус зеленой пятнистости гибискуса

ВМБ - вирус мозаики бамбука

ВТМ - вирус табачной мозаики

ВЖС - вирус желтухи свеклы

ВШМЯ - вирус штриховатой мозаики ячменя

киРНК - короткие интерферирующие РНК

ОНБ - ответ на несвернутый белок

оцРНК - одноцепочечная РНК

ПААГ - полиакриламидный гель

ПД - плазмодесма

ПКС - программируемая клеточная смерть

ПЛВМ - полулатентный вирус мятлика

сгРНК - субгеномная РНК

ТБГ - тройной блок генов

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ХВК - X вирус картофеля

dsRed — красный флуоресцентный белок

dTp - З'-дезокситимидин фосфат

GFP - зеленый флуоресцентный белок

pdTp - 3', 5'-дезокситимидин бисфосфат

SN - стафилококковая нуклеаза

YFP - желтый флуоресцентный белок

Заказ № 24-88-11-2013 Подписано в печать 01.11.2013 Тираж 120 экз.

Типография «Белый Свет». Тел. (499)709-33-17 dm@mrcl.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Замятнин, Андрей Александрович, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» Научно-исследовательский институт физико-химической биологии

имени А.Н.Белозерского

На правах рукописи

05201352085 ЗАМЯТНИН Андрей Александрович

Молекулярные основы некоторых путей развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе, стрессе и вирусной инфекции

03.01.03 - молекулярная биология 03.02.02 - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................................4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................8

Введение...............................................................................................................8

Классификация типов ПКС у животных.........................................................11

Классификация типов ПКС у растений...........................................................31

Каспазы и их субстраты....................................................................................39

Каспазо-подобные ферменты и их субстраты вне Metazoa...........................60

Стресс ЭПР и ответ на несвернутый белок (ОНБ).........................................69

Вирусная инфекция и стресс ЭПР...................................................................76

Заключение.........................................................................................................93

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................96

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ............................................................112

4.1. Метакаспаза растений mcII-Pa является аргинин/лизин-специфичной цистеиновой протеиназой...............................................................................112

4.2. Протеолитическая активность метакаспазы растений mcII-Pa необходима для развития ПКС.......................................................................116

4.3. Белок TSN является консервативным компонентом деградома растений и животных.......................................................................................................124

4.4. Отдельные молекулярные пути развития ПКС являются неизменными у представителей различных царств живых организмов.............................140

4.5. Белок ТБГЗ направляет внутриклеточный и межклеточный транспорт вирусов, содержащих ТБГ..............................................................................142

4.6. Мембранные белки ТБГЗ и цистеин богатый белок вызывают стресс ЭПР, приводящий к ПКС................................................................................154

4.7. Вирусы растений используют специальные механизмы для снижения уровня экспрессии своих белков, которые могут вызывать развитие ПКС ............................................................................................................................157

4.8. Разработка метода определения топологии мембранных белков in vivo ............................................................................................................................165

4.9. Заключение................................................................................................172

5. ВЫВОДЫ........................................................................................................177

Список работ, опубликованных по теме диссертации....................................179

Список сокращений............................................................................................185

Благодарности......................................................................................................186

6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................187

1. ВВЕДЕНИЕ

Программируемая клеточная смерть (ПКС) является особой формой гибели клетки, инициированной внутриклеточной программой. Разные формы ПКС встречаются практически у всех эукариотических организмов, включая одноклеточные. Апоптоз является одним из трех основных типов клеточной смерти, встречаемых у животных. В сравнении с двумя другими основными типами клеточной смерти у животных - аутофагией и регулируемым некрозом - процессы апоптоза к настоящему времени исследованы лучше всего как с биохимической, так и с морфологической точек зрения. Классический апоптоз сопровождается характерными морфологическими признаками: округлением погибающей клетки, снижением клеточного объема, конденсацией хроматина, сегментацией ядра и очень небольшими ультраструктурными модификациями цитоплазматических органелл. Кроме того, наблюдается сморщивание плазматической мембраны, которая, однако не теряет непроницаемости до финальных стадий процесса клеточной смерти, а также разделение погибающей клетки на части, известные как апоптотические тельца. В конце процесса такие апоптотические тельца поглощаются фагоцитами и деградируют внутри них с помощью лизосом.

В отличие от животных у растений, как и у многих представителей других царств живых организмов, как минимум, по двум причинам по определению не может быть «классического» апоптоза: (i) из-за наличия плотной клеточной стенки, что делает невозможным образование апоптотических телец; (и) из-за отсутствия у растений клеток, способных к фагоцитозу (van Doom et al., 2011).

пока охарактеризованы очень не полно. Для того, чтобы унифицировать критерии для определения разных типов клеточной смерти у животных, был создан комитет по номенклатуре клеточной смерти, который периодически публикует и обновляет рекомендации по использованию терминов в данной области. При этом, по мере накопления новых данных о молекулярных механизмах развития процессов ПКС рекомендуется переходить от морфологических определений к биохимическим (Galluzzi et al., 2012). Аналогичная работа по классификации типов клеточной смерти проводится сообществом исследователей, изучающих ПКС в растениях (van Doom et al., 2011).

Каспазы являются идеальными эффекторами для обеспечения процессов ПКС по трем причинам. Во-первых, каспазы конститутивно экспрессируются в виде неактивного зимогена. Таким образом, некоторое их количество постоянно присутствует в клетке и после активации может выполнить свою функцию в достаточно сжатые сроки. Во-вторых, реакции протеолитического расщепления, катализируемые каспазами, являются необратимыми. В третьих, существенным преимуществом является определенная полиспецифичность каспаз, что обусловливает расщепление, с одной стороны, многих субстратов, а с другой - нерасщепление абсолютно всех белков. У представителей царства животных каспазы достаточно консервативны, однако их количество и типы могут сильно варьировать у разных организмов.

растений детектируется каспазо-подобная активность (Bonneau et al., 2008), стимулировало исследователей применить специальные

биоинформатические методы, которые позволили обнаружить у растений очень отдаленных родственников протеиназ, относящихся к семейству каспаз, - метакаспазы (Uren et al., 2000). Кроме того, к настоящему времени охарактеризовано еще несколько протеиназ, активность которых, как считается, необходима при развитии некоторых видов ПКС у растений. Такими протеиназами являются: вакуолярный процессирующий фермент (VPE), представитель субтилизин-подобного семейства протеиназ, названный фитаспазой, а также еще две сериновые протеиназы SAS-1 и SAS-2 (Chichkova et al2010; Coffeen and Wolpert 2004; Hatsugai et al., 2004). Несмотря на то, что у животных известно более тысячи природных субстратов каспаз (Crawford et al., 2013), у растений к настоящему времени охарактеризован единственный природный субстрат протеиназ, обеспечивающих развтие ПКС в растениях. Им является субстрат фитаспазы - белок VirD2, но его расщепленее фитаспазой скорее всего не связано с процессами развития ПКС (Chichkova et al., 2010).

эукариотическим организмам. Недавно было показано, что инфекция, вызываемая X вирусом картофеля (ХВК) у растений, а также вирусспецифический гидрофобный транспортный белок ТБГЗ ХВК способны индуцировать стресс ЭПР, ОНБ и, в некоторых условиях, последующее развитие ПКС (Ye et al., 2011; 2013). Несмотря на активные исследования, проводимые в последние годы, механизмы, используемые вирусами для осуществления тонких настроек фундаментальных процессов развития ОНБ для обеспечения собственной продуктивной инфекции, до сих пор остаются, во многом, неясными (Zhang and Wang 2012).

Настоящая работа была направлена на выявление новых молекулярных механизмов развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе, стрессе и вирусной инфекции. Для этого нами были поставлены и реализованы следующие задачи:

1. Охарактеризовать функциональную роль метакаспазы растений mcll-Ра в процессах развития ПКС при морфогенезе и в условиях стресса.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

В XIX веке и в первой половине XX века учеными из разных стран постепенно накапливались данные о том, что отдельные клетки погибают в ходе развития разных организмов (Ма§118оисП е/ а1, 2012). Получению этих данных способствовало открытие немецких химиков в середине XIX века, которые показали возможность прокрашивания тканей с помощью экстрактов, полученных из растений, животных и минералов. При этом отдельные клетки в ткани - в норме прозрачные - окрашивались и становились видны с помощью микроскопа. Это открытие положило начало развитию гистологии. Почти сразу стало понятно, что часть из ставших видимыми клеток в тканях подвергаются гибели. В 1842 году Карл Фогт, изучая амфибий, заметил, что в процессе их метаморфоза исчезает хорда. Он сделал предположение о том, что такой процесс является физиологическим (]У^Ь8оисИ еЬ а1, 2012). В 1862 году Август Вейсман наблюдал похожий процесс в ходе метаморфоза насекомых, и, введя термин гистолиз, описал процесс гибели клеток (]У^118оисН е/ а/., 2012). Во второй половине XIX века и в первой половине XX века разные ученые описали гибель многих других типов клеток: хондроцитов, клеток фолликулов яичника, миоцитов и миофибрилл, сенсорных нейронов, и многих других. В итоге в 1951 году Алекс Глюксман опубликовал монументальный обзор, в котором объединил данные о почти 100 видах клеточной смерти, происходящей в процессах раннего развития позвоночных (СШскБшапп, 1951). Значительная часть этой работы сосредоточена на объяснении смысла клеточной смерти в разных случаях и рассматривает процесс гибели клеток, как нормальный аспект развития.

Другим важным открытием конца XIX века, имеющим непосредственное отношение к основной теме работы, явилось открытие процесса фагоцитоза И.И. Мечниковым, который в опытах на личинках

морских звезд наблюдал как особые подвижные клетки поглощают частички введенной в личинку красной краски кармина. И.И. Мечников назвал блуждающие клетки фагоцитами (от греческих слов cpayeiv - пожирать и Kuxoç - клетка). В дальнейших исследованиях Мечников наблюдал фагоцитоз у дафний, лягушек, черепах, ящериц и млекопитающих (Metschnikoff, 1883; Maghsoudi et al., 2012).

В 50-е годы XX века произошел серьезный прорыв в развитии методов биологических исследований. Принципиально улучшилось качество световых микроскопов, появилась электронная микроскопия, дифференциальное центрифугирование и др. Таким образом, в руках исследователей появился новый набор методов, позволяющий проводить постановку экспериментов на новом уровне и решать новый круг научных задач. В итоге Кристианом де Дювом были открыты лизосомы и выдвинута гипотеза о том, что их разрушение приводит к клеточной смерти, а сами лизосомы являются «контейнерами самоубийства» (suicide bags) (De Duve, 1957). Эта гипотеза стала первой попыткой объяснить механизм клеточной гибели.

В середине 60-х годов американский клеточный биолог Ричард Локшин, исследуя метаморфоз насекомых, сопровождаемый смертью клеток в определенный момент времени под действием гормонов, предложил термин программируемая клеточная смерть. Данный термин должен подчеркивать, что физиологическая смерть клеток может регулироваться на генетическом уровне (Lockshin, 2008).

В 1972 году Джон Керр и коллеги предложили новый термин «апоптоз» (греч. шгблтюоц; - опадание листьев) для того, чтобы описать серию событий, сопровождающих смерть клеток в различных ситуациях, включающих как морфогенез, так и стресс (Kerr et al., 1972).

Исследования развития Caenorhabditis elegans показали, что в процессе нормального онтогенеза всегда погибает ровно 131 из 1090 клеток нематоды (Horvitz, 2003). Очевидно, что объяснить такой факт можно только с

помощью генетики, тем более что у С. elegans смерть этих 131-й клеток оказалась зависимой от экспрессии одного гена ced-З, кодирующего цистеиновую протеиназу (Ellis and Horvitz 1986). Постепенно стало понятно, что основы молекулярных механизмов, ответственных за программируемую клеточную смерть, очень консервативны у животных, начиная от нематоды и заканчивая человеком. Исключительную важность этих открытий подчеркивает вручение Сиднею Бреннеру, Роберту Хорвицу и Джону Сулстону Нобелевской премии по физиологии и медицине в 2002 году.

Интенсивное изучение представителей других живых организмов показало, что программируемая клеточная смерть не является уникальным явлением только для царства животных и широко распространена среди дрожжей и растений. Например, у растений ГЖС играет важную роль при эмбриогенезе, формировании проводящих пучков, в процессах защиты от стрессов и патогенов. В то же время несмотря на необходимость ПКС для обеспечения нормальных процессов онтогенеза и защиты от стресса и патогенов, пути развития клеточной смерти у растений и у животных сильно различаются как на морфологическом, так и на биохимическом уровнях (van Doom et al., 2011). Наличие плотной клеточной стенки и отсутствие фагоцитирующих клеток у растений делает невозможным образование апоптотических телец и их последующего фагоцитоза макрофагами или другими соседними клетками. Именно такие процессы являются основными морфологическими признаками апоптоза у животных. Поэтому в ходе развития ПКС растительные клетки используют литические вакуоли для обеспечения аутофагии (van Doom et al., 2011). Неудивительно что в геномах растений, а также в геномах представителей других царств, исключая царство животных, отсутствуют гены, кодирующие ключевые белки, участвующие в апоптозе животных.

Классификация типов ПКС у животных

Интенсивные исследования ПКС в течении последних 30-ти лет выявили большое разнообразие в типах развития клеточной смерти, встречающихся у одного и того же организма. Многие типы клеточной смерти описаны морфологически, однако данные об их биохимических механизмах отсутствуют. Для унификации критериев разных типов клеточной смерти у животных был создан комитет по номенклатуре клеточной смерти (Nomenclature Committee on Cell Death; NCCD), который периодично публикует и обновляет рекомендации по использованию терминов в данной области (Kroemer et al., 2005, 2009, Galluzzi et al., 2012). По мере развития молекулярных методов исследований

Информация о работе

Замятнин, Андрей Александрович
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Молекулярные основы некоторых путей развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе, стрессе и вирусной инфекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Молекулярные основы некоторых путей развития программируемой клеточной смерти при морфогенезе, стрессе и вирусной инфекции - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы