Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности функционирования антиоксидантной системы растений при индуцированном апоптозе

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Особенности функционирования антиоксидантной системы растений при индуцированном апоптозе"

005010548

На правах рукописи

ГАГАРИНА АННА ЮРЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ ПРИ ИНДУЦИРОВАННОМ АПОПТОЗЕ

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Воронеж-2012

005010548

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет».

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Павловская Нинэль Ефимовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент

Наквасина Марина Александровна

кандидат биологических наук Божко Ольга Юрьевна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО

«Орловский государственный университет»

Защита состоится «2» марта 2012 года в /? часов на заседании

диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет».

Автореферат разослан « » января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Брехова Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Открытие программируемой гибели клеток (ПГК) многоклеточных организмов явилось мощным стимулом в развитии биологии. Познания особенностей программируемой гибели клеток растений позволят управлять процессами их роста, развития и старения, понять многие физиологические и патологические процессы, происходящие в клетке.

Апоптоз играет важную роль в реализации программы развития в онтогенезе и поддержании тканевого гомеостаза организма. Являясь важной составляющей иммунитета, апоптоз вовлечен в защитные реакции животных и растений на инфекционные возбудители. Реализация программируемой гибели клеток при различных патологических состояниях происходит путем удаления клеток, тем самым способствуя сохранению нормального функционирования биологической системы.

Современные представления об апоптозе основываются на результатах электронно-микроскопических и биохимических исследований и как особый вариант клеточной смерти были открыты Kerr J.F., et al. (1972).

Несмотря на большое количество экспериментальных данных, до сих пор не исследованы многие механизмы и пути регуляции апоптоза отдельных клеток в целостном многоклеточном организме.

Ряд компонентов клеток растений способен активировать программируемую гибель клеток и у растений и у животных, в том числе опухолевых (Fingrut О., Flescher Е., 2002).Сравнительный анализ показывает, что некоторые факторы, участвующие в реализации программируемой гибели клеток, универсальны для всех эукариот, однако растения могут использовать и уникальные пути (Lam Е., et al., 2001).

В отличие от некроза, программируемая гибель клеток генетически обусловлена, что доказано на животных организмах. На растениях этот вопрос изучается Lain S.(CLUA), Pavid L. (Великобритания), Arpagaus. S, Broendle R. (Бернский университет, Швейцария), Khurshed 1. (университет Кашмир, Индия) и др. В России единственной пока школой, занимающейся проблемой апоптоза, является МГУ им. М.В. Ломоносова (Ванюшин и др., 1987-2009; Скулачев, 1999-2009, Самуилов,2009).

Вместе с тем, не ясным остается вопрос, какой или какие факторы клеток приводят к ее гибели по апоптозному типу, являются ли они общими для однодольных и двудольных растений, какую роль играет в этом процессе антиоксидантная система и теломераза.

Цель и задачи исследований. В связи с этим целью работы является сравнительное исследование проявления апоптоза у различных растительных культур и изучение влияния апоптозных компонентов на начальные стадии развития однодольных и двудольных растений.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение предполагаемых индукторов апоптоза из молодого листа монстеры, колеоптилей пшеницы и ячменя;

2. Изучение изменения в структуре ДНК в полученных проростках гороха, пшеницы и ячменя на вторые - десятые сутки эксперимента;

3. Выявление активности теломеразы методом ТЯАР-анализа на проростках гороха, пшеницы и ячменя в динамике;

4. Изучение активности ферментов антиоксидантной системы:

супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы, аскорбатпероксидазы,

содержание малонового диальдегида, каротиноидов, витаминов С, Е в проростках гороха, пшеницы и ячменя в процессе развития;

5. Разработка модели апоптоза у растений.

Научная новизна работы. Впервые проведены сравнительные исследования проявления естественного апоптоза в колеоптилях пшеницы, ячменя и при формировании листа монстеры. Изучено индуцирование апоптоза на основе фрагментации ДНК, активности ферментов

антиоксидантной системы и динамики накопления низкомолекулярных антиоксидантов на начальных стадиях развития растений. Впервые изучена активность теломеразы в норме и при апоптозе. Разработана биохимическая модель апоптоза растительных клеток, заключающаяся в регистрации изменения активности антиоксидантов, нарушении проницаемости мембран, фрагментации ДНК по типу «лесенки» и активности теломеразы.

Практическая и теоретическая значимость работы. Полученные результаты исследований форм гибели клеток у растений расширяют представление о роли биоэнергетических систем клетки и активных форм кислорода в программируемой гибели клеток. Программируемая гибель клеток играет важную роль в иммунитете растений, что может дать ключ к созданию новых сортов сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам. Контроль над некрозом и апоптозом растений позволит создавать средства, регулирующие

продолжительность жизни, синхронность созревания урожая. На основании полученных данных можно прогнозировать довизуальные симптомы генетических нарушений, происходящих в живых объектах под влиянием экстремальных факторов, осуществлять мониторинг окружающей среды. Отдельные положения работы могут быть использованы в преподавании практического курса по физиологии и биохимии растений.

Положения выносимые на защиту.

- Выделены компоненты индукции апоптоза из вытяжек колеоптилей ячменя, пшеницы и молодого листа монстеры.

- Апоптоз у растений выявляется с помощью ДНК- «лесенки», активности антиоксидантной системы и активности теломеразы.

- Проявление апоптоза у однодольных и двудольных растений идентично.

- Модель физиолого-биохимической трансформации метаболизма растительных клеток при их апоптозе заключается в изменении активности антиоксидантов, нарушении проницаемости мембран, фрагментации ДНК по типу «лесенки» и снижении активности теломеразы.

Аппобацня работы. Материалы диссертации были доложены: на Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик» (Курск, 2009), региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Роль молодых ученых и специалистов в повышении эффективности растениеводства» (Орел, 2009), «Теоретические основы применения биотехнологии, генетики и физиологии растений в современной селекции растений и растениеводстве» (Брянск, 2009), Московской Международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010), , конкурсе молодых ученых на лучшую научно — исследовательскую работу в рамках Московского международного конгресса « Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 15-17 марта 2010), на II, III этапе Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов, молодых ученых высших учебных заведений Минсельхоза России в номинации « Сельскохозяйственные науки» (Курск, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в т.ч. 3 в журналах рецензируемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, заключения, приложения, списка литературы, включающего 231 источников, из них 170 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 62 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Диссертационная работа выполнена в период с 2008-2011 г.г. в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно технического комплекса Российской Федерации», приоритетное направление «живые системы», пункт 6 « клеточные технологии», утвержденной президентом РФ от 11 июля 2011г.

Объекты исследований. Пшеница (Triticum aesiivum) - сорт «Московская 39», горох (Pisum sativum) - сорт «Норд», ячмень (Hordeum sativum L.) - сорт «Скарлет», листья монстеры (Monstera deliciosa L.).

Исследования проводились на водных культурах путем выращивания в программируемой климатокамере “Фитотрон” (производства компании Biokom) при температуре 25°С и отсутствии освещенности (этиолирование).

Для получения индукторов апоптоза из колеоптилей семена пшеницы и ячменя этиолировали в кювете на влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили отделяли от прочих органов проростка, и дальнейший эксперимент вели с навеской, равной 2 грамма. Из колеоптилей брали вытяжку клеточного сока, равную 1мл, и центрифугировали в течение 15 минут при 15000 об/мин.

Для подготовки проб монстеры из молодых листьев брали пробы в местах предполагаемой перфорации лопастей.

Индуктором воздействовали на семена исследуемых культур при замачивании в течение 2-х часов.

Проращивание обработанных семян проведено в рулонах фильтровальной бумаги по ГОСТ - 12038-84.

Экспериментальная работа проводилась на базе «Орловского регионального биотехнологического центра сельскохозяйственных растений» ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный Университет».

Методы исследований. Выделение и электрофоретический анализ состояния ДНК производились с помощью набора реагентов и методики, разработанной предприятием Biokom. Фотографии гелевой пластины получают на ультрафиолетовом трансиллюминаторе (Biokom), используя способность комплекса бромистого этидия с ДНК светиться в ультрафиолетовом свете (Шевелуха и др., 2003). Для определения активности каталазы (КФ 1.11.1.6) в растениях была использована методика А.И. Ермакова (1987) с модификациями JI.E. Иваненко (1997). Активность пероксидазы (КФ 1.11.1.7) растений определяли колориметрическим методом Бояркина с модификациями (Плешков, 1985). Для определения активности супероксидцисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.1) была использована модифицированная методика (Giannopolities and Ries, 1977) с использованием фотореактора (Гринблат, 2007). Активность аскорбатпероксидазы (КФ 1.10.3.3) определяли по интенсивности поглощения кислорода спектрофотометрически. (Ермаков А.П. 1987). Активность малонового диальдегида определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой при высокой температуре в кислой среде (Орехович В.Н. 1997.) Для определения содержания токоферола использована объединенная методика по ГОСТ 30417-96. Метод определения витамина С основан на титровании тиосульфатом натрия до измения окраски. Метод определения каротиноидов заключается в измерении оптической плотности вытяжки (экстракта) пигментов на спектрофотометре при максимуме поглощения каротиноидов (440,5 нм) (Ермаков А.П. 1987). Определение активности теломеразы в клеточных экстрактах проводили модифицированным методом TRAP, основанном на ПЦР-амплификации продуктов теломеразной реакции, полученных при удлинении ферментом

специфического праймера. Для определения природы индуктора использован ВЭЖХ Милихром -5, с обращено-фазной колонкой КФХ 6-80-4, сорбент-сепарон С18, элюент ацетонитрил и вода (35:65). Смесь в количестве 100 мкл наносилась в элюенте. Удерживаемый объем колонки 80x2 1000-1300 мкл.

Статистическая обработка данных. Лабораторные опыты проводили в 3 кратной биологической повторности, аналитическое определение для каждой пробы - в трех повторностях. Достоверность экспериментальных данных оценивали методами математической статистики с привлечением современных программных средств. Расчеты, построение графиков и их описание осуществляли с помощью приложений Microsoft Office Word 7 и Excel 7 для Windows ХР и пакета прикладных программ «Statistica. 7,0», «Biotest -D».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение индукторов апоптоза

С целью выделения из растительных объектов и выявления природы факторов, вызывающих апоптоз, были использованы неорганические (вода, соль, щелочь) и органический (этиловый спирт) растворители.

Навеска растительных тканей составила 2г. и после гомогенизации доводилась растворителем до 10 мл.

Выход сухого вещества из различных растительных объектов приведен в таблице 1.

Таблица 1

Выход сухого вещества при экстракции растворителями

________растительных объектов___________________________

Растворители Выход сухого вещества, мг/100г.

Лист монстеры Колеоптиль пшеницы Колеоптиль ячменя

Вода 12,05 ±0,05 13,12 ±0,04 14,25 ±0,05

NaCl(O.lH) 7,32 ±0,03 9,34 ±0,06 8,41 ±0,03

NaOH (0,4%) 5,06 ±0,08 8,63 ±0,03 7,23 ±0,09

С2Н5ОН (70%) 6,64 ±0,05 10,18 ±0,05 9,65 ±0,05

Таким образом, самый высокий выход сухого вещества из трех растительных объектов отмечен при экстракции водой, затем последовательно спиртом, солью и щелочью.

Экстракты растительных объектов использовались в трех концентрациях: 10'2%, 10°%, 10'4%.

Испытание экстрактов из молодого листа монстеры, колеоптилей ячменя и пшеницы показало, что на проявление активности антиоксидантных ферментов концентрация сухого вещества вытяжки из растительных тканей

никакого существенного влияния не оказала. Вместе с тем, значение активности ферментов зависит от растворителя, и их наибольшие величины получены в вариантах с водной вытяжкой, затем спиртовой, солевой и самые низкие - щелочной.

В вариантах с обработкой семян гороха соответствующими вытяжками наблюдается плавное повышение активности супероксиддисмутазы с 1900 Е/г сырой массы до 2200 Е/г сырой массы на пятые сутки. Далее идет более резкое снижение активности к десятым суткам проращивания до 1300 Е/г сырой массы.

Рисунок I - Динамика активности супероксиддисмутазы в проростках гороха под влиянием водной вытяжки из молодого листа монстеры

(п=3; Р <0,05).

В варианте с обработкой семян гороха водной вытяжкой из молодого листа монстеры на пятые сутки проращивания наблюдается сильно выраженный пик активности фермента (3900 Е/г сырой массы) по всем рассмотренным концентрациям (рис.1). Аналогичные результаты получены и под влиянием экстрактов колеоптилей злаковых.

Результаты, полученные на проростках пшеницы и ячменя, показали, что динамика изменения активности ферментов по всем вариантам обработки сохраняет одинаковую тенденцию: активность повышается до 5-х суток и падает к 10-м суткам проращивания, следовательно, индуктор апоптоза, выделенный из разных растительных объектов, во-первых, водорастворимый, во-вторых, идентичный у монстеры, ячменя и пшеницы, в-третьих вызывает одинаковые изменения в активности трех высокомолекулярных антиоксидантов: супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы в начальные стадии прорастания гороха, ячменя и пшеницы.

2.Хроматографический анализ факторов апоптоза в растительных

объектах

Известно, что белковые препараты поглощают в УФ-области 230-300 нм с пиком около 280 нм, причем интегральное поглощение спектрального контура определяется в подавляющем количестве вкладом остатков ароматических аминокислот фенилаланина, тирозина и триптофана. Вклад серосодержащих аминокислот цистеина, дистина и метионина в долю общего УФ - спектра пренебрежимо мал.

Предварительные данные показали, что максимум поглощения анализируемых вытяжек из растительных тканей находится в области 280нм. В связи с этим качественный анализ проводили путем детектирования при длинах волны 220, 240. 260 и 280 нм.

А Б В

Рисунок 2 - Хроматограмма клеточного экстракта при длине волны 280 нм: А - колеоптиль пшеницы, Б - колеоптиль ячменя, В - лист монстеры.

У пшеницы детектирование при длине волны 280 нм выявило, что пик №1 имеет площадь 363,5 мм2, время удерживания 2мин., а 4-ый - 32 мм2 ,время удерживания 6 мин (рис.2А). При длине волны 220 нм обнаружены 4 пика. Пики 1 и 2 - с площадью под пиками 483 мм2 и 160 мм2 соответственно. Время удерживания на колонке составляет 2,2 мин и 4,0 мин. Маленькие пики 3 и 4 имеют площади 76,5 и 46 мм2 соответственно, со временем удерживания 4 и 7,8 мин. При детектировании 240 нм у пшеницы наблюдаются 5 пиков, из которых 1-ый с площадью под пиком 516 мм2 и временем удерживания 2 мин соответствует максимальному пику при 220 нм.

Для ячменя при 280 нм существенным оказался 1-й пик (рис.2Б) с площадью 99,2 мм2. При длине волны 220 нм обнаружен один преобладающий пик с площадью под пиком 355 мм2 и временем удерживания на колонке 2 мин. Пики 2,3,4,5 не существенны. В тех же условиях детектирования при 240 нм обнаружен пик, имеющий площадь под пиком 54,6 мм2, со временем удерживания 2 мин. 3-им и 4-ым пиками можно пренебречь.

У монстеры детектирование при 280 нм (рис. 2В) выявило, что 1-й пик имеет площадь 28,5 мм2 со временем удерживания 1,5 мин., при 240 нм

выявлен аналогичный для всех культур пик №1 с площадью 67,2 мм2 и временем удерживания 2 мин.

Выявленные детектированием при длине волны 260 нм пики у пшеницы, ячменя и монстеры имеют площади соответственно 335 мм2; 164,8 мм2 и 64,5 мм2 и временем удерживания 2 мин. 2-ой пик оказался существенным только у пшеницы (53,5 мм2), время удерживания 3,8 мин.

Как показали данные ВЭЖХ (рис.2), экстракты растительных объектов имеют область поглощения в интервале 220-280 нм, что соответствует белкам (Сааков B.C., ] 987).

Известно, что белки классифицируются по растворимости в различных растворителях и подразделяются на альбумины (водорастворимые), глобулины (солерастворимые), глютелины и проламины (спирторастворимые) и гистоны (щелочерастворимые). Можно предположить, что во все растворители в нашем опыте перешли белки, но количество водорастворимых — легких белков, в том числе ферментов, превосходит все остальные классы.

Таким образом, на основании данных хроматографического анализа, можно предполагать, что индуктор апоптоза, входящий в состав растительных экстрактов, выделенный из колеоптилей пшеницы, ячменя и формирующихся листьев монстеры, является веществом белковой природы.

Выявление его природы требует дальнейших исследований.

3. Анализ состояния ДНК растений под влиянием индукторов апоптоза

Развитие этиолированных проростков пшеницы сопровождается обязательным апоптозом в стареющем колеоптиле и апикальной части первого листа. Это выражается в специфических структурных изменениях цитоплазмы и значительной межнуклеосомной фрагментации ядерной ДНК (Vanyushun B.F. et al., 2004).

а б в

Рисунок 3 - Электрофореграмма ДНК, выделенной из клеточного экстракта: а - этиолированного колеоптиля пшеницы; б - этиолированного колеоптиля ячменя; в - листа монстеры (1 - ткани сформированного листа;

2 - ткани из мест перфорации листа)

При исследовании тканей колеоптилей злаковых в течение десяти дней проращивания на электрофореграммах, полученных в агарозном геле, наблюдается «лестницеобразная» деградация ДНК, начиная с седьмых суток проращивания с дальнейшим ее увеличением к десятым суткам проращивания (рис. 3 а-б). На электрофореграмме тканей молодого листа монстеры, взятого из мест перфорации листа, также прослеживается фрагментация ДНК. в виде «лестницы», что является основным маркером апоптоза (рис. 3-в). Все это указывает на начало необратимой стадии апоптоза, за которой следует дальнейшая быстрая, уже относительно неспецифическая и глубокая деградация ДНК нуклеазами.

На седьмые сутки начинается фрагментация ДНК проростков гороха под влиянием вытяжки из молодого листа монстеры и колеоптиля пшеницы, на пятые сутки под влиянием вытяжки из колеоптиля ячменя, усиливающаяся на восьмые и десятые сутки. Просматривается характерная для запрограммированной гибели клеток так называемая «лесенка», в отличие от контрольного образца, где не наблюдается подобной фрагментации (рис. 4).

1 2 3

Рисунок 4 - Электрофореграмма ДНК, выделенной из проростков гороха (2, 4, 5, 7,8, 10 сутки): А - обработанной вытяжкой из: 1- молодого листа монстеры, 2- колеоптиля ячменя, 3- колеоптиля пшеницы; Б - контроль без

обработки

При обработке семян пшеницы вытяжкой из колеоптиля пшеницы фрагментация наблюдается уже на пятые сутки и усиливается на седьмые, восьмые и десятые сутки. Характерная «лесенка» проявляется более выражено.

Исследования, проведенные на проростках ячменя, показали, что обработка семян данной культуры вытяжкой молодых листьев монстеры также ведет к проявлению запрограммированной клеточной гибели, начинающейся на седьмые сутки. Усиление фрагментации ДНК происходит на восьмые и десятые сутки.

По электрофореграммам и темпорально рассчитанным линейным профилям можно наблюдать типичную для апоптоза картину -лестницеобразные пятна на электрофореграмме, связанные с апоптотической формой деградации ДНК. Четко различимая “лестница” на линейных профилях у некоторых образцов, начиная с пятых или седьмых суток,

волнообразное искажение нисходящей ветви главного пика является следствием суперпозиции главного и группы малых пиков, появляющихся только в случае лестницеобразных электрофореграмм.

4. Активность теломеразы в апоптозных клетках

Теломераза поддерживает постоянную длину теломер. Если теломераза не достраивает теломер, хромосома укорачивается при каждом делении, пока теломераза не разрушится и хромосома не начнет деградировать (МсКш§Ы: Т.Б. е^ а1., 1997).

В здоровых проростках ячменя, пшеницы и гороха (рис активность теломеразы обнаруживается на протяжении десяти суток.

5)

г ■ ч

* 10. „

Рисунок 5 - Результаты анализа теломеразной активности проростков сельскохозяйственных культур в норме : А - проростки пшеницы;

Б - проростки ячменя; В -проростки гороха;

Исследования проростков ячменя, подвергнутых обработке индукторами апоптоза, показывают наличие активности теломеразы до четвертых суток под воздействием вытяжек из колеоптилей злаковых (рис. 6 А, Б) и до пятых суток под воздействием вытяжки из молодого листа монстеры (рис. 6В).

Рисунок 6 - Результаты анализа теломеразной активности на проростках ячменя под воздействием предполагаемых индукторов апоптоза: А - вытяжка из колеоптиля пшеницы; Б - вытяжка из колеоптиля ячменя; В - вытяжка из молодого листа монстеры.

На проростках пшеницы активность теломеразы проявляется со вторых до пятых суток под влиянием вытяжки из колеоптиля ячменя и листа монстеры.

В проростках гороха наблюдается аналогичная картина. В здоровых проростках от 2-х до 10-х суток наблюдается активная теломераза, а под влиянием вытяжек из колеоптилей пшеницы и ячменя проявляется только до четвертых суток, и к 10-му дню прорастания не обнаруживается. Под влиянием вытяжек из листа монстеры активность теломеразы проявляется до пятых суток прорастания.

Таким образом, можно резюмировать, что в здоровых проростках пшеницы, ячменя и гороха до 10-ых суток прорастания теломеразная активность высока, вследствие интенсивного деления клеток развивающегося растения. В этиолированных колеоптилях злаковых активность теломеразы наблюдается до четвертых суток проращивания, на начальных стадиях активации программируемой гибели клеток теломераза перестает работать. Подобная картина наблюдается и в случае индуцируемого апоптоза на проростках гороха, пшеницы, ячменя в течение десяти суток проращивания.

При сопоставлении данных ДНК анализа и выявления теломеразной активности, установлена определенная тенденция: при появлении на электрофореграммах «лестницеобразной» ДНК, характерной только при апоптозе, активность теломеразы перестает детектироваться. Это также может являться маркером апоптоза.

5. Влияние индукторов апоптоза на антиоксидантную систему сельскохозяйственных культур

Жизнеспособность организмов поддерживается за счет высокой активности антиоксидантной системы, в составе которой низко- и высокомолекулярные антиоксиданты. Роль антиоксидантов сводится к тому, что в низких концентрациях они способны инициировать свободнорадикальные процессы, проявляя при этом прооксидантные свойства, тогда как при избытке они подавляют образование свободных радикалов в живых организмах, проявляя антиоксидантные свойства.

Под влиянием вытяжек из молодого листа монстеры, колеоптилей пшеницы и ячменя установлено, что активность каталазы возрастает в начале опыта и к концу имеет тенденцию к снижению. Так, активность фермента каталазы под влиянием вытяжки из молодого листа монстеры повышается с 40 у.е. до 47 у.е. к пятым суткам. Далее идет плавное снижение активности до 32 у.е. к десятому дню. Под влиянием вытяжек из колеоптилей злаковых сохраняется такая же тенденция.

Динамика изменения активности каталазы показывает состояние метаболизма. При высоких показателях судят о нарушении обменных

процессов, выражающихся в накоплении агрессивных для растений активных форм кислорода.

Снижение активности каталазьг в вариантах с индуцированием апоптоза приводит к накоплению пероксидов, необходимых пероксидазе для дезактивации низкомолекулярных антиоксидантов, способных реактивировать оксидоредуктазы.

При нормальном развитии у проростков происходит равномерное снижение активности фермента с 32 у.е. до 22 у.е. в течение десяти дней эксперимента.

Пероксидаза контролирует уровень перекиси водорода и низкомолекулярных антиоксидантов в клетках растений. Стабильный рост активности пероксидазы является показателем увеличения мощности высокомолекулярного сегмента антиоксидантной системы пшеницы.

а б

Рисунок 7 - Динамика изменения активности пероксидазы под действием вытяжек индукторов апоптоза в проростках: а - пшеницы; б - гороха

(п=3; Р <0,05).

В проростках пшеницы отмечено значительное повышение активности пероксидазы к пятым суткам с дальнейшим резким падением, начиная с седьмых суток проращивания (рис.7). Под влиянием экстракта молодого листа монстеры скачок активности начинается с 390 Е/г сырой массы до 860 Е/г сырой массы на пятые сутки, с седьмых суток падение активности пероксидазы происходит с 490 Е/г сырой массы до 100 Е/г сырой массы к десятым суткам. Под влиянием вытяжек из колеоптилей ячменя скачок активности пероксидазы начинается с 370 Е/г сырой массы до 950 Е/г сырой массы и значительное последующее снижение до 60 Е/г сырой массы к десятым суткам. Под влиянием экстракта из колеоптилей пшеницы тенденция не меняется: повышение активности пероксидазы начинается с 380 Е/г сырой массы до 920 Е/г сырой массы и последующее ее снижение до 80 Е/г сырой массы к концу эксперимента (рис. 7).

Появление пика пероксидазной активности можно объяснить усилением перекисного разрушения низкомолекулярньгх компонентов

антиоксидантной системы при апоптозе, которые являются субстратами пероксид азы.

При изучении активности пероксидазы в контрольном варианте выявлена совершенно противоположная тенденция. Уровень содержания пероксидазы повышается с начала эксперимента к десятым суткам проращивания у пшеницы с 360 Е/г сырой массы до 610 Е/г сырой массы., в проростках ячменя - с 49 Е/г сырой массы до 390 Е/г сырой массы., в проростках гороха - с 160 Е/г сырой массы до 490 Е/г сырой массы (рис. 7).

2 4 5 7 8 10

сутки проращивания

ЕВ лист монстеры □ колеоптиль ячменя

□ колеоптиль пшеницы ■ контроль

а б

Рисунок 8 - Динамика изменения активности супероксиддисмутазы под действием вытяжек индукторов апоптоза в проростках: а - ячменя; в - гороха (п=3; Р <0,05).

Супероксиддисмутаза является важнейшим элементом антиоксидантной защиты организма.

В условиях нормального обмена супероксиддисмутазы поддерживают стационарную концентрацию супероксидных радикалов на определенном уровне, защищая тем самым клеточные структуры от повреждающего действия как самих радикалов кислорода, так и от гидроксильных радикалов, которые могут образовываться из кислорода и

н2о2.

Динамика изменения активности супероксиддисмутазы проростков под влиянием индукторов апоптоза, выделенных из молодого листа монстеры, дает скачок на пятые сутки эксперимента, а под влиянием индукторов, выделенных из колеоптилей пшеницы и колеоптилей ячменя, повышается на четвертые — пятые сутки (рис. 8).

При обработке вытяжкой из молодого листа монстеры пик активности супероксиддисмутазы у проростков гороха наступает на пятые сутки и составляет 3950 Е/г сырой массы, затем активность падает и на десятые сутки составляет 1020 Е/г сырой массы. При обработке вытяжкой из колеоптиля пшеницы пик приходится на четвертые сутки (1600 Е/г сырой массы) с последующим снижением активности до 480 Е/г сырой массы. При обработке вытяжкой из колеоптиля ячменя пик приходится на четвертые

сутки (1650 Е/г сырой массы) с последующим снижением активности фермента до 490 Е/г сырой массы (рис. 8).

Динамика изменения активности супероксиддисмутазы в контрольных проростках пшеницы имеет тенденцию повышения в течение всего срока эксперимента с 2200 Е/г сырой массы до '7050 Е/г сырой массы в проростках ячменя - с 2100 Е/г сырой массы до 5600 Е/г сырой массы, у гороха с 2950 Е/г сырой массы до 8500 Е/г сырой массы.

а б

Рисунок 9 - Динамика изменения активности аскорбатпероксидазы под влиянием вытяжек индукторов апоптоза в проростках: а - пшеницы; б-гороха; (п=3; Р <0,05).

Аскорбатпероксидаза локализована в хлоропластах и является там главным ферментом, утилизирующим перекись водорода.

В результате проведенных исследований показано, что при нормальном развитии динамика активности аскорбатпероксидазы в проростках пшеницы плавно нарастает с 10 Е/г сырой массы до 30 Е/г сырой массы в течение десяти суток эксперимента (рис. 9). Расщепление Н202 в хлоропластах проходит в соответствии с потребностями молодого развивающегося растения.

Активность аскорбатпероксидазы в проростках пшеницы, подвергнутых обработке предполагаемыми индукторами апоптоза, повышается до пятых суток, затем наблюдается ее снижение. При обработке проростков вытяжкой из молодого листа монстеры происходит повышение активности с 5,8 Е/г сырой массы до 15,5 Е/г сырой массы на пятые сутки и последующее снижение до 7,6 Е/г сырой массы на десятые сутки проращивания (рис. 9). Аналогичная картина наблюдается на проростках, подвергнутых индуцированию вытяжками из колеоптилей злаковых: активная работа фермента до пятых суток и дальнейшее ее снижение.

Полученные данные дают основание предположить, что в клетках пшеницы, подвергнутых индуцированию, накопление перекисей на начальных стадиях апоптоза тормозится повышающейся активностью пероксидаз, после пятых суток пероксидазная активность снижается в связи с

усилением патологических процессов, накопления пероксидов в прогрессирующих условиях клеточной гибели и аутодеструкции клетки.

Анализ полученных данных по изменению активности аскорбатпероксидазы в растениях ячменя и гороха показал, что в случае индуцированного апоптоза тенденция активности аналогична с растениями пшеницы.

сутки проращивания

-лист монстеры - колеоптиль пшеницы

-колеоптиль ячменя - контроль

а б

Рисунок 10 - Динамика изменения содержания малонового диальдегида под влиянием вытяжек индукторов апоптоза в проростках: а - пшеницы; б - ячменя; (п=3; Р <0,05).

Малоновый диальдегид рассматривают как показатель степени окислительного стресса растений и структурной целостности мембран (Розтук М.М., 2005).

Результаты исследований накопления малонового альдегида в проростках пшеницы, ячменя и гороха, подвергнутых обработке предполагаемыми индукторами апоптоза, показали постепенное его накопление со вторых - четвертых суток в течение эксперимента, что может свидетельствовать о повышении уровня перекисного окисления липидов мембран в клетках растений. При обработке вытяжками из колеоптилей зерновых культур содержание альдегида с 3 мкмоль/г увеличивается до 8-12 мкмоль/г (рис. 10), вытяжка из молодого листа монстеры приводит к повышению концентрации с 3 мкмоль/г до 7 мкмоль/г (рис. 10).

По содержанию малонового альдегида можно судить о степени повреждения клеточных мембран проростков пшеницы, подвергнутых индуцированию, вследствие окислительного стресса.

В контрольном варианте с начала прорастания до пятых суток идет накопление малонового диальдегида до 5,5 мкмоль/г., затем наблюдается постепенное снижение его содержания до десятых суток проращивания (3,2 мкмоль/г) (рис. 10)

В процессе развития в растениях происходит постепенное накопление аскорбиновой кислоты, необходимой для растяжения клеточных стенок и деления клеток.

В контрольных проростках пшеницы и ячменя уровень содержания аскорбиновой кислоты повышается с 2 мг/100г до 12 мг/100г, у гороха наблюдается равномерное накопление витамина С на протяжении десяти суток эксперимента с 30 мг/100гдо 68 мг/ЮОг.

Обеднение аскорбиновой кислотой связано в основном с превращением аскорбат-иона в дегидроаскорбат под действием активных форм кислорода, ключевую роль среди которых в данном случае играют пероксиды.

Динамика концентрации аскорбиновой кислоты в проростках пшеницы и ячменя плавно снижается по всем вариантам обработки предполагаемыми индукторами апоптоза с 1,2 мг/ 100г до 0,3 мг/ЮОг (вытяжка их молодого листа монстеры), 0,1 мг/ЮОг (вытяжка из колеоптилей ячменя), 0,15 мг/ЮОг (вытяжка из колеоптиля пшеницы). При воздействии на семена гороха вытяжкой из молодого листа монстеры концентрация аскорбиновой кислоты снижается с 31 мг/ЮОг в начале прорастания до 22 мг/100 г в конце. При обработке вытяжкой из колеоптилей злаковых снижается с 30,5 мг/ ЮОг до 22,5мг/Ю0г соответственно. Количество аскорбиновой кислоты уменьшается, возможно, за счет того, что возрастает ее расход на окисление липидов.

■ лист монстеры □ колеоптиль ячменя

Ы колеоптиль пшеницы Я контроль

в

Рисунок 11 - Динамика содержания токоферола под влиянием вытяжек индукторов апоптоза в проростках: а - пшеницы; б - ячменя; в - гороха;

(п=3; Р <0,05)

Токоферолы взаимодействуют с полиненасыщенными ацильными группами липидов, стабилизируют мембраны, обезвреживают АФК и побочные радикальные продукты окислительного стресса в липидной фазе. (Ла1ее1 С.А., е! а]., 2009).

На рисунке 11 видна четкая тенденция линейного снижения содержания токоферола в проростках пшеницы и ячменя, подвергнутых обработке предполагаемыми индукторами апоптоза в течение десяти суток эксперимента: с 12 мг/100г до 4,2 мг/100г. В проростках гороха концентрация токоферола снижается с 0,9 мг/100г на вторые сутки до 0,2 мг/100г на десятые сутки проращивания по всем вариантам обработки индукторами.

При нормальном развитии содержание токоферола в проростках пшеницы и ячменя постепенно повышается с 12,5 мг/100г до 22,5 мг/100г. В проростках гороха с начала эксперимента составляет 0,81 мг/100г., на пятые сутки концентрация составляет 1,0 мг/100г., к концу эксперимента концентрация токоферола -1,6 мг/100г.

а б

Рисунок 12 - Динамика содержания суммы каротиноидов под влиянием вытяжек индукторов апоптоза в проростках: а - пшеницы; б - ячменя;

(n=3; Р <0,05)

Основная функция каротиноидов в растительной клетке состоит в защите ее структур от повреждающего действия свободных радикалов, образующихся в процессе фотосинтеза (Лукаткин A.C., 2002). Каротиноиды защищают мембраны от повреждающего действия свободных радикалов и замедления процессов старения (Galeschi L.,et al., 2002). Изменение содержания каротиноидов, в свою очередь, оказывает значительное воздействие на формирование проростков.

Под влиянием вытяжки из листа монстеры на пятые сутки проращивания идет увеличение концентрации каротиноидов с 0,3 мг/100г на вторые сутки до 0,9 - 1 мг/100 г., затем наблюдается снижение его концентрации до 0,3 мг/100г. Аналогичная тенденция по содержанию каротиноидов сохраняется у проростков и при обработке вытяжками из колеоптилей злаковых. Под влиянием вытяжки из колеоптилей ячменя

концентрация суммы каротиноидов увеличивается с 0,4 мг/100 г на первые сутки проращивания до 1,13 мг/100 г на пятые сутки и дальнейшее снижение до 0,4 мг/100 г на десятые сутки. Под влиянием вытяжки из колеоптилей пшеницы концентрация суммы каротиноидов увеличивается соответственно с 0,37 мг/100 г до 0,96 мг/100 г на пятые сутки и дальнейшее снижение до

0,35 мг/100 г на десятые сутки. В проростках гороха динамика накопления каротиноидов соответствует выше изученным культурам.

В проростках гороха, ячменя и пшеницы, не подвергнутых обработке, происходит равномерное накопление каротиноидов до 1,3 — 2,6 мг/100г (рис.12).

Модель фюиипиго-йиихимтеской трап (¿формаций ЩЗШШШк растительных теток при ипоптогзе(с по /Д

| ап о птоз } [ норма. ........

. , _ - ' - - -

увеличивается до 5-х | 'Еру 1_1 л СОД увеличивается

суток, к 10-м снижается -Мвнь-- §. .

увеличивается до 5-х * Пероксидаза ’ увеличивается

суток, к 10-м снижается ^ г _ ~ - л

i • - •. | • Аскорбат- ... §!

увеличивается до 5-х ; •-= увеличивается

суток, к 10-м снижается - * пероксидаза • ’ __

. увеличивается до 5-х 111111^ Каталаза снижается

суток, к 10-м снюкаетея -1 ® ^ .ММ

Витамин С

увеличивается

снижается

Токоферол (витамин Е)

снижается

увеличивается

увеличивается до 5-х ' суток, к* 10-м снижается

Каротиноиды

увеличивается

до 5-та суток увеличивается, к 10-

Малоновый

диальдегид

увеличивается

детектируется с 5-х суток

«лестница»

после 4-х суток не детектируется

Активность

теломераза

Рисунок 13 - Модель физиолого-биохимической трансформации метаболизма растительных клеток при апоптозе (со 2-х по 10-е сутки)

Обобщение экспериментальных данных позволило предложить биохимическую модель апоптоза растений (рис. 13), выражающуюся в том, что в колеоптилях злаковых до появления настоящих листьев, т.е. до четвертых - пятых суток и местах перфорации листа монстеры происходит нарастание активности высокомолекулярных компонентов антиоксидантной системы (СОД, каталаза, пероксидаза, аскорбатпероксидаза), а затем резкое

их снижения. Снижение содержания низкомолекулярных (витаминов С, Е, каротиноидов) происходит сразу. '

Содержание малонового диальдегида увеличивается, происходит фрагментация ДНК и ингибирование активности теломеразы.

Выявлен фактор апоптоза, максимум которого лежит в области поглощения 220-240 нм и минимум 260-280 нм, что указывает на его белковую природу.

ВЫВОДЫ

1. Выделены компоненты индукции апоптоза из вытяжек колеоптилей ячменя, пшеницы и молодого листа монстеры и изучено их влияние на начальные стадии развития проростков гороха, пшеницы, ячменя. Наибольший выход сухого вещества вытяжек из растительных объектов неорганическими (вода, соль, шелочь) и органическими (этиловый спирт) растворителями, отмечен при экстракции водой и составляет для листа монстеры 12 мг/100г, колеоптиля пшеницы 13,1 мг/100г, колеоптиля ячменя 14,2 мг/ЮОг.

2. Влияние различных концентраций сухого вещества экстракта молодого листа монстеры, колеоптилей ячменя и пшеницы на изменение активности антиоксидантных ферментов растений существенного действия не оказало.

3. Компоненты апоптоза вытяжки из колеоптилей злаков и формирующегося листа монстеры имеют в области поглощения 220-280 нм идентичный для всех объектов пик со временем удерживания 2,0 мин, указывающий на белковую природу индуктора апоптоза.

4. При обработке семян исследуемых сельскохозяйственных растений экзогенными индукторами апоптоза выявлена ДНК - «лесенка», обусловленная межнуклеосомной деградацией ДНК, характерной для программируемой гибели клеток.

5. Программируемая клеточная гибель растений характеризуется отсутствием активности теломеразы, что косвенно свидетельствует о нарушении структуры хромосом под воздействием компонентов апоптоза колеоптилей злаковых и формирующегося листа монстеры.

6. Установлено что, при индуцированном апоптозе на четвертые и пятые сутки проращивания семян однодольных и двудольных растений повышается активность каталазы, пероксидазы, аскорбатпероксидазы, супероксидцисмутазы, начиная с пятых-шестых суток наблюдается спад активности.

7. Выявлено, что накопление содержания низкомолекулярных антиоксидантов в опытных растениях (токоферола, каротиноидов и

аскорбиновой кислоты) происходит на протяжении четырех-пяти дней проращивания с последующим снижением на десятые сутки эксперимента.

8. Апоптоз сопровождается нарушением структурнофункциональной целостности мембран, регистрируемым повышением содержания малонового диальдегида в проростках исследуемых культур, подвергнутых индуцированию.

9. Предложена модель физиолого-биохимической трансформации метаболизма растительных клеток при апоптозе, включающая изменение содержания антиоксидантов и активности ферментов, нарушение проницаемости мембран, фрагментацию ДНК по типу «лесенки» и снижение активности теломеразы.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих

работах:

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Павловская, Н.Е. Индуцирование апоптоза в проростках гороха / Н.Е. Павловская, А.Ю. Гагарина // Вестник ОрелГАУ. - 2010.- №6. - С.128 -131.

2. Павловская, Н.Е. Хроматографический анализ факторов апоптоза в растительных объектах / Н.Е. Павловская, А.Ю. Гагарина // Вестник ОрелГАУ. - 2011.- №3. - С.75 -77.

3. Павловская, Н.Е. Технология создания биологически активных добавок для животноводства / Н.Е.П авловская, И.В. Горькова, И.Н.Гагарина, И.А. Гнеушева, А.Ю. Гагарина // Вестник ОрелГАУ. - 2011.- №6. - С.29 -32.

Статьи и материалы конференций:

4. Павловская, Н.Е. Рекогносцированное исследование

индуцированного апоптоза биологических объектов / Н.Е.Павловская, И.Н.Гагарина, И.В. Горькова, К.Н. Козявина, А.Ю. Гагарина //

«Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик». Материалы Всероссийской научно-практической конференции,- Курск.: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава. - 2009. - С.76-78.

5. Павловская, Н.Е. Выделение индукторов апоптоза/

Н.Е.Павловская, И.Н.Гагарина, К.Н. Козявина, А.Ю. Гагарина

//«Фундаментальные и прикладные исследования в АПК на современном этапе развития химии». Сборник материалов 2-й международной Интернет -конференции. - Орел. - 2009.- С.107-110.

6. Павловская, Н.Е. Выделение индукторов апоптоза из растительных объектов. / Н.Е.Павловская, К.Н. Козявина, А.Ю. Гагарина. И.Н.Гагарина, И.В. Горькова // «Роль молодых ученых и специалистов в повышении

эффективности растениеводства» Материалы региональной научнопрактической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов. — Орел

- 2009,- С.97-98. '

7. Гагарина, А.Ю. Биологическая активность растительных экстрактов/ А.Ю.Гагарина, O.A. Щуров, Н.Е.Павловская, И.Н.Гагарина // «Роль молодых ученых и специалистов в повышении эффективности растениеводства» Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов. - Орел. - 2009.- С.44-46.

8. Павловская, Н.Е. Растительные индукторы апоптоза / Н.Е.Павловская, К.Н. Козявина, И.Н.Гагарина, И.В. Горькова, А.Ю.Гагарина // «Теоретические основы применения биотехнологии, генетики и физиологии растений в современной селекции растений и растениеводстве» Материалы международной научно- практической конференции молодых ученых. - Брянск. - 2009. - С. 196-201.

9. Павловская, Н.Е. Создание новых композиций биопрепаратов с учетом принципов экологизации в растениеводстве /Н.Е.Павловская, С.В.Степанова, И.Н.Гагарина, И.В. Горькова, А.Ю.Гагарина // «Интенсификация и оптимизация продукционного процесса сельскохозяйственных растений» Материалы международной научнопрактической конференции,- Орел. - 2009,- С.308-310

10. Павловская, Н.Е. Влияние индукторов апоптоза на фрагментацию ДНК и антиоксидантную систему гороха./ Н.Е.Павловская, А.Ю.Гагарина // «Биотехнология: экология крупных городов» Материалы Московской Международной научно - практической конференции. - Москва: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2010 - С.240-241.

11. Павловская, Н.Е. Влияние индукторов апоптоза на антиоксидантную систему сельскохозяйственных растений /Н.Е.Павловская, И.Н.Гагарина, А.Ю.Гагарина // «Инновационный потенциал молодых ученых

- АПК Орловской области» Материалы региональной научно- практическая конференции. - Орел. - 2010.- С.247-249.

12. Павловская, Н.Е. Фрагментация ДНК при апоптозе./ Н.Е.Павловская, К.Н. Козявина, А.Ю.Гагарина, И.Н.Гагарина, И.В. Горькова //« Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству» Материалы III Международной Интернет- конференции к 35- летию Орловского государственного аграрного университета.- Орел. - 2010.- С.81-84.

13. Павловская, Н.Е. Влияние индукторов апоптоза на фрагментацию ДНК / Н.Е.Павловская, А.Ю.Гагарина. И.Н.Гагарина //Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. - ВГУ: - 2010. - вып.12. -С 264.

14 . Павловская, Н.Е. Антиоксиданты в явлениях апоптоза и некроза / Н.Е.Павловская, К.Н. Козявина, А.Ю.Гагарина. И.Н.Гагарина, И.В. Горькова // «Биоантиоксидант: Тезисы докладов VIII международной конференции (4-6 октября 2010г., Москва) Москва, 2010. - С.558.

15. Павловская, Н.Е. Проблемы геронтологи связанные с явлением апоптоза и некроза / Н.Е.Павловская, А.Ю. Гагарина // Развитие инновационного потенциала агропромышленного производства. Сборник статей по материалам Всероссийской научно- практической конференции. Орел.-2010.-С. - 150-152.

16. Павловская, Н.Е. Исследование влияния степени измельчения замороженных растительных объектов на полноту выделения пероксидазы / Н.Е.Павловская, И.В. Горькова, И.Н.Гагарина, А.Ю. Гагарина // «АПК в современном мире: взгляд научной молодежи»: материалы науч. конф. (19-20 апр. 2011г., Орел). - Орел, 2011. - С. 101-103.

17. Павловская, Н.Е. Влияние индукторов апоптоза на антиоксидантную систему сельскохозяйственных растений пероксидазы / Н.Е.Павловская, А.Ю. Гагарина. И.Н.Гагарина, И.В. Горькова // «АПК в современном мире: взгляд научной молодежи»: материалы науч. конф. (19-20 апр. 2011г„ Орел). - Орел, 2011. - С. 101-103.

18. Павловская, Н.Е. Антиоксидантная система у пшеницы и гороха в норме и патологии (при апоптозе, некрозе, диагностике): моногр./ Н.Е. Павловская, А.И. Гринблат. А.Ю. Гагарина. И.Н.Гагарина, И.В. Горькова, К.Н. Козявина. - Орел: ОрелГАУ, 2012. - 100с.: ил.

Подписано в печать 20.01.2012 г.

Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс.

Уел. печ. л. 1,0. Заказ 19. Тираж 100 экз.

Отпечатано в издательстве Орел ГАУ, 2012, Орел, Бульвар Победы, 19

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гагарина, Анна Юрьевна, Орел

61 12-3/613

ФГБОУ ВПО «ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

ГАГАРИНА АННА ЮРЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ ПРИ ИНДУЦИРОВАННОМ АПОПТОЗЕ

03.01.05 - физиология и биохимия растений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Павловская Н. Е.

Орел-2012

Содержание

стр

Введение 5

1. Литературный обзор. 9 1.1 .Программируемая клеточная гибель. 9 1.1.1 Участие митохондрий и хлоропластов в программируемой 13 гибели растительной клетки.

1.2. Значение апоптоза в старении организма. 18

1.3. Индукторы апоптоза (внешние и внутренние). 22

1.4. Теломераза и ее участие в процессах старения и гибели 30 клетки.

1.4.1. Теломераза растений 39

1.5. Активные формы кислорода и их участие в нормальном 42 функционировании и развитии патологических состояний растений

1.5.1. Участие активных форм кислорода в программируемой 47 гибели клеток

2. Объекты и методы исследований 51

2.1. Исследуемые растения 51

2.2. Условия выращивания 51

2.3. Факторы воздействия на экспериментальные растения 51

2.4. Биохимические методы исследования 55 3.Экспериментальная часть. 61

3.1. Выделение индукторов апоптоза. 61

3.2. Хроматографический анализ факторов апоптоза в 66 растительных объектах

3.3. Анализ состояния ДНК под влиянием индукторов апоптоза 72

3.4. Активность теломеразы в апоптозных клетках 78

3.5. Влияние индукторов апоптоза на антиоксидантную систему 84

сельскохозяйственных культур.

3.5.1. Изучение влияния индукторов апоптоза на 84 антиоксидантную систему пшеницы

3.5.2. Изучение влияния индукторов апоптоза на 98 антиоксидантную систему ячменя

3.5.3. Изучение влияния индукторов апоптоза на 110 антиоксидантную систему гороха

3.5.4. Влияние индукторов на рост и развитие растений 123 Заключение 129 Выводы 132 Список литературы 134 Приложения

Список сокращений

АКС - активные кислородные соединения;

АЛТ - альтернативное удлинение теломер;

АО - альтернативная оксидаза;

АТФ - аденозинтрифосфат;

АФК - активные формы кислорода;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ДНК - дизоксирибонуклеиновая кислота;

ДНП - дизоксинуклеопротеиды;

ПГК - программируемая клеточная гибель;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

СОД - супероксиддисмутаза;

УФ - ультрафиолет;

AZT - азидотемидин;

CN- - цианид;

NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат востановленный; TRAP - (Telomer Repeat Amplification Protocol) амплификация теломерного повтора;

TRFs - терминальная рестрикция фрагментов;

Введение.

Открытие программируемой гибели клеток (ПГК) многоклеточных организмов явилось мощным стимулом в развитии медицины и биологии. Познания особенностей программируемой гибели клеток растений позволит управлять процессами их роста, развития и старения, понять многие физиологические и патологические процессы, происходящие в клетке.

Апоптоз играет важную роль в реализации программы развития в онтогенезе и поддержании тканевого гомеостаза организма. Главное свойство апоптоза состоит в том, что это активный и контролируемый процесс, который, в свою очередь, оказывает регулирующее влияние на состояние организма в целом (Самуилов В.Д., 2001). Являясь важной составляющей иммунитета, апоптоз вовлечен в защитные реакции животных и растений на инфекционные возбудители. Реализация программируемой гибели клеток при различных патологических состояниях происходит путем удаления клеток, выживание которых нежелательно для организма, тем самым способствуя сохраненною нормального функционирования биологической системы, очищая от ненужных, больных, закончивших свой жизненный цикл или появившихся в результате мутаций потенциально опасных клеток.

Современные представления об апоптозе основываются на результатах электронно-микроскопических и биохимических исследований и как особый вариант клеточной смерти были открыты Kerr J.F., et al. (1972).

На сегодняшний день дано описание морфологических характеристик апоптоза у животных, который сопровождается выраженной последовательностью структурно-морфологических изменений клетки, используемых в качестве показателей этого процесса. Однако, несмотря на большое количество экспериментальных данных, до сих пор не исследованы

многие механизмы, не до конца выяснены пути регуляции апоптоза отдельных клеток в целостном многоклеточном организме.

Ряд компонентов клеток растений способен активировать программируемую гибель клеток и у растений и у животных, в том числе опухолевых (Fingrut О., Flescher Е., 2002), а основные характеристики процесса у растений выявляются главным образом по аналогии с известными данными для животных.

Сравнительный анализ показывает, что некоторые факторы, участвующие в реализации программируемой гибели клеток, универсальны для всех эукариот, однако растения могут использовать и уникальные пути (Lam Е., et al., 2001).

В отличие от некроза, программируемая гибель клеток генетически обусловлена, что доказано на животных организмах. На растениях этот вопрос изучается Lain S.(CIIIA), Pavid L. (Великобритания), Arpagaus. S, Broendle R. (Бернский университет, Швейцария), Khurshed 1.(университет Кашмир, Индия) и др. В России единственной пока школой, занимающейся проблемой апоптоза, является МГУ им. М.В.Ломоносова (Ванюшин и др., 1987-2009; Скулачев, 1999-2009, Самуилов,2009).

Вместе с тем, не ясным остается вопрос, какой или какие факторы клеток приводят к ее гибели по апоптозному типу, являются ли они общими для однодольных и двудольных растений, какую роль играет в этом процессе антиоксидантная система и теломераза.

В связи с этим целью наших исследований является сравнительное исследование проявления апоптоза у различных растительных культур и изучение влияния апоптозных компонентов на начальные стадии развития однодольных и двудольных растений.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение предполагаемых индукторов апоптоза из молодого листа монстеры, колеоптилей пшеницы и ячменя;

2.Изучение изменения в структуре ДНК в полученных проростках гороха, пшеницы и ячменя на вторые - десятые сутки эксперимента;

3. Выявление активности теломеразы методом ТИАР-анализа на проростках гороха, пшеницы и ячменя в динамике.

4. Изучение активности ферментов антиоксидантной системы: супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы, аскорбатпероксидазы, содержание малонового диальдегида, каротиноидов, витаминов С, Е в проростках гороха, пшеницы и ячменя в процессе развития.

5. Разработка модели апоптоза у растений.

Научная новизна работы. Впервые проведены сравнительные исследования проявления естественного апоптоза в колеоптилях пшеницы, ячменя и при формировании листа монстеры. Изучено индуцирование апоптоза на основе фрагментации ДНК, активности ферментов антиоксидантной системы и динамики накопления низкомолекулярных антиоксидантов на начальных стадиях развития растений. Впервые изучена активность теломеразы в норме и при апоптозе. Разработана биохимическая модель апоптоза растительных клеток, заключающаяся в регистрации изменения активности антиоксидантов, нарушении проницаемости мембран, фрагментации ДНК по типу «лесенки» и активности теломеразы.

Практическая и теоретическая значимость. Полученные результаты исследований форм гибели клеток у растений расширяют представление о роли биоэнергетических систем клетки и активных форм кислорода в программируемой гибели клеток. Программируемая гибель клеток играет важную роль в иммунитете растений, что может дать ключ к созданию новых сортов сельскохозяйственных растений, обладающих повышенной устойчивостью к патогенам. Контроль над некрозом и апоптозом растений позволит создавать средства, регулирующие продолжительность жизни,

синхронность созревания урожая. На основании полученных данных можно прогнозировать довизуальные симптомы генетических нарушений, происходящих в живых объектах под влиянием экстремальных факторов, осуществлять мониторинг окружающей среды. Отдельные положения работы могут быть использованы в преподавании практического курса по физиологии и биохимии растений.

1. Литературный обзор.

1.1.Программируемая клеточная гибель.

Программируемая клеточная гибель (ПКГ) является физиологическим процессом гибели клеток, связанным с селективным устранением нежелательных клеток, способствующим сохранению нормального функционирования организма, очищению от невостребованных, больных, завершивших жизненный цикл или появившихся в результате мутаций потенциально опасных клеток.

У животных примером программируемой гибели клеток служат выполняющие временные функции клетки хвоста у головастика при метаморфозе; клетки позвоночных нейронов, которые продуцируются в избытке, метаморфоз у насекомых. У растений селективная гибель клеток необходима для роста и выживания, так алейроновые клетки погибают по завершении прорастания, как и клетки на пути прорастающей пыльцевой трубки. Клеточная гибель также может привести к формообразованию листьев (Roger I., 1997). У представителей рода Monstera (сем. Агасеае), места перфораций, наличие лопастей определяется зонами гибели клеток на ранних стадиях развития. Опадание листьев и созревших плодов сопровождаются избирательной гибелью клеток отделительной зоны, расположенной между основанием черешка листа или плода и стеблем, которая активируется благодаря экспрессии так называемых .vag-генов (senescence-associated genes) (Самуилов В.Д., 2001).

В многоклеточном организме каждая клетка в любой момент готова погибнуть, если это необходимо для блага организма в целом. Но, как показали недавние исследования, апоптоз имеет место также у одноклеточных организмов. У бактерий, как и у многоклеточных, запрограммированная смерть играет важную роль в ряде жизненных процессов, таких как лизис материнской клетки при споруляции и

вегетативных клеток при образовании плодового тела у миксобактерий, а также при спонтанном автолизе (Гордеева A.B., 2004).

Наиболее принципиальным в достижении программируемой клеточной гибели явилось установление программируемого характера биохимических изменений, приводящих к некрозу (Проскуряков С.Я. и др., 2002; Lockshin R.A., Zakeri Z., 2004.). В связи с этим в современной классификации программированной клеточной гибели (ГЖГ) апоптоз получил название «ПКГ-1 типа», «ПКГ-И типа» представлен аутофагией, а некроз «ПКГ-Ш типа».

Некроз - патологическая форма клеточной гибели. Характеризуется разрывом цитоплазматической и внутриклеточных мембран, что приводит к разрушению органелл, высвобождению лизосомальных ферментов и выходу содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство. Вирус или иной паразит, размножившись в клетке, разрушает ее: клетка лизируется, ее содержимое изливается наружу, в межклеточное пространство. Новое поколение паразитов устремляется в соседние клетки, нанося все больший и больший ущерб организму. Начинается воспалительный процесс, исходом которого может быть как выздоровление, так и гибель организма. Некротическую гибель могут вызывать физические или химические повреждения, например, обморожение или ожог, органические растворители, гипоксия, отравление, гипотонический шок и др. (Самуилов В.Д.и др., 2000).

Апоптоз представляет собой регулируемый процесс самоубийства на клеточном уровне. Его роль незаменима в индивидуальном развитии и поддержании тканевого гомеостаза у многоклеточных организмов. Нарушение регуляции апоптоза приводит к развитию ряда заболеваний (Гордеева A.B., 2004). От другого вида запрограммированной смерти -некроза, апоптоз отличает ряд морфологических и биохимических особенностей (Проскуряков С.Я., 2002). Апоптоз — форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении её размера, конденсации и фрагментации

хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматической мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду.

Картина апоптоза у растений и животных имеет много общего. Как и у животных, программируемая гибель клеток у растений служит для выполнения жизненно важных функций для реализации программы развития, дифференцировки клеток и тканей, при эмбриогенезе и постэмбриональном развитии, для реализации функций иммунной системы, защиты от патогенов. У растений отсутствуют специализированные клетки, которые, подобно макрофагам животных, фагоцируют остатки клеток, подвергшихся апоптозу. Разнообразны молекулярные механизмы программируемой гибели клетки. Апоптоз у растений может быть реализован с участием вакуолярных гидролитический ферментов. Освещение стимулирует СИ- индуцированное разрушение ядер в устьичных клетках, содержащих хлоропласты и не влияет на разрушение ядер в эпидермиальных клетках, не содержащих хлоропласты (Самуилов В.Д., 2001).

Аутофагия - процесс, описанный почти одновременно с апоптозом, как альтернативный вариант программируемой гибели клетки. Процесс аутофагии имеет более сложный биологический механизм, который функционирует в нормальной клетке как способ обновления органелл (ЬоскБЫп К. А., гакеп Ъ., 2004; Копёо У. е1 а1., 2005).

Основу этого процесса составляет: мечение подлежащей удалению части клетки, обертывание мембраной с образованием аутофагосомы и последующее слияние с лизосомой с формированием аутофаголизосомы (Оогиашк Б., КппсЫ А., 2004; ЬоскзЫп Я.А., гакеп г., 2004; Ьеуте В., 2005). Однако под влиянием некоторых стрессорных факторов приведенные выше явления могут значительно активизироваться. Аутофагия может быть индуцирована активными формами кислорода, ионизирующей радиацией, некоторыми противоопухолевыми препаратами, прекращением действия

фактора роста, снижением содержания аминокислот и АТФ в цитозоле клетки (Манских В.Н., 2007).

В последние годы были выделены в качестве самостоятельных форм гибели клетки митотическая катастрофа и сенесенс, информация о механизмах и особенно о биологическом значении которых достаточно противоречива.

Митотическая катастрофа - этот тип клеточной гибели стали выделять позже всех остальных. Под митотической катастрофой принято понимать гибель клетки в результате грубых нарушений митоза, таких как отставание хромосом в мета- и анафазе, К - митозы, мультиполюсные и многогрупповые мета- и анафазы (Roninson I.B. et al., 2001; Castedo et al., 2004). Ведущим морфологическим признаком этой формы гибели клетки считается образование одного или нескольких микроядер, в которых отсутствуют явления маргинации и конденсации хроматина, что отличает ее от апоптоза. Отсутствуют также разрывы ДНК, выявляемые TUNEL - методом (Roninson I.B. et al., 2001; Okada H., Mak T.W., 2004). Основанием для выделения митотической катастрофы в отдельный тип смерти послужили данные экспериментов по определению клоногенности облученных опухолевых клеток с блокированным апоптозом. Оказалось, что блокада апоптоза не может повысить выживаемость клеток и способность к колониеобразованию после облучения. Причем наблюдалась обратная корреляция между этими показателями и частотой образования клеток с микроядрами (Roninson I.B. et al., 2001). Из этих фактов были сделаны выводы о существовании особой формы гибели клеток, отличной от апоптоза, некроза и аутофагии.

Клеточное старение - англоязычный термин «senescence» может быть переведен на русский язык как «одряхление» и обозначает особую форму программируемой гибели клетки или, скорее, клеточного ответа на ряд внутриклеточных и внеклеточных факторов: укорочение теломер при реплекативном старении, воздействие радиации и цитостатических средств,

повреждение ДНК и др. (Копшбоп 1.В. е! а1., 2001; БеЫапоу А. й а1., 2001; Окаёа Н., Мак Т.\У., 2004). Помимо необратимого включения из пролиферации, такие клетки отличаются набором морфологических и биохимических свойств: они характеризуются уплотнением, повышенной гранулярностью цитоплазмы, наличием особых морфологический изменений гетерохроматина ядра, повышенной экспрессией Р53 и фосфорилированной ЯВ, экспрессией металлопротеиназ, продуктов генов ШК4А и АКБ и особенно в цитоплазме активности фермента р- галактозидазы (Яошпзоп 1.В. et а1., 2001; Окаёа Н., Мак Т.\¥., 2004). Последний считается специфическим маркером клеточного старения (Глухов А.И. и др., 2003).

В настоящее время благодаря интенсивному изучению вопросов танатогенеза клетки представления о разнообразии механизмов клеточной гибели и их биологической роли значительно усложнились. Чрезвычайно важным явилось понимание их неоднозначного, зачастую деаликтивного влияния на ход физиологических и особенно патологических процессов, что хорошо видно на примере опухолевого роста. Вместе с тем расширение знаний о смерти клетки привело к постановке многочисленных новых, пока еще не решенных вопросов. Все эти обстоятельства нужно учитывать при разработке подходов к активному вмешательству в регуляцию клеточной гибели в �