Структурный анализ взаимодействий гепатоцитов, эндотелиоцитов и звездчатых клеток печени при вибрационном и вирусном воздействиях

Постникова, Ольга Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурный анализ взаимодействий гепатоцитов, эндотелиоцитов и звездчатых клеток печени при вибрационном и вирусном воздействиях
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурный анализ взаимодействий гепатоцитов, эндотелиоцитов и звездчатых клеток печени при вибрационном и вирусном воздействиях"

На правах рукописи

Постникова Ольга Алексеевна

СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ГЕПАТОЦИТОВ, ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ И ЗВЕЗДЧАТЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ПРИ ВИБРАЦИОННОМ И ВИРУСНОМ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в ФГБУ Научно-исследовательском институте региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения РАМН (Новосибирск) и в ГБОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете МЗ РФ

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор Маринкин Игорь Олегович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Гуляева Людмила Федоровна профессор заведующая лабораторией молекулярных меха-

низмов канцерогенеза ФГБУ «НИИ молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН

доктор биологических наук Клинникова Марина Геннадьевна

ведущий научный сотрудник лаборатории цитологии и клеточной биологии ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН

Селятицкая Вера Георгиевна

заведующая лабораторией эндокринологии ФГБУ «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» СО РАМН

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения РАМН (Новосибирск)

доктор биологических наук, профессор

Защита диссертации состоится «_»_2013 г. в 10.00

на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.037.01 в ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан «_» _ 2013 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций Молодых Ольга Павловна Д 001.037.01 доктор биологических наук, профессор

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

библиотека общАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гепатоциты представляют собой огромную клеточную систему, специализированную на выполнении многообразных метаболических и биосинтетических функций. Несмотря на то, что ткань печени на первый взгляд выглядит мономорфной, она гетерогенна с точки зрения и структуры, и функции (Герок В., Блюм Х.Е., 2009). Эта гетерогенность обусловлена кровоснабжением дольки: клетки, локализующиеся в перипортальной зоне, отличаются от клеток перивенулярной зоны по набору ключевых ферментов, рецепторов и субклеточных структур и в связи с этим имеют различные функциональные способности (Kmiec Z., 2001). В большинстве случаев мозаичность повреждений связана с метаболической гетерогенностью гепатоцитов.

Изменения гепатоцитов, интерпретируемые как дистрофические, могут отражать как повреждение их структур и нарушение функции, так, и наоборот, интенсивную функцию клеток, их повышенную метаболическую активность. Особенно наглядно это положение подтверждается при использовании электронно-микроскопической радиоавтографии, что позволяет не только видеть изменения ультраструкгуры клетки, но одновременно оценивать ее функциональное состояние. Д.С.Саркисовым (1993) показано, что даже при выраженной жировой дистрофии гепатоцита сохраняется достаточно высокий уровень биосинтетических реакций в ядерном и цитоплазматическом компартментах.

Печень относится к органам, физиологическая и репаративная регенерация которых выражается примерно в одинаковой степени одновременно в двух формах - клеточной и внутриклеточной, т.е. осуществляется как путем увеличения числа клеток, так и гиперплазии ультраструктур в сохранившихся клетках (Court F.G. et al., 2002). Один из важнейших выводов, который можно сделать по регенерации гепатоцитов, состоит в том, что пролиферативная активность зрелых гепатоцитов достаточна для репопуляции печени после парциальной гепатэктомии. Резервный компартмент стволовых клеток печени активизируется для пролиферации и дифференцировки только в очень специфических условиях, когда пролиферация зрелых гепатоцитов ограничена или заблокирована (Fausto N., 1991; Forbes S„ 2002).

Взаимодействия паренхиматозных клеток различных органов и эн-дотелиоцитов микроциркуляторного русла являются составной частью паренхиматозно-стромальных взаимоотношений и играют важную роль в развитии физиологических и патологических процессов. Особая актуальность изучения взаимодействий паренхимы и стромы, в том числе элементов микроциркуляторного русла, связана с индукцией и прогрессией опухолевого роста (Thiery J.P., 2002).

При изучении метастазирования опухолей молочной железы продемонстрировано явление эпителиально-мезенхимной трансформации, ко-

торую рассматривают в качестве одного из механизмов ремоделирования тканей, осуществляемого в критических фазах эмбрионального развития у многих видов животных (Tomaskovic-Crook Е. et al., 2009). Кроме того, запуск механизма эпителиально-мезенхимной трансформации может иметь место и в других патологических процессах, таких как фиброз (Guarino M. et al., 2009; Fabris L., Strazzabosco M., 2011). Эти данные заставляют по-новому видеть проблему дифференцировки дефинитивных клеточных форм (Гаршин В.Г., 1939; Заварзин А.А., 1947).

В этом аспекте известна пластичность эндотелиальных клеток сосудов, являющихся активными участниками ряда ключевых физиологических функций, в том числе транспорта кислорода и питательных веществ к тканям (Patel-Hett S., D'Amore P.А., 2011). Среди других важных функций эндотелиоцитов - регуляция тонуса сосудистой стенки и процессов свертывания крови, участие в ангиогенезе и воспалении, что имеет фундаментальное значение в развитии широкого спектра адаптивных и патологических процессов (Bedi S. et al., 2008).

Влияние эндотелия на окружающие ткани реализуется различными путями: эндотелиальные клетки синтезируют компоненты соединительной ткани и способны регулировать синтез этих компонентов другими клетками, с помощью эндотелия осуществляется регуляция тонуса гладкомы-шечных клеток и, следовательно, показателей кровотока. Эндотелиальные клетки синтезируют компоненты собственной базальной мембраны, в том числе, фибронектин, коллагены, ламинин, эластин и гликозаминогликаны, экспонирующиеся на люминальной поверхности и в экстрацеллюлярном матриксе (Brandao D.F. et al., 2006).

Эндотелиоцитам свойственны тканевая специализация и ткане-специфичный полиморфизм, что определяет наличие нескольких дефинитивных форм структурной организации капилляров: соматических с непрерывной эндотелиальной выстилкой, фенестрированных и синусоидных (Braet F. et al., 2009; Jacobs F. et al., 2009; March S. et al., 2009; Cogger V.C. et al., 2010; Kawasaki T. et al., 2010; Xie G. et al., 2012; Yokomori H. et al., 2012).

Физиологические и патологические вариации функционирования тканей и органов обусловлены высокой пластичностью сосудистой системы и особенно ее микроциркуляторного русла. Эндотелий и ад-вентиция обладают выраженной способностью к регенерации, являясь «депо» полипотентных камбиальных клеточных элементов стромы (Саркисов Д.С, 1980).

По данным электронно-микроскопической радиоавтографии, мельчайшие сосуды являются элементарными структурно-функциональными единицами соединительной ткани, о чем свидетельствуют наивысшая пролиферативная и метаболическая активность перикапиллярных клеток и градиент уменьшения этой активности по мере удаления от сосудистой стенки (Саркисов Д.С., 1993; Колокольчикова Е.Г. и др., 1997).

Установлено, что во взаимоотношениях паренхимы и стромы на территории тканевого микрорайона капилляру принадлежит ключевая роль, он является своеобразным пейсмейкером (Непомнящих Г.И. и др., 1987).

Звездчатые клетки печени («липоциты», клетки Ито, жиронакапли-вающие клетки печени) локализуются в пространствах Диссе между ге-пагоцитами и эндотелиальной выстилкой синусоидов и играют ведущую роль в регуляции гомеостаза ретиноидов, депонируя до 80% витамина А (Balabaud С. et al., 2004; Geerts А., 2004; Ryder S.D., 2004; Senoo H. et al., 2010). Пространство Диссе является зоной наибольшей функциональной ответственности, обеспечивая транссинусоидальный обмен (Balabaud С. et al., 2004; Senoo Н., 2004).

Все большее значение придается роли звездчатых клеток в развитии фиброза и цирроза печени (Gabele Е. et al., 2003; Forbes S.J., Parola M., 2011; Tacke F., Weiskirchen R., 2012). При получении фиброгенных стимулов «покоящиеся» звездчатые клетки «трансдифференцируются», приобретая миофибробластоподобный фенотип, и могут продуцировать коллаген, протеогликаны и другие компоненты экстрацеллюлярного ма-трикса (Gutierrez-Reyes G. et al., 2007; Friedman S.L., 2008). Фиброз на уровне центральных вен, синусоидов или портальных сосудов лимитирует нормальную гемодинамику печени, что приводит к уменьшению объема метаболически эффе1сгивной паренхимы, в дальнейшем - портальной гипертензии и порто-системному шунтированию.

Накопление соединительной ткани в пространствах Диссе нарушает нормальный метаболический обмен между кровью и гепатоцитами, препятствуя клиренсу циркулирующих макромолекул, изменяя межклеточные взаимодействия и приводя к дисфункции клеток печени (Brandao D.F. et al., 2006; Lee Y„ Friedman S.L., 2011).

Существуют противоречивые мнения относительно того, способны ли активированные звездчатые клетки возвращаться к покоящемуся фенотипу. Получены данные о том, что фиброгенные звездчатые клетки печени могут частично нивелировать процесс активации, например, при воздействии ретиноидов или при взаимодействии с компонентами экстрацеллюлярного матрикса (Kisseleva Т., Brenner D.A., 2007). Решение этого вопроса лежит в основе проблемы обратимости фиброза и разработки терапевтических подходов к лечению цирроза печени (Desmet V.J. et al., 2004; Schuppan D., Afdhal N.H., 2008).

В настоящее время при исследовании состояния печени с помощью современных методов оценивают некоторые вирусологические и иммунологические показатели. Имеется достаточно большое количество исследований по ассоциации полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (Вавилин В.А., 2002), опухолевым заболеваниям и быстро прогрессирующим циррозам печени (Непомнящих Д.Л. и др., 2006). Тем не менее, даже при использовании комплекса молекулярно-генетических методик структурное исследование печени остается необходимым для

оценки изменений органа, в том числе, в условиях вибрационного и вирусного воздействий.

Исследования висцеральных органов при вибрационном воздействии единичны и касаются, как правило, лишь экспериментальных моделей, несмотря на то, что полиорганные изменения развиваются вследствие системного поражения микроциркуляторного русла с последующей дисфункцией внутренних органов. В условиях профессиональной вибрации важное место занимает печень как основной метаболический и детоксикационный орган (Сухаревская Т.М. и др., 2000; Измеров Н.Ф. и др., 2004).

В оценке структурных изменений органов большое значение имеют межорганные взаимодействия, отражающие системность заболеваний (Крылов A.A., 2000; Апросина З.Г. и др., 2002; Плешко Р.И. и др. 2006). В этом контексте нами продолжено изучение гепато-гастральных отношений, единство которых обеспечивается принадлежностью к пищеварительной системе.

Цель исследования - изучить ультраструктурные основы межклеточных взаимодействий основных популяций печени при вибрационном и вирусном воздействиях для разработки концепции эндотелиально-сгро-мально-паренхиматозных взаимодействий как основе альтеративных и репаративных процессов.

Задачи исследования:

1. Изучить характер внутриклеточной реорганизации основных клеточных популяций печени (гепатоцитов, эндотелиоцитов, звездчатых клеток) при воздействии производственной вибрации.

2. Провести оценку структурных изменений клеточных популяций печени после воздействия экспериментальной вибрации (в течение одного месяца) и в периоде восстановления.

3. Изучить внутриклеточную реорганизацию основных клеточных популяций печени (гепатоцитов, эндотелиоцитов, звездчатых клеток) при воздействии РНК-содержащего вируса гепатита С (HCV-инфекция).

4. Провести структурно-функциональное исследование звездчатых клеток печени в онтогенезе (экспериментальная модель) и при вирусном HCV воздействии (клиническая модель).

5. Изучить особенности морфогенеза эндотелиапьно-стромально-па-ренхиматозных взаимодействий в печени при воздействии вибрационного и вирусного факторов.

Научная новизна. Впервые на основе сравнительного изучения характера эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий установлены основные этапы структурно-функциональной перестройки печени при вибрационном и вирусном воздействиях. Представлены основные варианты внутриклеточной реорганизации гепатоцитов, эндотелиоцитов и звездчатых клеток печени при реализации физиологических и патологических процессов.

Установлено, что к ведущим ультраструктурным изменениям гепато-цитов и эндотелиоцитов относятся редукция белоксинтезирующих орга-нелл, частичная деструкция митохондриального компартмента, усиление аутофагических процессов. Показано, что снижение белоксинтезирующей и энергетической функций гепатоцитов и угнетение транссинусоидального обмена сопровождаются фибро генной трансформацией звездчатых клеток, увеличением количества коллагеновых волокон в пространствах Диссе, развитием перицеллюлярного фиброза.

Впервые показано, что тканевая пространственная организация печени при воздействии производственной вибрации имеет особенности в сравнении с вирусными воздействиями. При вибрационном воздействии наблюдается высокая объемная плотность гепатоцитов с «опустошенной» цитоплазмой при уменьшении количества двуядерных гепатоцитов по сравнению с данными показателями при гепатите С, что свидетельствует о снижении регенераторного потенциала паренхимы печени. РНК-содержащий вирус гепатита С повреждает преимущественно цитоплаз-матические органеллы при сохранении ядерного компартмента.

Определена фиброгенная активация звездчатых клеток печени, характеризующаяся редукцией липидных капель и синхронной экспрессией фибробластоподобных свойств - позитивной иммуногистохимической реакцией на гладкомышечный а-актин, гиперплазией гранулярной цито-плазматической сети и перигепатоцеллюлярным формированием коллагеновых фибрилл. Особенно значительная экспрессия гладкомышечного а-актина происходит в фибробластах и миофибробластах портальных зон.

Несмотря на прогрессирующее уменьшение численной плотности липидосодержащих звездчатых клеток при развитии фиброза, поддерживается функция депонирования ретиноидов: при циррозе печени в фиброзных септах и внутри долек сохраняются липидосодержащие звездчатые клетки. Сделано заключение, что звездчатые клетки печени - полиморфная гетерогенная популяция с широким спектром функциональной активности.

Установлено, что основу висцеропатий при вибрационном воздействии составляет синдром, включающий прогрессирующую системную дистрофию и последующую атрофию паренхиматозных клеток, диффузный фиброз стромы, ранние системные изменения микрососудов с атрофией и дисфункцией эндотелиоцитов. В ткани печени развивается субтотальный и тотальный коллапс синусоидов, сопровождающийся фиброгенной трансформацией звездчатых клеток, диффузной атрофией гепатоцитов и коллагенизацией пространств Диссе.

Выделены структурные маркеры цитотоксического поражения гепатоцитов при вирусном гепатите С, ассоциированном с опийной зависимостью, - частичная деструкция митохондриального компартмента и гиперплазия агранулярной цитоплазматической сети, ассоциированная с редукцией белоксинтезирующих органелл.

В отличие от вирус-ассоциированного, преимущественно перипор-тального поражения печени, структурное выражение воздействия наркотических веществ реализуется в центролобулярной зоне. Его маркеры -макровезикулярная липидная инфильтрация гепатоцитов, интрагепатоцел-люлярный холестаз, центролобулярные некрозы, присутствие эозинофилов в клеточных инфильтратах, центральный и перисинусоидальный фиброз.

Впервые при сопоставлении данных биохимического анализа, ПЦР и структурных изменений печени установлено отсутствие прямой зависимости между выраженностью структурных изменений печени, активностью НСУ-инфекции и выраженностью репликации вируса (его количественного присутствия в образцах крови и/или ткани печени). Показано, что при достаточно высоком уровне виремии доминируют минимальные изменения структуры печени, определяется слабо выраженная степень активности НСУ-инфекции.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты раскрывают новые закономерности тканевых, клеточных и внутриклеточных реакций, имеющие большое теоретическое и практическое значение - установлена роль звездчатых клеток печени в развитии фиброза органа, представлены варианты пластичности клеточных популяций печени, описаны механизмы «автономизации» паренхиматозных клеток печени, существенно влияющие на паренхиматозно-синусоидальный обмен в условиях перисинусоидального фиброза и на возможность редукции фиброзных изменений.

Данные проведенного исследования свидетельствуют о важности комплексного морфологического изучения биопсий печени для диагностики, дифференциальной диагностики, определения прогноза и тактики терапии хронических заболеваний печени. Результаты исследования целесообразно внести в курс преподавания соответствующих разделов гистологии и патоморфологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При вибрационном и вирусном воздействиях в клеточных популяциях печени развиваются нарушения клеточной и внутриклеточной регенерации, пластический дефицит, дистрофия, атрофия, элиминация клеток, диффузный реактивный фиброз.

2. Профессиональная вибрация существенно влияет на структуру и функцию печени - основного метаболического и детоксикационного органа - обнаруживается выраженная атрофия паренхиматозных клеток, фиброз и системные изменения микрососудов с атрофией и дисфункцией эндотелия.

3. Наличие РНК НСУ в крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NSЗAg) не имеют достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по струюурным изменениям печени и клинико-биохими-ческим тестам.

4. Структурные признаки активации звездчатых клеток печени - превращение их из «пассивных», накапливающих витамин А, в клетки «мио-фибробластоподобные» с исчезновением липидных капель и экспрессией гладкомышечного а-актина - ассоциируются с прогрессией фиброза и цирроза печени.

Апробация работы. Материалы исследования представлены на 8-й научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 1998); 6-й Всероссийской конференции «Патология клетки» (Москва, 2000); научно-практических конференциях «Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине» (Новосибирск, 2000, 2001); 12-й Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2006); 13-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2011» (Санкт-Петербург, 2011); 19-й научно-практической конференции «Достижения современной гастроэнтерологии» (Томск, 2011); XVII Ежегодном Российском конгрессе «Гепашлогия сегодня» (Москва, 2012); 14-м Международном СлавяноБалтийском научном форуме «Санкт-Петербург - Гастро-2012» (Санкт-Петербург, 2012); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2012); Ученом совете ФГБУ Научно-исследовательского института региональной патологии и паггоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 научных работ, из них 19 - в рецензируемых журналах по списку ВАК и в системе цитирования (библиографической базе) Web of Science.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 188 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), результатов собственных исследований (7 глав), обсуждения, выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован таблицами и рисунками (диаграммы, микрофото- и электронограммы).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено комплексное морфофункциональное исследование характера эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий в печени в условиях вибрационного и вирусного воздействия.

Вибрационное воздействие: экспериментальная модель. Исследовали 190 крыс-самцов Вистар массой тела 180 - 200 г. 120 крыс было использовано для изучения воздействия вибрации, 70 - для изучения процессов восстановления. Для исследования эффектов вибрации животные были разделены на 5 групп по 24 особи в каждой группе.

Животные 1-й группы подвергались воздействию вибрации однократно (1 ч), 2-й группы - в течение 5 сут, 3-й группы в течение 10 сут, 4-й - 20 сут, 5-й - 30 сут, по 1 часу ежедневно. Применяли ежедневное

воздействие общей вертикальной вибрации (частотой 32 Гц при ускорении 50 м/с2) в специальной клетке, установленной на площадке вибратора от вибростенда ВЭДС-100Б в течение 1 ч.

Каждая группа состояла из 12 контрольных и 12 опытных животных. Для изучения восстановительного периода животных, подвергнутых воздействию вибрации, выводили из эксперимента на 5-е, 10-е, 20-е и 30-е сутки. Исследование проводилось совместно с проф. Е.Л.Потеряевой (НГМУ).

Вибрационное воздействие - клиническая модель: печень.

Проанализированы 112 наблюдений (45 биоптатов печени) с вибрационным синдромом от воздействия локальной (62 человека) и общей (50 человек) вибрации - мужчины в возрасте от 33 до 60 лет: в 70% диагностирована I степень вибрационного синдрома, в 30% - П степень; при воздействии общей вибрации в 71% случаев установлена I степень, в 26% - II степень.

Проведен сравнительный анализ с гепатитами С (35 человек) и С+В (20 человек).

Вирусное воздействие. Проанализированы 118 наблюдений с HCV-инфекцией (79 мужчин и 39 женщин) в возрасте от 18 до 62 лет; 22 человека были инфицированы при внутривенном употреблении наркотических веществ (опиатов), среди них преобладали мужчины молодого возраста (18 человек). Изучены биохимические показатели крови с определением активности сывороточных ферментов, выявляли серологические маркеры вирусной инфекции.

Изучение биопсий играло ключевую роль в оценке определения степени и активности инфекционного процесса, базировалось на световой и электронной микроскопии, дополненной методами морфометрии, сте-реологии и иммуногистохимии.

При анализе структурных изменений в биоптатах печени использована Лос-Анджелесская классификация хронических гепатитов (Desmet V.J. et al., 1994), выделяющая в качестве ведущей характеристики этиологический фактор, а также определение степени активности HCV-инфекции и стадии развития фиброза.

Общую степень активности инфекционного процесса оценивали по трем составляющим: клинической, биохимическим тестам с ведущей ролью цитолитического синдрома и структурным изменениям печени.

Оценка структурно-функциональной реорганизации звездчатых клеток печени в онтогенезе и динамике развития фиброза. Экспериментальная модель. Проведен сравнительный анализ популяции звездчатых клеток печени в динамике онтогенеза у 38 крыс-самцов Вистар массой тела от 110 до 480 г. Животные были разделены на 4 возрастные группы: 4, 9, 12 и 24 мес (по 10, 10, 9 и 9 животных соответственно).

Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных

(Приказ МЗ СССР № 75 5 от 12.08.1977) и правилами Европейской конвенции по защите животных (Страсбург, 1986); клинический материал изучали с соблюдением положений последней редакции Этических принципов Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000).

Проводилась световая микроскопия, включая парафиновые и полутонкие срезы, а также электронная микроскопия и ультраструктурный стереологический анализ поверхностной плотности цитоплазматических органелл звездчатых клеток.

Клиническая модель. Проведено комплексное исследование 100 образцов биоптатов печени при HCV-инфекции на различных стадиях фиброзных изменений, разделенные на 4 равные группы по степени выраженности фиброза. Стадию фиброза печени определяли по 4-балльной шкале, начиная от портального фиброза (I стадия) до цирроза с образованием порто-центральных васкуляризованных септ и нодулярной трансформацией паренхимы.

Звездчатые клетки печени и другие матрикс-продуцирующие клеточные элементы выявляли в динамике развития фиброза по экспрессии гладкомышечного а-актина.

Методы морфологического и молекулярно-генетического анализа. Световая микроскопия. Для проведения световой микроскопии образцы фиксировали в охлажденном 4%-м растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (pH 7,2 - 7,4). Далее следовали обезвоживание и заливка в парафин по общепринятой схеме.

Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию (Меркулов Г.А., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996). Полутонкие срезы окрашивали реактивом Шиффа и азуром II. Исследование проводили в универсальном микроскопе Leica DM 4000В (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры Leica DFC 320 и компьютерной программы Leica QWin.

Электронная микроскопия. Использовали фиксацию в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (pH 7,2 - 7,4). Материал дофиксировали в 1% растворе 0s04, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, проводили через ацетон и помещали в смесь эпона и аралдита.

Полутонкие срезы готовили на ультрамикротоме Tesla, окрашивали реактивом Шиффа и азуром II. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB III, контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца в парах щелочи натрия и исследовали в электронных микроскопах серии JEM (100 SC и 1010) при ускоряющем напряжении 80 кВт.

Иммуногистохимическое исследование. Экспрессию гладкомышечного a-акгина в матрикс-продуцирующих клетках печени тестировали

с помощью двухшагового непрямого иммунопероксидазного метода со стрептавидин-биотиновой системой визуализации продуктов реакции с негативным контролем.

В качестве первичных антител использовали мышиные монокло-нальные антитела к пхадкомышечному а-актину (NovoCastra Lab. Ltd, Великобритания) в разведении I : 25; в качестве вторичных антител -универсальные биотинилированные антитела. Продукты иммуногисто-химической реакции визуализировали с помощью диаминобензидина, затем срезы докрашивали гематоксилином Майера. При статистической обработке данных применяли критерий Стьюдента; различия сравниваемых параметров считали значимыми, если вероятность ошибки Р была меньше 0,05.

Морфаметрическое и стереологическое исследование. Морфометри-ческое исследование печени проведено с помощью окуляр-микрометра МОВ-1-15* на полутонких срезах. Стереологический анализ проводили на двух уровнях структурной организации - тканевом и внутриклеточном.

Стереологический анализ образцов печени проводили с применением окулярной многоцелевой тестовой системы коротких отрезков (п = 36, Р = 72, L = 650 мкм). При стереологическом исследовании образцов печени оценивали структурную плотность компонентов паренхимы и стромы: гепатоцитов, синусоидов, эндотелиоцитов, стромы, клеточных инфильтратов.

После определения первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные параметры, отражающие паренхиматозно-васкулярные взаимоотношения. Численную плотность звездчатых клеток оценивали на полутонких срезах в единице поля зрения, равной 38000 мкм2.

Внутриклеточный стереологический анализ паренхиматозных клеток печени при вирусном воздействии (HCV и HBV) включал определение структурной плотности цитоплазматических органелл гепатоцитов. Тестовая система состояла из циклоидов суммарной длиной 45 мкм и 70 тестовых точек (Gundersen H. et al., 1988).

Радиоавтографическое исследование. Для радиоавтографического исследования in vitro фрагменты биоптатов и осадок, полученный центрифугированием, помещали во флаконы с 5 мл питательной среды № 199 и одним из предшественников синтеза ДНК или РНК, меченых тритием. Концентрация 3Н-тимидина (удельная радиоактивность 24 Ки/мМ) составляла 100 мкКи/мл, концентрация 3Н-уридина (удельная радиоактивность 26,6 Ки/мМ) - 100 мкКи/мл.

Инкубацию проводили в ультратермостате УТ-15 при температуре 37°С в течение 1,5 часов. Затем образцы быстро отмывали от инкубационной смеси, фиксировали в 4%-м растворе параформальдегида, постфик-сировали в 1%-м растворе 0s04 и обрабатывали по стандартной методике для электронно-микроскопического исследования. Подсчет плотности и индекса метки проводили на полутонких срезах.

Метод ПЦР. Исследования выполнены с помощью диагностических наборов QIAamp Viral PNA kit (Германия), ЗАО «Сибэнзим» (Новосибирск) и коммерческих тест-систем научно-производственной лаборатории при ЦНИИ эпидемиологии (Москва). Для выделения РНК вируса гепатита С из биологических субстратов использовали метод кислофенольной субстра-ции. Комплементарную кДНК получали путем реакции обратной транскрипции с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Далее проводили стандартную полимеразную цепную реакцию с помощью Taq-полимеразы и специфичных праймеров.

Генотипирование. Генотипирование HCV осуществлялось путем сравнения последовательностей 5'UTR и частей гена выявленных изолятов HCV с данными базы «Генбанк». Оценка уровня виремии проводилась с помощью тест-системы научно-производственной лаборатории ЦНИИ эпидемиологии (Москва). При исследовании пункционной биопсии печени, кроме световой микроскопии, парафиновых и полутонких срезов и электронной микроскопии, проводили иммуногистохимическое исследование парафиновых срезов на выявление NS3 Ag HCV и гладкомышечного а-актина.

Статистическая обработка данных. Сравнительный анализ количественных переменных проводили методами описательной статистики. Для оценки нормальности распределения признаков использовали показатели эксцесса и асимметрии.

В случаях нормального распределения, а также равенства выборочных дисперсий, для сравнения средних применяли t-критерий Стьюдента. В случае распределений, не соответствующих нормальному, а также при неравенстве дисперсий, использовали непараметрические U-критерий Манна-Уитни (для независимых выборок) и Т-критерий Вилкоксона (для связанных выборок).

Обработку и графическое представление данных проводили с помощью компьютерных программ Statistica 6.0 и Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальная модель воздействии вибрации. Структурные изменения внутренних органов экспериментальных животных в период воздействия вибрации имели стереотипный характер. Главными на всех сроках наблюдения являлись острые нарушения гемодинамики, прежде всего микроциркуляторного русла, сопровождающиеся гиперемией, периваскулярным отеком, геморрагиями и сладж-синдромом. Синхронно с сосудистой дисфункцией возникали дистрофические изменения паренхиматозных клеток, нарастающие с длительностью воздействия вибрации.

Воздействие вибрации в течение 5 дней приводило к углублению гемодинамических расстройств. Выявлены однотипные изменения co-

судов микроциркуляторного русла в миокарде и надпочечниках, характеризующиеся расширением, особенно венозного отдела, выраженным периваскулярным отеком.

Отмечали набухание и десквамацию эндотелиоцитов, внесосудистое расположение эритроцитов, плазматическое пропитывание стенок мелких артерий и разрыхление их адвентации.

При продолжительном воздействии вибрации нарушение гемодинамики носило выраженный характер: полнокровие всех сосудов, внесосуди-стые скопления свежих эритроцитов, периваскулярный и интерстициаль-ный отек, в отдельных сосудах - отслоение эндотелия, утолщение стенок мелких артерий. Продолжительное воздействие вибрации сопровождалось менее значительным увеличением количества капилляров на площади 1 мм2 по сравнению с однократным воздействием (до 56,0 ± 3,41) и степени капилляризации (0,18 ± 0,04).

При исследовании ультраструктурных изменений печени крыс на 5-й день вибрационного воздействия в синусоидах обнаруживались признаки диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром) (Вашкинель В.К., Петров М.Н., 1982). Нередко агглютинированные скопления тромбоцитов полностью перекрывали просветы синусоидов. Обнаружены некробиотические изменения в части эндотелиоцитов с поврежденными плазмолеммами. На 30 сут воздействия вибрации отмечена тенденция к развитию атрофии гепатоцитов, почечных клубочков, желудка, а также фрагментация и атрофия кардиомиоцитов и скелетных мышц.

Ведущим феноменом в ультраструктурной реорганизации являлись системные изменения эндотелия - резкое истончение, фрагментация и деструкция эндотслиальной выстилки микрососудов, наиболее выраженная на поздних сроках.

Ультраструктурные изменения в печени крыс на 30-й день вибрационных воздействий характеризовались более выраженными, чем на предыдущих этапах опыта, проявлениями ДВС-синдрома в синусоидах. Наблюдались признаки всех трех стадий образования тромбов. Часто обнаруживались явления «закупорки» синусоидов агрегатами агглютинированных тромбоцитов в участках разрушенной эндотелиальной выстилки, где также нередко были видны дегранулированные и распавшиеся тромбоциты, входящие в конгломераты с агглютинированными эритроцитами и нитями фибринами, наблюдались явления сладжирования эритроцитов.

Таким образом, в условиях эксперимента можно проследить определенную фазность в реакции микроциркуляторной системы на вибрационное воздействие и однотипность морфологических изменений сосудов различных органов (миокарда, печени, почек и надпочечников). Полнокровие микроциркуляторного русла с компенсаторным увеличением количества капилляров и степени капилляризации является одним из ранних последствий однократного воздействия вибрации.

В восстановительный период после воздействия вибрации отмечалась положительная динамика: постепенно уменьшалась выраженность гемо-динамических нарушений, сокращалось количество паренхиматозных и эпителиальных клеток с признаками дистрофии; на 30 сут после окончания воздействия вибрации многие клеточные популяции восстановили нормальную структуру и функции.

В гепатоцитах отмечено возрастание количества свободных и прикрепленных рибосом и полисом, восстановление ультраструктурной организации митохондрий, гиперплазия элементов гранулярной цито-плазматической сети, увеличение числа микроворсинок на васкулярном полюсе.

Обращала на себя внимание ультраструктурная реорганизация микро-циркуляторного русла: отмечены признаки гиперплазии цитоплазмати-ческих органелл эндотелицитов и гепатоцитов, увеличение количества микровезикул и выростов люминальной поверхности эндотелиальной выстилки, что свидетельствует о повышении функциональной активности микрососудов.

Таким образом, у экспериментальных животных, подвергшихся длительному воздействию общей вибрации, выявлены признаки системных нарушений микроциркуляции, сопровождающиеся развитием ДВС-синдрома, некробиотическими изменениями эндогелиоцитов и нарушением структурно-функциональных свойств эритроцитов и тромбоцитов. При структурном анализе внутренних органов животных выявлены стереотипные дистрофически-атрофические изменения паренхиматозного и эндотелиального компартмента, носящие обратимый характер.

Клиническая модель воздействия производственной вибрации на структуру и функцию печени. Отличительная макроскопическая особенность биоптатов печени при вибрационном воздействии - бледный, почти белый цвет образца. При микроскопии обращало на себя внимание состояние синусоидальной системы печеночных долек: тотальный или субтотальный коллапс синусоидов, диффузная атрофия гепатоцитов при значительном снижении содержания гликогена.

В цитоплазме клеток отмечалось различное количество гранул желчного пигмента и мелко- и средневезикулярные липидные включения; небольшая часть гепатоцитов - с опустошенной цитоплазмой. Обращал на себя внимание перисинусоидальный фиброз, сопровождающийся гиперплазией фиброгенных звездчатых клеток; портальные тракты были умеренно расширены и фиброзированы.

При изучении биоптатов печени отмечалась гетерогенность ультраструктурной организации гепатоцитов. Большинство паренхиматозных клеток печени характеризовалось парциальной или тотальной опустошенностью цитоплазмы, содержащей перинуклеарные короткие одиночные цистерны гранулярной цитоплазматической сети и контактирующие с ними мелкие митохондрии.

Минимальная часть гепатоцитов отличалась сравнительно высокой насыщенностью мембранными органеллами, среди которых имелись расширенные короткие профили гранулярной цитоплазматической сети, мелкие митохондрии с плотным матриксом, единичные лизосомы и многочисленные полиморфные резидуальные тельца. В некоторых гепатоцитах локализовались гранулы с желчными пигментами, а также мелкие цистерны и везикулы гладкой цитоплазматической сети, концентрирующиеся у билиарного полюса клеток. Эндотелиоциты синусоидов отличались высокой осмиофильностью цитоплазмы и низким уровнем транссинусоидального обмена.

Пространства Диссе содержали фрагменты разрушенных мембранных структур и коллагеновые фибриллы. Звездчатые клетки печени имели переходный и фибробластоподобный фенотип с индукцией белоксин-тезирующей активности. Таким образом, длительное воздействие производственной вибрации сопровождалось коллапсом синусоидов и, как следствие, нарушением транссинусоидального обмена и прогрессирующей атрофией и гибелью гепатоцитов.

Исследование тканевой пространственной организации биоптатов печени при воздействии производственной вибрации выявило отличительные особенности в сравнении с гепатитами С и С+В. Обращали на себя внимание достаточно высокая объемная плотность гепатоцитов с опустошенной цитоплазмой (клеточно-инволютивная дистрофия) при вибрационном воздействии (рис. 1) и уменьшение количества двуядерных гепатоцитов по сравнению с вирусными гепатитами, что в целом свидетельствует о снижении регенераторного потенциала паренхимы печени при вибрационном воздействии.

Большинство вторичных стереологических параметров принимали близкие средние значения, в том числе при оценке васкулярно-паренхи-матозных взаимоотношений (рис. 2). Отличались показатели объемно-объемного паренхиматозно-стромального взаимоотношения, среднее значение которого при вибрационном воздействии имело выраженную тенденцию роста но сравнению с близкими между собой показателями групп вирусных гепатитов. Это связано, по-видимому, с невысокими значениями объемной плотности соединительнотканного компартмента печени при вибрационном воздействии, в отличие от вирусных гепатитов, где наблюдается развитие фиброза органа.

В целом, паренхиматозный и эндотелиальный компартменты печени при вибрационном воздействии имели ультраструктурные признаки атро-фических изменений, выражающиеся в редукции белоксинтезирующих структур, и сопровождающиеся усилением фиброгенной активности звездчатых клеток печени с дисфункцией синусоидов вследствие «блокады» пространства Диссе.

Морфологическое исследование печени при вирусной НСУ-инфскции. При морфологическом исследовании биоптатов печени

см3/см3 2,5

2,0

1,5 -

1,0

0,5 -|

0,0

число

1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 -- 0,6 -- 0,4 -- 0,2 0,0

1 2 3

Рис. 1. Объемная плотность гепатоцитов с явлениями клеточно-инволютивной дистрофии (а) и численная плотность двуядерных гепатоцитов в единице ПОЛЯ зрения (О) при вирусном С (1), С+В (2) и вибрационном воздействиях (3).

см3/см3 6,0

5,0

4,0

3,0

2,0

1,0

0,0

-ь-

КЗ |

1 1 2

см3/см3 0,8

0,6 0,4 0,2 0,0

Рис. 2. Объемно-объемные паренхиматозно-стромальные (а) и васкулярно-парен-химатозные (сз) взаимоотношения при вирусном С (1), С+В (2) и вибрационном воздействии (3).

мииимальной степени активности (А 1) инфекционного процесса соответствовали очаговые дистрофические изменения гепатоцитов и отсутствие очагов некроза и некробиоза. При слабо выраженной степени активности (А2) дистрофия гепатоцитов носила более распространенный характер, очаги некроза и некробиоза отсутствовали. При умеренной степени активности (A3) дистрофия гепатоцитов сочеталась с моноцеллюлярными или более крупными, но единичными, очагами некроза, некробиоза или постнекротическими гранулемами.

Выраженная степень активности (A4) ассоциировалась с наличием некротической компоненты - внутридольковыми очагами некроза и некробиоза. Из 118 наблюдений в 23 случаях установлена минимальная степень активности, в 64 - слабо выраженная, в 28 - умеренная, и лишь в трех случаях выраженная степень активности.

Морфогенез гепатита С рассматривался по трем взаимосвязанным составляющим: поражение гепатоцитов, реакция непаренхиматозных

клеточных популяций печени и ремодел ирование соединительной ткани -развитие фиброза. Ведущей и универсальной реакцией паренхиматозных клеток печени при любом повреждающем воздействии является дистрофия, иногда приводящая к некробиозу и некрозу гепатоцитов, в частности, в результате накопления в цитоплазме железа, меди, и компонентов желчи. Вторая составляющая морфогенеза - клеточная инфильтрация (реакция иммунокомпетентных клеток на вирусную инфекцию), связанная с миграцией и пролиферацией Т-лимфоцитов, формирующих агрегаты в портальных трактах с последующим распространением в паренхиму. Третий компонент морфогенеза - фиброз печени как результат комплекса деструкгивно-пролиферативных реакций в динамике инфекционно-ви-русного процесса.

При гепатите С преобладала особая форма повреждения гепатоцитов, характеризовавшаяся редукцией цитоплазматических органелл и визуальной картиной «опустошенности» клеток. Основу данной формы дистрофии составляла не альтерация и последующий некроз гепатоцитов, а снижение процессов восстановления «изношенных» цитоплазматических органелл за счет угнетения синтеза структурных белков.

Этот вид дистрофии оказался доминирующим при НСУ-инфекции. Микроскопически клеточно-инволютивная дистрофия проявлялась фокальной или почти тотальной опустошенностью цитоплазматического матрикса при сохранении интактного ядра и перинуклеарных комплексов цитоплазматических органелл, определяющих возможность последующей внутриклеточной регенерации, что позволяет считать это состояние клетки обратимым.

В инфицированной клетке наблюдались фокальные очаги деструкции мембранных цитоплазматических органелл с последующим формированием гетерогенных резидуальных телец, обнаруживаемых впоследствии в пространстве Диссе.

Значительная доля НСУ-инфицированных лиц наркозависимы. В таких случаях морфогенез структурных реакций печени определялся сочетанием эффектов вирусного и токсического факторов - некоторые тканевые и ультраструкгурные изменения имели особенности, связанные, вероятно, с метаболизмом наркотических веществ. В частности, обнаружена специфичность фиброзных изменений печени с преимущественным фиброзом центральных вен и центролобулярной зоны (метаболический фиброз) даже при минимальном фиброзе портальной и перипортальной ткани.

В половине образцов на фоне микровезикулярной липидной инфильтрации выявлена макровезикулярная липидная дистрофия гепатоцитов - один из универсальных маркеров токсического воздействия. Гиперплазия агранулярной цитоплазматической сети и появление гигантских митохондрий указывают на напряжение антитоксической функции печени.

При изучении биоптатов печени лиц с НСУ-инфекцией, ассоциированной с наркоманией, отмечено преобладание слабо выраженной степени

о ------- . —-I

12 3 4

Степень активности

Рис. 3. Зависимость степени активности НСУ-инфекции (1 - минимальная; 2 -слабо выраженная; 3 - умеренная; 4 - выраженная) по биоптатам печени (%) от уровня АлАТ.

активности процесса и фиброза независимо от давности инфицирования, и большая частота формирования лимфоидных фолликулов. Последнее, возможно, обусловлено многократным реинфицированием наркозависимых вирусом гепатита С, отличающимся генотипическим разнообразием. В 60% случаев в составе клеточного инфильтрата портальных зон и в просветах синусоидов встречались эозинофилы, присутствие которых относят к маркерам лекарственного либо паразитарного поражения печени (Серов В.В., Лапиш К., 1989).

Одним из основных функционально-биохимических маркеров активности НСУ-инфекции является уровень сывороточных трансаминаз, в первую очередь, аланиновой аминотрансферазы (АлАТ). По выраженности цитолитического синдрома (уровню АлА'Г) выделено 5 групп - АлАТ в пределах нормы (25 ± 1,8 ед./л), минимально повышенная (64,7 ± 2,3 ед./л), слабо повышенная (141,1 ±6,5 ед/л), умеренно выраженная (304,7 ± 15,3 ед./л) и выраженная (709,9 ± 105,3 ед./л). Повышение уровня АлАТ сопровождалось, как правило, нарастанием тяжести клинических синдромов, а также гепатомегалии.

В целом, показатели АлАТ колебались от 10 до 689 ед./л (112,62 ± 10,15 ед./л). При наличии репликации вируса в образцах крови уровень АлАТ составил 115,98 ± 11,42; в отсутствие репликации - 97,54 ± 19,98 ед./л. Результаты статистического анализа показали, что существует положительная корреляция (Я = 0,66) между показателями АлАТ и выраженностью структурных изменений печени, но при детальном анализе обнаружено, что эта зависимость ослабляется при возрастании степени активности инфекционного процесса (Я2 = 0,52) (рис. 3).

Преимущественно невысокий уровень АлАТ при НСУ-инфекции можно объяснить тем, что АлАТ является внутриклеточным ферментом, и увеличение его показателей отражает цитолиз гепатоцитов, то есть гибель

клетки путем колликвационного некроза; при НСУ-инфекции крайне редко развивались некрозы такого типа.

Выявление РНК НСУ в различных биологических субстратах. При моноинфекции РНК НСУ выявлена в сыворотке крови в 77% случаев, в мононуклеарных клетках крови - в 73%; в сыворотке и мононуклеарах одновременно - в 55% наблюдений. В 18% случаев РНК НСУ обнаружена в клеточных элементах при отсутствии в сыворотке крови. Кроме того, ПЦР на РНК НСУ была положительна в образцах слюны у 7 человек из 34, в моче - у 5, у 3 человек - в обоих субстратах.

Анализ сопоставления маркеров репликации вируса, по данным по-лимеразной цепной реакции (ГЩР), и степени активности инфекционно-вирусного процесса показал, что при наличии РНК НСУ в сыворотке и/или мононуклеарных клетках крови в 70% случаев обнаружена минимальная (14,3%) и слабо выраженная (55,8%) степень активности процесса. Статистический анализ не выявил корреляционной связи между наличием репликации вируса в образцах крови и выраженностью структурных изменений в биоптатах печени.

ПЦР на РНК НСУ в образцах крови (сыворотка и мононуклеарные клетки) и ткани печени имела положительный результат в 67% случаев, в образцах крови - в 15% случаев, в образцах печени - в 12%, маркеры репликации отсутствовали у 6% пациентов. При наличии РНК НСУ в крови и ткани печени степень активности патологического процесса была преимущественно минимальной или слабо выраженной (68% случаев), так же как и при наличии репликации вируса в биоптате печени при отрицательных данных ПЦР в образцах крови. Кроме того, даже в отсутствие репликации вируса во всех субстратах регистрировалась более высокая (АЗ) степень активности.

При полуколичественном анализе экспрессии антигена NSЗAg НСУ обнаружено, что поражение печени при НСУ-инфекции не зависит от числа инфицированных гепатоцитов: в 71% случаев обнаружена минимальная и слабовыраженная степень активности патологического процесса. В подавляющем большинстве случаев репликация НСУ в нативной ткани печени (80%) и образцах крови (83%) по данным ПЦР сопровождалась иммуногистохимическим выявлением Ы83А§.

Генотипирование НСУ. Большинство пациентов (53% случаев) инфицированы вирусом гепатита 1Ь, 30% - генотипа 2 и 14% - генотипа За. При генотипах 1Ь и За почти в 100% случаев определялась умеренная виремия. При генотипе 2 в 10% наблюдений имела место низкая виремия, однако именно этот генотип ассоциировался с более высокими показателями активности патологического процесса (46% случаев) (рис. 4).

В целом, обнаружены следующие основные закономерности, характеризующие морфогенез НСУ-инфекции:

- Наличие РНК вируса гепатита С в крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии

53% 92 наблюдения

Генотип нем г, при А1 | г.лриАг г. при Аз

1Ь 2 0,832 р<0,001 0,672 р<0,001

0,220 р>0,05 0,230 р>0,05 ' 0,390 р<0,001

За 0,343 р=0,002 0,287 р=0,007 I 0,368 р<0,001 !

□ минимальная ■ слабо выраженная

□ умеренная 1Ь 1а 2 За

Рис. 4. Генотипирование НСУ и степень активности гепатита С.

6 пациентов

83 пациента

Степень активности

й минимальная И умеренная И слабо выраженная а выраженная

Низкая виремия

Ю5 - 10е копий I мл плазмы

Высокая виремия

10е -10* «опий I мл плазмы

Рис. 5. Уровень виремии НСУ и степень активности гепатита С.

NSЗAg НСУ) не имеют достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по клинико-биохимическим данным и структурным изменениям печени.

- При высоком уровне виремии (от 106 до 108 копий НСУ в 1 мл плазмы) доминируют незначительные изменения структуры печени: в 60% случаев выявлена слабо выраженная степень активности НСУ-инфекции (г = 0,631, р< 0,001) (рис. 5).

- Отсутствие зависимости между репликацией НСУ и степенью поражения печени при НСУ-инфекции связано с выраженной антивирусной реакцией гепагоцитов, фенотипически проявляющейся клеточно-инволю-тивной дистрофией.

В целом, поражение печени при НСУ-инфекции не имеет прямою отношения ни к количеству инфицированных гепатоцитов, ни к репликации НСУ. Ведущими моментами в интерпретации этого феномена могут быть особенности биологии вируса гепатита С.

Структура и функция звездчатых клеток печени в онтогенезе. В

онтогенезе крыс Вистар происходит ремоделирование пространств Диссе - активация звездчатых клеток печени, превращение их из липоцитов, накапливающих витамин А, в фиброгенные клетки. В переходных звездчатых клетках при сохранении одиночных липидных капель увеличивался объем цитоплазмы, и активизировалась белоксинтезирующая функция с увеличением количества свободных рибосом, полисом и канальцев гранулярной цитоплазматической сети. Деградация липидных капель осуществлялась путем формирования аутофагосом.

В динамике онтогенеза у крыс Вистар в звездчатых клетках выявлены ультраструюурные стереологические маркеры индукции белоксинтези-рующей функции, обратно коррелирующие с выраженностью функции депонирования ретиноидов. Прогрессирующие дисфункции митохондрий гепатоцитов и более выраженная фиброгенная активность звездчатых клеток являются ключевыми факторами фиброза печени у крыс в возрасте 24 мес.

Стереологический анализ ультраструктурной организации звездчатых клеток печени крыс в онтогенезе продемонстрировал уменьшение поверхностной плотности липидных включений, имеющее достоверные отличия (р<0,05) в возрасте 24 мес: 4 мес - 396,8±11,6 м2/см3; 9 мес - 376,8±21,2; 12 мес - 286,3±13,5 и 24 мес - 243,3±12,7 м2/см3. Соответствующие четырем возрастным группам показатели поверхностной плотности профилей гранулярной цитоплазматической сети звездчатых клеток печени демонстрировали неуклонный рост: 28,1±4,3; 32,4±5,1; 38,9±6,2 и 52,7±4,9 м2/см3.

Таким образом, в динамике онтогенеза в звездчатых клетках печени выявлены ультраструктурные стереологические маркеры индукции белоксин-тезирующей функции, обратно коррелирующие с выраженностью функции депонирования ретиноидов. Это свидетельствует о том, что в динамике онтогенеза при снижении энергетического потенциала гепатоцитов у крыс в возрасте 24 мес синхронно индуцируется фиброгенная трансформация звездчатых клеток печени, обусловливающая инволютивные изменения и фиброзную трансформацию печени.

В онтогенезе у крыс Вистар звездчатые клетки печени в состоянии фиброгенной активации экспрессируют переходный, или смешанный, фенотип: уменьшение числа и последующее исчезновение липидных капель с синхронной сменой звездчатой формы на фибробластоподобную полигональную и увеличением размеров клетки с синхронной гиперплазией гранулярной цитоплазматической сети и увеличением числа митохондрий.

Прогрессирующая в онтогенезе дисфункция митохондрий гепатоцитов, ассоциированная с окислительным стрессом, и более выраженная фиброгенная активность звездчатых клеток являются ключевыми факторами фиброза печени.

Структурно-функциональная характеристика звездчатых клеток печени в динамике фиброза. При гепатите С на начальных стадиях фиброза (О, I) популяция звездчатых клеток печени отличалась выраженным полиморфизмом - варьировали размеры, форма, количество липидных капель и их тинкториальные свойства: обращали на себя внимание различия в осмиофильности липидосодержащего материала в разных клетках. Численная плотность звездчатых клеток, визуализируемых в препаратах по наличию цитоплазматических липидных капель, составляла 5,01±0,18 в единице поля зрения.

На стадиях фиброза II и III ультраструктура большинства звездчатых клеток приобретала так называемый смешанный, или переходный, фенотип - одновременное присутствие морфологических признаков и липидосодержащей, и фибробластоподобной клетки. В таких липоцитах ядра имели глубокие инвагинации нуклеолеммы, более крупное ядрышко, увеличенный объем цитоплазмы с липидными каплями. Одновременно резко возрастало количество митохондрий, свободных рибосом, полисом и канальцев гранулярной цито плазматической сети. Как правило, отмечался контакт липидных капель и митохондрий, свидетельствующий об «утилизации» липидов. Во многих клетках деградация липидных капель осуществлялась путем формирования аутофагосом, которые затем элиминировались. В некоторых случаях отмечалась гиперплазия звездчатых клеток смешанного фенотипа.

Матрикс-продуцирующие звездчатые клетки, наиболее многочисленные на стадии цирроза печени, характеризовались исчезновением липидных гранул, отростчатой фибробластоподобной формой, развитым белоксинтезирующим компартментом и формированием в цитоплазме фибриллярных структур; перицеллюлярно в пространствах Диссс локализовались многочисленные пучки коллагеновых фибрилл.

При прогрессировании НСУ-инфекции, сопровождавшимся внутри-дольковым перисинусоидальным фиброзом, отмечалась активация звездчатых клеток печени, превращение их из так называемых «пассивных», накапливающих витамин А, в клетки фиброгенные и пролиферирующие. Звездчатые клетки печени отличались выраженным полиморфизмом, варьировались их размеры, форма, количество липидных капель и тинкториальные свойства. На начальных стадиях фиброза численная плотность звездчатых клеток печени, визуализируемых по наличию цитоплазма-тических липидных капель, составляла 4,98±0,17 при НСУ-инфекции и 2,45±0,06 клеток - при НСУ+НВУ-инфекции (р<0,05).

На стадии трансформации в цирроз печени происходило значительное уменьшение численной плотности липидосодержащих звездчатых клеток, свидетельствующее об их фиброгеипой трансформации. Однако при сформированном циррозе печени в единичных случаях встречались участки паренхимы печени с перисинусоидальными липидосодержащи-ми звездчатыми клетками.

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1.5

0.5 0

F 0 -1

F II

F III

Рис. 6. Численная плотность липидосодержащих клеток Ито при различной выраженности перигепатоцеллюлярного фиброза.

Кроме того, в одном из биоптатов в перипортальной фиброзной ткани обнаружены многочисленные липоциты, что, вероятно, свидетельствует о важной роли звездчатых клеток в метаболизме ретиноидов в организме даже на стадии цирроза органа. Ультраструктурный анализ дополнил светомикроскопическую характеристику звездчатых клеток, в том числе, отмечены неравномерность в электронной плотности липидных гранул, иногда с формированием более электронно-плотного ободка по периферии, очаговая пролиферация и появление двуядерных липоцитов.

Степень выраженности перигепатоцеллюлярного фиброза при HCV-инфекции имела достоверную обратную корреляцию с численной плотностью липидосодержащих звездчатых клеток - их численная плотность на стадии фиброза III и при циррозе органа составляла 0,20 ± 0,03 в единице поля зрения, что достоверно меньше (р<0,05), чем на стадиях фиброза 0 -1 (4,98±0,17) и II (2,02 ± 0,04) (рис. 6).

Фиброгенная активность матрикс-продуцирующих клеток тестирована с помощью иммуногистохимического исследования по экспрессии гладкомышсчного а-актина. Продукты иммуногистохимической реакции различной интенсивности обнаруживались в цитоплазме активированных звездчатых клеток, локализующихся внутри печеночных долек. Особенно значительная экспрессия гладкомышечного а-актина отмечалась в цитоплазме фибробластов и миофибробластов портальных зон, гладкомышеч-ных клетках сосудов и миофибробласгах вокруг центральных вен.

В целом, фиброг енная активация звездчатых клеток включала следующие признаки: уменьшение числа и последующее исчезновение липидных капель, очаговую пролиферацию липоцитов, гиперплазию гранулярной цитоплазматической сети, экспрессию фибробластоиодобных белков, в том числе гладкомышечного а-актина, и формирование экстрацеллюлярных коллагеновых фибрилл.

Таким образом, при прогрессировании фиброза в условиях HCV-инфекции значимо уменьшалась численная плотность липидосодержащих звездчатых клеток, при этом часть популяции сохраняла гак

называемый «покоящийся» фенотип для осуществления метаболической функции.

Миофибробластоподобные звездчатые клетки печени в состоянии фиброгенной активации характеризовались следующими структурно-функциональными особенностями: уменьшением числа и последующим исчезновением липидных капель, гиперплазией гранулярной цитоплаз-маггической сети и митохондрий, очаговой пролиферацией, иммуноги-стохимической экспрессией фибробластоподобных белков, в том числе гладкомышечного а-актина, и формированием перицеллюлярных колла-геновых фибрилл в пространствах Диссе.

Эти данные свидетельствуют о том, что звездчатые клетки печени представляют собой не статичную, а динамичную популяцию, принимающую непосредственное участие в ремоделировании внутридолькового перигепатоцеллюлярного матрикса.

Анализ проведенных исследований позволил сделать вывод о том, что в структурных реакциях органов и тканей при хронических воспалительных процессах нередко отсутствуют классические признаки, которые позволили бы интерпретировать найденные изменения как воспалительные. Стали доминировать процессы, имеющие морфологический фенотип дистрофий, диффузный характер и тенденцию перехода в атрофию. Ультраструктурный анализ показал, что основу этой дистрофии составляет редукция белоксинтезирующих органелл, свидетельствующая о снижении регенераторных реакций, что подтверждено радиоавтографическим изучением синтеза ДНК и РНК.

Комплексное морфологическое изучение позволило выделить новую форму хронических заболеваний, названную первично дистрофической (Непомнящих Г.И., 1996). В соответствии с этим, среди хронических процессов выделены следующие морфогенетические варианты: первично дистрофические, первично воспалительные и смешанные. Решающим стимулом в подходе к этой дифференцировке явилось отсутствие в значительном числе исследованных биоптатов классических морфологических признаков хронических воспалительных процессов.

На основании морфологического анализа сформулированы основные признаки первично дистрофических процессов: поражение клеток имеет фенотип дистрофии, основа которой - не альтерация цитоплазматических органелл, а их недовоспроизводство; в финале - атрофия клеток и безнекротическая элиминация или десквамация; воспалительно-клеточная инфильтрация отсутствует или неадекватна имеющимся структурным изменениям; диффузный реактивный склероз стромы. В целом, структурные изменения имеют инволютивный, дегенеративно-дистрофический характер, напоминающий процесс старения, своеобразное старение на клеточном уровне.

В последние годы частота дистрофически-атрофических процессов в органах и тканях, особенно в слизистых оболочках различных локализа-

ций, значительно увеличилась. Вероятно, в современных условиях формируются качественно новые типы реакций, отражающие взаимодействие организма с различными неблагоприятными факторами внешней среды - химического (ксенобиотики), биологического (вирусы) и физического (вибрация, радиация) характера, оказывающими цитопатические действие на клетки паренхимы.

ВЫВОДЫ

1. При вибрационном и вирусном воздействиях в результате эндотели-ально-стромально-паренхиматозных взаимодействий развиваются скор-релированные изменения ультраструюуры гепатоцитов, эндотелиоцитов синусоидов и звездчатых клеток печени. К ведущим ультраструктурным изменениям гепатоцитов и эндотелиоцитов относятся редукция белок-синтезирующих органелл, частичная деструкция митохондриального компаргмента, усиление аутофагических процессов. Снижение белоксин-тезирующей и энергетической функций гепатоцитов и угнетение транссинусоидального обмена сопровождаются фиброгенной трансформацией звездчатых клеток, увеличением количества коллагеновых волокон в пространствах Диссе, развитием перицеллюлярного фиброза.

2. Воздействие вибрации в эксперименте сопровождается острым нарушением гемодинамики, преимущественно микроциркуляторного русла. Синхронно с сосудистой дисфункцией развивается дистрофия паренхиматозных клеток печени, нарастающая с увеличением длительности воздействия. В восстановительном периоде (через 30 суток после воздействия вибрации) отмечается положительная динамика - реорганизация микроциркуляторного русла и восстановление структуры клеточных популяций. К концу эксперимента в клетках хорошо развита гранулярная и гладкая цитоплазматическая сеть, формируются многочисленные митохондрии.

3. Основу структурных изменений печени при производственной вибрации составляют прогрессирующая тотальная дистрофия, последующая атрофия паренхиматозных клеток, диффузный фиброз стромы, ранние системные изменения микрососудов с атрофией и дисфункцией эндотелиоцитов. В печени развивается коллапс синусоидов, сопровождающийся фиброгенной трансформацией звездчатых клеток, диффузной атрофией гепатоцитов и коллагенизацией пространств Диссе.

4. Тканевая пространственная организация печени при воздействии производственной вибрации имеет особенности в сравнении с вирусными воздействиями. При вибрационном воздействии наблюдается высокая объемная плотность гепатоцитов с «опустошенной» цитоплазмой при уменьшении количества двуядерных гепатоцитов по сравнению с данными показателями при гепатите С, что свидетельствует о снижении регенераторного потенциала паренхимы печени. РНК-содержащий вирус

гепатита С повреждает преимущественно цитоплазматические органеллы при сохранении ядерного компартмента.

5. Степень активности HCV-инфекции не ассоциирована непосредственно с выраженностью репликации вируса - наличие РНК вируса гепатита С в образцах крови и/или ткани печени (по данным ПЦР) и число инфицированных гепатоцитов (по экспрессии NS3Ag HCV) не имеет достоверной связи со степенью активности инфекционного процесса, оцениваемой по структурным изменениям печени и клинико-биохими-ческим тестам. При достаточно высоком уровне виремии (от 106 до 108 копий РНК HCV в 1 мл плазмы) доминируют минимальные изменения структуры печени; в 60% случаев (г=0,631, р <0,01) определяется слабо выраженная степень активности HCV-инфекции.

6. При сравнительном стереологическом исследовании паренхиматозных клеток печени при HCV-инфекции большинство цито плазматических органелл гепатоцитов имеют равные показатели структурной плотности независимо от степени активности инфекционного процесса. HCV-инфекция ассоциирована с тенденцией к увеличению объемной плотности липидных включений. Высокая степень активности HCV-инфекции обусловливает меньшую выраженность «опустошения» гепатоцитов за счет большей структурной плотности белоксинтезирующих органелл.

7. Ультраструктурные маркеры гепатотоксического (опийного) воздействия - макровезикулярная липидная инфильтрация гепатоцитов, ин-трагепатоцеллюлярный холестаз, центролобулярные некрозы, присутствие эозинофилов в клеточных инфильтратах и центральный (метаболический) и перисинусоидальный фиброз. Внутриклеточная перестройка гепатоцитов заключается также в гиперплазии агранулярной цитоплазматической сети, ассоциированной с редукцией белоксинтезирующих органелл, а также деструкцией и компенсаторной гиперплазией митохондриального компартмента.

8. В онтогенезе крыс Вистар центральным событием ремоделирования пространств Диссе является появление в них активированных звездчатых клеток, превращение их из липоцитов, накапливающих витамин А, в фиброгенные клетки. В динамике онтогенеза у крыс Вистар в звездчатых клетках выявляются ультраструктурные стереологические маркеры индукции белоксинтезирующей функции, обратно коррелирующие с выраженностью функции депонирования ретиноидов. Прогрессирующая дисфункция митохондрий гепатоцитов и более выраженная фиброгенная активность звездчатых клеток являются ключевыми факторами развития фиброза печени у крыс в возрасте 24 мес.

9. Структурная характеристика звездчатых клеток печени в динамике фиброза при HCV-инфекции включает в себя следующие признаки: уменьшение числа и последующее исчезновение липидных капель, очаговую гиперплазию липоцитов, гиперплазию гранулярной цитоплазматической сети, экспрессию фибробластоподобных характеристик, в том

числе гладкомышечного а-акгина, и формирование экстрацеллюлярных коллагеновых фибрилл. Степень выраженности перигепатоцеллюлярного фиброза при HCV-инфекции, по данным морфометрического анализа, имела достоверную обратную корреляцию с численной плотностью липи-досодержащих звездчатых клеток - на стадии фиброза III и при циррозе органа она составляла 0,20±0,03 в единице поля зрения, что достоверно меньше (р<0,05), чем на стадиях фиброза 0 - I (5,01±0,18) и II (2,02 ± 0,04). Компенсаторной реакцией является резорбция гепатоцитами экс-трацеллюлярного матрикса в пространстве Диссе - феномен экспрессии макрофагальных свойств гепатоцитов.

10. На основании комплексного структурного анализа клеточные и внутриклеточные реакции печени при вибрационном и вирусном воздействии (атрофия паренхиматозных клеток, фиброз, системные изменения микрососудов с атрофией и дисфункцией эндотелия при отсутствии воспалительной реакции) отнесены к дистрофическим процессам (ге-патопатии). При вибрационном воздействии ведущую роль играет системное поражение сосудов микроциркуляторного русла - вибрационная микроангиопатия, составляющая морфологическую основу структурных изменений печени.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты исследования биоптаггов печени показали, что, несмотря на прогрессирующее уменьшение числа липидосодержащих звездчатых клеток при развитии фиброза, в фиброзных септах и внутри долек сохраняются липидосодержащие звездчатые клетки печени с широким спектром функциональной активности, что необходимо учитывать в оценке прогноза развития фиброза и цирроза печени.

2. Использованные в работе морфологические маркеры токсического поражения (ультраструктурные модификации митохондриального компар-тмента) целесообразно использовать при исследовании эффективности антитоксической терапии.

3. Результаты исследования показали, что при вибрационном воздействии ведущую роль играет системное поражение сосудов микроциркуляторного русла. Пациенты с вибрационной микроангиопатией должны систематически обследоваться в специализированных учреждениях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Непомнящих Д.Л., Постникова O.A., Мигуськина Е.И. Патоморфо-логическое исследование хронических гепатитов по биопсиям печени // Актуальные вопросы современной медицины: Тезисы докладов 8-й научно-практической конференции врачей. - Новосибирск, 1998. - С. 407 - 408.

2. Непомнящих Д.Л., Мезенцева Г.А., Сасин A.B., Айдагулова C.B., Нохрина Ж.В., Постникова O.A., Долговых А.К. Роль биопсии печени в диагностике хронических вирусных гепатитов // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине: Материалы научно-практической конференции. - Новосибирск, 2000. - С. 87 - 88.

3. Непомнящих Г.И., Непомнящих Л.М., Айдагулова C.B., Постникова O.A. Ультраструюура гепатоцитов при действии вирусов гепатита В и С // Материалы VI Всероссийской конференции «Патология клетки». -Москва, 2000. - С. 205.

4. Непомнящих Д.Л., Айдагулова C.B., Мигуськина Е.И., Сасин A.B., Мезенцева Г.А., Постникова O.A., Нохрина Ж.В., Бабошкина Ю.В. Особенности структурных реакций печени при хронических вирусных гепатитах у опий-зависимых пациентов // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине: Материалы научно-практической конференции ГНОКБ. - Новосибирск, 2001. - С. 279.

5. Непомнящих Г.И., Айдагулова C.B., Непомнящих Д.Л., Капустина В.И., Постникова O.A. Ультраструюурное и иммуногистохимическое исследование звездчатых клеток печени в динамике фиброза и цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 142, № 12. - С. 681 - 686.

6. Nepomnyashchikh G.I., Aidagulova S.V., Nepomnyashchikh D.L., KapustinaV.I., PosüiikovaO.A. Ultrastructural and immunohistochemical study of hepatic stellate cells over the course of infectious viral fibrosis and cirrhosis of the liver // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2006. - Vol. 142,№6.-P. 723-728.

7. Непомнящих Г.И., Трубникова H.B., Волкова Д.В., Постникова O.A., Кожевникова O.B. Морфологические особенности эпителия бронхов при бронхиальной астме, ассоциированной с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. -2006.-№20.-С. 26-27.

8. Непомнящих Д.Л., Виноградова Е.В., Постникова O.A., Капустина В.И. Клинические и патоморфологические особенности цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. - 2006. - № 20. - С. 28 - 31.

9. Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Постникова O.A., Понамар-чук О.И. Клинико-морфологический анализ микст-гепатита С+В при серонегативном варианте HCV-инфекции // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2006. - Т. 16, № 5. Приложение № 28. Материалы 12-й Российской гастроэнтерологической недели. - С. 84.

10. Непомнящих Д.Л., Бурковская В.А., Айдагулова C.B., Бакарев М.А., Постникова O.A., Капустина В.И., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Структурные модификации эпителия гастроэнтеральной системы при иммунозависимом гранулематозе // Бюллетень эксперимен-

тальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 150, № 10. - С. 467 - 471.

11. Nepomnyashchikh D.L., Burkovskaya V.A., Aidagulova S.V., Bakarev M.A., Postnikova O.A., Kapustina V.l., Nohrina Zh.V., Vinogradova E.V. Structural Modification of the Gastrointestinal Epithelium during Immune-Dependent Granulomatosis// Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2011. - Vol. 150, № 4. - P. 490 - 494.

12. Непомнящих Г.И., Айдагулова C.B., Бакарев М.А., Постникова O.A., Непомнящих Д.Л. Роль биопсии печени в исследовании хронического гепатита С // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. - 2011. - № 2-3. Материалы 13-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2011». - С. М64.

13. Непомнящих Д.Л., Вавилин В.А., Айдагулова C.B., Макарова С.И., Караваева Ю.Ю., Щепотина Е.Г., Постникова O.A. Полиморфизм цитохрома Р450 2D6 - молекулярно-генетический маркер прогрессиро-вания цирроза печени // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - Т. 152, № И. - С. 568 - 571.

14. Постникова O.A., Непомнящих Д.Л., Айдагулова C.B., Виноградова Е.В., Капустина В.И., Нохрина Ж.В. Структурно-функциональная характеристика звездчатых клеток печени в динамике фиброза // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 10. - С. 359 - 362.

15. Айдагулова C.B., Непомнящих Д JL, Постникова O.A., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Хронический микст-гепаггит С+В: Клинические варианты // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 10. - С. 457 - 461.

16. Вавилин В.А., Непомнящих Д.Л., Макарова С.И., Айдагулова C.B., Караваева Ю.Ю., Щепотина Е.Г., Постникова O.A., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Ляхович В.В. Молекулярно-генетический маркер про-грессирования цирроза печени - полиморфизм цитохрома Р450 2D6 // Сибирский научный вестник. - 2011. - Вып. XV. - С. 17 - 20.

17. Непомнящих Г.И., Домникова Н.П., Бакарев М.А., Постникова O.A. Структурный анализ печени при острых лейкозах и лимфопроли-феративных заболеваниях // Сибирский научный вестник. - 2011. - Вып. XV.-С. 49-53.

18. Постникова O.A., Айдагулова C.B., Непомнящих Д. Л..Виноградова Е.В., Караваева Ю.Ю., Нохрина Ж.В. Комплексное патоморфологическое, электронно-микроскопическое и стереологическое исследование биопта-тов печени при хронической микст-инфекции HCV+HBV // Сибирский научный вестник. - 2011. - Вып. XV. - С. 70 - 73.

19. Постникова O.A., Айдагулова C.B., Капустина В.И. Ультраструктурный и стереологический анализ звездчатых клеток печени в онтогенезе // Сибирский научный вестник. - 2011. - Вып. XV. - С. 74 - 77.

20. Капустина В.И., Постникова O.A., Айдагулова C.B. Электронно-микроскопический и стереологический анализ популяции звездчатых клеток в онтогенезе // Фундаментальные исследования. - 2011. - № И.-С. 170-173.

21. Постникова O.A., Айдагулова C.B., Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Караваева Ю.Ю. Ультраструктурное и стереологи-ческое исследование печени при хронической микст-инфекции HCV+HBV // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2011. - Т. 152,№ 12.-С. 713-716.

22. Непомнящих Д.Л., Постникова O.A., Боброва C.B., Айдагулова C.B. Вибрационная гепато- и гастропатия: клинико-морфологическое и стереологическое исследование // Сибирский медицинский журнал. -

2011. - Т. 26, № 4. - С. 152 - 155.

23. Непомнящих Г.И., Постникова O.A., Домникова Н.П., Бакарев М.А. Морфологический анализ патологии печени при острых лейкозах и лимфопролиферативных заболеваниях// Сибирский онкологический журнал. - 2012. - Т. 49, № 1. - С. 26 - 30.

24. Постникова O.A., Непомнящих Д.Л., Бакарев М.А., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В., Айдагулова C.B., Савченко С.А. Хронический вирусный гепатит в сочетании с описторхозом: Патоморфологическое исследование // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - Т. 27, №

1. - С. 119 - 122.

25. Непомнящих Г.И., Айдагулова C.B., Постникова O.A., Непомнящих Д.Л., Нохрина Ж.В., Виноградова Е.В. Морфогенез хронического гепатита С и цирроза печени инфекционно-вирусного генеза // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. - 2012. - №

2.-С. 13-21.

26. Непомнящих Г.И., Постникова O.A., Непомнящих Д.Л., Айдагулова C.B. Перспективы исследования полиморфизма цитохрома Р450 2D6 как молекулярно-генетического маркера прогрессирования цирроза печени // Росийский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2012. - Т. 22, № 2. Приложение № 39. Материалы XVII Ежегодного Российского конгресса «Гепатология сегодня». - С. 58.

27. Nepomnyashchikh D.L., Vavilin V.A., Aidagulova S.V., Makarova S.I., Karavaeva Yu.Yu., Shchepotina E.G., Postnikova O.A. Cytochrome P450 2D6 polymorphism is a molecular marker of liver cirrhosis progression // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - Vol. 152, № 5.-P. 633 - 636.

28. Postnikova O.A., Aidagulova S.V., Nepomnyashchikh D.L., Nohrina Zh.V., Vinogradova E.V., Karavaeva Yu.Yu. Ultrastructural and stereological study of the liver in chronic mixed HCV+HBV infection // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - Vol. 152, № 6. - P. 764 - 767.

29. Постникова O.A., Непомнящих Г.И., Айдагулова C.B., Капустина В.И., Непомнящих Д.Л. Структурно-функциональная характеристика звездчатых клеток печени в динамике фиброза // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск,

2012.-С. 234-235.

30. Непомнящих Д.Л., Постникова O.A., Айдагулова C.B., Караваева Ю.Ю., Виноградова Е.В., Нохрина Ж.В., Савченко С.А. Универсальные структурные маркеры лекарственно-индуцированного поражения печени // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2012. - С. 364 - 366.

31. Непомнящих Г.И., Вавилин В.А., Караваева Ю.Ю., Постникова O.A., Непомнящих Д.Л. Роль полиморфизма генов цитохрома Р450 2D6 в развитии фиброза и цирроза печени // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. -2012. -№ 2-3. Материалы 14-го Международного СлавяноБалтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2012». - С. М65.

32. Непомнящих Г.И., Мезенцева Г.А., Постникова O.A., Русинова С.Г. Структурные изменения эпителиоцитов при карциномах желудка // Фундаментальные исследования. - 2012. - № S (1). - С. 91 - 95.

33. Непомнящих Г.И., Постникова O.A., Бакарев М.А., Непомнящих Д.Л., Капустина В.И. Структурно-функциональные особенности липидо-содержащих гепатоцитов при гепатите С // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, № 5. - С. 751 - 754.

34. Постникова O.A., Непомнящих Г.И., Юданов A.B., Непомнящих Д.Л., Капустина В.И. Внутриклеточный холестаз в условиях HCV- и HBV-инфекции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, № 6. - С. 881 - 885.

35. Nepomnyashchikh G.I., PostnikovaO.A., Bakarev M.A., Nepomnyash-chikh D.L., Kapustina V.l. Structural and Functional features of Lipid-Containing Hepatocytes in Hepatitis С // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - VoL 153, № 5. - P. 787 - 790.

36. Postnikova O.A., Nepomnyashchikh G.I., Yudanov A.V., Nepomnyashchikh D.L., Kapustina V.l. Intracellular Cholestasis in HCV and HBV infection // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - Vol. 153, № 6.-P. 899 - 902.

Соискатель

O.A. Постникова

Подписано в печать 09.11.2012.Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл.печ.л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 8.

Отпечатано в типо1рафии ОАО «НИИсистем» Новосибирск-58, ул. Русская, 39, т. 306-67-39

2012251942

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Постникова, Ольга Алексеевна, Новосибирск

ФГБУ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОМОРФОЛОГИИ СО РАМН

ГБОУ ВПО НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ МЗ РФ

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

На правах рукописи

05201350533

ПОСТНИКОВА Ольга Алексеевна

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор И.О. Маринкин

Новосибирск - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. СОВРЕМЕННЫЕ КОНЦЕПЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНО-СИНУСОИДАЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ОБЩЕБИОЛОГИЧЕСКИХ И

ОБЩЕПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ .............................. 18

1.1. Эндотелиально-синусоидальная композиция в развитии общебиологических и общепатологических процессов.............. 19

1.2. Полиморфизм звездчатых клеток печени и их роль

в фиброгенезе и онтогенезе............................................................ 26

1.3. Стереотипность дистрофически-атрофических реакций паренхиматозных клеток в условиях различных повреждающих воздействий.......................................................... 32

1.4. Морфогенез вибрационно-индуцированных изменений ............ 36

1.5. Структурно-функциональные особенности клеточных популяций печени при НСУ-инфекции ........................................ 42

1.6. Резюме ........................................................................................47

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава II. ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАННОГО МАТЕРИАЛА

И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................................... 50

2.1. Характеристика экспериментальных моделей ............................. 50

2.2. Характеристика клинических моделей ......................................... 52

2.3. Методы светооптического, электронно-микроскопического

и иммуногистохимического исследования................................... 53

2.4. Морфометрический, стереологический анализ

и радиоавтографическое исследование......................................... 55

2.5. Метод полимеразной цепной реакции и генотипирование......... 56

Глава III. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС ВИСТАР ПРИ ВИБРАЦИОННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ............................... 57

3.1. Светооптическая и ультраструктурная характеристика клеточных популяций и микрососудов печени при 30-суточном воздействии вибрационного фактора ..................... 57

3.2. Светооптический и ультраструктурный анализ клеточных популяций и микрососудов печени в восстановительный период после вибрационного воздействия ...................................60

3.3. Характеристика перекисного окисления липидов

и функциональных свойств эритроцитов, тромбоцитов и эндотелиоцитов в восстановительном периоде......................... 62

3.4. Р е з ю м е ..........................................................................................65

Глава IV. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ

ПЕЧЕНИ В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ ВИБРАЦИИ.......................................65

4.1. Светооптический и ультраструктурный анализ печени при длительном воздействии вибрационного фактора ...................... 66

4.2. Стереологический анализ тканевой пространственной организации печени при длительном вибрационном воздействии в сравнении с гепатитами С и С+В..........................69

4.3. Резюме .........................................................................................74

Глава V. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЖЕЛУДКА ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ ВИБРАЦИИ...........................................75

5.1. Светооптическое, ультраструктурное и радиоавтографическое исследование фундального и пилорического отделов желудка ...77

5.2. Стереологический анализ тканевой организации слизистой оболочки желудка (сравнение вибрационного воздействия, вирусного гепатита и гастропатии) ............................................... 95

5.3. Резюме .......................................................................................... 98

Глава VI. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ПЕЧЕНИ В УСЛОВИЯХ ПЕРСИСТИРУЮЩЕЙ НСУ-ИНФЕКЦИИ .............................. 98

6.1. Морфогенез НСУ-инфекции.......................................................... 99

6.2. Репликация вируса гепатита С и степень активности НСУ-инфекции .............................................................................. 113

6.3. Выявление РНК НСУ в различных биологических

субстратах ...................................................................................... 116

6.4. Иммуногистохимическое исследование биоптатов печени

и генотипирование при НСУ-инфекции ..................................... 117

6.5. Резюме ........................................................................................ 120

Глава VII. СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ ЗВЕЗДЧАТЫХ КЛЕТОК

ПЕЧЕНИ В ОНТОГЕНЕЗЕ....................................................... 121

7.1. Светооптический и ультраструктурный анализ звездчатых клеток печени в динамике онтогенеза крыс Вистар.................. 122

7.2. Стерео логический анализ звездчатых клеток печени

в онтогенезе.................................................................................... 130

7.3. Резюме ...................................................................................... 133

Глава VIII. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗВЕЗДЧАТЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ В ДИНАМИКЕ ФИБРОЗА ................................................................................... 133

8.1. Светооптическая и ультраструктурная характеристика звездчатых клеток печени в динамике фиброза........................ 134

8.2. Иммуногистохимическое, морфометрическое и стереологическое исследование печени в динамике фиброза .... 146

8.3. Резюме ........................................................................................ 148

Глава IX. ЭНДОТЕЛИАЛЬНО-ПАРЕНХИМАТОЗНЫЕ

РЕАКЦИИ ПРИ ВИБРАЦИОННОМ И ВИРУСНОМ ВОЗДЕЙСТВИЯХ И ИХ РОЛЬ В МОРФОГЕНЕЗЕ ОБЩЕПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ........................ 152

ВЫВОДЫ ...........................................................................................................160

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................................163

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................. 164

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Гепатоциты представляют собой огромную клеточную систему, специализированную на выполнение многообразных метаболических и биосинтетических функций. Несмотря на то, что ткань печени на первый взгляд выглядит мономорфной, она гетерогенна с точки зрения и структуры, и функции (Герок В., Блюм Х.Е., 2009). Эта гетерогенность обусловлена кровоснабжением дольки: клетки, локализующиеся в перипор-тальной зоне, отличаются от клеток перивенулярной зоны по набору ключевых ферментов, рецепторов и субклеточных структур и в связи с этим имеют различные функциональные способности (Kmiec Z., 2001). В большинстве случаев мозаичность повреждений связана с метаболической гетерогенностью гепатоцитов.

Изменения гепатоцитов, интерпретируемые как дистрофические, могут отражать как повреждение их структур и нарушение функции, так, и наоборот, интенсивную функцию клеток, их повышенную метаболическую активность. Особенно наглядно это положение подтверждается при использовании электронно-микроскопической радиоавтографии, что позволяет не только видеть изменения ультраструктуры клетки, но одновременно оценивать ее функциональное состояние. Д.С.Саркисовым (1993) показано, что даже при выраженной жировой дистрофии гепатоцита сохраняется достаточно высокий уровень биосинтетических реакций в ядерном и цитоплазматическом компартментах.

Печень относится к органам, физиологическая и репаративная регенерация которых выражается примерно в одинаковой степени одновременно в двух формах - клеточной и внутриклеточной, т.е. осуществляется как путем увеличения числа клеток, так и гиперплазии ультраструктур в сохранившихся клетках (Court F.G. et al., 2002). Один из важнейших выводов, который можно сделать по регенерации гепатоцитов, состоит в том, что пролифера-тивная активность зрелых гепатоцитов достаточна для репопуляции печени после парциальной гепатоэктомии. Резервный компартмент стволовых клеток печени активизируется для пролиферации и дифференцировки только в очень специфических условиях, когда пролиферация зрелых гепатоцитов ограничена или заблокирована (Fausto N., 1991; Forbes S., 2002).

Взаимодействия паренхиматозных клеток различных органов и эндоте-лиоцитов микроциркуляторного русла являются составной частью паренхи-матозно-стромальных взаимоотношений и играют важную роль в развитии физиологических и патологических процессов. Особая актуальность изучения взаимодействий паренхимы и стромы, в том числе элементов микроциркуляторного русла, связана с индукцией и прогрессией опухолевого роста (ТЫегу 1.Р., 2002). При изучении метастазирования опухолей молочной железы продемонстрировано явление эпителиально-мезенхимной трансформации, которую рассматривают в качестве одного из механизмов ремоделирования тканей, осуществляемого в критических фазах эмбрионального развития у многих видов животных (ТотаБкоук-Сгоок Е. е1 а1., 2009). Кроме того, запуск механизма эпителиально-мезенхимной трансформации может иметь место и в других патологических процессах, таких как фиброз (виаппо М. е1 а1., 2009; РаЬпэ Ь., З^аггаЬоБсо М., 2011). Эти данные заставляют по-новому видеть проблему дифференцировки дефинитивных клеточных форм (Гаршин В.Г., 1939; Заварзин А.А., 1947).

В этом аспекте известна пластичность эндотелиальных клеток сосудов, являющихся активными участниками ряда ключевых физиологических функций,, в том числе транспорта кислорода и питательных веществ к тканям (Ра1е1-Неи Б., Б'Ашоге Р.А., 2011). Среди других важных функций эндоте-лиоцитов - регуляция тонуса сосудистой стенки и процессов свертывания крови, участие в ангиогенезе и воспалении, что имеет фундаментальное значение в развитии широкого спектра адаптивных и патологических процессов (ВесН Б. е1 а1., 2008).

Влияние эндотелия на окружающие ткани реализуется различными путями: эндотелиальные клетки синтезируют компоненты соединительной ткани и способны регулировать синтез этих компонентов другими клетками, с помощью эндотелия осуществляется регуляция тонуса гладкомышечных клеток и, следовательно, показателей кровотока. Эндотелиальные клетки синтезируют компоненты собственной базальной мембраны, в том числе, фиброн-ектин, коллагены, ламинин, эластин и гликозаминогликаны, экспонирующиеся на люминальной поверхности и в экстрацеллюлярном матриксе (Вгапёао Б.Р. ег а1., 2006).

Эндотелиоцитам свойственны тканевая специализация и тканеспеци-

фичный полиморфизм, что определяет наличие нескольких дефинитивных форм структурной организации капилляров: соматических с непрерывной эндотелиальной выстилкой, фенестрированных и синусоидных (Braet F. et al., 2009; Jacobs F. et al., 2009; March S. et al., 2009; Cogger V.C. et al., 2010; Kawasaki T. et al., 2010; Xie G. et al., 2012; Yokomori H. et al., 2012).

Физиологические и патологические вариации функционирования тканей и органов обусловлены высокой пластичностью сосудистой системы и особенно ее микроциркуляторного русла. Эндотелий и адвентиция обладают выраженной способностью к регенерации, являясь «депо» полипотентных камбиальных клеточных элементов стромы (Саркисов Д.С., 1980).

По данным электронно-микроскопической радиоавтографии, мельчайшие сосуды являются элементарными структурно-функциональными единицами соединительной ткани, о чем свидетельствуют наивысшая пролифера-тивная и метаболическая активность перикапиллярных клеток и градиент уменьшения этой активности по мере удаления от сосудистой стенки (Саркисов Д.С., 1993; Колокольчикова Е.Г. и др., 1997).

Звездчатые клетки печени («липоциты», клетки Ито, жиронакаплива-ющие клетки печени) локализуются в пространствах Диссе между гепатоци-тами и эндотелиальной выстилкой синусоидов и играют ведущую роль в регуляции гомеостаза ретиноидов, депонируя до 80% витамина A (Balabaud С. et al., 2004; Geerts А., 2004; Ryder S.D., 2004; Senoo H. et al., 2010). Пространство Диссе является зоной наибольшей функциональной ответственности, обеспечивая транссинусоидальный обмен (Balabaud С. et al., 2004; Senoo H., 2004).

Reyes G. et al., 2007; Friedman S.L., 2008). Фиброз на уровне центральных вен, синусоидов или портальных сосудов лимитирует нормальную гемодинамику печени, что приводит к уменьшению объема метаболически эффективной паренхимы, в дальнейшем - портальной гипертензии и порто-системному шунтированию. Накопление соединительной ткани в пространствах Диссе нарушает нормальный метаболический обмен между кровью и гепатоцитами, препятствуя клиренсу циркулирующих макромолекул, изменяя межклеточные взаимодействия и приводя к дисфункции клеток печени (Brandao D.F. et al., 2006; Lee Y., Friedman S.L., 2011).

Существуют противоречивые мнения относительно того, способны ли активированные звездчатые клетки возвращаться к покоящемуся фенотипу. Получены данные о том, что фиброгенные звездчатые клетки печени могут частично нивелировать процесс активации, например, при воздействии рети-ноидов или при взаимодействии с компонентами экстрацеллюлярного матрик-са (Kisseleva Т., Brenner D.A., 2007). Решение этого вопроса лежит в основе проблемы обратимости фиброза и разработки терапевтических подходов к лечению цирроза печени (Desmet V.J. et al., 2004; Schuppan D., Afdhal N.H., 2008).

Исследования висцеральных органов при вибрационном воздействии единичны и касаются, как правило, лишь экспериментальных моделей, несмотря на то, что полиорганные изменения развиваются вследствие системного поражения микроциркуляторного русла с последующей дисфункцией внутренних органов. В условиях профессиональной вибрации важное место занимает печень как основной метаболический и детоксикационный орган, а также желудок как полый орган, особенно чувствительный к вибрационному

воздействию (Сухаревская Т.М. и др., 2000; Измеров Н.Ф. и др., 2004).

В оценке структурных изменений органов большое значение имеют межорганные взаимодействия, отражающие системность заболеваний (Крылов A.A., 2000; Апросина З.Г. и др., 2002; Плешко Р.И. и др. 2006; Непомнящих Д.Л. и др. 2010). В этом контексте нами продолжено изучение гепато-гастральных отношений, единство которых обеспечивается принадлежностью к пищеварительной системе.

Цель исследования - изучить ультраструктурные основы межклеточных взаимодействий основных популяций печени при вибрационном и вирусном воздействиях для разработки концепции эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий как основе альтеративных и репаративных процессов.

Задачи исследования:

5. Изучить особенности морфогенеза эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий в печени при воздействии вибрационного и вирусного факторов.

Научная новизна. Впервые на основе сравнительного изучения характера эндотелиально-стромально-паренхиматозных взаимодействий факторов установлены основные этапы структурно-функциональной перестройки печени при вибрационном и вирусном воздействиях. Представлены основные варианты внутриклеточной реорганизации гепатоцитов эндотелиоцитов и звездчатых клеток печени при реализации физиологических и патологиче-

ских процессов.

Установлено, что к ведущим ультраструктурным изменениям гепато-цитов и эндотелиоцитов относятся редукцией белоксинтезирующих орга-нелл, частичная деструкция митохондриального компартмента, усиление аутофагических процессов. Показано, что сн�

Информация о работе

Постникова, Ольга Алексеевна
доктора биологических наук
Новосибирск, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Структурный анализ взаимодействий гепатоцитов, эндотелиоцитов и звездчатых клеток печени при вибрационном и вирусном воздействиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Структурный анализ взаимодействий гепатоцитов, эндотелиоцитов и звездчатых клеток печени при вибрационном и вирусном воздействиях - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы