Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние куркумина и глиотоксина на звездчатые клетки печени и портальные фибробласты крыс in vitro

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние куркумина и глиотоксина на звездчатые клетки печени и портальные фибробласты крыс in vitro"

На правах рукописи

Миянович Оля

Влияние куркумина и глиотоксина на звездчатые клетки печени и портальные фибробласты крыс in vitro

03.01.04-Биохимия 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ИЮН 2014

Казань-2014

005549798

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный

университет»

Научный доктор биологических наук, доцент

руководитель: Ризванов Альберт Анатольевич

Научный доктор медицинских наук,профессор

консультант: Киясов Андрей Павлович

Официальные Коксин Владимир Петрович,

оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ГАУЗ ВПО «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и ИЗ Минздрава РТ», и.о. зав. лабораторией биохимии; ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Минздрава России, старший преподаватель (г. Казань)

Шевлюк Николай Николаевич,

доктор биологических наук, профессор кафедры гистологии, ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия Минздрава РФ» (г.Оренбург)

Ведущая Государственное бюджетное образовательное учреждение

организация: высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «26» июня 2014г. в 11.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008 г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, ауд.211. Телефон: 7(843)23-37-842

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д.35.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжркий) федеральный университет» www.kpfu.ru Автореферат разослан «(Ь» 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

АбрамоваЗ.И

ОЬЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Хронические заболевания печени, в результате которых развивается цирроз, занимают восьмое место в причинах смертности взрослого населения в мире (Martin, et. al // Hepatology. 2014.V.59; Parola, etal. // FibrogenesisTissueRepair. 2009. V.2). В связи с этим, огромное значение имеют исследования молекулярных механизмов активации и ингибирования профиброгенного потенциала паренхиматозных и непаренхиматозных клеток печени, связей биохимических внутриклеточных процессов с деятельностью отдельных популяций клеток печени. Подобные исследования позволяют выяснить причины развития фиброза и цирроза печени и изыскать новые пути их эффективного лечения. Единственным эффективным методом лечения цирроза печени на данный момент является трансплантация донорского органа печени, но многие аспекты функционирования печени в этих условиях с биохимической и клеточной точки зрения изучены недостаточно. Именно поэтому ведутся активные поиски новых биологически активных веществ, а также проводится исследование физиологического действия уже известных лекарственных средств с целью расширения их показаний и возможностей применения в медицине, что позволит предотвратить развитие, замедлить и обратить вспять фиброз печени. Перспективными подходами представляются применение клеточной терапии стволовыми и прогениторными клетками, генная терапия, одновременно ведутся поиски новых химических соединений, оказывающих влияние на процессы образования внеклеточного матрикса (ВКМ) в печени (DeLeve, 2013 // J. Clin. Invest. 2013. Vol.5.; Isao Oakazaki, Extracellular Matrix and the Liver // book auth. 2003). Доклинические исследования различных препаратов и методов лечения включают эксперименты invilro на культурах клеток. Однако, до сих пор не установлены клеточные типы, обладающие профиброгенным потенциалом и участвующие в развитии фиброза в печени (Bataller, etal // J. Clin. Invest. 2005.Vol. 2.; Diehl, et al // Journal of Clinical Investigaron. 2013. Vol. 5; Yin, et. al // Journal of Clinical Investigaron. 2013. Vol. 5). Недоконцавыясненнымиостаютсясигнальныепутиикаскады, запускающиесинтезкомпонентовВКМвответственныхклетках (Iredale, et. al // Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 2013. Vol.7). Исследование клеточных основ процессов фиброзирования-дефиброзирования в печени и молекулярных основ активации и ингибирования этого процесса может помочь в создании принципиально

новых подходов в лечении хронических гепатитов и их грозных осложнения фиброза и цирроза органа. Одним из перспективных подходов для успешного лечения заболеваний печени является применение биологических веществ, проявляющих антифиброзную активность. Примерами таких веществ являются куркумин и глиотоксин (Dai, etal // Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 2013. Vol. 6; Qiu, et al // Eur J Pharmacol. 2014. Vol. 728; Tian, et al., // Molecular Medicine Reports. 2014. Vol. 9)

Цель работы: Характеристика молекулярно-биохимических механизмов диференцировки, морфогенеза и апоптоза invitro клеток печени с фиброгенным потенциалом в ответ на воздействие куркумина, глиотоксина, инсулина и TNF-a.

В соответствии с поставленной целью решали следующие задачи:

1. Получить культуры звездчатых клеток печени и портальных фибробластов методом эксплантации и ферментативной обработки из фрагментов печени и крупных портальных трактов здоровых четырёхдневных новорожденных крыс Rattusnorvegicus.

2. Провести иммунофенотипический анализ полученных культур клеток и исследовать их способность к дифференцировке и трансдифференцировке invitro.

3. Определить влияние биологически активных веществ: куркумина, глиотоксина, инсулина и TNF-a, на биохимические показатели культур звездчатых клеток печени и портальных фибробластов, в том числе и на пролиферацию, апоптоз и биосинтез компонентов цитоскелета.

Научная новизна работы

Получены приоритетные данные по дозозависимому влиянию куркумина, глиотоксина, инсулина и TNF-a на биосинтез компонентов цитоскелета звездчатыми клетками печени и портальными фибробластами, а также их пролиферацию и апоптоз. Несомненной новизной обладают данные по влиянию куркумина, глиотоксина, инсулина и TNF-a на культуры клеток портальных фибробластов из крупных портальных трактов по сравнению со звездчатыми клетками печени. Впервые проведено сравнение двух методов (эксплантация и ферментативная обработка) получения культур звездчатых клеток печени и портальных фибробластов из эксплантов печени и крупных портальных трактов четверодневных крыс. Проведен сравнительный анализ иммунофенотипа полученных культур клеток и исследована их способность к дифференцировке и трансдифференцировке invitro. На основании

4

полученных данных впервые экспериментально показано, что не только звезчатые клетки печени, но и портальные фибробласты составляют важную фиброгенную популяцию клеток печени.

Теоретическая и научная значимость

В рамках проведенного исследования предложен новый подход для получения звездчатых клеток печени и портальных фибробластов. Метод является более простым и удобным с практической точки зрения и позволяет получать клетки для моделирования фиброза печени ¡ткго. Подобная модель может быть использована для исследования процессов фиброгенеза в печени и доклинического исследования действия различных биологически активных веществ на культуры клеток, обладающих фиброгенным потенциалом. В ходе исследования влияния куркумина, глиотоксина, инсулина и ТКР-а на культуры звездчатых клеток печени из фрагментов печени и портальных фибробластов из крупных портальных трактов, были определены концентрации веществ, токсичные для клеток и обладающие антипролиферативным эффектом. Полученные данные об активации апоптоза и подавлении биосинтеза компонентов цитоскелета (один из маркеров фиброгенеза) глиотоксином и куркумином открывают перспективу применения исследуемых веществ в медицине для лечения фиброза печени.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Антифиброзное действие куркумина и глиотоксина связано с их непосредственным апоптотическим эффектом, как на звездчатые клетки печени, так и на портальные фибробласты.

2. Портальные фибробласты, наравне со звездчатыми клетками печени, способны к дифференцировке в миофибробласты и участию в процессах фиброза.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (г.Казань, 2011), XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (г.Казань, 2012), I научно-практической конференции студентов и молодых ученых Института фундаментальной медицины и биологии «Современные проблемы фундаментальной медицины и биологии» (г.Казань, 2013), Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2014» (г.Москва, 2014).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в объеме 137 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертационная работа иллюстрирована 32 рисунка и 5 таблиц. Библиографический указатель включает 182 источников литературы (3 отечественных и 179 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использованы крысы Rattus norvegicus, линия Wistar, полученные из питомника лабораторных животных «ПУЩИНО», содержание и использование которых соответствовало правилам, принятым в К(П)ФУ, рекомендациям местного этического комитета (Генин А. М. и др // Авиа космическая и экологическая медицина, 2001. №4).

Исследованные вещества: Куркумин (Curcumalonga (Tumeric) Sigma (С1386): 100 мкМ, 50 мкМ, 30 мкМ; глиотоксин (Gliocladiumfimbriatum, SigmaG9893): 0,1 мкМ; 0,05 мкМ; 0,25 мкМ ; инсулин (ПанЭко): 1000 мкМ, 500 мкМ, 200 мкМ ; TNF-a (PANBiotechGmbH): 10 нг/мл, 20 нг/мл, 50 нг/мл.

Получение эксплантацнонной культуры из печени крыс проводили из здоровых четырёхдневных животных, которых подвергали декапитации и обрабатывали 70% этанолом. Все последующие манипуляции проводили в стерильных условиях под бинокулярным операционным микроскопом StemiDV4 CarlZeiss (Германия). Осуществляли операционный доступ, извлекали печень, снимали Глиссонову капсулу. Паренхиму печени разделяли на фрагменты размером около 3 мм3 и помещали в питательную среду DMEM с добавлением 10% FBS, 200 гаМ L-глутамина и антибиотика на культуральный пластик. Фрагменты инкубировали в термостате при 37°С в атмосфере увлажненного воздуха с содержанием 5% С02. Прижизненное наблюдение за процессом эксплантации осуществляли инвертированной световой микроскопией. На 3-й сутки фрагменты печени удаляли, а питательную среду заменяли на свежую.

Получение эксплантацнонной культуры из крупных портальных трактов и дальнейшее культивирование осуществляли аналогично описанному выше. Однако печень при этом, не извлекали.

Получение культуры портальных фибробластов методом эксплантации после проназно-коллагеназной обработки. Выделение портальных трактов осуществляли по выше опигднной методике. Далее

б

портальные тракты инкубировали 30 мин при 37°С и постоянном покачивании в растворе DMEM (ПанЭко), содержащем 0,066% коллагеназу Clostridium hystolyticum (Sigma), 0,055% проназу (Sigma), 0,006% дезоксирибонуклеазу (Биолот), 3% FBS, 0,1% БСА (Sigma), 10 mM HEPES и антибиотики. Полученную клеточную суспензию пропускали через 40 мкм монофиламентный сетчатый фильтр. Оставшуюся на фильтре ткань помещали в среду DMEM и инкубировали при 37°С в атмосфере увлажненного воздуха с содержанием 5% СО2.

Фибробласты (ФБ) из кожи четырёхдневных крыс получали в стерильных условиях, измельчая фрагменты ткани до 1-2 мм кусочков хирургическим скальпелей и помещая образцы в лунки 6-луночного культурального планшета. Затем добавляли в каждую лунку по 2 мл культуральной среды и инкубировали 7 дней при 37°С во влажной атмосфере, 5% С02. На 7 сутки культуральную среду заменяли. Через 16-21 день инкубации формировался плотный монослой клеток.

При получении мультипотентных стромальных клеток (МСК) из костного мозга крыс из костномозговой полости крупных трубчатых костей вымывали костный мозг раствором DPBS в стерильную пробирку, который затем гомогенизировали, центрифугировали 5 мин при 500 g. Образовавшийся осадок ресуспендировали в питательной среде а-МЕМ и высевали на культуральный пластик.

Пероксидазно-антипероксидазный метод. Клетки фиксировали 10 мин 4% параформальдегидом и промывали 4 раза водопроводной водой. Для окрашивания на внутриклеточные антигены проводили 2 мин пермеабилизацию клеточных мембран 1% Тритоном Х-100. Проводили пероксидазный блок с 0,06% Н2О2 20 мин. и промывали TBS однократно 5 мин. Затем 1 ч инкубировали с первичными антителами и промывали 3 раза по 5 мин TBS. Для визуализации результатов использовали систему Novolink (Novocastra, UK). Проявляли окрашиванием аминоэтилкарбазолом (АЭК). Ядра окрашивали гематоксилином по стандартной методике.

Иммунофлуоресцентный метод. Фиксацию клеток в лунках культурального планшета проводили охлажденным метанол (карбинол, Тат ХимПродукт, Россия) после удаления культуральной среды, инкубируя при -20°С 10 мин. Затем клетки промывали 3 раза по 5 мин 50 мМ раствором Триса, pH 7,6, включающим 150 мМ (TBS). Инкубацию с первичными антителами (разведение 1:200) проводили в TBS 1 ч, затем промывали 3 раза по 5 мин в TBS и инкубировали 1 ч с вторичными антителами (разведение 1:2000 в TBS). После трёхкратной промывки по 5 мин в TBS добавляли DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, разведенный 1:50000 TBS; Invitrogen, США) и

7

инкубировали 5 мин и повторяли отмывку TBS. Далее в лунки добавляли по 500 мкл TBS и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии AxyoObserverZl (Carl Zeiss, Германия).

Иммуногистологию проводили ранее опубликованным методом (http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/paraffin_sections.js) Проточная цитофлуориметрия. Клетки фиксировали 30 мин в фиксативе CellFix, на основе формальдегида, 10 мин пермеабилизировали мембрану 0,1% раствором Твина-20 в PBS. Суспензию клеток 1 ч инкубировали с первичными антителами, затем 30 мин с вторичными антителами, конъюгированными с флюорохромом Alexa 488. Результаты анализировали на проточном цитофлуориметре GuavaeasyCyte 8НТ.

Исследование апоптоза методом окрашивания Annexin-V FITC и PI. На 7-ой день культивирования к клеткам добавляли исследуемые вещества в различных концентрациях и инкубировали 24 ч. Затем клетки собирали центрифугированием 5 мин при 500 g, оставшиеся прикрепленными клетки трипсинизировали, снова собирали, после чего 1-й и 2-й осадок объединяли, промывали два раза и окрашивали Annexin-V FITC PI согласно инструкции фирмы-производителя (Sigma).

Иммуноблотинг. После электрофоретического разделения белковых молекул в соответствии с рекомендациями фирмы Bio-RadMini-PROTEIN 3 Cell. Проводили перенос белков с гелей на Immun-Blot PVDF-мембрану (BioRad). Мембрану блокировали в 5% обезжиренном молоке 40 мин при комнатной температуре, а потом инкубировали-с первичными антителами при +4°С в течение ночи. Затем мембрану тщательно отмывали в PBS-Твин-20, после чего инкубировали 40 мин со вторичными антителами. Визуализацию иммунного преципитата проводили с помощью набора для хемилюминесцентной детекции белка Amersham™ ECL™ Prime Western Blotting Detection Reagent (GEHealthcareBio-SciencesAB, #RPN2232) и прибора ChemiDoc™ XRS+ System (Bio-Rad, Сингапур).

Трансфекция. Клетки трансфицировапи in vitro плазмидными конструкциями с помощью коммерческого трансфицирующего реагента Turbofect согласно инструкции фирмы-производителя (TermoFisher)

xCELLigance Real-Time Cell Analyzer (Roche), (метод проводили по инструкции фирмы Roche)

MTS-тест. Цитотоксичность куркумина, глиотоксина, инсулина и TNF-а на культурах клеток определяли колометрически с помощью реагента CellTiter 96® Aqueous MTS Reagent Powder (Promega, США) на планшетном анализаторе CERES 900HDi (Bio-Teklnstrumentslnc., США). Для этого при 490 нм определяли влияние исследуемых веществ на активность

8

митохондриальных дегидрогеназ. Статистический анализ проводили методом t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Excel 2007.

Диференцировка. Для индукции дифференцировки, осуществляемой в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях в соответствие с методом (Dogan A. etal // International Journal of Nanomedicine. 2012) клеточные культуры инкубировали со специальными средами согласно стандардном протоколу.

Результаты и их обсуждение

1. Фенотипический анализ клеток, получаемых методом эксплантации из фрагментов печени и крупных портальных трактов новорожденных крыс

Поскольку влияние веществ, в частности куркумина, глиотоксина, инсулина, TNF-a, на процессы активации /ингибирования фиброза печени невозможно исследовать без надежной модели эксплантации культуры клеток, с целью получения миофибробластов (МФ) необходимо было выполнить фенотипический анализ клеток, получаемых методом эксплантации из фрагментов печени и крупных портальных трактов новорожденных крыс.

Методов выделения ЗКП (звездчатые клетки печени), не содержащих в своей цитоплазме витамина А и находящихся на стадии МФ, в литературе не описано. Вследствие их высокой биосинтетической активности и способности трансдифференцироваться в МФ, которые синтезируют макромолекулы межклеточного матрикса соединительной ткани, ЗКП считают главными «виновниками» развития цирроза и фиброза печени (Ramadori, etal., // Liver. 2002. Vol. 22).Однако в последнее время появляется всё больше данных о том, что помимо ЗКП источником МФ могут являться фибробласты портальных трактов или ПФ (портальные фибробласты). Таким образом, на сегодняшний день обе эти популяции клеток ЗКП и ПФ рассматриваются как источник МФ и соединительной ткани при фиброзе печени (Iwaisako, etal., // JGastroenterolHepatol. 2012: Vol. 27).

Мы предположили, что для получения МФ с целью моделирования активации ЗКП и ПФ может быть использован метод эксплантации, при котором клетки, обладающие высокой биосинтетической активностью, мигрируют из фрагментов тканей invitro с образованием монослойной культуры.

Общепринятым маркёром МФ является альфа-гладкомышечный актин (а-ГМА). Отличительным признаком МФ, происходящихиз ЗКП, является

9

сохранение в цитоскелете миофибробластов десмина. Характерным маркером ПФ является Thy-1.

На первом этапе работы были получены клеточные культуры из эксплантов печени и крупных портальных трактов. Клетки, получаемые как из фрагментов печени, так и из крупных портальных трактов, имели морфологию, характерную для МФ.

При исследовании фенотипа клеток, полученных из эксплантов печени, была показана устойчивая экспрессия десмина - маркёра ЗКП крыс, что позволяет нам предположить, что мигрировавшие клетки являлись преимущественно МФ-ЗКП. (Рис. 1 А, Б).

РисЛ.Иммуноцитохимический анализ клеток, окрашенных антителами на (А) Десмин,12 день, пассаж О (РО), х40 (увеличение), (Б) Проточная цитофлуориметрия клеток, полученных из эксплантов печени Р1 (пассаж 1): - окрашивание на Десмин (зеленый пик -контроль (Я2), красный- опыт (1*3- 84%)).

При исследовании фенотипа клеток, полученных из крупных портальных трактов, было выявлено 81% положительно окрашенных клеток на ТЬу-1, что подтверждает получение МФ-ПФ (Рис.2)

Рис.2. Проточная цитофлуориметрия клеток, полученных из эксплантов крупных портальных трактов (пассаж 1): - окрашивание на ТЬу-1 (зеленый пик -контроль (Я2), красный- опыт (ЯЗ- 81%), (Б) Иммуноцитохимический анализ кпетокполученных из крупных портальных трактов , окрашенных антителами на (А) ТЬу-1,12 день, пассаж О (РО), х 10 (увеличение).

Поскольку экспрессия цитокератинов 18 и 19 не была выявлена, можно утверждать, что полученные культуры клеток были не эпителиального происхождения. А отсутствие экспрессии альбумина и а-фетопротеина было

ю

показателем того, что полученные клетки не были зрелыми гепатоцитами (Рисунок 3).

Рис. 3 - Проточная цитофлуориметрия клеток, полученных из эксплантов печениР1 (пассаж 1): — окрашивание на a-FP, Альбумин, СК-18, CK 19.(зеленый пик -контроль (R2), красный- опыт (R1))

2. Влияние куркумина, глиотоксина, инсулина, TNF- на ПФ и ЗКП, полученных из крупных портальных трактов

Исследование веществ, потенциально рассматривающийся в качестве препаратов для лечения фиброза печени, ранее проводилось на ЗКП. Учитывая участие ПФ в синтезе внеклеточного матрикса и их большой вклад в развитие фиброза печени, сравнительный анализ влияния на них и на ЗКП различных веществ,вероятно, поможет в поиске новых подходов к лечению фиброза печени. Биологически активные вещества, влияющие на эти клетки, потенциально способны модулировать процессы фиброза. Мы предположили, что использование известных ингибиторов фиброза: куркумина и глиотоксина, -может влиять на пролиферацию, жизнеспособность и статус активации МФ-ПФ.

С целью выбора оптимальных концентраций было исследовано влияние широкого диапазона концентраций всех веществ на полученную культуру клеток МФ-ЗКП: куркумина 5-200 мкМ; глиотоксина 0,025-30 мкМ; инсулина 10-1000 мкМ; TNF-a 1-50 нг/мл. Все вещества в указанныхконцентрациях добавляли через 24 ч после посева клеток, анализ их действия оценивали с помощью прибора xCELLiganceReal-TimeCellAnalayzer, который позволяет наблюдать влияние различных веществ на клеточный индекс в реальном времени.

На основании опубликованных данных по действию разных концентрации куркумина, глиотоксина, инсулина и TNF-a на МФ-ЗКП и собственных наблюдений, были выбраны 3 оптимальные концентрации каждого вещества: куркумина - 100 мкМ, 50мкМ и 30 мкМ, глиотоксина -

0,25 мкМ 0,1 мкМ, 0,05 мкМ, инсулина -1000 мкМ, 500 мкМ и 200 мкМ и ТОТ-а - 20 нг/мл и 10 нг/мл.

При самой высокой из используемых концентраций куркумина -100 мкМ - наблюдали наиболее токсичное действие на клетки. После начального периода адаптации клеток к влиянию вещества, начинался их апоптоз, а потом и некроз, что отражено в графике косонисходящей кривой, показывающей снижение пролиферации клеток (Рис. 4 А).

Посев клеток внес4>нне КУГКУМПНЛ Аначиз по конечно!! точке

И

шяия

■ШШЕНЯ

Окраска Аппнт-УИТС Р1 (48 часов) Внесение ЮТЮМШ1Л(24 чае

Постоянное поу чение результатов

Рис. 4. (А) Исследование клеточного индекса ПФ, при добавлении куркумина. Куркумин в различных концентрациях (30 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ) добавляли в культуру клеток, и пролиферативную активность клеток определяли на основе клеточного индекса, полученного с помощью прибора хСЕЬ1^апсеКеа1-"ПтеСе11Апа1ау2ег. (Б) Ранний апоптоз после инкубации с куркумином в концентраций 50 мкМ. Окраска красителями АппехтУ-Р1ТС (маркер апоптоза, зеленая флуоресценция) и Р1 (маркер некроза, красная флуоресценция), х20 (увеличение)

При добавлении средней (50 мкМ) концентрации куркумина клетки хорошо адаптировались, наблюдались лишь признаки раннего апоптоза (Рис. 4 Б). После этого клеточный индекс достигал фазы плато. Однако он был ниже по сравнению с контрольными клетками, которым ничего не добавляли (Рис. 4 А). Эту концентрацию можно считать наиболее значимой, т.к. клетки сохраняют способность к пролиферации, хотя и на более низком уровне. Видно, что рост клеток по отношению к клеткам контрольной группы снижается примерно на 50%. При самой низкой концентраций в ЗОмкМ практически отсутствовало влияние вещества на клеточный индекс (Рис.4 А).

По сравнению с куркумином глиотоксин оказывает более токсичное действие на ПФ. Глиотоксин добавляли к культивируемым клеткам через 48

48 ч. Концентрация 0,05 мкМ практически не оказывала влияния на клетки, некроза впервые 24 ч отмечено не было. Клетки на короткий промежуток времени подвергались апоптозу, а затем их рост восстанавливался, и на 72 ч культивирования их клеточный индекс был больше, чем у контрольных клеток (Рис. 5 А). Такие показатели сохранялись до конца эксперимента.

Посев клеток Внесение Глиотоксина Анализ по конечной точке

►

Тш*(и1 How)

Постоянное получение результатов

----;----L ■

Рис. 5. Исследование клеточного индекса ПФ при добавлении глиотоксина. Глиотоксин в различных концентрациях (0,05 мкМ; 0,1 мкМ; 0,25 мкМ) добавляли в культуру клеток (через 48 ч после посева клеток) и пролиферативную активность клеток определяли на основе клеточного индекса, полученного с помощью прибора xCELLigance Real-Time Cell Analayzer. Определение некроза/апоптоза клеток в дальнейшем проводили с помощью флуоресцентных красителей Annexin V-FITC и PI

При концентрации глиотоксина 0,1 мкМ клетки подвергались апоптозу, а частично и некрозу. Часть клеток выживала, однако роста клеточного индекса в процессе дальнейшего культивирования практически не наблюдалось. Таким образом, глиотоксин в концентрации 0,1 мкМ оказывает на клетки антипролиферативный эффект (Рис. 5 А). Концентрация 0,25 мкМ оказалась слишком токсичной и вызывала некроз исследуемых клеток (Рис. 5 А). Следует отметить, что полученные данные о токсичности веществ

актуальны для исследуемого типа клеток и зависят от концентрации и изначального их количества.

Методом проточной цитофлуориметрии показано, что при его добавлении в концентрации 0,25 мкМ 63,65% клеток погибали и 31,93% уходили в апоптоз, живыми оставались лишь 3,32% клеток (Рис. 6 Б).

0,1 мкМ 0,05 мкМ

Рис. 6. Влияние глиотоксина на процессы некроза и апоптоза в ПФ. Глиотоксин добавляли в культуру клеток в концентрациях 0,05 мкМ, 0,1 мкМ и 0,25 мкМ. После инкубаций 24 ч апоптоз/некроз клеток определяли с помощью флуоресцентных красителей АппехтУ-Р1ТС (маркер апоптоза, зеленая флуоресценция) и Р1 (маркер некроза, красная флуоресценция). Анализ проводили с помощью проточной цитофлуориметрии

С уменьшением концентрации глиотоксина (0,1 мкМ) количество мертвых и ушедших в апоптоз клеток снижалось (48,86% и 24,90%, соответственно), и увеличивалось количество живых клеток -22,66% (Рис. В). Наименьшая из выбранных концентраций глиотоксина (0,05 мкМ) не приводила к немедленной гибели клеток (5,70% некроза), однако апоптозу подвергалось 15,04% клеток, что почти в восемь раз превышает значение

14

спонтанного апоптоза в контроле 1,92% (Рис.6 А), количество живых клеток при этом составляло 76,14% (Рис. 6 Г).

На основании тестов по определению активности митохондриальных дегидрогеназ были подтверждены результатами хСе1П§апсе и максимальные нетоксичные концентрации куркумина и глиотоксина.

Кроме того, было исследовано влияние веществспротивоположным эффектом: инсулина и Т№-а - на клетки МФ-ПФ.

Хотя инсулин является известным митогеном, действуя на клетки через специфичные рецепторы, его влияние на ПФ оставалось недостаточно изученным. В ходе исследований показано, что инсулин способствует пролиферации ПФ. Получены экспериментальные данные, которые показывают, что от самой низкой - 200 мкМ - до самой высокой - 1000 мкМ-концентрации, инсулин способствовал росту клеточного индекса (Таблица 1).

Таблица 1.

Влияние куркумина, глиотоксина-TNF-a и инсулина на МФ-ПФ крыс in vitro

ВЕЩЕСТВО КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРОЛИФЕЕЧЦИЯ ti-ГМА Annexin-V FITC Is!

АПОПТОЗ

ранний поздний

КУГКУМНН 30 мкМ + + + + - +

50 мкМ -/+ ++ + -

IOOmkM - + - +

гапотокспн 0,05 мкМ -/+ + + - +

0,1 мкМ -/+ ++ - +

0.25мкМ — + - +

TNF-« Юнг/мл + + * *

20нг/ыл ++ ++ » *

ЩО 11Ш 200 мкМ + + * *

S00 мкМ + + ++ * *

1000 мкМ +++ +++ * *

(-) - снижение пролиферации, биосинтезаГМА или отсутвиеапоптоза. (+) — увеличение пролиферации, биосинтеза ГМА или индукция апоптоза. * — не определяли

Хотя известно, что цитокин TNF-a обладает множеством эффектов,имеющих критическое значение в процессах регенерации, изменение роста клеток после добавления TNF-a в течение 24 ч практически не наблюдалось, однако после 48 ч инкубации наблюдалось увеличение пролиферативной активности по отношению к клеткам контрольной группы (Таблица 1).

Результаты, полученные в ходе нашего исследования, направленного на изучение влияния нескольких биологически активных веществ в различных концентрациях на пролиферативную активность, биосинтез компонента цитоскелета a-ГМА и апоптоз МФ-ПФ, обобщены в Таблице 1.

Таким образом, исследовано действие куркумина и глиотоксина на ПФ, предложены оптимальные концентрации куркумина (50 мкМ) и глиотоксина (0,1 мкМ), которые могут быть использованы для подавления пролиферации и активации МФ-ПФ. Полученные результаты расширяют современные знания о клетках, входящих в фиброгенные популяции печени, их превращении, и открывают новые возможности для клинического применения биологически активных веществ (куркумина и глиотоксина) шу/уопри лечении заболеваний печени.

ВЫВОДЫ

1. Получены культуры звездчатых клеток печени из фрагментов печени и культуры портальных фибробластов из крупных портальных трактов крыс Rattus norvegicus методом эксплантации и ферментативной обработки (проназной и коллагеназой).

2. Из результатов иммунофенотипирования следует, что звездчатые клетки печени десмин-положительные, а портальные фибробласты Thy-1-положительные при культивировании in vitro.

3. В процессе культивирования звездчатые клетки печени и портальные фибробласты дифференцируются в процессе культивирования в миофибробласты, экспрессирующие альфа гладкомышечный актин.

4. Установлено пролиферативное влияние TNF-a и инсулина на культуру клеток портальных фибробластов и увеличение биосинтеза компонентов цитоскелета (а-ГМА).

5. Добавление куркумина и глиотоксина в культуру звездчатых клеток печени и портальных фибробластов оказывает дозозависимый про-

апоптотический эффект и снижает биосинтез компонентов цитоскелета (а-ГМЛ).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Миянович О. Выделение и культивирование миофибробластов печени крыс методом эксплантации / О. Миянович, А.К. Шафигуллина, A.A. Ризванов, А.П. Киясов// Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-VII (3).-2012 . - С.112-115 (Список ВАК-авт. 0,125 пл.).

2. Миянович О. Анализ миофибробластов крысы, полученных из структур портальных трактов печени методом эксплантации / О. Миянович, М.Н. Катина, A.A. Ризванов, А.П. Киясов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-УШ(З). -2013. - С.119-124 (Список ВАК - авт. 0,1875 п.л.).

И. Тезисы докладов региональных и международных конференций:

1. Миянович О. Роль NFkB в активации каскада клеточных реакций при фиброзе печени / О. Миянович, А. Шафигуллина // XVI Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине», секция «Фундаментальные науки»: Материалы конференции. - Казань, 2011. -С.130.

2. Мнянович О. Иммуноцитохимический анализ фенотипа звездчатых клеток печени / О. Миянович, А. Шафигуллина // Материалы XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». — Казань, 2012. - С.145.

3. MijanovicO. TheroleofNF-KBinhepaticstellatecellsduringliverfibrosis / О. Mijanovic, А.P. Kiyasov, A.A. Rizvanov // М1жнароднанаукова конференщя студентш и молодих вчених «Сучасш теоретичш та практичш аспекти клппчно! медицини 19-20 квтш 2012 року»: Тезидоповидей. - 2012. — С.46-47.

4. Mijanovic О. The role of NF-kB in the activation of a cascade of cellular reactions in liver fibrosis / Mijanovic O. // The 4th international IMBG conference

17

for \oung scientists « Molecular biology: Advances and perspectives». - Kyiv, 2011. - p. 14-17.

5. Мнянович О. Выделение и культивирование миофибробластов печени крыс методом эксплантации / О. Миянович, А.К. Шафигуллина, A.A. Ризванов, А.П. Киясов // Международная конференция «Биология - наука XXI века». - Москва, 2012,- С.587-589.

6. Миянович О. Перспективы применения куркумина при хронических гепатозах / О. Миянович, М.Н. Катина // Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2014». - Москва, 2014.

7. Проттой P.A. Качественное и количественное определение экспрессии транскрипционного фактора NF-кВ в культуре миофибробластов печени крысы / Проттой P.A., О. Мнянович, A.A. Ризванов // I научно-практическая конференция студентов и молодых ученых Института фундаментальной медицины и биологии «Современные проблемы фундаментальной медицины и биологии»: Сборник тезисов. - Казань, 2013. - С.104-105.

Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу:

420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание КФУ, к. 105, отдел аттестации научно-педагогических кадров, e-mail: RGDziubenko@kpfu.ru. факс 8(843) 233-78-67.

Подписано в печать 23.04.2014г. Усл. печ. л. 1,1. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Отпечатано с готового оригинал-макета в копировально-множительном центре Казанского федерального университета. 420008 Казань, ул. Кремлевская, 18

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Миянович, Оля, Казань

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

На правах рукописи

/ {

04201459538

Миянович Оля

Влияние куркумина и глиотоксина на звездчатые клетки печени и портальные фибробласты крыс in vitro

03.01.04 - Биохимия 03.03.04 - Цитология, гистология и клеточная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., доцент Ризванов A.A. Научный консультант: д.м.н., профессор Киясов А.П.

Казань - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................10

1.1 Клетки печени, их превращение, основные фиброгенные популяции ..10

1.1.1 Морфология печени..............................................................................10

1.1.2 Эмбриональное развитие печени.........................................................11

1.1.3 Клетки печени 12...................................................................................И

1.1.4 Цитокиновая регуляция в печени.........................................................14

1.1.5 Митогены в печени................................................................................15

1.1.6 Фиброз и цирроз печени 17...................................................................16

1.1.7 Миофибробласты..................................................................................17

1.1.8 Звёздчатые клетки печени.....................................................................22

1.1.9 Портальные фибробласты.....................................................................28

1.1.10 Клеточные маркеры Thy-1, а-ГМА....................................................30

1.2 Экзогенные и эдогенные биологически активная вещества, оказывающие влияние на биохимические и молекулярно-биологические процессы развития и дифференцировки клеток печени................................32

1.2.1 Транскрипционная регуляция активации звездчатых клеток печени ...........................................................................................................................32

1.2.2 Куркумин...............................................................................................34

1.2.3 Глиотоксин.............................................................................................39

1.2.4 Инсулин..................................................................................................41

1.2.5 TNF-a.......................................................................................................42

1.3 Заключение по обзору литературы............................................................44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................47

2.1 Получение эксплантационной культуры из эксплантов печени крыс Rattus norvégiens.................................................................................................47

2.2 Получение эксплантационной культуры из крупных портальных трактов.................................................................................................................48

2.2.1 Получение портальных фибробластов из крупного портального тракта крыс Rattus norvégiens методом эксплантации после проназно-колагеназной обработки.................................................................................48

2.3 Получение фибробластов (ФБ) кожи крыс Rattus norvégiens...............49

2.4 Получение клеток костного мозга (МСК) крыс Rattus norvegicus..........49

2.5 Метод иммуноцитохимического окрашивания........................................50

2.5.1 Пероксидазно-антипероксидазный метод...........................................50

2.5.2 Иммунофлуоресцентный метод...........................................................52

2.6 Иммуногистология.......................................................................................52

2.7 Проточная цитофлуориметрия..................................................................53

2.7.1 Исследование апоптоза методом окрашивания Annexin-V FITC (fluorescein isothiocyanate) и PI......................................................................54

2.8 Иммуноблотинг............................................................................................54

2.9 Трансфекция клеток с помощью трансфекционного агента TurboFect. 55

2.10 Исследование клеточного индекса с помощью прибора xCELLigance Real-Time Cell Analayzer...................................................................................56

2.11 MTS-тест.....................................................................................................56

2.12 Диференцировка.........................................................................................57

2.12.1 Анализ дифференцировки...................................................................58

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ........................................60

3.1 Фенотипический анализ клеток, полученных методом эксплантации из фрагментов печени и крупных портальных трактов новорожденных крыс Rattus norvegicus.................................................................................................60

3.1.1 Дифференцировочный потенциал (фенотипическая пластичность) клеток, получаемых методом эксплантации из фрагментов печени и крупных портальных трактов новорожденных крыс..................................78

3.2 Влияние химических веществ (куркумин, глиотоксин, инсулин и TNF-a) на ПФ, полученных из крупных портальных трактов...................................83

3.2.1 Влияние куркумина на культуру клеток ПФ, полученных из крупных портальных трактов........................................................................88

3.2.2 Влияние глиотоксина на культуры клеток ПФ, полученные из крупных портальных трактов........................................................................94

3.2.3 Влияние инсулина на культуры клеток, полученные из крупных портальных трактов......................................................................................101

3.2.4 Влияние TNF-a на культуры клеток ПФ, полученные из крупных портальных трактов......................................................................................103

3.3 Влияние исследуемых веществ на активность митохондриальных дегидрогеназ (пролиферативный MTS тест).................................................105

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................108

ВЫВОДЫ............................................................................................................114

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................115

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................117

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Хронические заболевания печени, в результате которых развивается цирроз, занимают восьмое место в причинах смертности взрослого населения в мире (Martin, et al., 2014; Parola, et al., 2009). В связи с этим огромное значение имеют исследования молекулярных механизмов активации и ингибирования профиброгенного потенциала паренхиматозных и непаренхиматозных клеток печени, связей биохимических внутриклеточных процессов с деятельностью отдельных популяций клеток печени. Подобные исследования позволяют выяснить причины развития фиброза и цирроза печени и изыскать новые пути их эффективного лечения.

Единственным эффективным методом лечения цирроза печени на данный момент является трансплантация донорского органа печени, но многие аспекты функционирования печени в этих условиях с биохимической и клеточной точки зрения изучены недостатачно. Именно поэтому ведутся активные поиски новых биологически активных веществ, а также проводится исследование физиологического действия уже известных лекарственных средств с целью расширения их показаний и возможностей применения в медицине, что позволит предотвратить развитие, замедлить и обратить вспять фиброз печени. Перспективными подходами представляются применение клеточной терапии стволовыми и прогениторными клетками, генная терапия, одновременно ведутся поиски новых химических соединений, оказывающих влияние на процессы образования внеклеточного матрикса (ВКМ) в печени (DeLeve, 2013) (Isao Oakazaki, 2003).

Доклинические исследования различных препаратов и методов лечения включают эксперименты in vitro на культурах клеток. Однако, до сих пор не утановлены клеточные типы, обладающие профиброгенным потенциалом и участвующие в развитии фиброза в печени (Bataller, et al., 2005; Diehl, et al., 2013; Yin, et al., 2013). Не до конца выясненными остаются сигнальные пути

5

и каскады, запускающие синтез компонентов ВКМ в ответственных клетках (Iredale, et al., 2013). Исследование клеточных основ процессов фиброзирования-дефиброзирования в печени и молекулярных основ активации и ингибирования этого процесса может помочь в создании принципиально новых подходов в лечении хронических гепатитов и их грозных осложнения фиброза и цирроза органа.

Одним из перспективных подходов для успешного лечения заболеваний печени является применение биологических веществ, проявляющих антифиброзную активность. Примерами таких веществ являются куркумин и глиотоксин (Dai, et al., 2013; Priya, et al., 2008; Zheng, et al., 2006) (Qiu, et al., 2014; Tian, et al., 2014)

Цель работы: Характеристика молекулярно-биохимических механизмов диференцировки, морфогенеза и апоптоза in vitro клеток печени с фиброгенным потенциалом в ответ на воздействие куркумина, глиотоксина, инсулина и TNF-a.

В соответствии с поставленной целью решали следующие задачи:

1. Получить культуры звездчатых клеток печени и портальных фибробластов методом эксплантации и ферментативной обработки из фрагментов печени и крупных портальных трактов здоровых четырёхдневных новорожденных крыс Rattus norvegicus.

2. Провести иммунофенотипический анализ полученных культур клеток и исследовать их способность к дифференцировке и трансдифференцировке in vitro.

3. Определить влияние биологически активных веществ: куркумина,

глиотоксина, инсулина и TNF-a, на биохимические показатели культур

звездчатых клеток печени и портальных фибробластов в том числе и на

пролиферацию, апоптоз и биосинтез компонентов цитоскелета.

6

Научная новизна

Получены приоритетные данные по дозозависимому влиянию куркумина, глиотоксина, инсулина и TNF-a на биосинтез компонентов цитоскелета звездчатыми клетками печени и портальными фибробластами, а также их пролиферацию и апоптоз. Несомненной новизной обладают данные по влиянию куркумина, глиотоксина, инсулина и TNF-a на культуры клеток портальных фибробластов из крупных портальных трактов в сравнении со звездчатыми клетками печени. Впервые проведено сравнение двух методов (эксплантация и ферментативная обработка) получения культур звездчатых клеток печени и портальных фибробластов из эксплантов печени и крупных портальных трактов четверодневных крыс. Проведен сравнительный анализ иммунофенотипа полученных культур клеток и исследована их способность к дифференцировке и трансдифференцировке in vitro. На основании полученных данных впервые экспериментально показано, что не только звезчатые клетки печени, но и портальные фибробласты составляют важную фиброгенную популяцию клеток печени.

Положения, выносимые на защиту:

1. Антифиброзное действие куркумина и глиотоксина связано с их непосредственным апоптотическим эффектом как на звездчатые клетки печени, так и на портальные фибробласты.

2. Портальные фибробласты, наравне со звездчатыми клетками печени, способны к дифференцировке в миофибробласты и участию в процессах фиброза.

Теоретическая и научная значимость

В рамках проведенного исследования предложен новый подход для получения звездчатых клеток печени и портальных фибробластов. Метод является более простым и удобным с практической точки зрения и позволяет получать клетки для моделирования фиброза печени in vitro. Подобная модель может быть использована для исследования процессов фиброгенеза в

печени и доклинического исследования действия различных биологически активных веществ на культуры клеток, обладающих фиброгенным потенциалом.

В ходе исследования влияния куркумина, глиотоксина, инсулина и ТОТ-а на культуры звезчатых клеток печени из фрагментов печени и портальных фибробластов из крупных портальных трактов, были определены концентрации веществ, токсичные для клеток и обладающие антипролиферативным эффектом. Полученные данные об активации апоптоза и подавлении биосинтеза компонентов цитоскелета (один из маркеров фиброгенеза) глиотоксином и куркумином открывают перспективу применения исследуемых веществ в медицине для лечения фиброза печени.

Личное участие автора в полученных результатах

Автор принимал участие в формулировании научной проблемы и планировании эксперимента, участвовал в написании статей, проводил информационный поиск по исследуемой тематике. А также лично выполнял исследования, проводил статистическую обработку полученных данных, обсуждал и описывал полученные результаты. В итоге решена важная биохимическая задача поиска биологически активных веществ, снижающих фиброгенный потенциал клеток печени. Данные, полученные лично автором, демонстрируют возможность применения куркумина и глиотоксина для активации апоптоза и подавления биосинтеза компонентов цитоскелета портальных фибробластов и звездчатых клеток печени.

Связь работы с базовыми научными программами 1. Грант РФФИ 12-04-97088-р_поволжье_а «Изучение фундаментальных механизмов пластичности и направленной дифференцировки звёздчатых клеток печени для разработки клеточной биомедицинской технологии восстановления гепатоцитов» (2012-2014);

2. Грант РФФИ 09-04-97013-р_поволжье_а "Клетки Ито - ключевое звено для дифференцировки внепеченочных стволовых клеток в гепатоциты или стволовые клетки печени?" (2009-2011).

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (г.Казань, 2011), XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (г.Казань, 2012), I научно-практической конференции студентов и молодых ученых Института фундаментальной медицины и биологии «Современные проблемы фундаментальной медицины и биологии» (г.Казань, 2013), Международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2014» (г.Москва, 2014).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 работы в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК для защиты диссертаций, 7 тезисов докладов на Международных и Всероссийских конференциях и конгрессах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа в объеме 137 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертационная работа иллюстрирована 32 рисунка и 5 таблиц. Библиографический указатель включает 182 источников литературы (3 отечественных и 179 иностранных).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Клетки печени, их превращение, основные фиброгенные популяции 1.1.1 Морфология печени

Печень - самая крупная железа организации млекопитающих, которая участвует в обмене веществ, выполняет экзо- и эндокринную функции. Она имеет ряд особенностей. Во-первых, печень осуществляет метаболизм, синтез, детоксикацию ряда веществ, осуществляя, таким образом, защитную функцию организма. Во-вторых, печень имеет огромный регенеративный потенциал. В-третьих, хотя печень и не является лимфоидным органом, она осуществляет целый комплекс иммунных функций (Viebahn, et al., 2008; Wallace, et al., 2008). Функциональной единицей печени является печеночная долька. Классическая печеночная долька имеет шестиугольную форму с портальными триадами по углам и центральной веной посередине. Сеть синусоидов печени обеспечивает равномерное распределение крови в печеночной дольке. По главному входному пути артериальная кровь и кровь портальной вены достигают синусоидов печени. Портальный тракт является главным «входом» в долю печени и одним из двух основных «выходов». По выходному тракту желчь поступает в двенадцатиперстную кишку. Желчь собирается в желчные проточки, которые сливаются в желчные протоки

(Рис.1) (Katalin, 2011).

Гепатоциты

Центральная вена

Желчные канальцы

Печеночная артерия

Желчный проток

\ Портальная триада

Портальная вена

Рис. 1. Архиктектура печени. Адапритировано из (Zorn, 2008)

Синусоид

1.1.2 Эмбриональное развитие печени

Эксперименты на эмбрионах животных показали, что развитие печени происходит через последовательную серию реципрокных тканевых взаимодействий между эмбриональной эндодермой и примыкающей мезодермой. Из эндодермы образуются передняя, средняя и задняя кишки. Из передней кишки образуются легкие, печень (гепатобласты, предшественники гепатоцитов и билиарного эпителия - примитивные клетки желчных протоков), желчный пузырь и поджелудочная железа. Из мезодермы образуется печеночная мезенхима, в состав которой входят портальные фибробласты и ЗКП (Huang, et al., 2006). В последнее десятилетие были идентифицированы многие гены и молекулярные пути, регулирующие гепатогенез. Практическое применение полученной информации позволило ученым создать из эмбриональных стволовых клеток in vitro печеночно-подобную ткань. В дальнейшем данная технология может помочь разработать ткань, пригодную для трансплантации с лечебной целыо (Zorn, 2008). В процессе эмбриогенеза плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки дают начало эктодерме, эндодерме и мезодерме.

1.1.3 Клетки печени 12

Принято разделять клетки печени на клетки паренхимы (гепатоциты и холангиоциты) и синусоидальные (клетки Купфера, эндотелиальные клетки, перисинусоидальные клетки (ЗКП) и ямочные клетки). Большинство исследователей традиционно фокусируются на гепатоците, однако в последние годы стало очевидным, что холангиоциты и синусоидальные клетки вносят существенный вклад в функцию печени и развитие патологии печени. Поэтому сейчас интенсивно ведутся исследования по определению эмбриональных источников этих клеток (Zhao, et al., 2005),для выяснения их роль в развитии и понимания механизмов регенерации.

1.1.3.1 Гепатоциты

Основной функ�