Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы возникновения и репарации двунатеневых разрывов ДНК с образованием делиций

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы возникновения и репарации двунатеневых разрывов ДНК с образованием делиций"

Р Г Б ^РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

. п ГСП '00./;

! ' С2БЗРСК02 ОТДОЕНЖ

ЕНСТШТ щгтолопш й ГЕНЕТИКИ

У

правах ругстгся УДК 547.922.32

Сшпцана О.-ьгз Ивзяозиа

ИОЛЕШНРНШ КШШ ВОЗШЕОВЕНЯН И РЕПАРАЦИЯ ДВУШ'ТКШХ РАЗИЙОВ ДКС С ЙЗРАЗОВ1ЕЗЭ1 дкгщзй.

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученей степени кандидата биологически! наук

Новосибирск 19Э4

Работа Енноашш в Етстптута цатолслаз и гекБ?гкз СО РАН, г. Новосибирск

НаучныЗ руководитель: дс;:тор баологзческзх каук

Г.Л. Дагнов

ЕГОТЕТУТ ЦаТОЛОГШ И ГЕЕЭТШШ СО Р1Н, г. НовосЕбарск

О^щаалькыз сшскакты: доктор бзаюгичэскгсг нзув,

профессор Н.А. Какчиюв Институт цц галопа в генетика СО Р^, г. Новосибирск

доктор вшическах нар, профессор Г.Л. Нсвтхкай Институт беооргажчзскоЗ гялши СО РАЯ, г. Новосибирск

Еэотее учревдзше: Санкт-Петербургский

Государственный Укгвврситет, кафедра генетики и селекции г. Санкт-Петербург

Зачета диссертации состоятся ■ ¿¿/¿£¿^£"1994 г.

на _ заседании специализированного совета по

завдте диссертаций на соискание учзкой степени доктора наук (Д-002.П.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск, проспект Академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан ■ г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

4?Ц2ль52сть_П20бл5Ш. Способность хиычесхнх а {еззчзс-khz иутагезоз минировать структурна пгрзстройя генома хороао иззястпз. Однако только з последние голи, когда раззз-тгз L*ac9KyjL4pno3 гзквтиэ ало особенно шггенсавко, йин разработана коше кэтодп, которнз позеолея глубгэ проглянуть в isiamraia генетЕчесЕсЗ реясибгнзцш а попить способ» дайстяя мутогзнов.

Среда друт перзстрозя генсна дзлзцпз вддэлввтся той, ЧТО С ЕЗЕбОДКЗЙ вэроятностья ПРИВОДЯТ К УКЗКЬЕЭЕЭ собкостя оргашзкэ. Однако в то S3 вреет дзгецзя играет вязнул звапЕ^олнуз роль, сбоспечззая удалвшгэ участксз утратит сЕса фуЕкци. Кроет того, дзгзцея - зто извзстшг! способ Еояструнровзнзя ИОВНХ ГвЕЭТНЧЭСЗИХ ПрОГрс^!, КОТОрт подвергается одэшга отбором.

Анализ споптзнных п пздудяроззнных двгвщЗ, возптазгзх под дзйстваги ыутагенов в генолах проялрзот а гукзрсот, указывает на то, что большая часть пх происходи в регугьтате взагаюдзйстизя пряж отдалэнко распмсзэЕнн1 повторов. Полученные в ■ настогсзЗ работа дашис, поддергашза ргбэтаия друга авторов (Салгаизк И др.,1237; Sargen'tini and Smith, 1992), говорят о тем, что путь к взаимодействуя ?зкз1 позторсз от-кргвазт двуштекй разрыв,' прозсгодятй ш иду ша, котора слузшт трятерш реконбянгцй. Однако бслызпство 1пжчзсш цутагенсз га способно непосредственно вызывать разрывы фос$о-даэффных связей в иолекулах ДЕК, тем на кзлве, ош обладает способностью стЕкуларовать процесса . генетической рекоибена-цез, проводив к форнярованшэ структурных перестроек, в частности, делецей. T8KZM образом, вопрос о иолекудяряых кэха-низмах образования дзлецзй пра действии мутагенов остается открытии.

Далью настояний работы являлось:

1. Выяснять молекулярные механизш возникновения двувитевых разрывов ЛЕЕ при действии мутагенов; идентифицировать фермента, участвуйте в этом процессе.

2. Установить, каким образон двунитевне разрывы ДНК стекулз-руют процессы рекомбинации с образованием дотаций.

йутаая_ндви^_и_практ^^я_згачи^та_работы. Пока-

зано, что близкорасположенные противолежзщв повреждения двух

Е2КЙ ДЕ{ елщцщет язлгцгоашз иутацаа, тогда кал одноетз-кгэ површдангя ев пргвода к псешееэ) докщгЗ. Епзргкв

усгшгвззЕо, что еь-еко процесс згхцагяоякой репзрацаш близ-корзсса&ссгнацх сшознтвах . ио^т^^цгрогикшз: ССЕ0Б2ЕЕ1 б Д5С прзадл л сСразовглиз) прэквокзаги брггзй и, слсдозатоаь-ео, к ЕозкэаюЕеЕЕз двуЕзгакя разрывов, Еоторае с испиши рогсибзнзвдошгЁ процэсс, загерЕсгзйга форлрсзггазы дахз-образуется в рззультатз ЕзгыодайствЕЯ пряшх постсрзз на фланга! разорэгакн ксшзкул ДЩС, рсспологекнах на рсгхи удазвка от точки разрыва. В зткг состоа? кочевая стает моияудзраото шхалпэаа образования дзхзцйЕ с ютакпз-иэ раааразза дзуЕЭтзвыг разршюз, в частости , в гаплоидной гс2жз. В рззультате провадзшгх пссхадовзпЕа кюриа продз-^гстрровано, что в процесса Еоссоеда^езш разорванных концов ПК с образованна участвуют клзточкаэ зкзоярлз-аза, обеспочнгагщтв Езаагоде2ск>гэ • юшяаноктарзих посжвдова-тзхьссстей в составе прякдх повторов на фланга! разрыза. На осшсз получении данных в работе обсувдаатся цзхазази обра-зобеезз дашцй, ЕВДуигруеШ! блсззорзсполозвнншз позрездс-Е222 ЕНЯ в протоапж^дх участках. Показано, что фераснты, обсашавах^зо репарадгэ ДЗК, участвует и в процесса! рехса-бзисз, с образоваке!! делений.

Показано, что использованные в работе шгазилддкз ДЗК, соДэргада пршкэ повтора в позвогнгсзо прозодать пологатель-нуэ селехци» дздацаЗ: когут быть пржакаш в качзствэ тест састеи да Еагалэнзл разлгашх ферритов, участвущгх в репа-рада б рексшбшацт у разных организмов, а такта для тестирования иутагенов, загрязкягггп окрузавдую среду.

Апробащя_работи. Результаты работа докладывалась на 2 Двусторонней Сшшсзаумэ СССР-США "Структура зукарготического генома в регуляция его экспрессии" (Тбилиси, 19Э9г.); на 7 Всесоюзной Сшшозиуме "Иолекулярные «яханизкы генетических процессов" (йосква, 1990) и на 15 Уеадународном Конгрессе по Ввохвши (Иерусалим, 1991).

0б°8м_с_с7р2кт2рэ_^ссе^тадия. . Диссертация изложена на страницах, содержит £ таблиц, рисунков, список лите-

ратуры из ¿жР*?-- наименований. Работа содершт елвдупцие глава: вваезнивг обзор литературы, натерзали и нетода исследований,

рззуяьтага пссгадозаяй, сбсуцдешэ розультатсз, зая.тлзгсэ, ЕНЗЗОЕ1.

К57ЛБТАТЫ И СЗСШЕНГЗ ""

ftt показал, что прэ^ттащсплыз погрозиися проттЕссз-es^th участков ДНК лойстгзтзапо сздуцзрувт. с5р?со~г.:сз згэ-иЗ п ЕНсср^зЭ (тгбл.1). 3 piöcrai rix—Л лгЗ-зрз-

торгл Сило показано, что £3-1эст про-сюдзт прз кпсст прэеттаг^онксго дзуЕзтзсого рззргза в ДЗГС. £ шз ¿зталыэ иссгадозггя пздутпгп такгх пзр^стрсся п устагет-

р.о, что сел еозепкзт в результата езссоздзезезл хспцсз ра-зсрзанпсЗ пэгазуа по гшисионтарЕИ посяэлоБатапЕостг^ ЕОрСППХ ПрЗ-'Л позтсрзз, ОЕЕГЖПРТЕЛЗХ точку рагр*ва. 3 то п время гнкпзсгзгэ вояфпк ст, згтропп^г^е ^зкттзг^э ссгозз-ПИЯ ТОХЫСО О.Т'Оа ЕГО пггеЗ ВЕС, с'^зтгтгпо рзпарзртптсз п срз-бодят 2 постлэт гдзшпа сСргзса точшзл сутагсй, езсзм-пзп со срзЕгглольпо штоЗ частотсЗ (Олгазст а др., 1537). Тзблзцэ 1. 3;?ф8зст поврзздгаса ДЕЗС pBR322 0-кэтзлгядролхжз:с1

В ргЙХЯЯ BamH1- CSiT3.

Характер Стг~1 Проанзгазгро- га X ипы иутацпЗ

ПОВрЭЗДРЕЗЯ ваз:о трзке- 5CJE2SET03 .ДОЗЦ^П ЕНСОрЩП T04T.CEÜ9 БССГО

СЙГА по одной штя EBI0I 1032 2 - 25 27

С&ГА по двум нити HBI0I 380 29 II 23 60

Контроль ЕШЮ1 1250 0 0 0 0

Ki предположила, что основной причиной образования даяз-ций, которые наблюдаются при обработке ДНК ыутагенаи, шжэт быть эксцизионная репарация близкорасположенных повреждений обеих нитей ДВК, сопрсгвождащаяся возникновением двунитевнх разрывов. В данной работе ш исследовали процесс формирования двунитевнх разрывов в ДВК, ' содержащей близксрасполокенкне оппозитнне уращыы, и генетические последствия такого повреждения ДВК.

Конструирование пяазид.

Для создания урацид-содаржащх ДВК Aua использована

штазизда {¿{4-165 , производная рВЕ327, содерзацая пряшэ повторы, даней в 165 н.п., с пожвшкериой послэдователькостьв кздду няш в ЕнаэтЕЕшроваЕнса tat геко (Dianov et al.,1991). Регажй5Еа1ДЯ по пршш повторам, которая индуцируется двуна-текы разрьвоа, лохаигзоваикыа -в полалшшре цзвду повторами долша првводзть к дэлоцда одного из повторов н последовательности ыевду ниш. В результате этого коено огвдать . вос-стаЕовлвЕзе первоначальной структура tat - гена, что тестируется по появленья тетрацдкиш-устойчивих колоний среда траке-форшрованнп бактериальных шаток.

Плазздда рК4-165 использовалась для конструирования молекул ЛЕН, содарнагзх остатки урэцагов в составе одкоЗ ши двух estsS. Шгазщдную ДЕС гвдролазовалз по уникальному сайту в состазэ полагалкера зндонуишазой рзстршсщи asp7181. п Едтоззш "швах" концов линейнш иолвкул ДНК иода^иццровала бгсуш^втоц натрия. В результата реакции дезаьшшровашя остатки щтозвна в последовательности gatc одеого елл обеих "лшшях" концов молекулы Д5С превращались в остатки урацалов в, соответственно, посладователькость gatc превращалась в последовательность gtaU. ^дампированная таким образом ДНК на ьотзт зашкаться в кольцо ЕЗС-шгазоЗ фага Т4 в стандартна условиях, тгш ках esst нехошязкентарныз "липкие" конца (Еэдкздав • в др,1580). Восстановление кольцззой структура ДШС проводилось с использованием специально сшггезпровакных для этой цели ол2гонуклеотвдна1 дуплексов, содараацах кошлеизн-тарзыэ концы дал урацил-содерззцзЗ ДЕй. На рисунке I представлена структура олпгонуклеотцдкых дуплексов. Дуплекс III способен кошягкзнтарно взаимодействовать с плазщдной ДНК, ердзргащей остатки урацвлов на обоих "лшки1" концах и обра-зувдяся в результате лигированая кольцзвая шлекула будет содержать два оппозитных урацила на расстоянии 12 н.п. (2Ш9К). Кольцевая молекула ДНК.содераащая один остаток ура-цала ШДНК). получалась при реазащи лигировавия дуплекса II с иодотированной ДНК. В качестве контрольной использовали гвдролизоваяную, но не кодфацированиую плазвдщую ДНК, зашс-кутую в кольцо с поаопгыо олнгонуклеотидного дуплекса I

Шкзщгщая

Коншшкянтаршй

ДГПЕ8КС

Восстановленная кольцевая иолзкула

—CTCG GIACCCGG— I —GAGCCATG GGCC—

. Неиодифищрованный

сайт Авр7181

CTACATCGAT

TAGCTACAIG

—CTCG GIACCCGG— Ц ATACCAGACA

—GAGCUATG GGCC— GTCTGTCATG

Сайт Авр7181 с одним

урацшюм -

—CTCG CTAUCCGG— Ш A1ACATCGAT

—GAGCUATG GGCC— TAGCIiCAIA

Сайт Авр7181 с двумя -

урацилаиа

Ряс. I. Схеиа конструирования слазшдша остатками урадилов.

с одним и двумя

ЯдыктиДикация двунитевшс разрывов ДНК в системе' бесклеточных лизатов.

Урацал в норме не присутствует в составе ДНК, так как удаляется специальным ферментом репарации - урацил-ДВК-гли-кознлазов. № сконструировали кольцевые плязмидннв молекулы с оппозитныш урацилаыи и ехида ли, что в результате удаления остатков урацила из состава ДНК урацил-ДНК-гликозала зой и эксцизяи получащпся АП сайтов АП-эндонуклеазаш в ДНК будет возникать двунитевой разрыв. В результате кольцевая молекула ДНК станет линейной. Напротив, репарация молекул, содержа*! одиночный урацал, нв долина приводить к двунитевому разрыву. Чтобы проверить это предположение - сконструированные плазщди, меченные с помощью ^Р-олнгонухлеотидов. инкубировали с лиза-тами клеток е. сои дикого типа (ипд*), содержавши активную урацил-ДНК- гликозилазу. После инкубации с клеточным лизатом плазмидную ДНК .очщали и анализировали электрофорезом в 1.7* агарознои геле. Результаты электрофореза представлены на рисунке 2. Урацм-содержаиая плазшда, нв обработанная клеточным лизатом, присутствует в кольцевой и линейной форме (рис. 2;1). Присутствие линейной формы меченой ДНК мохет быть ре-

зультатои неполного хагеровавия, либо наличия шгазщд, кода-£Щ2рОЗаЕНЫХ ТОЛЬКО ПО ОДНОМУ "ДШКОИу" концу, которкэ Г2ГВ-руясь с олггонуклэопкоа III, остается лжзйныш.

Посла внкубацал с клеточкшш лазаташ кольцевые ЩНК в 2ШШ шшзкздц полностью переходили в лзкайную форау (рас 2; 3, 4), в то время как ка содержащая урацилов контрольная пдазиада сохранялась в виде кольца (рве 2; 2). Это било • ке-охвднным, т.к. прздполагалось, что ЩНК, в отличие от 2ШНК, дохла быть устойчива к линеаризация.

t¿i предположили, что причиной наблюдаемой лшааризацЕЗ ыотла бы быть чувствительность одконитзкя участков ДНК, образумься во вреия репарации ШИК шгазьяды, к присутствующим в клеточных лззатах нуклеазаа. В отличие от используеиой наш систеш бесклеточны1 лизатов, однонитевие участка ДНК в клетка, по-вадакоиу, защдакы специ4ическшш белкаш, обладакцши еисоким сродством к однонвтевым структурзи, например, таша как RecA ели ssb. Действительно, посла дсбавлонпя RecA белка, в реакционную спесь, двунатввоЗ разрыв наблодала только в случае 2ШШК плазивд (рас 2; 5), при этой ЩЩК плазада сохраняла кольцевую фориу (рис 2; 6).

.Ríe. 2. Авторадаогра^ся агарозного 12 3 b О электрофореза, тестирущего образование дгунотевых разрывов в ДНК плазшд после инкубации с клеточный лизатаки Г-— е. сои. С-яольцзвая форма ДНК.

У L-линейная форма ДНК; старты: 1-2U№

1,-шюв«9в > без инкубации с лизатои; 2-контрольная ДНК, инкубированая с лизатои; 3-ШНК, инкубированная с лизатоа; 4-211ДЕК, инкубированная с лизатои; 5-2ÜE®. поело инкубирования с лизагоы в прясутствии RecA-белка; 6-ЦДИК после инкубации с лизатои в присутствии RecA-белка (реакционная смесь содержала 2цМ RecA-белка). Инкубация плаз-ывдшх ДНК с лизатои проводилась в реакционной снеси, содержав 20 шм ЭДГА; 100 тМ трпс-HCi, pH 7.2; 0.5 мкг ДНК и клеточный лизат до 0.1 иг/ил по суммарному белку.

Анализ_образования_разрывов_в лизатах.

Слвдущш этапом нашей работы, было: проверить, что дву-нитевые разрывы; наблюдаемые в 21MHK, действительно, являются результатом репарационного действия урацпл-ДНХ-гликозилазы, а es активности несаецифичесгаи нуклеаз. С этой целью ш инкубировали 2ШНК с клеточными лизатама, приготов-

леннши ез штаыиов е. coi i, содеркащях sktsehjh (ипд ) или неактивную (una) урацил-ДЙК-гликозшгазу. После шжубацл с лизата;я плззмаднуп ДНК очищали и анализировали электрофорезом в 1,7" агарознои геле. Результаты электрофореза представлена на рисунке 3.

1 2 3 4 5 Рис. 3. Авторадаографм агарозного

электрофореза, тестирувгрго образование двунитевых разрывов в ДВК С- — <■» — плазшд после инкубации 2ШШ с

i клеточнши лизаташ штаииоз е. coi i

L гл.—ипд+ и ипд- кольцевая форна ДЕС,

L- линейная форма ДНК. Старта: 1-2ЦДНК без инкубации с клеточная лизатои; 2-инкубация с ипд лкзатом; 3- инкубация с ипд лизатои; 4-иаркер лшвйноЗ Форш плаззядтой ДНК; 5-иаркер кольцевой фори плазкяддой ДНК. Инкубация плазшдаях ДЙК с лизатои проводилась в реакцз-онной смеси, содержащей 20тм ЭДТА; 100тМ трас-нс1, ¡07.2: 0.5шсг ДНК и клеточный лязат до ОЛиг/ил по сукнзрнсау баллу.

Линеаризация кольцзвсЗ форки 2ШКК била полной после

пнкубацяз с лизатои из ипд+ итааиэ (рте 3: 2) и нв кабгзда-лась при инкубации с лизатои клеток из ипд' maesa е. coi i (рис 3¡ 3). Тагам образом, ш показали, что двунитевые разря-вы, нзблвдзеию в случае 2ШНК, возникают, благодаря удаления близкорасположенных остатков урзцалов урзцил-ДНК-гликозЕлззой в систеыэ бэсклзточзых лззатов.

.Уникальный сайт рестрикции зндонуклеззы asp7181 локализован в составе полилинкерной последовательности, следовательно, удаление остатков урацилов из 2ШНК приведет к образованию двуштевого разрыва, фланкированного прямнш повтора-ыи. Если двунитевой разрыв стимулирует образование делвций, то это долито приводить к восстановлению функции tet гена. Для проверки этого предположения кольцевые форш сконструированных ДЩС были отдалены от линейных электрофорезом в 1.7* агарозноа геле и использована для трансфорнации клеток е. coi i штамма ABII57 (w. t. ). Число трансформантов подсчитывало«, по количеству ашициллин-устойчивщ колоний и частота образования делеций ' определялась как число тетрациклин-устойчивых колоний на 100 трансфорнантов. • Данные пяти экспериментов суммированы в таблице 2.

Видно, что наличие двух оппозитных близкорасположенных остатков урацилов в плазмвдных ДНК более эффективно стщул-

pyei обра звание делеой по сравнении с контрольной ДНК или с плазюдой, содержащей только один урацил.

Таблица 2. Индукция образования делевдй в ДЭС плазмад после трансформации урадал-содергада плазюд в шташ! е. со а ЛВ1157

Трансфошрущая N зкспе- Число Ар1" рвкента колоний Часло Тс1 колоний Число Тс Екол. на 100 Аргкол.

Контрольная I 50 0 0

дня 2 300 3 1.0

3 350 I 0.29

4 740 3 0.4

5 270 I 0.37

да I 30 I 3.3

2 400 5 1.2

3 800 7 0.87

4 580 6 I.I

5 290 3 1.0

2ШНК I 42 8 19.0

2 400 37 9.2

3 600 63 10.5

4 920 130 14.1

. 5 200 18 9.0

Уровень образования дзлеций зависел от присутствия нор-изльно фуЕСцзонирупцей урацил-ДНК-гликозилазы и был на порядок кенына, когда плазиидаш, содэрзапдаз два оппозптныг урацяяа трансформировали ипд'штака е.соИ (таблица 3). '

Таблица 3. Образоваше деле дай при трансформации урацал-со-деркадаш шшаидяии иташюв е.соИ W3110(ung+) и BDI0(üng ).

Трансфовирущая К зкспе- Число tjF Число Тсг Число Тсг кал ДНЯ римента колоний колоши на 100 Арг кол

Контрольная ДНК

ыщ

tmg mg

ieo 2зо

390 190

ung

mg

<0.2 <0.2 0.26 <0.2

ШВК

2ДОНК

340 200 420 270

240 250 , 320 360

16 28

<0.3 <0.2 0.48 0.37

6.6 8.7

0.4

0.6 '

Итак, ш показали,что ипд- зависимая репарация остатков

урацилов, расположенных на расстояния 12 н.п. в оппозатных нитях ДНК приводит к образованию двугатевого разрыва, г.оторя4 ыогет стгяулпровать рэтайанацасзше события а залэряэется формированием делзцаи в плззгадной ДНК.

Hä поставили перед собой задачу, исследовать пэ только иехашзш возникновения двуитэтых разрезов в клзтка, но и B03H0ZH0CTE El реПЭрЗЦЯЯ! то есть, KSS31 образом и при учес-тзи продуктов каких генов клзтка способна воссозданять разорванные концы молекул, гсзсуси генетическую ЕвфорнацЕЮ. На данной этапе isa столкнулась с кзобходяюстьи некоторой шди £якацзи изгей модели гсследозангя. Дело з тоа, что пргпгра-тивяоз поучение урацил-содзргадах кольсввы1 шаязд, с использованием реакция гятарсвания и затеи препаративного электрофореза, является очень • трудоеккеЗ и нетеигаясгзчноа процедурой. Она еэ позволяет наработать достаточное кегле ство ДЗН для более детального генетического анализа, не говоря угэ о tcü, что такой способ очзеттш ДНК не позволяет полностью избавиться от срЕиеси лгнейзых молекул. Для получения -урацал-ссдэрзащх пжазыид га рэзар использовать птзш e.coü RZ 1032, коториЗ содержат в состагэ ДНК спонтанно встроенные урлезлн (2-14% остатхсз теееэ .завезены урацатаи), благодаря dut.ung генотипу (Warner et al.,1581).

_ з ЗУ.ЖСЗ_ gHKi__cogejrrsseft__СПСЗПЕЯНО__встрозтаые

Плазкяду рЯ4-165 трансформировала в стазд е. сои EZ-1032, пассировали в esu несколько поколений, контролируя фз-еотеп Ар+Тс~. Ээтс:! нарастали этот втака с р*С4-165 в уелмш-ях, обеспечиваюсь шнссешьноз количество згмзгзеяиЭ теззоз на урацяла (Earner et al.,1531 ),и выделили из него влазшдкув ДНК, со спонтанно встроенный уращшиа (ЦЯ4-165). Такую плазнидную ДНК анализировала в системе бесхяеточнах лизатоз.

На рисунке 4 представлены результата электрофореза урацаи-содерзавей ДНК, инкубированной с клеточный лизатааа бактерий разных штаиюв.

Прз репарации урацилов наблюдается исчезновение суперкольцевой форьы ЛПК в лизате бактерий дикого типа (рисЛ; 2). Прз увеличении времени инкубации ила количества дззата происходит развал ДНК на фрзпгенты с образованием "¡кейфа" по все-

цу гелэ, тогда как в лсзатах бактерий с да$ектаип по систем репараци ураяшюв (ипд ) и с дефекташ по репарация образуются при зтса АП-сайтов {xth ) сущестззтшх пзнэнзееЗ в ДЕИ ш пронсюдат (psc.4; 3, 4). Однако, есла урацал-содерхащую ДЗК обрабатывать совместно клзточеез лизатао ез ставки БОЮ (ипд") и Ш69 (xth"), то прсЕсхода "коииешзнтация" дефектов, приводящая к рзпарэдд урацилоз и, следовательно, к исчезнованию суперкольцевой форш плазьеда, как с г случаз птамаа дакого тша (рзс.4; 5). Контрольная плазшдная ДНК, кз содерзацая урацилоз, не претерпевает каких либо изыенений при инкубации ее с клеточные ллзатаыи (рис.4; 6).

Рис. 4. Анализ плазиздной ДНК, содержащей споптанко встроенные урацилы при обработке препарата ДНК лпзатаил клеток е.соИ злоктрофорззои б 1.7% агарознса гелз. S- позиция су-

перкольцевой форш плазызда; С-

П03ЯЦ0Я КОЛЬЦЕВОЙ форШ ПЛЗЗШ- .

дг, L- пазаз&л линейной форш плазщда; Н- позиция стартоЕ. Старты: 1- урацгл-содзрзацая pK4-I65 (UpK4-I65) без ннкуба-i№i цга с лизатшз: 2- UpK4-I65, обработанная лизатои клеток штакиа АВ1157 (*.t.); UpK4-i65, обработанная лззатоа кле-

ток итаии BDI 0 (ипд ):. 4- UpK4-Itö, обработанная лизатом кдзток втзиаа SA769 (xth ); 5- UpK4-I65, обработанная совместно лизаташ кдзток сташа BDI0 (ипд ) с ВАТ69 (xtfj ); 6-контрольная рК4-165, обработанная лазатей! клеток сташи АВ1157 (v.t.). . (Плазшдную щк инкубировали с пхлето<шшш лизаташ бактерий в течение 15 кгнут при 37 С; реакционная сжсь содержала 0.1 ют сушмрного белка на I юг шизиидной ДНК).

Вхияниа _¥2тзщй_ _ С5сс_п_хеь_на_в§лячпн2__фактора

SMegö.in.vivo.

В предадущх экспериментах ьы показали, что поведение плязшдн ЦрК4-165 .(плазшдной ДНК со спонтанно встроенными урацыаш) в системе клеточных лизатов принципиально не отличается от поведения сконструированной наш 2ШЗК| описанной выхе. Следовательно, такую плазшдную ДНК можно использовать в генетически экспериментах для изучения молекулярных механизмов репарации двунитевых разрывов. Так как в составе ДНК ыазкцн ЦрК4-165 твшны замецены на урацилы случайным образом по дюшв всей молекулы в обеил нитях то, очевидно, что

1 2 3 4 5 б.

урадан с рапкоЗ вероятностью попадут как в состгз гзка amp, так п в состав генз tet, в тем часлз п з пссг^азэтальнссть иазку npnssai погтсраи. При зксцизионнсй рзпарзщз блтзаэ-рзсполсзктпш сппозитных ypaijwoB, "зтодсзхся иеаду прггш повторги, ЕОЗЗШЕ8Т ДЕукитевой разрл, ЛлзшзрозЕсзЛ npniri-¡п повторам. На ухо показала, что возпютовзвиз двунвтевого разрыва ггеаду пряккз псзтсргья сяагуягрует образование дэгз-цзй по пржаи позторга, что тестируется фзиоташчзскп по восстановлении фуксгз tet reza. ' При сксц-зззстиса удзлгша урэ-цилоз,' расяолозеяых в другзг районах шиззднс! ыолекулы, toso будут появляться дзуштегга разрязн, готорнэ,- скорее всего, будут приводить к деградации пжз^гдаой ьялзкулы з клетке, так как на га концах пет протяганзях участков гс.гзло-гии. Об уровне этого процесса а шяза су,~тть косвенно,

по падзгая вцгзБзекостя Ц^4-165-тргна}ор:2роззккнх бактериальных клеток на среда, содергатЗ ампициллин, по сравнвнЕэ' с Еьютаеиостья бактериально® культура, трансфорлрсБЭЕнсЗ контрольной плазиздсЗ рГС4-165. Тагам образоа, ссзесвлиэ очевидна пзобюдаэсть норкзроввЕзя частоты газуцзровзпгах дэлецдй, возникащп при трансфертна различил птзидав бактериальных культур плазиадсЭ UpK4-I65, на частоту спонтанных рекочбшга-циЗ, тестирует по частоте появления тетрзцдклан-устойчпЕнх колоний, пря трзнсфсры^цпз тех rs нтаикз е. coi i контрольной плазнидой рК4-165. Таим образом m подсчитывали коэйицаент индукцги образования далец-зй пря репарзцгз спонтанно рясполо-ганных урацзлов в составе ДНК плазиады IJpK4-IG5 в каздеа из использованных штагаов е со.и.

Данные по трансфоргащи таппп плаз'-лдишга ДНК рззлтплх атгкяов е.соИ суисгрсЕаиы в таблице 4. Очевидно, что в клетках с норильно фугасцяокяруЕсзши системами репарации уроззкь индукции делецзй на порядок вниз, чем в клетках, дефвдитшг по урацил-ДНК-гликозал£ьз - ферменту, вырезапцеиу урацял из ДВК, а, следовательно, играющему ключевую роль в процессе образования двунитевых разрывов. В клетках с ипд генотнпоа коэффициент индукции приблизительно равен I, чего и следовало ошдать, т.к. в отсутствие урацал-ДШГ-гликозшгазы UpK4-I65 ев подвергается репарации, а нормально реплицируется, аналогично контрольной плазмиде ¿¿C4-I65. Об этом .свидетельствует, в час-

твости, так 18 в тот факт, что нв происходит падания выживаемости клеток этого. штаьыа, трансфорифсв анншс урацал- • содержащей плазшдой, по сравнению с трансформацией контрольной ДйК. Эта данккэ согласуются . с результаташ, полученншы нага в эксперимента! с сконструированвши плазмядшпи ДНК, содоржавдш 2 ошозитных урацила на расстоянии 12 н.п.

Таблица 4. Ендукция образования делефй при трансформации плазшдой ЦрК4-165 различных шташов е.сан.

Вташ {£4-165 ЦрМ-165 Козф.

---------------- ИНДУКЦИИ Е

Аргкд- тЛо- 1 Аргко- 1сгко- i Ui/i=K

ЛОШЙе ЛОНИЙ B/ipe ЛОНЯЙц ЛОНЕЙ ЦК/АРц

до5 н ноö хйР да но0

АВ1157 5.5 3 0.54 1.5 10 6.7 12.4

ОМ.) 15.0 10 0.7 3.5 52 14.9 21.3

2.9 5 1.7 0.9 18 20.0 11.8 15.50

9.1 5 0.55 3.0 37 12.3 18.3 ±3.356

3.4 4 1.17 1.3 21 16.0 13.8

ВОЮ 1.3 7 5.4 1.0 3 3.0 0.6

(дав ) 8.5 3 0.4 5.0 5 1.0 2.5

8.1 65 8.0 7.3 58 7.9 t.O .1.32

2.1 10 4.8 1.8 6 3.3 0.7 ±0.132

5.7 42 7.4 5.3 71 13.3 1.8

ВА769 4.4 3 0.7 0.9 5 5.6 8.0

(Ith") 2.8 3 1.1 2.0 15 7.5 6.8

1.3 15 11.5 0.7 42 60.0 5.2 .6.84

5.5 7 1.3 2.1 19 9.0 6.9 ±0.213

2.1 17 . 8.1 0.9 60 59.1 7.3

U649 2.2 55 25.0 1.1 98 89.1 3.6

(recBC ) 9.1 2 0.2 5.6 2 0.4 2.0

18.0 59 3.3 7.5 48 6.4 1.9 .2.82

v 0.9 21 23.3 0.5 41 82.0 3.5 ±0.134

0.5 1 2.0 0.5 3 6.2 3.1

V1293 1.6 29 18.1 0.7 17 24.3 1.3

(recBC 1.6 3 1.9 0.8 2 2.5 1.3 1,26

xth') 2.9 9 3.1 1.0 2 0.5 0.3 ±0.06

1.0 2 2.0 0.6 2 3.3 1.6

0.7 2 2.9 0.4 2 5.0 1.8

В клетках с xth генотипом наблюдается двукратное достоверное снижение коэффициента индукции образования далзций на фона падения выживаемости. Это свидетельствует о тон, что продукт гена xth - экзонуклваза III приникает участие не только в / процессе эксцизионной репарации урацилов, внося раз-

ч

ргш по кесту образуемся АП-сайтоз, но и в процессе- репарации co3B3xaES3z пра этсы деунзтевыi разрывов.

В2ЭДЗШ8 НуТЕЦЗИ recBrecC ESC!£3S3T ПОЧТЯ ЕЗСТЕфЗТЕСЭ достоперное кипение коэффициента шиукцст образования дзгэ-цнй по сравнения с кгатяага даого типа, и почтя з 2.5 раза достоверное снзгенгэ козф&гцзента сндугщз! по срзшжнта с xth

генотипом нэ фоле гналогачного падггзя el"2K3£i:oot.__Слздогл-

тельно, продукт генов гесвгесс .- ЕесЕС- нуклеаза, пессгшзино, прзяпкает участгэ з процессе рзпарацга дзунгтэгнх разраюз.

Пакояац, взедзнпэ двойной иутащз recoc.xth гпзводзт nosijrnneir: пндукци образовав двгац™1 из уровень такового 3 ILTTESI С ung геКОТЕПСУ, В KOTCpCJ ЕЗ ПРОИСХОДЯТ ЕЕРПЯЭШИ

уриптсв, п, следовательно, ест пгдузща дзугатгзях рязрнвев. Пра зтоа согрггхатся падеже Енпхгекэста, гн&шгсчнеэ тгкеау в случае кгздеЗ пз соответстЕулЕЯХ одзночных цгтасзЗ.

Элзктрофорзтпчвспгй анализ плэзщдных ДНК, гыдзлзпнше пз тетрэцшиин-устсачзгвьп кояонпй показал, что рсдарспя it тзтрэ-цззстн-рвзпстантпостз, ДЕйствательно, пронзо^ла в результате рег.оабинэцга , по прел-.! повторам п делзтЕроваыя одного из повторов и полггзяернсЗ последовательности кзгду гага. Бее плагкаот, содоржаг^з делэцеа, Епдусфсвашигз репарахтоннкнз собатенги, и в зкеперзгентах с 2UJШК п в зкеперщектах с Up''4-I65 присутствовал в ':снс^зрно2 фор-.та (рисунок 5), в то вре^я как спонтанно рэхс'йзкгроззвЕзе ялаетгка представляла пз себя даюрные форта (Dianov et al.,1991).

Ряс. 5. Апгпз ДН плазизд.в so-

l23H5 67 89j011jm

D-1А-

тернх врсззспдя дзлеции, эгзкт-рофорезоа з 13 агарозпеи гелз. S- позиция стартоз,. D- поезцзя дакерной супзрхольцевсЗ ijopia ШИБМЗДЫ, М- П03ЯС1Ч нонс1яркоа суперяольцэвой фотл! шизики Старты: 1-4: швзщгсгая ДНК, выделенная из спонтакго рэвертиро-вавгзх колоний ятгига ¿BII57 (яЛ.); 6-S: шизэдная ДНК, выделенная Тс -колоний, полученных при трансформации клеток E.aoli штаиыа ¿ВИ57 2ШНК; ДНК, выделенная из Т<г-колоний, полученных клеток E.coii сташа ABII57 плазкядой

10-13: плазмадная

пои трансформации _ . _ . ______

LfpK4-I65; 5- ионоиерная рЯ4-165 (маркер); 9- дигарная рК4-Г65

(иаркец).

каждой серии экспериментов с использованием 2ШНК и

плгклда Up-i-IK проаная^шрозакэ по 50 щдЕЕПдуаяьшх

препаратов пхаззщдсЗ ЕЕ, кдахзикрй вз ТсГ- колоее£ ¡¡наша E.coli АВ1157 (s.t.)

__SES

Ci^sssïD гзшиз позболзаЛ ésm Ерсддовать иагэкуллрзуэ юдаь образовав езлзцЗ 1 пра 1 репзрацга (З-таетргсаодт^шьи cnaoc2rnr.il повргздзка в бзятерЕэдьяоа клзтаз (рве. 6).

Ззсг^згоаная репарация бгазкоргсизлогашЕХ оппозатии: уратдаш npzBo^iT к образовании дзушлвЕото разрыва ДЕС (рз-суеоп 6; Л,Б) ПрадстЕвляатея Бзроятг-а, что кощаБыз участи roi. й2К, каслагЕгз в результате кбзтштсього psspsa, двз-5Д'сл навстречу spyr другу до toi пор, сока на протзвеполоз-Ш1 ватах еэ встретятся юяаивьвЕтарка псысздоват&гьноста вузелзотвдш. Ех e3£2joîs£ctes) прздаствуэт гсдракз одаЗ сз кггей в даунитзвой Ш, которой качнется в обопх концах дауижшого разрыва в 'J-Ъ! esi б^-эЛшправязЕзях (рнсунок 6: В).

Естрзчноз продгнгоЕаэ образугсзхса пра зтои одношггека участков ДШС прогемдст до тех пор, пока нз встретятся хотя Clî коротаю коагеаэнмрвыв участка п кз произойдет ех спара-важз. Гчйсти ютей, остаться клз спарзнного участка и образовавшийся кольцевой структуры, подвзргаются, очевидно, гидролизу. (рпс.б.Г). Репарационный сшггез дак в состава одко-ватевих бреизй в лигированге однонитевдх разрывов завершат образование молекулы с дзлецега по пряеы повторна (рисунок 6.Д).

Пра такой схема событий становится понятный влияние двойной мутавда recec.xth на величину фактора индукции образования тестируемых делвцийшо-видимому, продукт гена xth - зкзо-нуклзаза III осуществляет гидролиз одной из нитей на концах двунитевого разрыва в ^направлении, а продукт гена гвевс-KecBCD- нуклваза обеспечивает такой гидролиз в 5/-3/ направлении. Вероятно, обе этих реакции, взаимно дополняя друг друга , обеспечивают процесс "обитания" комплементарных последовательностей, необходимей для образования стабильного гетеро-дуплвкса в его поелвдуюцей репарации. Щи инактивации обеих

нуклеаз в случае двойка геевс.хы, образсггппз дву-

л^теЕ'Л рззрнвоз пря ргпарзг^з сппоттгшх урац^гст прс~сю,т.? за счет тщпа .Ш-гндсЕуялвазгых гг.тгвЕсстеЗ, срсутстзуг^зх в бактзрзально! вгэткз, та эта разрзя пэ могут г-^слтззго репзрироваться.

А. Б.

Г,'' 1 1

и

Б.

Г.

га

СЗ СП

э

д.

Ргс. 6. Схеца образования дзлецй в процессе репаргцш близкорасположенных ошозятных псврзздзЕнй ЦЩС.

ВЫВОДЯ

1. Показано, что иодфвсация остатков цятозинов 0-иетапидроксилашкоа п бисульфиоа натрзя в противолежащих участках даух нитей плазэдной ЛЕИ на порядок более эффективно стимулирует образование делений по сравнен® с иодафкаци-яна вдтозина в составе одной нити.

2. Показано, что появление ошозятннх урадаов в составе

гшзгадисй ДйК приводит к вознишовеиза • двунатевых разрывов.

3., Показано, что дзуштевые разрыва в плаззддной ДШС образуется в результате процесса одновременной эксцизиовной ргпарациз оппзгятаых урацвлов.

4. Показано, что клзчзвой стадой образования делена пра сидалавш близкорзсполоЕанннх оплота так повреждений в да (уращлов) является вознЕсковекгз дзритевого разрыва шад7 щж5да повторакз. ворЕроваиш делзцкй в процессе репарация дзуЕитевах разрывов ДИК происходят в результате вза-оядгйзтшя котш^зЕгарных последовательностей в состава приап повторов ка флангах разрывов.

5. Впервые показано, что ферк'зкта эксцйзеобной репарадзп, обычно оЗесаачшзанзз коррекции одкокитевых совреждзшй в ДНК, в условиях , появлзная близкорасположенных оппоззтнах поврездензЗ приводят к образована) делещЗ.

6. ECepBiie показано, что для образования даяецгй в процзссв рзпараца двуттеБнх разрывов ДНК лзобюдаго участие клеточшл зкзонукаеаззых активностей, гидролизущп одну из шггей ДНК, а шгзкио: знзонуклеазы III и КэсБСБ ,- звдэяуклеаза (зкзонуклзазы V).

CGEC0K РШЛ, ОПУ&ЛЙКОШШХ ПО TEJE ЩССЕРТЩИ

1. Даанов Г.Л., Васшзна Е.Д., Ошицдна О.И., Овчинникова Л. П., Салгакик Р.Е-. Уолекуляршз иелакизш возкашовения полных и козаичшх нутаций // Генетика. 1985. т.21. £8, С.-1253-1259.

2. Мапот G.L., Е.А. Vasymlna, L.P. Ovchinnlfcoya, O.I, Si-nitslna and R.I, Salganlk Tha molecular basis о 1 the origin ol coajlete sad Boealc mutants // Hutatloh Research. 1986. V.159. P.41-46.

3. Синодика О.П., фанов Г. Л., Салгашк Р.Е. Репарационная эксцизия противолежа ¡121 повреждений двух нитей ДНК вызывает двувитевае разрыва // ДАН. 1989. Т.306. И. C.2I4-2I7.

4. Dianov G.I., T.V. Tlmchenlco, 0.1. Slnltslna, A.V. Kuzml-noy, O.A. Kedvedev and E.I Salganlk Repair ol uracil residues closely spased on the opposite strands oi plasmid ША results In double-strand break and deletion formation II Mol G«n Genet.•1991. T.225. P.448-452.