Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Молекулярно-генетическое разнообразие и филогения пород и типов пушных зверей семейства Canidae

ВАК РФ 06.02.09, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое разнообразие и филогения пород и типов пушных зверей семейства Canidae"

На правах рукописи

ЛЕГКОБИТ АННА ПАВЛОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЛОГЕНИЯ ПОРОД И ТИПОВ ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ СЕМЕЙСТВА САГЧГОАЕ

06.02.09. - звероводство и охотоведение

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005061988

2 о г.:.?;! т

пос. Родники Московской обл. — 2013

005061988

Работа выполнена в ГНУ Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В А. Афанасьева Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ НИИПЗК Россельхозакадемии)

кандидат биологических наук Бекетов Сергей Валериевич

Столповский Юрий Анатольевич доктор биологических наук, ФГБУН Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН г. Москва, ведущий научный сотрудник

Козловский Юрий Евгеньевич

кандидат биологических наук, ФГБУ Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН г. Москва, зав. лабораторией молекулярной микроэволюции

ФГЪОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева»

Защита состоится «25» июня 2013г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.047.01 при ГНУ Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева Россельхозакадемии по адресу: 140143, Московская область, Раменский р-н, п. Родники, ул. Трудовая, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ НИИПЗК Россельхозакадемии

Автореферат разослан (0/у> мая 2013г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат сельскохозяйственных наук

Лоенко Наталья Николаевна

1.0БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Эффективное звероводство базируется на максимальном использовании потенциала пород и типов животных, полученных в процессе селекции. В настоящее время активное внедрение в животноводство высокопродуктивных пород и гибридов приводит к постепенному вытеснению их менее перспективных аналогов. Как крайние случаи, можно привести примеры, когда руководствуясь конъюнктурой рынка, в послевоенный период за рубежом почти полностью было уничтожено поголовье платиновых лисиц (Ильина Е.Д., Кузнецов Г.А., 1983), аналогично в 2008-2009 гг. в отечественных зверохозяйствах избавлялись от разведения песцов. При очевидных временных экономических преимуществах подобных процессов в целом происходит обеднение генофондов популяций сельскохозяйственных животных. И это при том, что отдельные породы, помимо своего хозяйственного значения являются источником уникальных генетических свойств, обладают устойчивостью к неблагоприятным условиям среды, повышенной выносливостью и высокой резистентностью к заболеваниям.

В связи с этим представляет интерес проблема молекулярно-генетической систематики и оценки биоразнообразия существующих и исчезающих пород пушных зверей.

Современные ДНК-технологии во многом позволили преодолеть недостатки использования морфологических признаков в решении ряда таксономических вопросов. Прежде всего, это связано с тем, что ДНК-маркеры генерируют огромные наборы дискретных признаков, не подвержены эндогенному влиянию и могут быть идентифицированы на любой стадии развития живого организма.

В ходе исследований повторяющихся последовательностей стало очевидно, что геном представляет собой сложную иерархию различных структурно-функциональных элементов, изменчивость которых имеет отличные друг от друга механизмы и разные фенотипические и микроэволюционные последствия. Иными словами анализ полиморфизма ДНК последовательностей к настоящему времени принципиально изменил положение в систематике животных (Гречко В.В.,2002, Банникова A.A., 2004).

Тем не менее, несмотря на активное развитие ДНК-технологий в животноводстве они еще не получили широкого распространения в изучении изменчивости пород и типов пушных зверей. В лучшем случае ДНК-методы используются в популяционном анализе и ветеринарной практике для диагностики инфекционных заболеваний.

Анализ научных публикаций показывает малую изученность полиморфизма ДНК промышленных популяций пушных зверей семейства

Canidae. До сих пор за редким исключением в основном исследовали лишь дикие формы пушных зверей семейства псовых Alopex lagopus h.,Vulpes vulpes L. и Nyctereutes procyonoides Gray (Stepniak et al., 2002; Dalen et al., 2004; Джикия EJI. и др., 2007; Плошница А.И. и др., 2007; Chunshan, Xiujuan, 2008). При этом отсутствуют какие-либо работы, устанавливающие филогенетические связи и уровень генетического разнообразия пород и типов лисиц, песцов и енотовидных собак между собой. Для сравнения аналогичные исследования на породах собак в количественном выражении измеряются десятками.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является исследование генетического разнообразия пушных зверей семейства Canidae, разводимых в зверохозяйствах, и установления межвидовой и межпородной степени родства с применением мультилокусных маркеров (RAPD - random amplified polimorphic DNA и ISSR - inter simple sequence repeats).

Для этого были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Провести сравнительный анализ полиморфных фрагментов, выявляемых с использованием RAPD- и ISSR-праймеров.

2. Оценить информативность спектров ампликонов ДНК, получаемых при использовании RAPD- и ISSR-маркеров.

3. Выявить получаемые в результате RAPD- и ISSR-анализа фрагменты, определяющие межвидовую и межпородную генетическую дифференциацию и связи.

4. Оптимизировать этап выделения ДНК из тканей мышц при использовании готовых наборов, путем сравнения метода высаливания с аналогичным методом, дополненным колоночной сорбцией.

5. По результатам RAPD- и ISSR-исследований установить филогенетические отношения на уровне вид, пород-тип лисиц, песцов и енотовидных собак, разводимых в зверохозяйствах Российской Федерации.

Научная новизна исследований. Впервые по данным молекулярного анализа генома (RAPD- и ISSR-методы) определены филогенетические связи основных пород и типов пушных зверей семейства Canidae, разводимых в отечественных зверохозяйствах. Рассмотрены особенности генетической дифференциации пород и типов лисиц, песцов и енотовидной собаки по полиморфизму мультилокусных фрагментов ДНК.

Практическая значимость. Подобраны наиболее информативные мультилокусные RAPD- и ISSR-праймеры, позволяющие проследить родственные отношения между видами и породами пушных зверей.

Полученные результаты дают возможность контролировать динамику генофондов пород пушных зверей семейства Canidae и способствовать сохранению их биоразнообразия.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Применение RAPD-маркеров в изучении генофондов пород пушных зверей семейства Canidae позволяет использовать их для установления видовой и породной принадлежности животных.

2. Генотипирование пород пушных зверей семейства Canidae с помощью ISSR-маркеров отражает популяционно-генетические взаимоотношения между группами животных на внутрипородном уровне.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на международной научно-практической конференции «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных», 2010 г., Краснодар; Международной конференции «Повышение интенсивности и конкурентоспособности отраслей животноводства», 2011 г., Республика Беларусь, Жодино.

Публикация результатов исследования. Основные результаты работы опубликованы в 3 научных статьях, в том числе 1 из них в журнале, рекомендованном ВАК России.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 106 страницах и включает введение, главы «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Оптимизация этапов ДНК-типирования», «Молекулярно-генетическое маркирование пород пушных зверей семейства Canidae», «Характеристика филогенетических отношений пород пушных зверей семейства Canidae», заключение, выводы, предложения производству, список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 15-ю таблицами, 21-им рисунком. Список литературы включает 121 публикацию, в том числе 93 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Сбор материала и формирование коллекции образцов

Научное исследование выполнялось с 2008 по 2011г.г. Работу проводили на 3 видах пушных зверей семейства псовых: лисице, песце и енотовидной собаке, включая 11 пород и типов лисиц, 2 породы песцов и одомашненную форму енотовидной собаки, разводимых в зверохозяйствах Российской Федерации.

Образцы мышечной ткани для анализа ДНК пушных зверей отбирали во время убоя (ноябрь-декабрь) на звероферме ЗАО «Малоярославецкое зверохо-зяйство» (Калужская обл.) — песец серебристый; в ОАО «Племенной

зверосовхоз «Салтыковский» (Московская обл.) - лисица серебристо-черная, беломордая, бургундская, коликотт, жемчужная, сапфировая; ОАО «Племенной завод «Пушкинский» (ФГУП «Русский соболь») (Московская обл.) - лисица серебристо-черная, огневка вятская, сиводушка, снежная, красная, песец вуалевый, енотовидная собака.

Первичную фиксацию и хранение биологических образцов проводили с использованием 96% этанола (Оа\узопе1а1., 1998). С этой целью от тушки животного ножницами отрезали кусочек двуглавой мышцы бедра (т. ЫсерзГетопз) и помещали в коническую пластиковую микропробирку с интегрированной крышкой типа «еррепс1огБ> объемом 1,5-2,0 мл, заполненную 96% этиловым спиртом. Затем, подготовленные и пронумерованные образцы в пробирках устанавливали на длительное хранение (по нашим данным до 3-х лет) в морозильную камеру при 1=-25°С.

Общая схема исследований образцов ДНК пород и типов пушных зверей семейства СапМае представлена на рисунке 1.

Рис.1. Общая схема исследований.

Выделение ДНК. ДНК для филогенетического анализа выделяли не менее чем из 5 индивидуальных образцов разных пород и типов пушных зверей семейства Canidae. Всего выделено и проанализировано 133 образца. Перед выделением ДНК мышечную ткань извлекали из пластиковой пробирки, промывали дистиллированной водой, измельчали скальпелем и проводили ряд последовательных процедур, описанных в протоколе выделения ДНК для набора Diatom™ DNA Prep 200.

Кроме реагента Diatom DNA Prep 200 для выделения ДНК использовали набор AxyPrep™ Multisource Genomic DNA Miniprep Kit, специально разработанный для экстракции ДНК из тканей животных.

Считается, что в этом наборе за счёт двухфазной технологии высаливания-сорбции ДНК эффективно отделяется от протеинов, пигментов, углеводородов и липидов, не фрагментируется, может достигать размеров более 30 т.п.о. и подходит для целого ряда рутинных методов исследования.

К полученному объему водного раствора выделенной ДНК добавляли 1/10 часть калий ацетатного буфера и 2 части 96% этилового спирта. Переведенная «под спирт» ДНК при t=-25°C может храниться, по нашим данным, до 3-х лет

Амплификация ДНК. Принимая во внимание преимущества ПЦР-технологии в плане доступности и меньшей трудоемкости, мы остановили свой выбор на методах ПЦР-анализа: RAPD и ISSR.

В ходе RAPD-анализа для амплификации и последующего выявления полиморфизма ДНК пород и типов пушных зверей использовали праймеры ранее подобранные другими авторами (St^pniak et al., 2002) — OPG-04: AGCGNGTCTG, OPG-07: GAACCTGCGG, OPG-17: ACGACCGACA, M-9: CTCACCGTCC, M-15: GACGGATCAG, а также праймер OPE-4: GTGACATGCC.

ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 100 нг ДНК-матрицы, 0,25 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCI2, 0,3 ед. ДНК Taq-полимеразы в соответствующем 1х буфере и 0,5-1,0 мкМ праймера.

RAPD-PCR амплификацию проводили по программе, описанной Атиензаром с сотрудниками (2000) (Atienzar et al., 2000) с предварительной денатурацией - 4 мин (95°С) в режиме: денатурация - 1 мин при 95°С, отжиг праймера - 1 мин при 50°С, элонгация ДНК - 1 мин при 74°С, число циклов 3639, конечная элонгация ДНК - 10 мин при 74°С.

Метод ISSR-PCR применяли с использованием праймеров (AG)?C и (GA)9C к микросателлитным локусам (ТС)„ и (СТ)„ как участкам отжига (Глазко, 2009). Амплификацию проводили в следующем режиме: начальная денатурация - 2 мин при 94-95°С, денатурация 30 секунд при 94 °С, отжиг 30 с

при 55°С, элонгация ДНК - 2 мин при 72°С, число циклов 35-37, завершающая элонгация ДНК - 7-10 минут при 72°С. Количество циклов амплификации -35-37.

Разделение и детекция продуктов реакции. Присутствие ампликонов детектировали электрофоретическим разделением.

Продукты RAPD-PCR реакции фракционировали по размеру в 1,7% агарозном геле с добавлением бромида этидия. Размер фрагментов ДНК определяли путем сравнения их подвижности с маркером молекулярных размеров GeneRuler lkb DNA Ladder (MBI Fermentas).

Фракционирование продуктов амплификации ISSR-анализа проводили в 2%-ом агарозном геле в течение 100-110 мин. при напряжении 120 В, с использованием маркера молекулярных масс GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas). После электрофореза гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в коротковолновом УФ-свете цифровым фотоаппаратом.

Статистическая обработка данных. В работе использовали стандартные биометрические методы кластерного анализа. Дивергенцию видов и пород семейства Canidae проводили на основе мер генетических расстояний с использованием евклидовой метрики (Евклидова дистанция).

Для количественной оценки RAPD и ISSR-полиморфизма и определения уровня дивергенции между анализируемыми объектами полученные данные представляли в виде матрицы состояний бинарных признаков. Наличие или отсутствие в RAPD- и ISSR-спектрах одинаковых по размеру ампликонов рассматривали как состояния 1 и 0, соответственно.

Исходя из полученной матрицы, с использованием невзвешенного парно-группового метода с арифметическим усреднением UPGMA (Unweighted Pair-Group Methods) (Sokal, Sneath, 1963) была построена дендрограмма, отражающая степень различий между RAPD-спектрами исследуемых образцов.

Кластерный метод NJ (Neighbor-Joining) (Saitou, Nei, 1987) — ближайшего связывания или одиночной связи оказался наиболее приемлемым для разбиения исходной совокупности матричных объектов, полученных по результатам спектров ISSR-анализа.

Все вычислительные операции проводили с использованием пакета программ Excel Microsoft и STATISTICA.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Оптимизация этапа выделения ДНК

Принимая во внимание эффективность выделения ДНК методами высаливания и высаливания-сорбции, мы остановили свой выбор на наборах

реагентов Diatom™ DNA Prep 200 ООО «Лаборатория Изоген» (Россия) и АхуРгер™ Multisource Genomic DNA Miniprep Kit компании Axygen (США).

Реакции с участием нуклеиновых кислот требуют необходимого количества и чистоты препарата. В нашем случае для определения концентрации двуцепочечной нуклеиновой кислоты в растворе использовали спектрофотометрический метод (Спирин A.C., 1958; Tataurov et al., 2008) прибор Nano Photometer Pearl UV/Vis SDRAM фирмы Implen (Германия).

Выделенные образцы нуклеиновых кислот могут содержать примеси белков и других органических веществ. Отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (А2бо/28о) используют для оценки чистоты препарата от примесей белков и фенола, которые могут давать значительные погрешности при измерении концентрации нуклеиновых кислот. Чистая ДНК имеет соотношение А26о/28о порядка 1,8-2,2 (Glasel, 1995; Sambrook, Russell, 2001).

Поглощение на длине волны 230 нм может быть вызвано загрязнениями фенолятами, тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для чистого образца ДНК отношение А2бодзо не должно существенно превышать 1,8 (Glasel, 1995).

Таблица 1. Средние значения концентрации и чистоты ДНК из мышцы лисиц породы огневка вятская.___

Набор для выделения ДНК п Концентрация выделенной ДНК (ng/Ц» А2бс/А28о А26о/А2зо

Diatom™ 17 25,18+3,430 1,98+0,074 0,03+0,003

АхуРгер™ 12 28,63+1,723 1,83+0,061 0,04+0,007*

Примечание: предельные значения А26о/А28о~1,8-2,2; AWA230 ~1,8, *р<0,05

Как следует из данных таблицы 1 различия по концентрации ДНК и ее чистоте от загрязнения белком при использовании наборов Diatom™ и АхуРгер™ недостоверны, в то время как загрязнение другими органическими соединениями достоверно ниже при использовании Diatom™ t=2,189, р<0,05), но в данном случае это не столь существенно, так как предельное значение по этому показателю не должно превышать значение 1,8.

Помимо спектрометрического анализа дополнительно проводили электрофоретическую проверку чистоты и степени деградации тотальной ДНК. Несмотря на то, что геномная ДНК в отличие от плазмидной и фаговой всегда дает шлейф из фрагментов разного размера, при использовании набора АхуРгер™ он практически полностью отсутствовал, и наблюдался лишь при применении набора Diatom™ (рис. 2).

Рис. 2. Определение качества выделенной ДНК методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. 1 -3 - образцы ДНК, выделенной набором АхуРгер™; 4-6 -образцы ДНК, выделенной набором Diatom™; М - маркер.

Согласно шкале, предложенной Амосом и Хельцелем (Amos, Hoelzel, 1991) (рис. 3) ДНК пушных зверей, экстрагированная с помощью набора АхуРгер™, как правило, оценивали 1-2 баллом, а выделенная набором Diatom™ в некоторых случаях характеризовалась значительным уровнем деградации.

14.0 КЬ-

8.0 Kb-

4

I

0.2 Kb-

Рис. 3. Балльная шкала для оценки качества и количества выделенной ДНК (Amos, Hoelzel, 1991): 1 - не деградированная ДНК с высоким молекулярным весом, 2 - ДНК с небольшой деградацией и высоким весом, 3 - деградированная ДНК с высоким весом, 4 - ДНК с высоким уровнем деградации, 5 - полностью деградированная ДНК, 6 - отсутствие ДНК.

По результатам подбора методов выделения тотальной ДНК можно отметить, что применение готовых наборов значительно экономит время, и обеспечивает безопасность работы по сравнению с классическим фенол-хлороформным способом.

При этом как отечественный набор, основанный на принципе высаливания, так и зарубежный - с использованием дополнительной абсорбционной колонки по степени очистки отличались между собой не существенно, но со значительным преимуществом по снижению уровня деградации выделенной ДНК при использовании набора АхуРгер™.

3.2. Молекулярно-генетическое маркирование пород пушных зверей семейства Саш(1ае

Для ПАРО маркирования пород пушных зверей семейства СапИае, в результате предварительного анализа, было отобрано 6 праймеров, позволяющих детектировать достаточно высокий уровень межвидового полиморфизма (табл. 2). Минимальное и максимальное число полиморфных фрагментов, в зависимости от использованного праймера, составило 11 (праймеры ОРС-04 и М-15) и 21 (праймер ОРС-07), соответственно. Размер ампликонов варьировал в пределах от 250 н.п. до 1750 н.п. В качестве примера на рисунке 4 представлена фореграмма спектров ампликонов, выявляемых праймером ОРв-07.

Таблица 2. Количество амплифицированных фрагментов и уровень общего полиморфизма, выявляемые с помощью использованных КАРБ праймеров у пород пушных зверей семейства Сашс1ае

КАРЭ праймер Последовательность праймера Число фрагментов спектра Число полиморфных фрагментов Уровень выявленного полиморфизма, (%)

ОРС-07 ОААССТОСОО 21 18 85,7

М-9 СТСАССйТСС 15 12 80,0

ОРС-04 АОСОТСТСТО 11 11 100,0

ОРЕ-4 ОТСАСАТССС 13 12 92,3

М-15 ОАСООАТСАО 11 9 81,8

ОРО-17 АСОАССйАСА 13 12 92,3

ВСЕГО 6 83 74 88,8

Общий уровень полиморфизма, обнаруживаемый с помощью выбранных праймеров, достаточно высокий и составляет 88,8%. При этом из 83 RAPD-фрагментов 6 являются мономорфными, т.е. присутствуют в спектрах всех анализируемых пород - это праймеры OPG-07 размером 312, 439 и 1250 н.п., М-9 (500, 815 н.п.) и OPG-17 (500 н.п.). По-видимому, эти фрагменты можно считать специфичными маркерами для совокупности рассматриваемых видов.

Рис. 4. RAPD спектр, полученный с праймером OPG-07. Лисицы: 1 -сиводушка, 2 - коликотт, 3 - платиновая, 4 - беломордая, 5 - красная, 6 -сапфировая, 7 - бургундская, 8 - огневка вятская, 9 -жемчужная, 10 - снежная, 11 - серебристо-черная, 12 - серебристо-черная; песцы: 13 - серебристый, 14 -вуалевый, 15 - енотовидная собака. K-отрицательный контроль, М-маркер lkb DNA Ladder.

Кроме того, при использовании праймера OPG-07 в структуре надвидовых фрагментов были дополнительно детектированы специфичные RAPD-фрагменты общие для лисиц и песцов величиной 500 н.п. и по праймеру OPG-04 ампликоны размером 312, 340 и 406 н.п.

Помимо надвидовых RAPD-фрагментов определены также уникальные видовые фрагменты для лисиц - праймер ОРЕ-4 (406 н.п.), песцов - OPG-07 (300 н.п.); М-9 (1700 н.п.) и енотовидной собаки OPG-07 (1750 н.п.), М-9 (680 н.п.), ОРЕ-4 (680 н.п.); OPG-17 (421 н.п.).

Наиболее высокий уровень внутривидового полиморфизма характерен для Vulpes vulpes L. - 83,3%. Следом за лисицей по величине внутривидового полиморфизма следует Alopex lagopus L. (66,7%). Оценить уровень внутривидового полиморфизма для енотовидной собаки не представляется возможным,

т. к. вид представлен выборкой из одной популяции, мономорфной по используемым ЯАРО-маркерам.

Примечательно также, что при сравнении видов между собой, полиморфные ДНК-фрагменты, выявляемые с помощью шести вышеуказанных ЯАРБ-праймеров, были обнаружены у всех рассматриваемых видов пушных зверей.

Для маркирования генома представителей семейства Сашс1ае с помощью 18811 маркеров было отобрано два праймера. Детектируемый с их помощью совокупный полиморфизм у лисиц, песцов и енотовидной собаки составил 100,0 %. Данные по количеству полиморфных фрагментов представлены в таблице 3. Размеры ампликонов находились в пределах 200-1200 н.п.

Таблица 3. Количество амплифицированных фрагментов и уровень общего полиморфизма, выявляемые с помощью использованных КвЫ праймеров у пушных зверей семейства Сатйае_

Последователь- Число фрагментов спектра Число полиморфных фрагментов Уровень поли-

праймер ность праймера морфизма (%)

к локусу (ТС)п (АО)9С 27 27 100,0

к локусу (СТ)п (ОА)9С 23 23 100,0

ВСЕГО 2 50 50 100,0

Как и в случае использования НАРО-маркеров, наиболее высокий уровень внутривидового полиморфизма зафиксирован для лисиц УЫрея \ulpes (82,0%). Для песцов внутривидовая изменчивость, выявляемая с помощью 188Я-праймеров, была ниже значений, полученных для этого же вида с помощью КАРО-метода и составила 32,0%, с наименьшим уровнем полиморфизма у енотовидной собаки — 20,0%.

Наличие внутрипородного полиморфизма по ДНК-фрагментам 18811 профилей наблюдали у 6 пород и типов лисиц из 9 рассматриваемых, в то время как по данным ЯАРО-профилей данных различий вообще не обнаружили. При использовании 188И.-праймеров (Ав)9С и (ОА)9С у лисиц красной, беломордой и платиновой не было выявлено различающихся компонентов. Наибольший уровень полиморфизма отмечали у сапфировой - 18,0% и жемчужной лисицы -16,0%, наименьший у огневки вятской - 2,0% и снежной - 4,0%.

В частности на фореграмме (рис. 5) можно видеть внутрипородный полиморфизм выявляемый с помощью праймера (ОА)9С.

Рис. 5. ISSR спектр, полученный с праймером (GA)9C: 1-2-лисица снежная, 3-5-песец серебристый, 6-9-лисица жемчужная, K-отрицательный контроль, М-маркер 50bp DNA Ladder.

В ходе проведенного анализа не было выявлено специфических надвидовых фрагментов, однако удалось выявить несколько уникальных фрагментов, которые могут служить видовыми маркерами. Например, с помощью праймера (AG)9C определены общие уникальные фрагменты для двух видов: песцов Alopex lagopus L. (610 н.п.) и енотовидной собаки Nyctereutes procyonoides Gray (710 н.п., 850 н.п.). Кроме того, с помощью указанного праймера удалось обнаружить также несколько породоспецифичных фрагментов у жемчужной лисицы (520 н.п., 720 н.п., 1000 н.п., 1200 н.п.).

У пород песца наибольшей изменчивостью характеризовался серебристый песец (уровень полиморфизма - 20,0%) в отличие от вуалевого - 2,0%. Внутрипородный полиморфизм у енотовидной собаки оказался близок к полиморфизму у серебристого песца и составил 16,0%.

Таким образом, несмотря на большее количество используемых праймеров, RAPD-спектры характеризуются меньшей разрешающей способностью по сравнению с ампликонами, полученными с помощью ISSR-праймеров, и не позволяют произвести оценку изменчивости рассматриваемых видов на уровне порода-тип.

3.3. Характеристика филогенетических отношений пород пушных зверей семейства Сашс1ае

Сходство и различия изученных пород и типов пушных зверей семейства псовых оценивали в нашей работе по ДНК-фрагментам, выявленным в ходе ЯАРЭ- и 188Я-анализа.

На основании данных, полученных в результате КАРО-маркирования отдельных видов и пород, были рассчитаны коэффициенты попарного сходства, которые затем использовались для построения филогенетической дендрограммы методом невзвешенного парно-группового метода с арифметическим усреднением (иРвМА).

На построенной с помощью иРОМА-метода дендрограмме (рис. 6) выявляются четыре крупных кластера. Один из них образован енотовидной собакой, три других — песцами и лисицами.

В свою очередь каждый из этих четырех крупных кластеров, за исключением енотовидной собаки, состоит из нескольких клад. Одна из них объединяет серебристого и вуалевого песцов, вторая - серебристо-черную лисицу и огневку, третья — беломордую, снежную и платиновую лисицу, четвертая -лисицу сапфировую, коликотт, бургундскую и красную, пятая клада — жемчужную лисицу и сиводушку.

Величина расстояния объединения между видами согласно иРвМА-дереву при сравнении енотовидной собаки с песцом и лисицей составила 6,3 и между песцом и лисицей - 5,5.

При межпородном сравнении лисиц наибольшее сходство по КАРБ-фрагментам наблюдается внутри клад между красной и бургундской лисицей -2,8, наименьшее между серебристо-черной лисицей и огневкой вятской — 4,5. У песцов расстояние объединения между серебристой и вуалевой породами составило 4,0.

На дендрограмме, построенной по результатам 18811-анализа (рис. 7) по методу ближайшего связывания, четко выделяются два субкластера. Первый образует енотовидная собака, второй включает породы и типы лисиц и песцов.

Важно отметить, что, несмотря на различную группировку внутри ветвей, некоторые кластеры соответствуют таковым на дендрограмме, ранее построенной по результатам ИАРО-анализа с использование иРвМА-метода. Например, серебристый песец оказался в одной кладе с вуалевым песцом, серебристо-черная лисица с огневкой вятской. В то же время, в отличие от дендрограммы, построенной по данным КАРО-спсктров, самостоятельный кластер сформировали лисицы красная и коликотт, и отдельный - сиводушка.

Гч)

о

Енотовидная собака Песец серебристый Песец вуалевый Лисица серебристо-черная Лисица огневка вятская Лисица беломордая Лисица снежная Лисица платиновая Лисица сапфировая Лисица бургундская Лисица красная Лисица коликотт Лисица жемчужная Лисица сиводушка

я *х>

я 8 к о

55

?! ® 1 * 1 >8 -3

о й

и ф р

•ч

го я

Я л

я о ■ч о

о §

ь

ю

Р

я о тз о

ы я н я а о ш я

Е я и-X

Расстояние объединения

ТЭ

о »

п> Я! О

ч

(Я Р

О

р

я

я о о н ■о о

Енотовидная собака Енотовидная собака Енотовидная собака Песец вуалевый Песец вуалевый Песец серебристый Песец серебристый Песец серебристый Лисица коликотт Лисица красная Лисица жемчужная Лисица жемчужная Лисица жемчужная Лисица сапфир Лисица сапфир Лисица сапфир Лисица сапфир Лисица снежная Лисица снежная Лисица серебристо-черная (Салтыковский) Лисица серебристо-черная (Салтыковский) Лисица серебристо-черная (Салтыковский) Лисица серебристо-черная (Пушкинский) Лисица серебристо-черная (Пушкинский) Лисица серебристо-черная (Пушкинский) Лисица огневка Лисица огневка Лисица бургундская Лисица платиновая Лисица беломордая Лисица сиводушка Лисица сиводушка Лисица сиводушка

Р

я Р О о

я о

Уровень видовых различий по величине сходства между енотовидной собакой и совместно песцом с лисицей, образующими единый видовой кластер, составил 3,45. Межпородная генетическая дистанция серебристой и вуалевой пород песца - 2,6.

При этом расстояние между отдельными особями в популяции вуалевого песца находилось в пределах 1,0, а у серебристого песца от 2,2 до 2,6. Еще больший внутрипопуляционный размах дистанций наблюдается в популяции жемчужной лисицы - от 1,0 до 2,6 и в популяциях лисицы сапфир и сиводушки -от 1,4 до 2,2.

Примечательно, что результаты анализа ^БЯ-спектров в целом подтверждают молекулярную систематику рассматриваемых видов, согласно которой песец образует общий кластер с лисицей (Масс1опа1с1, 2001; Лапа П. и др., 2009) (рис. 8).

85

100

- А1орех Iадориэ

- \Zulpes vuIpes

- А/ус/егеи/ез ргосуопоШез Сат'з Ьрив

СаЫэ IатШапэ

- игзиэ атепсапиэ

0.01

Рис. 8. Филогенетическое древо, построенное N1 методом (Лапа П. и др., 2009).

При этом данные ЯАРО-анализа в большей степени согласуются с морфологической систематикой, где песец считается единственным членом рода А1орех, и не группируется с другими лисицами в роду УЫреэ.

Безусловно, полученные данные охватывают далеко не полный перечень известных пород и типов пушных зверей семейства псовых разводимых в неволе. Тем не менее, в ходе проведенной работы удалось выявить родственные отношения пород пушных зверей на молекулярном уровне, в целом совпадающие с их генетической классификацией (табл. 4).

Таблица 4. Генетическая классификация пород и типов лисиц (Колдаева Е.М., 2004)

Генотип Наименование типа окраски волосяного покрова

Рецессивная мутация красной окраски

ЪЬ Серебристо-черная

Рецессивные мутации черной окраски

ьъ^ Бургундская

ЪЪрр Жемчужная

ЬЬее Коликотт

Доминантные мутации черной окраски

Беломордая

ЪЪ»Л* Платиновая

ЪЪ Снежная (грузинская белая)

Комбинативные типы окраски

ЬЬррзз Сапфировая

Как следует из представленной таблицы, рассматриваемые нами породы и типы лисиц, которые ведут свое происхождение от серебристо-черной лисицы можно разбить на три группы. При этом, если породы и типы, объединяемые в группу «Доминантные мутации черной окраски», близкородственны (изменчивость в пределах одного доминантного аллеля), то породы группы «Рецессивные мутации черной окраски» отличаются по рецессивному гомозиготному гену. Помимо этого в работе анализировали лисицу красной окраски (генетическая формула ААВВ), сиводушку (ААВЬ) и огневку вятскую, при создании которой проводилось вводное скрещивание с серебристо-черной лисицей.

Однако если филогенетическая схема по ИАРП-анализу, практически полностью совпадает с существующей генетической классификацией (табл. 4), то результаты кластеризации, по данным 18811-анализа, вступают с ней в некоторое противоречие.

Скорее всего, выявленные различия между деревьями, полученными с помощью 18811- и ЯАРП-маркеров можно объяснить спецификой участков генома, детектируемых этими методами.

Выводы

1. Впервые на объектах пушного звероводства (породы и типы пушных зверей семейства Canidae) проведен молекулярно-филогенетический анализ. По результатам исследования установлено, что RAPD- и ISSR-маркеры проявляют различную разрешающую способность. В частности, общий уровень полиморфизма, обнаруживаемый с использованиемЯАРБ-праймеров составил 88,8% и ISSR-праймеров - 100,0%.

2. С учетом внутривидовой и внутрипородной (типовой) оценки информативности ампликонов RAPD-анализ предпочтителен для изучения таксономических связей на уровне вид, порода-тип, в то время как ISSR-метод целесообразно применять, для проведения популяционных исследований пушных зверей семейства Canidae.

3. По данным RAPD-анализа специфичными для всех рассматриваемых видов пушных зверей являются фрагменты: OPG-07 (312, 439 и 1250 н.п.), М-9 (500, 815 н.п.) и OPG-17 (500 н.п.), для лисиц и песцов: OPG-07 (500 h.n.),OPG-04 (312, 340 и 406 н.п.).

Уникальными RAPD-фрагментами для лисиц являются: ОРЕ-4 (406 н.п.), песцов: OPG-07 (300 н.п.) и М-9 (1700 н.п.), енотовидной собаки: OPG-07 (1750 н.п.), М-9 (680 н.п.), ОРЕ-4 (680 н п.), OPG-17 (421 н.п.).

Уникальными ISSR-фрагментамидля песцов являются (AG)9C (610 н.п.), енотовидной собаки - (AG)9C (710 н.п., 850 н.п.), жемчужной лисицы- (AG)9C (520 н.п., 720 н.п., 1000 н.п., 1200 н.п.).

4. Филогения видов ( Vulpes vulpes L., Alopex lagopus Ь.и Nyctereutes procyonoides Gray), установленная по результатам мультилокусного анализа (RAPD и ISSR-метод) в целом согласуется с данными морфологической и молекулярной систематики, а кластеризация пород и типов пушных зверей семейства Canidae, проведенная по данным RAPD-анализа, преимущественно совпадает с их генетической классификацией.

5. В ходе оптимизации этапа выделения ДНК установлено, что дополнительное использование экстракционной колонки в методе высаливания-сорбции не влияет на концентрацию и степень очистки ДНК, однако снижает степень ее деградации.

Предложения производству

Использование предлагаемого набора RAPD-праймеров: OPG-04, OPG-07, OPG-17, М-9, М-15, ОРЕ-4 позволит в дальнейшем идентифицировать отдельные породы и типы пушных зверей семейства Canidae и прогнозировать их некоторые хозяйственно-полезные признаки; применение ISSR-праймеров: (AG)9C и (GA)9C применение рекомендуется для проведения популяционно-генетических исследований.

Полученный в работе материал может быть использован в учебном процессе для характеристики представителей семейства Сашс1ае.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Легкобит А.П. ДНК-методы и перспектива их использования в звероводстве. / Легкобит А.П., Бекетов C.B. // Кролиководство и звероводство. - 2010. - № 3. - С. 22-24.

2. Легкобит А.П. Праймеры для ПЦР-анализа пород лисиц и песцов. / Легкобит А.П., Бекетов C.B. // Сборник трудов: Межд. конференции. «Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных». — Краснодар, 2010. — С. 8-9.

3. Легкобит А.П. RAPD и ISSR методы в выявлении полиморфизма ДНК промышленных популяций пушных зверей семейства псовых / Легкобит А.П., Бекетов C.B. // Тезисы докладов: Межд. конференции. «Повышение интенсивности и конкурентоспособности отраслей животноводства». -Жодино.: РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по животноводству», 2011. - С. 104-106.

Подписано в печать:

22.05.2013

Заказ № 8539 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Легкобит, Анна Павловна, пос. Родники Московской обл.

ГНУ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПУШНОГО ЗВЕРОВОДСТВА И КРОЛИКОВОДСТВА ИМЕНИ В.А. АФАНАСЬЕВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

042П11ЛП27І

На правах рукописи

ЛЕГКОБИТ АННА ПАВЛОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЛОГЕНИЯ ПОРОД И ТИПОВ ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ СЕМЕЙСТВА СА1ЧГОАЕ

Специальность 06.02.09 - звероводство и охотоведение

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Бекетов Сергей Валериевич,

кандидат биологических наук

пос. Родники Московской обл. -2013

Оглавление

Стр.

Введение........................................................................................4

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................7

1.1. Пушное звероводство - как самостоятельная отрасль животноводства..............................................................................7

1.2. Проблемы систематики семейства псовых (Сашёае)............................10

1.3. Молекулярно-генетическое разнообразие и филогения

пушных зверей...............................................................................19

1.4. Исследование генома животных с помощью молекулярных

маркеров.......................................................................................24

1.4.1. ЯБЬР и УШП-методы..............................................................28

1.4.2. Методы, основанные на РСЯ-реакции..........................................32

1.4.2.1. ЯАРО анализ........................................................................33

1.4.2.2. БТЯи ЗТЭ-маркирование........................................................34

1.4.2.3. маркеры.......................................................................37

1.5. Картирование генома и полиморфизм структурных

генов сельскохозяйственных животных................................................38

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................44

2.1. Сбор материала и создание коллекции образцов..............................44

2.2. Выделение ДНК........................................................................46

2.3. Амплификация ДНК и детекция продуктов реакции...........................49

2.4. Статистическая обработка данных.................................................50

ГЛАВА 3. ОПТИМИЗАЦИЯ ЭТАПОВ ДНК-ТИПИРОВАНИЯ..................52

3.1. Подбор методов выделения ДНК...................................................52

3.2. Критерии выбора ДНК-методов для молекулярно-филогенетического анализа.........................................................................................60

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ МАРКИРОВАНИЕ ПОРОД ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ СЕМЕЙСТВА САЫГОАЕ.......................................68

4.1. Молекулярное маркирование пород пушных зверей семейства Сапісіае методом ИАРО-анализа....................................................................68

4.2. Молекулярное маркирование пород пушных зверей семейства Сапісіае методом 188Я-анализа......................................................................71

4.3. Обсуждение...............................................................................76

ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ ПОРОД ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ СЕМЕЙСТВА САЫГОАЕ......................................................................................80

5.1. Определение филогенетического сходства пород и типов пушных зверей семейства Сапісіае по данным КАРЭ- и ^БЯ-анализов..............................80

5.2. Обсуждение...............................................................................84

Заключение....................................................................................90

Выводы.........................................................................................92

Предложения производству...............................................................93

Список литературы..........................................................................94

ВВЕДЕНИЕ

Эффективное звероводство базируется на максимальном использовании потенциала пород животных, полученных в процессе селекции. В настоящее время активное внедрение в животноводство высокопродуктивных пород и гибридов приводит к постепенному вытеснению их менее перспективных аналогов. Как крайний случай, можно привести пример, когда руководствуясь временной конъюнктурой рынка, некоторые зверохозяйства в 2008-2009 гг. полностью избавлялись от разведения песцов. При очевидных временных экономических преимуществах подобных процессов в целом происходит обеднение генофондов популяций сельскохозяйственных животных. И это при том, что местные породы являются источником уникальных генетических свойств, обладают устойчивостью к неблагоприятным условиям среды, повышенной выносливостью и высокой резистентностью к заболеваниям.

В связи с этим представляет интерес проблема молекулярно-генетической систематики и оценки биоразнообразия существующих и исчезающих пород пушных зверей.

Очень важно, что при использовании ДНК маркеров отпадает необходимость ожидания определенной стадии онтогенеза для отбора толерантных генотипов животных, при этом достаточно небольшого количества генетического материала.

В настоящее время полиморфные последовательности ДНК применяют для маркирования генов и отдельных участков хромосом. Широкое распространение ДНК-маркеры получили также в области молекулярно-генетического картирования геномов различных животных, оценки уровня генетического полиморфизма, при генотипировании особей, линий, популяций, видов. Использование ДНК-технологий во многом позволило преодолеть недостатки метода белковых маркеров в решении ряда таксономических вопросов и отдельных задач селекции. Прежде всего, это связано с тем, что ДНК-маркеры не подвержены эндогенному влиянию и могут быть идентифицированы на любой стадии развития живого организма.

В результате точечных мутаций, вставок, делеций или инверсий гомологичные последовательности ДНК у разных индивидов могут различаться по одному или нескольким основаниям. Такие последовательности ДНК называются полиморфными, а само явление гетерогенности нуклеотидного состава — полиморфизмом ДНК.

Всего в геноме биологических организмов выделяют три типа последовательностей ДНК: 1.) уникальные, представленные всего лишь одной или несколькими копиями на геном; 2.) умеренно повторяющиеся последовательности, насчитывающие от нескольких десятков до нескольких сотен копий, среди которых имеются как кодирующие, так и некодирующие последовательности; 3.) частые повторы, представленные многими сотнями или даже тысячами копий. При этом размер генома может варьировать у разных видов в достаточно широких пределах (Гриф, 1999).

Благодаря развитию исследований повторяющихся последовательностей стало очевидно, что геном представляет собой сложную иерархию различных структурно-функциональных элементов. Полиморфизм отдельных таких элементов имеет отличные друг от друга механизмы и разные фенотипические и микроэволюционные последствия. То есть, анализ полиморфизма ДНК последовательностей к настоящему времени принципиально изменил положение в популяционной генетике и систематике животных.

Тем не менее, несмотря на активное развитие ДНК-технологий они еще не получили широкого распространения в селекции и разведении пушных зверей. В лучшем случае ДНК-методы используются в ветеринарии для диагностики инфекционных заболеваний, например, алеутской болезни норок.

Актуальность и новизна исследования Анализ научных публикаций показывает малую изученность полиморфизма ДНК промышленных популяций пушных зверей семейства Canidae. До сих пор за редким исключением в основном исследовали лишь дикие формы пушных зверей семейства псовых Alopex lagopus L.,Vulpes vulpes L. и Nyctereutes procyonoides Gray (Stepniak et al., 2002; Dalen et al., 2004; Джикия

и др., 2007; Плошница и др., 2007; Chunshan, Xiujuan, 2008). При этом отсутствуют какие-либо работы, устанавливающие филогенетические связи и уровень генетического разнообразия пород и типов лисиц, песцов и енотовидных собак между собой. Для сравнения аналогичные исследования на породах собак в количественном выражении измеряются десятками.

Цель исследования

Целью настоящей работы является исследование генетического разнообразия пушных зверей семейства Canidae, разводимых в зверохозяйствах, и установление межвидовой и межпородной степени родства с применением мультилокусных маркеров (RAPD - random amplified polimorphic DNA и ISSR -inter simple sequence repeats).

Задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ полиморфных фрагментов, выявляемых с использованием RAPD- и ISSR-праймеров.

2. Оценить информативность спектров ампликонов ДНК, получаемых при использовании RAPD- и ISSR-маркеров.

3. Выявить получаемые в результате RAPD- и ISSR-анализа фрагменты, определяющие межвидовую и межпородную генетическую дифференциацию и связи.

4. Оптимизировать этап выделения ДНК из тканей мышц при использовании готовых наборов, путем сравнения метода высаливания с аналогичным методом, дополненным колоночной сорбцией.

5. По результатам RAPD- и ISSR-исследований установить филогенетические отношения на уровне вид, пород-тип лисиц, песцов и енотовидных собак, разводимых в зверохозяйствах Российской Федерации.

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Пушное звероводство - как самостоятельная отрасль

животноводства

Известно, что подавляющее большинство сельскохозяйственных животных человек начал интенсивно одомашнивать в период «неолитической революции» (X-III тыс. лет до н. э.). Так, овцы и собаки были одомашнены около 12 тыс., лошади - 6 тыс. и северный олень - 2-3 тыс. лет назад. В то время как коммерческое разведение пушных зверей возникло только на рубеже XIX-XX вв. Не исключено, что некоторые виды пушных животных попали под одомашнивание еще в неолите или более поздний срок, но в дальнейшем были утрачены. Правда, хозяйственное значение они имели совсем иное, скорее всего их использовали в пищу (Хлебович, 1987).

Современное пушное звероводство является узкоспециализированной отраслью животноводства, преимущественно ориентированной на производство меховой продукции. Главное направление в селекции пушных зверей - создание таких цветовых вариаций окраски меха, которые больше всего ценятся на рынке.

Во всем мире на промышленных зверофермах помимо хищников: хорьков, куниц, скунсов, енотов и енотовидных собак, разводят грызунов: нутрий, шиншилл, бобров, ондатр. Предпринимаются попытки одомашнивания речной выдры, калана, колонка, рыси. Однако основными объектами звероводства традиционно являются четыре вида хищников - это представители семейства псовых (Canidae): лисица (Vulpes vulpes L.), песец (Alopex lagopus L.) и два вида семейства куньих (Mustelidae): норка (Mustela vison Sehr.) и соболь (Martes zibellina L.).

В результате разведения в неволе пушные звери во многом утратили первоначальные географические признаки своих диких предков. У одомашненных видов в основном изменились те показатели, которые связаны с качеством и количеством основной продукции звероводства - шкуркой. Прежде

всего, это окраска меха, размеры тела и плодовитость. Исходя из параметра -окраска меха, наибольшей степенью доместикации характеризуется американская норка. На сегодняшний день в мире зарегистрировано несколько десятков пород и породных типов цветных лисиц и песцов, две породы у соболя. Однако по сравнению с другими видами пушных зверей изменчивость по окраске меха достигает наибольшего максимума у американской норки - более чем 200 различных цветовых типов.

Основная причина такого разнообразия с одной стороны связана с уменьшением пресса естественного отбора, который в природе постоянно элиминирует признаки, отличные от стабильного фенотипа. С другой, жестким искусственным отбором ценных мутантных форм и подбором соответствующих родительских пар при разведении.

Что касается размера тела, то этот показатель в значительной степени определяет площадь шкурки, от чего зависит ее стоимостная ценность. У лисиц и песцов оценку размера проводят по длине тела, измеряемой от кончика носа до корня хвоста, у норок - по длине тела или живой массе, у соболей по живой массе (Ильина, Кузнецов, 1983). Так как оценка по живой массе зависит от упитанности зверя, и, следовательно, менее точна.

Наследуемость длины тела у пушных зверей достаточно высока. Так, коэффициент наследуемости к у норки варьирует в пределах от 0,46 до 0,96 (Ильина, Кузнецов, 1983), соболя 0,28-0,78, песца 0,19-0,50, лисицы 0,22-0,49 (Колдаева, 2004). В целом размер основных видов пушных зверей за период их клеточного разведения увеличился на 25-35%. В меньшей степени увеличение размера тела сказалось на соболе, т. к. при разведении этого зверька первоначально использовали небольшие по размеру, но ценные по окраске географические типы: баргузинский, енисейский и амурский. В то время как самые крупные особи характерны для популяций соболя Урала и Камчатки (табл. 1).

Более консервативным признаком оказалась плодовитость. Фактически установлено, что массовый отбор по плодовитости, широко применяющийся в

звероводстве дает небольшой эффект. С другой стороны, если бы плодовитость не была наследственно обусловленной, селекция на отбор племенного молодняка от наиболее продуктивных самок, вряд ли дала бы реальные результаты. Очевидно также, что немаловажную роль в увеличении плодовитости пушных зверей сыграло кормление. В частности, недостаточное или неполноценное кормление в период подготовки к гону способствует развитию меньшего числа фолликулов, а во время беременности гибели части эмбрионов.

Таблица 1. Достижения в селекции пушных зверей

Виды зверей Длина тела, см Плодовитость Половая зрелость, мес. Период использования, лет

Дикая форма Домашн. форма Дикая форма Домашн. форма

Лисица 50-90 >124 4-5 5-6 9-11 5-6

Песец 45-75 >113 5-8 8-12 9-11 3-4

Норка 31-60 >95 4-5 5-6 9-10 2-4

Соболь 35-56 >58 2-4 3-4 16-28 10-12

Анатомическое сравнение диких и клеточных лисиц и песцов показало, что у зверей, разводимых в неволе (как и у других сельскохозяйственных животных) возник ряд изменений. В частности, по сравнению с их дикими сородичами уменьшился объем мозга. У одомашненной норки исчезла адаптация сердечной мышцы к нырянию, появились различия в ткани трубчатых костей у диких и домашних лисиц, норок и соболей. В результате доместикации изменились поведенческие реакции: у большинства животных, содержащихся на фермах, исчез резко выраженный оборонительный рефлекс на приближение человека, оказалось стертым территориальное поведение, клетки разделены только сетчатой перегородкой или расположены очень близко друг к другу (Ильина, Соболев, 1990).

В то же время мы не можем назвать хищных пушных зверей, содержащихся на фермах, полностью домашними. Для них в полной мере характерен такой важный признак, отличающий диких животных от домашних, как моноцикличность, т. е. размножение один раз в год, в строго определенный, наиболее благоприятный для этого сезон. В то время как домашним животным присуще либо отсутствие приуроченности рождения детенышей к строго определенному сезону, либо характерна полицикличность с возможностью размножения два и более раз в году. В связи с этим пушных зверей следует считать все же не домашними, а пока еще только одомашненными видами.

1.2. Проблемы систематики семейства псовых (СапШае)

Основная задача систематики состоит в том, чтобы систематическое положение каждого животного соответствовало его эволюционному происхождению. В классической систематике положение вида (или другого таксона) в системе базируется преимущественно на морфологических особенностях животных: размерах, пропорциях черепа, строении зубов, размерах и окраске тела.

С развитием генетики и биохимии, появлением новых, более совершенных и точных методов исследований появилась возможность использовать признаки, которые могут не иметь внешних проявлений, например, изменчивость определенных участков ДНК. Использование таких признаков позволяет уточнять и изменять положение животных в системе живых организмов, поскольку появилась возможность более точно реконструировать происхождение различных групп и изменять ранг таксонов.

Несмотря на то, что в последнее время наблюдается тенденция к ревизии системы живых организмов, в частности с целью поиска не монофилетических (произошедших от разных предков) групп и их расформирование, что недавно произошло в систематике ластоногих.

Тем не менее, до сих пор в современной систематике в качестве базовой основы принято признавать существование, прежде всего, монофилетических (произошедших от одного предка) таксонов, т.е. включающих всех известных потомков гипотетического ближайшего предка, общего только для членов этой группы и ни для кого другого.

Что же касается происхождения псовых, то считается, что около 50 млн. лет назад от общего ствола миацид отделилось семейство амфиционид, или медведесобак. Среди них были первые крупные животные из числа настоящих xHiiiHbix(Agusti, Anton, 2002).

Уже в конце олигоцена существовала группа амфиционид, включавшая абсолютно хищные формы. В раннем миоцене ряды суперхищных амфиционид значительно расширились за счет таких новых форм, как Pseudocyon sansaniensis. Этот достаточно крупный амфиционид (120-130 кг) имел узкие моляры, плохо приспособленные для дробления костей. Другой представитель этого рода, P. caucasicus, также был суперхищным амфиционидом, потерявшим премоляры, но обладающий узкими, режущими хищническими зубами.

В конце раннего миоцена абсолютно хищным стал Agnotherium grivense, крупный амфиционид, до 170 кг весом. У этого вида также развились хищнические зубы, специально приспособл�