Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ филогении жуков семейства Coccinellidae

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ филогении жуков семейства Coccinellidae"

на правах рукописи

Паленко Мария Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФИЛОГЕНИИ ЖУКОВ СЕМЕЙСТВА

COCCINELLIDAE

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004 год

Работа выполнена в Группе генетической инженерии животных Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Муха Д. В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Митрофанов В. Г.

Кандидат биологических наук Гришаева Т.М.

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита состоится"_"_2004 г. в "_" часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991 ГСП-1, Москва, ул. Губкина, д. 3. Факс: (095)132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.

Вавилова РАН.

Автореферат разослан"_"_2004 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Полухина Г.Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Интерес к проблеме происхождения, филогенетических взаимоотношений, видового состава жуков семейства Coccinellidae обусловлен их значительным фенотипическим разнообразием и высокой географической изменчивостью. Многие виды божьих' коровок проявляют полиморфизм по окраске и рисунку на надкрыльях и переднеспинке, и существуют многочисленные данные о зависимости структуры популяций этих видов от экологических условий обитания. В то же время систематика, основанная на сравнении морфологических признаков, для многих видов кокцинеллид затруднена [Добржанский, 1924].

Нет единой точки зрения на таксономический статус видов и географических форм рода Adalia [Лусис, 1973], в частности, формы Adalia bipunctata fasciatopunctata Fald., которая обитает совместно с Adalia bipunctata bipunctata в западной части Забайкалья, Туве и Монголии. В Туве доля божьих коровок с фенотипом fasciatopunctata составляет 50%-57%, в Монголии - до 75%. В ряде работ эта форма рассматривается как самостоятельный вид [Савойская,1983; Bielawski, 1975; Шарова, 1962], в других как подвид или географическая раса (морфа) [Кузнецов, 1993; Лусис, 1973]. До настоящего времени не была исследована возможность использования молекулярно-генетических методов при изучении центрально-азиатских адалий, отличающихся от европейских окраской надкрылий и переднеспинки.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей в

последнее время приобретает все большее распространение и

признание в качестве метода для уточнения статуса групп, положение и

родство которых трудно установить на основании морфологических

данных. Наиболее часто в целях молекулярной систематики видов

насекомых исследуются области рибосомного кластера (NTS, ITS1, ITS2)

и митохондриальные гены, эволюционирующие с высокой скоростью.

Использование в качестве эволюционного маркера мтДНК позволяет

количественно оценить с т reije-Rft6cM3iUipaao6iWHHpi ти д у

БИБЛИОТЕКА

09 т^^ЛгПА 1

родственными видами при изучении нуклеотидных последовательностей. Вместе с тем, на вопрос, какая степень различий между популяциями соответствует их принадлежности к одному виду, а какая - к разным видам, филогенетический анализ не всегда может дать однозначный ответ. В этом случае филогенетический анализ должен быть дополнен сравнительной генетикой вида [Алтухов, 2003]. В рамках данной работы представлялось целесообразным в первую очередь определить степень дивергенции мтДНК между видами семейства Coccinellidae, а также в пределах рода Adalia. Для определения генетических дистанций по исследуемому молекулярно-генетическому маркеру различия между видами в пределах рода должны быть соизмеримы с различиями между популяциями в пределах вида [Алтухов, 2003]. Кроме того, определение генетических дистанций между видами • и построение филогенетических деревьев, к сожалению, не позволяет определить конкретные механизмы, лежащие в основе эволюционного процесса. В рамках диссертационной работы нами была сделана попытка проведения такого исследования на основе анализа эволюционной изменчивости кластера рибосомных генов.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении филогенетических связей внутри семейства Coccinellidae на основе использования участка митохондриального гена (310 пар нуклеотидов),- кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы, в частности, сравнение тувинских божьих коровок Adalia bipunctata fasciatopunctata и европейских коровок Adalia bipunctata bipunctata на молекулярно-генетическом уровне.

В задачи входило:

1) Амплификация, клонирование и секвенирование фрагмента гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы десяти видов (7 родов) кокцинеллид, с целью получения информации о степени вариабельности исследуемого участка мтДНК;

2) Проведение филогенетического анализа для определения генетических дистанций между видами семейства Coccinellidae: Harmonia axyridis Pall., Adalia bipunctata L.., Adalia decempunctata L,

Coccinella quinquepunctata L, Coccinella transverso guttata Fald., Coccinella septempunctata L, Semiadalianotata Laich., Hippodamia tredecimpunctata L, Exochomus quadripustulatus L, Thea vigintiduopunctata L

3) Амплификация, клонирование и секвенирование фрагмента гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы Adalia bipunctata, с целью получения информации о степени внутрипопуляционной вариабельности исследуемого участка мтДНК.

4) Анализ эволюционной изменчивости рДНК, включающей ITS1, 5.8S и ITS2, у нескольких видов кокцинеллид.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей участка гена субъединицы I цитохромоксидазы десяти видов божьих коровок (7 родов). Впервые показана возможность использования нуклеотидных последовательностей мтДНК для изучения филогении божьих коровок (Coccinellidae). Охарактеризована изменчивость исследуемой мтДНК, нуклеотидный состав, определены генетические дистанции между десятью видами божьих коровок, построены филогенетические деревья на основе матриц нуклеотидной изменчивости мтДНК и изменчивости аминокислот в белке цитохромоксидазы I. Для трех видов (Harmonia axyridis, Adalia decempunctata, Coccinella transversoguttata) установлены значения дивергенции мтДНК между особями из географически удаленных популяций.

Проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 3' - области гена, кодирующего субъединицу 1 цитохромоксидазы у представителей Adalia bipunctata L, имеющих различную окраску переднеспинки и надкрылий, из географически удаленных популяций (Тува, Италия). Результаты работы позволяют понять эволюционные процессы видообразования божьих коровок, исследовать микроэволюционные процессы, то есть относительно недавние события дивергенции на межпопуляционном уровне. Полученные сведения могут быть использованы для дальнейшего

изучения филогенетических связей видов кокцинеллид, в том числе подвидов Adalia bipunctata L, имеющих спорный таксономический статус.

В работе также проведено сравнение длины участка рДНК, включающего нуклеотидные последовательности ITS1, 5.8S, ITS2. Выявлен генетический мономорфизм исследуемого признака в пределах вида и сальтационный характер изменчивости при сравнении рДНК различных видов семейства Coccinellidae.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на конкурсе молодых ученых, Москва, 2001 г.; конкурсе молодых ученых, Москва, 2003 г.; 2-ой коференции МОГиС "Актуальные проблемы генетики", Москва, 2003 г.; конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетики, Киев, 2003 г.

Структура и объем диссертации. Публикации. Диссертация состоит из шести разделов: введение и обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение, выводы, список использованной литературы, приложение. Работа изложена на 91 страницах, иллюстрирована 17 рисунками, и содержит 6 таблиц. Библиография -97 источников зарубежных и отечественных авторов.

По теме диссертационной работы опубликовано 3 печатных работы.

Работа выполнена в сотрудничестве с лабораторией профессора Захарова И. А. (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН), при финансовой поддержке программы поддержки научных школ (фант НШ-827.2003.4).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В данной работе были использованы кокцинеллиды разных видов: Harmonia axyridis Pall. (1 особь, Сибирь), Adalia decempunctata L (1 особь, Болгария), Coccinella quinquepunctata L (1 особь, Москва), Coccinella transversoguttata Fald. (2 особи, Тува), Coccinella septempunctata L. (1 особь, Кавказ), Semiadalia notata Laich. (1 особь, Москва), Hippodamia tredecimpunctata L. (1 особь, Санкт-Петербург),

Exochomus quadripustulatus L. (1 особь, Крым), Thea vigintiduopunctata L (1 особь, Киргизия).

В популяционный анализ Adalia bipunctata были включены девять особей из итальянской популяции, 15 особей Adalia bipunctata из Тувы, одна особь из Санкт-Петербурга, одна особь из Болгарии.

Выделение тотальной ДНК из божьих коровок проводили согласно стандартной методике с обработкой лизата протеиназой К и последующей экстракцией ДНК смесью фенол-хлороформ [Маниатис, Фрич, Сзмбрук., 1984].

Фрагменты (310 п.н.) гена субъединицы I цитохромоксидазы исследуемых кокцинеллид были амплифицированы с помощью специфичных праймеров UEA9 и UEA10 [Juan, 1996], клонированы в клетках штамма Escherichia coli XL2-Blue с помощью векторной плазмиды pGEM®-T Easy Vector ("Promega", США) исеквенированы. Секвенирование проводили ручным и автоматическим способами. Было использовано несколько клонов на каждый вид.

В работе использованы компьютерные базы данных и Internet-ресурсы, размещенные на сервере NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Программу анализа нуклеотидных последовательностей BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) использовали для поиска сходства исследуемых последовательностей с последовательностями, размещенными в международных базах данных. Также были- использованы в работе последовательности Harmonia axyridis Pall., Adalia bipunctata L, Adalia decempunctata L, полученные из базы данных GenBank.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей мтДНК проведен с помощью программы MEGA V2.1 [Kumar et. al., 2001].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Анализ первичной структуры 3'-области гена субъединицы цитохромоксидазы десяти видов кокцинеллид.

Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагмента гена субъединицы I цитохромоксидазы десяти видов кокцинеллид показало,

что доля вариабельных сайтов исследуемой области мтДНК составляет 40% (рис. 1). Данный участок характеризуется значительным накоплением мутаций в третьем положении кодонов (70% от количества вариабельных сайтов). Нами был рассмотрен нуклеотидный состав секвенированного участка мтДНК для десяти видов божьих коровок. Распределение нуклеотидов участка гена субъединицы I цитохромоксидазы в трех положениях кодонов у всех изученных видов имеет сходную картину. Доля нуклеотидов А/Т (среднее значение) составляет 72,6% от общего количества, а доля G/C значительно меньше - 27,4%. Распределение нуклеотидов в трех положениях кодонов представлено в таблице 1, а также представлено графически на рисунке 2.

С использованием компьютерного анализа установлены генетические дистанции между десятью видами божьих коровок методом оценки р-расстояний (таблица 2). Оценка дивергенции участка гена субъединицы I цитохромоксидазы показала, что нуклеотидная изменчивость исследуемой мтДНК варьирует следующим образом: внутривидовая от 0,6% до 1,3%, межвидовая от 7% до 10%, межродовая от 10% (между представителями трибы Coccinellini) до 21% (между представителями разных триб).

Аминокислотная изменчивость части белка субъединицы I цитохромоксидазы составляет: внутривидовая от 0 до 1% замен, межвидовая от 3% до 8% замен, межродовая внутри трибы Coccinellini достигает 16% замен (табл. 3, рис. 3).

Нуклеотидная изменчивость, исследуемого участка мтДНК примерно сходна с вариабельностью гена субъединицы I цитохромоксидазы видов из других семейств жуков: межвидовая дивергенция последовательностей субъединицы I цитохромоксидазы гораздо ниже межродовой, которая варьирует в разных семействах жесткокрылых (отряд Coleoptera) от 12% до 18%. Внутри родов минимальные значения были отмечены между близкородственными видами - 1% для рода Denonectes (Dytiscidae) [Ribera et al., 2001], рода Tetraopes (Cerambycidae) [Farrel, 2001], 1,3% для Cicindela (Cicindelidae) [Vogler, DeSalle, 1993], а максимальные значения достигали 16%.

1.Harmonía axyridis GTA AAC CTA ACA TTT TTT CCT CAA CAC TTC TTA GGA CTA AGA GGG ATA CCT CGA CGA TAC TCT GAT TAT CCT GAT-75

... T.. • AT

■ AT

• AT ..T ...

• AT

. .A ... . .c ..A.C . .c

1.Harmonía axyridis 2 .Harmonía axyridis* 3.Adalia bipunctata 4 .Adalia decempunctata

5.Adalia decempunctata*

6.COCcinella quinquepunctata l.C. transversoguttata

8.C. transversoguttata i.Coccinella septempunctata 10.Semiadalía nota ta

11.Hippodamia tredecimpunctata

12.Exochomus quadripustulatus

13.Thea vigintiduopunctata

GCT TAT TAC AAA TGA AAT AAA ATT TCT TCT ATC GGA TCT ATA ATT TCC TCT ATT AGA ATA ATC TTT ATA ATC TTA-1S0

..T ,T. . .T .TG ..T .TG ... ,T.

■T .T. .7 .T.

... .T. ..T .T. ..T .T.

• CT TTT C ,TT .T.

G .

G G

. .T . .T . .T . .T . .T . .T , ,T . .T ..T

. .T . .T

. .T T.A.....A

..T T.A ..T ..A

..T T.A ..T ..A

..T T.. ..A ..A

..T T.. ..T ..A

..II.......A

G.. T.C ..T ..A

..T ..C ..T A.A ..T.....G ..A

T.......A A.A

A . .C T.C ..T . .A

. .A T.A

G.T T.A . G.T ..A . G.T ..A . G. . C.A . G. . T.A . C.. T.A . G. . ..T . . .C T.A . ..T T.A . . .T ..TA T G. . T.A A

A T A .

.......-150

. T.A A.T-150 . T.A A.C-150 . T.A A.C-150 . T.A A.T-150 . C.A A.T-150 . C.A A.T-150 . C.A A.T-150 . T.A A.T-150 . ..A A.C-150 T T.A A. .-150 . T.A A.T-150

1.Harmonía axyridis ATT ATT TGA CAA AGA TTT TAT TCA ATA CGT TTA AGA AAG TTT AAT TCT AAT GTA CCC TCT TTA ATT GAA TGA CTT-22S

2.Harmonía axyridis* ............................................................ ...............-225

3.Adalia bipunctata ...................T. . .T.....A ... .C. ..A.......A. ... A.. ..A ... C.............A-225

i. Adalia decempunctata ...................T. . .T T.. ..A C.. .C. ..A.......A. ... A.. . ,T ... C...........T.A-225

5.Adalia deceirpunctata* ...................T. . .T T.. ..A C.. .C. . .A.......A. ...A.. . ,T ... C...........T.A-22S

6.Coccinella quinquepunctata .............................A A.......A.......A. ... A.G ,.T A..............T..-22S

l.C. transversoguttata ..............T..............A A.......A.......T. ... A.C ..TA..............T..-225

8.C. transversoguttata ..............T..............A A.......A.......T. ... A.C ..TA..............T..-225

9.CoccineJJa septempunctata .............................A A.......A.......A. ... A.G . .T A..............T..-22S

10-SeroiadaJia nota ta ....................C........A A.......A.......TA ... A.C ..T.................C-225

11.Hippodamia tredecimpunctata.............................A A.......A.....C .TA ... A.C . .T ..A...............-225

12. Exochomus guadripustulatus ... C............ A.A.....T .CT . ,A A.T .AT TTA AA. ... AA. ...A.. . .T...............A.A-225

13. Thea vigintiduopunctata .......................T.....A A.T.....A C.........CG A.. ..A...............A.A-225

X.Harmonía axyridls

2.Harmonía axyxldie

3.Adalia bípunctata

i. Adalia decempunc ta ta 5 .Adalia decempunccata*

6. CoccinelXa qulnqucpunc ta ta

7.C. transvereogvittata

8.C. transversoguttata

Э.CoccinelXa septernpunctata 10.Semladalla nota ta

11.Hippcxlamia tredeciiopunctata

12.Bxochomua quadrlpustulatus 13 .Thea vlgintiduopunctata

T.A ..C ... T.A ..A ..C T.A ..A ..C T.A AG. . .A . .1

..A AG......

'..A AG......

..C AG......

T.A . .C.....

T.A . .C . .A .. ■ T TCA AT. ... AT .. T.A.....С ..

..С

..С .. . -С . .

AGA AGA AGA

. . AGA • C AG.

. .T . .T . -T

CAA CTT TCT CCT CCT AAT GAA CAT TCT TAT TCA GAA GTA ССА АТС TTA GCT CAA AAA TTC TAA TAT GGC AGA TTA-300

........................' ...-300

T.A AT......................-300

T.A AT......................-300

T.A ATG.....................-300

A. . AT......................-300

... AT. ...,...................-300

... AT. ... '..................-300

. . AT......................-"300

T.C TCC.....................-300

T.C TC......................-300

A.. TT......................-300

. . . TCT.....................-300

A.T А.С А.С A.T А.С А.С А.С A.T А.С A..

. .T . .T ..T . .T . .T . .T . .T . .c

. .A . .A . .A . .T . .T С . .T T.A

1 GTG CAT TGG А-310

2 ... ... "... .-310

3 ... .......-310

4 .......-310

5 ... .......-310

Б ... .......-310

7 ... ... >.. .-310

8 ... .......-310

9 ... .......-310

10 ... .......-310

11 ... .......-310

12 . . . .......-310

13 .......-310

Рисунок 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагмента гена, кодирующего субъединицу 1 цитохромоксидазы десяти видов жуков семейства Coccinellidae. Для двух видов использованы нуклеотидные последовательности, полученные из базы данных GenBank (для Harmonía axyridis*, регистрационный номер AF515054; для Adalia decempunctata*, регистрационный номер AJ312061). Точками обозначены идентичные нуклеотиды.

оо

Таблица 1. Нуклеотидный состав (в процентах) участка гена субъединицы I цитохромоксидазы в трех положениях кодонов у десяти видов кокцинеллид.

А Т в С

1 31,8 36,5 14,2 17,5

2 26,9 37,0 15,6 20,5

3 43,6 41,9 3,6 10,9

46 4Й

3»

ЗО

га

А1 Т1 С! в| А2 Т2 С2 С2 А» ТЗ СЗ <53

Рис. 2. Нуклеотидный состав участка гена субъединицы I цитохромоксидазы в трех положениях кодонов у десяти видов кокцинеллид.

Реконструкция филогении десяти видов божьих коровок.

Сравнение нуклеотидных последовательностей мтДНК позволило отразить филогенетические связи кокцинеллид (рис. 4, 5). Филогенетические схемы родства божьих коровок, показанные на рисунке 4 и рисунке 5, в целом соответствуют древу, построенному на основании морфо-экологических критериев [М^егиэ, 1994], а также совпадают с дендрограммой, полученной в результате сравнения первичной структуры !ТБ1 кокцинеллид [БсИЫепЬигд е1 а1., 2001]. Изученная нами последовательность оказалась хорошим маркером на уровне подсемейств, представленных как родами, близкими морфологически и генетически, так и дальними родами. Так, практически не существует четких морфологических признаков, отделяющих роды 8вт1ада11а и Ч1рродат1а. Результаты анализа молекулярно-генетических данных четко дифференцируют эти таксоны. Тем не менее

Таблица 2. Оценка нуклсотидиых различий участка гена субъединицы 1 цитохромоксидазы, выраженная в р -расстояниях (отношение наблюдаемого числа замен к общему числу нукпеотидов в исследуемом участке гена).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1. Напиопга ахуг1<Ив

2. н. ахуг1<Ив* •• ' 0 013 -

3. А(1аИа Ырипсгага 0 148 0 148

4. А. decempunctata 0 174 0 171 0 071

5. А. йесетрипааСа* 0 181 0 177 0 077 0 006

6. СосслпеНа quln¡Juepunctata 0 152 0 155 0 132 0 139 0 139

7. СоссхпеНа traпsversoguttata 0 158 0 161 0 152 0 155 0 165 0 100

В. Сосс1пе11а transverвoguttata 0 155 0 158 0 14 8 0 158 0 168 0 100 0 006

9. С0СС1пе11а septempunctata 0 168 0 171 0 171 0 165 0. 174 0 106 0 071 0 077

10. Sem.icida.lia лоСаСа 0 161 0 161 0 123 0 155 0 158 0 148 0 135 О 139 0 165

11. Шррос1ат1а tredecilnpunctata 0 155 0 161 0 126 0 145 0 155 0 155 0 132 0 135 0 174 0 100

12. Ехос^ютиБ quadripustiJlatus 0.213 0 213 0 190 0 203 0 210 0 184 0 190 0 190 0 197 0 194 0.210

13. ТЬез vigintiduopunctata 0 203 0 194 0 168 0 181 0 184 0 187 0 177 0 181 0 181 0 184 0.190 0.216

Примечание. Нуклеотидные последовательности видов, помеченных звездочкой, получены из базы данных ОепВапк.

Таблица 3. Оценка аминокислотных различий С - концевого участка субъединицы 1 цитохромоксидазы, выраженная в р -расстояниях (отношение наблюдаемого числа замен к числу аминокислотных остатков).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1. НагтоЫа ахугиНз

2. Н. ахупсИэ" 0.010

3. АйаНа ЫрипсШа 0.137 0.147

4. А. с)есетрипс1а1а 0.157 0.167 0 029

5. А. ¿есетрипсМа' 0.157 0.167 0.029 0.000

6. СосстеИа ци^иерипс1а1а 0.167 0.176 0 088 0.118 0.118

7. СосстеИа 1гап$\>егзодиНа1а 0.157 0.167 0.108 0.137 0.137 0.049

8. СосстеИа ¡гап$\/ег5одиПа1а 0.157 0.167 0.108 0.137 0.137 0.049 0.000

9. СосстеИа зср1етрипс!а1а 0.157 0.167 0 137 0.157 0.157 0.078 0.029 0 029

10. Зет'/абаЬа по1а1а 0.127 0.137 0.088 0.118 0.118 0108 0.098 0.098 0.127

11. Нфробатт 1гебеатрип<Ла1а 0.127 0.127 0 098 0.127 0.127 0.118 0.108 0.108 0.137 0.029

12. ЕхосЬотиз циа<3г1ри$1и1а1и5 0255 0.265 0.265 0.275 0.275 0.275 0 294 0 294 0.284 0.235 0 265

13. ТЛез У1дтШиорипс1а1а 0.186 0.176 0.167 0.176 0.176 0.167 0 157 0.157 0.186 0.167 0.167 0 275

Примечание. Нуклеотидные последовательности видов, помеченных звездочкой, были взяты из базы данных ОепВапк.

Harmonía axyridie Harmonía axyrldia (GenBank) Adalia blpunctata Adalia decempuncta ta Adalia decGwpunctata (GenBank) Cocclnella guinquepunctata Coccinella transversóguttata Cocclnella transversoguttata Coccinella septempunctata Semiadalia nota ta Hippodamia tredecimpunctata Exochomus quadrlpustulatus Thea vigintiduopunctata

Harmonía axyridis Harmonía axyridis (GenBank) Adalia bipunctata Adalia decempunctata Adalia decempunctata (GenBank) Coccinella guinquepunctata Coccinella transversoguttata Coccinella transversoguttata Cocclnella septeirpunctata Semiadalia notata Hippodamia tredecimpunctata Exochomus quadripustulatus Thea vigintiduopunctata

VNLTFPPQHF LGLSGMPRRY SDYPDAYYKW KKISSIGSMI SSISMIFMIL IIWESFVSMR LSKFNSNVPS LIEWLQL ..........................................L..................................

.N. ■ N.

• M.

• N.

. .M. . .M. . .M. . .M. . .M. . .M. . .M. . .M. . .M.

■ SF.

■ FM.

• VL..LI ......F... .T.

.VM..LI ......F.L. .T.

.VM..LI......F.L. .T.

.IL

• IL

■ IL

-IF____VL..LI

• IF____VL. .LI

■ IF ...VL..LI

.VF____V... LI

.1. .Т..IL..LI .1. ..M.IL..MI

■ L. .T. , I.MFLM ,IF ..L.VLM.LI

• Y.M. .Y.M.

• Y.M.

..... ____м.. . .Y М Т . . .F..

. . . . . ____м.. . . F I т . ..F..

..... ____м.. . .F I т . ;. F..

• T.

INLN.N.M.. I..L..TM..

____MHS

____M. .

SPPNEHSYSE VPIIAQKF*Y GSLVHW

Рисунох 3. Сравнение аминокислотных последовательностей участка белка субъединицы 1 цитохромоксидазы. Точками обозначены идентичные аминокислотные остатки.

они оказываются наиболее родственными по сравнению с другими членами семейства. Эти результаты не удивляют, поскольку роды Semiadalia и Hippodamia входят в подтрибу Hippodamiini.

Полученные нами данные позволили выявить филогенетические связи внутри рода Coccinella. Вид Coccinella quinquepunctata значительно удален от других представителей рода Coccinella. Морфологически он имеет также наименьшее сходство с Coccinella transversoguttata и Coccinella septempunctata. Виды трибы Coccinellini, являющиеся афидофагами, образуют монофилетичную группу, значительно удаленную от представителя трибы Chilocorini, вида-кокцидофага Exochomus quadripustulatus. Вид Thea vigintiduopunctata L, являющийся мицетофагом (триба Psylloborini), филогенетически близок к трибе Coccinellini. Известно, что признаки строения ротового аппарата мицетофагов имеют сходство с особенностями строения ротового аппарата как афидофагов, так и фитофагов. Таким образом, можно предположить, что в эволюции кокцинеллид происходит смена пищевой специализации.

Рисунок 4. Филогения кокцинеллид. Дендрограмма построена с использованием метода максимальной экономии. Бутстрэп-анализ проведен на 500 повторностях. Величины бутстрэп-коэффициентов обозначены в местах разветвлений филогенетического дерева. Нуклеотидные последовательности видов, помеченных звездочкой, получены из базы данных GenBank.

_г Adalia decempunctata

__I— Adalia decempunctata (GenBank)

- Adalia blpunctata

_l- Semiadalia notata

'-Hippodamla tredecimpunctata

С Harmonía axyridís Harmonía axyridís (GenBank)

- Cocclnella quinquepunctata

- - Cocclnella septempunctata

_rCoccinella transversoguttata

'-Cocclnella transversoguttata ¡

-Thea viglntiduopunctata

_Exochomus quadripustulatus

002

Рисупок 5. Филогения десяти видов кокцинеллид. Дендрограмма построена методом ближайшего связывания с использованием алгоритма Кимуры, с учетом замен в трех положениях кодона. Нуклеотидные последовательности видов, помеченных звездочкой, получены из базы данных ОепБапк. Масштаб дан в доле нуклеотидных различий.

2. Анализ изменчивости нуклеотидных последовательностей участка митохондриапьного гена субъединицы I цитохромоксидазы ВНУТРИ вида АЬаИа Ыоипсгага.

Известно, что мтДНК характеризуется сравнительно высокой скоростью эволюции нуклеотидных последовательностей в отличие от ядерной ДНК. Это дает нам возможность сравнивать близкородственные таксоны насекомых (виды, подвиды). Митохондриальная ДНК является чувствительным индикатором к воздействию демографических процессов на популяции. На структуру популяций могут оказывать влияние в различной степени определенные эволюционные процессы, такие как обмен генами между популяциями, вымирание субпопуляций, миграции и соответственно эффект основателя, прохождение популяций через "горлышко бутылки". Последний фактор обладает наиболее жестким воздействием на изменчивость митохондриальную ДНК как маркера генетической структуры групп организмов. Он сказывается на степени полиморфизма нуклеотидных последовательностей, и скорость снижения полиморфизма этого маркера в случае недавнего события прохождения через «бутылочное горло» будет высокой. При этом

последующий рост численности популяции может предотвратить полную элиминацию вариабельности мтДНК. Обмен генами играет также существенную роль в эволюции вида. В случае, если имел место интенсивный обмен генами между популяциями, то вероятность низких значений генетических дистанций в анализе структуры популяций будет высокой.

До последнего времени оставался спорным таксономический статус центрально - азиатских популяций ЛбаИа bipunctata, которые имеют особый тип полиморфизма (1 fasciatopunctata), отличающего "азиатских" адалий по окраске и рисунку переднеспинки и надкрылий от других форм этого вида. Нами был проведен анализ на молекулярно -генетическом уровне двух наиболее удаленных популяций адалий - из Италии и Тувы. Выборка из тувинской популяции была представлена жуками форм ^ bipunctata и fasciatopunctata. Кроме того, для сравнения мы использовали нуклеотидные последовательности образцов из Болгарии и Санкт-Петербурга и одного из Москвы. Последний получен из базы данных GenBank ^313070). Полученные данные свидетельствуют о том, что среди жуков А. bipunctata из разных популяций преобладает один вариант мтДНК, названный нами "типичным", который был выявлен у 16 особей из 27 и найден в популяциях Италии, Москвы, Санкт-Петербурга, Тувы (рис. 6). Всего было обнаружено 12 вариантов (мт-гаплотипов), представленных в основном единичными особями, причем девять из этих вариантов отличаются от типичного по одной - двум заменам. Два гаплотипа - 25 и 26 - оказались наиболее отличающимися. Первый был найден в Туве, второй - в Болгарии. Отличие этих вариантов от типичного - 11 нуклеотидов (3,6%) и 9 нуклеотидов (3%) соответственно, что, однако, значительно меньше, чем различия между А. bipunctata и A decempunctata (7%). Сопоставление внутри и межвидовой изменчивости внутри семейства Coccinellidae, описанное в разделе 1, позволяет сделать вывод, что генетическая изменчивость участка гена субъединицы I цитохромоксидазы вида А. bipunctata соответствует показателям внутривидовой изменчивости. Таким образом, несмотря на резкие морфологические различия особей из европейских и центрально - азиатских популяций A bipunctata, а также

географическую удаленность исследованных популяций и принадлежность к разным климатическим зонам, характер изменчивости мтДНК не позволяет четко их дифференцировать.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей части белка субъединицы I цитохромоксидазы выявил единичные замены аминокислот (рис. 7) как между популяциями, так и внутри популяций.

Сложно назвать причины низкого генетического разнообразия внутри вида А. bipunctata. Можно сказать, что расхождение двух географически удаленных популяций является недавним событием (до 1 млн. лет) по сравнению с расхождением А. bipunctata и А. decempunctata. Возможно, что время независимого существования А. bipunctata fasciatopunctata и А. bipunctata bipunctata мало для того, чтобы популяции накопили изменения, дифференцировавшие их по генетическим признакам.

Нами показано, что характер выявленного в природных популяциях полиморфизма мтДНК отражает общее состояние видообразования комплекса близких форм - А. bipunctata, которые образуют цепь географически замещающих популяций подвидового ранга, не изолированных строго друг от друга генетическими механизмами. Полученные данные еще раз подтверждают выводы, полученные ранее на основе генетического анализа, что нет оснований придавать форме fasciatopunctata видовой ранг [Лусис, 1973]. Следует сказать, что только по результатам исследования одного молекулярного маркера мы не можем делать однозначных выводов по поводу таксономического статуса тувинских популяций божьих коровок. Привлечение других методов и использование других маркеров необходимо для изучения форм А. bipunctata.

3. Сравнительный анализ полиморфизма длин внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК кокцинеллид.

Молекулярно-генетическая организация рДНК различных эукариот во многом сходна, в то же время- каждый вид обладает рядом структурных и функциональных особенностей, характерных для данного

1? «ТААЛССТААСАТТт ТССТСААСАТТТСТТАаСАТТ ЧАСАРО ААТ А СС АСС* С«« ТАТТСТСАТТ АСССАбАТОСТТАГТ ЬТАТ АТОААА Т ААйАТТТСАТ» з 61 ат отааасстаасал пттА. 1 иААСА 1 гт ся аооатт ^лоадолатассасгньдататтстоаттаесош*тосгтлтт>тататоалатладатттсат • д о» я атхмсстмюи ш. 11ииикСАТттсггАи^ттАгасю*АТАССАссАсаьтАТтст^ . х ш

«т отааасстаасаппл1 исгсааса!1ю [*диттч»с1^мт1Д>аиа1*7*ттстслтт*сусла»гасттАтт1кТАТХТС^^ аа&агттсат• ю 1

*Т ОТАААССТААСА/ тТ|1С1и>АСАГГГСТТАаОАТТМП»Д1Ц»ТАСО>СТЦ^^

*т оталлстпасли а I тч гцклоттст7*дсцттмдлаацт*с1^>^тл|тст^ттАссс^ ГСАААгллдлггтслг- I о»

•п д7АААССТААСА1 111 пи.1¡-»ЛСАГТТСТГАаОАТТЦ/ЦСХЦАТАССАта^еСАТАТТС^ .101 Г 0ТАААССТААСА1»1I а>

г? ОТ*ААССТА*СА>» 1тгсо>сААСМТгсттА«мтт1А&АтеАА7АссАст>сщ^ 1С1

1 (Т РТАААССТААСАТТ.Т Ггг СТСААСА ТГТСТТАССА ГГ*ЛСЛООМ?>СС*О^С|СД7ДТТСГСАГТЦХ,С.ЦЦ Т-ЛТТЛ ТУ» ТА ТлТЦАААТААО * ГГГСД Т . 1 с » : :т ОТААА'ХТААСА ГТТ1ГГЦС 1СААСАТТТСТГАОСАТТААО АОйААТАСС *СПАСйАТАТТСГ1АТТАСС САОАТй(.ТГАТТ*ТЛТА7ЦАААТААЬАПТилТ ■ ] ВI ;гг СТАЛД£СТААСАТ7 ГТТ ГС С 7 СААСАТТТ СТТАоСАТТ АЛйАОДААТ АССАСйЧССА Т* ТГСТСАТТАСССАбД ГОСГГА Г7А Г Л ТЛ? ОЛАА ТАЛ ¿А ТТТС АТ • 1СД ♦>Т РТАААССТ ААСА П1111' лиСААСАТТТ СТГАЗйАТТААЗАДОААТ АСС А СЕАС^ТМТСТСАТТ АС СОДА ? 1Д.Т1А11 АТАТАТСАААТАА1АТТ*ГСЛТ -1С1 ИТ КТАААССТААСАГ ГТ1IЧ 1С IСЛАСАТТГСТТАДДАТТААЯАООААТ1ССА ССАССАТАТТСТСАТТАСССА&АТОСТТАТТдтАТАТОАААТААСАТТ^УАТ-1Г1 1М СТ1ААССТААС* IТ Т ГП1С ^¿^ACAmCTГAlWTГAAЦAaCAATACCACttAUMT»m•^nACC^^ ААДАТТгаТ . 161

ит СТАААССТААСАТТТ. 1 ИСТСААСАТТI СТ ТАДСАТГААДАСЗААТАССАСЕАСЧАТАТТСТРАТТАСССАСАТОСТТАТТитаТАТОАААТААСАТТТСАТ• >61 1*Т СТАААССТААС* ' 1Т11 НЧ. 1СААСАГПОI «<»1ГТАА(^гСААТАС^С^ ГОАТАТТСТйАТТАСССА^ТШТГГАГГАТАГАТСАААТА -101

11Т ЗТАААССТААСАТТТТпССТСАДСАТТТСТТАДСАТТ ЦСАССААТАССЛССАССЛГАТТСТОАТТАСССАДАТССТ7АТТ»ТАТ>ТСАААТААДАТТТСА7-:о!

I »Т СТАААССТААСА ПТ1ГГО-1СМСАТТТСТГАЗОАТТА«ДАОСА»Т*ГГАД ^СГЛТ»ГГСТЛАТТАСССАС1>ТГ^ГТТ>ТТ*ТАТАТСАААТ1и^ГГТСА?--.Ы 1гт ОТАААССТААСАНТ» ГТТАЧЦЦ^ГГТС1ТАДСАТГМ6АС^ТАССАСГАГ^^

II т СТАААССТААСАГТ Г'1 ПЧ-'ГСААСАГН СТТ АйСА ТТЫиУИЭОААТАССАОУкСЪАТАГТСТаАГТ АСТХАОАТОСТТАТТ А ТА ТАТС *ААТ ААСАТТТС *Т • 101 «Т СТАААССГААСА1Л и ЦД.IикАСАТТТСТТАДОАТТААеЫДААТАССАСТиНЦТП1>ТТАГСС1Д>ТаСТТАТТАТАТАТСАДАТАА0АТТТСАТ' 1 в» 2)Т СТАААССТААС А ! I П Н ЧI и^АС>^^СТТ>С^ТТМ>ОАОСЦ>ТХССАСОАССАТАТТСтаАТТАеееАО>ТОС^АТТАТАТ АТбАААТ АА^АТТТСАТ •) м ?«Т СТАААССТААСАГГТТ' ГСГ Т СААСА&ТТСТТАССАТТААСАССМ ТАСОСООНА^ ^СТй>1ТАОСС*ОАТОСУУАТТд ТАТ» ТСАААТААСАТТГСАТ ♦ 101 ЗЬГ СТАААССТААСАТТ Т1I I«.I.!ОАСАТТ7^ТТАОСАТТААСАОПАДТАСО^О»ГОАТАТТСТДАТТАСССАаАТОСТТАГГАТАТаТОАААТААДЙТТТСАТ 101 14Т (ГГАААССТ1кАСАТТТТТТССГСААСАТТ1ТТТАООАТТААПАС."1АДТАЛГАтАП%АТМТГТ*«АТТАССС{^ЗАТССТТАГ1АТАТАТОАААТАА1^ТТТСАТ• 1?Т ТТ АОСАТ7 ААЛАДЗААТАССАГОАСПАТАТТСтАТТАССС АЛАТС СТТАТТАТАТАТЗАМкТААСА ТТГСАТ -191 акт стааассткасч I г:пи-ч^мсла1,пАацтг»лс&з^ТАССАсайст^тат[стсагга^ссад»^рсттат^^ 101

ХТ СТАТТОМТСТАГГГТЖ1УХ-11ААГГАаАШТ^АТТТ>,ТАГГ>ЛГГАТТАТ1ТМ^А^Ц»Г1ПГ/ТЛАТАССАГТЛАСАААЛТТТАЛТТАТЛЛТЛТАСС• >В» 1Т СТАТТОСАТСТАГ111АП-1 |ид№ТАаАдТТГГАТУГАТА^»АТТАТУА?ТГОА0»А1^ТГт>Т^ :м

)Т СТАТТООАТС'Г* ГТ> ГАТССТСААТТАаАРТ7ТТАТТТАТА7'ТААТТАГТАТТТа»ОАААОАГ1ТТ Т'ПХ. ГАГАРаДТТМГШААТТТААТТАТААТАТАГС -1М «т и>А|'1ицАГ<.ТАТТ<ТАТСС 1СЧАТТАДАШТТТАТТТ7кТАТТААТТАТТАТТТСА0Ц>А0АТ17111'1У1АТАССАТТ^АС>»ААА^ТТААТТАТ*АТАТАСС• 1 в4 »? СТАТГОСАТСТМТТТ/ ТОЛСААТТАОАйТТТТАГГТАТАТТААТТ^ТТАТТТСАСАААаАТТТТГГТСТАТАСОАТТААСААЧАТГГААТТАТААТАТАГС • 2 0« 1Т СТАГТООАТ1.1А 1111 АТССТСААТТАОАСТТП'АГГГАТАГТААТТАТТАТТТСАСАААОА 1 1СIАТАСОАТТААСААААТТТААТТАТАА ТАТ АСС - а 9 < ТТ СТАТТОЗАТС^ТНЧСААТТАДАДТТТТАГ7ТАТАТТААТТАТТАТТТСАСАААСА1ПШ ТС1АТАССА7ТААСЛАААТТТЛАГТА;ААГАТАСС» г06 •Т СТАТТО^ТСТАГГтатХТСААГГАОАЦ ТТТТАП! АТАТТААТТАТТ АТТТСАСАААСА :г л Т1ТС1 АТАССАГГААСиЛААТТ:ААТТАТ ААГАТАС С • а 0 > ГТ (ТАТТО^ТСТАПТТАТССГГаиТТАаАШТТТАГГГАТАТГААГГАГТАТПР^^ 10Т СТАТТОЦТСТАТТГТАТССТСААТТАОАШТТТАТГГАТАТТААТТАТГАТТТСАДАААСАГТГГ? ГПЛАТЖСдАТТААСААЛАТТТААТТАТ^ТАТАСС-аО« 11Т СГАТТОСА1Х.1 А11 ГТ А ГСС П^ЦГГАДАСТТГГАТТГАТАГГААГТАТГАТТГСАйиЛЦ )Г 1 Щ IVI АТАГаАГТААСААААТТТААТТАТААТАТАСС- ?ц< т тттооА?дмтгт»тсс>сл*ггАйА&гтлтАт*геА*ггАтттта>аААЛс»гг1 гтггстатассаггаасааааггтаатгатаататасс-ас« ит СТАТТ«АТСТАТГГТАТССТС»АТТАСАа1ТГГАтАТ»ГГМТТА<ТАТТтааЛЛ*0^

1*т СГЛГ?д^ТСТАТТТГАТССТСААТТАДАДТТТТЛ ТТТ АТАТТААТТА ТТ» ТТТС «ЛААСА Я IГГНПАТ АССАТТ «АСл,-^чАТГ Т^ ТТЛТ ААТАТАГС-?0« 1*Т СТАГМаАТСТАГТТТАТССТСААТТАСАШТТТАТТТЛТАТТААТТАТТА*^ТСЛСАААСА 1 I! 111IIIАТАССГ.ТТААСААААТТТААТТЛТЛАТКТАСкГ-2Ь« \<Т ГГЛГГ^Т<^ТТПАТССТСАЛХТАаА01ТГГАТТТАТАГ7^ГГАГГ»ГГ^^ 1ТТТ11 С-ГАТАСОАТТАЛСАААЛТТТААТТАТЬЛТАТАСС-2Л

1 ТТ СТХ ТТДЬАДСТАТТТТАТССТСЛА?ТА0А&ТТСТАТТГАТАТТ ААТТАТТ АТТТйАОАААДАГ ГПЧГЮЛТ АСйА ТТАЛСААААТТПкАТТ А Т ААТАТ АСС - 3 е * ^Т СТАТТОСАТСТАТГТТАТССТСААТТАДА^ 1111 АТ Г ГАТ.>Т7ДЛТТАТТАГПТЦ.Ц<ЛЛыи ¡11111И АТАССАТТААСААААТТТААТТАТ ААТАТАСС» >01 1»Т СТАТТООАТСТАТТТТАТССТСААТТАСАи 1111А11 ¿АТАТТАЛТТАТТАТГГО^У^ДДА1.1'111 П^Ч АТАОЗАТТААСААА*ТТТААТТАТААТАТ»СС - 3 Д К 2СТ СТАТ70йАТСТАТТТТАТССТСААТТАОА^ЛТТтаГТТАТАТТААТТАТГ>ТТТСАСАА>ДЛТГТТТТТСТАТАСТАТТААСААА/.ТТТААТТАТААТ»ТАС^ . »0« 31Т СТАТТ«ЖТ«АТТ1ТАТССТСААТТАОАОТТТТАТТТАТАТТААТТАТТА?ТГСАСААА&-. 11ТТТПС»АТАССАТТААСААААТТТ*АТТАТААТАТАСС-за» 12Т ДSГT■^^CTATTTГAГ^aЛCAATTAIWГГTTA7TTATA^^AArГAГIATTTO^eAЛЛCAi■| ПП ТСIАТАСйАТТЛАСХАААТГГААТТАТААТАТАеС• 3С» »1Т С1 А17\>аАТСТАТТТТАТССТСА>ТТАОА<Г1*ГТТА1ПАТ>ТГКАТТАТТАТТТСАСАААСА ГГ ПТ Т ГСТ АТА{ДАТТАА£АЛААТТТААТТАТАДТАТАСС »а о« г«Т СТАТТОСАП-ТАМ Г1АК\. ШкАТТАСА^Ч1; 11 А! П АТАТТААТТАТТАТТГаАйАААСАГП ТТ! ТС1 АТАСОАТТААСаАААТТГ>ЛТГАТ»АТАТАСС• а Ь< а»Т сйкТ^СаАТСТ АТТТТАТС^РСААТТАЛА^ТТ Г Г А ГГ." АТАТТ ААТТАТТ А ТТТиАйАААОАгттгт СГАТ АСОАТТААСАААА ТТТ ААТТ А? ЛЛТ *ТЬСС-23< ЦТ СдАТТиО^ГСТАТТТТАТССТСААТТАСА*.!'/1 ТА!ГJAГATTAATTATTATTTOAДAДA6A^ Ц?Л)ЧС?АТАСЬАГТ*ЛСААААТТТААТТА7ААТАТАСС• 1 в* а-Т СТАТТОДАТСТАП Г Г АТСУ ГСААТТ ШАагТТТАТТТ> ТАТТААТТАТТ ЛТТТСАДАААОА! Т :ТГ1СТАТАС^АТТААСАЛЛАТТТААТТАТААТАТАСС-3 э» 211 СТАТТСОАТСТАТТТТАТС^ТСЛАТГ АСАСТТ^ТАТТТ *ТЛТТААТТАТТ * ТТЙАОААЛСА1111111С ¡ХГАСОА^ТААСААААТТТААТТАТААТАТАСС-ЗВ«

:т АТСТСТААТТОААТСАСТАСААТТАТССССТССТААООААСА1ТСТГАТТСТСАА»ТТСС*АТТТТАТСААТАААА1ТСТ>АТАТО<>САДАТТ^ ТТОСА• Л» 2Т »ТСТСТААТТСЛАТОАСТАСААТТАТССССП ССТААТОАА иАтДСТТАГТСТйАААТТССААТ7ТТАТСААТААААТТСТААТАТООСАСАГТдОТОСАТТССА -11 а )Т АТСТСТААТТСААТОАСТАСААТТА ПЛТХТ ССТ ЧА^Ы^ГГСТГАТТСТШ>ААТТСОи.ТтАТСААТААААТТСТЛАТАТД<^ -31а

«Г АТСТСТААТГОААТО АСТАГААТТАТи. С1АА ОСЛАСАТГСТТАТГСТСАААТТССААТТТГАТ СААТАЛЛАТТСТААТА ТСОСАаАГТАС ГС СА ТТОСА • J10 Я АТСГСГАМТСААТОАСТАСААТТАТССССТССТААССААСАТТСТТАТТСТОАААТТССААТТТТАТСААТААААГТСТААТАТООСАйАТТАОТОСАТТОСАО!» 5Г АТСТСТААТТСААТСЛСТАСМТТАТССССТССТААСОААСАТТСРТАТТСТ'аАМТГССААТТТТАТСААТААААТТСТААТАТСОСАСАГТАСГССАТТОСА-110 «Т АТСТСТААГГОААТОАСТАСААТТАТССе СТССГААСОАЛСАПеТ: АТТС ГиАААТТССААТТПАТСААТААЛАТТСТААТАТОЗСАСАТТАС ТОСАТ70СА-119 ТТ АГСТСТААТт»АТ<и^АДЦТТА«СССТССТААСаДАСАТТСГТАГТСТТ1АА^ •»»

•г АТСТСТМТТТ^ГйА-ТАааТТАТССССТССТААеаААСАТТСГГАТбСТОЛААТ^^ 110

»Т АТСТСТА^ТТСААТОАСТАСААТТА Т ССССТССТ АА ССААСАТТ С ГТ АПСТ^аЛААТТССААТТТТАТСААТААААТТСТ ААТАТгааСАДАТТАО ТОСА ТТае А . ) 1 е ЮТ АТСТСГМТТбААТиАСГАСААТТАТССССТССТААССААГАТТСТТАТТСТСАААТТССААТТТТАТСААТААААТТСТААТАТФЗСАСАТТАСТОСАТТС»ДА • 1Ю I :г АТСТСТТиГГйЦТаАСТАСААТТАТССССТССТААСаААСАГТСТТАГГС71ЖЦГ^^ -11 а

1УТ АТГТСТ^ТТ1^ТОАСТАеААтТССССТССТ>кАОйААС»|ТТСГГАТТ^^ 1»

11Т АТСГСТОАТТС ААТОАСТАСААГТ кТССС С Г ААГаААСАТ1УТТАТГСТСАААГГССААГтАТСААТААААТТеТААТАТ^^АСАТТАаТ1^ • 11» ИТ АТСТСТААТГСААТОАГТАОкАТТАТСССС IСГТ АА МААСА ТТСТТАТТСТСАААТТССАА1111А и ААТ ААААТТСТ ААТАТССС»ДАТТАС*ССАТТССА-110 ИТ АТСТ^иТТОААТОАСТАСААТТАТССССТССТААССААСАIТК Г1АПС1 (^^ГГССААТТТТАТСААТААААТТСТААТАТСССАДАТТАСТОСАТТСОА -110 ЦТ АТСТС-ГААТТОААТйАСТАСААТТ>1ССССТССГААСаААС»ТТСТТАТТа^ААГГССААТТТГАТСААТ**^ТТ^^ 1 а

1 ТТ АТГТГТААТТСААТйАСТ АСААТТ АТССССИ-С: ААСйААОТТГТТ А ГГСТаАААТТССААТТГТАТТ ААТААААГТСТА ТС ОСАДА ГГАСТОС» ТТ 0<Ц - 310 1»Т А1ГТГТААТТСААТСАСТАСААГТАТССССТССТААСЙААСАТТСТТАГГСТСАААТТСГАЛТГГТАГСААТААААТТСТААТАТОЛ^АОАТТАДТДСАТГЭОА-НА 1 »Т АТГТСТ»ЛТТСААТаАСТАСААТТАТССС С1 ССТ кА^^СЛТТГТТАГГГТОА*>Т^УГААТГ^А7ГЛАТАААА7ТСТАЛ ТАТСйСАСАТТАС7Х.С" Г^УЦ. -НО »ОТ АТС1СТХАТТСААТСАСТАОАТТАТССССТССТААСйААСАТТСТТАГКТСАААТТССААТТГГАТСААТААААТТСТААТАТОЛСАОАТТАСТССАТТО<1А 110 ИТ АТСТ е^ЯЛТТОААТйА СТ ^САА Т^ЯТССССТССТ ААГО^АСА ТТСТТ АТТСТЦААА ТТССААТТТТАТГААТ ААААТТСТ ААТАТСДСАйАТТАСТССАТТСОА • а 1» ит А ГСГСТААТТСААТОАСТАСААТТАТССССТССТ ААСйААСАТТ СТТАТТСТСАААТТССА> ТТТТАТС АА т АААА ТТСТ АА ТАТ5ССАмАГТАСТССАТТйСА • У > 9 31Т АТСТСГААТТСААТЧАСТ АСААТТ АТСС ССТ ССТ ААСЙААСА ТТСТТАТТСЯ1ААА ТТССЛЛТГТГАТСААТ АААА ТТСТ ААТАТООС АД АТТАОТО .~>Т-ДСА-1)9 )4Т АТСТСТААТП1ААТЦАСТ АС ААТТА ТССССТ^СТ ААСПААСА ТТСТТАТТСТОААА ГГССАА ГПТАТСААТАААА ГГ СТАЛ ТАТ ООСАйАТТАСТССА ТТООА -11» ИТ АТ С}{СГААТТОААтаАСТАС ААТТ > ТС (ХС Й^ХТ АА^рААГАТТСТТАТТСГСАД^ Т^ХАА ТТТТАТС ААТ АААА ТТСТ А/ ТАТЗС С АДАТТАДТОС» -11»

г.т »тстстААТгалАТО*4тАаи^АтсессдсггААС<КАСАгггттА^гп^^ • 1 > а

ИТ АТСТСТААТТОААТвАСТАСААТТ*ТССССТССТААСЯААСАТГСГГ»ТТСТОАААТТСГ|кЛТТГГАТСААТАА^ 110

;(Т с'!^. ТААТТДААТСД^ТАСААТТАТС^СС^СТААДЬААСА^ТСТТАТТ ПЧААА ГГССААТТ^АТСА^ -11 а

Рисунок 6, Сравнение нуклеотидных последовательностей (310 пн) 3- области гена субъединицы 1 цитохромоксидазы вида АЛаИа ЫрипааШ из разных популяций. 1Т-9Т - Италия; ЮТ - Санкт-Петербург; 11Т-25Т- Тува; 26Т-Болгария; 27Т - Москва; 1%Т-АйаИа йесетрипаша.

1 уттггрснг иялсмрюпг БВУРОДУУМИ хк:зз1сз1ь гБитапод ПИЕЗГГЗШ* иктюю ЫЕШДЬ

2 ................................................М............................

3 .............................................................................

22 ..........................

23 ..........................

24 ..........................

25 .......... V...............

2 6..........................

27 ..........................

28 ..........................

Рисунок 7. Сравнение аминокислотных последовательностей С - концевого участка субъединицы I цитохромоксидазы вида АЖгНа Ырипс1а1а из разных популяций: 1 -9 - Италия; 10 - Санкт - Петербург; 11 - 25 - Тува; 26 - Болгария; 27 - Москва, 28 -А. ¿¡есетрипама.

участка генома. Характерной особенностью рДНК является то, что различные структурные элементы эволюционируют с разной скоростью. Наименее эволюционно консервативными являются транскрибируемые и нетранскрибируемые спейсеры. Их сравнительный анализ эффективен

при исследовании филогенетических взаимоотношений между близкородственными видами. Для эволюции рДНК известны два типа преобразований: постепенное накопление нуклеотидных замен и сальтационные изменения, выражающиеся в перестройках рибосомального оперона [Алешин и др., 1995; Муха и др., 1999,]. Показано, что сальтационные изменения играют большую роль в эволюции видов [Муха и др., 1999]

Методом ПЦР при амплификации участка генома, включающего ITS1, 5.8S, ITS2, с использованием универсальных праймеров DAMS_18 и DAMS_28 [Муха и Сидоренко, 1995; 1996] нами были выявлены различия в длине фрагмента рДНК, содержащего транскрибируемые спейсеры, у пяти видов божьих коровок (рис. 8). Этот результат согласуется с литературными данными по вариабельности ITS1 у видов семейства Coccinellidae.

При сравнении двух видов Adalia bipunctata и Adalia decempunctata обнаружена вставка в исследуемую область рДНК Adalia bipunctata. В то же время мы не выявили различий на внутривидовом уровне. Нами показано, что коровки A. bipunctata fasciatopunctata и A. bipunctata bipunctata не различаются по длине фрагмента рДНК, включающего внутренние транскрибируемые спейсеры (рис.9). Длина фрагмента рДНК не различается также и внутри вида Coccinella septempunctata из географически удаленных популяций (рис. 10).

С нашей точки зрения, характер изменчивости транскрибируемых спенсеров рибосомной ДНК исследованных видов божьих коровок не может быть объяснен с позиции теории нейтральной эволюции [Кимура, 1985]. Более адекватной представляется интерпретация полученных результатов с позиции теории генетического мономорфизма [Алтухов, 2003], согласно которой видообразование трактуется не как постепенный вероятностный процесс, протекающий на популяционном уровне, а как следствие качественных реорганизаций генома.

Приведенные выше данные позволяют считать, что сальтационные изменения, выражающиеся в перестройках рибосомального оперона, играют большую роль в эволюции видов семейства Coccinellidae.

А

18Э 1ТБ1 5,88 1Т52 288 ЫТЭ 18Э

Рисунок 8. А - Схема строения кластера рибосомных генов божьих коровок, Б - Электрофорез продуктов ПЦР (область ГТ81, 5 8Б, ГГ82), полученных при амплификации рДНК божьих коровок . 1 - Adaha bipunctata, 2 -Propylea quatuordecimpunctata, 3 - Chilocorus rempustulatus ,4 - Coccinella quinquepunctata, 5 -Adalia decempunctata, М - маркер, полученный расщеплением ДНК фага лямбда эндонуклеазой (цифрами справа обозначены длины • фрагментов в п н)

Можно предположить, что видообразование божьих коровок сопровождалась освоением новых экологических ниш, для которых более адаптивными являлись разные уровни интенсивности метаболизма и, следовательно, различная интенсивность синтеза рРНК, которая определяется, в частности, структурой транскрибируемых спейсеров

В настоящее время остается открытым вопрос о конкретных механизмах, лежащих в основе качественной смены структуры

рибосомной ДНК в процессе эволюции видов. В то же время показано, что меж - и/или внутрихромосомная генная конверсия лежит в основе изогенизации членов мультигенного семейства и их согласованной, "концертной" эволюции [Dover, 1982]. Можно предположить, что процесс изогенизации происходит неравномерно по всей длине мультигенного семейства. Новые структурные варианты, возникающие в рДНК, могут оказаться селективно выгодными в новых условиях окружающей среды. Избирательная магнификация генов рРНК, описанная в экспериментах на D. melanogaster [Hawley et al., 1985], и направленная ("полярная") генная конверсия [Dover, 1982] - два механизма, благодаря которым новый структурный вариант может стать основным членом мультигенного семейства.

Подчеркнем, что в описанной гипотетической схеме изменчивости божьих коровок особое внимание уделяется генетическим событиям, происходящим на уровне особи. Именно определенный структурный вариант рибосомной ДНК, магнифицированный в клетках полового пути конкретной особи, является основой для формирования кластера рибосомных генов нового вида. Этот подход, с нашей точки зрения, хорошо согласуется с постулатами теории генетического мономорфизма, согласно которой, в частности, "любой вид по генетически мономорфной части генома предстает перед нами как отдельная особь" [Алтухов, 2003].

выводы

1. Доля вариабельных сайтов гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы при сравнении десяти видов жуков семейства Coccinellidae, составляет 40%. Данный участок характеризуется значительным накоплением мутаций в третьем положении кодонов (70% от количества вариабельных сайтов). Показано, что исследованные нуклеотидные последовательности. мтДНК являются информативными для анализа филогенетических взаимоотношений на уровне видов и подсемейств.

2. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена субъединицы I цитохромоксидазы позволяет выявить филогенетические связи десяти видов кокцинеллид (роды Harmonía, Adalia, Coccinella, Semladalia, Hippodamia, Exochomus, Thea).

3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 3' -области гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы, у представителей Adalia bipunctata L, имеющих различную окраску переднеспинки и надкрылий, из географически удаленных популяций показал отсутствие различий видового уровня между Adalia bipunctata fasciatopunctata и Adalia bipunctata bipunctata.

4. Фрагмент рДНК, включающий транскрибируемые спейсеры, у разных представителей семейства Coccinellidae, различается по длине. Внутри вида не было выявлено различий. Таким образом, обнаружен внутривидовой генетический мономорфизм и сальтационный характер эволюции данных участков генома в семействе Coccinellidae.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Паленко М. В., Муха Д. В., Захаров И.' А. Изменчивость митохондриапьного гена цитохромоксидазы I внутри вида Adalia bipunctata и между видами жуков семейства Божьи коровки (Coleoptera: Coccinellidae) // Генетика. 2004. Т. 40. № 2. С. 205-209.

2) Паленко М. В., Муха Д. В., Захаров И. А. Филогения жуков семейства Coccinellidae на основе анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы // Тезисы докладов 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова "Актуальные проблемы генетики". Москва, 20-21 февраля 2003. С. 220-221.

3) Phytogeny of the Coccinellidae based on the mitochondrial cytochrome oxidase I sequence data. // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Kyiv, Ukraine. September 25-27, 2003. P. 26.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 26.08.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 908. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

i 16782

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Паленко, Мария Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Объект исследований

1.1.1. Краткая характеристика семейства Coccinellidae

1.1.2. Полиморфизм вида Adalia bipunctata

1.2. Особенности эволюции мтДНК насекомых

1.2.1. Свойства мтДНК

1.2.2. Различия в скорости эволюции синонимичных и несинонимичных сайтов

1.2.3. Филогения видов на основе изучения мтДНК

1.3. Изменчивость рДНК в эволюции эукариот

1. 4. Методы филогенетического анализа

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.1. Выделение ДНК

2.1.2. Электрофорез

2.1.3. Амплификация

2.1.4. Получение очищенных ПЦР продуктов

2.1.5. Лигирование

2.2. Трансформация клеток Е. coli

2.2.1. Приготовление компетентных клеток

2.2.2.Трансформация компетентных клеток

2.2.3. Выделение плазмидной ДНК и очистка для идентификации истинных рекомбинантов

2.2.4. Рестрикция рекомбинантных плазмид для установления длины вставки

2.3. Секвенирование

2.3.1. Подготовка секвенирования и фореза для секвенирования

2.3.2. Приготовление реакционной смеси (на одну реакцию) 49 2.4. Компьютерный анализ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Анализ первичной структуры З'-области гена субъединицы I цитохромоксидазы десяти видов кокцинеллид

3.1.1. Клонирование и анализ первичной последовательности фрагмента гена цитохромоксидазы I десяти видов божьих коровок

3.1.2. Реконструкция филогении десяти видов божьих коровок

3.2. Исследование изменчивости нуклеотидных последовательностей участка митохондриального гена цитохромоксидазы I внутри вида Adalia bipunctata

3.3. Сравнительный анализ полиморфизма длин внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК кокцинеллид

4. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ филогении жуков семейства Coccinellidae"

Интерес к проблеме происхождения, филогенетических взаимоотношений, видового состава жуков семейства Coccinellidae обусловлен их значительным фенотипическим разнообразием и высокой географической изменчивостью. Многие виды божьих коровок проявляют полиморфизм по окраске и рисунку на надкрыльях и переднеспинке, и существуют многочисленные данные о зависимости структуры популяций этих видов от экологических условий обитания. В то же время систематика, основанная на сравнении морфологических признаков, для многих видов кокцинеллид затруднена (Добржанский, 1924).

Нет единой точки зрения на таксономический статус видов и географических форм рода Adalia (Лусис, 1973), в частности, формы Adalia bipunctata fasciatopunctata Fald., которая обитает совместно с Adalia bipunctata bipunctata в западной части Забайкалья, Туве и Монголии. В Туве доля божьих коровок с фенотипом fasciatopunctata составляет 50%-57%, в Монголии-до 75%. В ряде работ эта форма рассматривается как самостоятельный вид (Савойская,1983; Bielawski R., 1975; Шарова, 1962), в других как подвид или географическая раса (морфа) (Кузнецов, 1993; Лусис, 1973). До настоящего времени не была изучена возможность использования молекулярно-генетических методов в исследовании центрально-азиатских адалий, отличающихся от европейских окраской надкрылий и переднеспинки.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей в последнее время приобретает все большее распространение и признание в качестве метода для уточнения статуса групп, положение и родство которых трудно установить на основании морфологических данных. Наиболее часто в целях молекулярной систематики видов насекомых исследуются области рибосомного кластера (NTS, ITS1, ITS2), митохондриальные гены, эволюционирующие с высокой скоростью.

Использование в качестве эволюционного маркера мтДНК позволяет количественно оценить степень генетической разобщенности между родственными видами при изучении нуклеотидных последовательностей. Вместе с тем, на вопрос, какая степень различий между популяциями соответствует их принадлежности к одному виду, а какая - к разным видам, филогенетический анализ не всегда может дать ответ. В этом случае филогенетический анализ должен быть дополнен сравнительной генетикой вида (Алтухов, 2003). Целесообразно в первую очередь определить степень дивергенции мтДНК между видами семейства Coccinellidae, а также в пределах рода Adalia. При этом различия между видами в пределах рода должны быть соизмеримы с различиями между популяциями в пределах вида (Алтухов, 2003). Кроме того, определение генетических дистанций между видами и построение филогенетических деревьев, к сожалению, не позволяет определить конкретные механизмы, лежащие в основе эволюционного процесса. В рамках диссертационной работы нами была сделана попытка проведения такого исследования на основе анализа эволюционной изменчивости кластера рибосомных генов.

Цель настоящей работы состояла в изучении филогенетических связей внутри семейства Coccinellidae на основе использования участка митохондриального гена (310 пар нуклеотидов), кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы, в частности, сравнение тувинских божьих коровок Adalia bipunctata fasciatopunctata и европейских коровок Adalia bipunctata bipunctata на молекулярно-генетическом уровне. Перед нами стояли следующие задачи:

1) амплификация, клонирование и секвенирование фрагмента гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы десяти видов (7 родов) кокцинеллид, с целью получения информации о степени вариабельности исследуемого участка мтДНК;

2) проведение филогенетического анализа для определения генетических дистанций между видами семейства Coccinellidae: Harmonia axyridis Pall., Adalia bipunctata L., Adalia decempunctata L., Coccinella quinquepunctata L., Coccinella transversoguttata Fald., Coccinella septempunctata L., Semiadalia notata Laich., Hippodamia tredecimpunctata L., Exochomus quadripustulatus L., Thea vigintiduopunctata L. j

3) амплификация, клонирование и секвенирование фрагмента гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы Adalia bipunctata, с целью получения информации о степени внутрипопуляционной вариабельности исследуемого участка мтДНК^

4) анализ эволюционной изменчивости рДНК, включающей ITS1, 5,8S и ITS2, у нескольких видов кокцинеллид.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Паленко, Мария Владимировна

выводы

1. Доля вариабельных сайтов гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы при сравнении десяти видов жуков семейства Coccinellidae, составляет 40%. Данный участок характеризуется значительным накоплением мутаций в третьем положении кодонов (70% от количества вариабельных сайтов). Показано, что исследованные нуклеотидные последовательности мтДНК являются информативными для анализа филогенетических взаимотношений на уровне видов и подсемейств.

2. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена субъединицы I цитохромоксидазы позволяет выявить филогенетические связи десяти видов кокцинеллид (роды Harmonia, Adalia, Coccinella, Semiadalia, Hippodamia, Exochomus, Thea).

3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 3' - области гена, кодирующего субъединицу I цитохромоксидазы, у представителей Adalia bipunctata L., имеющих различную окраску переднеспинки и надкрылий, из географически удаленных популяций показал отсутствие различий видового уровня между Adalia bipunctata fasciatopunctata и Adalia bipunctata bipunctata.

4. Фрагмент рДНК, включающий транскрибируемые спейсеры, у разных представителей семейства Coccinellidae различается по длине. Внутри вида не было выявлено различий. Таким образом, обнаружен внутривидовой генетический мономорфизм и сальтационный характер эволюции данных участков генома.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Паленко, Мария Владимировна, Москва

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. М.: Мир, 1988. С. 202-218.

2. Алешин А. А., Владыченская Н. С., Кедрова О. С., Милютина И. А., Петров Н. Б. Сравнение генов 18S рибосомной РНК в филогении беспозвоночных // Молекулярная биология. 1995. Т. 29. № 6. С. 1408-1440.

3. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. Москва: ИКЦ "Академкнига". 2003. 254 с.

4. Дядечко Н.Г. Кокцинеллиды Украинской ССР. Киев: Издательство Академии Наук Украинской ССР. 1954. С. 102-108.

5. Добржанский Ф.Г. О географической и индивидуальной изменчивости Adalia bipunctata L. и A. decempunctata L. ( Coleoptera, Coccinellidae) // Русск. Энтом. Обозр. 1924. XVIII. с.

6. Кузнецов В.Н. Жуки-кокцинеллиды (Coleoptera, Coccinellidae) Дальнего Востока России. Часть 2. Владивосток: Дальнаука, 1993. 335 с.

7. Майр Э. Зоологический вид и эволюция. М.: Мир, 1968. 597 с.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984.

9. Медников Б.М., Банникова А.А., Ломов А.А., Мельникова М.Н., Шубина Е.А. Рестриктазный анализ повторяющейся ядерной ДНК, критерий вида и механизм видообразования // Молекулярная биология. 1995. Т. 29. № 6. С. 1308-1319.

10. Ю.Минченко А.Г., Дударева Н.А. Митохондриальный геном. Новосибирск: Наука, 1990. С. 146-148.

11. Митрофанов В.Г., Сорокина С.Ю., Андрианов Б.В. Изменчивость митохондриального генома в эволюции Drosophila II Генетика. 2002. Т. 38. №8. С. 1063-1077.

12. Муха Д.В., Сидоренко А.П. Выявление и анализ доменов последовательности 26S рибосомной ДНК Tetrahymena pyriformis, различающихся по степени эволюционного консерватизма // Молекулярная биология. 1995. Т. 29. С. 529-537.

13. Муха Д.В., Сидоренко А.П. Выявление и анализ доменов последовательности 17S рибосомальной ДНК Tetrahymena pyriformis II Генетика. 1996. Т. 32. № 11. С. 1494-1497.

14. Муха Д.В., Вигманн Б.М., Шал К. Сальтационные изменения в структуре кластера рибосомных генов в процессе эволюции тараканов рода Blatella //Докл. РАН. 1999. Т. 364. № 1. С. 134-139.4

15. Лусис Я.Я. Таксономические отношения и географическое распространение форм жуков рода Adalia Mulsant // Уч. Зап. Латв. Гос. Унт-та. 1973. Т. 184. № 1. С. 5-128.

16. Савойская Г.И. Кокцинеллиды (систематика, применение в борьбе с вредителями в сельском хозяйстве). Алма-Ата. 1983. 245 с

17. Тимофеев Ресовский Н.В. К теории вида / В сб.: Радиационная цитогенетика и эволюция. Труды Института биологии. Вып. 44. АН ССР, Уральский филиал. Свердловск. 1965. С. 11 -21.

18. Шарова С.В. О фауне Тувинской автономной области // Зоолог, журн. 1962. Т. 41. Вып. 8. 1175-1183.

19. Aquadro, C.F., Kaplan, N., Risko K.J. An analysis of the dynamics of mammalian mitochondrial DNA sequence evolution // Mol. Biol. Evol. 1984. V. 1. P. 423-434.

20. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool//J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P. 403-410.

21. Attardi G., Schatz G. Biogenesis of the mitochondria // Annu. Rev. Cell. Biol. 1988. V. 4. P. 289-333.

22. Avise J. C., Arnold J., Ball R. M., Bermingham E., Lamb Т., Neigel J., Reeb C., Saunders N. Intraspecific phylogeography: The mitochondrial-DNA bridge between population genetics and systematics //Annu. Rev. Ecol. Syst. 1987. V. 18. P. 489-522.

23. Beckenbach A., Wei J., Liu H. Relationships in the Drosophila obscura species group, inferred from mitochondrial cytochrome oxidase II sequences // Mol. Biol. 1993. V. 10. P. 619-634.

24. Bielawski R. Ergebnisse der zoologischen Forschungen von Dr. Z. Kazab in der Mongolei Nr. 352 Coccinellidae V und VI (Coleoptera) // Fragmenta Faunistica. 1975. V. 20. № 16. P. 247-271.

25. Britten R. J. Forbidden synonymous substitutions in coding regions // Mol. Biol. Evol. 1993. V. 10. V. 205-220.

26. Bogdanowicz S., Schaefer P., Harrison R. Mitochondrial DNA variation among world wide population of gypsy moths, Limantria dispar. И Mol. Phyl. Evol. 2000. V. 15. № 3. P. 487 495.

27. Brown W., George M., Wilson A.C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 1967 1971.

28. Brown W., Prager E., Wang A., Wilson A. Mitochondrial DNA sequence of primates: tempo and mode of evolution // J. Mol. Evol. 1982. V. 18. P. 225 -239.

29. Brown W. The mitochondrial genome of animals. In Molecular Evolutionary Genetics, ed. R. J. Maclntyre. New York: Plenum. 1985. P. 95 130.

30. Clary D., Wolstenholme D. The mitochondrial DNA molecule of Drosophila yakuba: Nucleotide sequence, gene organization and genetic code // J. Mol. Evol. 1985. V. 22. P. 252-271.

31. Clary D., Wolstenholme D. Drosophila mitochondrial DNA: conserved sequence in the A+T rich region and supporting evidence for a secondary structure model of a small ribosomal RNA//J. Mol. Evol. 1987. V. 25. P. 116 -125.

32. Crozier R., Crozier Y. The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organization // Genetics. 1993. V. 133. P. 97-117.

33. Clegg M. Molecular diversity in plant populations // Plant population genetics, breeding, and genetic resources / Eds Brown A. H. D., Clegg M. Т., Kahler A. L., Weir B. S. Sinauer, Sunderland, MA, 1990. P. 98 115.

34. Cluster P., Marincovic D., Allard r.,Ayala F. Correlation between developmental rates, enzyme activities, ribosomal DNA spacer length phenotypes and adaptation in Drosophila melanogaster II Procl. Natl Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 610 - 614.

35. Davis J., Nixon K. Population, genetic variation and the delimitation f the phylogenetic species // Syst. Biol. V. 41. P. 421 435.

36. Derancourt J., Lebor A.S., Zukerkandl E. Sequence nucleotides et evolution // Bull. Soc. Chim. Biol. 1967. V. 49. P. 577-603.

37. DeSalle R., Freedman Т., Prager, Wilson A. Tempo and mode of sequence evolution in the mitochondrial DNA of Hawaiian Drosophila И J. Mol. Evol. 1987. V. 26. P. 157-164.

38. Disotel Т., Honeycutt R., Ruvolo M. Mitochondrial DNA phylogeny of the old-world monkey tribe Papilioni // Mol. Biol. Evol. 1992. V. 9. P. 1 13.

39. Dobler S., Farrell B. Host use evolution in Chrysochus milkweed beetles: Evidence from behavior, population genetics and phylogeny // Mol. Ecol. 1999. V. 8. P. 1297-1307.

40. Dover G. A molecular drive through evolution // Bioscience. 1982. V. 32. P. 526 533.

41. Farrel B. Evolutionary assembly of the milkweed fauna: cytochrome oxidase I and the age of Tetraopes beetles // Mol. Phyl. Evol. 2001. V. 18. № 3. P. 467 -478.

42. Farris J.S., Kluge A.G., Eckardt M.J. A numeral approach to phylogenetic systematics // Syst. Zool. 1970. V. 19. P. 172 189.

43. Felsenstein J. Phylogenies from molecular sequences: inference and reliability //Annu. Rev. Genet. 1988. V. 22. P. 521 565.

44. Fitch W.M. The estimate of total nucleotide substitutions from pairwise differences is biased // Philos. Trans. R. Soc. (Lond.) B. Biol. Sci. 1986. V. 312. P. 317-324.

45. Fitch W.M., Marcowiz E. An improved method for determining codon variability in a gene and its application to te rate of fixation of mutations in evolution // Biochem. Genet. 1970. V. 4. P. 579 593.

46. French S., Robson B. What is a conservative substitution // J. Mol. Evol. 1983. V. 19. P. 171-175.

47. Gerbi S., Gourse R., Clark C. Conserved regions within ribosomal DNA: Location and some possible functions // The Cell Nucleus, X / Eds Busch H., Rothblum L. N. Y.: Acad. Press, 1982. P. 351 386.

48. Gillespie J.H. The causes of molecular evolution. Oxford University Press, New York. 1991.

49. Harlew R.S. and Tarto S. A two-stage model for the control of rDNA magnification //Genetics. 1985. V. 109. P. 691 -700.

50. Hillis D., Davis S. Evolution of ribosomal DNA: Fifty million years of recorded history in the frog genus Rana // Evolution. 1986. V. 40. P. 1275 1288.

51. Hillis D., Dixon M. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference//Q. Rev. Biol. 1991. V. 1991. P. 411 -453.

52. Hodek I. Biology of Coccinellidae. Praque. Academia. 1973. 260 p.

53. Howland D., Hewitt G. Phytogeny of the Coleoptera based on the mitochondrial cytochrome oxidase I sequence data // Insect. Mol. Biol. 1995. V.4. №3. P. 203-215.

54. Irwin D., Kosher Т., Wilson A. Evolution of the cytochrome b gene of mammals //J. Mol. Evol. 1991. V. 32. P. 128-144.

55. Juan C., Oromi P., and Hewitt G.H. Phylogeny of the genus Hegeter ( Tenebrionidae, Coleoptera) and its colonization of the Canary Islands deduced from cytochrome oxidase I mitochondrial DNA sequences // Heredity. 1996. Vol. 76. P. 392 403.

56. Juan C., Oromi P., and Hewitt G.H. Mitochondrial DNA sequence variation and phylogeography of Pimelia darkling beetles on the Island of Tenerife (Canary Islands) // Heredity. 1996. V. 77 P. 589 598.

57. Kessing В. H. Strongylocentrotid sea urchin mtDNA: phylogenetic relationships and patterns of molecular evolution. M. S. thesis, Unuversity of Hawaii, Honolulu.

58. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol. 1980. Vol. 16. P. 111-120.

59. Kliman R., Andolfatto P., Coyne J., Depaulis F„ Kreitman M., Berry A., McCarter J., Wakeley J., Hey J. The population genetics of the Drosophila simulans comlex species // Genetics. 2000. V. 156. № 4. P. 1913 1931.

60. Kondo R., Horai S., Satta Y., Takahata N. Evolution of hominoid mitochondrial DNA with special reference to the silent substitution rate over the genome // J. Mol. Evol. 1993. Vol. 36. P. 517-531.

61. Kumar S., Tamura K., Nei M. Molecular evolutionary genetic analysis. Version 2.1. The Pennsylvania State University. 2001. University Park. PA 16802.

62. Liu H., Beckenbach. Evolution of the mitochondrial cytochrome oxidase II gene among ten orders of insects // Mol. Phyl. Evol. 1992. V. 1. P. 41 52.

63. Long E. O., Dawid I. B. Repeated genes in eukaryotes //Annu. Rev. Biochem. 1980. V. 49. P. 727-764.

64. Majerus M. E. N. Ladybirds. London: HarperCollins Publ., 1994. 367 p.

65. Mardulin P. Phylogeography f the Vosges mountains populations of Gonostena pallida (Coleoptera: Chrysomelidae): a nested clade analysis of mitochondrial DNA haplotypes // Mol. Ecol. 2001 V. 10. P. 1751 1763.

66. Martin A. P., Naylor G. J. P., Palumbi S. R. Rates of mitochondrial DNA evolution in shares are slow compared with mammals // Nature. 1992. V. 357. P. 153-155.

67. Miyamoto M.p Kraus F., Ryder O. A. Phylogeny and evolution of anlered deer determined from mitochondrial DNA sequences // Procl. Natl Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 6127-6131.

68. Miyata Т., Hayashida H., Kikundo R., Hagesawa M., Kobayashi M., Koike K. Molecular clock of silent substitution: at least sixfold prepondance of silent changes in mitochondrial genes over those in nuclear genes // J. Mol. Evol. 1982. Vol. 19. P. 28-35.

69. Moritz С., Dowling Т.Е., Brown W.M. Evolution of animal mitochondrial DNA: relevance for popular biology and systematics // Annu. Rev. Ecol. Syst. 1987. Vol. 18. P. 269-292.

70. Nevo E., Beiles A. Ribosomal non-transcribed spacer polymorphism in subterranean mole rats: genetic differentiation, environmental correlates and phylogenetic relationships // Evolut. Ecol. 1988. V. 2. P. 139 156.

71. Nice C., Chris, Shapiro A. M. Patterns of morphological, biochemical, and molecular evolution in the Oeneis chryxus Complex (Lepidoptera: Satyridae): a test of historical biogeographical hypotheses // Mol. Phyl. Evol. 2001. V. 20. №1. P. 111-123.

72. Nigro L., Solignac M, Sharp P. Mitochondrial DNA sequence divergence in the melanogaster and oriental species subgroups of Drosophila // J. Mol. Evol. 1991. Vol. 33. P. 156-162.

73. Penny D., Hendy M.D., Steel M.A. Progress with methods for constructing evolutionary trees // Tree. 1992. V. 7. P. 73 79.

74. Rokas A., Nylander A. A., Ronquist F., Stone N. G. A maximum-likelihood analysis of eight phylogenetic markers in gallwasps (Hymenoptera: Cypinidae): implications for insect phylogenetic studies // // Mol. Phyl. Evol. 2002. V. 22. №2. P. 206-209.

75. Roslin T. Spatual population structure in a patchily distributed beetle // Mol. Ecol. 2001 V. 10. P. 823 837.

76. Ruvolo M., Disotel T. R., Allard M. W., Brown M. Resolution of the African hominoid trichotomy by use of a mitochondrial gene sequence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 1570 1574.

77. Saitou N, Nei M. The neigbour joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 406 - 425.

78. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cloning: Laboratory Manual // N. Y.: Cold Spring Harbor Univ. Press. 1989. V. 1 3. 1626 p.

79. Saraste M. Structural features of cytochrome oxidase // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. P. 331 -366.

80. Sharp P., Li W.H. On the rate of DNA sequence evolution in Drosophila И J. Mol. Evol. 1989. V. 28. P. 398-402.

81. Shoemaker J.S., Fitch W.M. Evidence from nuclear sequences that invariable sites should be considered when calculating sequence divergence // 1989. Mol. Biol. Evol. 1989. V. 6. P. 270-289.

82. Simon C., Franke A., Martin A. Polymerase chain reaction: DNA extraction and amplification, pp. 329-355. In G.M. Hewitt ed., Molecular techniques in taxonomy. NATO Advanced Studies Institute, H57, Springer, Berlin. 1991.

83. Sperling F., Hickey D. A. Mitochondrial DNA sequence variation in the spruce budworm species complex (Choristoneura: Lepidoptera) // Mol. Biol. Evol. 1994. V. 11. P. 656-665.

84. Suzuki H., Tsuchiya K., Sakaizumi M., Wakana S., Sakura S. Evolution of restriction sites of ribosomal DNA in natural populations of the field mouse, Apodemus speciosus// J. Mol. Evol. 1994. V. 38. P. 107- 112.

85. Suzuki H., Sato Y., Ohba N. Gene diversity and geographic differentiation in mitochondrial DNA of the genji firefly, Luciola cruciata (Coleoptera: Lampyridae) // Mol. Phyl. Evol. 2002. V. 22. № 2. P. 193-205.

86. Swofford D. L., Olsen C.J. Phylogeny reconstruction, pp. 411-501. In D.M. Hillis and Moritz eds., Molecular systematics II. Sinauer, Sunderland, MA. 1990.

87. Swofford D. L. Phylogenetic analysis using parsimony. Illinois Natural History Survey, Urbana, IL. 1993.

88. Temleton A. B. Nested clade analyses of phylogeographic data: testing hypothesis about gene flow and population history // Mol. Ecol. 1998. V. 7. P. 381 397.

89. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL-W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting, positions specific gap penalties and weight matrix choice // Nucl. Acids Res. 1994. V. 22. p. 4673-4680.

90. Vogler A. P., DeSalle R., Assmann Т., Knisley B. Molecular population genetics of the endangered tiger beetle Cicindela dorsalis (Coleoptera: Cicindelidae) //Ann. Entomol. Soc. Am. 1993. V. 86. № 2. P. 142 152.

91. Vogler A. P., DeSalle R. Phylogeographic patterns in coastal north American tiger beetles (Cicindela dorsalis Say) inferred from mitochondrial DNA sequences // Evol. 1993. V. 47. № 4. P. 1192 1202.