Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические механизмы эволюции вируса гепатита C
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические механизмы эволюции вируса гепатита C"
НА ПРАВАХ РУКОПИСИ
КАЛИНИНА Ольга Викторовна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЭВОЛЮЦИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С
03.02.02 - вирусология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
005533320
2 6 СЕН 2013
Санкт-Петербург 2013
005533320
Работа выполнена в Федеральном бюджетное учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»
Научные консультанты:
член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, заместитель директора по научной работе ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова» Российской академии медицинских наук
доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник специализированной научно-исследовательской лаборатории эпидемиологии и профилактики СПИДа ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора
доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярных основ дифференцировки клеток ФГБУН Институт цитологии Российской Академии Наук
Ведущая организация: ФГБУ «Научно-исследовательский институт ГРИППА» Минздрава России.
Защита диссертации состоится «16» декабря 2013 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д 208.131.01 в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава России.
Автореферат разослан «13» сентября 2013 года
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук
Жебрун
Анатолий Борисович
Нарвская
Ольга Викторовна
Юминова
Надежда Васильевна
Кравченко Алексей Викторович
Поспелов
Валерий Анатольевич
Бурцева Елена Ивановна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
По данным Всемирной Организации Здравоохранения, в мире более 150 млн. человек (около 3% населения планеты) инфицировано вирусом гепатита С (ВГС), ежегодно более 350 тыс. человек умирает от болезней печени, ассоциированных с вирусным гепатитом С (ГС) [Инф. бюлл. № 164, ВОЗ, 2012]. За последнее десятилетие число зарегистрированных больных хроническим гепатитом С (ХГС) в Российской Федерации увеличилось вдвое и достигло 40,9°/00оо [Вирусные гепатиты в РФ, под редакцией Онищенко Г., Жебрун А., 2010]. По тяжести течения заболевания, причиняемому экономическому ущербу ГС занимает одно из ведущих мест в инфекционной патологии человека. Это обусловлено высокой генетической вариабельностью ВГС, которая обеспечивает «ускользание» вируса от факторов иммунной защиты организма человека, что способствует значительной хронизации заболевания (до 70%) и затрудняет разработку эффективных методов специфической профилактики и лечения ГС [Шахгильдян И., Михайлов М., Онищенко Г., 2003]. В связи с этим и учитывая тот факт, что предотвращение распространения возбудителя является основным направлением борьбы с данным заболеванием, исследование природных популяций и эволюции ВГС приобретает особую актуальность в современных условиях.
Вирус гепатита С, один из наиболее динамично эволюционирующих патогенов вирусной природы, был открыт в 1989 г и отнесен к семейству Flaviviridae, род Hepacivirus [Choo Q. et al., 1989]. Современная классификация ВГС включает 6 генотипов и более 300 субтипов вируса, при этом постоянно появляются сообщения о выявлении новых вариантов вируса [Simmonds P. et al., 2005]. Долгое время генетическое разнообразие ВГС связывали только с высокой частотой мутаций, накапливаемых в геноме. Другой фундаментальный механизм изменчивости - рекомбинации, происходящие между геномами вирусов различных генотипов/серотипов, считали несвойственными ВГС или полагали, что образующиеся рекомбинанты являются «нежизнеспособными». Сравнение результатов генотипирования, выполненных на основании различных участков генома изолятов ВГС за более чем десятилетний период не выявило генетических рекомбинаций у данного возбудителя [Simmonds P. et al., 1999]. В то же время, в немногочисленных образцах сыворотки крови было обнаружено одновременное присутствие нескольких изолятов ВГС, принадлежавших к различным генотипам [Львов Д. с соавт., 1997; Jarvis L. et al., 1994; Goumay J. et al., 1995; Sheng L. et al., 1995; Viazov S. et al., 2000). Таким образом, вопрос о возможности формирования новых вариантов ВГС за счет рекомбинации между геномами изолятов различных генотипов оставался открытым, поэтому неполными оставались и представления о механизмах эволюции ВГС, понимание которых является крайне важным как в теоретических, так и прикладных областях исследований: для мониторинга глобальной и локальной популяций ВГС, для прогнозирования развития эпидемического процесса и научно-обоснованного выбора стратегии профилактических, лечебных и противоэпидемических мероприятий.
Изложенное определило цель и задачи настоящей работы.
Цель исследования
Изучить генетические механизмы изменчивости ВГС и оценить их вклад в формировании структуры современной популяции ВГС.
Задачи работы
1. Доказать с использованием молекулярно-генетических методов исследования и филогенетического анализа наличие явления рекомбинации в эволюции вируса гепатита С.
2. Изучить механизм формирования природного рекомбинанта RFl_2k/lb на основе анализа первичной и вторичной структур генома.
3. Оценить значение природного рекомбинанта RFl_2k/lb как модели для изучения молекулярно-генетических механизмов резистентности ВГС к противовирусным препаратам на примере резистентности к интерферону.
4. Оценить значимость природного рекомбинанта RFl_2k/lb в формировании современной структуры популяции ВГС.
5. Изучить роль синонимических мутаций в core области генома ВГС в формировании вариантов вируса с измененным белковым профилем.
Научная новизна
Впервые в мире доказано существование явления природной генетической рекомбинации ВГС и установлена его роль в эволюции ВГС.
Идентифицирован природный рекомбинант ВГС RFl_2k/lb, определена нуклеотидная и аминокислотная последовательность открытой рамки считывания рекомбинантного генома.
Впервые на основе анализа вторичной структуры «родительских» геномов и генома рекомбинанта предложена модель формирования природных рекомбинантов ВГС. Обоснована значимость природного рекомбинанта ВГС RFl_2k/lb для изучения молекулярно-генетических механизмов, обуславливающих формирование резистентности к интерферону.
Получены данные о распространенности природного рекомбинанта ВГС RFl_2k/lb в современной мировой популяции ВГС.
Показано значение синонимических мутаций в core области генома ВГС в эволюции ВГС при формировании вариантов с повышенным уровнем экспрессии соге+1/ARFP белка, обуславливающего атипичный профиль антител к ВГС у лиц, инфицированных такими изолятами.
Практическая значимость исследования
Нуклеотидные последовательности изученных изолятов ВГС депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank, что позволяет участвовать в международных исследованиях распространения природного рекомбинанта RFl_2k/lb и глобальной эпидемиологии ВГС; осуществлять мониторинг структуры популяции ВГС в различных географических зонах; проводить эпидемиологическую диагностику случаев спорадической и вспышечной заболеваемости вирусным гепатитом С (идентификация источника, путей и
факторов передачи, и благодаря этому — принятие адресных мер профилактики); расследование случаев завоза вариантов ВГС из других географических зон мира.
Картирование природного сайта рекомбинации легло в основу последующего создания in vitro успешных химерных рекомбинантов ВГС для изучения значения различных участков генома ВГС в морфогенезе вируса, в том числе, для изучения молекулярно-генетических механизмов, обуславливающих формирование резистентности к противовирусным препаратам.
В клинической практике доказательство инфицирования пациента природным рекомбинантом RFl_2k/lb позволит своевременно выбрать стратегию противовирусной терапии.
Полученные результаты могут быть использованы в деятельности клинико-диагностических лабораторий, учреждений Госсанэпиднадзора и здравоохранения, в научных учреждениях, при разработке целевых программ; в учебном процессе в медицинских вузах.
Положения, выносимые на защиту
1. Геном вируса гепатита С подвержен природной рекомбинации. Рекомбинация является одним из механизмов эволюции ВГС.
2. Природный рекомбинант RFl_2k/lb сформировался в результате гомологичной рекомбинации геномов lb и 2к по механизму непроцессивной смены матрицы.
3. Природный рекомбинант RFl_2k/lb обладает селективным преимуществом, обеспечивающим ему значимую роль в эпидемическом процессе по сравнению с «родительским» изолятом субтипа 2к.
4. Синонимические точечные мутации в core области генома вируса гепатита С могут приводить к формированию изолятов с измененным белковым профилем.
Апробация работы
По теме диссертации опубликованы 43 печатные работы, включая 12 статей в журналах списка, рекомендованного ВАК, 9 из них - в зарубежных изданиях.
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на 22 российских и международных семинарах, конгрессах и конференциях в 2001-2013 гг.: 8th International Symposium on Hepatitis С and related Viruses, 2-5 September, Paris, Франция, 2001; VIII Съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-28 марта, Москва, 2002; 5th Baltic Nordic Congress of Infectious Diseases, 22-25 May, 2002, St.Petersburg, Russia; 9th International Meeting on HCV and Related Viruses, 7-11 July, 2002, San-Diego, USA; XIIth International Congress of Virology, 27 July - 1 August, 2002, Paris, France; 10th International Meeting on HCV and Related Viruses, December, 2003, Kyoto, Japan; Human Hepatitis С Workshop in the frame of New Visby Program of the Swedish Institute Stockholm, 10 March, 2003; 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 1^4 May 2004, Praga, Чехия; 6th Nordic-Baltic Congress on Infectious Diseases, 3-6 June, Palanga, Lithuania, 2004; 11th International Meeting on HCV and Related Viruses, October, 2004, Heidelberg, Germany, 2004;
12th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. 1-5 July, Paris, Франция, 2006; 3rd HCV Visby Program Workshop: HCV infection- factors associated with persistence, clearance and protection, 13-14 February, Malmo, Sweden 2006; Международная научная конференция в честь 150-летия со дня рождения С.Н. Виноградского «Биоразнообразие и генетика микроорганизмов», 4-5 сентября, Санкт-Петербург, 2006, 4th Annual New VISBY HCV University Network Meeting, 9-12 February, Stokholm 2007; Confer. Scientif. Internat. Du Reseau Internat. Des Instituts Pasteur, 26-27 June, Paris, Франция, 2008; 5th Annual meeting of the New VISBY University Network on hepatitis C. Moscow, 31 January - 4 February, 2008; Ha заседании лаборатории микробиологии и иммунологии Пекинского Детского Госпиталя, 9 ноября, 2011, Пекин, Китай; The 8th Annual Conference on Hepatitis C, Vilnius, 13-16 February, Lithvenia, 2011; The 9th Annual Conference on Hepatitis C, St Petersburg, 31 March - 04 April.2012; X Съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 12-13 Апреля, Москва, 2012; IV Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням, 26-28 Марта, Москва, 2012; 10th Annual Conference of New Visby Network in Hepatitis, 10-13 February, Riga, Latvia, 2013; Международная конференция к 90-летию НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, 5-7 Июня, Санкт-Петербург, 2013.
Внедрение результатов исследований в практику
1. Природный рекомбинант RFl_2k/lb включен в действующую классификацию вируса гепатита С как отдельная номенклатурная единица, названная циркулирующая рекомбинантная форма CRF 01_lb2k (Kuiken С. and Simmonds P., 2009. Nomenclature and Numbering of the Hepatitis С virus. Chapter 4. Hepatitis C: Methods and Protocols, Second Edition, vol. 510, ed. Hengli Tang).
2. 193 нуклеотидные последовательности депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank: 48 фрагментов размером около 550 н. о. из core области генома (JF701908.1-JF701913.1), 130 фрагментов из NS5B области размером 253 н. о. и четыре фрагмента размером 1776 н. о. (HQ641453.1-HQ641455.6), три фрагмента размером 1210 н. о. из E2/NS3 области генома, два фрагмента размером 3620 н. о. (AY070214.1) и 3650 н. о. (AY70215.1) из core/NS3 области, две открытые рамки считывания рекомбинантного генома (AY587845.1 - 9357 н. о.) и «родительского» генома субтипа lb (AY587844.1 -9365 н. о.).
Личное участие автора в получении результатов
Основные результаты получены лично автором. Выделение изолятов ВГС из образцов сыворотки крови пациентов с диагнозом ГС, молекулярно-генетические исследования, компьютерный и статистический анализ проведены автором в Шведском институте по контролю за инфекционными заболеваниями (Стокгольм) при участии проф. L. О. Magnius, Н. Norder, Т. Tallo, С. Jern в рамках совместного научно-исследовательского проекта и в лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.
Серологические и молекулярно-генетические исследования образцов плазмы крови доноров Королевства Камбоджа, компьютерный и статистический анализ проведены в Парижском Институте Пастера при участии проф. A. Budkowska, Р. Maillard, а также при участии V. Horm и Е. Nerrienet (Институт Пастера, Королевство Камбоджа), A. Kakkanas (Институт Пастера, Греция) в рамках Трансверсального проекта Сети Институтов Пастера (руководитель проекта проф. P. Mavromara, Институт Пастера, Греция), персональных грантов автора от Мэрии Парижа и Национального Исследовательского Агенства по изучению ВИЧ и вирусных гепатитов (ANRS, Франция) и в лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.
Изучение структуры генотипов ВГС в Санкт-Петербурге в 1999-2003 гг. было проведено совместно с проф. C.JI. Мукомоловым (зав. лаб. вирусных гепатитов ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера). Изучение структуры генотипов ВГС в Москве и молекулярно-генетические исследования, посвященные изучению влияния рекомбинанта RFl_2k/lb на эффективность противовирусной терапии, выполнены при участии д.м.н. О.О. Знойко (МГМСУ им. А.И. Евдокимова, Москва) и к.х.н. М.Г. Исагулянц (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 228 страницах машинописного текста и состоит из введения, 7 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, 4 главы результатов собственных исследований, обсуждение результатов), выводов и приложения. Иллюстративный материал включает 10 таблиц и 43 рисунка. Список литературы содержит 502 наименования, из них 24 отечественных и 478 иностранных источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе изучены фрагменты нуклеотидных последовательностей 45 из 149 изолятов ВГС, РНК которых была выделена из образцов сыворотки крови санкт-петербургских пациентов в 1999 г. на базе Шведского института по Контролю за инфекционными заболеваниями, и все изоляты были генотипированны на основе NS5B области генома [Калинина О. автореф. к.б.н., 2000]. С целью изучения возможности природной рекомбинации 41 изолят был отобран таким образом, чтобы представляли выборку, в которую вошли изоляты из всех субкластеров, сформированных на разных ветвях филогенетического дерева, основанного на NS5B области генома: по 18 изолятов принадлежали к субтипу 1Ь и За, два - к субтипу 2а, по одному изоляту - к каждому из субтипов 1а, 2с и 4а (Таблица 1). Четырнадцать из 41 изолята ВГС были выделены от анти-ВГС позитивных пациентов, употреблявших внутривенно наркотические средства (ВНС), четыре -от пациентов отделений гемодиализа, 23 - от пациентов с диагнозом ГС. Еще четыре изолята, принадлежавшие к субтипу 1Ь по NS5B области генома, были включены в исследование дополнительно.
Таблица I. Распределение изолятов ВГС по субтипам согласно данным филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей из ЫБ5В области генома.
Изоляты ВГС Субтипы ВГС
1а lb 2а 2с За 4а
всего 149 4 82 4 2 56 1
отобрано 41 1 18 2 I 18 1
В работе изучено 306 образцов сыворотки крови, полученных от анти-ВГС и РНК ВГС позитивных пациентов, наблюдавшихся в течение 1998-2010 гг. в Санкт-Петербурге (75 пациентов, включая 16 пациентов гемодиализа, 8 пациентов с гепатокарциномой), Москве (64 пациента), Эстонии (67 пациентов), и в стационаре одного из округов Стокгольма (100 пациентов). Образцы сыворотки крови, полученные от пациентов Санкт-Петербурга и Москвы, были предоставлены д.м.н. О. О. Знойко (МГМСУ им. А. И. Евдокимова, Москва), проф. К. В. Ждановым и д.м.н А. С. Гусевым (BMA им. С. М. Кирова, СПб), к.м.н. В. В. Чахарьян (ЦГСЭН в Калининском районе, СПб), врачом П. Н. Кислым (СПбГМА им. И.И. Мечникова), к.м.н. М. И. Генераловым (ЦНИРРИ Росздрава, СПб, пос. Песочный).
В работе изучено 87 образцов плазмы крови (58 анти-ВГС положительных и 29 анти-ВГС отрицательных), полученных из донорской крови добровольцев в 2002-2003 гг. в Королевстве Камбоджа. ИФА с использованием трех коммерческих тест-систем: 1) Serodonia® HCV (Fujirebio, Япония); 2) Monolisa anti-HCV PLUS Assay Version 2 (BioRad, Mame la Coquette, Франция); 3) третье поколение иммуноферментного анализа микрочастиц (MEIA) (AxSYM HCV, version 3.0; Abbott, Weisbaden, Германия), проведенный в вирусологической лаборатории Института Пастера Королевства Камбоджа в рамках Трансверсального проекта Сети Институтов Пастера, подтвердил наличие анти-ВГС в 58 образцах плазмы крови и их отсутствие в 29 образцах, использованных в последующих экспериментах в качестве отрицательного контроля.
Все образцы были получены для научного исследования под кодовыми наименованиями согласно Хельсинской декларации на основании протоколов Этического комитета ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (протокол № 11 от 01.04.2013), Национального Этического Комитета по Исследованиям при Министерстве Здравоохранения Королевства Камбоджа (протокол № 1296/02 OGH), Этического комитета ЦНИРРИ Росздрава, СПб, пос. Песочный (протокол № 02-07 от 12.02.2007).
Определение вирусной нагрузки в образцах плазмы крови было проведено с помощью коммерческой тест-системы b-DNA assay (Versant HCV RNA 3.0, Simmens Health Care Diagnostics St. Denis, Франция). Core антиген ВГС оценивали методом ИФА с использованием коммерческой тест-системы Ortho® Antibody to HCV Core Antigen ELISA Test System (Ortho Diagnostics, Wako, Германия). Наличие анти-ВГС подтверждали, используя Chiron RIBA HCV 3.0 Strip
Immunoblot Assay (SIA) (Ortho Clinical Diagnostics, Франция). Все реакции проводили согласно инструкциям производителей.
Антитела к core белку ВГС определяли, используя синтетический core пептид (3-75 ам. о.) субтипа 1а, предоставленный д.б.н. A.A. Колобовым (НИИ ОЧБ, СПб), и рекомбинантный core белок (1-120 ам. о.), предоставленный проф. Р. Mavromara (Hellenic Pasteur Institute, Афины, Греция). Условия ИФА отрабатывали на стандартной панели, включавшей 10 анти-ВГС положительных, 10 анти-ВГВ (вирус гепатита В) положительных образцов сыворотки крови и 10 образцов сыворотки крови от здоровых людей. Пороговое значение здесь и далее определяли как среднее из величин поглощений, регистрируемых для отрицательных образцов, и образцы считали положительными, если величина поглощения тестируемого образца превышала среднее из величин поглощений отрицательных образцов более чем в 2,1 раза.
Антитела к core+1/ARFP белку определяли, используя рекомбинантный core+1/ARFP белок (10-169 ам. о.) субтипа 1а, предоставленный проф. Р. Mavromara. Специфичность анализа подтверждали, используя анти-соге+1/ARFP положительные образцы сыворотки крови анти-ВГС положительных пациентов, предоставленные проф. J. М. Pawlotsky (National Reference Center for Viral Hepatitis В, С and Delta, Hôpital Henri Mondor, Université Paris-Est, Créteil, France).
Наличие анти-core+l/ARFP антител в образцах сыворотки крови, не содержавших анти-core антител, подтверждали методом ИФА с синтетическим core+1/ARFP пептидом (91-106 ам. о.) [Vassilaki et al., 2003].
Тотальную РНК выделяли из образцов сыворотки крови, используя гуанидин изотиоционат-фенол-хлороформный метод с модификациями; коммерческий реагент Trizol (GIBCO-BRL, США); коммерческие наборы реагентов фирмы Qiagen или комплект реагентов «РИБО-СОРБ» AmpliSens (ФГУН ЦНИИЭ, Москва) согласно инструкциям. Тотальную РНК хранили при -80°С. Синтез кДНК осуществляли с использованием фермента обратной транскриптазы Superscriptll (GIBCO-BRL) и гексаоксирибонуклеотидных праймеров.
Гнездная ПЦР включала два этапа, на которых использовали внешние и внутренние праймеры соответственно. На первом этапе матрицей служила кДНК, на втором - продукты ПЦР, полученные с внешними праймерами. Второй этап ПЦР проводили с внутренними праймерами для повышения чувствительности и специфичности метода. Амплификацию фрагментов из 5'UTR/core и NS5B областей генома проводили с использованием «вырожденных» праймеров как описано ранее [Калинина О., автореф. к.б.н., 2000].
Стратегия амплификации больших фрагментов ПЦР приведена на Рисунке 1. Для шести изолятов ВГС (N747, N796, N611, N674, N687 и N589) были амплифицированы с использованием набора Expand Long Template PCR System (Roche Diagnostic GmbH) два перекрывающихся фрагмента core/NS2 (в положении 342-3485) и E2/NS3 (в положении 2089-3741). Для двух изолятов ВГС (N687 и N589) были амплифицированы с использованием набора Expand Long Template PCR System еще четыре перекрывающихся фрагмента E2/NS3 (в положении 2500-5157), NS3/NS5A (в положении 4036-6815), NS3/NS5B (в положении 5002-8638) и NS5B (в положении 8168-9398).
соге| El I E2 |p7¡ NS2 | NS3 | NS4 | NS5a[ NS5B
uni^-l JM NSfrsl 3741ч B^ol 4505s 5<£8j L68I5 hqiyi 9028f 93j3ai5^Sas
750 2089 3741 4036 6815 8168 9398
565s
Iff COREs t_NS3-jAS Sj002s U5^22i_7y2as ^05 J 20
'2 256 E2-asl P7-2as NS2-2as348S 5002 67KI, 7085as 80S4as 8638
Efr2S Nj^-s2 40<)5ai 5|^7as 2500 TZ. 5157
Рисунок 1. Стратегия амплификации и секвенирования перекрывающихся больших ПЦР фрагментов. Нуклеотидные положения соответствуют нумерации в геноме референсного изолята pj6CF (ОепВапк Асс. АР 177036). Положение праймеров показаны над и под ПЦР фрагментами. Стрелки обозначают прямой и обратный праймеры соответственно.
Продукты амплификации после второго этапа ПЦР визуализировали в 1,2% агарозном геле. Размеры искомых ПЦР фрагментов были для core/NS2 - 3143 н. о.; для E2/NS3 - 1652 н. о. и 2657 н. о.; для NS3/NS5A - 2779 н. о.; для NS3/NS5B -3636 н. о. и для NS5B - 1230 н. о.
Секвенирование ДНК проводили методом лимитированного секвенирования. Стратегия секвенирования ПЦР фрагментов представлена на Рисунке 1. ПЦР продукты очищали с использованием коммерческого набора реагентов GFX PCR DNA и Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech) согласно прилагаемой инструкции. Реакцию лимитированного секвенирования проводили с использованием BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Kits (PE Biosystems, version 2.0) и 4 пмоль соответствующего праймера. Капиллярный электрофорез выполняли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems).
Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с помощью пакета программ LASERGENE (DNA STAR Inc., США) и Clustal X. Филогенетический анализ был выполнен методами neighbor-joining (метод объединения ближайших соседей) и UPGMA (невзвешенный парногрупповой метод) (программа NEIGHBOR), используя Kimura's two parameter (двухпараметрический метод коррекции) (программа DNASIST) из пакета PHYLIP версия 3.53 [Вейр Б., 1995; Felsenstein J., 1993] и из программы Mega v.5.05 [Tamura К. et al., 2011]. В качестве внешней группы служил наиболее близкородственный вирус, входящий в состав рода Hepacivirus, GBV-B. Обработку филогенетических деревьев проводили с помощью программы TREETOOL версии 1.0 в GDE версии 2.2 (Genetic Data Environment, Milipore Imaging Systems, Ann Arbor, MI). Similarity plots («сравнение подобия») и Bootscan анализ («самокопирование») были выполнены с помощью программы SimPlot version 1.2.2 и bootscanning с использованием пакета PHYLIP версия 3.53 для филогенетического анализа [Felsenstein J., 1993; Lole К. et al., 1999].
Моделирование вторичной структуры РНК выполняли с помощью программы Mfold version 3.1 с использованием стандартных параметров [Mathews D. et al., 1999]. Вторичная структура РНК была смоделирована для core-NS3 области (+)-цепи РНК ВГС, включавшей сайт рекомбинации, для восьми изолятов: рекомбинанта RFl_2k/lb (N687), изолятов субтипа lb (N589, kl-s2, HC-Jta, MD4-1), субтипа 2k (VAT96), субтипа За (HC-J6, СВ); а также для core области генома изолятов субтипа la (Н, р34, р36). Вторичная структура РНК была предсказана также для core-NS3 области (-)-цепи РНК для трех изолятов ВГС: рекомбинанта RFl_2k/lb (N687), изолятов субтипа lb (N589) и субтипа 2k (VAT96).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel 6.0. Для подтверждения достоверности совпадения кластеров на филогенетическом дереве проводили бутстрэп анализ (bootstrap), используя программу Mega v.5.05, а также программы SEQBOOT и CONSENSE из пакета PHYLIP версии 3.53. Значение бутстрэппинга >70 соответствует вероятности > 95% (р<0,05 и выше) [Вейр Б., 1995; Salminen М.О., Cobb W, 1998].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
РЕКОМБИНАЦИЯ - ОДИН ИЗ МЕХАНИЗМОВ ЭВОЛЮЦИИ ВИРУСА
ГЕПАТИТА С
В настоящем исследовании результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей из двух различных областей генома (5'UTR/core и NS5B) шести изолятов ВГС позволили обосновать гипотезу о возможности спонтанной рекомбинации у данного вируса.
Для 41 изолята ВГС, генотипированного ранее по NS5B области генома, секвенировали фрагмент 5'UTR/core области генома. В результате филогенетического анализа на основе 5'UTR/core области у 39 изолятов наблюдалось полное совпадение результатов генотипирования, полученных при анализе нуклеотидных последовательностей обеих областей (NS5B и 5'UTR/core), тогда как два изолята, N747 и N796, отнесенные по NS5B области к субтипу 1Ь, по 5'UTR/core области формировали единую ветвь с изолятом VAT-96 субтипа 2к, выделенным в Молдавии (Samokhvalov Е. et al., 2000). Наблюдаемое у двух изолятов (N747 и N796) расхождение между результатами генотипирования, основанных на двух различных областях (5'UTR/core и NS5B) генома, и данные об отсутствии эпидемиологической связи между пациентами, из образцов сыворотки которых были получены эти изоляты, свидетельствовали об их принадлежности к атипичным вариантам ВГС. В связи с этим, был продолжен поиск подобных атипичных изолятов, и в исследование включили еще четыре санкт-петербургских изолята (N687, N203, N611, N674) субтипа lb, формировавших единый кластер на филогенетическом дереве по NS5B области генома вместе с изолятами N747 и N796 (Рисунок 2). Филогенетический анализ на основе 5'UTR/core области генома показал, что все четыре изолята N687, N203, N611, N674 формировали кластер с изолятами N747, N796 и принадлежали по этой области к субтипу 2к (Рисунок 3).
Рисунок 2. Филогенетическое дерево, построенные на 280 н. о. из NS5B области генома 100 изолятов ВГС с использованием алгоритам "neighbor-joining". Геном вируса GBV-B (Асс. NC001655) использован для внешнего сравнения. Наименование и географическое происхождение изолятов ВГС указаны справа от каждой ветви. Атипичные изоляты отмечены буквой R.
779 St Petersburg — 7BS Si. Petersburg 704 Si.PewrsBurg 7B3 Sl Petersburg 5-2 Japan
' 732 SLPeleriOury 576 St.Petersburg J33 Japan
PJ6CF USA PH77CV Chimera HC-J6 Japan
778 St Petersburg 686 St Petersburg 300 SLPetersburg BEBE1 Japan H CJK 081 Jakarta
HCJK139 Thefland
611 R SLPetersburg 203 R SLPetersburg
S&L^etersbu?g — 674 R SLPetersburg 687 R SLPetersburg
HPCHK6 Japan
Рисунок 3. Филогенетическое дерево, построенные на 548 н. о. из 5'UTR/core области генома 100 изолятов ВГС с использованием алгоритма "neighbor-joining". Геном вируса GBV-B (Асс. NC001655) использован для внешнего сравнения. Наименование и географическое происхождение изолятов ВГС указаны справа от каждой ветви. Атипичные изоляты отмечены буквой R.
Тот факт, что все атипичные изоляты, принадлежавшие к различным субтипам lb и 2к в зависимости от анализируемой области генома, кластеризовались вместе на обоих филогенетических деревьях и данные об отсутствии эпидемиологических связей между пациентами, из образцов сыворотки крови которых была получена РНК атипичных изолятов, явились доказательством наличия успешной рекомбинации между геномами ВГС.
Для идентификации сайта рекомбинации для пяти атипичных изолятов (N747, N796, N611, N674, N687) и одного изолята субтипа lb (N589) секвенировали фрагмент генома, включавший область core — начало NS3 (между нуклеотидами 342-3485). Данный участок мог иметь сайт рекомбинации с наибольшей вероятностью, поскольку для вирусов, имеющих аналогичную ВГС структуру генома в виде несегментированной одноцепочечной (+)-РНК, таких как флавивирусы и пикорновирусы (в частности, полиовирусы), точку рекомбинации часто находили в гене, кодирующем первый неструктурный белок, или, реже, в генах, кодирующих белки оболочки [Furione М. et al., 1993; Guillot S. et al, 2000; Tolou H. et al., 2001].
«Similarity plots» и Bootscan анализ показали, что сайт рекомбинации располагается в NS2 гене. Нуклеотидные последовательности 5'UTR - р7 области генома атипичных изолятов и референсного изолята VAT-96 субтипа 2к были сходны. Нуклеотидные последовательности 5'-конца NS2 области генома рекомбинантных изолятов были схожи с таковыми аналогичной области генома изолята субтипа 2к, тогда как нуклеотидные последовательности 3'-конца этой области были подобны таковой субтипа 1Ь.
Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента, включающего соге-NS2 область, пяти рекомбинантных и «родительских» референсных изолятов kl-s2 субтипа 1 b и VAT-96 субтипа 2k позволил установить, что точка рекомбинации расположена во второй трети NS2 гена между нуклеотидами 3175 и 3176 (в соответствии с нумерацией генома изолята pj6CF), в пределах кодона 949 (Val/Ile ам. о.), за которым на полипротеине располагается консервативный для всех генотипов участок, соответствующий кодонам 950 - 953 (Рисунки 4 и 5). В его состав входит гистидин в положении 952, ассоциированный с энзиматической активностью NS2/NS3 цистеиновой протеазы [Grakoui F. et al., 1993]. Наличие этого консервативного участка в области сайта рекомбинации могло не только способствовать рекомбинационным событиям, но и обусловить появление «жизнеспособного» рекомбинантного варианта.
Ранее был сконструирован только один «успешный» инфекционный химерный вариант ВГС, содержавший открытую рамку считывания (ORF) субтипа lb, а 5'- и З'-терминальные фрагменты субтипа la [Yanagi М. et al., 1998]; тогда как «успешные» инфекционные межгенотипные 1а/2а химеры получить не удавалось [Yanagi М. et al., 1998]. Одним из факторов, объясняющих отсутствие «жизнеспособных» 1а/2а химер ВГС, мог служить неоптимальный выбор точки слияния геномов: до или сразу после р7 области генома.
После создания клеточной модели Huh7.5, эффективно экспрессирующей инфекционные вирионы JFH1 субтипа 2а (HCVcc), наше предположение о роли сайта рекомбинации в формировании жизнеспособного «потомства» было
подтверждено в экспериментах in vitro при разработке клеточной модели, продуцирующей межгенотипные инфекционные рекомбинантные вирионы ВГС [Yi М. et al., 2007]. Жизнеспособными в клеточной модели оказались только химеры 1а/2а, имевшие сайт рекомбинации внутри NS2 области или между NS2 и NS3 областями, тогда как потомство химеры с сайтом рекомбинации между р7 и NS2 генами, также как и в более ранних экспериментах, было нежизнеспособно. Все последующие жизнеспособные межгенотипные химерные рекомбинанты были сконструированы согласно вышеприведенным данным, т.е., с сайтом рекомбинации внутри или в конце NS2 области генома.
» »tt»(ictiiuiit(Tt»uit((n с t_jt iiimiuiHittcii vat-»«
■ Ш ! trit
2k
. 0 . 79«-S«l> 2k/lb 747-Stf 2k/lb 6«7-StP 2k /lb 611-2k/Ik 674-StP 2k /lb
t 4 T S II 599-StP lb UTt тЬа-гг
rHAAUtATtlCIUHIUCHHAtUC tAUIUlU I*t T А А С С VftT-9« 2k
.... 736-StJ» 2k /1Ь
■ Ш.
fm rr^i im m :im:Ei: # :::ei:: :irrm:
CTTtCTAAATtlACTCtCAC
.....
. ill. Ir Г С ft^lr TI
Ш
I
Val/ lie
jffi
747-StP 2k/lb €»7-S«P 2k/lb 611-StP 2k/lb «74-St* 2k/lb 5«9-StP lb K1-S2 lb
±
EL
Ha^i""
« A T jC AC
0
* T C,XC Xе t A A T i T t WI-9« 2k
Ж.
( 79« SrP 2k /lb
t 747 StP 2k /lb
А $8? StP 2k/lb
1 «11 it? 2k /lb
С 674 StP 2k /lb
t А SS9 KZ-S P 7 lb lb
I XT t С А С ( С fr
t А Г
« А С tCAtOci .. а.. it
С С С s С С AJLQJLt С С iQtOt С С А С С С С
VKT-96 2k
796>£tP 2k/lb 747-i2k/lb
««7-StP 2k/lb
€11-St? 2k/lb
«74-StJ> 2k/lb
339-StP lb
K1-S2 lb
ТТСТТТТС A t С С С А ATbtAbAAA А А А С TCATTtTt
.щ. . с Г С Т 1 А С С С & А . . . .1С АС (
с t t Т ( А I с с Ь А . . . .It А С С : :й: :
■ • . с Г С Т 6 А С с с & А .... [С А С С
П. . Г t I u t с с & А .... Т]А С С
«К- с Г t Г (А ( с С & А .... [t А С С
i*Z). с Г С Т С А С с с С А ....{С А С С . .га. .
сГ7. * С Т * А С с т * А -........ М i с Г с
TOT»*« 2k 79«-StP 2k/lb Hl-S^t 2k/lb 6S7-S tP 2k /lb 611-5tP 2k/lb €74-S tP 2k/lb S99-?tP lb ta-si lb
Рисунок 4. Сравнение нуклеотидных последовательностей внутри ЫБ2 области генома в районе рекомбинации референсных изолятов к1-к2, N589 и УАТ-96, и пяти атипичных изолятов N796, N747, N687, N611 и N674. Стрелка показывает точку рекомбинации. Нуклеотидные позиции пронумерованы согласно Рисунку 1. Номера изолятов и их принадлежность к субтипам ВГС указаны справа.
Е2
Ы Ь I 11И ИЧ С1 С I. »« II I I 6
а
.£1.
А I Е К I. V I ЬН&ЛЗЛЛЗЗН С Н I,
1
•Ш
773
СП1 ГГ I» 4«ИК5»
: ж
I
«м-и 2к
7»4-5» 2к/1Ъ
747-5« 2кУ1Ь
447-5» 9У/1Ъ
<11-5» 5к/1Ь
»74-51» 2к/1Ь
311-5» !Ь
1С1-52 1Ъ
р7 |
1УТИУТГ5ПС8И5Г8 1И
□
ити^инЕОЕоишчнлгтпиянисе
• Щ).....гп...................
........-.......ш
........ш........
Ш- • -Ш
Г""
.0.
1? I М
Л#у
НЕ 11 А А 3 С Р Е И А А 5 С
.1С А У ПСШМ.
■1итгПищ|.
УУЫАГ
VII-» П(-Ш 747-5»
417-51? «11-51»
1К-ПГ К1-52
?Х
2кУ1Ь 2к/П> 2к/]Ь
2к/1Ь
Ш
1Ь
51»«15Л1Ш[Л11]В1И(Р
• Ш...............|Ё1. .
В о АК О О К
II.
Щ»
I а т 41 VI
1!11111Т1ГС(1?1
11.ГО. . .(Ту
I I. Т С А V в]. I I ТС А I я|.
Г В I ТДИ I I
. . . -ш. .
ж.
1
т
I I О Р С Т ь А И] С н
754-5» 747-51» Н|-ПГ 411-51» 474-5» 1 IV 34»-5» I ЯУ К1-51
2)1
2к/Л> 2к/2Ь 2к/1Ь
гч/а гк/а а а
1Р и 1Т 1ТГ¥ЯНА ч »1 С» АУ»
~.....В.......И.........
[ I. Э Б Б К Г У О Я И Ь Ь Т I. С К,» Т С Т У I Т В Н I
-ш-
... .[¡ШЖ! .1кта1. .Р
.ш..,
! А Г П К|
I* г Н К!.
т I. Я 0 Н 7Н-Я7
т 1ЯС Н 747-512
т ЮБ Н 447-51»
т 1 й 0 В 411-51»
т 1Й& Н 474-51»
7 1 Я 0 Н 549-5«
т 1 0 1> Д. К1-52
2к
2к/ 1Ь 2к/1Ь 2к/1Ъ
гиа
21с/зь
1Ь
1Ь
БТГГ¥ТГТТТауТ7 у| а
' I »<6 1Д А£ 6М 1
:В
РУЗА ЧИП 1 I ОНО
- - 'I г!
Ш,
Е ТТ 51 2к
5 1 С С 7М-5» 2к/]Ь
:пс 747-«» 2к/1Ь
5 1Е С 447-5» 2к/1Ъ
г 1 Е с 411-54 2к/1)>
3 1 Е С 474-5» 2к/В)
3 7 Е С 311-51» 1Ь
? \ Г с К1-52 я>
Рисунок 5. Сравнение аминокислотных последовательностей фрагмента Е2-р7-N52 полипротеина референсных изолятов к1-з2, N589 и УАТ-96, и пяти атипичных изолятов N796, N747, N687, N611 и N674. Стрелка показывает сайт рекомбинации. Аминокислотные позиции пронумерованы согласно Рисунку 1. Номера изолятов и их принадлежность к субтипам ВГС указаны справа. Вертикальные пунктирные линии отмечают сайты расщепления полипротеина.
Таким образом, картирование природного сайта рекомбинации внутри N82 гена открыло широкие перспективы создания химерных вариантов ВГС для изучения особенностей взаимодействия структурных и неструктурных белков ВГС различных субтипов в процессе сборки и формировании инфекционных вирионов.
Для анализа организации полноразмерного генома природного рекомбинанта секвенировали ORF рекомбинантного изолята N687 и нерекомбинантного «родительского» изолята N589 субтипа lb. Размер секвенированного генома составил 9315 нуклеотидов (позиции 41 - 9356) для рекомбинантного изолята N687 и 9324 нуклеотида (позиции 41-9365) для изолята N589 субтипа lb.
«Similarity plots» и bootscan анализ ORF рекомбинантного изолята N687 не выявил другой точки рекомбинации, кроме описанной выше между нуклеотидами 3175 и 3176 (Рисунок 6). Области генома от 5'UTR до рекомбинационного сайта внутри NS2 гена были подобны аналогичным областям генома изолята VAT-96 субтипа 2к, тогда как области генома от сайта рекомбинации до конца ORF были подобны таковым изолята kl-s2 субтипа lb. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей рекомбинантного изолята N687 с таковыми изолятов субтипов 2к и lb не выявило никаких инсерций или делеций на протяжении всего генома, включая нетранслируемые участки.
SiniPlot— Querv: 687-StP2k/lb
K1-S2 lb
VAT-96 2 k
BootScan-Query: 687-StP2k/lb
T~T
jL_JL
~TT
Jft I
л_L
VAT-96 2 k K1-S2 lb CB 3a
Рисунок 6. Similarity plots и bootscan анализ, основанные на 5'UTR некодирующей области генома и ORF, выполнены для рекомбинантного изолята N687. Стрелка указывает на сайт рекомбинации. «Родительские» генотипы представлены субтипом lb (изолят K1-S2) и субтипом 2к (изолят VAT-96). Генотип За (изолят СВ) использован как внешняя группа сравнения. Достоверность бутстрапинга основана на 1000 репликатах.
Состав генома рекомбинантного изолята N687 не отличался от такового нерекомбинантных изолятов ВГС и состоял из 10 генов. На 5'- и 3'- концах генома изолята N687, также как и у нерекомбинантных изолятов, были нетранслируемые участки. Открытая рамка считывания кодировала полипропротеин размером 3014 аминокислотных остатков. Состав полипротеина рекомбинантного изолята N687 по структурным белкам был схож с таковым изолятов субтипа 2к (изолят УАТ-96) и 2а (изолят НС-16), тогда как по неструктурным белкам он был идентичен таковому изолята субтипа 1Ь (изолят к1-Б2) (Таблица 2). Структурный белок Е2 (367 ам. о.) рекомбинантного изолята и изолятов субтипов 2а и 2к был на четыре ам. о. больше, чем аналогичный белок (363 ам. о.) изолятов субтипа 1Ь. В свою очередь, неструктурный белок N85 А (447 ам. о.) рекомбинантного изолята и изолятов субтипа 1Ь был на 19 ам. о. короче аналогичного белка (466 ам. о.) изолятов субтипов 2а и 2к (Таблица 2).
Как и ожидалось, структура полноразмерного генома санкт-петербургского нерекомбинантного изолята N589 была идентична таковой других изолятов ВГС субтипа 1Ь и не имела рекомбинационных сайтов, никаких инсерций или делеций на протяжении всего генома, включая нетранслируемые участки. Открытая рамка считывания кодировала полипропротеин размером ЗОЮ ам.о. (Таблица 2).
Таблица 2. Состав полипротеина рекомбинантного и референсных изолятов ВГС в зависимости от генотипа.
ОБЛАСТЬ КОЛИЧЕСТВО АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ
ПОЛИПРОТЕИНА СУБТИП 2а СУБТИП 2к КР1 2к/1Ь СУБТИП 1Ь СУБТИП 1Ь
С-.Г6 УАТ-96 N687 к 1-52 N589
ОКР 3033 3033 3014 ЗОЮ ЗОЮ
СОКЕ 191 191 191 191 191
Е1 192 192 192 192 192
Е2 367 367 367 363 363
Р7 63 63 63 63 63
N82 217 217 217 217 217
N53 631 631 631 631 631
54 54 54 54 54
261 261 261 261 261
466 466 447 447 447
N858 591 591 591 591 591
Механизм формирования природного рекомбинанта И7! 2к/1Ь ВГС
Анализ генетической структуры природного рекомбинанта ЮЧ_2к/1Ь показал, что его геном имеет структуру, идентичную «родительским» геномам субтипов 2к и 1Ь (Таблица 2). Сайт рекомбинации располагается в области, характеризующейся высокой степенью гомологии среди всех субтипов вируса (Рисунки 4 и 5). В области сайта рекомбинации и на протяжении всего генома не было никаких инсерций или делеций.
Гомологичная РНК-РНК рекомбинация - это процесс, происходящий между двумя близкородственными молекулами, в результате которого формируется потомство со структурой генома, аналогичной родительским [Lai M., 1992]. Таким образом, данные анализа генома природного рекомбинанта RFl_2k/lb свидетельствуют о том, что он сформировался в результате гомологичной рекомбинации между геномами ВГС субтипов lb и 2к.
Известно, что рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот могут быть образованы с помощью механизма репликативной смены матрицы или согласно модели разрыв-лигирование [Lai M., 1992]. Большинство РНК-РНК гомологичных рекомбинаций, как полагают, происходит с помощью механизма репликативной смены матрицы, который может проходить согласно процессивной или непроцессивной модели. Чтобы определить механизм рекомбинации, приведший к образованию рекомбинанта RFl_2k/lb необходимо было ответить на следующие вопросы:
1) что могло вызвать остановку процессивной элонгации?
2) как РНК-зависимая-РНК-полимераза (RdRp) смогла осуществить смену матрицы и реинициировать элонгацию на акцепторной матрице?
Наиболее популярными моделями in vitro для изучения механизмов рекомбинации несегментированных РНК-геномов являются вирус полиомиелита, а также вирусы растений: вирус скрученности турнепса (TCV), brome mosaic bromovirus (ВMV) и представители Tombusvirus [Gmyl A. et al., 1999; Nagy P. et al., 1998, 1999; White К., Morris T., 1995]. Поскольку в экспериментах по изучению особенностей процессивности RdRp разных вирусов было установлено, что RdRp ВГС, BVDB, GBVB и репликативный комплекс (+-)-РНК-содержащих вирусов растений, таких как TCV или BMV, может инициировать синтез РНК de novo по общему механизму, хотя и с различными предпочтениями по матрице и инициирующим нуклеотидам [Ranjith-Kumar С. Et al., 2003], данные, полученные на модели TCV и BMV, могут быть применимы для описания механизма рекомбинации ВГС.
На модели Tombusvirus показано, что стабильные вторичные структуры (hairpin structure) на матрице доноре являются предпочтительными областями рекомбинации [White К., Morris Т., 1995]. Моделирование вторичной структуры РНК для согеМБЗобласти генома (+)-цепи РНК семи изолятов ВГС (N687, N589, kl-s2, MD4-1, VAT-96, HC-J6 и СВ) выявило в области рекомбинации две стабильные вторичные структуры типа «шпилька» (hairpin structure), обозначенные HS1 и HS2 (Рисунок 7). Предсказанная HS1 включала 88 н.о. и формировалась сразу «выше по течению» от точки рекомбинации на (+)-цепи РНК трех изолятов только субтипа lb (N589, kl-s2, Md4-1). Замены в трех положениях A3110G, C3148U и C3149U, имевшиеся в геноме изолята N589, привели к «исчезновению» двух внутренних петель, что, в свою очередь, обусловило наибольшую вероятность формирования и стабилизацию HS1. Предсказанная HS2 включала 32 или 60 н. о. и формировалась «ниже по течению» от сайта рекомбинации на (+)-цепи РНК изолятов только субтипа 2а (HC-j6) и субтипа 2k (VAT-96). Наличие нуклеотидов в пяти положениях 3218 (G), 3224 (С), 3239 (Т), 3245 (А) и 3251 (Т) в геноме изолята VAT-96 были критичны для
стабилизации и формирования HS2, имевшей верхнюю «тетра-петлю» и три внутренних асимметричных петли (I, II и III), одна из которых (III) образовывала характерное и-«выпячивание» (U-bulge) (Рисунок 7).
N589
МсМ-1
нс-je
А
Y4
\-г* •Й
( ) -v., И
32ie'\*f 3Î4:
VAT96
308« \ 313
ЗОв^'^З!?«
V.
Hairpin Structure 1
Hairpin Structure 2
Рисунок 7. Вторичные структуры HS1 (А) и HS2 (В), предсказанные с помощью программы MFOLD. Нуклеотидные позиции, влиявшие на стабильность и длину данных структур, обозначены кругами, квадратами, треугольниками. Римские цифры обозначают внутренние петли на HS2. и-«выпячивание» взято в овал.
Положение HS1 и HS2 относительно сайта рекомбинации свидетельствовало о том, что именно HS1, характерная только для «родительского» генома субтипа Ib и располагавшаяся сразу перед сайтом рекомбинации, послужила причиной остановки RdRp и, соответственно, обусловила сайт рекомбинации.
Сравнение вторичных структур HS1 и HS2 с ранее моделированными вторичными структурами геномов (+)-РНК-содержащих вирусов показало, что вторичная структура HS2 субтипа 2к (изолят VAT-96) по своей организации и расположению «ниже по течению» от сайта рекомбинации схожа со вторичной структурой, названной motifl и предсказанной для TCV [Nagy P., Simon А., 1998] (Рисунок 7 и 8). Обе «шпильки» имели верхнюю «тетра-петлю» и аналогичное внутреннее и-«выпячивание», в котором делеции трех урациловых (U) остатков приводили к значительному уменьшению 3'-концевой элонгационой активности и исчезновению in vivo рекомбинации на модели вируса TCV.
GGGUGAGUUUUCUUA G -С UGGUUUUUGCCGCCGUCGgg - 51
Рисунок 8. Вторичная структура, motifl-hairpin [приведено по Nagy Р., Simon А., 1998]. и-«выпячивание» взято в овал.
Эксперименты, посвященные изучению механизмов рекомбинации на модели TCV выявили, что эффективность инициации З'-терминального синтеза дочерней РНК на акцепторной матрице зависела не только от наличия вторичной структуры подобной motifl-hairpin «ниже по течению» от сайта рекомбинации, но также и от короткого «линейного одноцепочечного» U-богатого участка (priming stem) в области сайта рекомбинации [Nagy Р. et al., 1998, 1999].
В настоящей работе анализ первичной и вторичной структур области рекомбинации выявил в геномах «родительских» субтипов наличие между HS1 и HS2 короткого «линейного» A/U богатого консервативного участка (priming stem) и отсутствие «двухцепочечного» участка, а также только в геноме субтипа 2к -наличие poly(A) участка (3270-3275 н. о.) «ниже по течению» от точки перекреста (Рисунок 9).
Г 1 I; С 5 И Л А Л и С Ч Л г II i t Г АС
ш
ш
ш
ElE^ttA Ü1 Я \i
UACAUCUAUSA
.а
t A t ПК в С i
А Т) & « г UAT-96 2k
•г с ?, 796-SUP 2k /lb
" у 74 7-SUP 2k/lb
? Г. А 687-SUP 2k /lb
С Z Í 611-SUP 2k /lb
" Ú 674-SOP 2k/lb
: ' V S89-SUP lb
L L-L K1-S2 lb
^ÖÖUli тт-
AC..
ti
HUAUtUi liAC С ti
С» Í И { С V U С 3 ;
ш
А А Г С С А
VAT-96 21с 1S6-SVP 2к/1Ъ 74 7-SUP 2к/1Ь 687-SUP 2к/1Ь 611-SUP 2к /1Ь 67 4-SUP 2к /1Ь 5S9-SW lb K1-S2 lb
и U r, Í! и и с А с с С Г А А У Ь С, А » А А А AAA V- U С А У У С У 5 и & С & С Л 5r 1 U >; д Г г, VAT-96 2k
с ХЗ с % А С С С 0 л Iе С с С 796-SUP 2k/lb
i У с V & A U С с (, А V « с С с Г; ? 747-SUP 2k /lb
с. У t ?! С А С С с А А С С vr ш л С 687-SUP 2k /lb
с У с и 5 А С с с 0 А АС с г. 611-SUP 2k/lb
<L с и с и Л С с с 0 А А С с V V ? 67 4-SUP 2k /lb
Г <J с У с V? '/АС с с А с А С с R V ? S89-SUP lb
CI т & А С с и i А С г 1м Г K1-S2 lb
Рисунок 9. Сравнение нуклеотидных последовательностей в области сайта рекомбинации. Стрелка показывает точку рекомбинации. Нуклеотидные последовательности пронумерованы согласно Рисунку 1. Номера изолятов и их принадлежность к субтипам указаны справа. Вертикальные линии показывают A/U богатый участок и poly (А) участок.
На основании результатов анализа первичной и вторичной структур «родительских» изолятов субтипов 1Ь, 2к и рекомбинантного генома ЛР1_2к/1Ь и, учитывая тот факт, что все (+) РНК-содержащие вирусы демонстрируют поразительное сходство стратегии репликации, можно заключить, что природный рекомбинант НР1_2к/1Ь образовался по механизму непроцессивной смены матрицы, который включал следующие этапы (Рисунок 10).
—^ в
RdRjX
Nascent RNA
Рисунок 10. Схематическое представление механизма рекомбинации, в результате которой сформировался жизнеспособный природный рекомбинант RFl_2k/lb. А: Остановка процессивной элонгации дочерней РНК. В: диссоциация RdRp вместе с репликативным комплексом от донорной матрицы. С: присоединение RdRp вместе с репликативным комплексом к акцепторной РНК и ре-инициация элонгации дочерней РНК. Консервативный участок (priming stem) на обеих родительских матрицах показан жирной черной линией. Фрагменты вторичных структур, предсказанных для (+)-цепи РНК изолятов N589 субтипа lb и VAT-96 субтипа 2к, представлены слева на рисунках А и С соответственно.
На первом этапе стабильная вторичная структура HS1 на донорной матрице, которой был геном субтипа lb, вызвала остановку процессивной элонгации дочерней РЖ цепи и обусловила сайт рекомбинации. Наличие в этой области A/U-богатого участка способствовало «проскальзыванию» вирусной RdRp и послужило дополнительным усиливающим фактором остановки элонгации. На втором этапе произошла диссоциация вирусной RdRp вместе с репликативным комплексом, включавшим дочернюю РНК, от донорной матрицы субтипа lb, которой способствовала низкая термодинамическая стабильность A/U-богатого участка в сайте рекомбинации [Lai М., 1992; Nagy Р. et al., 1998]. На третьем этапе стабильная вторичная структура HS2, предсказанная для генома субтипа 2к, сыграла роль энхансера для привлечения RdRp вместе с репликативным комплексом к акцепторной матрице, как и motifl в случае рекомбинации TCV [Nagy Р. et al., 1998]. Отсутствие стабильных вторичных структур между HS1 и HS2 сделало доступным акцепторный сайт и способствовало взаимодействию 3'-конца дочерней РНК и вирусной RdRp с акцепторной матрицей. Короткая консервативная область (3177-3188 н. о.) генома ВГС, расположенная в зоне перекреста, послужила праймерным участком при отжиге З'-конца дочерней РНК молекулы и реинициации элонгации на акцепторной РНК матрице. Дополнительно ро1у(А) участок, расположенный «ниже по течению» от сайта рекомбинации (3270-3275 н. о.) на акцепторной матрице субтипа 2к, мог играть роль промотора, хотя установлено, что RdRp ВГС способна инициировать праймер-независимый синтез РНК и в отсутствии промоторной последовательности [Behrens S. et al., 1996].
Наличие вторичной структуры HS2, предсказанной только для субтипа 2к и подобной по организации motifl-hairpin TCV, может служить объяснением того, что редко встречающийся субтип 2к стал одной из родительских матриц в процессе природной рекомбинации ВГС.
Еще один немаловажный вопрос - при синтезе (+) цепи или (-) цепи РНК произошла рекомбинация? Отсутствие стабильных вторичных структур в районе сайта рекомбинации при моделировании вторичной структуры РНК на (-)-цепи РНК ВГС субтипов lb, 2k и рекомбинантного генома и то, что элонгация RdRp ВГС с З'-UTR конца (-)-цепи РНК более эффективна, чем с З'-UTR конца (+)-цепи РНК [Reigadas S. et al., 2001], позволяют заключить, что природный рекомбинант RFl_2k/lb образовался при синтезе (-)-РНК цепи.
ПРИРОДНЫЙ РЕКОМБИНАНТ RFl_2k/lb КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ВГС К ИНТЕРФЕРОНУ
В многочисленных экспериментах установлено, что как структурные, так и неструктурные белки ВГС способны взаимодействовать с различными клеточными белками, регулируя их функции. Два белковых домена, расположенные в белке Е2 оболочки ВГС (PePHD - участок гомологии сайта фосфорилирования PKR-eIF2a) и в неструктурном белке NS5A ВГС (PKR-связывающий домен, включающий 1SDR область (INF-a sensitivity determining
region), как полагают, играют роль в формировании устойчивости вируса к действию интерферона посредством непрямого взаимодействия с протеинкиназой R (PKR) [Enomoto N. et al., 1996; Gale M. et al„ 1998; Taylor D. et al., 1999; 2000]. До сих пор существуют противоречивые данные о реальном вкладе PePHD и ISDR областей в формирование ответа на терапию интерфероном [Enomoto N. et al., 1996; Kumthip К. Et al., 2011; Taylor D. et al., 1999; 2000; 2001]. Особо следует отметить, что только у субтипа lb PePHD домен белка Е2 по своему аминокислотному составу имеет полное сходство с сайтом фосфорилирования eIF2a, и, соответственно, может взаимодействовать с PKR, ингибируя ее действие [Taylor D. et al., 1999]. Аналогично, в ряде исследований показано, что только у изолятов ВГС субтипа lb аминокислотный состав ISDR области неструктурного белка NS5A коррелировал с чувствительностью к действию интерферона-а [Enomoto N. et al., 1996; Kumthip К. Et al., 2011].
Очевидной характерной гено- и фенотипической особенностью рекомбинанта RFl_2k/lb является принадлежность всех его структурных генов к субтипу 2k, а неструктурных — к наиболее «агрессивному» субтипу 1Ь.
Аминокислотный состав PePHD области белка Е2 рекомбинантных изолятов N687, N674, N747, N796, М21 полностью идентичен таковому изолята VAT-96 субтипа 2к и отличен по двум (E652Q и L668H) ам. о. от такового изолятов субтипа lb (Рисунок 11). Поэтому он не может участвовать в формировании резистентности ВГС к действию интерферона.
Аминокислотный профиль ISDR области белка NS5A рекомбинантных изолятов N687, М21 полностью идентичен таковому изолята HC-J4 субтипа lb «дикого» типа, ассоциированного с устойчивостью к действию интерферона (Рисунок 11). По аминокислотному составу PKR-связывающего домена санкт-петербургский рекомбинантный изолят N687 обладал 93,9% гомологией с тем же изолятом HC-J4 субтипа lb «дикого типа», а рекомбинантный изолят М21, выделенный от пациента после проведенного курса терапии интерфероном - уже 97,0% (Рисунок 11).
Таким образом, природный рекомбинант RFl_2k/lb имеет уникальную не только генетическую, но и фенотипическую характеристику, которая позволяет использовать его в качестве природной модели для изучения молекулярно-генетических механизмов, приводящих к резистентности ВГС к действию интерферона. Изучение биологических свойств рекомбинантных вариантов ВГС, имеющих структурные и неструктурные белки различных генотипов, позволит лучше понять, какие молекулы и какие молекулярно-генетические механизмы вовлечены в те или иные регуляторные взаимодействия вируса с клетками хозяина при формировании персистенции, резистентности к используемым противовирусным препаратам и «ускользанию» от надзора иммунной системы хозяина.
ЙС ! ЙС С Ь Ей ВОЙ 1 £ Ь 1 Р I I ь гг г
о н
о и .
тире» и итя
Д........0-
в
ТЯЖ
| 2250
EDBR!VSV/^AEI:LRKSKKrPI■ALPIUAS¡I>I>rNtPL
а-
Н7Е 37Е
ш
1£Н1РК
ТЛьрк
т
I
в-
НС-Л 1Ь
<(Т и
М21 хг
к1-*2 1Ь
3» 1Ь
НС-Л6 2а
[ЙУАТ-Эб 2к
св
Н211
3»
За
Рисунок 11. Сравнение аминокислотных последовательностей РеРНО области гликопротеина Е2 (А) и РКЯ-связывающего домена неструктурного белка №5А (В). Аминокислотные позиции пронумерованы согласно Рисунку 1. Номера изолятов и их принадлежность к субтипам ВГС указаны справа. РеРНО область и РКЛ-связывающий домен выделены пунктирными линиями.
К настоящему времени три пациента (N1764 и N1763 из Москвы, М21 во Франции), инфицированные природным рекомбинантом КР 1_2к/1Ь, получили противовирусную терапию препаратами интерферона или в комплексе с рибавирином по стандартной схеме. Наличие устойчивого вирусологического ответа на противовирусную терапию было отмечено только у пациентки N1764 с коротким периодом инфицирования, предшествующим терапии. У пациента N1763 после первого курса противовирусной терапии наблюдался только биохимический ответ, тогда как повторный курс терапии, проведенный через несколько лет, не дал никакого ответа, более того вирусная нагрузка стала возрастать, то есть увеличилась эффективность репликации вирусного генома.
У пациента М21 рекомбинантный вариант был впервые идентифицирован через три месяца после окончания комбинированной терапии, проводимой по факту инфицирования изолятом ВГС субтипа За, при этом проведенное эпидемиологическое расследование исключило возможное реинфицирование пациента после окончания терапии [Morel V. et al., 2010]. Наличие устойчивого вирусологического ответа у пациентки N1764 можно объяснить совокупностью факторов, в числе которых решающим, вероятнее всего, была небольшая продолжительность заболевания, а также пол пациента (женщины лучше отвечают на противовирусную терапию, чем мужчины) [Ющук Н. с соавт., 2010]. Отсутствие вирусологического ответа у пациентов N1763 и М21 свидетельствует в пользу того, что наличие аминокислотного профиля ISDR области неструктурного белка NS5A «дикого» типа у изолята является важным фактором для формирования устойчивости к действию интерферона, тогда как наличие PePHD домена белка Е2 оболочки вируса, способного взаимодействовать с PKR, не является фактором, обуславливающим такую резистентность в естественных условиях.
Данные клинические случаи свидетельствуют о необходимости детального изучения влияния принадлежности изолята ВГС к рекомбинантному генотипу на выбор тактики терапии и прогноз исхода болезни. В этой связи, особое внимание следует уделять пациентам, инфицированным изолятами ВГС генотипа 2, поскольку коммерческие тест-системы для определения генотипа ВГС основаны на анализе фрагментов из 5'UTR/core области генома и не позволяют выявлять рекомбинантные варианты ВГС.
ПРИРОДНЫЙ РЕКОМБИНАНТ RFl_2k/lb В СТРУКТУРЕ СОВРЕМЕННОЙ ПОПУЛЯЦИИ ВГС
В исследование было включено 306 изолятов ВГС, полученных от анти-ВГС и РНК ВГС положительных пациентов Санкт-Петербурга, Москвы, Эстонии и Швеции. С помощью филогенетического анализа на основе NS5B области генома выявлена циркуляция семи субтипов ВГС на изученных территориях: 1а, 1Ь, 2а, 2Ь, 2с, 2к, За (Рисунок 12). Отмечено значительное различие в их распространении в зависимости от региона. На территориях бывшего Советского Союза доминировали два субтипа ВГС: 1Ь и За. В Москве первое место по встречаемости занимал субтип За, в Эстонии - субтип 1Ь, тогда как в Санкт-Петербурге оба субтипа имели практически одинаковое распространение. В Швеции доминировало три субтипа: 1а, 2Ь и За, что соответствовало ранее полученным данным и свидетельствовало об отсутствии смены превалирующих субтипов [Lindh М. et al., 2005; Westin J. et al., 1999].
Филогенетический анализ на основе NS5B области генома показал, что большинство изолятов субтипа За, выделенных от пациентов, проживавших в Санкт-Петербурге, Москве и/или Эстонии, образовывали обособленные кластеры, в состав которых могли входить изоляты из Сибири (Рисунок 13). Три четких кластера А, В и С не меняли своей топологии независимо от использованных
алгоритмов анализа, что указывает на активную циркуляцию на бывших территориях Совесткого Союза «собственных», отличных от европейских, азиатских, американских и/или австралийских вариантов, изолятов ВГС субтипа За, вероятно, сформированных в период ограниченного перемещения населения и распространения наркотических средств в пределах границ Советского Союза.
Санкт-Петербург (75 изолятов)
1%
1а
3% 4%
Москва (64 изолята)
Эстония у
(67 изолятов)
Рисунок 12. Процентное соотношение субтипов ВГС с учетом природного рекомбинанта 11Р1_2к/1Ь (обозначен как 1<Р) в зависимости от территории.
Швеция ^
(100 изолятов) 2%
В противоположность описанным взаимоотношениям между изолятами ВГС субтипа За, чуть менее половины (45%) изолятов ВГС субтипа 1Ь, выделенных в Москве, Санкт-Петербурге и Эстонии, не имели генетических связей и были рассеяны среди европейских и азиатских вариантов ВГС на филогенетическом дереве (Рисунок 14), что говорит о высокой гетерогенности данной популяции и отражает общую тенденцию разнообразия данного геноварианта во всем мире. Двадцать шесть изолятов группировались в четыре субкластера, каждый из которых включал санкт-петербургские изоляты, в два субкластера входили также эстонские изоляты (Рисунок 14С и Б
), в один - московские (Рисунок 14Е), в один - как эстонские, так и московские (Рисунок 14В). Каждый из четырех субкластеров входил в состав кластеров, включавших европейские, азиатские и/или австралийские изоляты.
Рисунок 13. Часть дендрограммы филогенетического дерева, построенного на 270 н. о. из NS5B гена с использованием метода neighbor-joining, представляет ветвь, сформированную изолятами ВГС субтипа За. Наименование и географическое происхождение изолятов ВГС указаны справа от каждой ветви.
Рисунок 14. Часть дендрограммы филогенетического дерева, построенного на 270 н. о. из NS5B гена с использованием метода neighbor-joining, представляет ветвь, сформированную изолятами ВГС субтипа lb. Географическое происхождение изолятов ВГС указаны справа от каждой ветви.
На филогенетическом дереве, построенном на основе N550 области генома среди всех изученных изолятов субтипа 1Ь выделялся обособленный четкий кластер, сформированный 18 изолятами, восемь из которых ранее были идентифицированы и описаны как рекомбинант НЛ_2к/1Ь ВГС (Рисунок 14). Наряду с санкт-петербургскими изолятами, в этот кластер входили изоляты из Москвы, Эстонии и Швеции. Последующий филогенетический анализ 5'итК/соге области генома показал, что эти изоляты также формировали общий кластер с ранее описанными санкт-петербургскими рекомбинантными изолятами и принадлежали по этой области к субтипу 2к, и, следовательно, были рекомбинантами. Интересно, что рекомбинантные изоляты были родственны санкт-петербургскому изоляту ВГС субтипа 2к (N464) не более, чем молдавскому изоляту УАТ-96.
Природный рекомбинант КР12кУ1 Ь был выявлен на всех территориях наблюдения, при этом в Санкт-Петербурге данный рекомбинант занимал третье место по встречаемости. Отдельно следует отметить, что только на территории Санкт-Петербурга выявлено два изолята ВГС крайне редко встречающегося субтипа 2к.
Доступные эпидемиологические и клинические данные о пациентах, инфицированных природным рекомбинантом КР1_2кУ1 Ь и субтипом 2к, приведены в таблице 3. Все 18 пациентов, инфицированные ИП_2к/1Ь, за исключением двух, состоявших в браке (N1763 и N1764), были эпидемиологически не связаны друг с другом и имели различные пути инфицирования: восемь употребляли внутривенно наркотические средства (ВНС), три имели в анамнезе оперативные медицинские вмешательства или переливания крови в начале 90-х г., один пациент находился на гемодиализе, у пяти пациентов в анамнезе отсутствовали указания на какие-либо возможные пути инфицирования. Возраст пациентов варьировал от 18 до 64 лет, составляя в среднем 32,82± 14,88. Выявление рекомбинанта КР1_2к/1Ь у супружеской пары (муж имел ХГС, жена - острый ГС, желтушная форма) свидетельствовало о наличии гетеросексуального пути передачи данного варианта ВГС.
Оба пациента, инфицированные субтипом 2к, страдали ХГС и были старше 59 лет. В анамнезе одного из них (N464) имелись оперативные медицинские вмешательства и переливания крови в 1965 и 1991 гг.. Возможный путь инфицирования второго пациента установить не удалось. Исходя из этих данных, можно сделать предположение о том, что пациент N464 мог быть инфицирован, начиная с 1965 года.
Как видно из приведенных эпидемиологических данных, природный рекомбинант 11П_2к/1Ь имеет определенный потенциал для более успешного распространения в популяции, по сравнению с «родительским» субтипом 2к, хотя и не обязательно является более вирулентным, чем родительский субтип 1Ь. В отличие от изолятов субтипа 2к, изоляты природного рекомбинанта ВГС выделены от различных групп пациентов всех возрастных категорий в разных регионах мира.
Таблица 3. Эпидемиологическая и клиническая информация о пациентах, инфицированных природным рекомбинантом ЯР1_2к/1Ь (п=18) и субтипом 2к
(п=2)-
ID Происхождение Генотип Пол Возраст Путь инфицирования Выявление анти-HCV АЛТ п<40 Возможный Били- период рубин инфицирования
1173 СПб 2k/lb Ж 63 1993 операции 2001 <40 п 1993
1155 СПб 2k/lb M 64 1997 трансфузии 1999 <40 16 1997
796 СПб 2k/lb м 29 Неизвестен 1997 74 20 ?
402 СПб 2k/lb ж 29 ВВН 1998 <40 п ?
1172 СПб 2k/lb м 29 1988-90 ВВН 2000 <40 п до 1990
747 СПб 2k/lb м 18 ВВН 1999 - - 1999
611 СПб 2k/lb м 22 ВВН 1999 240 21 1999
656 СПб 2k/lb м 20 ВВН 1999 2350 23 1999
568 СПб 2k/lb м 16 ВВН 1999 504 12 1999
687 СПб 2k/lb м 39 Неизвестен 1999 - - ?
674 СПб 2k/lb ж 25 Неизвестен 1999 54 п ?
203 СПб 2k/lb м 38 Гемодиализ 1999 <40 п ?
481 СПб 2k/lb м 19 ВВН 2000 - - до 2000
2011 СПб 2k/lb м 54 1974 ВВН 1992 42 17 1974
1763 Москва 2k/lb м 51 Неизвестен 2000 <40 п ?
1764 Москва 2k/lb ж 39 Гетеросексуальный 2000 2400 >50 2000
2032 Эстония 2k/lb м 21 1993операция,трансфузии 1998 - - 1993
2314 Швеция 2k/lb м 36 неизвестен 2001 - - ?
464 СПб 2k ж 59 1965,1991 трансфузии 2000 <40 п 1991
1183 СПб 2k м 70 неизвестен 1998 178 п ?
Благодаря депонированию сиквенсов первых санкт-петербургских изолятов природного рекомбинанта RFl_2k/lb в GenBank, стало возможным проводить глобальный мониторинг распространения таких изолятов.
На рисунке 15 представлен филогенетический кластер, сформированный изолятами RFl_2k/lb, описанными в данной работе, а также изолятами, сиквенсы которых были отобраны с помощью программы BLAST в GenBank как близкородственные природному рекомбинанту по NS5B области генома.
568 ВВН 16М Санкт-Петербург СУНСУ037 ПП 32М Кипр М21 ВВН ЗОМ Франция р179 ВВН 21М Амстердам 1764 ПП 39Ж Москва 1763 Н 51М Москва
796 Н 29 М Санкт-Петербург р135 Н 35Ж Амстердам Аг082 ВВН 38М Азербайджан
иг-Ши19 ВВН 19М Узбекистан 00417445 Н Ирландия 00417452 Н Ирландия (Россия) ^ А2105 ВВН 32М Азербайджан
Аг05] ВВН 34М Азербайджан - Аг129 ВВН ЗОМ Азербайджан
"2032 Т 21М Эстония '203 Г 38М Санкт-Петербург "611 ВВН 22М Санкт-Петербург -р077 ВВН 35М Амстердам (Россия " РБА62 Т 50М Южная Сибирь -АЬТ-30 Н 34Ж Южная Сибирь О 63Ж Санкт-Петербург "481 ВВН 19М Санкт-Петербург 2314 Н 36М Швеция
-402 ВВН 29Ж Санкт-Петербург
" 1155 Т 64М Санкт-Петербург -Аг15 Т/ВВН 22М Узбекистан
-р079 Н 42М Амстердам "656 ВВН 20М Санкт-Петербург -РБАЮв Н 37М Южная Сибирь
____Япония
- 198 04 Москва -1170 СПб -1152 СПб
1187 СПб 50 СПб
735 СПб
-2055 Эстония
-644 СПб -2191 СПб
-2246 СПС -HPCRNA Китай -HPVHCVN Япония - 1774 Москва - HCD85516 Япония
-643 СПб
-640 Эстония
-2187 СПб
^-MD3 1 Япония
-2035 Эстония
-1155 .Эстония
-CJ483 Япония -HCJ4 США -455 СПб -514 СПб
— 187_04 Москва
607 Эстония 2079 Эстония 15 Эстония - 197 04 Мосхва 201 03 Мосхва 641 "СПб
1171 СПб
- 2077 Эстония
-1160 СПб
- К1 R3 Япония
25Ж Санкт-Петербург 1172 ВВН 29М
Санкт-Петербург
RIG 128 Н Сибирь
747 ВВН 18М Санкт-Петербург
687 Н 39М Санкт-Петербург
2011 ВВН 54М Санкт-Петербург
-Н1А1002 BBH Ж Барнаул
KNG318 ВВН ЗОМ Барнаул CYHCV039 ВВН 39М Кипр ВВН 35М Амстердам
р!59 Н 39М Амстердам AzI39 ВВН 31M Азербайджан Azl14 ВВН 41М Азербайджан KNG327 Н 25М Барнаул
-2248 СПб
-383 СПб
-2178 СПб
- CON1 Германия - 1145 СПб 589 СПб -181 04 Москва
- MD2 1 Япония
-MD1 1 Япония
- MD5 1 Ягония
-НРСРР Япония -377 СПб -2180 СПб -GQ418304 Индонезия
-185 СПб
-2185 СПб
- НМ106914 Ирландия
Kg 1-1
- EU710293 Авс
1 Ирланди с
DQ345619 Мадагаскар
1Ре«сибинант RF_2krik кластер вмкгчоет
- 1777 Мосхва
-К1 S3 Япония
г К1 R2 Япония L К1 S2 Япония - HD 1 Германи*
;рмания 678 СПб
-885 СПб
-2031 Эстония
-761 СПб
-HCVAD78 Гер»
- 1776 Мобс
- HCVPOLYP Австралия
- 1153 СПб
-576 СПб
- 176 04 Москва
j-2057 Эстония
12022 Эстония
- 1149 Эстония -1159 СПб
-730 СПб
- 742 СПб
- 732 СПб -700 СПб
-EF543254 Таиланд --183 04 Москва
-200 04 "
Рисунок 15. Часть филогенетического дерева, построенного на 270 н.о. из NS5B гена с использованием метода neighbor-joining, представляет ветвь, сформированную изолятами ВГС субтипа lb. Наименование и географическое происхождение изолятов ВГС указаны справа от каждой ветви. Кластер, сформированный изолятами FRl_2k/lb, представлен в прямоугольнике.
В настоящее время изоляты природного рекомбинанта RFl_2k/lb идентифицированы в пяти регионах России (Санкт-Петербург, Москва, Московская область, Тамбовская область, Сибирь), а также в Эстонии, Узбекистане, Азербайджане, Швеции, Ирландии, Голландии, Франции, Кипре, что свидетельствует о его успешном распространении [Гаврилова И. с соавт., 2007; Юорегян К., 2012; Demetriou V. et al., 2011; Kurbanov F. et al., 2008; Moreau I. et al., 2006; Morel V. et al., 2010; Raghwani J. et al., 2012; Shustov A. et al., 2005].
Учитывая тот факт, что в Швеции, Ирландии, Голландии, Франции и на Кипре изоляты RF_2k/lb обнаружены только у эмигрантов из Грузии или России, распределение изолятов по территориям будет выглядеть следующим образом: Россия (24), Грузия (11), Азербайджан (6), Узбекистан (2), Эстония (1).
Несмотря на то, что в анамнезе всех пациентов из Азербайджана и большинства пациентов со всех территорий имелись указания на употребление ВНС, филогенетический анализ не выявил внутри RFl_2k/lb кластера ни одного субкластера, включавшего только изоляты, полученные от лиц, употреблявших внутривенно наркотические средства (ВВН). С другой стороны, не было ни одного субкластера, в который не входили бы изоляты, полученные от ВВН. Тем не менее, результаты филогенетического анализа в сочетании с эпидемиологическими данными не позволяют сделать вывод о том, что рекомбинационное событие произошло в среде ВВН, но свидетельствуют в пользу того, что рекомбинант RFl_2k/lb уже давно начал активно циркулировать на территории бывшего Советского Союза среди различных групп населения.
В 2012 году использование Байесовского метода в филогенетическом анализе при изучении изолятов природного рекомбинанта RFl_2k/lb, выделенных в Голландии, позволило ограничить время рекомбинационного события 1923 — 1956 годами [Raghwani J. et al., 2012]. Этот период включает создание в 1926 году первого в мире Научно-практического института переливания крови в Москве, начало широкого использования гемотрансфузий на всей территории Советской Республики и Великую Отечественную войну. Далее начался период истории, в течение которого общение людей проходило в пределах бывшего Советского Союза. Учитывая изложенное, и тот факт, что все известные на данный момент изоляты ВГС RFl_2k/lb выделены от жителей бывшего Советского Союза, можно однозначно заключить, что рекомбинация ВГС произошла на территории Советского Союза.
Наличие субкластера, в состав которого входили лишь изоляты, выделенные от пациентов из различных групп риска, проживавших только на территории Российской Федерации (Санкт-Петербург, Сибирь), указывает на имевшую место, по-видимому, некоторое время назад «территориальную» дивергенцию изолятов рекомбинанта RFl_2k/lb. Это подтверждается обнаружением в Канаде изолята, отнесенного к природному рекомбинанту RFl_2k/lb согласно организации генома и расположению сайта рекомбинации, однако наиболее дивергентного по сравнению с другими выявленными ранее изолятами данного варианта ВГС [Newman R. et al., 2012]. Начавшиеся с конца 80-х в России активная эмиграция и свободное перемещение жителей бывшего Советского Союза за пределы стран
проживания, а также масштабное использование наркотических средств открыли «новую» эру в распространении рекомбинанта ВГС RFl_2k/lb по всему миру.
С 2005 года природный рекомбинант RFl_2k/lb официально внесен в классификацию ВГС, как рекомбинантная форма RF 01_lb/2k, а с 2009 как циркулирующая рекомбинантная форма CRF 01_lb/2k [Kuiken S., Simmonds P., 2009; Simmonds P. et al., 2005].
РОЛЬ СИНОНИМИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В ФОРМИРОВАНИИ ИЗОЛЯТОВ ВГС С НОВЫМ БЕЛКОВЫМ ПРОФИЛЕМ
В любом организме мутационные изменения, включающие точечные нуклеотидные замены (транзиции, трансверсии), инсерции, делеции, дупликации и др., могут приводить к образованию как жизнеспособных, так и нежизнеспособных вариантов вида с новыми фенотипическими характеристиками. Отличительной особенностью ВГС является высокая частота точечных мутаций в геноме (1,92*10"3 на сайт в течение года), которая обеспечивает быструю генетическую эволюцию ВГС и способствует циркуляции широкого спектра генетически близкородственных вариантов ВГС. Основным фактором, обеспечивающим фенотипическое разнообразие ВГС, являются точечные несинонимические мутации, которые позволяют вирусу успешно выживать под селективным давлением окружающей среды, формируя квазивиды с различными аминокислотными детерминантами, например, в белках оболочки Е1 и Е2. В свою очередь, точечные синонимические мутации, обуславливающие значительное генетическое разнообразие ВГС, не приводят к изменению белкового профиля вируса.
Около 10 лет назад был описан новый белок core+1/ARFP, образующийся в результате -2/+1 сдвига рамки считывания или начала считывания с внутреннего инициирующего кодона (AUG85 или AUG87), расположенного в core гене [Vassilaki N. et al., 2002; Walewski J. et al., 2001]. Антитела к этому белку выявляются у 25% больных ХГС [Dalagiorgou G. et al., 2011], при этом сам белок до сих пор не обнаружен ни в одном биологическом материале, и его роль остается неясной.
С целью изучения мутационных изменений в core гене ВГС, приводящих к экспрессии core+1/ARFP белка, 87 образцов плазмы крови, полученных от доноров в 2002-2003 гг. в г. Пномпене, Королевство Камбоджа, были исследованы на наличие антител к core и core+1/ARFP белкам: 58 из них были определены как анти-ВГС РНК ВГС положительные, остальные 29 - как анти-ВГС и РНК ВГС отрицательные. В результате генотипирования на основе фрагмента NS5B области генома для 58 изолятов ВГС определены следующие генотипы: 28 отнесено к генотипу 6, один - к 2, 21 - к субтипу 1Ь, восемь - к 1 а.
ИФА с использованием синтетического пептида (с 3 по 75 ам. о.) и рекомбинантного белка (с 1 по 120 ам. о.) из core области генома показал наличие антител к core антигену ВГС лишь у 55 из 58 анти-ВГС положительных пациентов; три пациента (р31, р32, р34) не имели антител к core антигену ВГС.
У всех трех пациентов (р31, р32 и р34) отсутствие антител к core антигену ВГС подтверждено с использованием коммерческой тест-системы Chiron RiBA HCV 3.0 Strip Immunoblot Assay (SIA), при этом не обнаружены антитела и к NS5 белку, но выявлены антитела к белкам NS3 и NS4, что позволило сделать вывод о том, что отсутствие антител к core белку у всех трех пациентов не явилось следствием дефектного ответа гуморальной иммунной системы на вирусную инфекцию.
ИФА с использованием рекомбинантного белка core+1/ARFP субтипа 1а (с 14 по 160 ам. о.) показал наличие антител к core+1/ARFP антигену ВГС у 8 из 5В анти-ВГС положительных пациентов: пять пациентов были инфицированы ВГС генотипа 6, три - субтипом 1а (Рисунок 16).
б -
№ образцов плазмы крови
Рисунок 16. Результаты выявления антител к core+1/ARFP белку ВГС методом ИФА с использованием рекомбинантного белка core+1/ARFP (с 14 по 160 ам. о.), р/п - величина соотношения средней ОП исследуемого образца к средней ОП отрицательного контрольного образца.
Наиболее высокий уровень антител к core+1/ARFP белку ВГС был выявлен в трех образцах сыворотки крови (р31, р32 и р34), в которых отсутствовали антитела к core белку ВГС. Наличие антител к core+1/ARFP белку ВГС в этих образцах было также подтверждено ИФА с использованием синтетического пептида (с 91 по 106 ам. о.) из core+1/ARFP области генома в качестве антигена. Все три образца были получены от пациентов, инфицированных ВГС субтипа 1а. Несмотря на отсутствие антител к core белку, у двух из трех пациентов в образцах плазмы крови было выявлено наличие core белка с использованием коммерческой ИФА тест-системы Ortho® Antibody to HCV Core Antigen ELISA Test System. Уровень core белка в крови коррелировал с величиной вирусной нагрузки.
Для трех изолятов ВГС субтипа 1а, полученных от анти-core негативных/ анти-core+l/ARFP положительных пациентов (рЗ 1, р32 и р34), и для трех изолятов ВГС субтипа 1а, полученных от анти-core положительных/ анти-core+l/ARFP негативных пациентов (р29, рЗО и р36), была секвенирована core область генома.
Нуклеотидные последовательности core области генома трех изолятов ВГС (рЗ 1, р32, р34), выделенных от анти-core негативных пациентов, отличались от таковых изолятов ВГС, выделенных от анти-core положительных пациентов, и от референсного изолята Н: в трех положениях (223, 317 и 318) были несинонимические нуклеотидные трансверсии, которые привели к замене аминокислот в положениях Т75А (треонин на аланин) и S106N (серии на аспарагин) соответственно (Рисунок 17), в десяти положениях нуклеотидные замены были синонимическими, но также имели место трансверсии.
100
HCV-la ATGAGCACGA АТССТАААСС TCAAAGAAAA ACCAAACGTA ACACCAACCG TCGCCCACAG GACGTCAAGT TCCCGGGTGG CGGTCAGATC GTTGGTGGAG
р29 ....................................................................................................
рЗО .................................................................т..................................
рЗб .................................................................т..................................
рЭ1 ....................................................................................................
P32 ....................................................................................................
Р34 ....................................................................................................
BCV-la TTTACTTGTT GCCGCGCAGG GGCCCTAGAT TGGGTGTGCG CGCGACGAGG AAGACTTCCG AGCGGTCGCA ACCTCGAGGT AGACGTCAGC СТАТССССАА
Р29 ....................................................................................................
рЗО ...................................................................................................
р36 ...................................................................................................
Р31 ....................................................................................................
р32 ....................................................................................................
р34 ....................................................................................................
HCV р29 рЗО рЗб р31 р32 р34
HCV-:
p2S
рЗО
рЗб
рЭ1
р32
Р34
223 (75« of саге) 300
la GGCACGTCGG СCCGAGGGCA GtfíScCTGGGC XCAGCCCGGG TACCCTTGGC CCCTCTATGG CAATGAGGGT TGCGGGTGGG CGGGATGGCT CCTGTCTCCC
317 (lOfiaa of core)
CGTGGCTCTC GGCCTA зс 'G GGGCCCCACA GACCCCCGGC GTAGGTCGCG CAATTTGGGT AAGGTCATCG ATACCCTTAC GTGCGGCTTC GCCGACCTCA
м ИТ УГ
HCV-la TGGGGTACAT ACCGCTCGTC GOCGCCCCTC TTGGAGGCGC TGCCAGGGCC CTGGCGCATG GCGTCCGGGT TCTQGAAGAC GGCGTGAACT ATGCAACAGG
p29 ..........................................................С...........С.............................
РЗО ..........................................................С........А................................
рзе ..........................................................с........а................................
р31 ................1...........С...............................................G.......................
р32 ...............СТ...........С...............................................G.......................
р34 ................Т...........С...............................................G.......................
HCV-la GAACCTTCCT GGTTGCTCTT ТСТСТАТСТТ CCTTCTGGCC CTGCTCTCTT GCCTGACTGT GCCCGCTTCA GCC
р29 .......................................Т .................С...........G ...
рЗО .................................СТ.................Т................G ...
рЗб .................................СТ.................Т................G ...
Р31 .........................................................................
Р32 .........................................................................
р34 .........С...............................................................
Рисунок 17. Сравнение нуклеотидных последовательностей core области генома референсного изолята Н ВГС, трех изолятов ВГС (р29, рЗО, рЗб), выделенных от анти-core положительных пациентов, и трех изолятов ВГС (рЗ 1, р32, р34), выделенных от анти-core негативных пациентов. Нуклеотидные несинонимические замены выделены рамками.
Аминокислотные последовательности core области белка всех шести изолятов ВГС характеризовались высокой гомологией как между собой, так и в сравнении с референсным изолятом Н (Рисунок 18). Никаких замен в области 9-11 кодонов, значимых для экспрессии core+1/ARFP белка, не наблюдалось. Две замены в положении Т75А и S106N присутствовали в core белке всех трех изолятов, полученных от анти-core+l/ARFP положительных пациентов. Однако аналогичные замены уже были описаны ранее для изолятов, полученных от пациентов с нормальным серологическим профилем, т.е., с наличием антител в образцах плазмы крови к core белку ВГС [Nagasaka A. et а!., 1996].
HCV-la
р2 9
рЗО
РЗб
Р31
р32
р34
HCV-la
р29
рЗО
рЗб
р31
р32
р34
HCV-la
р2 9
рЗО
рЗб
Р31
р32
р34
HCV-la
р2 9
рЗО
рЗб
Р31
р32
р34
60
MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKPPGGGQX VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG
75 106 120
RRQPIPKARR PEGITiAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRl^TGPT DPRRRSRNLG
180
KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGAARA LAHGVRVLED GVNYATGNbP GCSFSIFLLA
191
IXSCLTVPAS A
Рисунок 18. Сравнение аминокислотных последовательностей core белка (1-191 ам. о.) референсного изолята Н ВГС, трех изолятов ВГС (р29, рЗО, рЗб), выделенных от анти-core положительных пациентов, и трех изолятов ВГС (р31, р32, р34), выделенных от анти-core негативных пациентов. Аминокислотные остатки, по которым имелись различия между изолятами, выделены рамками.
Аминокислотные последовательности core+1/ARJFP белка всех трех изолятов ВГС (р31, р32, р34) субтипа 1а, выделенных от анти-core негативных пациентов, были идентичны (Рисунок 19). В свою очередь, аминокислотные последовательности соге+1 белка всех трех изолятов ВГС (р29, рЗО, р36) субтипа 1 а, выделенных от анти- core положительных пациентов, были гетерогенны.
HCV-HCV-la ARILNLKEKP NVTP^iAHRT SSSRVAVRSL VEFTCCRAGA LDWV^»
p29-MR08S2 ..............................................
p30-MR5977 .................... L.........................
P36-MR0079 ....................L.........................
P31-MR0582 ..............................................
p32-MR0076 ..............................................
p34-MR644 8 ..............................................
60
"SGR LPSGRNLEVD
72
HCV-HCV-la VSLSPRBVGP R|A
p29-MR0862 ...F..L
P30-MR5977 ......R
P36-MR0079 ......R
P31-MR0582 .......
p32-MR0076 .......
p34-MR644 8 .......
HCV-HCV-la P29-MR0862 P30-ME5977 P36-MR0079 рЗ1-MR0582 p32-MR007 6 p34-MR644 8
:pglspgt lgp:
^RVA GGRDGSC
KA.......
A.......
A......Р
PLA PLA РЬА
LpL A V
SAPQT PGVGRAIWV
. .R........
■ L.........
. L.........
PLRAASP TEWGTYI
s.v..........
iEALPGPW RMASGF ........T...S
Рисунок 19. Сравнение аминокислотных последовательностей соге+1/АЛБР белка (1-160 ам. о.) референсного изолята Н ВГС, трех изолятов ВГС (р29, рЗО, р36), выделенных от анти-соге положительных пациентов, и трех изолятов ВГС (рЗ 1, р32, р34), выделенных от анти-соге негативных пациентов. Аминокислотные остатки, по которым имелись различия между изолятами, выделены рамками.
Поскольку соге+1 /ARFP белок синтезируется с альтернативной ORF со сдвигом в один нуклеотид, из десяти синонимических нуклеотидных замен в core области генома, девять стали несинонимическими для соге+1 области (Рисунки 18 и 19). Интересно, что в аминокислотной последовательности core+1/ARFP белка всех трех изолятов (р31, р32, р34), выделенных от анти-соге негативных пациентов, и одного изолята (р29), выделенного от анти-соге положительного пациента, присутствовал метионин в двух положениях (85 и 87), которые являются инициирующими сайтами рибосомальной трансляции укороченного core+1/ARFP белка [Vassilaki N, Mavromara P., 2003].
В связи с тем, что как синонимические, так и несинонимические нуклеотидные мутации могут влиять на наличие и стабильность вторичной структуры РНК, было сделано предположение, что наличие синонимических мутаций в core области генома в районе 85 и 87 инициирующих кодонов у трех
изолятов ВГС (рЗ 1, р32 и р34) могло привести к изменению вторичной структуры РНК, что, в свою очередь, могло обусловить более активную инициацию трансляции core+1/ARFP белка с внутренних инициирующих кодонов или со сдвига ORF.
В результате моделирования вторичной структуры РНК для core области генома изолятов ВГС р34, р36 и референсного изолята Н были выявлены две стабильные структуры типа «шпилька», обозначенные SL248 и SL332, состоявшие из 77 и 48 нуклеотидных остатков соответственно (Рисунок 20).
н
й .-A-J
ц
i 4
U С i-t
i-t-x
И
f" у ?
a—rf V
и
Bb"
хх
\
6-i р-с
С-й
it
___П
Н i i f?
HCV-la (Н)
рЗб
р34
Рисунок 20. Вторичные структуры SL248 и SL332, предсказанные с помощью программы mfold для core области генома трех изолятов ВГС субтипа 1а: референсного изолята Н, изолятов рЗб, выделенного от анти-core+l негативного пациента, и р34, выделенного от анти-core+l позитивного пациента. Прямоугольниками отмечены конечная петля («шапочка») SL332 и внутренняя петля SL248. Нуклеотидные замены в положениях 317 и 318, расположенные во внутренней петле SL248 и влиявшие на ее структуру, взяты в круг. Кругами также отмечены внутренние инициирующие кодоны AUG85 и AUG87 для трансляции укороченного соге+1 белка.
Замены в двух положениях 317 и 318 (ОС>АТ), имевшиеся в геноме изолята р34, выделенного от анти-соге негативного пациента, в сравнении с геномом референсного изолята Н и изолята рЗб, выделенного от анти-соге положительного
пациента, привели к изменению структуры концевой петли («шапочки») вторичной структуры SL332 и внутренней петли вторичной структуры SL248, последнее, в свою очередь, обусловило перемещение в ее зону первого инициирующего кодона AUG85, в результате чего он стал более доступным для взаимодействия с трансляционным комплексом.
Учитывая все вышеизложенное и тот факт, что стабильные вторичные структуры влияют на связывание рибосом с РНК, можно сделать предположение о том, что наличие синонимических мутаций в core области генома, вызвавших конформационные изменения вторичной структуры РНК на участке, кодирующем также core+1/ARFP белок, послужило благоприятным фактором для активации трансляции core+1/ARFP белка с внутреннего инициирующего кодона AUG85, в результате чего в образцах плазмы крови пациентов уровень антител к соге+1 core+1/ARFP белку стал высоким.
Таким образом, мутационный механизм эволюции ВГС, основанный на синонимических нуклеотидных заменах без делеций или инсерций на протяжении core гена, может приводить к формированию изолятов ВГС, экспрессирующих различный спектр белков с одной и той же нуклеотидной последовательностью в зависимости от рамки считывания, что, в свою очередь, обуславливает наличие нетипичного профиля антител к ВГС.
Полученные результаты позволяют предположить, что причиной отсутствия антител к core белку и наличия антител к core+1/ARFP белку были специфичные нуклеотидные мутации в области core гена, которые привели к усиленной продукции ARFP/core+1 белка, повлекшей за собой значительное снижение уровня трансляции core белка. В экспериментах in vitro с использованием клеточных культур, поддерживающих репликацию генома ВГС, доказано, что трансляция core+1/ARFP белка в основном происходит с внутренних инициирующих кодонов (85 и 87) и регулируется уровнем экспрессии core белка [Vassilaki N. et al., 2009]. Core+1/ARFP белок считается короткоживущим белком [Xu Z. et al., 2001], и, следовательно, также можно предположить, что аминокислотные замены в core+1/ARFP белке, идентифицированные у изолятов ВГС субтипа 1а, выделенных от пациентов с высоким уровнем антител к core+1 /ARFP белку, могли повлиять на стабильность данного белка и на время его «жизни».
Поскольку инфицирование пациентов изолятами, экспрессирующих повышенный уровень core+1/ARFP белка, приводит к усиленному иммунному ответу на данный антиген, и, соответственно, к повышенному уровню антител к core+1/ARFP белку, остается открытым вопрос: будет ли ассоциирован необычный серологический профиль с определенной патологией в течении ВГС инфекции. На сегодняшний день установлено, что более 50% пациентов с гепатокарциномой, инфицированных ВГС, имеют антитела к core+1/ARFP белку, тогда как среди больных ХГС только около 25% имеют антитела к данному антигену [Dalagiorgou G. et al., 2011].
Таким образом, результаты данного исследования позволили доказать, что в эволюцию ВГС вовлечены оба механизма изменчивости: мутационный и рекомбинационный, которые могут приводить к появлению вариантов вируса с абсолютно новыми фенотипическими характеристиками. Выявление природного рекомбинанта послужило толчком к поиску других природных атипичных изолятов ВГС, в результате чего к настоящему времени выявлено пять вариантов межгенотипных рекомбинантов ВГС: 2i/6p (Вьетнам), 2b/lb (Филиппины), 2/5 (Франция), 2b/6w (Тайвань), 2Ь/1а (США), однако каждый из которых представлен пока только единичным изолятом [Bhattacharya D. et al., 2011; Lee Y. et al., 2009; Legrand-Abravanel F. et al., 2007; Noppompanth S. et al., 2006; Yamamura J. et al., 2006].
ВЫВОДЫ
1. Эволюция вируса гепатита С обусловлена мутационным и рекомбинационным механизмами изменчивости. Впервые идентифицированный природный рекомбинант ВГС, названный RFl_2k/lb, является доказательством наличия явления рекомбинации в эволюции ВГС.
2. Рекомбинантный вариант ВГС RFl_2k/lb сформировался в результате гомологичной рекомбинации геномов субтипов lb и 2к по механизму непроцессивной смены матрицы на стадии синтеза (-)-цепи РНК.
3. Геном рекомбинантного варианта ВГС RFl_2k/lb кодирует полипротеин размером 3014 аминокислотных остатков, который в результате процессинга расщепляется на 10 белков, размеры которых соответствуют «родительским».
4. Геном рекомбинантного варианта ВГС RFl_2k/lb включает один сайт рекомбинации, расположенный внутри неструктурной NS2 области. Точка рекомбинации находится между 3175 и 3176 нуклеотидными остатками в кодоне Val/Ile. Начиная с 5' нетранслируемой области до точки рекомбинации внутри NS2 области, геном природного рекомбинантного варианта ВГС RFl_2k/lb принадлежит субтипу 2к, тогда как от точки рекомбинации внутри NS2 области в направлении 3' - субтипу lb.
5. Рекомбинантный вариант ВГС RFl_2k/lb имеет уникальную генетическую и фенотипическую характеристики, что позволяет использовать его как природную модель для изучения молекулярно-генетических механизмов, обуславливающих формирование резистентности к интерферону.
6. Природный рекомбинантный вариант ВГС RFl_2k/lb возник на территории бывшего Советского Союза. Данный рекомбинантный вариант обладает селективным преимуществом, позволяющим ему успешно адаптироваться и распространяться в популяции, по сравнению с «родительским» изолятом субтипа 2к.
7. Синонимические нуклеотидные замены в core области генома ВГС могут приводить к формированию изолятов с усиленной экспрессией core+1/ARFP белка, что обуславливает наличие нетипичного профиля антител к ВГС у пациентов, инфицированных такими изолятами.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Для повышения эффективности выявления изолятов природного рекомбинанта RFl_2k/lb на территории РФ особое внимание следует уделять пациентам, инфицированным изолятами ВГС генотипа 2 согласно данным, полученным при использовании коммерческих тест-систем для определения генотипа ВГС.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Калинина, О. В. Молекулярная эпидемиология гепатита С / О. В. Калинина, С. Л. Мукомолов // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. - 2000. -Т. 3. - № 10. - С. 9-15.
2. Жданов, К. В. Особенности течения гепатита С у наркоманов / К. В. Жданов, Ю. В. Лобзин, С. Л. Мукомолов, В. С. Чирский, О. В. Калинина, С. А. Повзун, В. А. Плотникова, Д. А. Гусев // Рос. журн. гастр., гепат., колопрокт. - 2000. - Т. 10. - № 1. - Прил. 9. - С. 8.
3. Жданов, К. В. Генотипы HCV и их взаимосвязь с морфологическими изменениями в печени у больных хроническим гепатитом С / К. В. Жданов, Ю. В. Лобзин, С. Л. Мукомолов, В. С. Чирский, О. В. Калинина, Д. А. Гусев. // Рос. журн. гастр., гепат., колопрокт. - 2000. - Т. 10. - № 5. -Прил. 11.-С. 79.
4. Zhdanov, К. Influence of HCV genotypes on clinical and histological features in young HCV-infected patients in Northwest region of Russia / K. Zhdanov, Y. Lobzin, S. Mukomolov, V. Chirsky, O. Kalinina, D. Gusev // 9th International Congress on Infectious Diseases. - 2000. - Buenos Aires. - P. 293.
5. Ветров, Т. А. Иммунный ответ структурным и неструктурным белкам вируса гепатита С у больных с острой и хронической формой инфекции / Т. А. Ветров, О. В. Калинина, В. Н. Плотникова, А. А. Колобов, Е. В. Эсауленко, С. Л. Мукомолов // Мат. 4-й росс.-итал. науч. конф. «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика». - 2000 - СПб. - С. 299.
6. Kalinina, О. Transmission of HCV in hemodialysis units in Saint-Petersburg involves only nosocomial strains / O. Kalinina, H. Norder, M. Borzanova, S. Mukomolov, L. Magnius // J. Clin. Virol. - 2001. - V. 22. - N. 2. - P. 174.
7. Жданов, К. В. Значение количественного определения РНК у больных хроническим гепатитом С / К. В. Жданов, Ю. В. Лобзин, В. С. Чирский, С. Л. Мукомолов, О. В. Калинина, Д. А. Гусев // Рос. журн. гастр., гепат., колопрокт. - 2001. - Т. 11. - № 5. - Прил. 15. - С. 77.
8. Kalinina, О. Shift in predominating subtype of HCV from lb to 3a in St.Petersburg mediated by increase in injection drug use / O. Kalinina, H. Norder, T. Vetrov, K. Zhdanov, V. Plotnikova, S. Mukomolov, L. Magnius // 8th International Symposium on Hepatitis С and related Viruses. - 2001. - Sept. 2-5. - Paris. - P. 302.
9. Калинина, О. В. Превалирование генотипа HCV За у больных острым гепатитом С в Санкт-Петербурге / О. В. Калинина, Е. В. Эсауленко, С. Л. Мукомолов // Гепатит В, С, D - проблемы диагностики, лечения и профилактики: тез. докл. IV Рос. науч.-практ. конф. - 2001. - Москва. - С. 160.
lO.Käfinina, О. Shift in predominating subtype of HCV from lb to 3a in St. Petersburg mediated by increase in injecting drug use / O. Kalinina, H. Norder, T. Vetrov, K. Zhdanov, M. Barzunova, V. Plotnikova, S. Mukomolov, L. Magnius // J. Med. Virol. - 2001. - V. 65. - P. 517-524.
11 .Калинина, О. Распространение вируса гепатита С в условиях тесного бытового контакта / О. Калинина, В. Чахарьян, В. Плотникова, С. Мукомолов // VIII Съезд ВНПОЭМП. - 2002. - Март 26-28. - Москва. - С. 108.
12.Шляхтенко, JI. И. Перспективы современной и полной этиологической диагностики вирусных гепатитов. Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций / JI. И. Шляхтенко, О. В. Калинина, В. А. Плотникова, JI. Г. Сулягина, В. В. Чахарьян, Е. П. Шаргородская, Н. Н. Птичникова, Н. А. Авсюкевич, С. JI. Мукомолов // Тез. Всерос. науч.-практ. конф. - 2002. - СПб. С. 87-88.
13.Kalinina, О. A natural intergenotypic recombinant of hepatitis С virus identified in St. Petersburg / O. Kalinina, H. Norder, S. Mukomolov, L. Magnius // J. Virol. - 2002. - V. 76. - P. 4034-4043.
14.KaIinina, O. Intrahospital outbreak of hepatitis С connected with virus transmission from an ansthesiologist to patients / O. Kalinina, H. Norder, L. Kryga, O. Parkov, L. Magnius, S. Mukomolov // 5th Baltic Nordic Congress of Infectious Diseases. -2002. - May 22-25. - St. Petersburg. - P. 78.
15.Kalinina, O. Natural intergenotyping HCV recombinant in St. Petersburg / O. Kalinina, H. Norder, V. Tchexorjan, S. Mukomolov, L. Magnius // 9th International Meeting on HCV and Related Viruses. - 2002. - July 7-11. - San-Diego. - P. 215.
16.Kalinina, O. More recombinant HCV strains recovered in St. Petersburg / O. Kalinina. H. Norder, V. Thcakharian, K. Zhdanov, P. Kislii, T. Vetrov, S. Mukomolov, L. Magnius // 9th International Meeting on HCV and Related Viruses. -2002. - July 7-11. - San-Diego. - P. 225.
17.Kalinina, O. Recombination in hepatitis С virus / O. Kalinina, H. Norder, S. Mukomolov, L. Magnius // XIIth International Congress of Virology. — 2002. - July 27- August 1. - Paris. - P. 100.
18.Cristina, J. Hepatitis С virus phylogeny: a useful clinical tool / J. Cristina, S. Mukomolov, R. Colina, O. Kalinina, L. Garcia, B. Khan, C. Mogdasy, P. Karayiannis // Acta Virol. - 2002. - V. 46. - P. 179-182.
19.Вирусные гепатиты в Российской Федерации : Аналитический обзор (4-й выпуск) / под. ред. Жебруна А. Б. - СПб: НИИЭМ им. Пастера, 2003. - С. 143183.
20.Мукомолов, С. JI. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов : Пособие для врачей / С. JI. Мукомолов, О. В. Калинина. - СПб.: Фолиант, 2003. - 24 с.
21.Мукомолов, С. JI. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов / С. JI. Мукомолов, О. В. Калинина // Мир вирусных гепатитов. - 2003. - № 11. - С. 2— 7.
22.Мукомолов, С. J1. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов / С. JI. Мукомолов, О. В. Калинина // Мир вирусных гепатитов. - 2003. - № 12. - С. 513.
23.Kalinina, О. Secondary RNA structures of parental strains support HCV recombination by template switch at negative strand synthesis / O. Kalinina, H. Norder, L. Magnius // 10th International Meeting on HCV and Related Viruses. -
2003. - December. - Kyoto. - P. 215.
24.Schijman, A. Comparison of Hepatitis С Viral Load in Patients with or without Coinfection with Different Genotypes / A. Schijman, R. Colina, S. Mukomolov, O. Kalinina, L. Garcia, S. Broor, A. Bhupatiraju, P. Karayiannis, B. Khan, C. Mogdasy, J. Cristina // Clin. Diag. Lab. Immun. - 2004. - V. 11. - P. 433-435.
25.Kalinina, O. More Strains of the HCV Recombinant Recovered in Russia / O. Kalinina, H. Norder, O. Znoiko, V. Thcakharian, S. Mukomolov, L. O. Magnius // 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. — 2004. -1-4 May. - Praga. - P. 211.
26.Kalinina, O. Natural recombinant hepatitis С virus strain: a useful tool for understanding of the interferon-alpha resistance // O. Kalinina, H. Norder, S. Mukomolov, L. O. Magnius // 6th Nordic-Baltic Congress on Infectious Diseases. -
2004. - 3-6 June. - Palanga. - P. 169.
27.Kalinina, O. Full-Length Open Reading Frame of a Recombinant hepatitis С Virus Strain from St. Petersburg: Proposed mechanism for its formation // O.Kalinina, H. Norder, L. Magnius // J. Gen. Virol. - 2004. - V. 85. - P. 18531857.
28.Kalinina, O. Spread of the natural hepatitis С virus recombinant, RFl_2k/lb, outside Russia / O. Kalinina, C. Jem, T. Tallo, O. Znoiko, M. Isaguliants, S. Mukomolov, H. Norder, L. Magnius // 11th International Meeting on HCV and Related Viruses. -
2004. - October. - Heidelberg (Germany). - P. 189.
29.Mavromara, P. The impact of HCV diversity on diagnosis tools for HCV infection / P. Mavromara, A. Sail, O. Kalinina, V. Horm, A. Budkowska, HCV Collaborative Team of the International Pasteur Network // Med. Mai. Infect. -
2005. - V. 35. - Suppl. 2. - P. 103-104.
30.Kalinina, O. Spread of the natural hepatitis С virus recombinant outside Russia / O. Kalinina, C. Jern, T. Tallo, V. Thcakharian, D. Gusev, O. Znoiko, M. Isaguliants, S. Mukomolov, H. Norder, L. O. Magnius // 12th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. - 2006. - July 1-5. - Paris. - P. 208.
31.Andreo, U. Lipoprotein lipase mediates hepatitis С virus (HCV) cell entry and inhibits HCV infection / U. Andreo, P. Maillard, O. Kalinina, M. Walic, E. Meurs, M. Martinet, P. Marceliin, A. Budkowska // Cell Microbiol. - 2007. - V. 9. - N. 10. - P. 2445-2456.
32.Budkowska, A. Biologycal role of a novel protein (CORE+l/F) encoded by the alternative open reading frame of the hepatitis С virus genome / A. Budkowska, A. Kakkanas, E. Nerrienet, O. Kalinina, P. Maillard, V. Sorn, G. Dalagiorgou, N. Vassilaki, P. Mavromara // Confer. Scientif. Internat. Du Reseau Internat. Des Instituts Pasteur. - 2008. - Juin 26-27. - Paris.
33.Мукомолов, С. JI. Молекулярно-биологическая характеристика возбудителей вирусных гепатитов В и С / С. Л. Мукомолов, О. В. Калинина, И. В. Ликий, М. В. Сталевская // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. - 2008. - Т. 28. - JV® 3. - С. 27-31.
34.Budkowska, A. Synonymous Mutations in the Core Gene Are Linked to Unusual Serological Profile in Hepatitis С Virus Infection / A. Budkowska, A. Kakkanas, E. Nerrienet, O. Kalinina, P. Maillard, S. Horm, G. Dalagiorgou, N. Vassilaki, U. Georgopoulou, M. Martinot, A. Sail, P. Mavromara // PLoS One. -
2011.-V. 6. — N. l.-P. 1-12.
35.Kalinina, O. Analysis of cases of nosocomial infection with HCV / O. Kalinina, S. Mukomolov, H. Norder, L. O. Magnius // The 8th Annual Conference on Hepatitis C. - 2011. - 13-16 February. - Vilnius.
36.Исагулянц, M. Г. Клинический случай: желтушная форма острого гепатита G с серологическими маркерами HCV-инфекции на фоне заместительной стероидной терапии / М. Г. Исагулянц, Е. В. Цыганова, О. О. Знойко, Т. В. Петрова, Н. В. Петракова, А. Виделль, Н. Д. Ющук, К. Р. Дудина, Н. В. Федосеева, В. Д. Смирнов, С. А. Солонин, О. В. Исаева, К. К. Кюрегян, М. С. Вонский, О. В. Калинина, Т. Талло, В. Тефанова // Мир вирусных гепатитов. - 2011. - № 1. - С. 35-43.
37.Жебрун, А. Б. Разнообразие и изменчивость популяций микроорганизмов на современном этапе / А. Б. Жебрун, С. JI. Мукомолов, О. В. Нарвская, И. В. Мокроусов, Г. Я. Ценева, JI. А. Кафтырева, Н. И. Романенкова, О. В. Калинина // Тез. X Съезда Всеросс. научно-практ. общества эпидем., микроб, и паразит. -
2012.-12-13 апреля. - Москва. - С. 82.
38.Калинина, О. В. Природный рекомбинант вируса гепатита С RFl_2k/lb: 10 ЛЕТ СПУСТЯ / О. В. Калинина, О. О. Знойко, Т. Г. Талло, М. Г. Исагулянц, К. В. Жданов, Д. А. Гусев, П. Н. Кислый, С. М. Мукомолов, В. В. Чахарьян , Н. Norder, L. О. Magnius // Тез. X Съезда Всеросс. научно-практ. общества эпидем., микроб, и паразит. - 2012. - 12-13 апреля. - Москва. - С. 446.
39.Калинина, О. В. Природный рекомбинант вируса гепатита С RFl_2k/lb: клинико-эпидемиологическое значение / О. В. Калинина, О. О. Знойко, М. Г. Исагулянц // Тез. IV Ежегодного Всеросс. Конгресса по инфекц. болезням. -2012. - 26-28 марта. - Москва. - С. 169.
40.Kalinina, О. Clinical and epidemiological features of the natural hepatitis С virus recombinant RFl_2k/lb / O. Kalinina, O. Znoiko // The 9th Annual Conference on Hepatitis C. - 2012. - 31 March-04 April.-St. Petersburg.
41.Калинина, О. В. Организация генома и география природного межгенотипного рекомбинанта вируса гепатита С RFl_2k/lb / О. В. Калинина // Инфекции и иммунитет. - 2012. - Т. 2. - № 4. - С. 677-686.
42.Kalinina, О. Somatic Changes in Primary Liver Cancer from Russia: a pilot study / O. Kalinina, A. Marchio, A. Urbanskii, A.Tarkova, Kh. Rebbani, D. A. Granov, A. Dejean, M. Generalov, P. Pineau // Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. - 2013. - In press.
43.Kalinina, O. Atypical Somatic Changes in Primary Liver Cancer from Russia: a pilot study / O. Kalinina, A. Marchio, M. Generalov, A. Urbanskii, A. Tarkova, Kh. Rebbani, A. Dejean3, D. A. Granov, P. Pineau // 10th Annual Conference of New Visby Network in Hepatitis. - 2013. - 10-13 February. - Riga.
ОТ АВТОРА
Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научным консультантам - член-корреспонденту РАМН, профессору Анатолию Борисовичу Жебруну и д.м.н., профессору Ольге Викторовне Нарвской за ценные советы, конструктивные комментарии и всестороннюю поддержку.
Автор благодарит проф. L. О. Magnius и Н. Norder (лаб. вирусных гепатитов Шведский институт по Контролю за инфекционными заболеваниями (SMI, г. Стокгольм) за совместные научные дискуссии и исследования, увенчавшиеся открытием первого природного рекомбинанта ВГС. Автор выражает признательность Т. Tallo, а также всем сотрудникам лаборатории вирусных гепатитов (SMI, г. Стокгольм) за многолетнее плодотворное сотрудничество и дружескую поддержку.
Автор благодарит проф. С. JI. Мукомолова (зав. лаб. вирусных гепатитов ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) за совместную научную работу на протяжении многих лет, которая позволила впервые установить структуру генотипов ВГС на территории г. Санкт-Петербурга среди различных групп населения, включая пациентов отделений гемодиализа.
Автор сердечно благодарит к.х.н. М. Г. Исагулянц (ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского), д.м.н. О. О. Знойко (МГМСУ им. А.И. Евдокимова), проф. К. В. Жданова, д.м.н А. С. Гусева (BMA им. С. М. Кирова, СПб), к.м.н. В. В. Чахарьян (ЦГСЭН в Калининском районе, СПб), П. Н. Кислого (СПбГМА им. И.И. Мечникова), к.м.н. М. И. Генералова (ЦНИРРИ Росздрава, СПб, пос. Песочный) за успешное сотрудничество.
Автор признателен проф. Agata Budkowska (Pasteur Institute, France) за творческие научные дискуссии, советы и заботу на протяжении многих лет. Автор выражает признательность Patrick Maillard и Ursula Andréo, всем коллегам Сети Институтов Пастера, участвовавших в Трансверсальном проекте, руководителю проекта Penelope Mavromara, Srey Viseth Horm и Eric Nerrienet (Институт Пастера Королевства Камбоджа) за плодотворное сотрудничество. Автор сердечно благодарит Pascal Pineau (Pasteur Institute, France) за научную совместную работу.
Автор сердечно благодарит сотрудников лаборатории молекулярной микробиологии д.б.н. И. В. Мокроусова, к.б.н. А. А. Вязовую, Д. А. Старкову и друзей за всестороннюю поддержку.
Отпечатано в ООО "АРКУШ", Санкт-Петербург, Каменноостровский пр. 10, лит. Б ИНН 7825442972 / КПП 781301001 Подписано в печать 09.09.2013 г. Формат 60x84/16 заказ №0909/1 от 09.09.2013 г., тир. 100 экз.
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Калинина, Ольга Викторовна, Санкт-Петербург
ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПАСТЕРА
0^201450166 НА ПРАВЛХ рукописи
Калинина Ольга Викторовна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЭВОЛЮЦИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С
03.02.02 - вирусология
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научные консультанты:
член-корреспондент РАМН,
д.м.н., профессор Жебрун Анатолий Борисович
д.м.н., профессор Нарвская Ольга Викторовна
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2013 г.
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ..............................................................5
ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................13
1.1. Организация генома и белки вируса гепатита С............................................................15
1.1.1. Структурные белки вируса гепатита С..................................................................17
1.1.2. Неструктурные белки вируса гепатита С............................................................23
1.2. Жизненный цикл вируса гепатита С..........................................................................................26
1.3. Эволюция вируса гепатита С............................................................................................................33
1.3.1. Роль мутаций в эволюции вируса гепатита С..................................................35
1.3.2. Классификация вируса гепатита С..............................................................................36
1.3.3. География и эволюция генотипов вируса гепатита С..............................39
1.4. Рекомбинация как один из молекулярно-генетических механизмов эволюции РНК-содержащих вирусов................................................................................................49
1.4.1. Типы и механизмы РНК рекомбинации................................................................50
1.4.2. Рекомбинация у представителей семейств Picornaviridae и Coronaviridae..............................................................................................................................................................52
1.4.3. Рекомбинация у представителей семейства Flaviviridae........................55
1.5. Лабораторная диагностика вирусного гепатита С........................................................57
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................................................61
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................61
2.1. РНК изолятов вируса гепатита С..................................................................................................61
2.2. Образцы сыворотки и плазмы крови........................................................................................62
2.3. Определение соге-антигена ВГС, антител к core и core+1/AFRP белкам 64
2.4. Выделение тотальной РНК................................................................................................................66
2.5. Синтез кДНК..................................................................................................................................................67
2.6. Амплификация 5'UTR/core и NS5B фрагментов генома ВГС методом гнездной ПЦР............................................................................................................................................................67
2.7. Амплификация больших фрагментов генома ВГС методом гнездной
ПЦР....................................................................................................................................................................................68
2.8. Секвенирование ДНК методом лимитированного секвенирования...... 70
2.9. Анализ нуклеотидных последовательностей.................................. 71
2.10. Моделирование вторичной структуры РНК.................................. 71
ГЛАВА 3. РЕКОМБИНАЦИЯ -ОДИН ИЗ МЕХАНИЗМОВ ЭВОЛЮЦИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С................................................................. 73
3.1. Доказательства наличия природной рекомбинации между геномами изолятов ВГС различных генотипов.................................................. 73
3.2. Идентификация сайта рекомбинации........................................... 79
3.3. Организация генома природного рекомбинанта ВГС........................ 84
3.4. Характеристика вторичной структуры РНК ВГС в области сайта рекомбинации............................................................................. 87
3.5. Механизм формирования природного рекомбинанта КР1_2к/1Ь
вируса гепатита С......................................................................... 91
ГЛАВА 4. ПРИРОДНЫЙ РЕКОМБИНАНТ ЯИ_2к/1Ь КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ВГС К ИНТЕРФЕРОНУ..................................... 98
4.1. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
области Е2 рекомбинантных изолятов ВГС КР1_2к/1Ь........................... 99
4.2. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей N85А области рекомбинантных изолятов ВГС КЕ1_2к/1Ь.............................. 103
4.3. Влияние рекомбинантного варианта ВГС КЕ1_2к/1Ь на результат
терапии интерфероном.................................................................. 110
ГЛАВА 5. ПРИРОДНЫЙ РЕКОМБИНАНТ КИ_2к/1Ь В СТРУКТУРЕ СОВРЕМЕННОЙ ПОПУЛЯЦИИ ВГС............................................... 113
5.1. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов ВГС, выделенных от анти-ВГС и РНК ВГС положительных пациентов Санкт-Петербурга, Москвы, Эстонии и Швеции.......................................... 113
5.2. Географический и эпидемиологический анализ изолятов природного рекомбинанта КР1_2к/1Ь..................................................................................................................122
ГЛАВА 6. РОЛЬ СИНОНИМИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В ФОРМИРОВАНИИ ИЗОЛЯТОВ ВГС С НОВЫМ БЕЛКОВЫМ
ПРОФИЛЕМ..............................................................................................................................................................127
ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................................................................139
7.1. Рекомбинационный механизм эволюции ВГС................................................................139
7.2. Мутационный механизм эволюции ВГС и его роль в формировании
изолятов с новым белковым профилем..........................................................................................152
ВЫВОДЫ......................................................................................................................................................................157
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..............................................................................................158
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................159
ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................................................................................................220
ОТ АВТОРА..............................................................................................................................................................229
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ам. о. - аминокислотный остаток
анти-ВГС - антитела к вирусу гепатита С
ВВН - лица, употреблявшие внутривенно наркотические средства
ВГС - вирус гепатита С
Вирусный ГС - вирусный гепатит С
ВНС - внутривенные наркотические средства
ВОЗ - Всемирная Огрганизация Здравоохранения
ГС - гепатит С
ИФА - иммуноферментный анализ
н. о. - нуклеотидное основание
ОТ-ПЦР - обратно-транскриптазная-полимеразная цепная реакция
ПЦР - полимеразная цепная реакция
BMV - brome mosaic virus (англ. вирус мозаики костра)
HS - hairpin structure (англ. вторичная структура «шпилька»)
1RES - internal ribosomal entry site (англ. внутренний сайт связывания рибосомы)
NS - nonstructural (англ., неструктурные)
RdRp - РНК-зависимая РНК-полимераза
TCV - turnip crinkle virus (англ. вирус скрученности турнепса)
UPGMA - unweighted pair-group method of arithmetic averages (англ. невзвешенный попарный метод арифметических средних)
3'UTR - 3'-untranslated region (англ. З'-нетранслируемый участок)
5'UTR - 5'-untranslated region (англ. 5'-нетранслируемый участок)
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) в мире более 150 млн. человек (около 3% населения планеты) инфицировано вирусом гепатита С (ВГС), ежегодно более 350 тыс. человек умирает от болезней печени, ассоциированных с вирусным гепатитом С (ГС) [470]. За последнее десятилетие число зарегистрированных больных хроническим гепатитом С (ХГС) в Российской Федерации увеличилось вдвое и достигло 40,9°/00оо [3]. По тяжести течения, причиняемому экономическому ущербу ГС занимает одно из ведущих мест в инфекционной патологии человека. Это обусловлено высокой генетической вариабельностью ВГС, которая обеспечивает «ускользание» вируса от факторов иммунной защиты организма человека, что способствует значительной частоте хронизации заболевания (до 70%) и затрудняет разработку эффективных методов специфической профилактики и лечения ГС [3]. В этой связи, учитывая то, что предотвращение распространения возбудителя является основным направлением борьбы с данным заболеванием, исследование природных популяций и эволюции ВГС приобретает особую актуальность в современных условиях.
Вирус гепатита С, один из наиболее динамично эволюционирующих патогенов вирусной природы, был открыт в 1989 г и отнесен к семейству Flaviviridae, род Hepacivirus [80; 394]. Современная классификация ВГС включает 6 генотипов и более 300 субтипов вируса, при этом постоянно появляются сообщения о новых, ранее не выявляемых, вариантах вируса [395]. Долгое время генетическое разнообразие ВГС связывали только с высокой частотой мутаций, аккумулируемых в геноме. Другой фундаментальный механизм изменчивости -рекомбинации, происходящие между геномами вирусов различных генотипов/серотипов, считали несвойственными ВГС или полагали, что образующиеся рекомбинанты являются «нежизнеспособными». Сравнение результатов генотипирования, выполненных на различных участках генома
изолятов ВГС за более чем десятилетний период не выявило генетических рекомбинаций у данного возбудителя [392]. В то же время, в немногочисленных образцах сыворотки крови было обнаружено одновременное присутствие нескольких изолятов ВГС, принадлежавших к различным генотипам [7; 16; 146; 195; 304; 391; 455). Таким образом, вопрос о возможности формирования новых вариантов ВГС за счет рекомбинации между геномами изолятов различных генотипов оставался открытым, поэтому неполными оставались и представления о механизмах эволюции ВГС.
Понимание природных механизмов генотипической изменчивости ВГС является крайне важным как в теоретических, так и прикладных областях исследований: для мониторинга глобальной и локальной популяций ВГС, для прогнозирования развития эпидемического процесса и научно-обоснованного выбора стратегии профилактических, лечебных и противоэпидемических мероприятий.
Изложенное определило цель и задачи настоящей работы.
Цель исследования
Изучить генетические механизмы изменчивости ВГС и оценить их вклад в формировании структуры современной популяции ВГС.
Задачи работы
1. Доказать с использованием молекулярно-генетических методов исследования и филогенетического анализа наличие явления рекомбинации в эволюции вируса гепатита С.
2. Изучить механизм формирования природного рекомбинанта ЯИ_2к/1Ь на основе анализа первичной и вторичной структур генома.
3. Оценить значение природного рекомбинанта КР1_2к/1Ь как модели для изучения молекулярно-генетических механизмов резистентности ВГС к противовирусным препаратам на примере резистентности к интерферону.
4. Оценить значимость природного рекомбинанта RFl_2k/lb в формировании современной структуры популяции ВГС.
5. Изучить роль синонимических мутаций в core области генома ВГС в формировании вариантов вируса с измененным белковым профилем.
Научная новизна
Впервые в мире доказано существование явления природной генетической рекомбинации ВГС и установлена его роль в эволюции ВГС.
Идентифицирован природный рекомбинант ВГС RFl_2k/lb, определена нуклеотидная и аминокислотная последовательность открытой рамки считывания рекомбинантного генома.
Впервые на основе анализа вторичной структуры «родительских» геномов и генома рекомбинанта предложена модель формирования природных рекомбинантов ВГС. Обоснована значимость природного рекомбинанта ВГС RFl_2k/lb для изучения молекулярно-генетических механизмов, обуславливающих формирование резистентности к интерферону.
Получены данные о распространенности природного рекомбинанта ВГС RFl_2k/lb в структуре современной мировой популяции ВГС.
Показано значение синонимических мутаций в core области генома ВГС в эволюции ВГС при формировании вариантов с повышенным уровнем экспрессии core+1/ARFP белка, обуславливающего атипичный профиль антител к ВГС у инфицированных такими изолятами.
Практическая значимость исследования
Нуклеотидные последовательности изученных изолятов ВГС депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank, что позволяет участвовать в международных исследованиях распространения природного рекомбинанта RFl_2k/lb и глобальной эпидемиологии ВГС; осуществлять мониторинг структуры популяции ВГС в различных географических зонах; проводить эпидемиологическую диагностику случаев спорадической и вспышечной
заболеваемости вирусным гепатитом С (идентификация источника, путей и факторов передачи, и благодаря этому - принятие адресных мер профилактики); расследование случаев завоза вариантов ВГС из других географических зон мира.
Картирование природного сайта рекомбинации легло в основу последующего создания in vitro успешных химерных рекомбинантов ВГС для изучения значения различных участков генома ВГС в морфогенезе вируса, в том числе для изучения молекулярно-генетических механизмов, обуславливающих формирование резистентности к противовирусным препаратам.
В клинической практике доказательство инфицирования пациента природным рекомбинантом RFl_2k/lb позволит своевременно выбрать стратегию противовирусной терапии.
Полученные результаты могут быть использованы в деятельности клинико-диагностических лабораторий; учреждений Госсанэпиднадзора и здравоохранения, в научных учреждениях; при разработке целевых программ; в учебном процессе в медицинских вузах.
Положения, выносимые на защиту
1. Геном вируса гепатита С подвержен природной рекомбинации. Рекомбинация является одним из механизмов эволюции ВГС.
2. Природный рекомбинант RFl_2k/lb сформировался в результате гомологичной рекомбинации геномов lb и 2к по механизму непроцессивной смены матрицы.
3. Природный рекомбинант RFl_2k/lb обладает селективным преимуществом, обеспечивающим ему значимую роль в эпидемическом процессе, по сравнению с «родительским» изолятом субтипа 2к.
4. Синонимические точечные мутации в core области генома вируса гепатита С могут приводить к формированию изолятов с измененным белковым профилем.
Апробация работы
По теме диссертации опубликованы 43 печатные работы, включая 12 статей в журналах списка, рекомендованного ВАК, 9 из них - в зарубежных изданиях.
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на 22 российских
и международных семинарах, конгрессах и конференциях в 2001-2013 гг.:
th
8 International Symposium on Hepatitis С and related Viruses, 2-5 September, Paris, Франция, 2001; VIII Съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-28 марта, Москва, 2002; 5th Baltic Nordic Congress of Infectious Diseases, 22-25 May, 2002, St.Petersburg, Russia; 9th International Meeting on HCV and Related Viruses, 7-11 July, 2002, San-Diego, USA; XIIth International Congress of Virology, 27 July - 1 August, 2002, Paris, France; 10th International Meeting on HCV and Related Viruses, December, 2003, Kyoto, Japan; Human Hepatitis С Workshop in the frame of New Visby Program of the Swedish Institute Stockholm, 10 March, 2003; 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 1-4 May 2004, Praga, Чехия; 6th Nordic-Baltic Congress on Infectious Diseases, 3-6 June, Palanga, Lithuania, 2004; 11th International Meeting on HCV and Related Viruses, October, 2004, Heidelberg, Germany, 2004; 12th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. 1-5 July, Paris, Франция, 2006; 3rd HCV Visby Program Workshop: HCV infection- factors associated with persistence, clearance and protection, 13-14 February, Malmo, Sweden 2006; Международная научная конференция в честь 150-летия со дня рождения С. Н. Виноградского «Биоразнообразие и генетика микроорганизмов», 4-5 сентября, Санкт-Петербург, 2006, 4th Annual New VISBY HCV University Network Meeting, 9-12 February, Stokholm 2007; Confer. Scientif. Internat. Du Reseau Internat. Des Instituts Pasteur, 26-27 June, Paris, Франция, 2008; 5th Annual meeting of the New VISBY University Network on hepatitis C. Moscow, 31 January - 4 February, 2008; Ha заседании лаборатории микробиологии и иммунологии Пекинского Детского Госпиталя, 9 ноября, 2011, Пекин, Китай; The 8th Annual Conference on Hepatitis C, Vilnius, 13-16 February, Lithvenia, 2011; The 9th Annual Conference on Hepatitis C, St Petersburg, 31 March - 04 April 2012; X Съезд Всероссийского научно-
практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 12-13 Апреля, Москва, 2012; IV Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням, 26-28 Марта, Москва, 2012; 10th Annual Conference of New Visby Network in Hepatitis, 10-13 February, Riga, Latvia, 2013; Международная конференция к 90-летию НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, 5-7 Июня, Санкт-Петербург, 2013.
Внедрение результатов исследований в практику
1. Природный рекомбинант RFl_2k/lb включен в действующую классификацию вируса гепатита С как отдельная номенклатурная единица, названная циркулирующая рекомбинантная форма CRF 01_lb2k (Kuiken С. and Simmonds P., 2009. Nomenclature and Numbering of the Hepatitis С virus. Chapter 4. Hepatitis C: Methods and Protocols, Second Edition, vol. 510, ed. Hengli Tang).
2. 193 нуклеотидные последовательности депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank: 48 фрагментов размером около 550 н. о. из core области генома (JF701908.1-JF701913.1), 130 фрагментов из NS5B области размером 253 н. о. и четыре фрагмента размером 1776 н. о. (HQ641453.1-HQ641455.6), три фрагмента размером 1210 н. о. из E2/NS3 области генома, два фрагмента размером 3620 н. о. (AY070214.1) и 3650 н. о. (AY70215.1) из core/NS3 области, две открытые рамки считывания рекомбинантного генома (AY587845.1 - 9357 н. о.) и «родительского» генома субтипа lb (AY587844.1 -9365 н. о.).
Личное участие автора в получении результатов
Основные результаты получены лично автором. Выделение РНК изолятов ВГС из образцов сыворотки крови пациентов с диагнозом ГС, молекулярно-генетические исследования, компьютерный и статистический анализ проведены автором в Шведском институте по контролю за инфекционными заболеваниями (Стокгольм) при участии проф. L.O. Magnius,
-
Калинина, Ольга Викторовна
-
доктора биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2013
-
ВАК 03.02.02
- Особенности вируса гепатита C в острой и хронической стадиях инфекции и дифференциация стадий
- Новые вирусы гепатита В птиц
- Оценка влияния массовой вакцинации против гепатита В на генетическое разнообразие вируса гепатита В, заболеваемость и неблагоприятные исходы инфекции.
- Вопросы генотипирования и анализ генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита
- Клинико-морфологическое исследование различных вариантов хронической HCV+HBV-инфекции
