Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические аспекты эволюции байкальской нерпы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические аспекты эволюции байкальской нерпы"

На правах рукописи

<т> см

МАЛИКОВ НАРГИЗ ГАББАСОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭВОЛЮЦИИ БАЙКАЛЬСКОЙ НЕРПЫ

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1997

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН и Лимнологическом институте СО РАН г.Иркутск

Научные руководители:

член-корреспондент РАН,

доктор химических наук Михаил Александрович Грачев кандидат химических наук Сергей Михайлович Зеленин

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент РАЕН Николай Павлович Мертвецов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Николай Александрович Колчанов

доктор биологических наук,

профессор Станислав Николаевич Загребельный

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Защита состоится о/ _ 1997 г. в У часов на заседании Диссертационно-

го совета К 003.52.01 при Новосибирском Институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского Института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан " /Л 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук О.С.Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Изучение байкальской нерпы (Ркоса

¿гЫпса) на протяжении последних 200 лет стимулируется не столько хозяйственной ценностью этого вида, сколько и связи с пониманием значения этого животного для функционирования уникального биоценоза озера Байкал. Одним из основных аспектов исследования этого вида япляется пмягпеннс его происхождения и эволюции. К настоящему времени получено большое количество данных по экологии, этологии, морфологии, физиологии, зоогеографии, биохимии, цитогенетике, остеологии, а также об условиях сутсстиовамня современной и ископаемых форм байкальского тюленя. Все эти данные могут быть использованы при обсуждении проблемы происхождения нерпы в Байкале. Однако наиболее цепную информацию для решения этого вопроса могут дать исследования с иснользоцанием методов молекулярной систематики. Эта наука позволяет выяснять эволюционные отношения и идо и на основе сравнения аминокислотных последовательностей их бел кон и нуоеотидных последовательностей ДНК.

Для решения проблемы происхождения байкальской нерпы методы молекулярной систематики до настоящего времени нснользонаны не оыл>>. Настоящая работа является первым шагом в этом направлении, что определяет ее актуальность и новизну.

Целыо настоящей работы являлось определение времени дивергенции байкальской нерпы (Р/юсп ьШтса) от общего для обыкновенных тюленей предкового вида, а также выявление эволюционных связен между :пнмн видами. Для выполнения этой цели было необходимо решить следующие задачи:

♦ Определить первичную структуру миоглобина байкальской нерпы (РЬоса ¿¡Ытч) н сравнить ее со структурой мпоглобипов б.никородшнеиных нндоь - прибрежного (Ркоса ЫН/Ипа) и серого (НнИс/юспт дп/рих) тю.тгпги - для оценки времени дивергенции их ог общего предкового вида.

♦ Определить нуклеотидную последовательность фрагментов гена миоглобина байкальской нерпы (Р/юса $1Ыг1са) и сравнить их с соответствующими фрагментами гена серого тюленя (НаНскоегиз дгурш) для более точной оценки времени Их дивергенции от общего предкового вида.

♦ Определить нуклеотидную последовательность фрагмента митохондриального гена шгго.хрома В байкальской нерпы (Р/юса згЫггса) и тихоокеанского тюленя (Р/юса 1агдка) с целью выяснения филогенетических взаимоотношений этих видов.

Иаичная новизна работы.

♦ Впервые определена аминокислотная последовательность миоглобина байкальской нерпы (Р/юса з1Ыпса). На основе ее сравнения с известными структурами миогло-бшюв серого (НаИскосгш дгуриэ) и прибрежного (Р/юса ЫЫИпа) тюленей показана их полная идентичность, что говорит об относительно недавней дивергенции вышеуказанных нндов от общего предка. Исходя из известной скорости эволюции миоглобина, показано, что дивергенция этих видов могла произойти в последние 7 млн. лет.

♦ Впервые определена нуклеотндная последовательность трех экзонов гена миоглобина байкальской нерпы (Р/юса ^¿Ыпса). Обнаружена ее полная идентичность соответствующей структуре гена миоглобина серого тюленя (НаНс/юегиБ дгуриь). С учетом скорости мутации синонимичных кодонов генов миоглобина, было рассчитано время дивергенции вышеуказанных видов тюленей - не более 2,2 млн. лет назад.

Впервые определены нуклеогпдные последовательности фрагментов митохондрнальных генов цитохрома В байкальского (Р/юса хгЫг1са) и тихоокеанского (Р/юса /агд/ха) тюленей. Последующее сравнение .тги.х последовательностей позволило оценить время дивергенции эшх нидов тюленей как около 1,14 млн лет.

Апробаиия работы. Материалы диссертации были доложены на Первой Верещагинской Байкальской международной конференции (Иркутск) в 1989 году. По результатам исследований опубликовано 3 статьи.

Стриктура и объем работы. Диссертация состоит из ВВЕДЕНИЯ, трех глав (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ) и ВЫВОДОВ. Диссертация изложена на 81 странице, включая 15 рисунков и список литературы (126 цитированных работ). СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Аминокислотная последовательность миоглобина байкальской нерпы' (Phoca sibirica).

Для определения филогенетических связей между байкальской нерпой, серым (fíalichocrus grypus) и прибрежным (Phoca vitulina) тюленями, обитающими в Балтийском и Северном морях и н Ледовитом океане к северу от Европы, мы использовали метод построения филогении на основе сравнения первичной структуры многлоби-нов этих близкородственных видов. Для этого совместно с В.В.Шемякиным и др. была определена первичная структура миоглобина байкальской нерпы (Phoca sibirica). Мп-оглобин в количестве 43 мг выделили из 50 г сердечной мышцы байкальской нерпы сульфат-аммонийным осажденном из гомогеиата с последующей хроматографией на СМ-ссфадексе. Для определения первичной структуры использовали основную хрома-тографнческую компоненту миоглобина нерпы, которая представляет собой электрофо-ретически гомогенный белок с молекулярной массой 18,0 кДа (рис.1). После удаления гема провели анализ N-копцевой аминокислотной последовательности миоглобина, что позволило идентифицировать 43 аминокислотных остатка (рнс.З). В дальнейшем, при определении первичной структуры миоглобина, придерживались стандартной стратегии. А именно, расщепляли полипептидную цепь на крупные участки, фрагментирова-ли их на более мелкие пептиды и затем устанавливали их аминокислотную последовательность.

í

Рисунок I. Электрофорез по Лэммли (12% полиакриламидный гель) миоглоби-на Phoca Sibirica. Дорожки соответствуют: t - альбумину человека (45 кДа); 2 - миоглобину лошади (18кДа); 3,4,5,6 - препаратам миоглобипа байкальской нерпы Phoca Sibirien.

Расщепление белка проводили бромциановым методом в 0,1 N HCl, в течение 18 часов. Полученные пептиды разделяли методом обращенпо-фазовой хроматографии в градиенте концентрации ацетонитрила. На хроматограмме отчетливо видно шесть пиков (рис.2). Все бромциановые пептиды были рехроматографированы при более пологом градиенте.

N-концевон бромциамовый пептид В6 был идентифицирован по поглощению на 280 н.м, т.к. у всех бромцнановых пептидов близкородственных видов в N-концевом пептиде содержится два остатка триптофана. Прямым секвепированием N-концевого бромцианового пептида определено пять аминокислотных остатков.

В2

500 IOOO 1500 . 2000 мкл

Рисунок 2. Разделение смеси пептидов, полученных при расщеплении миоглоби-на байкальской нерпы (Phoca Sibirica) бромцианом. Колонка 2x64мм, сорбент -Nucleosil 5-С18. Подвижная фаза (2500 мкл) - раствор 50% CHjCN в 0.1% трифторуксусной кислоте. Скорость потока элюента 50 мкл/мин. Объем наносимой пробы 50 мкл.

Дальнейшее определение структуры этого пептида не имело смысла, т.к. последовательность 43 Ы-концевых аминокислотных остатков уже была определена.

Пептид В1 перед.секвенированием был повторно рехроматографирован при рН 4,0. Структура бромцианового пептида В1 была определена с 132 по 152, В2 с 56 по 93 аминокислотные остатки. Бромциановый пептид ВЗ был секвенирован с 56 по 92 аминокислотные остатки (в последующем было показано, что этот пептид является результатом неполного бромцианового расщепления с 56 по 153 аминокислотные остатки).

На следующем этапе работы было проведено расщепление бромциановых пептидов по остаткам глутаминовой кислоты.

Все основные пики, полученные в результате расщепления пептида ВЗ, были рехроматографированы и секвенированы. При этом были установлены структуры следующих пептидов: ВЗ-СЗ (137-143), ВЗ-С5 (106-130), ВЗ-02 (136-147), ВЗ-С1 (149153), что позволило реконструировать значительную часть пептида ВЗ.

Гидролизу по остаткам глутаминовой кислоты был подвергнут также Ы-концевой бромциановый пептид В6. Все пептиды были собраны, рехроматографированы, и был определен аминокислотный состав каждого пептида. По результатам аминокислотного анализа был выбран для секвенирования пептид В5-С1 (43-52), структура которого позволила практически полностью реконструировать ЬГ-концевой бромциановый пептид.

Для реконструкции недостающих участков структуры миоглобина был проведен триптический гидролиз. На основании аминокислотного анализа были секвенированы пептиды Т2 (97-102) и Т1 (99-102), структура которых перекрывается. Это явилось результатом неполного гидролиза данного участка белка. Структура пептида Т4 (148153) позволила реконструировать С-конец белка. Секвенирование пептида ТЗ позволило определить структуру важного участка между аминокислотами 103 и 106.

10 20 30 40 50 60

, 1—11-I—В6-в1 —^

70 80 90 100 110 120

ЬНКНСЫТ\П,ТАЬаа1ЬКККСННЕАЕЬКР1А03НАТКНК1Р1КТЪЕР13ЕА11НУЬНЗКНР

I-В2 ---|— вз-вб-

I— -Из -

I—Т2 -

130 140 150

АЕРОАБА0ААЫКЮи.ЕЬР1иП) 1ААКУКЕЫЗРНС

-

I-В1

I— С1—-

Рисунок 3. Первичная структура миоглобина байкальской нерпы (РИоса зШпса). Указаны последовательности аминокислот, установленные при сек-венировании всей молекулы миоглобина (Р), а также пептиды бромцианового расщепления (В), гидролиза трипсином (Т), глутаминовой протеаэой (О, ли-зинспецифической протеазой (Ь). Отмечены только те пептиды, полная или частичная аминокислотная последовательность которых была необходима для реконструкции первичной структуры белка.

С целью поиска пептидов, обеспечивающих определение полной аминокислотной последовательности миоглобина, было предпринято расщепление белка по остаткам глутаминовой кислоты с помощью эндопротеиназы Яи-С и их разделение. Все собранные пептиды были рехроматографированы и на основании аминокислотного анализа

были секвенированы следующие очень важные для реконструкции полной структуры пептиды: С1 (86-97) и С2 (123-133).

Для завершения реконструкции полипептидной цепи миоглобина был предпринят гидролиз белка эндопротеиназой ЬуБ-С. Все пептиды были собраны и рехромато-графированы. На основании аминокислотного анализа для секвенирования был выбран пептид Ы. В результате секвенирования этого пептида удалось перекрыть метионин-55 и реконструировать полную структуру миоглобина.

В результате проделанной работы нам удалось определить первичную структуру миоглобина байкальской нерпы, состоящую из 153 аминокислотных остатков (рис.3). Она оказалась идентичной первичной структуре миоглобинов. РИоса ийиИпа и НаНскоегш дгуриэ.

По данным многочисленных исследований, средняя скорость эволюции миоглобина равняется одной аминокислотной замене за 7 млн. лет. Поэтому идентичность первичных структур миоглобинов тюленей Ркоса 5Шпса, РИоса ьИиНпа и НаИскоетиз дтурш указывает на то, что они "отпочковались" от общего предка не ранее 7 млн. лет назад. Полученные нами результаты, а также последние данные по геологической истории Восточцой Сибири и Байкала, позволили нам предположить, что наиболее вероятным временем вселения нерпы в Байкал является плейстоцен. 2. Структура фрагментов трех экзонов гена миоглобина байкальской'нерпы (РАосй згЫпса).

Для более точной оценки времени дивергенции тюленей РИоса пЬтса и НаИсИоегиз дгурш нами было проведено сравнение нуклеотидных последовательностей трех фрагментов генов миоглобина этих двух видов, принадлежащих к разным родам. Для получения фрагментов гена байкальской нерпы был использован метод полиме-разной цепной реакции.

1 11 21 31 41 51

atggggctcagcgacggggaatgg-3'(ОН) -»

atggggctcagcgacggggaatggCACTTGGTGCIGAACGTCTGGGGGAAGGTAGAGACT

GlyLeuSerAspGlyGluTrpHi sLeuValLeuAsnValTrpGlyLysValGlyThr

61

71

81

91

101

111

ctctttaagagccaccctgag -3' GACCTCGCGGGCcatgggcaggaggtcctcatcagg..ctctttaagagccaccctgagACC

AspLeuAlaGlyHisGlyGlnGluValLeuTleArg LeuPheLysSerHisProGluThr

-(0K)3'-gtacccgtcctccaggagtagtcc

экзон 1 экзон 2

121 131 141. 151 161 171

(OH) -

TTGGAGAAGTTTGACAAGTTCAAGCACCTGAAGTCAGAGGACGACATGAGGCGTTCTGAG

LeuGluLysPheAspLysPheLysHisLeuLysSerGluAspAspMetArgArgSerGlu

181 191 201 211 221 231

GACCTGAGGAAGCACGGCAACACGGTGCTCACGGCCCTGGGGGGCATCCTCAAGAAGAAG

AspLeuArgLysHisGlyAsnThrValLeuThrAlaLeuGlyGlylleLeuLysLysLys

241 251 261 271 281 291

GGACATCACGAGGCTGAGCTGAAGCCCCTGüCCCAGTCACÄTGCCACCAAGCAcaagatc

GlyHisHisGluAlaGluLeuLysProLeuAlaGlnSerHisAlaThrLysHisLysIle

-(OH)3 ' -gttctag

301

311

321

331

341

351

cccatcaagtacctggag

ProIleLysTyrLeuGlu gggtagttcatggacctc

экзон 2

ttcatctcagaagccatcatccatg-3'(OH) -

.ttcatctcagaagccatcatccatgTCCTGCACAGCAAGCAT

PhelleSerGluAlallelleHisValLeuHisSerLysHis

экзон 3

361 371 381 391 401 411

CCCGCGGAATTCGGCGCCGACGCCCAGGCTGCCATGAAAAAGGCCCTGGAGCTGTTCCGG

ProAlaGluPheGlyAlaAspAlaGlriAlaAlaMetLysLysAlaLeuGluLeuPheñrg

421 431 441 451 461

AATGACATCGCTGCCAAATAcaaggagctggggttccatggctaa...

AsnAspIleAlaAlaLysTyrLysGluLeuGlyPheHisGly* * * - (OH)31-grttcctcgaccccaaggtaccgatt

Рисунок 4. Нуклеотидная последовательность экзонов гена миоглобина Phoca sibirica. Наклонными буквами представлены последовательности олигонуклео-тидных праймеров выбранных для амплификации по гомологии с геном миоглобина Halichoerus grypus [125]. Кодируемая экзонами гена аминокислотная последовательность миоглобина Phoca sibirica представлена в трехбуквенном выражении. Границы экзонов отмечены стрелками.

Для амплификации была использована геномная ДНК, выделенная из печени взрослой особи Phoca sibirica. Олигонуклеотиды для амплификации были выбраны исходя из известной структуры гена миоглобина Halichoerus grypus (рис.4). Полученные продукты амплификации в дальнейшем были использованы для клонирования в составе бактериофага М13 шр18.

Фрагменты смешивали с .предварительно подготовленным вектором М13 шр18 расщепленного рестриктазой Eel 136 II и лигировали с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Лигазной смесью трансформировали клетки E.coli JM109. При клонировании были отобраны фаги, дающие белые бляшки.

Первичные структуры отобранных клонов определяли методом Сэнгера с использованием флуоресцентно меченных праймеров и ДНК полимеразы бактериофага Т7 на автоматическом секвенаторе фирмы Applied Biosystems. Полученные результаты, сведенные в нуклеотидную последовательность трех экзонов гена миоглобина суммарной длиной 315 пар оснований представлены на рисунке 4. При их сравнении с соответствующими участками гена Halichoerus grypus отличий обнаружено не было. Зная

скорость мутаций для синонимичных кодонов генов миоглобина ((4,44 ± 0,82)*10"9

мутаций на один сайт за год) и используя формулу для скорости расхождения двух гомологичных последовательностей (У=М/2Т; V- скорость, N -количество мутаций за время Т, N=1), мы определили время дивергенции вышеуказанных видов тюленей как последние 2,2 млн. лет геологической истории Земли, что подтверждает гипотезу о плейстоценовом происхождении байкальской нерпы (Ркоса ьШпса). 3. Нуклеотидная последовательность фрагмента митохондриалыюго гена цитохрома В тюленей Ркоса хгЫпса и РИоса 1атдИа.

Для определения первичной структуры фрагмента митохондриального гена цитохрома В тюленей РЫса ¡гЫпса и РНоса Iагд/га был применен метод полимеразной цепной реакции в сочетании с секвенированием по методу Максама-Гнлберта. Для амплификации (рис.5) была использована ДНК, выделенная из печени взрослых особен.

12 3 4 5

307 Вр

Рисунок.5. Электрофорез в 1% агарозном геле продуктов амплификации фрагментов митохондриального гена цитохрома В тюленей: 1,2 - Ркоса зЛЫса; 3 - РИоса ¡агдИа. 4 - продукт стандартной амплификации. 5 - маркер длин ДНК (ВьрШ гидролизам ДНК плазмиды рОРП' - 1326, 919, 762, 587, 540, 504, 458, 434, 307, 267 п.п.)

Каждую пробу амплифицировали дважды, при этом один из олигонуклеотидов был [32р]-меченным, а другой не меченным. Нуклеотидные последовательности, полученные в результате секвенирования данных ДНК фрагментов байкальской нерпы Р/юса ¡Лтса и тихоокеанского тюленя РЫса 1агдЬа показаны на рисунке 6. Можно видеть, что последовательности митохондриальиых генов цитохрома В байкальской нерпы РИоса пЫпса и тихоокеанского тюленя РЫса 1агдИа на длине 307 пар нуклеотидов различаются между собой в 7-ми точках.' Сравнение полученных первичных структур митохондриального гена цитохрома В Ркоса вШпса и Р/юса ¡агдНа с нуклеотидной последовательностью соответствующего фрагмента митохондриального гена цитохрома В прибрежного тюленя РНоса ьНиПпа выявило 8 и 3 отличия (рис.6) соответственно.

10

20

30

40

50

Р. в!Ыг1са СТТТСОАТСТСТТСГСООААТСТвССТААТССТАСАвАТСТТААСА&ЗСТ

Р. 1агдЬа СТТТ«ЗАТСТСТТСТС<Х^ТСТеССТААТССТОСАвАТСТТААСА«ЗСТ

Р. УЛ ЫИпа СТТТССАТСТСТТСТСО(ЗААТСТеССТААТССТОСАвАТСТТААСАОвСТ

Р. в1Ь1И са Р. 1агдЬа Р. ^БиНва

£0 70 80 90 100

ТАТТССТАСССАТАСАТТАСАССТСАаАСАСААССАСАСССТТСТСАТСА ТаГТССГАСССАТАСАСТАСАССГСАОАСАСААССАСАОССТТСТСАТСА ТАТТССТАСССАТАСАСТАСАССТСА(ЗАСАСААССАСАОССТТСТСАТСА

110

120

130

140

150

Р. в1Ых1с& СТААСССАСАТСТСССОАОАССТАААСТАСООСТОААТСАТССбСТАТСТ

Р. 1агдЬа ОТААСССАСАТСТОССаАаАСОТАААСТЛСОаСТаААТСАТССаТТАТСТ

Р. v¿ tul¿na ОТААСССАСАТТТОСС<ЗА<ЗАССТАААСТАССЗОСТОААТСАТССаТТАТСТ

160

170

180

190

200

Р. в1Ыг!са ТСАСССАААТСЗАССТТССАТАТТСТТСАТСТОССТАТАСАТССАТОТОО

Р. 1агд-Ьа ТСАСССАААТ(ЗЗАССТТССАТАТТТТТСАТСТ0ССТАТАСАТ0САТаТА0

Р.тг1Ьи.11па. ТСАСССАААТОаАаССТССАТАТТТТТСАТСТаССТАТ АСАТОСАТаТАа

210 220 230 240 250

Р. в±Ыг1са САСОА<ЗаАСТаГАТТАССаСТССТАСАСАТТСАСАСАОАСАТСАААСАТС

Р. 1агдЪа ОАСОАСЮАСТвТАТГАС<ЮСТССТАСАСАТТСАСАОА(ЗАСАТОАААСАТС

Р. VI ЫИпа САСОАОаАСТаТАТТАСООСТССТАСАСАТТСАСАСАаАСАТОАААСАТС

*

260

270

280

290

300

p.вiЫrica P.vitullna

GGCATrГATCC'TCTTA1TCkCCG^CATkGCTkCAGCk1TTATGGGCTACG'Г GGCAT'?A'TCC1CTTkTTCACCGTCATkGCTkCAGCk1TCATGGGCrГACGT GGCAT^ATCC'ICTTk1TCkCCGTCATkGCTkCAGCk1TCk.TGGGC'TACGT

Р.в1Ыг1са

Р.1агдЬа

р.х?1ЬиИпа

ССТАССА ССТАССА ССТАССА

*******

Рисунок 6. Секоенироеанпые нуклеотидные последовательности фрагментов митохондриальных генов цитохрома В тюленей РЫса зИппса и РНоса 1агдка и их сравнение между собой и с нуклеотидной последовательностью соответствующего фрагмента митохопдриального гена цитохрома В прибрежного тюленя Р1юса vitulinа. Звездочками обозначены нуклеотиды, совпадающие в сравниваемых последовательностях.

На основании полученных результатов и известной скорости дивергенции мито-хсэдриалыюго генома млекопитающих (от 0,5 до 1,0 % за 1 млн. лет, т.е. от 0,5 до 1,0 замены на 100 н.п. за 1 млн. лет ) мы оценили время дивергенции байкальской нерпы Рксса 51Ыпса от прибрежного, обитающего в Арктике (РИоса ЫШИпа) и тихоокеанского (РНоса 1агд1ш) видов тюленей как около 1,14 млн. лет назад.

Полученный результат соответствует современным представлениям о геологической истории Евразии и Прибайкалья в плейстоцене (1,7 - 0,01 млн. лет до Настоящего времени). Можно предположить, что общим предком арктических и байкальских тюленей была популяция тюленей, населявшая Северный Ледовитый океан в плиоцене. Плейстоценовое похолодание и формирование ледового щита в Арктике могло привес-ТЗ к вытеснению части этой популяции в пресноводные водоемы Евразии. Во время тгяого события тюлени могли проникнуть в Байкал через Лену, которая в интервале от 1 до 2 млн лет до конца плейстоценового похолода1шя вытекала из Байкала Этот путь проникновения нерпы в Байкал представляется более вероятным, чем проникновение

через Енисей п Ангару, так как последняя п в настоящее время, и в плейстоцене изобиловала порогами. К сожалению, изложенный сценарий не может быть подтвержден палеонтологическими данными в связи с тем, что ископаемые кости тюленей на севере Сибири и Западной Европы пока не обнаружены.

ВЫВОДЫ

1. Впервые определена аминокислотная последовательность многлобина байкальской нерпы (Ркоса ¡1Ыг1са). На основе ее сравнения с известными структурами миогло-бинов серого (НаИсНосгиз дгури5) и прибрежного (Ркоса ьНиИпа) тюленей показана их полная идентичность, что говорит об относительно недавней дивергенции вышеуказанных видов от общего предка. Исходя из известной скорости эволюции многлобина, показано, что дивергенция этих видов могла произойти в последние 7 млн. лет.

2. Впервые определена нуклеотидная последовательность трех экзонов гена многлобина байкальской нерпы (Ркоса я*Ыпса). Обнаружена полная ее идентичность соответствующей структуре гена многлобина серого тюленя (НаНсИоегиз дгуриь). С учетом скорости мутаций синонимичных кодонов генов многлобина, было рассчитано время дивергенции вышеуказанных видов тюленей; оно оказалось равным не более 2,2 млн. лет.

3. Впервые определены иуклеотидные последовательности фрагментов митохондриаль-ных генов цитохрома В байкальского (Ркоса эЛтса) и тихоокеанского (Ркоса \argka) тюленей. Последующее сравнение эгих последовательностей позволило оценить время дивергенции этих видов тюленей как около 1,14 млн лет.

4. Таким образом, получены веские доказательства того, что вселение тюленей в озеро Байкал и их репродуктивная изоляция от близкородственных видов произошли сравнительно недавно, во время великих оледенений в плейстоцене.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Маликов Н.Г., Барам Г.И., Шемякин В.В., Миргородская O.A., Назимов И.В. Структура многлобина байкальской верны // Первая Верещагинская Байкальская международная конференция. Иркутск, 1989. С.72-73.

2. Барам Г.И., Грачев М.А., Маликов Н.Г., Назимов II.В., Шемякин В.В. Аминокислотная последовательность многлобина байкальской нерпы /./ Биооргаиическая химия. 1991. Г.17. N 9. С.1166-1171.

3. Маликов Н.Г., Грачев М.А., Зеленин С.М., Морозов И.В., Мертвецов Н.П. Структура фрагментов трех экзонов гена многлобина байкальской нерпы (Plioca sibirica) // Журнал эволюционной биохимии и физиологии.- 1996.-К»5.-С. 656-658.

4. Маликов Н.Г., Грачев М.А., Мертвецов Н.П. Оценка времени дивергенции тюленей Phoca vitulitia, Ркоса largha и Ркоса sibirica от общего предкового вида // Журнал эволюционной биохимии и физиологии,- 1997.-_К°1.

Подписано к печати 22.11.У6. Формат 6(>хК4/16 Печ. л. 1. Тираж 100. Зак. Х9.

Ниисистем. Новосибирск. 58. Русская. ЗУ.