Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая оценка эффективности противотуберкулезной химиотерапии (экспериментальные исследования)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая оценка эффективности противотуберкулезной химиотерапии (экспериментальные исследования)"

На правах рукописи

Смирнова Татьяна Геннадьевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена в ГУ Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Лариса Николаевна Черноусова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Диана Тимофеевна Леви доктор медицинских наук Сергей Сергеевич Белокрысенко Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт вакцин

и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится "_"_2005 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д208.046.01 в ГУ Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Автореферат разослан "_"_2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

С.Ю. Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. До настоящего времени туберкулез остается важной медико-биологической и социальной проблемой. К началу 60-х годов сложилось ошибочное мнение о туберкулезе как об исчезающей болезни. Однако этот прогноз не оправдался. За последние 20 лет в мире не произошло существенного снижения заболеваемости ни в России, ни во всем мире [Шилова М.В., 2001].

Несмотря на успехи в разработке и применении новых противотуберкулезных препаратов и использовании утвержденных схем лечения и регламентированных способов оценки эффективности лечения, в мире увеличиваются случаи рецидивов туберкулеза. Реактивация туберкулезного процесса может быть следствием подавления иммунной системы при развитии иммунодефицитных состояний различной этиологии (ВИЧ-инфекция, прием иммуносупрессоров) или развиться в ходе естественного старения организма. Реактивация туберкулезного процесса может быть следствием неправильного лечения заболевания. В любом случае, в основе реактивации туберкулеза лежит сохранение в организме метаболически неактивных форм микобактерий, которые при определенных условиях могут перейти в активно размножающиеся формы. Выживание возбудителя в макроорганизме, благодаря его широкой изменчивости, и персистенция микобактерий представляет потенциальную опасность развития эндогенной реактивации и клинически выраженного туберкулезного процесса на протяжении всей жизни человека [Дорожкова И.Р., Крупу В.Н., Попеску Т.Т., 1990; Земскова З.С., Дорожкова И.Р., 1984, Дорожкова И.Р., 1974].

Так как выявление некультивируемых форм микобактерий невозможно традиционными бактериологическими методами, для адекватной оценки эффективности противотуберкулезной химиотерапии необходимо использовать более тонкие методы, выявляющие генетический материал МЛиЪггсиЪт. Молекулярно-генетические методы позволяют провести идентификацию, типирование и определение лекарственной чувствительности возбудителя прямо из диагностического материала, таким образом расширить представление о реактивации туберкулеза при химиотерапии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования явилась молекулярно-генетическая оценка эффективности противотуберкулезной химиотерапии при экспериментальном туберкулезе.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. На экспериментальной модели хронической туберкулезной инфекции при внутривенном заражении M.tuberculosis H37Rv в дозе 2,5x104 КОЕ мышей линии BALB/C провести ПЦР на выявление ДНК M.tuberculosis в паренхиматозных органах и крови.

2. Провести бактериологические, цитологические и молекулярно-генетические исследования экспериментального туберкулеза при лечении двумя препаратами (изониазидом и пиразинамидом) и возникновении реактивации туберкулезного процесса.

3. Провести типирование по RFLP 186110 штамма M.tuberculosis H37Rv, использованного для заражения мышей и штаммов микобактерий, полученных на разные сроки лечения и реактивации туберкулезного процесса.

4. Провести сравнение результатов бактериологических, цитологических и молекулярно-генетических исследований, полученных при лечении экспериментального туберкулезного процесса изониазидом и пиразинамидом и при включении в схему химиотерапии рифампицина.

5. Изучить спектр лекарственной чувствительности штаммов M.tuberculosis на все сроки эксперимента бактериологическим и молекулярно-генетическим методами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Показано, что при экспериментальной туберкулезной инфекции ДНК M.tuberculosis выявляется не только в паренхиматозных органах, но и в крови зараженных животных.

В Корнелловской модели реактивированного туберкулеза доказан эндогенный характер реактивации процесса.

Экспериментально доказано, что предотвращение реактивации экспериментального туберкулезного процесса связано не с продолжительностью химиотерапии, а с комбинацией противотуберкулезных препаратов, использующихся для лечения.

Показано, что штаммы микобактерий туберкулеза, полученные в результате эндогенной реактивации, сохраняли чувствительность к

противотуберкулезным препаратам исходного штамма M.tuberculosis H37Rv, использованного для заражения мышей.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. ДНК M.tuberculosis выявляется методом ПЦР в паренхиматозных органах и крови зараженных туберкулезом животных.

2. Выявление ДНК M.tuberculosis в крови и органах зараженных и леченных мышей при отсутствии роста микобактерий на питательных средах может свидетельствовать о сохранении в организме животных популяции микобактерий в некультивируемой форме.

3. Эндогенный характер реактивации туберкулеза может быть доказан идентичностью генотипических характеристик штаммов M.tuberculosis, вызвавших заболевание и полученных после реактивации процесса.

4. Эффективность противотуберкулезной химиотерапии зависит от применяемой схемы,

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

Показано, что выявление ДНК микобактерий при отсутствии роста микобактерий на питательных средах является свидетельством сохранения некультивируемых форм M.tuberculosis в организме хозяина.

Выявление ДНК M.tuberculosis при туберкулезном процессе является фундаментальной основой для оценки эффективности противотуберкулезной химиотерапии с включением результатов ПЦР.

Модель эндогенной реактивации туберкулеза может быть использована для более полного изучения персистенции возбудителя туберкулеза в организме хозяина.

Показано, что методом генотипирования по RFLP IS6110 можно доказать характер реактивации туберкулезного процесса (эндогенный или экзогенный).

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ.

Модель эндогенно-реактивированной туберкулезной инфекции может быть использована для поиска новых противотуберкулезных препаратов, воздействие которых направлено на некультивируемые формы микобактерий.

Материалы диссертации используются при чтении цикла лекций аспирантам и ординаторам ГУ ЦНИИТ РАМН, а также на курсах

усовершенствования врачей-лаборантов бактериологических лабораторий из различных регионов России.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на: 4-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 2002), на научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" в рамках международной конференции "Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 2002), на конгрессе Европейского общества микробиологов в Дубровниках (2002), на заседании секции микробиологии и иммунологии туберкулеза Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002, 2003), на конференции молодых ученых (Москва, 2001, 2003).

Работа апробирована на совместном заседании отделов микробиологии и иммунологии ГУ ЦНИИТ РАМН (06.04.2004 г.)

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает ссылки на 20 отечественных авторов и 139 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 200 мышах инбредной линии BALB/C, массой 21-24 грамма, в возрасте 2-4 месяцев.

Для заражения мышей использовали вирулентный штамм М. tuberculosis H37Rv (Pasteur). Для определения концентрации микобактерий, выращенных на бульоне 7Н9 Dubos (Difco), серию 5-кратных разведений суспензии, профильтрованной через 5 микронный фильтр (Millipore) наносили по 20 мкл на чашки Петри с агаром 7Н10 Dubos (Difco). Через 3-4 суток культивирования производили подсчет микроколоний. Концентрация микобактерий в суспензии выражалась числом колониеобразующих единиц микобактерий на мл (КОЕ/мл).

Для заражения мышам в латеральную хвостовую вену вводили суспензию M.tuberculosis H37Rv в концентрации 5х104 КОЕ/мл в 0,5 мл физиологического раствора.

Через 20 дней, 2, 4, 6 и 8 месяцев после инфицирования животных подвергали эвтаназии, получали легкие, селезенку и кровь. Органы гомогенизировали в фарфоровых ступках в 5 мл 6% серной кислоты для предотвращения контаминации неспецифической флорой. Осадок гомогенатов отмывали физиологическим раствором 2 раза, после чего производили посев на плотную питательную среду Левенштейна-Йенсена. Рост микобактерий туберкулеза детектировали течение 10 недель. Для определения бактериальной нагрузки на орган подсчитывали число колоний на среде через 18 дней инкубации при 37°С. Затем пересчитывали количество колоний микобактерий на целый орган.

Определение лекарственной устойчивости штаммов M.tuberculosis H37Rv проводили методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена (рифампицин - 40мкг/мл, пиразинамид - 200 мкг/мл, изониазид -1 мкг/мл, стрептомицин -10 мкг/мл, этамбутол - 2 мкг/мл).

Для выявления кислотоустойчивых бактерий в органах животных и оценки клеточных реакций готовили мазки-отпечатки органов. Окраску производили по Цилю-Нильсену и по Романовскому-Гимзе. Результаты бактериоскопического исследования учитывались путем подсчета кислотоустойчивых палочек в 100 полях зрения и подсчитывались в условных единицах (бактериоскопический показатель, табл. 1) [Першин Г.Н., 1971; Приказ МЗ РФ № 109,2003].

Таблица 1.

Расчет бактериоскопического показателя

Количество кислотоустойчивых палочек в Бактериоскопический

100 полях зрения показатель, ед.

до 10 1

10-50 2

50-100 3

более 100 4

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ Excel и Biostat.

ДНК микобактерий туберкулеза выявляли методом ПЦР. Выделение ДНК из образцов проводилась по методу, предложенному Boom R. et al., 1990. Разрушение клеток производили с помощью гуанидинизотиоционата. ДНК сорбировали на диатомовую землю, отмывку от белков производили раствором этанола, элюирование ДНК с сорбента - ТЕ-буфером. Полученные образцы ДНК использовали для амплификации.

Амплификацию выделенных образцов ДНК проводили с помощью коммерческого набора "Ампли-Сенс" (НИИ Эпидемиологии МЗ и СР РФ, Россия), содержащего специфические праймеры к вставочной последовательности IS6110, на термоциклере "Терцик" (ДНК-технология, Россия). В результате амплификации получали продукт размером 390 пар оснований.

Молекулярно-генетическое типирование штаммов M.tuberculosis H37Rv проводили по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов, содержащих инсерционную последовательность 6110 (RFLP IS6110) с использованием стандартного протокола Van Embden, 1993.

Для этого из бактериальной массы выделяли ДНК M.tuberculosis методом, позволяющим получить длинные, неповрежденные двунитевые молекулы ДНК в растворе ТЕ-буфера. Полученную ДНК подвергали рестрикции с использованием фермента PvuII. Рестрикционные фрагменты разгоняли в 1% агарозном геле (40V, 18 часов), переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с зондом, содержащим последовательность ДНК, комплементарную к правому плечу IS6110. Зонд предварительно метили флуоресцентной меткой. Гибридизационный сигнал визуализировали путем экспозиции мембраны с рентгеновской пленкой. Результаты учитывали по числу и взаимному расположению рестрикционных фрагментов, содержащих IS6110. В качестве стандарта молекулярных масс использовали искусственно синтезированные фрагменты ДНК определенной длины, содержащие последовательность нуклеотидов, комплементарную правому плечу IS6110 (Jack-standard, PHRI, Нью-Йорк, США).

Установление чувствительности штаммов M.tuberculosis к противотуберкулезным препаратам по выявлению точечных мутаций в генах гроВ (отвечающих за устойчивость к рифампицину), katG, inhA, ahpc (отвечающих за устойчивость M/tuberculosis к изониазиду) проводили с помощью микрочиповой технологии (Институт молекулярной биологии им.

ВА Энгельгардта РАН). Для этого ДНК M.tuberculosis, выделенную из культур или гомогенатов органов мышей, на первой стадии амплифицировали с праймерами, комплементарными участкам ДНК, ограничивающим области генов rpoB, katG, inhA, ahpc, в которых встречаются мутации. Продукты первой амплификации являлись матрицами для второй амплификации, в которой нарабатывались одноцепочечные фрагменты ДНК. Реакция происходила в избытке одного из праймеров, который был мечен флюорофором Texas Red. После гибридизации с олигонуклеотидными зондами и отмывки биочипа проводили регистрацию интенсивности флуоресцентного сигнала в чипоскопе. Обработку результатов вели с использованием пакета программ «Imageware» (Институт молекулярной биологии им. ВА Энгельгардта).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Таблица 2.

Группы животных I (зараженные не леченые мыши) II (зараженные, леченые двумя препаратами мьшга) ш (зараженные, леченые тремя препаратами мьшга) IV (икгакгные мыши)

сроки после заражения сроки лечения сроки лечения

а 20 дней после заражения - - иишстные мыши

б 80 дней после заражения 2 месяца (60 дней) лечения 2 месяца (60 дней) леченш интактные мыши

в 140 дней после заражения 4 месяца (120 дней) лечения 4 месяца (120 дней) лечения интактные мыши

г 200 дней после заражения 6 месяцев (180 дней) лечения 6 месяцев (180 дней) лечения интактные мыши

Д -- 4 мес. лечения (120 дней) + 2 месяца (60 дней) без лечения 4 мес. лечения (120 дней) + 2 месяца (60 дней) без лечения ---

е 260 дней после заражения 6 мес. лечения (180 дней) + 2 месяца (60 дней) без лечения 6 мес. лечения (180 дней) + 2 месяца (60 дней) без лечения интактные мыши

В табл. 2 приведена общая схема эксперимента и группы обследованных животных. В каждую группу вошло по 10 мышей. На 21-й день после заражения у мышей из групп II и III была начата противотуберкулезная химиотерапия перорально путем введения препаратов через зонд в пищевод. Через 2 месяца (группы Пб, Шб), 4 месяца (группа Пв, Шв) и 6 месяцев (группа Пг, Шг) после начала лечения проводили исследование туберкулезного процесса. Для получения эндогенной реактивации туберкулеза после 4-х и 6-тимесячного лечения у животных

групп Цд и Щд после 4-х месяцев химиотерапии, а у животных групп Ile и Ше после 6-ти месяцев было прекращено лечение и после этого через 2 месяца животные были обследованы.

В качестве контроля на каждом сроке были исследованы зараженные, не леченые мыши (I группа) и интактные животные (IV группа).

Результаты обследования мышей I группы показали развитие хронического туберкулезного процесса, которое характеризовалось при естественном течении туберкулезного процесса (¡а, КДв, fr, Ie), показали, что высеваемость M.tuberculosis из легкого и селезенки различна. Бактериальная нагрузка на легкое на 21 день после заражения была в 10 раз больше вводимой дозы и высеваемости из селезенки и порядок ее не снижался с течением времени, что говорило о более высокой тропности возбудителя к легочной ткани. Высеваемость M. tuberculosis из селезенки достоверно снижалась (р<0,05) с течением туберкулезного процесса и к 200 дню после заражения бактериальная нагрузка на селезенку стабилизировалась и составила в группах Ь* (200 день после заражения) и к (260 день после заражения) 3,37х103±0,58х103и 3,02х103±0,90х103КОЕ/орган, что свидетельствовало о сдерживании инфекции за счет защитных сил организма (рис. 1, рис.2).

Сравнение результатов культуральных исследований органов зараженных M.tuberculosis H37Rv мышей с естественным течением туберкулезного процесса (Ь, I6, Ь, fr, Ie) и зараженных и леченых двумя препаратами (изониазидом и пиразинамидом) мышей (Пб, Пв, Пг, Цд и Не) показало, что химиотерапия двумя препаратами оказала влияние на высеваемость M.tuberculosis из органов уже ко второму месяцу лечения (рис.1А,Б, рис. 2.А,Б). Среднее число колониеобразующих единиц M.tuberculosis при посеве гомогенатов легких у мышей группы Пб было 8,17х103±0,27х103, при посеве гомогенатов селезенки 7,07х102±0,37хЮ2, что достоверно ниже, чем высеваемость из легких и селезенки зараженных M.tuberculosis и не леченых мышей (группа I6) на тот же срок эксперимента (6,43х105±0,78х103 и 2,58х104±0,64х104 соответственно). Химиотерапия изониазидом и пиразинамидом в течение 4-х месяцев привела к стерилизации

органов мышей группы IIb: посевы гомогенатов органов легких и селезенки стали отрицательными. В группах мышей 11г, леченых двумя препаратами в течение 6-ти месяцев, роста культуры M.tuberculosis H37Rv на среде Левенштейна-Йенсена также выявлено не было (рис.1А,Б, рис.2А,Б). Однако, прекращение химиотерапии на 2 месяца как после 4-х месячного курса химиотерапии, так и после 6-ти месячного, привело к реактивации туберкулезного процесса: гомогенаты легких и селезенки в группах мышей 11д и 11е дали рост M.tuberculosis H37Rv на среде Левенштейна-Йенсена. Бактериальная нагрузка на легкие у мышей групп 11д и 11е составила и соответственно (р>0,05), т.е.

высеваемость MJuberculosis из легких мышей после 2-хмесячного перерыва в лечении не зависела от сроков проведения химиотерапии - 4 или 6 месяцев (рис. 1А,Б, рис. 2А,Б). Высеваемость MJuberculosis из селезенки в группах Пд и Пе была различна. Число КОЕ MJuberculosis в селезенке в группе 11д было достоверно выше (р<0,05), чем КОЕ MJuberculosis в группе Пе(4,13х10±0,21x10).

В отличие от результатов посева органов мышей, леченых двумя препаратами (II группа), посевы на питательные среды гомогенатов органов мышей, зараженных и леченых тремя препаратами (III группа), показали, что терапия рифампицином, изониазидом и пиразинамидом оказалась эффективной уже ко 2-му месяцу лечения. Рост культур M.tuberculosis не был получен ни из легких, ни из селезенки зараженных, леченых мышей на все сроки исследования (группы IIIS, iiib, 111г). У мышей, оставленных на 2 месяца без лечения как после 4-х, так и после 6-тимесячной химиотерапии тремя препаратами (Щд и 111е) посевы органов (легких и селезенки) также остались отрицательными (рис. 1А,Б, рис. 2А,Б).

Рис 1. Сравнение КОЕ в легких зараженных, не леченых мышей (группы I), зараженных, леченых двумя препаратами (группы II) и зараженных, леченых тремя препаратами (группы III) на разные сроки эксперимента А Представлены группы мышей, исследованные через 20 дней, 80 (2 мес леч), 140 (4 мес леч) и 200 (4 мес леч + 2 мес без леч) Б Представлены группы мышей, исследованные через 20 дней, 80 (2 мес леч), 140 (4 мес леч), 200 (б мес леч) и 260 (6 мес. леч + 2 мес без леч)

Рис. 2. Сравнение результатов подсчета КОЕ в селезенках зараженных, не леченых мышей (группы I), зараженных, леченых двумя препаратами (группы II) и зараженных, леченых тремя препаратами (группы III) на разные сроки эксперимента.

А. Представлены группы мышей, исследованные через 20 дней, 80 (2 мес. леч), 140 (4 мес. леч.) и 200 (4 мес. леч + 2 мес. без леч.) Б. Представлены группы мышей, исследованные через 20 дней, 80 (2 мес. леч.), 140 (4 мес. леч.), 200 (6 мес. леч.) и 260 (6 мес. леч + 2 мес. без леч.)

Результаты культуральных исследований групп мышей, полученные на фоне химиотерапии двумя, тремя противотуберкулезными препаратами и без химиотерапии не противоречили результатам бактериоскопических исследований мазков-отпечатков паренхиматозных органов. (рис.3.А,Б; рис.4.А,Б).

Анализируя данные бактериоскопических исследований мазков-отпечатков легких зараженных M.tuberculosis И37Ку мышей (группа I) было отмечено, что достоверного снижения бактериоскопического параметра не произошло. В группе 1а мышей, исследованных на 21-й день после заражения, бактериоскопический параметр по группе составил 2,70+0,82, а через 260 дней после заражения (группа 1е) 2,11+0,85. Исследование мазков-отпечатков селезенки зараженных M.tuberculosis И37Ку мышей выявило достоверное снижение бактериоскопического параметра в группах мышей, начиная с 200-го дня после инфицирования. Бактерископический параметр в мазках-отпечатках селезенки мышей группы 1а составил 2,60+0,52, а в группах мышей 1г и 1е - 1,56+0,73 и 1,44+0,53 соответственно (рис. 3А,Б, рис.4 А,Б.)

Сравнение результатов бактериоскопических исследований контрольных групп зараженных животных и животных, получавших химиотерапию двумя препаратами (изониазидом и пиразинамидом) показало, что через 2 месяца химиотерапии (11б), излечения мышей не произошло. Во всех мазках-отпечатках легкого и селезенки были найдены типичные кислотоустойчивые палочки (бактериоскопический параметр 2.60+0.83; 2.51+0.53 соответственно). Количество микобактерий в этой группе достоверно не отличалось от зараженных не леченных групп животных, (рис. 3.А,Б; рис.4.А,Б) Через 4 и 6 месяцев лечения у зараженных животных (группы 11в и 11г) число микобактерий достоверно снижалось и среднее значение балла по группе 11г к 6-му месяцу лечения составило 0.80+0.42 и 0.70+0.82 в легких и селезенке соответственно, (рис. 3ДБ; рис. 4ДБ)

В группах животных, оставленных на 2 месяца без лечения, как после 4-х (Ид), так и после 6-тимесячного лечения (Не), бактериоскопическое исследование мазков-отпечатков показало появление в легких и селезенке типичных палочек микобактерий туберкулеза. Причем средний балл в мазках-отпечатках легких как в группе Ид, так и в группе Не (3.00+0.47 и 2.90±0.32 соответственно) достоверно увеличился до показателя в контрольных не леченных группах (рис.3 .А,Б). В отличие от этого, бактериоскопия селезенки мышей этих же групп не выявила достоверного увеличения числа микобактерий, однако различие между группами Ид и Не было достоверным (рис.4. А,Б).

Сравнительный анализ результатов бактериоскопических исследований в группах III зараженных M.tuberculosis H37Rv мышей показал, что, в отличие от мышей, получавших два препарата, лечение тремя противотуберкулезными препаратами (рифампицином, изониазидом и пиразинамидом) приводило к исчезновению типичных палочек в мазках-отпечатках органов уже ко второму месяцу лечения (группы Шб). После 2-хмесячного перерыва в лечении как после 4-х, так и после 6-тимесячного курса лечения не было выявлено типичных форм M.tuberculosis. (рис.3.А,Б; рис.4.А,Б)

Рис 3 Результат бактериоскопических исследований мазков-отпечатков легких зараженных, не леченых мышей (группы I), зараженных, леченых двумя препаратами (группы II) и зараженных, леченых тремя препаратами (группы III) на разные сроки эксперимента

А. Представлены группы мышей, исследованные через 20 дней, 80 (2 мес. леч), 140 (4 мес. леч) и 200 (4 мес леч + 2 мес. без леч) Б Представлены группы мышей, исследованные через 20 дней, 80 (2 мес леч), 140 (4 мес. леч), 200 (6 мес леч ) и 260 (6 мес. леч + 2 мес. без леч)

Рис 4 Результат бактериоскопических исследований мазков-отпечатков селезенок зараженных, не леченых мышей (группы I), зараженных, леченых двумя препаратами (группы II) и зараженных, леченых тремя препаратами (группы III) на разные сроки эксперимента

А Представлены группы мышей, исследованные через 20 дней, 80 (2 мес леч), 140 (4 мес леч) и 200 (4 мес леч + 2 мес без леч) Б Представлены группы мышей, исследованные через 20 дней, 80 (2 мес леч), 140 (4 мес леч), 200 (6 мес леч) и 260 (6 мес леч + 2 мес без леч)

Таким образом, динамическое наблюдение показало, что при лечении двумя препаратами мышей, зараженных M.tuberculosis через 4 месяца наблюдалось отсутствие роста микобактерий из органов при посеве паренхиматозных органов на плотные питательные среды у всех животных, что может говорить об исчезновении культивируемых форм микобактерий. При отмене химиотерапии на 2 месяца возобновлялся рост микобактерий при посеве паренхиматозных органов на плотные питательные среды, что свидетельствовало о сохранении в организме хозяина некультивируемых форм микобактерий. Включение в схему лечения рифампицина приводило к прекращению роста микобактерий уже через 2 месяца лечения. После отмены химиотерапии тремя препаратами на 2 месяца рост культуры из паренхиматозных органов мышей не возобновился.

Анализ результатов цитологических исследований позволил подтвердить, что использованная модель заражения мышей микобактериями туберкулеза соответствовало хроническому течению туберкулезного процесса, оценить эффективность химиотерапии по клеточным реакциям и сделать некоторые дополнительные выводы.

Результаты цитологических исследований мазков-отпечатков легких и селезенки зараженных M.tuberculosis H37Rv мышей леченых групп (П и III) показали некоторые различия с результатами цитологических исследований мазков-отпечатков паренхиматозных органов зараженных мышей контрольных не леченых групп (I).

В мазках-отпечатках как легких, так и селезенки мышей, зараженных M.tuberculosis H37Rv (из групп I) на 20 день после заражения (¡а) была выявлена яркая картина воспаления: многочисленные нейтрофилы, макрофаги, выраженная лимфоидная реакция, большие скопления эпителиоидных клеток, биосинтезирующих макрофагов. Снижение числа лимфоцитов, отсутствие нейтрофилов и появление коллагеновых волокон говорило о некоторой стабилизации процесса заболевания к 200-му дню эксперимента в органах зараженных мышей. M.tuberculosis H37Rv признаки туберкулезного воспаления продолжали наблюдаться, усилилась дистрофия клеток. Отличительной чертой в цитологической картине мазков-отпечатков

паренхиматозных органов мышей этой группы (1е) являлось большое число коллагеновых волокон, свидетельствующих о процессах заживления через 260 дней после заражения.

В группах зараженных И.ШЬггсиШз И37Яу мышей (11б, 11в, 11г), получавших курс химиотерапии двумя препаратами (изониазидом и пиразинамидом) наблюдалась тенденция к затуханию инфекционного процесса уже через 4 месяца лечения (Ив). Для мазков-отпечатков паренхиматозных органов мышей этой группы было характерно уменьшение числа лимфоцитов, биосинтезирующие макрофаги и эпителиоидные клетки встречались только единичные. После 6 месяцев проведения противотуберкулезной химиотерапии двумя препаратами у зараженных мышей группы Пг (в отличие от зараженных, нелеченых мышей (1г), исследованных на тот же срок) признаки туберкулезного воспаления наблюдались редко. Во всех органах наблюдались дистрофические изменения клеток, гораздо более сильные, чем у мышей зараженных и не леченых группы 1г, что связано, по-видимому, с токсическим действием противотуберкулезных препаратов.

Несмотря на то, что полученные результаты культуральных исследований позволяли сделать вывод об успехе проводимой противотуберкулезной химиотерапии двумя препаратами, цитологическая картина, выявленная у мышей, оставленных на 2 месяца без лечения как после 4-х (Ид), так после 6-тимесячного лечения (11е), демонстрировала специфические изменения в паренхиматозных органах. Эти изменения были гораздо сильнее выражены, чем у зараженных и не леченых мышей, подвергнутых эвтаназии на тот же срок (1г и 1е). В легких отмечалось значительно увеличение числа клеток воспаления - лимфоцитов, нейтрофилов, макрофагов (в том числе и биосинтезирующих, которых не было у мышей не леченого контроля), скопления эпителиоидных клеток, в селезенке наблюдалась инфильтрация нейтрофилами, эпителиоидные клетки, гипоплазия лимфоидных элементов.

При цитологическом исследовании зараженных M.tuЬerculosis И37Яу мышей, получавших химиотерапию тремя препаратами стабилизация

туберкулезного процесса наблюдалась уже после 2 месяцев лечения (группа Шб). К 4 месяцам лечения в органах мышей группы 11в были отмечены фиброзные процессы, свидетельствующие о заживлении. К 6 месяцу проведения химиотерапии в легких сохранялись единичные лимфоциты и фагоцитирующие макрофаги, биосинтезирующие макрофаги отсутствовали, эпителиоидные клетки встречались редко. Отмечалось значительное число коллагеновых волокон. В селезенке находили гипоплазию лимфоидных элементов, признаки фиброзирования, редкие эпителиоидные клетки, нейтрофилы и макрофаги отсутствовали. На основании полученных данных можно сделать вывод о эффективности проводимой 6-тимесячной химиотерапии рифампицином, изониазидом и пиразинамидом. Необходимо отметить дистрофию клеток, появившуюся у мышей, леченых противотуберкулезными препаратами.

В группе мышей, оставленных на 2 месяца без лечения после 4-хмесячного курса химиотерапии (Шд) и 6-тимесячного курса химиотерапии тремя препаратами (Ше) цитологическая картина отличалась от картины, полученной сразу после окончания 4-хмесячного лечения. В легких мышей групп Шд и Ше появлялись единичные биосинтезирующие макрофаги, эпителиоидные клетки, что могло свидетельствовать об усилении специфических клеточных реакций паренхиматозных органов.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что, несмотря на отрицательные результаты культуральных и бактериоскопических исследований, клеточные реакции паренхиматозных органов мышей, леченых двумя препаратами в течение 4-х и 6-ти месяцев свидетельствовали о сохранении популяции микобактерий в некультивируемой форме. Появление роста M.tuberculosis на питательных средах и выявление кислотоустойчивых палочек в мазках-отпечатках органов мышей после 2-хмесячного перерыва в лечении подтвердило данные цитологии. Несмотря на то, что при лечении мышей группы III тремя противотуберкулезными препаратами (с включением рифампицина) роста культур не было выявлено и бактериоскопия продолжала оставаться отрицательной после 2-хмесячного

перерыва в лечении, цитологическая картина указывала на сохранение туберкулезного воспаления в паренхиматозных органах.

Данные цитологии согласовывались с результатами молекулярно-генетических исследований. ПЦР показала, что при естественном течении туберкулезного процесса ДНК Мtuberculosis выявлялась в крови (так же, как и в селезенке и легких) на всех сроках исследования у всех мышей (группы 1а, 1б, 1в, 1г и 1е). Проведение химиотерапии двумя препаратами (изониазидом и пиразинамидом) не повлияло на число положительных ПЦР у мышей групп II6, 11в, 11г, 11д и 11е - как и в группах зараженных, не леченых мышей, ДНК М tuberculosis также выявлялась у всех животных на все сроки эксперимента.

Результаты ПЦР с кровью и паренхиматозными органами зараженных М.tuberculosis H37Rv мышей, леченых тремя препаратами существенно отличались от результатов ПЦР групп мышей, описанных выше. Уже ко второму месяцу лечения ДНК М.tuberculosis выявлялась меньше, чем у половины мышей группы Шб (хотя в легких и селезенке у всех мышей этой группы ПЦР продолжала оставаться положительной). После 4-х месяцев лечения число мышей с положительной ПЦР в органах (111в) существенно снизилось и продолжало снижаться до 6-го месяца лечения тремя препаратами. После 2-хмесячного перерыва в лечении ДНК М.tuberculosis продолжала выявляться в легких и селезенке мышей групп Щд и 111е В селезенке число положительных ПЦР было достоверно выше, чем в легких. В крови ДНК М.tuberculosis перестала выявляться у всех мышей к 6-му месяцу лечения (111г) и не была обнаружена у мышей группы 111е, оставленных без лечения на 2 месяца после 6-тимесячного курса противотуберкулезной химиотерапии.

Таким образом, результаты ПЦР показали, что у всех мышей, леченых двумя препаратами, через 4 и 6 месяцев лечения, ДНК М.tuberculosis продолжала выявляться в крови и паренхиматозных органах. Динамическое наблюдение за группами мышей III, показало, что ДНК М.tuberculosis выявляли в органах и крови мышей и при лечении тремя препаратами. Эти данные свидетельствовали о сохранении популяции М.tuberculosis в

организме мышей как при лечении двумя, так и при лечении тремя препаратами, несмотря на отрицательные результаты культуральных и бактериоскопических исследований. Сохранение популяции микобактерий при лечении двумя препаратами было подтверждено реактивацией туберкулезного процесса через 2 месяца после отмены химиотерапии. Несмотря на то, что при лечении тремя препаратами реактивации туберкулезного процесса не произошло, нельзя исключить сохранение популяции некультивируемых форм M.tuberculosis, т.к. у мышей групп III была выявлена ДНК M. tuberculosis.

Ни в одной известной работе, где исследователи получали экспериментальную реактивацию туберкулезного процесса, не был доказан эндогенный характер реактивации. Также интересно было проверить, не изменился ли профиль гибридизации IS6110 у штаммов M.tuberculosis H37Rv Pasteur, т.е., не произошло ли каких-либо крупных изменений в геноме M.tuberculosis за длительное время персистирования микобактериальной популяции в организме хозяина при естественном течении инфекции или под влиянием химиотерапии. Результаты RFLP IS6110 показали идентичность профилей гибридизации рестрикционных фрагментов, содержащих вставочную последовательность 6110, исходного штамма M.tuberculosis H37Rv Pasteur и штаммов, полученных в результате реактивации (рис.5). Эти данные подтвердили эндогенный характер реактивации. Идентичность профилей гибридизации IS6110 штамма M.tuberculosis H37Rv Pasteur, использованного для заражения животных и штаммов микобактерий, полученных на разные сроки естественного течения туберкулезного процесса и через 2 месяца лечения двумя препаратами показала, что за время эксперимента (260 дней) и под воздействием противотуберкулезной химиотерапии изменений в геноме M.tuberculosis H37Rv Pasteur не произошло.

Рис. 5. Профили гибридизации штаммов M.tuberculosis H37RvPasteur

1 M.tuberculosis H37Rv, использованный для заражения мышей 6 M.tuberculosis H37Rv, выделенный у мышей группы 1е

1 M.tuberculosis H37Rv, выделенный у мышей группы 1а 1 M.tuberculosis H37Rv, выделенный у мышей группы 116

i M.tuberculosis H37K.V, выделенный у мышей группы 16 8 M.tuberculosis H37Rv, выделенный из легкого у мышей группы Ид

4 M.tuberculosis H37Rv, выделенный у мышей группы 1в 9 M.tuberculosis H37R.V, вьщеленный из селезенки у мышей группы Ид

S M.tuberculosis H37Rv, выделенный у мышей группы 1г 10 M.tuberculosis H37Rv, вьщеленный из легкого у мышей группы Пе

itd Стандарт молекулярных масс (Jack-standard) 11 M.tuberculosis H37Rv, выделенный из селезенки мышей группы Пе

Спектр лекарственной чувствительности исходного штамма M.tuberculosis H37Rv, использованного для заражения и штаммов, давших рост на питательных средах на разные сроки эксперимента был проанализирован методом абсолютных концентраций. Кроме того, лекарственную чувствительность к рифампицину и изониазиду определяли на микрочипах. Для этого использовали ДНК, полученную из выделенных из паренхиматозных органов культур M.tuberculosis, а в случае отсутствия культур M.tuberculosis анализировали ДНК, выделенную из гомогенатов органов и крови животных.

Исследования показали, что штамм M.tuberculosis H37Rv, несмотря на проведенную химиотерапию, был чувствителен к противотуберкулезным препаратам, спектр лекарственной чувствительности не менялся на протяжении всего эксперимента, независимо от сроков и схемы лечения. На биочипах не было выявлено присутствие субпопуляции M.tuberculosis H37Rv, устойчивой к рифампицину и/или изониазиду в штамме, использовавшемся для заражения, а также в популяции M.tuberculosis на все сроки лечения (2, 4 или 6 месяцев). Культуры штаммов M.tuberculosis, полученных в результате реактивации туберкулезного процесса при лечении двумя препаратами и ДНК Mtuberculosis, выделенной из органов и крови мышей, оставленных на 2 месяца без лечения после 4-х и 6-тимесячного курса химиотерапии тремя препаратами также были подвергнуты анализу чувствительности к противотуберкулезным препаратам. Результаты показали, что культуры микобактерий, полученные в результате реактивации при лечении двумя препаратами были чувствительны к рифампицину, изониазиду, пиразинамиду, стрептомицину и этамбутолу по данным метода абсолютных концентраций и не несли мутаций в исследуемых генах независимо от срока лечения (4 или 6 месяцев). ДНК M.tuberculosis, выделенная от мышей групп III, оставленных без лечения после 4-х и 6-ти месячной химиотерапии тремя препаратами также не имела мутаций в генах rpoB, katG, inhA и ahpC независимо от того, из легкого, селезенки или крови зараженного животного она была выделена.

ВЫВОДЫ.

1. При внутривенном заражении M.tuberculosis H37R.V в дозе 2,5x104 КОЕ мышей линии BALB/C ДНК М. tuberculosis выявлялась в паренхиматозных органах и крови мышей на все сроки в течение 260 дней эксперимента.

2. При лечении неполной схемой химиотерапии (изониазидом и пиразинамидом) создаются условия для появления некультивируемых форм М.tuberculosis, так как при отрицательных результатах посевов паренхиматозных органов были выявлены ДНК М. tuberculosis в паренхиматозных органах и крови, специфические клеточные реакции туберкулезного воспаления и была получена реактивация туберкулезного процесса.

3. Реактивация туберкулезного процесса носила эндогенный характер, что было доказано идентичностью результатов типирования по RFLP IS6110 культуры штамма M.tuberculosis H37Rv, использованного для заражения мышей и культур микобактерий, полученных в процессе лечения изониазидом и пиразинамидом и реактивации.

4. Использование полной схемы противотуберкулезной химиотерапии (рифампицин, изониазид, пиразинамид) предотвратило реактивацию туберкулезного процесса по данным культуральных и бактериоскопических исследований, однако, выявление ДНК M.tuberculosis в органах и крови и специфическая цитологическая картина мазков-отпечатков паренхиматозных органов указывала на сохранение в организме хозяина некультивируемых форм M.tuberculosis.

5. Возникновение реактивации туберкулезного процесса зависело от схемы лечения (двумя или тремя препаратами с рифампицином) и не было связано с длительностью химиотерапии (4 или 6 месяцев).

6. Культуры М. tuberculosis H37Rv, полученные в результате реактивации туберкулезного процесса, сохраняли чувствительность к основным противотуберкулезным препаратам и не имели мутаций в генах rpoB, katG, inhA и ahpC. ДНК М. tuberculosis H37Rv, выделенная из органов и крови животных, леченных тремя препаратами, также не несла мутаций в генах rpoB, katG, inhA и ahpC.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИИССЕРТАЦИИ.

1. Смирнова Т.Г., Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н., Николаева Г.М. Характеристика экспериментальной модели эдогенно-реактивированного туберкулеза: определение ДНК микобактерий в процессе химиотерапии. // Пробл. туб., - 2002. - №12. - С.52-56.

2. Смирнова Т.Г., Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н., Николаева Г.М. Экспериментальное свидетельство сохранения персистенции МБТ у зараженных M.tuberculosis H37Rv мышей при лечении тремя препаратами первого ряда (рифампицином, изониазидом, пиразинамидом). // Пробл. Туб. -2004.-№3.-с. 32-37

3. Смирнова Т.Г., Мартынова Л.П., Савинкова С.Н., Черноусова Л.Н. Молекулярный мониторинг эффективности химиотерапии туберкулеза (экспериментальные исследования) // Сб. тез. 1 Нац. Конгресса «Клиническая иммунология, аллергология и иммунореабилитация». -1999. - с. 128

4. Смирнова Т.Г. Выявление ДНК микобактерий в крови зараженных M.tuberculosis H37Rv инбредных мышей при экспериментальной хиимотерапии. // Сб. мат. НПК молодых ученых. - 2001. - с.214-216

5. Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Катулина Н.И., Шудрова М.А. Генотипирование микобактерий, выделенных от больных туберкулезом из пенитенциарного учреждения // Пробл. туб. - 2001. - № 7. -с. 60-62

6. Smimova T.G. Detection of M.tuberculosis DNA in parenchymatous organs of infected mice in prolonged antituberculosis chemotherapy with three first line drugs // 3-rd Congr. ofEuropean region IUATLD. - 2004.- p. 76

7. Tchernousova L, Smirnova Т., Andreevskaya S., Nikolaeva G. Persistent M. tuberculosis infection: experimental model of endogenously re-activated ТВ // Eur. Resp. J. - 2002. - Vol. 20. - p.582

Список использованных сокращений. ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота КОЕ - колониеобразующая единица ПЦР - полимеразная цепная реакция IS - вставочная последовательность

RFLP - типирование по полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

Принято к исполнению 26/12/2004 Исполнено 26/12/2004

Заказ № 530 Тираж 70 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru

t H

V /

У

14

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Смирнова, Татьяна Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ «Экспериментальные модели туберкулезной инфекции».

1.1. Экспериментальные животные в моделях туберкулезной инфекции.

1.2. Дозы M.tuberculosis, использующиеся для создания моделей и способы введения патогена.

1.3. Экспериментальные модели эндогенно-реактивированной туберкулезной инфекции.

1.4. Экспериментальные модели туберкулезной инфекции для тестирования новых противотуберкулезных препаратов и разработки курсов лечения.

1.5. Молекулярно-генетические методы типирования M.tuberculosis, использованные в работе.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Схема эксперимента.

3.2. Характеристика течения хронического туберкулезного процесса при заражении мышей линии BALB/C штаммом M.tuberculosis H37Rv в дозе 2,5x104 КОЕ/мышь.

3.3. Течение экспериментального туберкулеза у зараженных M.tuberculosis H37Rv в дозе 2,5x10 КОЕ мышеи при лечении двумя препаратами (изониазидом и пиразинамидом).

3.4. Характеристика штаммов M.tuberculosis H37Rv, полученных в модели эндогенно-реактивированного туберкулеза.

3.4.1. Молекулярно-генетическое типирование штаммов M.tuberculosis H37Rv.

3.4.2. Определение чувствительности штаммов M.tuberculosis H37Rv к противотуберкулезным препаратам.

3.5. Течение экспериментального туберкулеза у зараженных M.tuberculosis H37Rv в дозе 2,5x104 КОЕ мышеи при лечении тремя препаратами (рифампицином, изониазидом и пиразинамидом).g

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Глава 5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая оценка эффективности противотуберкулезной химиотерапии (экспериментальные исследования)"

Актуальность проблемы

До настоящего времени туберкулез остается важной медико-биологической и социальной проблемой. К началу 60-х годов сложилось ошибочное мнение о туберкулезе как об исчезающей болезни. Однако этот прогноз не оправдался. За последние 20 лет в мире не произошло существенного снижения заболеваемости ни в России, ни во всем мире [20, 143].

В 1992 году по данным ВОЗ в мире было зарегистрировано более 8 млн. новых случаев заболевания туберкулезом [16, 75]. В 1993 году Всемирная организация здравоохранения провозгласила "возрождение" туберкулеза глобальным, чрезвычайным положением, поскольку если не будет преодолено пренебрежение самой проблемой, то от него погибнет в ближайшее десятилетие более 30 миллионов человек, а по некоторым данным, до 90 млн. человек [159]. Основной задачей ученых и врачей всего мира на данный момент является разработка новых подходов к диагностике и лечению туберкулеза.

Эффективность противотуберкулезной химиотерапии оценивается по клинической динамике и прекращению выделения возбудителя туберкулеза по данным бактериоскопии и культурального посева.

Данные научных исследований, полученных на группе больных туберкулезом легких, находившихся на лечении ЦНИИТ РАМН и подвергнутых стандартной химиотерапии продемонстрировали, что через 6 месяцев лечения при отрицательных результатах бактериоскопии и отсутствие культурального роста МБТ у части больных выявлялась ДНК микобактерии туберкулеза [19, 18]. Выявление ДНК микобактерий в диагностическом материале больных после окончания курса химиотерапии отражает недостаточную эффективность лечения, приводящую к рецидивам V заболевания. Длительное наблюдение за такими больными позволило бы определить прогностическую ■ значимость обнаружения в диагностическом материале ДНК микобактерий туберкулеза.

Цель исследования

--ЦедБго настоящего—исследования—явилабь молекулярно-генетическая оценка эффективности противотуберкулезной химиотерапии при экспериментальном туберкулезе.

ДКзадачи исследования ■входило

1. На экспериментальной модели хронической туберкулезной инфекции при внутривенном заражении M.tuberculosis H37Rv в дозе 2,5x104

J |/ КОЕ мышей линии BALB/C провести ПНР на выявление ДНК M.tuberculosis в паренхиматозных органах и крови.

2. Пррвёсти „бактериологические, цитологические и молекулярно-генетические исследования экспериментального туберкулеза при лечении двумя препаратами (изониазидом и пиразинамидом) и возникновении реактивации туберкулезного процесса.

-3. Провести типирование по RFLP IS6110 штамма M.tuberculosis

H37Rv, использованного для заражения мышей и штаммов микобактерий,

9 ДсВ^^ полученных на разные сроки лечения и реактивации туберкулезного ' iu( --—-процесса. V

4. Провести сравнение результатов бактериологических, цитологических и молекулярно-генетических исследований, полученных при лечении экспериментального туберкулезного процесса изониазидом^ пиразинамидом и при включении в схему химиотерапии рифампицина. ^ 5. Изучить спектр лекарственной чувствительности штаммов

M.tuberculosis на все сроки эксперимента бактериологическим и молекулярно-генетическим методами.

Новизна исследования

Показано, что при экспериментальной туберкулезной инфекции ДНК

V . , . ^С^-гдассЯ:-- '--, v M.tuberculosis выявляется не-толь-ко-в паренхиматозных органах, -но-шв крови. зараженных животных.

В Корнелловской модели реактивированного туберкулеза доказан эндогенный характер реактивации процесса.

Экспериментально доказано, что предотвращение реактивации экспериментального туберкулезного процесса связано^, (/не с

1>-~ ---------"- ' и продолжительностью химиотерапии,/а'/с комбинацией противотуберкулезных

I — - I препаратов, использующихся для лечения.

Показано, что штаммы микобактерий туберкулеза, полученные в результате эндогенной реактивации, сохраняй^ чувствительность к противотуберкулезным препаратам исходного штамма M.tuberculosis H37Rv, использованного для заражения мышей.

Научно-практическая значимость:

Показано, что выявление ДНК микобактерий при отсутствии роста микобактерий на питательных средах является свидетельством сохранения некультивируемых форм М. tuberculosis в организме хозяина.

Выявление ДНК M.tuberculosis при туберкулезном процессе является фундаментальной основой для оценки эффективности противотуберкулезной химиотерапии с включением результатов ПЦР.

Охарактеризованная модель эндогенной реактивации туберкулеза может быть использована для поиска новых противотуберкулезных препаратов, направленных на элиминацию из организма некультивируемых форм микобактерий.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Смирнова, Татьяна Геннадьевна

ВЫВОДЫ f 1. При внутривенном заражении M.tuberculosis H37Rv в дозе 2,5x104

V &ICJ

КОЕ мышей линии BALB/C ДНК М. tuberculosis выявлялась в q ----^ паренхиматозных органах и крови мышей -на-BGe-GpOK» в течение 260 дней эксперимента. ^

2. При лечении неполной схемой химиотерапии (изониазидом и rfy.\0 пиразинамидом) создаются условия для появления некультивируемых

V/ форм М. tuberculosis, так как при отрицательных результатах посевов паренхиматозных органов ^бьши выявлены ДНК М. tuberculosis в jv^^Ti паренхиматозных органах и крови, специфические клеточные реакции туберкулезного воспаления и была"** получена реактивация туберкулезного процесса. 3. Реактивация туберкулезного процесса носила"эндогенный характер, s f что бьшб^доказано идентичностью результатов типирования по RFLP IS6110 культуры штамма M.tuberculosis H37Rv, использованного для заражения мышей и культур микобактерий, полученных в процессе лечения изониазидом и пиразинамидом и реактивации.

Л.

4. Использование полной схемы противотуберкулезной химиотерапии (рифампицин, изониазид, пиразинамид) предотвратило реактивацию V^ ^ ^ туберкулезного процесса ^ по данным культуральных и Рбактериоскопических исследований, однако^ выявление ДНК M.tuberculosis в органах^-и- крови и специфическая цитологическая картина мазков-отпечатков паренхиматозных органов указывала^на сохранение в организме хозяина некультивируемых форм M.tuberculosis.

Uyl

5. Возникновение реактивации туберкулезного процесса» зависело от схемы лечения (двумя или тремя препаратами с рифампицином) и не б^ю связано с длительностью химиотерапии (4 или 6 месяцев).

6. .Культуры М. tuberculosis H37Rv, полученные в результате реактивации туберкулезного процесса, сохраня)н^чувствительность к основным противотуберкулезным препаратам и не имелц^ мутаций в генах гроВ,-katG, inhA и ahpC. ДНК М. tuberculosis H37Rv, выделенная из органов и крови животных, леченных тремя препаратами, также не нёеда мутаций в генах гроВ, katG, inhA и ahpC.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Модель эндогенно-реактивированной туберкулезной инфекции может быть использована для поиска новых противотуберкулезных препаратов воздействие которых направлено на некультивируемые формы микобактерий.

Выявление ДНК M.tuberculosis методом полимеразной цепной реакции может быть применено как лабораторный критерий при диагностике туберкулеза и для оценки эффективности противотуберкулезной терапии.

Материал настоящего исследования может быть использован в цикле лекций для студентов, аспирантов учреждений микробиологического и фтизиатрического профиля.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Смирнова, Татьяна Геннадьевна, Москва

1. Ерохин В.В. Морфологические реакции в легких при химиотерапии экспериментального туберкулеза // Проблемы туберкулеза.- 2000.- №5.-с. 15-19.

2. Желткова Е.К. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью // Автореф. канд. дисс. канд. мед. наук.- 2004.- 25 с.

3. Косарева М.В. Клинико-диагностическое значение микобактериемии при туберкулезе у подростков // Автореф. дисс. канд. мед. наук.- 1999.24 с.

4. Лемешко М.В., Овсянкина Е.С., Голышевская В.И. Роль микобактериемии в диагностике абациллярных форм туберкулеза у подростков // Материалы VII Национального конгресса по болезням органов дыхания. Сборник резюме.- 1997.- №411,- с. 114.

5. Лепеха Л.Н, Бурцева С.А., Ерохин В.В. Морфологическая диагностика туберкулеза и некоторых диссеминированных заболеваний легких // Проблемы туберкулеза.- 2001.- №3.- с. 45-50.

6. МакМаррей Д.Н. Модель туберкулеза у морских свинок. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль // Под ред. Барри Блума.- 2002.- М.-"Медицина".

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // 1984.- М.- "Мир"

8. Методы экспериментальной химиотерапии (Практическое руководство).// Под ред. Г.Н. Першина.- 1971.- М.- "Медицина".

9. Приказ МЗ РФ № 109 «О проведении микробиологических исследований при туберкулезе».- 2003.

10. Пузанов В.А., Косарева М.В. Бактериемия при туберкулезе и других микобактериальных инфекциях // Проблемы туберкулеза.- 1999.- №1.-с. 54-59.

11. Радаева Т.В. Сравнительная характеристика иммунологических параметров мышей инбредных линий с генетически детерминированной чувствительностью к туберкулезу и ихсверхрезистентных гибридов // Автореф. дисс. канд. мед. наук.- 2002.25 с.

12. Снайдер Д.Е., Равигльоне М., Кочи А. Глобальное бремя туберкулеза. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль // Под ред. Барри Блума.-2002,- М.- "Медицина".

13. Черноусова Л.Н., Ларионова E.E., Севастьянова Э.В., Голышевская В.И. Роль ПЦР анализа в комплексных бактериологических исследованиях во фтизиатрии // Проблемы туберкулеза.- 2001.- №3, с. 58-60.

14. Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В., Масленникова Ю.В. Обнаружение M.tuberculosis в мокроте больных с ограниченными формами туберкулеза легких методом ПЦР // Мат. конф. "Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы".- 2000.- М.- с. 89-90.

15. Шилова М.В. Туберкулез в России в 2000 году // 2001.- С.-П.-"Дыхание и здоровье".

16. Alcaide F., Telenti A. Molecular techniques in the diagnosis of drug-resistant tuberculosis // Ann Acad Med Singapore.- 1997.- Vol. 26.- P.647-650.

17. Alland D., Kakut G. E., Moss A. R., McAdam R. A., Hahn J. A., Bosworth W., Drucker E., and Bloom B. R. Transmission of tuberculosis in New York

18. City. An analysis by DNA fingerprinting and conventional epidemiologic methods//N Engl. J. Med.- 1994, Vol. 330.-P. 1710-1716.

19. Amrami K.K, Sundaram M, Shin A.Y., Bishop A.T. Mycobacterium marinum infections of the distal upper extremities: clinical course and imaging findings in two cases with delayed diagnosis // Skeletal Radiol.-2003.- Vol. 32(9).- P. 546-549.

20. Apt A., Avdienko V., Nikonenko B. et al. Distinct H-2 complex control of mortality, and immune responses to tuberculosis infection in virgin and BCG-vaccinated mice // Clin. Exp. Immunol.- 1993.- Vol. 94.- P. 322-329.

21. Aronson J.D. Spontaneous tuberculosis in salt water fish // J. Infect. Dis.-1926.- Vol. 39.-P. 315-320.

22. Aubry A, Chosidow O, Caumes E, Robert J, Cambau E. Sixty-three cases of Mycobacterium marinum infection: clinical features, treatment, and antibiotic susceptibility of causative isolates // Arch Intern Med.- 2002.-Vol. 162(15).-P. 1746-52

23. Barclay W.R., Anacker R.L., Brehmer W., Leif W., Ribi E. Aerosol-induced tuberculosis in subhuman primates and the course of the disease after intravenous BCG vaccination // Infect Immun.- 1970.- Vol. 2.- P. 574-82

24. Barclay W.R., Busey W.M., Dalgard D.W. Protection of monkeys against airborne tuberculosis by aerosol vaccination with bacille Calmette-Guerin // Am. Rev. Respir. Dis.- 1973- Vol. 107.- P. 351-358.

25. Barker L.P., George K.M., Falkow S., Small P.L.S. Differential Trafficking of Live and Dead Mycobacterium marinum Organisms in Macrophages // J. Infection and Immunity.- 1997.- Vol. 65.- P. 1497-1504.

26. Bonato V.L., Goncalves E.D., Santos R.R., Silva C.L. Genetic aspects and microenvironment affect expression of CD 18 and VLA-4 in experimental tuberculosis // Scand. J Immunol.- 2002.- Vol. 56(2).- P. 185-194.

27. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.H. Rapid and simple method for purification of nucleic acid // J.Clin.Microb.- 1990.- Vol. 28.- №2. P. 495503.

28. Browning C.N., Gulbransen R. Studies on experimental tuberculosis in mice. The susceptibility of mice to inoculation with tubercle bacilli // J. Hyg.- 1926.- Vol. 25.- P. 323-332.

29. Cardona P.J., Llatjos R., Gordillo S. Evolution of granulomas in lungs of mice infected aerogeniclly with Mycobcterium tuberculosis // Scand. J. Immunol.- 2000.- Vol. 52.- P. 156-163.

30. Caws M., Drobniewski F.A. Molecular Techniques in the Diagnosis of Mycobacterium tuberculosis and the Detection of Drug Resistance // Annals New York Academy of Sciens.-2001.- 139-145

31. Chapuis L., Ji В., Truffot-Pernot C., O'Brien R. J., Raviglione M. C., and Grosset J. H. Preventive therapy of tuberculosis with rifapentine inimmunocompetent and nude mice // Am. J. Respir. Crit. Care Med.- 1994.-Vol. 150.- P. 1355-1362.

32. Collins F.M. Protection against Mycobacterial disease by means of live vaccines tested in experimental animals // In G.P. Kubica and L.G. Wayne (ed.) The Mycobacteria: a Sourcebook.- 1984.- New York.- P. 787-839.

33. Colorni A. A systemic mycobacteriosis in the European sea bass Dicentrarchus labrax cultured in Eilat (Red Sea) // Isr. J. Aquacult. Bamidgeh.- 1992.- Vol. 44,- P.75-81.

34. Cooper A.M., Callahan J.E., Griffin J.P., Roberts A.D., Orme I.M. Old mice are able to control low-dose aerogenic infections with Mycobacterium tuberculosis //J. Infect. Immun.- 1995.- Vol. 63.- P. 3259-65.

35. Dannenberg A.J. Roles of cytotoxic delayed-type hypersensitivity and macrophage-activating cells-mediaeted immunity in the pathogenesis of tuberculosis // J. Immunobiology.- 1994.- Vol. 191.- P. 461-473.

36. Dannenberg A.M. Jr. Immunopathogenesis of pulmonary tuberculosis // J. Hosp. Pract.- 1993.- Vol. 28.- P. 33-40.

37. Dannenberg A.J. Pathogenesis of pulmonary tuberculosis // Am. Rev. Respir. Dis.- 1982.- Vol. 125.- P.25-29.

38. Dannenberg A.M. Jr. Delayed-type hypersensitivity and cell-mediated immunity in the pathogenesis of tuberculosis // J. Immunol. Today.- 1991.-Vol. 12.-P. 228-233.

39. Diamant A.A., Banet M.U, Colorni A., Knibb W., Kvitt H. Mycobacteriosis in wild rabbitfish Siganus rivulatus associated with cage farming in the Gulf of Eilat, Red Sea//Dis. Aquat. Org.- 2000.- Vol. 39.- P. 211-219.

40. Dubos R.J., Pierce C.H. Differential characteristics in vitro and in vivo of several substrains of BCG. IV Immunizing effectiveness // Am. Rev. Tuberc.- 1956.- Vol. 74.- P. 699-717.

41. Eisenach К. D., Sifford M. D., Cave M. D., Bates J.H., Crawford J. Т. Detection of Mycobacterium tuberculosis in Sputum Samples Using a polymerase Chain Reaction // Am. Rev. respire Dis.- 1991.- Vol. 144.- P. 1160-1163.

42. E1-Hajj H.H., Marras S.A.E., Tyagi S., Kramer F.R., Alland D. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons // J. Clin Microbiol.- 2001.- Vol. 39.- P.4131-4137

43. Enzensberger R, Hunfeld K.P, Elshorst-Schmidt T, Boer A, Brade V. Disseminated cutaneous Mycobacterium marinum infection in a patient with non-Hodgkin's lymphoma// Infection.- 2002.- Vol. 30(6).- P. 393-395.

44. Fregnan G.B., Smith D.W. Immunogeneticy and allergenicity in guinea pigs of a deffated Mycobacterial vaccine and its fractions // Am. Rev. Respir. Dis.- 1963,- Vol. 87.- P. 877-888.

45. Friedman C. R., Stoeckle M. Y., Johnson Jr. W. D., Riley L. W. Double repetitive element PCR method for subtyping Mycobacterium tuberculosis clinical isolates // J. Clin Microbiol.- 1995,- Vol. 33.- P. 1064-1069.

46. Frothingham R., Meeker W. A. O'Connel. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats//Microbiology. 1998. - 144. - P.l 189-1196.

47. Giavenni R. Alcuni aspetti zoonosici delle micobatteriosi di origine ittica // Riv. Ital. Piscicolt. Ittiopatol.- 1979,- Vol. 4,- P. 123-126.

48. Good R.C. Simian tuberculosis: immunologic aspects // Ann NY Acad Sci.-1968.-Vol. 154.-P.200 213

49. Greifinger R., Grabau J., Quinlan A., Loeder A., DiFerdinando Jr. G., and Morse D. L. Transmission of multidrug-resistant tuberculosis among immunocompromised persons in a correctional system // MMWR.- 1992.-Vol. 41.- P. 507-509.

50. Haas W. H., Butler W. R., Woodley C. L., and Crawford J. T. Mixed-linker polymerase chain reaction: a new method for rapid fingerprinting of isolates of the Mycobacterium tuberculosis complex // J. Clin Microbiol.- 1993.-Yol. 31.- P. 1293-1298.

51. Напсе A.J., Grandchamp В., Levy-Frebault V. Detection and identification of mycobacteria by amplification of Mycobacterial DNA // Mol. Microbiol.-1989,- Vol. 3.- P.843-849.

52. Hermans P. Characterization of a major polymorphic tandem repeat in M. tuberculosis//J. В acteriol.- 1992.- Vol. 174.-P.4157-4165.

53. Hermans P.W.M., Schuitema A.R.J., Van Sooligen D. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol.- 1990.- Vol. 28,- P. 1204-1213.

54. H6ner zu Bentrup Kerstin, Russell G. David. Mycobacterial persistence: adaptation to a changing environment // Trends in Microbiology.- 2001.-Vol. 9.- P. 135-144

55. Janicki B.W., Good R.C., Minden P., Affronti L.F., Hymes W.F. Immune responses in rhesus monkeys after bacille Calmette-Guerin vaccination andaerosol challenge with Mycobacterium tuberculosis // Am Rev Respir Dis.-1973.- Vol. 107,- P.359-366.

56. Jespersen A. Studies on tuberculin sensitivity and immunity in guinea pigs induced by vaccination with varying doses ob BCG vaccine // Acta Pathol. Microbiol. Scand.- 1956.- Vol. 38.- P. 203-209.

57. Jespersen A. Bacteraemia in red mice (Clethrionomys g. glareolus Schreb.) after intraperitoneal injection of large doses of tubercle bacilli // Acta Pathol Microbiol Scand.- 1975,- Vol. 83(3).- P. 211-218.

58. Kochi A. The global tuberculosis situation and the new control strategy of the World Health Organization // Tubercle.- 1991.- Vol. 72.- P. 1-6.

59. Kolk A.H., Kox L.F., Kuijper S., Richter C. Detection of Mycobacterium tuberculosis in peripheral blood (letter, comment). / /Lancet.- 1994.- Vol.3. -P. 694.

60. Laboratory Services in Tuberculosis Control. Part II: Microscopy.// Geneva.- WHO.- 1998.- P. 27-44.

61. Laboratory Services in Tuberculosis Control. Part III: Culture // Geneva.-WHO.- 1998.-P. 37-55

62. Lee A.S., Lim I.H., Tang L.L., Telenti A., Wong S.Y. Contribution of kasA analysis to detection of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis in Singapore //Antimicrob Agents Chemother.- 1999.- Vol. 43.- P.2087-2089

63. Legranderie M., Ravisse P., Marchal G., Gheorghiu M., Balasubramanian V. Wiegeshaus E.H., Smith D.V. BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route // Tuberc. Lung Dis.-1993.- Vol. 74.-P. 38-46.

64. Lenaerts A.M.J.A., Chase S.E., Chmielewski A.J., Cynamon M.H. Evaluation of Rifapentine in Long-Term Treatment Regimens for Tuberculosis in Mice // Antimicrob. Agents Chemother.- 1999.- Vol. 43.- N. 10.-P. 2356-2360.

65. Lima V.M., Bonato V.L., Lima K.M., Dos Santos S.A., Dos Santos R.R., Goncalves E.D., Faccioli L.H., Brandao I.T., Rodrigues-Junior J.M., Silva

66. C.L. Role of trehalose dimycolate in recruitment of cells and modulation of production of cytokines and NO in tuberculosis // Infect Immun.- 2001.-Vol. 69(9).-P. 5305-5312.

67. Lurie M.B. The correlation between the histological changes and the fate of living tubercle bacilli by rabbit pulmonary alveolar macrophages and its relation to native resistance to tuberculosis // J. Immunol.- 1932.- Vol. 91.-P. 553-556.

68. Lurie M.B. The fate of BCG and associated changes in the organs of rabbits // J. Exp. Med.- 1934,- Vol. 60.- P. 163-178.

69. Lurie M.B. Nature of inherited resistance to tuberculosis // Rroc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1938,- Vol. 39,- P. 181-187.

70. Lurie M.B. Heredity, constitution and tuberculosis. An experimental study // Am. Rev. Tuberc.- 1941.- Vol. 44.- P. 1-125.

71. McCune R.M., Feldmann F.M., Lambert H.P., McDermott W. Microbial persistence I. The capacity of tubercle bacilli to survive sterilization in mouse tissues // J.Exp. Med.- 1966.- Vol.123.- P. 445-468.

72. McKee C.M., Rake G., Donovick R., Jambor W.P. The use of the mouse in a standardized test for antituberculous activity of compounds of natural or syntetic origin // Am. Rev.Tuberc.- 1949.- Vol. 60.- P. 90-108.

73. McKinney J. D. In vivo Veritas: The search for ТВ drug targets goes live // Nature Medicine .- 2000.- Vol.6 №12.- P. 1330-1331.

74. McMurray D.N. Disease model: pulmonary tuberculosis // Trends in Molecular Medicine.-2001.-Vol. 7.-N. 3.-P. 135-137.

75. McMurray D.N. A Nonhuman Primate Model for Preclinical Testing of New Tuberculosis Vaccines // Clin. Inf. Dis.- 2000.- Vol. 30.- P.210-212.

76. Miyazaki E., Chaisson R.E, Bishai W.R. Analysis of rifapentine for preventive therapy in the Cornell mouse model of latent tuberculosis // Antimicrob. Agents Chemother.- 1999.- Vol. 43.- P. 2126-2130.

77. Nigrelli R.F., Vogel H. Spontaneous tuberculosis in fishes and in other coldblooded vertebrates with special reference to Mycobacterium fortuitum Cruz from fish and human lesions // Zoologica.- 1963.- Vol. 48.- P. 131-144.

78. Nikonenko B.V., Averbakh M.M., Lavebratt C., Schurr E., Apt A.S. Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice // Tuber. Lung. Dis.- 2000.- Vol. 80.- P. 15-25.

79. Nikonenko B.V., Hanrahan C. Murine model of tuberculosis. In vitro and in vivo study // Russian Journal of Immunology.- 2002.- Vol. 7.- №4.-P. 308-322.

80. North R.J. Importance of thymus-derived lymphocytes in cell-mediated immunity to infection // Cell. Immunol.- 1973.- Vol. 7.- P. 166-176.

81. Orme I.M. A mouse model of the recrudescence of latent tuberculosis in the elderly//Am. Rev. Respir. Dis.- 1988,- Vol. 137.- P. 716-718.

82. Orme I.M. Mechanisms underlying the increased susceptibility of aged mice to tuberculosis //Nutr. Rev.- 1995.- Vol. 53.- P. 535-540.

83. Orme I.M. The immunopathogenesis of tuberculosis: a new working hypothesis // Trends in microbiology.- 1998.- Vol. 6.- P. 94-97.

84. Orme I.M. Virulence of recent notorious Mycobacterium tuberculosis isolates // Tuberc. Lung. Dis.- 1999.- Vol. 79(6).- P. 379-381.

85. Parish N.M., Dick J.D., Bishai W.R. Mechanism of latency in Mycobacterium tuberculosis // Trends, of Microbiol.- 2000.- Vol. 6.- P. 107112.

86. Planes A.M.,Gasser 1., Gonzales T. Bacteriemia caused by Mycobacterium tuberculosis and or Mycobacterium avium detected by the nonradiometric BACTEC system. //Enferm. Infect. Microbiol. Clin. 1993. - Vol. 11. - N 9.-P. 494-496.

87. Plikaytis В. В., Crawford J. Т., Woodley, C. L., Butler W. R., Eisenach K. D., Cave M. D., and Shinnick Т. M. Rapid, amplification-based fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin Microbiol.- 1993.-Vol. 139.- P. 1537-1542.

88. Quinn D. Frederick., Birkness A. Kristin,. King J. Peter. Alpha-Crystallin as a Potential Marker of Mycobacterium tuberculosis Latency.- ASM News.- 2002.- Vol. 68.- №12,- P.-612-617.

89. Ramaswamy S., Musser J.M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update // Tuber Lung Dis.- 1998.- Vol.79.-P. 3-29.

90. Rastogi N. Emergence during unsuccessful chemotherapy of multiple drug resistance in a strain of M. tuberculosis // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.- 1992.-Vol. 11.-P. 901-907.

91. Ravins M., Bercovier H., Chemtob D., Fishman Y., Rahav G. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis infection in Israel // J. Clin. Microbiol.- 2001.- Vol.39.- №3.- P. 1175-1177.

92. Reddy V. M., Nadadhur G., Daneluzzi D., O'Sullivan J.F., Gangadharam P.R.J. Antituberculosis activities of clofazimine and its new analogs B4154 and B4157 // Antimicrob. Agents. Chemother.- 1996.- Vol. 40.- P. 633-636.

93. Ribi E., Anaclcer R.L., Barclay W.R. Efficacy of mycobacterial cell walls as a vaccine against airborne tuberculosis in the rhesus monkey // J Infect Dis.- 1971.-Vol. 123.-P. 527-538.

94. Richeldi L. Molecular diagnosis of tuberculosis // J. Eur Respir.- 1995 -Vol. 20.- P. 689-700.

95. Richter С., Kox L.F., Van-Leeuwen I.V. PCR detection of mycobacteriemia in Tanzanian patients with extrapulmonary tuberculosis. // Eur. J. Clin. Micribiol. Infect. Dis.- 1996. Vol. 15. -N 10. - P. 813-817.

96. Ringuet H., Akoua-Koffi С., Honore S., Varnerot A., Vincent V., Berche P., Gaillard J.L., Pierre-Audigier C. hsp65 sequencing for identification of rapidly growing mycobacteria // J Clin Microbiol.- 1999.- Vol. 37.- P.852-857.

97. Rolfs A., Beige L., Finckh U. Amplification of Mycobacterium tuberculosis from peripheral blood // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33.-N 12.-P. 3312-3314.

98. Sever J.L., Youmans G.P. Enumeration of viable tubercle bacilli from the organs of nonimmunized and immunized mice // Am. Rev. Tuberc. Pulm. Dis.- 1957.- Vol. 76.- 616-635.

99. Shoen C.M., DeStefano M.S., Sklaney M.R., Monica B.J., Slee A.M., Cynamon M.H. Short-course treatment regimen to identify potential antituberculous agents in a murine model of tuberculosis // J Antimicrob Chemother.- 2004.- №2.- P.535-543.

100. Smith D.W. Protective effect of BCG in experimental tuberculosis // Adv. Tuberc. Res.- 1985.- Vol. 22.- P. 1-93

101. Smith D.W., Harding G.E., Chan J.K. Potency of 10 BCG vaccines as evaluated by their influence on the bacillemic phase of experimental airborne tuberculosis in guinea pigs // J. Biol. Stand.- 1979.- Vol. 7.- P. 179197.

102. Smith D.W., Wiegeshaus E.H. What animal model can teach us about the pathogenesis of tuberculosis in humans // Rev. Infect. Dis.- 1989.- Vol. 11.-P. 385-393.

103. Small P. M., Hopewell P. C.3 Singh S. P., Paz A., Parsonnet J., Ruston D. C., Schecter G. F., Daley M. P. H. C. L., and Schoolnik G. K. The epidemiology of tuberculosis in San Francisco // N. Eng. J. Med.- 1994.-Vol. 330.-P. 1703-1709.

104. Stead W.W. Pathogenesis if a first episode of chronic pulmonary tuberculosis in many recrudescence of residuals of the primary infection or exogenous reinfection? // Am. Rev. Respir. Dis.- 1967.- Vol. 95.- P. 721745.

105. Talaat A.M., Reimschuessel R., Wasserman S.S., Trucksis M. Goldfish, Carassius auratus, a Novel Animal Model for the Study of Mycobacterium Marinum Pathogenesis // J. Infect. Immun.- 1998.- Vol. 66.- P. 2938-2942.

106. Telenti A. Genetics and pulmonary medicine. 5. Genetics of drug resistant tuberculosis // J. Thorax.- 1998.- Vol.53.- P.793-797

107. Telenti A., Honore N., Cole S.T. Detection of mutations in mycobacteria by PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) // Methods Mol Biol.- 1998.- Vol. 101.- P.423-430.

108. Telenti A, Iseman M. Drug-resistant tuberculosis: what do we do now? // J. Drugs.- 2000.- Vol. 59.- P.171-179.

109. Telenti A., Marchesi F., Balz M., Bally F., Bottger E.C., Bodmer T. Rapid identification of Mycobacteria to the species level by polymerase chane reaction and restriction enzyme analysis // J. Clin Microbiol.- 1997.- Vol. 31.-N2.- P.175-178.

110. Telenti A., Persing D.H. Novel strategies for the detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis // Res Microbiol.- 1996.- Vol. 147(1-2).- P.73-79

111. Thoen C.O., Richards W.D., Jarnagin J.L. Mycobacteria isolated from exotic animals // J Am Vet Med Assoc.- 1977.- Vol. 170.- P. 987 990.

112. Treatment of tuberculosis. Recommendations for national programs // Geneva.- WHO.- 1998.- P. 25-70.

113. Uclco M., Colorni A., Kvitt H. Strain variation in Mycobacterium marinum fish isolates // Appl. and Envirommental Microbiology.- 2002.- №2.- P. 5281-5287.

114. Vandiviere H.M., Loring W.E., Melvin I., Willis S. The treated pulmonary lesion and its tubercle bacillus. The death and resurrection // Am. J. Med. Sci.- 1956.- Vol. 232.- P. 30-37.

115. Van Soolingen D., de Haas P. E. W., Hermans P. W. M., and van Embden J. D. A. DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis // Meth. Enzymol.- 1994.- Vol. 235.- P. 196-205.

116. Van Soolingen D., Kremer K., Vynycky E. New perspectives in the Molecular Epidemiology of tuberculosis. P. 17-45 In Kaufmann S.H.E., Hahn H.: Mycobacteria and ТВ. Issues Infect Dis. Basel., Karger., 2003.-Vol.2.- P. 155.

117. Walsh G.P., Tan E.V., de la Cruz E.C. The Phillipine cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) provides a new nonhuman primate model of tuberculosis that resembles human disease // Nature Med.- 1996.- Vol. 2.- P. 430-436.

118. De Wit D., Wootton M., Dhillon J., Mitchison D.A. The bacterial DNA content of mouse organs in the Cornell model of dormant tuberculosis // Tuberc. Lung Dis.- 1995.- Vol. 76,- P. 555-562.

119. Yamamura Y, Walter A, Bloch H. Bacterial populations in experimental murine tuberculosis. I. Studies in normal mice // J. Infect. Dis.- I960.- Vol. 106.-P. 211-222.

120. Yamazaki Т., Haga S., Nakamura R.M., Ookubo H., Okazawa Y., Tanno K., Hayashi Т., Tamura Т., Fujino T. Detection of rifampicin-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis by a non-radioactive PCR-SSCP method // Kekakku.- 1996.-Vol. 71.-P.465-471.

121. Yang Z. H., de Haas P. E. W., Wachman С. H., van Soolingen D., van Embden J. D. A., and Andersen A. B. Molecular epidemiology of tuberculosis in Denmark in 1992 // J. Clin. Microbiol.- 1995.- Vol. 33.2077-2081.

122. Zahrt C. Thomas Molecular mechanisms regulating persistent Mycobacterium tuberculosis infection // Microbes and Infection.- 2003.-Vol. 5.-P. 159-167.