Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика мутаций бета-глобинового гена у населения двух регионов Азербайджана

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика мутаций бета-глобинового гена у населения двух регионов Азербайджана"

— 1 9 з1

АКАДЕМИЯ НАУК АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ

На правах рукописи УДК 616.155.

АЛИЕВА КАМИЛЯ АЛИ АГА кызы

молекулярно-генетическая характеристика

мутации бета-глобинового гена у населения двух регионов азербайджана

Специальность — 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Баку — 1992

Работа выполнена па кафедре генетики и дарвинизма Бакинского Государственного Университета им. М. Э. Расул-заде.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Э. М. Расулов

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Р.А.Кулиев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Р. Т. Алиев кандидат биологических наук К. М. Мовсум-заде

Ведущее учреждение: — Центральная научно-исследовательская лаборатория при институте Усовершенствования врачей им. А. Алиева МЗ Азерб. Республики.

Защита состоится «с^ » 993 г. в .-¿О <

4

'часов

на заседании Специализированного совета Д. 004.20.01 в Институте генетики и селекции АН Азербайджанской республики по адресу: 370106, г. Баку, проспект Азадлыг, 155.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института Генетики и Селекции АН Азербайджана.

Автореферат разослан « 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук, АЛИЕВ

;.'JjЦ;jАК'ГУш.ность проблемы. Под эгидой Всемирной Организации Здравоохранения в настоящее время в различ;шх центрах проводят исследования по изучению молекулярных основ патогенеза, методов диагностики, лечение и профилактики - иJ- талассемий, серповидно-клеточной анемии (CaO А., al, 1991,1992).

Изучение такого заболевания, как J>~ талассемия на молекулярном уровне показали, что эта группа наследственных анемий связана о дефектом экспрессии^/3- глобинового гена,т.е. нарушением на четырех уровнях: транскрипционном, посттранскрипционном,трансляционном и лосмрансляционном - синтезаJ> - цепей глобина.

Эти нарушения вызывает частичный дефицит продукции (ув+) или полное отсутствие (/J0)/3 - цепей глобина (Р.Ф.Гарькавцева в соавт. 1974,1976; С.А.ЛимЙорская в соавт.,1976,I960,1987; Ю.Н.Токарев в соавт.,1983; С. ^^1990).

Ежегодно в шре ровдашея более 250 ООО гомозигот по^з-талассемии. Оттого и пристальное вникшие исследователей во всем шре и в бывшей СССР к этой группе наследственных анемий (Р.Ф, Гарькавцева,1977; С.А.Лимборская,1983; Ю.Н.Токарев 1983; К.Н.Нов-сумзадз в соавт., 1585,1986).

В этил вопросе население Лзерба]1цжана представляет особый интерес, т.к. частота готерозигот п^у3- талассемии здесь самая высокая и достигает в некоторых регионах 10-15?? -го носительст-ва (A.M.Ахундова,1965,1972; Р.Ш.Рустамов в соавт.,1981; К.М.'Лов-сум-заде в соавт., 1981,1985). Каждый год в Азербайджане роядают-ся 400 детей с гомозиготной cJopMoiiji-талассемии (анемия Кули). Число их увеличивается вследствие кровнородственных и эндемичных браков, которые широко распространены в нашей республике.

J J* ~ глобинового гена наблюдается более 100 мутаций способствующих развитию данного заболевания. Составление геногеографи-ческих карт различных вариантов мутаций ji - талассемии у населения конкретного региона имеет как теоретическое так и большое практическое значение дая решения задач, связанных с генетическим скринингом ц- талассемии в период.беременности, у новорожденных.

Для возможности ранней диагностики (8-10 недель) гемоглоби-■ нопатии необходимо упростить существующие молекулярно-генетичес-кие методы исследования ж забора биологического материала (ворсин хориона - клетки плаценты). В связи с этим исключительно вал-'но разработать недорогие, а также нерадиоактивные экспресс-методы диагностики мутаций а - глобинового гена на амгошфицировашшх

- г -

образцах ДНК, выделенных из ворсин хориона.

В конкретных регионах республики изучение молекуллрно-гене-тической характеристики мутаций -глобинового гена повисит эффективность генетического консультирования, па основе пренаталь-иой диагностики и последующего лечения.

Цель и задачи работа. Целью данной работа било изучить моле-кулярно-геноаическую характеристику и геногеографшо мутаций^ -глобинового гена у населения двух регионов Азербайджана. Для достижения поставленной цели били сформулировали следующие задачи:

1. Изучить генетическую гетерогенность мутации^ - талассе-мии на уровне^ -глобинового гена.

2. Изучить геиогеографго мутаций- талассешш у насачешш двух регионов республики -{Кгардаг/лгр и Кабала).

3. Разработать иерадиоактишт! экспресс-метод диагностики мутаций кодсна 8 (-АА)у - глобинового гена.

4. Осуществлять проведение препатальпои диагностики^ -та-лассешй в первом триместре беременности на уровне ДНК выделенных из ворсин хориона с использованием молекулярно-гепетнческих методов диагностики.

5. Провести пренатальную диагностикуталассемиГ; во ето-роы триместре беременности на уровне цепей глобина Еццеленных из крови плода.

Научная новизна, а) Впервые изучена молекулярно-генетичес-кая характеристика и геногеография мутаций-глобинового гена у населения Кюрдамирск.го и Кабахинского районов Азербайджана.

б) Составлена геногеограгеическая карта для четырех нутаций включаилая 70 талассемнческих генов из двух регионов республики.

в) Впервые разработан и использован иерадкоакмены;! электро-зоретический экспресс-метод диагностики мутации кокона 8 (-АА)

^ -глобинового гена.

г) Впервые применяя этот метод проведена препатальная диагностика плода и предотвращено рождение больных талассеьыей доте";.

Практическая значшоогь работы. Значит,гасть настоящего исследования заключается в разработке и использовании'нерадиоактивного электрофореткческого метода диагностики мутаций ко дона 8 (-АА) у -глобинового гена, что делает метод доступном для многих гледи-нлнекнх центров, зациг.'.агщгсся проблемой гемоглобинопатии. Кроме того, на основе состаглешшк геногеографэтеских ксот (годбор необходимых а;01йаь-спэц1:";ическлх олпгонукиеотидгасс зотщов) шкпо «гово'з:?» к^шфиэдадаапоэ генетическое коясулыЕрошше соне"

с последующей преиатальпой диагностики плода, направленное на снижение частоты рожаемости детей с гемоглобииопатай у населения.

Апробация работы: Результата исследования были представлены и обсукдени: na Совето гйолодцх учених биологического факультета БГУ (1989,1991), на годовых отчетах кафедры генетики и дарвинизма биологического факультета БГУ (1589,1990,1991), научно-практической конференции "Актуальные вопросы медицинской диагностики" (Баку,1990).

Структура и объем работы: Диссертация написана на 118 страницах машинописного текста, включая 20 рисунков и 6 таблиц. Состоит из введения,обзора литературы, описания материалов и использованных методов исследований, результатов исследований и их обоуж-дения, общего заключения, выводов и предложения, списка цитируемой литературы, содсрхсщего 124 наименования, из них 3? отечественных и 87 иностранных авторов.

Публккттин. По теме диссертации опубликовано 4 статьи. Список публикаций приведен и конце автореферата..

МЛТЕР'И/Л И I.ffiTOßJ ИССЛЕДОВАНИЯ '

Для выявления генетической гетерогенности генаj- талассе-Mioi на уровне фенотипа с использованием метода аналитического изоэлекгро^окусирования обследовано 568 детей из двух регионов Азербайджанской республика (Кврдамлр,Кабала), среди которых выявлено 34 больных: 26 гомозигот по ji -талассомии и 8 компаундов. Материал собран при экспедиционных условиях' в Кюрдамирскоы и Ка-балинскогл регионах республики,

Б медико-генетическую лабораторию Каучло-иеследовательско-го института ануперотва и гинекологии ИЗ Аз ерб. Республики обратились пять сеней из г.Баку родом из Кгардамирского и Кабалинско-го районов республики, которые имели пять гомозиготных по/- та-лассемии больных детей. Цель обращения семей прогноз потомства.

Г'олекулярно-гоштмческую характеристикуj> -глобинового гена изучали на 70 хромосомах, полученных от 31 гомозиготного и 8 ком-паундного больного в возрасте от I года до 28 лет. При этом боль' пне тлели различные фено'типические проявления болезни. Идентифицировано четыре типа мутацийJ - глобинового гена.

Проведено три случая вренаталыюй диагностики J -талассемии у плода в различные сроки беременности, при этом использова1*1.! белковые (Биосинтез цепей глобина.и изоэлектрофокусированио и

молекулярно-гепотические методы диагностики (прямые и косвенные методы диагностики мутаций. Материалом для исследования этих семей сл.угшга венозная кровь от родителей и больних детей,клетки ворсин хориона (клетки таценты), фибробласти амнлотической жидкости и ткань абортуса.

В целом, путем скрининга больных детей и брачных пар,обратившихся в медико-генстическу» лабораторию, и в экспедиционных условиях, обследовано 595 человек.Среди вне выявлено 31 гомозигота noталассемии и 8 компаундов с генотипом -^з^/Нв S .

В работе использовались следующие методы исследований:

1. Молекулярно-гецетические методы диагностики; аллель-сшцифическая олигонуклеотидная дот-гибридизация амгши-фицированных и неамплифицировашшх образцов фрагмента ДНК (А5 0), нерадиоакпшный - элекгрофоретический метод диагностики мутаций кококв 8 -глобинового гена, субгашготиппрованле.

2. Анализ состава гемоглобина и глобинов (биосинтез цепей глобина,мзоалектрофокусирование на ПААГ с рН 3,5-9,5 и 6-S'электрофорез па ацетат-целлюлозных пленках рН 9,0 количественное определение Детального гемоглобина.

Расчет генной частоты гемоглобинопатии проводили на основании учета ех двух стенотипических частот.

Для обработки материалов использовали общепринята статистические методы, изложенные в руководствах по статистике. .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЩОВАШЯ '.

Исследование генетической гетерогенности гена Jb -талассе-мии у 39 больных, показало наличие двух стенотипических форм гена (f^ соотношение которых составило 58Д2, приблизительно 5/1.

Полученные результаты легли в основу дальнейших молекуляр-но-генетичесхих исследования по идентификации генных «угащй на уровнеJ>~ глобинового гепа.

Молекулярш-генетическув гетерогенность J> -глобинового гена изучали тестированием 70 хромосом от 31 гомозиготы по-талассект и 8 кокпауцшюго больного (Нв5/^ -талассемия) в возрасте от I года до 28 лет. •

Генетический скрининг 70 хромосом от больных талассешей с использованием 10-ти аллель-специфических олигонуклеотедцшх зондов в ICQ? случаях идентифицировано 4 мутаций: кодон 8(-АА) с- 79,2%, J- Ш -2-1 - 8,3$у - IJS -1-6 - 8,3% иj)+ - 1У£ -

I-IIO -4,2

Результата тестирования 70 талассемическях генов из двух регионов республики представлен« в таблице I,

Таблица I.

Типы, а частоты мутаций в Кюрдамирском и Каба-л'.шском регионах Азербайджанской республики.

Регион Количество генов Мутации У - ■талаасемшг

Л с -1У5 -2-1 é+-D5-I-IT0 Р

N ¥ -вс Час- кол-то- во та Час-" Кол- Частота во тота Кол- Час-во тота

Кюрдамир Кабала 48 22 28 22 58,3 8 100,0 - 16,6 4 8,3 8 16,6

ВСЕГО 70 50 79,2 8 8,3 4 4,2 8 8,3

Таким образом, генетический скрининг с копользованием 4-х олигонуклеотидних зондов {jP&.jf-US -2-1, j.+-US -1-6,j.+-î'fS -I—110) позволяет диагностировать на 100$ вое мутаций л -глобино-вого гола у населения двух регионов Азербайджана.

По нашим данным уз- талассемия у населения Кабалинского района I0QÎ представлена'мутаций 8-го кодона (-АА)у*-глобинового гена. Опрос всех 12 больных (10 гомозигот и 2 компаундов) из Кабалинско-го района показал, что 4 из них по национальности являются удинами, двое икгияоАцами, один лезгин, а остальные азербайджанцы. Все перечисленные нации и народности являются коренными для кавказского региона. Следовательно мутация кодон 8(—АА)yj -глобгаю-, вого гена незавезена в данный регион, а является эндемичной, что подтверждается также нашими результатами. По данным Расулова Э. М. п Кулиева А.1'. (Г9Э2) частота мутаций кодона 8 (-АА) у населения Азербайджана состаачяет 35,11$ от всех мутаций л- глобшю-вого гена встречающихся в данном регионе.

Полученные данные позволяют прздпологать,. что эта мутация дутем миграции населения из этого региона проникла в Турцию, а затем Балканские страны.

На рисунках I и 2 представлены геногеограйичоскал карта мутаций ft-глобинов'ого гена у населения дпух регионов Asepôa'V'rw-

¿Гвроло

Рсса/а

/Сослиисхее море

/?<рри*а

Рис.2. Ггногеогра$ическая карта основных мутаций^у?-глооииового

гена в странах Средиземноморского бассеина, Ближнего Востока и Азероаилжанской Реепуолики.

Х.Португалия. ¿.Испания. З.Юг Франции. 4.о-з Сардиния (.Италия). 5.Тунис. 6. Италия. 7.Греция. 8.Турция. 9.о-в Кипр. 10.Ирак (Курдистану. II.Ливан. 12.Азербайджан. 13.Югославия. 14. Болгария.

.»а 1

не уделгифици-рованяые

- tí -

oKoi! Республики и сравнительная геиогеографическая карта основных нутаций J -глобинового гена в странах средиземноморского бассейна,Ечижнего Востока и ЛгербаМдзанскок Республики,соответственно.

Преимущество составления геногеографической карты заключается в том, что знал регион республики, откуда пациент, или лее зная к какой этнической группе они относятся, мохно целенаправленно нспользовагь те аллолъ-спетфпеокле олнгоиуклеотщцшэ прай-меры, которцо характерные для мутаций данного региона или же этнической группы.'Этот подход позволяет нам сократить время работы по идентификации мутацийJ3-глобинового гена у супругов п следовательно сокращает ирсмя подготовки к пренатальнои диагностики плода с использованием иолекулярно-генеткческих методов. Такая тактика позволяет без опоздания в первом триместре беременности (до 12 иедой.) провести ДИК-диагностику плода.

Способ диагностinm нутации 8-го кодона С-АА) р-глобинового гена.

Разработал нерадиоадтквнни электрофоретнческии метод диаг-постики мутации кодона &(-Ak)Ji -глобинового гена, что мо~ет быть использован при медико-генетическом консультировании, в частности в проведении пренатольной диагностики данной мутации у плода.

Целью разработки является быстрое и упрошенное перадиоактив-ное электрофорегическое определение мутации 8 кодона (-АА)J -гло-биноього гена.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения мутации 8 кодонаj -глобинового гена амплифшеат подвергается электрофоре зног/.у разделе ниш па 8/5-м полкакрллаг.'ддном геле при напряжении 150 В, силе тока 22 мА. Окраску разделенных фрагментов алплифтшага производят еодным раствором эгвдиум бромида, что делает метод безопасным и простым в исполнении.

Сущность способа заключается в том, что из 0,5-1 мл целью" крови выделяют клеточную ДИК. Затем с помощью двух комплементарных олигопуклеотящшх зондов j, AIS и К37 (0,6 мклДи) буфера, всех 4-х дезоксинуклеотндов п фермента термофильной ДНК - поли-меразы проводят амплификации - полиыеразную ценную реакцию ("раг-мента J -глобинового гена, где расположена мутация. После электрофореза наличке (йракции ДНК (агликфиката) данной 200 пар нук-леотндов свидетельствует о наличии мутантного гена с деление:; ■2-х пуклеоткдог. (-АА) в коконе- 8 í -глобинового гена. Фрадщл

размером 202 пар нуклестддов свидетельствует о норме.

Интерпретацию результатов проводят следующим образом: у здоровых людей наблюдается наличие одной фракции длиной 202 пар нук-леотндов. Наличие одной фракции с длиной 200 пар пуклеотидов свидетельствует о гомозиготном состоянии мутации кодона 8 (-ЛА) у обследуемого и имеет гелотип -У гетерозигот отличаются две полосы с размерами 200 и 202 пар нуклеотвдов. (уЛ8/у?°8).

Упразднение процедур в прототипе: перенос амплифкката фрагмента ДНК на нейлоновый (¡исьтр, предгибрэдязация,гибридизация о радиоактивным олигонуклеотиднш зондом, приготовления этого зонда, ауторадиогра^яя значительно сокращает время определения мутации 8-го кодона (-М)j -глобинового гена o-í 5-6 дней до" 1-2 дней. При этом сокращается большое количество приборов п химических реактивов с сохранением точности определения.

Таким образом, предлагаемый способ о сохранением точности значительно ускорит и упрости? диагностику вышеописанной мутации в медико-генеигческпх консультациях.

Пренетальная диагностика гемоглобинопатий.

Из-за отсутствия элективного лечения, единственный правильный путь борьбы с наследственной патологией является пренатальпая диагностика плода, который производится в семьях, имеющих генетический риск рождения больного гемоглобннопитий ребенка. В случае выявления наследственной патологии у плода производится прерывание беременности с согласия супругов. Для пренататьной диагностики плода использованы белковые и молекулярно-генетические методы исследований. В первом случае объектом для исследований явилось пуповкнная кровь плода, получаемая кордоцептезом. Забор пуповидной крови производили при сроках 20-24 недели беременности. Лдя анализа пуповинной крови использовали кетод биосинтеза цепей глобина.

¡.¡олекулярно-гечетические исследования проводили на молекулах ДНК, внделешня из клеток ворсин хориона и фибробластов ан-тютическо;; шдкосги. Saóop которых производили при сроках 310 и 16-20 недель беременности, соответственно.

Как в:дао из рисунка 3, молекулярно-генетические исследования включали пряше и косвенные метода диагностики. К пря1»км методам относятся: аллель-спешфгаеская олгсгопуклеотддпая гибридизация, а татке ггоедаояошшП нами способ Екяшепия мугацкй кодона О (—АЛ) в -глоб'лового гена. К косвегшил иетодяк относится -

КОРДОЦЕПТЕЗ (20-24 вед.)

Х0РИ0ЦЕКТЕЗ (8-10 нед.)

АШИОЦЕНГЕЗ (16-20 нед.)

Ьделенке ДНК Í

Агжтафикация - ПЦР

• . V

а) Биооинтез цепей глобина (БЦГ)

б) су'бгаплотирование

в) Аллель-спещ-фячеокая ojcrro-вуклеоткдная гибридизация (ASO)

г) Электрофорез (предложенный метод)

0

1

Рис.3 Схема проведения пренатальной диагностики плода при гешглобинопатиях.Бачковые методы диагностики: а)БЦГ; а такке шлекулярно-гепетические: б) субган-лотировапие; в) ASO; г) электрофорез

субгаплотипированне.

Ниже приводим результата пренатаяьной диагностики двух семей с риског.1 ролсденля больного талассемиай ребенка.

Беременная М.Н.1964 года роздепия и её мук И.Н. 1960 года ровденшг не состоят в кровном родстве. Имеют дочь 5 лот с клинической картиной больной^-талассешя (анемия Кули), Девочка получает ежемесячные переливания крови. Настоящая беременность у жешцшш - шестая. Кз пяти предыдущих одна закончилась родами, четыре тоследуэдих - искусственными абортами, и последняя беременность протекает без ослогшопий. При ультразвуковом исследовании плода видимо 15 патологии по обнаружено, (фотометрические показатели соответствовали 23-недельлой беременности. Плацента располагалась на передней стопке матки и на дне.

Кровь из луговинной вепн в количестве 0,5 мл была получепа с помоиыо спм-нлопгоной иглы & 22 под контролем секторного датчика на ультразвуковом аппарате "ТоапЗа 38$". Ез помещали в раствор ЭДТА н анализировали на автоматичеоком счетчико.

В результате гематологического обследования родит&тей била выявлена гинохромиая микропдтарная анемия с швшеннш уровнем Нв ¿2 и подтверждено носительство гена у -талассеши.

На_ рисунке 4 приведены результаты хроматографкческого разделения цепе;' глобина из крови плода. Видно, что у ютода синтезируются у-цёпа глобина, Соотношение^/¡>¿{-0,074 соответствует гомозиготной^з-талассеши. Однако галичие^в-глобиповнх цепей, несовершенное разделение^- и^-пиков, отсутствие данных о ти-пе^-талассемзгй у больной дочери, потребовали провести аналогичный анализ у ней, чтобы исключить гегерозиготность в случае^ -талассишй. В результате исследования у девочки выявлена большая / -талассемпя с соотноиенпем новосинтезировашшх глобшювнх цепей =5,15 к^/ не«( =1,62 (рис.5).

Беременность была гфервана в 25 недель. В случае, наступления следующей беременности сеже рекомендовано повторное образовав с целью цренатачыюй диагностики в I триместре для анализа ДНК из ворсин хориона галекулярпо-гепотическики метода!,аз.

Таким образом, с помощью кордоцентеза и методов биохзтичес-кой диагностики, осуществлена пренагальная диагностика гомозиготной ^5+-талассешей, что позволило предотвратить розденпе больного ребенка с тетелой наследственной патологией.

Тестирование мутацииу-глобшювого гена в семье показал, что отэц Ы.П.является готерокиготои по мутации -ХУЬ'-Г-ИО

Wûâr

500

Рло.4. • ïco:.!2Torr)aji4aoK03 разделение - гло6::';оеух цепе:'; лз пупоз:: коозл плода в со.мьэ iio ооа ордзкато- рад.".оактг.внозть (л;.:п./;,ин. -ICr)йо осл абсцлсо-■ номер■фракции.

Ул

Рлс.5.

-н-1----—■ I..... I-

zo w 60 во

ХроматогоагЪзесксе разпзленае глобг.новых цепел из" проз:; больно': ?аласае:.'.П5-": в се.мьэ M, ~ По ооп орд'.'.нат - оадооаккззость (пап/шк. • 10°) по ос:;- айсцзсс - но.'.'.зр ".ракаса.

мать.М.Н. -гетерозиготои по мутанли ~^0-1У5~2-1, следовательно, ' больной ребенок является компаундом с генотипом л+ -I7S -1-110/ f- US -2-1. J

Приблизительно год спустя семья ¡¿.повторно обратилась в Ш1 института для прогноза потомства, В момент охранения Í.Í.H. тела беременность 8 недель. Зная мутацию - глобпнового гена у супругов ревгиля провести пренатальной диагностики шгода с использованием прямого метода обнаружения мутации на уровне ДНК, выделенной из ворсин хоршяа. Был проведен забор ворсин хориона.

Олигоиуклеогвдная гибридизация с использованием двух мече-ннх радиоактивным (Р32) олигоиукдгеотидных зондов:-2-1 к j.^-173 —I—110 показало отсутствие сигнала и специфической окраски на рептгенплеике п йотьтра, соответственно. Полученный резулъ-тат свидетельствовал, о том, что плод оказался не больным, т.е. плод клал здоровы» генотип^ ^.

Лля верификации ранее полученного результата !'.Н. была госпитализировала в родильное отделение Института для родов. М.Н. родила в срок девочку. Вес - 3400г.,рост - 49см. При родах из пуповины новорожденной взяли кровь дош диагностики патология. Тестирование мутаций^ °-iys -2-1 и а+ - Ш5 -I-II0 не показало соответствующих сигналов на рентгешиенке и не сформулировало голубого' цвета на фильтрах.

Путем обращения семьи А.выявлена, что семья имеет риск рождения больного ребенка с диагнозом^ -талассемий; А.Г.' имела беременность 8 недель. Семья А. - внходцы из Кабашшского района республики - проживает в г.Баку. Не состоят в родственном браде. Медико-генетическим консультированием семьи А. выявлено двое больных детей с диагнозом больная галассешя - анемия Кули(рис. 6).

///

т

I

's

Рис.6.' Родословная семьи А.

Молекулярно-генетические исследования выявили иосительство мутации (-М) 8 кодонаJ- глобшювого гена у супругов и гомози-готнооть по данной мутации у болышх детей.

Супруги дали согласие на проведение пренаталъной диагностики плода. При сроке беременности II недель произведен трансабдо-миналышй забор ворсин хориона. После амплификации ДНК, выделеп-ной яз ворсин хориона образцы гибридизпровали олигонуклеотидами, меченными радиоактивными (Р^2). Результаты гибридизации показа- ли,сигнал для зонд в°8, Это свидетельствовало о том, что плод имеет гомозиготное состояние талассемического гена с генотипом

ft°8/a°8.

* ^ Ломимо аллель-специфической олшчшуклеогвдной гибридизации для ранее известной мутации амшшфкцировашше образцы ДНК

ворсин хориона обследованы путем электрофореза на В% НАГ. Элек-трофоретическое разделение ампгафицировашшх образцов фрагмента генаj-гжобтоъото гена показало наличие амдлифицированной фракции; длиной 200 п. п.,что свидетельствует о.мутации 8 кодона (*°8). Беременность била прервана при сроке 13 недель. Результаты верификации на уровне материала абортуса подтвердили пренатальнне исследования. '.

Таким образом, постнаталышй анализ полностью подтвердил результаты, полученные исследованием ДНК из ворсин хориопа.

Впервые, применяя этот метод, проведена пренатальная диагностика и предогвращено рождение больных талассешй детей.

Таким образом, используя молекулярно-генеткческие методы диагностики, изучена характеристика (тип и частоты) и гепогеог-рафия мутацииJ— талаоешй у населения двух регионов Азербайджана, а гакяа внедрением разработанного наш нерадиоактпвного электрофоретйческого метода диагностики мутаций 8-го кодона^- • глобииового гена проведена пренатальная диагностика талассешй в первом триместре беременности.

Изучение молекулярно-генетической характеристики мутаций ■ ^-глобииового гена в конкретных регионах республики повысит эф-фектнвиость генетического консультирования, проведения пренаталъной диагностики и лечения.

ВЫВОДЫ

1. Используя молекулярно-генетические метода диагностики, установлена характеристика и геногеография мутации^у?-глобилового гена у населения Кпрдшлнрзкого и Кабашшского районов Азербайджана, посредством пренататыюН диагностики у-талассемий у плода. J

2. Идентифицировало четыре мутацийJ— глобинового гона: дсленион-лая мутация, приводящая к сдвигу рамки считывания - деления динуклеотида - АА в кодоне S, за!,юна нуклеотида Г-А в первой позиции второго пнтрона приводящая к нарушению процессинга mPíK с фенотипами 1уЗ°-талассо;л:ш. Осталыше генные мутации -а+-175 -I-II0 (Г-А) иу - IYS -Г-б (Г-Ц) имели фенотипj>+ -татассемии. Установлены частот цугацшг: л°8-79,2%,л°-1УУ -2-1 - -I-II0 - 4,2,5,^ -1УГ-1-6 - 8,5?.

3. Составлена геногеографическая карта для четырех мутации мигв-чапдая 70 талассемкческлх генов из двух регионов республшш, дащая возмодность использовать те аллеяь-спещкТические олиго-нуклеотидиые праймеры, которые характерны для мутаций присущи больным данного региона.

■4. На основе разработанного наг/л нерадиоактивного электрофорети-ческого метода диагностики мутации С кодона (~АА)^-глобиново~ ' го гена впервые, проведена пренатальная диагностика плода и предотвращено ротгдеште больных тшгассеши детей.

5. Используя современные молекулярпо-генетические метода диагностики в первом триместре беременности на уровне ДНК выделенных из ворсин хориона проведена пренатальная диагностика -талассегтт.

6. Используя метод бкоскнтеза цепей глобина проведена пронаталь-ная димностжа^'-танассеши во втором триместре беременности (23-24 иед.) на уровне крови плода. Установлена соотпош-

цепей глобина, при гетерозиготном состоянии глода noji -талассеми-.

ИРЕДЛОЗЗЗй'Ш!

Учитывая тенденцию повьшенкя частота встречаемости f - та-

лассе:.ши в республшсе, а такхе упорядочения учета и диагностики

данного заболевания,предлогам:

I. Проводить повсеместно прггаудптсльнуп сдачу крови г гпдя-

ко-генеткческих консультациях республики у людей вступающих в брак.

Необходимость этого мероприятия заключается в том, чтобы при первых триместрах беременности можно бвло бы заранее (с согласия супругов) предотвратить нежелательные последствия возможные поело родов,

2. Использовать в медико-генетических лабораториях, амбулаториях и поликлиниках республики, разработанный наш норадиоак-• тивный электрофорегический способ определения мутации 8 кодона J- глобинового гена.

СЛИСОК работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Алиева К.А., Раоулов Э.М;, "Новый нерадиоактивный способ выявления мутаций 8-го кодона (-АА)^ -глобинового гена" //Депонировано во НШТИ,1332,}г 1875.

2, Алиева К.А.,-Раоулов Э,!.!., Кулиев P.A., Себальоо Э.Э. "Молэкулярно-генатичеокая характеристика мутацийJ -глобинового гена у Населения Кюрдагафского района Азербайджша", // Вестник Бакинского Университета,19Э2, К I.

3, /лиева К.А., Расулов Э.М. "Характеристика мутацийJ -талаосемга у населения двух регионов Азерба5!дг;:анской Республики", Аз.мед.курнал,' в печати.

4. Раоулов Э.М.,Алиева К.А., Кулиев P.A. "Применение некоторых методов для пренатальной диагностики наследственных анемий", Вестник Бакинского Университета, 1992, Jf I.

d