Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-филогенетическое исследование видов подрода Esula Pers. рода Euphorbia L.

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-филогенетическое исследование видов подрода Esula Pers. рода Euphorbia L."

На правах рукописи

Крюков Алексей Анатольевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВИДОВ ПОДРОДА ESULA PERS. РОДА EUPHORBIA L. (EUPHORBIACEAE JUSS.)

03.02.01. - «Ботаника»

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 г ДЕК 2013

Санкт-Петербург - 2013

005543419

005543419

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботаническом институте им. В.Л. Комарова Российской академии наук.

Научный руководитель

кандидат биологических наук Гельтман Дмитрий Викторович

Официальные оппоненты:

Лоскутов Игорь Градиславович,

доктор биологических наук, доцент, Государственное научное учреждение «Всероссийский институт растениеводства им. Н. И. Вавилова» Российской академии сельскохозяйственных наук, заведующий отделом Матвеева Татьяна Валерьевна,

кандидат биологических наук, доцент, Федеральное государственное образовательное учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет», доцент

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Главный ботанический сад им. Н. В. Цицина Российской академии наук.

Защита состоится 25 декабря 2013 г. в 14 час. на заседании диссертационного совета Д 002.211.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботаническом институте им. В. Л. Комарова Российской академии наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 2. Тел. (812) 372-54-06, факс (812) 372-54-43.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Ботанического института им. В.Л. Комарова Российской академии наук.

Автореферат разослан « 7_0» ноября 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

О. Ю. Сизоненко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение систематики и филогении крупнейших родов цветковых растений в настоящее время оформилось в особое, активно развиваемое научное направление. Род молочай (Euphorbia L.) насчитывает до 2000 видов (Oudejans, 1990), широко распространенных в тропических, субтропических и умеренных областях Земного шара. По богатству жизненных форм этот род превосходит все остальные роды семейства молочайных. Виды рода объединяет удивительное однообразие особой структуры, промежуточной между цветком и соцветием — циатия.

Первый и единственный на сегодняшний день обзор рода в полном объёме выполнил Э. Буасье (Boissier, 1862), который отнёс к нему 723 вида, разделив их на 27 секций. Существенный вклад в построение системы рода внёс Я. И. Проханов (1949, 1964) подготовивший его обработку для «Флоры СССР». Система рода и входящих в его состав подродов неоднократно менялась; недавно Д. В. Гельтман (2007) на основании морфологических данных отнес евроазиатские виды изучаемого нами подрода Estila Pers. к 10 секциям.

Новым этапом в изучении систематики и филогении молочаев стали моле-кулярно-филогенетические работы, основанные на анализе и сравнении внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) гена 5.8S рРНК, а также некоторых хлоропластных генов (Molero et al., 2002; Steinmann, Porter, 2002; Bruyns et al., 2006; и др.), что дало новые результаты, в ряде случаев существенно отличающиеся от принятых ранее. Наша работа находится в общем русле этого направления исследований.

Цель и задачи исследования. Цель работы: используя методы молекулярной филогении, исследовать филогенетические отношения видов подрода Esula рода Euphorbia, определить степень родства и положение их на филогенетическом древе, сравнить полученные данные с имеющимися системами подрода.

Задачи исследования:

1. Провести секвенирование и сравнительный анализ района ITSl-ген 5.8S pPHK-ITS2 ядерных генов 45S рРНК у ряда представителей подрода Estila рода Euphorbia, выявить частоту и спектр мутаций в этих районах и, используя методы молекулярной филогении, реконструировать возможные филогенетические отношения внутри исследуемой группы.

2. Провести анализ полученных филогенетических деревьев и их сравнение с имеющимися системами подрода, основанными на классическом подходе, предложить изменения этой системы.

3. Провести специальное молекулярно-филогенетическое исследование видов секции Holophyïïiim (Prokh.).

4. Построить вторичные структуры ITS1 и ITS2 для исследуемых видов и провести их анализ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Подтверждена монофилия подрода Esula, в его пределах выявлены две большие клады, которые, скорее всего, отражают давно сложившиеся линии его

эволюции. Молекулярно-филогенетические методы подтвердили обоснованность лишь части секций подрода, ранее выделенных на основании морфологического подхода.

2. Переход от многолетней к однолетней жизненной форме в подроде Esula происходил неоднократно, поэтому нецелесообразно выделение секций и подсекций, обоснованных в основном по этому признаку.

3. Крупные делеции и вставки нуклеотидов в последовательностях ITS1 и ITS2 чаще всего конвергентны и происходят на определенных участках.

Научная новизна и практическая значимость работы. Секвенирован район ITS1—5.8SpPHK-ITS2 ядерного гена 45S рРНК у 93 видов подрода Esula, принадлежащих ко всем секциям подрода, распространенным во внетропиче-ской Евразии, в том числе для 74 видов — впервые. Также впервые было показано достоверное деление видов подрода Esula на ряд клад, при этом лишь некоторые из них соответствуют секциям, выделяемым по морфологическим признакам, а также показано, что переход от многолетней формы к однолетней происходил в подроде Esula неоднократно.

Сведения, полученные при выполнении работы, могут быть использованы при молекулярной идентификации видов подрода, имеющих практическое значение (в первую очередь лекарственных), а также при разработке учебных курсов по систематике и молекулярной филогении растений.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на совместном семинаре лаборатории биосистематики и цитологии и отдела Гербарий высших растений Ботанического института им. В. JI. Комарова РАН. Материалы диссертации также были представлены на I (IX) Конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (С.-Петербург, 2006), конференции по систематике и морфологии растений, посвященной 300-летию со дня рождения К. Линнея (Москва, 2007), на рабочем совещании «Молекулярные методы в ботанике» (Москва, 2008), XV Всероссийской молодёжной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2008), на XII делегатском съезде Русского ботанического общества (Петрозаводск, 2008), XII Московском совещании по филогении растений, посвященном 250-летию со дня рождения Георга-Франца Гофмана (Москва, 2010), VI и VII конференциях по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений (Санкт-Петербург, 2009 и 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 в изданиях из списка ВАК, из них 1 — в журнале, реферируемом библиографической системой «Сеть науки» (Web of Science).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 115 страницах и состоит из введения, 4 глав, раздела «Основные результаты и выводы», списка литературы и приложения. Список литературы насчитывает 85 источников, в том числе 55 на иностранных языках. Текст диссертации содержит 34 рисунка и 9 таблиц (из них 4 рисунка и 3 таблицы в приложении).

Благодарности. Хочу поблагодарить моего научного руководителя Д. В. Гельтмана за предложение интересной темы исследования, помощь и поддержку в процессе всей работы. Хочется также выразить признательность

А. В. Родионову, заведующему лабораторией биосистематики и цитологии БИН РАН, на базе которой производилась работа — за отеческое участие и помощь. Также благодарю сотрудников лаборатории за помощь и полезные советы в работе, а в особенности Э. М. Мачса, Е. С. Ким, Е. О. Лунину, H. Н. Носова. Отдельную благодарность хочу высказать своему самому первому научному руководителю И.С. Антоновой за первый научный опыт и предоставление возможности стать ученым.

Работа была поддержана проектами Российского фонда фундаментальных исследований 04-04-48758-а, 07-04-00848-а, 10-04-00290-а, 08-04-91103-АФГИР_а.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Кратко охарактеризован род Euphorbia, основные проблемы его систематики, выделены важнейшие направления его изучения. Одно из них — определение объема рода и его разделение на подроды. Другое — изучение отдельных внутриродовых групп (подродов, секций), а также видового разнообразия рода на отдельных территориях.

В диссертации кратко рассмотрены основные работы по систематике рода за последние 260 лет (Linnaeus, 1753; Desfontaines, 1804; Persoon, 1806; Haworth, 1812; Roeper, 1824; Dumortier, 1827; Meyer, 1833; Koch, 1837; Boissier, 1862, 1879; Проханов. 1933, 1949, 1964 и др.). Особо отмечено значение работ Я. И. Проханова (1949, 1964), на основе системы которого основан ряд современных точек зрения (Гельтман, 2007; Байков, 2007 и др.). Д. В. Гельтман разделил евроазиатские виды подрода на 10 секций.

Начиная с 2002 г. род исследуется и молекулярно-филогенетическими методами. Важнейшей в этом отношении является работа Steinmann, Porter (2002), где предложена концепция монофилии рода и его разделения на 4 клады (А, В, С и D), которые в дальнейшем были соотнесены с подродами (Bruyns et al., 2006). Показано, что до начала исследований, отраженных в данной диссертации, подрод Esuïa рода Euphorbia был незначительно исследован молеку-лярно-филогенетическими методами.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для проведения основной части исследования и построения филогенетических деревьев, представленных в диссертации, были отобраны фрагменты гербарных образцов и высушенные в силикагеле фрагменты листьев (всего 56 образцов), принадлежащих к 53 видам подрода Esula рода Euphorbia. Помимо этого, в анализе была использована информация из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) по 50 образцам (включая образцы из внешних групп), относящимся к 48 видам. Таким образом, всего в наш анализ, использованный для филогенетических реконструкций, был включен 101 вид, представляющий как все 10 секций подрода, принятых Д. В. Гельтманом (2007), так и ряд видов (главным образом американских и южноафриканских) секционная принадлежность которых на момент начала исследования была неясна. За все время исследования нами получены данные по ITS-последовательностям 93 видов молочаев из подрода Esula (для 74 впервые).

Выделение геномной ДНК производилось из высушенных растительных тканей по СТАВ-методу М.А. Сагхай-Маруфа и соавторов (Saghai-Maroof et al., 1984), модифицированному Дойлами (Doyle, Doyle, 1987), с незначительными модификациями (Родионов и др., 2005). Амплификация участка гена пре-рРНК проводилась с помощью ПЦР по стандартным методикам (Mullis et al., 1986). В качестве прямых праймеров, комплементарных участку гена 18S рРНК, использовались олигонуклеотиды ITS5 5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3' (White et al., 1990) или ITS1-P 5'-aaccttatcatttagaggaagg-3' (Ridgway et al., 2003). В качестве обратного праймера во всех случаях использовался олигонуклеотид ITS4 5'-tcctccgcttattgatatgc-3' (White et al., 1990), комплементарный участку гена 26S рРНК. Полимеразная цепная реакция производилась на амплификаторах «PCR-Sprint» (Hybaid Inc., Великобритания), «Techne ТС412» (Barloworld Scientific, Великобритания). Параметры циклов амплификации: 1 цикл: 5 мин 94 С; 35 циклов: 1 мин 94 С, 1 мин 56-58 С, 1 мин 72 С; 1 цикл: 10 мин 72 С.

Выделение и очистка полученного амплифицированного участка из ага-розного геля проводилось согласно методике Фогелынтайна и Джиллеспи (Vogelstein, Gillespie, 1979), в том числе с использованием QIAquick GelExtraction Kit («Qiagen», Германия).

Установление нуклеотидной последовательности производилось с помощью секвенирования с использованием флуоресцентно меченых терминирующих элонгацию аналогов нуклеотидов, согласно методу Ф. Сэнжера и соавторов (Sanger et al., 1977).

Анализ электрофореграмм проводился автоматически с последующей визуальной обработкой с помощью программы SeqScan v. 1.2.2 («Applied Biosystems», США). Анализ хроматограмм и перевод в нуклеотидную последовательность проводился с помощью программы Chromas v.2.23 («Technelysium Pty Ltd», Австралия). Выравнивание полученных последовательностей также выполнялось с помощью пакета программ MEGA 4-5.01 (Tamura et al., 2011) и корректировалось вручную.

Анализ матрицы данных проводился с помощью пакета программ MEGA 4-5.01 (Tamura et al., 2011). Молекулярно-филогенетические деревья строились методами максимального правдоподобия и максимальной парсимонии с помощью того же пакета программ, полученные деревья тестировались бутстреп-методом с числом репликаций от 1000 до 15000 (Felsenstein, 1985). Кроме того, была использована программа mrbayes-3.1.21 для построения деревьев по методу Байеса. Указанные методы построения деревьев дали в общем сходные по топологии результаты, а для филогенетических реконструкций было использовано дерево, построенное по методу Байеса.

Возможные вторичные структуры РНК рассчитывали с помощью программы RNA Structure v. 4.5 (Mathews et al., 2004), работающей на основе алгоритма Цукера (Zuker, 1989; Zuker et al., 1999).

ГЛАВА 3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ ВИДОВ ПОДРОДА ESULA РОДА EUPHORBIA 3.1. Результаты

3.1.1. Общая характеристика изученных последовательностей ITSl-ген 5.8S pPHK-ITS2 видов подрода Estila рода Euphorbia

Протяженность матрицы данных после выравнивания нуклеотидных последовательностей составила 717 позиций от мотива TCGAAACC до GCGACC включительно. В выравнивании оказалось 468 вариабельных позиций. В матрице данных представлены ITS1 (1-300 позиции) и ITS2 (465-717 позиции). Таким образом, длина гена 5.8S рРНК между ITS1 и ITS2 составила 164 позиции.

Нуклеотидная последовательность гена 5.8S рРНК весьма консервативна. По всей длине этого участка у исследованных видов имеются всего три одно-нуклеотидные делеции и лишь в 25 позициях имеются замены одного нуклео-тида на другой (большинство — единичные). Имеются и «кладоспецифичные» замены в 301, 394, 403, 432, 433,437 позициях. Поскольку мутации на этом участке генома происходят весьма редко, замены, которые наблюдаются в группе видов и отсутствуют у видов ближайшего окружения, могут быть маркером для выделения монофилетических групп и быть основанием для выделения соответствующих клад или субклад.

Длина ITS 1 у рассмотренных нами видов варьирует от 202 пар нуклеоти-дов у Е. exigua L. до 267 у Е. condylocarpa Bieb. при общей длине выравнивания в 300 позиций. Такая высокая вариабельность последовательностей ITS1 у видов подрода Estila обусловлена большим количеством вставок и делеций, в том числе и крупных. Самая крупная делеция представлена у Е. exigua — 49 пар нуклеотидов с 110 по 176 позиции выравнивания. Встречаются вставки до 7-8 нуклеотидов (в обоих ITS), которые обнаруживаются обычно на концах шпилек вторичной структуры ITS или между шпильками (т. е. в неспаренных участках последовательности). Обычно эти вставки — треки polyA. Процентное содержание G+C в ITS1 изучаемых последовательностей варьирует от 51.6 у Е. pekinensis Rupr. до 70.4 у Е. lathyris L..

Длина ITS2 у рассмотренных видов варьирует от 211 пар нуклеотидов (у Е. antiquorum L. — внешняя группа) до 235 пар (у Е. trichotoma Kunth) при общей длине выравнивания в 253 позиции. Крупные делеции и вставки в ITS2 наблюдаются реже. Содержание G+C для всех образцов по ITS2 варьируют от 55.6% у Е. procera Bieb. до 76.2% у Е. lathyris. Видно, что содержание G+C в ITS2 выше, чем в ITS1, возможно это способствует лучшей стабильности вторичной структуры ITS2.

У всех исследованных видов в ITS1 содержание А больше, чем Т; в большинстве случаев наблюдается превышение почти в два раза. С другой стороны, в ITS2 наблюдается обратная картина: у 95 процентов исследованных видов содержание Т больше чем А (для G и С таких зависимостей не наблюдается).

Для изучения межвидовой изменчивости ITS1 и ITS2 с помощью пакета программ Mega 5.01 были рассчитаны p-distance (п-расстояния). Максимальные р-distance внутри изучаемого подрода достигают 0.46 между Е. deflexa Sibth. et Sm. и E. altaica Ledeb., что говорит о значительной вариабельности видов подрода Esula

по этому признаку, сравнимой с изменчивостью внутри отдельных родов. Анализ значений p-distance показывает, что в пределах клад (которым соответствуют секции) в подроде Esula изменчивость ITS может достигать 10% или несколько больше, и лишь в отдельных случаях может значительно превышать это значение. Например, ITS видов из секции Chylogala (Fourr.) Prokh. (попавших в одну кладу) имеют значительные различия: p-distance между ними достигает 0.20 и это очевидным образом отражается на филогенетическом древе.

3.1.2. Вторичные структуры ITS-последовательностей

Были построены вторичные структуры ITS-последовательностей и проанализирована локализация делеций и вставок на них.

Рис. 2. Вторичная структура ITS1 Е. borealis Baikov. Линиями показаны участки делеций у видов, для которых они характерны, стрелкой показано место вставки трека poly - А.

Рис. 3. Первая шпилька в ITS2 Е. heteradena Jaub. et Spach и E. segueriana Necker. Линией показана вставка трека poly - А.

i».-

"А-

Делеции и вставки являются источником разнообразия вторичных структур ITS-последовательностей. Крупные вставки — треки polyA — встречаются или между шпильками, или на их концах. Крупные делеции, в свою очередь, играют важную роль в укорачивании шпилек. Знание этого может помочь в более достоверном выравнивании сложных участков последовательностей с крупными делениями, что дает возможность более адекватного построения филогенетических деревьев.

3.1.3. Филогенетические реконструкции

Основное филогенетическое дерево подрода Esiila в диссертации построено методом Байеса (рис. 4). Виды подрода Estila разделяются на 2 хорошо выраженные клады, которые мы далее будем называть В-1 и В-2, имея в виду, что все изучаемые виды относятся к «большой» кладе В, ранее выделенной Steinmann, Porter (2002). Каждая из клад, в свою очередь, разделяется на несколько субклад, которые мы обозначаем латинскими буквенными индексами.

В кладу В-1 попали 39 образцов видов, которые в системе Д. В. Гельтмана (2007) относятся к секциям Chamaebuxus Lázaro, Helioscopia Dumort. и Holophyllum, а также два макаронезийских вида (Е. mellifera Aitón = Е. longifolia Lam. и Е. stygiana H.С. Watson), традиционно относимых к секции Baisamis Webb et Berthelot. Клада В-1 с хорошей поддержкой (при анализе всеми методами) разделяется на 3 субклады, обозначенные здесь как В-1а, В-lb и В-1с.

В субкладу В-1а попало большинство видов клады, которые принадлежат главным образом к секции Chamaebuxus, три вида — к секции Helioscopia и два уже упомянутых представителя секции Baisamis. Внутри этой субклады устойчиво группируются восточноазиатские виды Е. pekinensis, Е. lucorum Rupr., E.jolkinii Boiss. и E.fauriei H. Lévl. et Vaniot. С достаточно хорошей поддержкой объединяются узкий кавказский эндемик Е. eugeniae Prokh. и среднеазиатский Е. alatavica Boiss.

Мелкие средиземноморские кустарники и полукустарнички Е. acanthothamnos Heldr. et Sart. ex Boiss., E. spinosa L. и E. glabriflora Vis. с небольшой поддержкой объединились с E. condylocarpa. Метод максимальной парсимонии показал объединение только первых трех видов из этой группы, а Е. condylocarpa отстоит отдельно от других трех видов. Метод максимального правдоподобия показал объединение только Е. spinosa и Е. glabriflora.

Американские однолетники Е. spathulata Lam. и Е. alta Norton неожиданно объединились в субкладу с азиатским Е. transoxana Prokh. и средиземноморским Е. oblongata Griseb.. Такое объединение показал только метод Байеса, остальные методы показывают объединение только Е. spathulata и Е. alta.

На деревьях, полученных всеми методами, с хорошей поддержкой морфологически довольно близкие между собой виды Е. palustris L., Е. procera Bieb., E. semivillosa Prokh., E. valdevillosocarpa Arvat et Nyárády, E. lamprocarpa (Prokh.) Prokh. и E. aristata Schnalh. группируются вместе с заметно отличающимися от них Е. pilosa L. и E. epithymoides L.

E.epithymoides M) + E.epithymoides (2) + E.semíVillosa + E.valdevillosocarpa -E.procera + E.palustris + E. pilosa E.pilosa + E.lamprocarpa + E.anstata + E. squamosa + E.dulcis + E.transoxana +

E.oblongata _

E.spathulata E.aita

E.condylocarpa+ E.acanthothamnos E.glabriflora +

E.spinosa _

E.mellifera E.styg¡ana_

I Hei

E.eugeniae + E.alatavica + E.orientalis E.depauperata E. jolkinii

E.lucorum E.pekinensis (11 E.pekmensis (2) E.faunei

E.alta¡ca_+_

E.stncta E.stncta + E.hehoscopia E.helíoscopia + E.sarawshamca + E.komaroviana + E. rupestns + E.charac¡as + E.macroceras + E.oblongifolia +

E.amygdaloides-

E.exigua + Pep

E.megalatlantica I E. medicaginea Pep

E.dendroides_|

E.mau Titánica | E.schimperi E.stolonifera_I

Bal

I B-lb

Bal

E.turczanmowü Pep E.kraussiana i

E.genistoides Esu_?

E.emirnensis-I

E.síeboldiana_ Esu_S

E.octoradiata E.esula(2) E.lunulata E.nakaü E.tschu¡ensis + E.esula(1) + E.uralensis + E. lucida + E.dubovikiae + E.discolor E.iatifolia + E.agraria + E.caesia + E.borealis + E.leptocaula +

С n.Thf-l-f i

Ё ! s¿"dvltsiT+ Pep E.tnchotoma NA E.portlandica + Her E.paraUas+ Pai_P., E.deflexa + Her E.taur¡nensis+ Pep E.robusta NA „ E.peplus_Pep

Eihet'eradena+ Chy

E.segueríana + E.pannonica + E.petrophylla + E. stepposa+_

Рис. 4. Филогенетическое древо. Анализ по Байесу. Подрод Esula - клада В. Буквы в самой правой колонке указывают на клады. В колонке левее указаны сокращения названий секций (по Гельтману, 2007): Cha - Chamaebuxus, Hei - Helioscopia, Bal - Baisamis, Hol -Holophyllum, Esu_P - Esula, подсекция Patellares, Pep - Peplus, Her - Herpetorrhiza, Tir - подрод Tirucalli, А - Африканские виды неясного секционного деления, Esu_? - Esula, подсекция неясна, Esu_S - Esula, подсекция Sieboldianae Prokh., Esu E - Esula, подсекция Esula, Chy - Chylogala, Par_M - Par alias, подсекция Myrsiniteae, ParC- Par alias, подсекция Conicocarpae, Lat - Lathyris, NA - виды неясной секционной принадлежности. Цифрами указаны индексы достоверности. Знак + около названия вида показывает наши данные.

Субклада B-lb содержит только Е. helioscopio L. — типовой вид секции Helioscopio, в то время как другие виды из этой секции попали в субкладу В-1а. Субклада В-1с состоит только из видов секции Holophyllum. Такой результат наблюдается на всех построенных деревьях.

Клада В-2 выглядит намного разнообразнее и включает в себя большое количество видов из различных секций.

Субклада В-2а образована видами подсекции Patellares Prokh. секции Esula (Pers.) Dumort., которые при любых вариантах выравнивания и параметрах построения деревьев объединяются с очень высокой поддержкой.

Субклада В-2Ь весьма разнообразна и включает, с одной стороны, макаро-незийские и южноафриканские древесные и полусуккулентные виды (большинство их традиционно относились к секции Baisamis, некоторые — к подроду Tirucalli Boiss.), а, с другой, преимущественно средиземноморские травянистые виды: однолетники Е. medicaginea Boiss., Е. tiirczaninowii Kar. et Kir. и Е. exigua L. (секция Peplus Lazara) и многолетник Е. megalatlantica Ball (секция Herpetorrhiza).

Обширная субклада В-2с образована видами секции Esula: большинство относится к подсекции Esula Boiss., один (Е. sieboldiana С. Morren et Decne.) — к подсекции Sieboldianae Prokh., подсекционная принадлежность трех, распространенных в Южной Африке (Е. genistoides P. J. Bergius, Е. kraussiana Bernh.) и на Мадагаскаре (Е. emirnensis Baker) неясна. Согласно методам максимального правдоподобия и максимальной парсимонии в эту же субкладу входит однолетник Е. szovitsii Fisch, et С. А. Меу. (подсекция Densiuscula Prokh. секции Peplus Lázaro), но на этом дереве он образовывает самостоятельную субкладу B-2d.

Субклада В2-е отличается наибольшим разнообразием секционной принадлежности входящих в него видов. Е. peplus L. и Е. taurinensis All. относятся к различным подсекциям секции Peplus, Е. portlandica L. и Е. deflexa — к секции Herpetorrhiza, Е. paralias L. — к монотипной подсекции Paralioideae Prokh. секции Paralias Dumort.; секционная принадлежность американских видов Е. robusta (Engellm.) Small и Е. trichotoma Kunth нам на момент проведения исследований была неясна. При этом Е. peplus и Е. robusta всегда объединяются вместе.

Субклада B-2f объединяет 3 вида, относящихся к секции Chylogala. Несколько обособленное положение в ней занимает Е. calyptrata Coss. et Kralik, который в отдельных вариантах выравнивания и при использовании для построения дерева метода минимальной эволюции выделяется в самостоятельную субкладу.

Субкладу B-2g образуют несколько небольших клад. Во-первых, это три вида подсекции Myrsiniteae Boiss. секции Paralias Dumort. (два других дерева также показали это объединение). Во-вторых, это Е. lathyris — представитель монотипной секции Lathyris Dumort. Необходимо отметить, что выравнивание последовательностей именно этого вида наиболее сложно и имеет несколько вариантов решения. И, в-третьих, с хорошей поддержкой выделяется субклада,

в которой оказались главным образом многолетние виды, относящиеся к подсекции Conicocarpae (Prokh.) Prokh. секции Paralias, но, кроме них, однолетник Е. falcata L., принадлежащий к подсекции Falcatae Geltman секции Peplus (два других дерева также показали это объединение). Таким образом, имеются определенные основания для разделения субклады B-2g на три самостоятельные.

В диссертации проанализировано, как соотносится филогенетическое древо с географией видов и их жизненными формами по системе Raunkier (1937). Выяснено, что практически нет клад и даже субклад, которые можно было бы объединить по этим признакам. Исключение составляют клады В-1с и В-2с, по всей вероятности, весьма компактные в эволюционном плане. Кроме того, анализ показал, что переход от многолетней жизненной формы к однолетней происходил в изучаемом подроде неоднократно.

3.2. Обсуждение 3.2.1. Объем подрода Esula

Согласно молекулярно-филогенетическим данным, в роде Euphorbia выделяются 4 клады (обозначаемые как клады А, В, С и D), которые таксономически соответствуют 4 подродам. Изучаемый нами подрод Esula (клада В) отличается от других подродов тем, что его объем как при использовании молекулярно-филогенетического, так и традиционного подхода различается незначительно и в наибольшей степени соответствует традиционным взглядам. Наша работа однозначно подтверждает монофилию изучаемого подрода во всех видах анализа.

Объем изучаемого подрода все время меняется в сторону увеличения количества включаемых в него видов. Буасье (Boissier, 1862) в своей работе выделил секцию Tithymalus (Gaertn.) Boiss., которая в целом соответствовала нынешнему пониманию подрода Esula. Эта секция тогда насчитывала 309 видов, а всего род Euphorbia в этой работе — 723. После пересмотра объема подрода (Riina et al., 2013) число видов увеличилось почти до 460.

3.2.2.Система подрода Esula и ее возможные изменения

Наши данные показывают, что лишь часть подразделений подрода Esula (Гельтман, 2007) получили поддержку при молекулярно-филогенетическом анализе.

Две основные клады В-1 и В-2 (рис. 4) полученные в нашем анализе, вероятно, соответствуют двум основным филогенетическим линиям в подроде Esula, разделение которых произошло достаточно давно, скорее всего, в начале третичного периода или даже раньше. В настоящее время они не отражены таксономически, но, возможно, их можно рассматривать как надсекции в пределах подрода Esula, либо подроды, если признавать род Tithymalus Gaertn.

В кладе В-1 оказалось две группы видов. Наиболее крупная из них включает виды двух близких секций Chamaebuxus и Helioscopia (разделение между которыми ранее было проведено в основном по признаку жизненной формы — однолетние или многолетние растения (Гельтман, 2007)). Наш анализ показывает, что однолетние виды встречаются в различных частях этой клады, так что выделение их в особую секцию нецелесообразно. Фактически молекулярно-12

филогенетические данные подтвердили мнение Проханова (1949, 1964), который включал многолетники и однолетники в секцию Helioscopio sensu lato. Этот подход принят и международным коллективом исследователей подрода Esula (Riina et al., 2013).

На отдельных ветвях дерева можно отметить тенденцию сближения географически близких видов, которые по морфологическим признакам обычно относились к различным группам родства. Интересен и факт отнесения к секции Helioscopio двух макаронезийских видов Е. mellifera и Е. longifolia, относимых ранее к секции Baisamis. Внимательный морфологический анализ показал, что эти виды имеют выросты на плодах — признак, характерный для большинства видов секции Helioscopio s.l. Таким образом, молекулярные данные указали на то, что было пропущено «традиционными» систематиками. Таким образом, все рассматриваемые виды следует относить к одной секции и принять для нее приоритетное название Helioscopio.

Вторая группа включает в себя виды секции Holophyllum, которые объединились в устойчивую субкладу В-1с. Более детально виды этой секции рассмотрены в главе 4.

Клада В-2 более разнообразна и включает в себя виды остальных секций подрода.

Хорошую поддержку получила подсекция Patellares секции Esula, соответствующая кладе В-2а (рис. 4). Однако представители других подсекций секции Esula оказались в кладе В-2с, которая вместе с кладой B-2d, включающей единственный вид Е. szovitsii (секция Peplus по Гельтману (2007)), образует кладу, сестринскую по отношению к кладам В-2а и В-2Ь. Мы считаем, что подсекция Patellares секции Esula заслуживает ранга секции; это предложение, высказанное нами (Крюков и др., 2010), было позже реализовано другими авторами (Frajman, Schönswetter, 2011) и также принято в итоговой работе по молекулярной систематике подрода Esula (Riina et al., 2013).

Клада B-2a оказалась сестринской кладе В-2Ь. В последней имеются виды из не менее чем 5 секций (по системе Гельтмана, 2007). Очевидно, что для достоверного разделения видов клады В-2Ь на секции в нашем анализе данных недостаточно. После привлечения более обширного материала (Riina et al. 2013) в кладе B-2b выделено 6 секций, часть из которых описаны как новые для науки.

Клада В-2с включает в себя все остальные виды секции Esula, не попавшие в кладу В-2а. Таким образом, из секции Esula необходимо исключить виды подсекции Patellares, выделив их в отдельную секцию, а секция Esula в этом случае окажется монофилетичной.

Клада B-2d, включающая единственный вид Е. szovitsii, по нашему мнению, заслуживает ранга секции, что и было недавно реализовано описанием новой секции Szovitsiae Geltman (Riina et al., 2013).

Клада В-2е, как и клада В-2Ь, по данным наших исследований оказалась состоящей из ряда секций (Гельтман, 2007), которые образуют две миниклады. Из-за недостатка данных мы не разделили кладу В-2е на две субклады, хотя для такого разделения имеются некоторые основания. Авторы новой системы подрода Esula (Riina et al., 2013) отнесли виды этой клады (В-2е) к двум близко-

родственным сестринским секциям Tithymalus и Paralias (Riina et al., 2013), состав которых оказался радикально пересмотрен по сравнению с традиционным подходом.

Тщательный анализ кладоспецифичных мутаций в кладе B-2f также показывает возможность разделения ее на две. Из-за недостатка данных нам не удалось проработать этот вопрос более детально, но Riina et al. (2013) нашли основания для разделения видов этой клады на две близкородственные секции, оставив виды Е. heteradena и Е. alaica Prokh. в секции Chylogala и выделив новую секцию Calyptratae Geltman, включив туда Е. calyptrata.

Последняя клада B-2g в нашей обработке включает в себя несколько групп видов. Во-первых, достаточно хорошую поддержку получили подсекции Myrsiniteae и Conicocarpae секции Paralias. Во-вторых, в эту кладу попал один вид из секции Peplus (по системе Гельтмана, 2007) и один из интереснейших видов подрода — Е. lathyris, который по анализу хлоропластных маркеров может быть выделен в отдельную базальную кладу (Riina et al., 2013).

В целом можно говорить о соответствии наших данных с данными других последних работ, в которых были использованы молекулярные данные. В тоже время значительная часть секций, ранее выделенных по морфологическим, географическим и экологическим признакам, себя не оправдала.

Подводя итог, отметим, что молекулярно-филогенетические данные показывают целесообразность широкого понимания секции Helioscopio, с отнесением к ней, как многолетников, деревьев и кустарников, так и однолетников. Подтверждена целесообразность выделения секций Holophyllum, Lathyris, а также подсекции Patellares секции Esula, которая заслуживает ранга секции. Объем и отличительные признаки этих таксонов при молекулярно-филогенетическом подходе оказываются примерно такими же, как и при традиционном морфологическом. В целом подтверждена обоснованность выделения секций Esula и Chylogala, хотя их объем и отличительные признаки несколько иные, чем при морфологическом подходе. Объем и отличительные признаки секций Paralias, Herpetorrhiza, Peplus и Balsamis существенно иные, чем при морфологическом подходе. Наибольшее несоответствие систем наблюдается в секции Peplus, к которой ранее относились исключительно однолетники.

Недавно коллективом авторов с нашим участием на основе молекулярно-филогенетических данных система подрода Esula рода Euphorbia существенно пересмотрена (Riina et al., 2013), в том числе был принят и ряд наших рекомендаций. Следует также отметить, что около 30 процентов данных по ITS-последовательностям, представленных в работе, получены с нашим участием.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЕКЦИИ HOLOPHYLLUM

Наша работа по изучению молекулярной филогении видов подрода Esula была в своей основе завершена к концу 2009 г., ее основные результаты были опубликованы в середине 2010 г. (Крюков и др., 2010). В 2010-2012 г.г. мы продолжали работать в составе большого международного коллектива и часть наших данных, как указывалось выше, вошла в заключительную работу (Riina 14

et al., 2013). В этой работе было обращено особое внимание на секцию Holo-phyllum, которая ранее была изучена явно недостаточно. Из 27 видов секции были получены данные по последовательностям для 12 видов. В 2012-2013 г.г. мы получили новые данные по ряду видов секции Holophyllum (12 образцов, относящихся к 10 видам); всего нами изучено 15 образцов, относящихся к 13 видам секции Holophyllum. Поэтому было признано целесообразным проанализировать новые данные и представить их в диссертации.

В наш анализ вошли данные по 18 видам изучаемой секции (22 образца), из них данные по 13 получены нами, а по 7 взяты из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).

Группа молочаев, имеющих нектарники без придатков, цельнокрайные листья и крупные, нередко морщинистые коробочки, была выделена Прохановым (1933) как подрод Holophyllum Prokh. рода Tithymalus. Позднее он (Проханов, 1949, 1964) принял эту группу как секцию рода Euphorbia, в которой выделял два видовых ряда.

Для секции Holophyllum характерна интересная дизъюнкция ареала: абсолютное большинство видов встречается в Северной (юг Сибири), Восточной, Средней и Центральной Азии, но один — Е. isatidifolia Lam. — на Пиренейском полуострове, при этом видов секции нет ни на Кавказе, ни на Балканах.

При построении дерева для внешней группы мы взяли 6 видов из других секций подрода Esula, относящихся к кладам В-1а и В-2с. Для построения филогенетического дерева использовался метод Байеса (рис. 5). Почти все виды рассматриваемой нами секции распределились в 2-3 клады.

Наши результаты подтвердили монофилию секции Holophyllum. В пределах клады, соответствующей секции, выделяется несколько субклад. Отчетливо выделяются клада А (обведена на рисунке кружком), в которую вошли высокогорные виды Восточной Азии и Гималаев (Е. himalayensis (Klotzsch) Boiss., Е. stracheyi Boiss., E. wallichii Hook, f.), а также Средней Азии (E. megalocarpa Rech, f., E. monocyathium Prokh., E. rosularis Fed., E. sarawschanica Regel, E. thomsoniana Boiss.).

Также хорошо выделяется клада среднегорных и равнинных преимущественно среднеазиатских видов (Е. ferganensis В. Fedtsch, Е. jaroslavii Poljakov, Е. lipskyi Prokh.) вместе с несколько отстоящим от них пиренейским Е. isatidifolia. Таким образом, молекулярно-филогенетические данные несколько прояснили вопрос о родственных связях пиренейского вида.

Остальные виды находятся в базальной части дерева и не образуют отчетливых клад. Их общим признаком является то, что они распространены в среднегорных и равнинных районах Южной Сибири и Монголии, российского Дальнего Востока, северо-восточного Китая, Кореи и Японии.

При соотнесении наших данных с системой К. С. Байкова (2000) оказалось, что из принятых в ней внутрисекционных таксонов полное подтверждение получил только ряд Ferganenses.

Таким образом наши данные позволили наметить основные группы родства в секции Holophyllum, которые в дальнейшем могут быть основой для пересмотра ее системы.

Рис. 5. Молекулярно-филогенетическое древо секции Но1орИу11ит, построенное по методу Байеса. Цифрами обозначены индексы апостериорной вероятности. Символом N обозначены виды из базы данных «Генбанк», полученные другими авторами. Кругом обведена группа высокогорных видов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Секвенированы и исследованы последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров и генов 5.8S рРНК 93 видов подрода Esula рода Еи-phorbia, в большинстве своем ранее неизученных.

2. Подтверждена монофилия подрода Esula.

3. Установлено, что в пределах подрода Esula имеется две крупные клады, отражающие давно обособившиеся линии его эволюции.

4. Лишь часть подразделений подрода Esula, установленных на основе морфологического подхода, получили поддержку при молекулярно-филогенетическом анализе

5. Переход от многолетней к однолетней жизненной форме в подроде Esula происходил неоднократно, поэтому нецелесообразно выделение секций и подсекций, обоснованных в основном по этому признаку.

6. Молекулярно-филогенетические данные показывают целесообразность широкого понимания секции Helioscopio, с отнесением к ней, как многолетников, деревьев и кустарников, так и однолетников.

7. Подтверждена целесообразность выделения секций Holophyllum, Lathyris, а также подсекции Patellares секции Esula, которая заслуживает ранга секции. Объем и отличительные признаки этих таксонов при молекулярно-филогенетическом подходе оказываются примерно такими же, как и при традиционном морфологическом.

8. В целом подтверждена обоснованность выделения секций Esula и Chylogala, хотя их объем и отличительные признаки несколько иные, чем при морфологическом подходе.

9. Объем и отличительные признаки секций Paralias, Herpetorrhiza, Peplus и Balsamis существенно иные, чем при морфологическом подходе. Наибольшее несоответствие систем наблюдается в секции Peplus, к которой ранее относились исключительно однолетники.

10. Построены вторичные структуры изучаемых последовательностей, показаны места вставок и делеций. Есть основания полагать, что вставки и делении чаще происходят у видов, относящихся к отдельным кладам изучаемого подрода, возможно, наиболее эволюционно активным, а также на определенных участках последовательностей.

11. Изучена молекулярная филогения секции Holophyllum. В секции прослеживается разделение на равнинные и высокогорные виды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Публикации в изданиях, включенных в список, рекомендованный ВАК

1. Крюков A.A., Гельтман Д.В., Мачс Э.М., Родионов A.B. Филогения видов подрода Estila рода Euphorbia (Euphorbiaceae) по результатам сравнительного анализа последовательностей района ITS 1-5.8S рДНК-1Т82 // Бот. журн. 2010. Т. 95. №6. С. 801-819.

2. Riina R., Peirson J.A., Geltman D.V., Molero J., Frajman В., Pahlevani A., Barres L., Morawetz J.J., Salmaki Y., Zarre S., Kryukov A., Bruyns P.V., Berry P.E. A worldwide molecular phylogeny and classification of the leafy spurges, Euphorbia subgenus Esula (Euphorbiaceae) // Taxon. 2013. Vol. 62. N 2. P. 316-342.

Другие публикации

3. Мачс Э.М., Крюков A.A., Райко М.П., Гельтман Д.В., Родионов A.B. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ITS2 некоторых видов рода Euphorbia // Тезисы 5 международного совещания по кариологии, ка-риосистематике и молекулярной филогении растений. СПб., 2005. С. 60-61.

4. Крюков A.A., Мачс Э.М., Гельтман Д.В., Родионов A.B. Молекулярно-филогенетические исследования некоторых видов подрода Esula рода Euphorbia L. // Материалы I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге, 21-26 мая 2006 г. Санкт-Петербург, 2006. С. 31-32.

5. Крюков A.A., Гельтман Д.В., Родионов A.B. Молекулярно-филогенетические исследования некоторых видов подрода Esula рода Euphorbia L. (Euphorbiaceae) // Материалы конференции по морфологии и систематике растений, посвященной 300-летию со дня рождения Карла Линнея. М., 2007. С. 111-112.

6. Крюков A.A. Новое в филогении подрода Esula рода Euphorbia II Материалы докладов XV Всероссийской молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии » (14-18 апреля 2008 г.). Сыктывкар, 2008. Т. 3. С. 142-143.

7. Крюков A.A., Гельтман Д.В., Родионов A.B. Молекулярно-филогенетическое изучение подрода Esula рода Euphorbia (Euphorbiaceae) II Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: Материалы всероссийской конференции (22-27 сентября 2008 г.). Петрозаводск, 2008. Часть 3. С. 45-47.

8. Родионов A.B., Мачс Э.М., Пунина Е.О., Красильников Е.М., Михайлова Ю.В., Носов H.H., Гельтман Д.В., Ким Е.С., Коцеруба В.В., Крюков A.A., Райко М.П., Чупов B.C., Шнеер B.C., Яковлев Г.П. Уровни внутривидовой и межвидовой изменчивости ITS в природных популяциях цветковых растений: ДНК-штрихкодирование как инструмент исследования и рационального использования биоразнообразия флоры России // Динамика генофондов. М., 2008. С. 63-66.

9. Крюков A.A., Гельтман Д.В., Мачс Э.М., Родионов A.B. Молекулярно-филогенетическое исследование подрода Esula рода Euphorbia путем сравнительного изучения последовательностей внутренних транскрибируемых спей-серов генов 45 S рРНК // Кариология и молекулярная систематика/ Ред. A.B. Родионов, B.C. Шнеер. СПб., 2009. С. 88-92.

10. Родионов A.B., Мачс Э.М., Тюпа Н.Б., Ким Е.С., Носов H.H., Пунина Е.О., Корчагина Ю.Ю., Красильников Е.М., Крюков A.A., Райко М.П. Внутривидовая и межвидовая изменчивость ITS в природных популяциях цветковых растений // Факторы экспериментальной эволюции организмов. Киев: Логос, 2009.Т. 6.С. 78-81.

11. Гельтман Д.В., Берри П., Фергюссон К., Вэнчи Дж., Крюков A.A., Мэй-филд М., Риина Р., Родионов A.B. Филогенетические взаимоотношения между евразиатскими и североамериканскими видами подрода Esula рода Euphorbia (Euphorbiaceae) по морфологическим и молекулярным (последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров) данным // XII Московское совещание по филогении растений, посвященное 250-летию со дня рождения Георга-Франца Гофмана. Материалы (Москва, 2-7 февраля 2010 г.). Москва: Товарищество научных изданий КМК, 2010. С. 79-82.

Подписано в печать 15.11.13. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризограф. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 112.

Отпечатано с готового оригинал-макета. ООО "ПиФ. сот" 197101, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крюков, Алексей Анатольевич, Санкт-Петербург

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ БОТАНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ. В.Л. КОМАРОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

0420Н54719 На правах рукописи

КРЮКОВ АЛЕКСЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

«МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВИДОВ ПОДРОДА ESULA PERS. РОДА EUPHORBIA L. (EUPHORBIACEAE JUSS.)»

03.02.01 «Ботаника» Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель кандидат биологических наук Д.В. Гельтман

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2013

Содержание

Введение 3

Благодарности 7

Глава 1. Обзор литературы 8

1.1. Род Euphorbia L. и основные проблемы его систематики 8

1.2. Краткая история таксономического изучения рода 1° Euphorbia L.

1.3. История молекулярно-филогенетического исследования 14 рода Euphorbia

Глава 2. Материал и методы 34

Глава 3 Молекулярная филогения видов подрода Esula рода 47 Euphorbia

3.1. Результаты 47

3.1.1. Общая характеристика изученных последовательностей ITS 1- ген 5.8S rRNA- ITS2 видов подрода Esula рода 47 Euphorbia

3.1.2. Вторичные структуры ITS-последовательностей 56

3.1.3. Филогенетические реконструкции 65

3.2. Обсуадение 72

3.2.1. Объем подрода Esula 72

3.2.2. 72 Система подрода Esula и ее возможные изменения

Глава 4. Молекулярно-филогенетическое изучение секции 77 Holophyllum (Prokh.) Prokh.

Основные результаты и выводы 83

Список литературы 85

Приложения 94

Введение

Актуальность темы. Род молочай {Euphorbia L.) насчитывает до 2000 видов (Oudejans, 1990), широко распространенных в тропических, субтропических и умеренных областях Земного шара. По богатству жизненных форм этот род превосходит все остальные роды семейства молочайных. Все виды рода объединяет удивительное однообразие особой структуры, промежуточной между цветком и соцветием — циатия.

Первый и единственный на сегодняшний день обзор рода в полном объёме выполнил Э. Буасье (Boissier, 1862), который отнёс к нему 723 вида, разделив их на 27 секций. Существенный вклад в построение системы рода внёс Я. И. Проханов (1949, 1964) подготовивший его обработку для «Флоры СССР». Система рода и входящих в его состав подродов неоднократно менялась; не так давно Д. В. Гельтман (2007) на основании морфологических данных отнес евроазиатские виды изучаемого нами подрода Esula Pers. к 10 секциям.

Новым этапом в изучении систематики и филогении молочаев стали молекулярно-филогенетические работы, основанные на анализе и сравнении внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) гена 45S rRNA, а также некоторых хлоропластных генов (Molero et al., 2002; Steinmann, Porter, 2002; Bruyns et al., 2006; и др.), что дало новые результаты, в ряде случаев существенно отличающиеся от принятых ранее. Наша работа находится в общем русле этого направления исследований (Мачс и др., 2005; Крюков и др., 2006, 2007, 2008, 2009, 2010; Родионов и др., 2008, 2009; Гельтман и др., 2010; Riina et al., 2013).

Цель и задачи исследования.

Цель работы:

Используя методы молекулярной филогении, исследовать филогенетические отношения видов подрода Esula рода Euphorbia,

определить степень родства и положение их на филогенетическом древе, сравнить полученные данные с имеющимися системами подрода.

Задачи исследования:

1. Провести секвенирование и сравнительный анализ района ITS1-5.8S pPHK-ITS2 ядерных генов 45S рРНК у ряда представителей подрода Esula рода Euphorbia, выявить частоту и спектр мутаций в этих районах и, используя методы молекулярной филогении, реконструировать возможные филогенетические отношения внутри исследуемой группы.

2. Провести анализ полученных филогенетических деревьев и их сравнение с имеющимися системами подрода, основанными на классическом подходе, предложить изменения этой системы.

3. Провести специальное молекулярно-филогенетическое исследование видов секции Holophyllum.

4. Построить вторичные структуры ITS1 и ITS2 для исследуемых видов и провести их анализ.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Секвенирован район ITSl-5.8SpPHK-ITS2 ядерного гена 45S рРНК у 93 видов подрода Esula, принадлежащих ко всем секциям подрода, распространенным во внетропической Евразии, в том числе для 74 видов— впервые. Также впервые показано достоверное деление видов подрода Esula на ряд клад, при этом лишь некоторые из них соответствуют секциям, выделяемым по морфологическим признакам (Проханов, 1964; Гельтман, 2007). Впервые показано, что переход от многолетней формы к однолетней происходил в подроде Esula неоднократно.

Сведения, полученные в ходе данной работы, могут быть использованы при молекулярной идентификации видов подрода, имеющих практическое значение (в первую очередь лекарственных), а также при разработке учебных курсов по систематике и молекулярной филогении растений.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на I (IX) Конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (С.-Петербург, 2006), конференции по систематике и морфологии растений, посвященной 300-летию со дня рождения К. Линнея (Москва, 2007), на рабочем совещании «Молекулярные методы в ботанике» (Москва, 2008), XV Всероссийской молодёжной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2008), на XII делегатском съезде Русского ботанического общества (Петрозаводск, 2008).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 в изданиях из списка ВАК, из них 1 — в журнале, реферируемом библиографической системой «Сеть науки» (Web of Science).

1. Крюков A.A., Гельтман Д.В., Мачс Э.М., Родионов A.B. Филогения видов подрода Esula рода Euphorbia (Euphorbiaceae) по результатам сравнительного анализа последовательностей района ITS1-5.8S рДНК-1Т82 //Бот. журн. 2010. Т. 95. № 6. С. 801-819.

2. Riina R., Peirson J.A., Geltman D.V., Molero J., Frajman В., Pahleva-ni A., Barres L., Morawetz J.J., Salmaki Y., Zarre S., Kryukov A., Bruyns P.V., Berry P.E. A worldwide molecular phylogeny and classification of the leafy spurges, Euphorbia subgenus Esula (Euphorbiaceae) // Taxon. 2013. Vol. 62. N 2. P. 316-342.

3. Мачс Э.М., Крюков A.A., Райко М.П., Гельтман Д.В., Родионов A.B. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ITS2 некоторых видов рода Euphorbia II Тезисы 5 международного совещания по кариологии, кариосистематике и молекулярной филогении растений. СПб. 2005. С. 60-61.

4. Крюков A.A., Мачс Э.М., Гельтман Д.В., Родионов A.B. Молеку-лярно-филогенетические исследования некоторых видов подрода Esula

рода Euphorbia L. // Материалы 1(1Х)Международиой конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге 21-26 мая 2006 г. Санкт-Петербург. 2006. С. 31-32.

5. Крюков A.A., Гельтман Д.В., Родионов A.B. Молекулярно-филогенетические исследования некоторых видов подрода Esula рода Euphorbia L. (Euphorbiaceae) // Материалы конференции по морфологии и систематике растений, посвященной 300-летию со дня рождения Карла Линнея. М., 2007. С. 111-112.

6. Крюков A.A. Новое в филогении подрода Esula рода Euphorbia // Материалы докладов XV Всероссийской молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии » (14-18 апреля 2008 г.). Т. 3. Сыктывкар, 2008. С. 142-143.

7. Крюков A.A., Гельтман Д.В., Родионов A.B. Молекулярно-филогенетическое изучение подрода Esula рода Euphorbia (Euphorbiaceae) // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: Материалы Всероссийской конференции (22-27 сентября 2008 г.).. Петрозаводск, 2008. Часть 3. С. Л5-41.

8. Родионов A.B., Мачс Э.М., Лунина Е.О., Красильников Е.М., Михайлова Ю.В., Носов H.H., Гельтман Д.В., Ким Е.С., Коцеруба В.В., Крюков A.A., Райко М.П., Чупов B.C., Шнеер B.C., Яковлев Г.П. Уровни внутривидовой и межвидовой изменчивости ITS в природных популяциях цветковых растений: ДНК-штрихкодирование как инструмент исследования и рационального использования биоразнообразия флоры России // Динамика генофондов. М., 2008. С. 63-66.

9. Крюков A.A., Гельтман Д.В., Мачс Э.М., Родионов A.B. Молеку-лярно-филогенетическое исследование подрода Esula рода Euphorbia путем сравнительного изучения последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров генов 45 S рРНК // Кариология и молекулярная систематика/ Ред. A.B. Родионов, B.C. Шнеер. СПб., 2009. С. 88-92.

10. Родионов A.B., Мачс Э.М., Тюпа Н.Б., Ким Е.С., Носов H.H., Лунина Е.О., Корчагина Ю.Ю., Красильников Е.М., Крюков A.A., Райко М.П. Внутривидовая и межвидовая изменчивость ITS в природных популяциях цветковых растений // Факторы экспериментальной эволюции организмов. Ред. В.А. Кунах. Киев: Логос, 2009. Т. 6.С. 78-81.

11. Гельтман Д.В., Берри П., Фергюссон К., Вэнчи Дж., Крюков A.A., Мэйфилд М., Риина Р., Родионов A.B. Филогенетические взаимоотношения между евразиатскими и североамериканскими видами подрода Esula рода Euphorbia (Euphorbiaceae) по морфологическим и молекулярным (последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров) данным // XII Московское совещание по филогении растений, посвященное 250-летию со дня рождения Георга-Франца Гофмана. Материалы (Москва, 2-7 февраля 2010 г.). Москва: Товарищество научных изданий КМК, 2010. С. 79-82.

Благодарности

Хочу поблагодарить моего научного руководителя - Гельтмана Дмитрия Викторовича, за предложение интересной темы для работы, материала, неоценимую помощь и поддержку в процессе всей работы.

Хочется также выразить признательность Родионову Александру Викентьевичу - заведующему лаборатории биосистематики и цитологии БИН РАН, на базе которой производилась работа - за отеческое участие и помощь.

Также благодарю сотрудников лаборатории за помощь и полезные советы в работе, а в особенности — Мачса Эдуарда Модрисовича, Ким Елену Сергеевну, Пунину Елизавету Ольгердовну, Носова Николая Николаевича.

Отдельную благодарность хочу сказать своему самому первому научному руководителю - Антоновой Ирине Сергеевне - за первый научный опыт и предоставление возможности стать ученым.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Род Euphorbia L. и основные проблемы его систематики

Род молочай {Euphorbia L.) относится к семейству молочайных (Euphorbiaceae) и является одним из трех крупнейших родов цветковых растений. Он насчитывает около двух тысяч видов, широко распространенных в тропических, субтропических и умеренных областях Земного шара. Для рода характерно большое разнообразие жизненных форм — среди молочаев можно встретить деревья и кустарники, стеблевые суккуленты, многолетние и однолетние травы. Что касается генеративной сферы, то в роде наблюдается удивительное однообразие в структуре соцветия - циатия, который иногда рассматривается как высокоспециализированный цветок (Лодкина, 1986). В настоящее время циатий рассматривается как структура, промежуточная между цветком и соцветием (Prenner, Rudall, 2007).

В роде довольно много стеблевых суккулентов, которые распространены в основном в засушливых областях Африки (пустыни Намиб, Карру и др.) и являются там ландшафтными растениями. Внешне многие из этих молочаев похожи на кактусы, что является одним из классических примеров конвергенции.

Большинство видов рода — энтомофильные растения, опылителями их большей частью являются мухи, маленькие пчелы, тараканы. Среди молочаев имеются декоративные виды, в том числе целый ряд суккулентных молочаев, которые попадают под юрисдикцию Конвенции о международной торговле видами дикой фауны и флоры, находящимися под угрозой уничтожения (Конвенция СИТЕС).

Среди травянистых видов много рудеральных и сорных растений. Некоторые молочаи являются злостными сорняками, борьба с ними требует много усилий.

Все виды рода имеют млечный сок, в состав которого нередко входят ядовитые вещества, например, эуфорбин, поэтому почти все виды рода ядовиты. Сорные виды молочаев опасны для скота не столько на пастбищах, где животные избегают эти растения, сколько в сене.

Систематике рода Euphorbia посвящено довольно много работ, тем не менее, далеко не все ее вопросы решены. В изучении систематики рода можно выделить несколько направлений. Одно из важнейших — определение объема рода и его разделение на подроды. Несмотря на достаточно большое число работ, общепринятой системы как подтрибы Euphorbiinae Hurus., так и самого рода Euphorbia в настоящее время не существует. Чаще род Euphorbia рассматривается как единственный род подтрибы, к нему относятся все растения, имеющие циатий. Иногда в пределах подтрибы выделяется несколько родов (Radcliffe-Smith, 2001), но и в этом случае род Euphorbia оказывается очень большим и объединяющим растения, имеющие самые разные жизненные формы. В роде выделен ряд подродов, однако границы между ними в ряде случаев дискуссионны.

Другое направление исследований — изучение отдельных внутриродовых групп (подродов, секций), а также видового разнообразия рода на отдельных территориях. Наше исследование принадлежит именно к этому направлению. Его предметом является подрод Esula Pers. рода Euphorbia, к которому относятся многолетние и однолетние травы, реже — кустарники и небольшие деревья, распространенные в основном в умеренной зоне Северного полушария; несколько видов встречается в горных системах тропиков, на юге Африки, в Новой Зеландии. Характерным признаком подрода является наличие годичного побега, заканчивающегося ложным зонтиком из лучей общего соцветия, окруженных листочками обертки. Для представителей подрода характерно наличие циатиев с 4 или 5 нектарниками, которые нередко имеют рожковидные придатки, хотя лепестковидные придатки в подроде никогда

не встречаются. Видовое многообразие подрода оценивается почти в 460 видов (около одной четверти разнообразия рода), большинство которых встречается в Старом Свете. В Новом Свете произрастает, по-видимому, не более 10% видов (Riina et al., 2013).

1.2. Краткая история таксономического изучения рода Euphorbia L.

Род молочай был давно известен ученым, но его рассмотрение мы начинаем с классификации К. Линнея (Linnaeus, 1753), давшей начало современной систематике. В этой работе приведено 56 видов, разделенных на 7 формальных групп одного ранга. В дальнейшем система Линнея была усовершенствована Р. Десфонтеном (Desfontaines, 1804) и X. Персуном (Persoon, 1806), причем число видов у последнего автора возросло в 3 раза по сравнению с работами Линнея. Кроме того, Персун предложил иерархическую систему, в которой род подразделялся на 4 подрода.

А. Хаворт (Haworth, 1812) предложил вместо рода молочай несколько более мелких родов, однако большинство исследователей XIX века не разделили его точку зрения и принимали род в широком смысле. В построение системы рода значительный вклад внесли Дж. Репер (Roeper, 1824), Б. Дюмортье (Dumortier, 1827), К. А. Мейер (Meyer, 1833), В.Кох (Koch, 1837) и др.

Важнейшим этапом в изучении рода стали работы Э. Буасье (Boissier, 1862, 1879). В 1862 г. он в обработке рода для «Продромуса» А. П. Декандолля (Boissier, 1862), впервые охарактеризовал род в полном объеме, отнеся к нему 723 вида, которые разделил на 27 секций, принадлежащих к 2 «сериям» Appendiculatae и Exappendiculatae, при этом он дал очень подробные диагнозы всех секций, сопоставимые по принятому набору признаков. Большую часть видов, относимых в настоящее время к подроду Esula, Буасье включил в секцию Tithymalus (Gaertn.) Boiss., которую разделил на 11 подсекций (Decussatae Boiss., Oppositifolia Boiss., Crotonopsideae Boiss., Ipecacuanae Boiss., Laurißorae

Boiss., Osirideae Boiss., Pachycladae Boiss., Carunculares Boiss., Galarrhoeus (Haw.) Boiss., Esula (Pers.) Boiss., Myrsiniteae Boiss., что оказалось важным для построения естественной системы подрода Esula.

Большой вклад в разработку системы молочаев, особенно произрастающих в пределах внетропической Евразии, внес Я. И. Проханов (1933, 1949, 1964), который сначала (Проханов, 1933, 1941) предложил вариант разделения рода Euphorbia на несколько более мелких и естественных родов, но затем, во «Флоре СССР» (Проханов, 1949) принял традиционную концепцию объема рода и предложил существенно переработанную и дополненную его систему. Позднее (Проханов, 1964) эта система была им несколько переработана. В этой работе Проханов отнес виды рода молочай, встречающиеся на территории СССР, к 3 подродам: Esula, Chamaesyce Raf. и Eremophyton (Boiss.) L.C. Wheeler, а в подроде Esula выделил 10 секций (рис. 1).

Система Проханова (иногда — с небольшими изменениями) была принята в большинстве региональных флор и обзоров, подготовленных для территории бывшего СССР (Клоков, 1955; Тер-Хачатурова, Тамамшян, 1973; Хинтибидзе, Гвинианидзе, 1983; Гельтман, 1996; Байков, 2007 и др.) и сопредельных стран. Эта же система была принята и зарубежными учеными (например, Radcliffe-Smith, 1982), хотя некоторые из них продолжали придерживаться системы Буасье (Rechinger, Schiman-Czeika, 1964).

Д. В. Гельтман (2007), используя идеи и подходы Проханова, предложил свой вариант системы подрода Esula для внетропической Евразии. Подрод Esula представлен в данной обработке 10 секциями.

Первые 3 секции: Chamaebuxus Lazaro, Helioscopio Dumort. и Holophyllum Prokh. сближаются автором по признаку схожих по строению эллиптических нектарников без придатков. Плоды видов из этих 3 секций гладкие или слегка морщинистые, но у видов секции Holophyllum без

секция 2 - Hofe E/mongot¡ca JE.paflasii /E.komaroviana ' E.serawschanica E.rupestris E.monocyathium E. (ocularis E.lianshanica E.prokhanovii E.komaroviana E.rapulum У E.blepharophylla ~i.ferganensis klipskyí

подрод Pat alias (род Tithymalis)

сеы!ия 3 -4 ulocaipa E.cripta E/squamosa .macrocarpa ^ .transoxana .mucronulata ( /E.kudrjaschevii E.orientalis E.palustrís E.eugeníae E.carpatica E.tauricota E.villosa E.semivillosa E. alístala E.soongaiica E.lamprocarpa E. pilosa E.polychroma E.carniolica E.stricta E.platyphylla E.microsphaera E.coniosperma E. alpina E.macrorrhrza E.buchtormensis E.pubescens E.alatavica E.lucorum E.condylocarpa E.wíttmanni i E.pachynhiza \E.talastavica i. dulcís |.angulata l altaica E.ieriophora E.netíoscopid

E.allepica E. exigua E.graeca E.ledebourií E.peplus E.aulacosperma E.falcata E.acumínata E.normanni E.francheti E.inderiensis E.triodonta E.sororia

E.aserbajdzhaníca E. consanguínea E.turczaninowii E.arvalis E.densa E.szovitsii \E. densíuscula

секция 5 • Muih E.parabas E.petrophila E.seguíeriana E.humilis E.kopetdaghí E.sogdiana E.macr ociada