Молекулярно-биологические особенности вируса гепатита B дикой и мутантной форм в трех регионах Российской Федерации

Писарева, Мария Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-биологические особенности вируса гепатита B дикой и мутантной форм в трех регионах Российской Федерации
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологические особенности вируса гепатита B дикой и мутантной форм в трех регионах Российской Федерации"

На правах рукописи

ПИСАРЕВА Мария Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИРУСА ГЕПАТИТА В ДИКОЙ И МУТАНТНОЙ ФОРМ В ТРЕХ РЕГИОНАХ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

03 00 06 — Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003 16 176 1

Санкт-Петербург 2007

003161761

Работа выполнена в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии Государственного Учреждения Научно-исследовательский институт гриппа Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

академик РАМН,

доктор биологических наук, профессор Киселев Олег Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мукомолов Сергей Леонидович кандидат медицинских наук Вашукова Светлана Степановна

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им академика И П Павлова

Защита диссертации состоится 12 ноября 2007 г В 12 час 00 мин на заседании диссертационного совета Д 001 46 01 при ГУ НИИ гриппа РАМН по адресу Санкт-Петербург, ул Профессора Попова, д 15/17

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ гриппа РАМН Автореферат разослан октября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук,

Лобова Т Г

Актуальность проблемы

Вирус гепатита В (ВГВ) является одним из самых распространенных гепатотропных вирусов, вызывающих хроническое поражение печени (Балаян MC и Михайлов МИ, 1999, Львов ДК, 2000, Шахгильдян ДИ, 2001, Ивашкин В Т , 2002) Несмотря на программу вакцинации против ВГВ в России распространенность ВГВ-инфекции продолжает неуклонно возрастать Клинические проявления хронического вирусного гепатита (ХВГ) многообразны и зависят в основном от биологических свойств вируса и особенностей его взаимодействия с иммунной системой хозяина (Oldstone S et al, 1991)

Антигенная специфичность белковых структур ВГВ определяется генотипической принадлежностью вирусов и возникающими мутациями, которые меняют фенотип вируса и влияют на течение ХВГ (Brunetto MR et al, 1999, Chan HL et al, 2002, Sumi H et al, 2003, Norder H , 2004, Hunt CM et al, 2004, Baumert T F et al, 2005) Вирус гепатита В считается наиболее изученным среди остальных вирусов гепатита Однако в последнее десятилетие возрос интерес к влиянию генетической вариабельности ВГВ на течение и исход болезни Генетическая вариабельность проявляется как в возникновении мутаций в вирусном геноме у каждого инфицированного субъекта, так и в существовании различных генотипов ВГВ, свойственных определенным популяциям носителей

Современная классификация ВГВ включает восемь генетических групп, обозначенных латинскими буквами от А до Н (Schaefer S , 2007) В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что генотип ВГВ может влиять на скорость сероконверсии е-антигена, тяжесть течения болезни, частоту хронизации и вероятность развития гепатокарциномы (Buti М et al, 2005) Кроме того, ответ на антивирусную терапию среди пациентов с хроническим гепатитом, по крайней мере, частично связан с генотипом ВГВ Распределение генотипов варьирует в зависимости от географических регионов мира, а информация по молекулярной эпидемиологии вирусов гепатита в

Российской Федерации по сравнению с другими странами весьма скудная Следует отметить, что к настоящему времени отсутствуют диагностические тест-системы для генотипирования вируса гепатита В

Вопросы распространения мутантных форм ВГВ, генотипов ВГВ, особенности течения ХВГ при разных формах ВГВ-инфекции требуют дальнейшего изучения Серологическая диагностика не охватывает всего разнообразия форм хронического гепатита В вследствие снижения образования или секреции ВГВ-антигенов из-за появления мутаций в precore/core и pres/s-областях генома (Santantonio Т et al, 1992, Baumert Т F , 1995, Brunetto M R et al, 1999, Khan N , 2004)

Противовирусная терапия (ПВТ) при ХВГ имеет малую эффективность, высокую стоимость, вызывает тяжелые побочные эффекты и недостаточно активно внедряется в практическое здравоохранение (Ивашкин В Т с соавт, 2003, Радченко В Г с соав , 2004, Hadzyannis S J et al, 2004, Zeuzeum S et al, 2005) Как правило, лечение аналогами нуклеозидов и нуклеотидов продолжается неопределенно долго, что может привести к развитию лекарственной устойчивости вируса гепатита В В настоящее время очень мало известно о том, какие мутации ВГВ приводят к возникновению лекарственной устойчивости в российской популяции пациентов

Целью работы явилось изучение молекулярно-биологических особенностей вируса гепатита В диких и мутантных форм в трех регионах Российской Федерации

Задачи исследования

1 Определить распределение различных генотипов ВГВ в Санкт-Петербурге, Карелии и Якутии, выявить зависимость тяжести течения заболевания от генотипа вируса

2 Определить степень распространенности precore/core и pres/s-мутантных форм ВГВ среди обследованных больных Выявить изменения в геноме вируса гепатита В, приводящие к возникновению мутантной формы

3 Выявить мутации ВГВ, приводящие к появлению устойчивости к ламивудину у обследованных больных Научная новизна исследования

Впервые был применен новый алгоритм генотипирования вируса гепатита В, разработанный в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии ГУ НИИ гриппа РАМН, для определения генотипа вируса у пациентов с ХГВ

Впервые установлена широкая распространенность среди больных хроническим гепатитом В HBeAg-нeгaтивнoй и HBsAg-нeгaтивнoй форм заболевания, обусловленных ргесоге/соге и ргев/в-мутантными типами вируса

Впервые обнаружено преимущественное инфицирование больных ХГВ вирусом гепатита В генотипа О и редкое инфицирование ВГВ генотипа А в Санкт-Петербурге и Карелии Выявлены особенности клинического течения хронического гепатита в зависимости от генотипа вируса гепатита В Практическая значимость

В связи с отсутствием диагностических тест-систем для генотипирования вируса гепатита В, исследование распространения различных генотипов вируса в различных регионах РФ и апробация алгоритма генодиагностики и генотипирования вируса имеет важное практическое значение для предсказания тяжести течения заболевания и результатов противовирусной терапии Выявление особенностей распространения и роль эндемичности в циркуляции определенных генотипов возможны при изучении этих процессов в географически близких и отдаленных регионах страны Положения, выносимые на защиту

1 В трех регионах РФ (Санкт-Петербург, Карелия и Якутия) встречаются генотипы А, Э и С вируса гепатита В Распределение генотипов различается в зависимости от исследованного региона РФ Генотипическая принадлежность ВГВ оказывает влияние на выраженность клинических проявлений и тяжесть течения хронического гепатита В

2 В настоящее время HBeAg-нeгaтивнaя и НВ5А§-негативная формы гепатита В, обусловленные ргесоге/соге- и ргев/з-мутантными типами вируса, часто встречаются среди больных ХГВ и характеризуются тяжелым прогрессирующим течением заболевания и низкой репликативной активностью ВГВ, что затрудняет его молекулярно-генетическую характеристику

3 Развитие устойчивости к терапии ламивудином у обследованных больных определяется двумя различными мутациями в так называемом УМЭЭ-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В, приводящими к замене метионина на валин или изолейцин в 204 положении

Личный вклад автора в проведенное исследование. Автором выполнены ПЦР-диагностика, генотипирование вируса гепатита В и секвенирование различных фрагментов генома вируса Кроме этого проведен сравнительный анализ полученных данных с клиническими и серологическими показателями, а также статистическая обработка результатов На основании полученных данных разработан и применен алгоритм генотипирования, позволяющий предсказывать течение заболевания и эффективность противовирусной терапии

Внедрение в практику

Методы генотипирования вируса гепатита В и секвенирования различных участков генома вируса используются для предсказания исхода заболевания и результатов терапии у больных ХГВ в Специализированной клинике ГУ НИИ гриппа РАМН Санкт-Петербурга, отделении ОКБ, поликлиниках г Петрозаводска, поликлинике КНМЦ СЗО РАМН Апробация диссертации

По данным работы опубликовано 15 научных работ, из них - 6 статей Материалы диссертации были представлены на 2-ой Международной конференции, посвященной 75-летию С -Петербургского института им Пастера, "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями", 2-4 сентября 1998 г, , конференции «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии,

эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций», 2001, Санкт-Петербург, Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», 4-5 сентября 2003 г, Санкт-Петербург, конференции, посвященной 150-летию со дня рождения П М Альбицкого, 9-10 октября 2003 г, С-Петербург, V съезде Научного Общества Гастроэнтерологов России, XXXII сессии ЦНИИ Гастро-энтерологии 3-6 февраля 2005, Москва, Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции — теоретические и практические аспекты», Международном мультидисциплинарном семинаре «Микробиоциды для здоровья и репродукции человека Медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» 2-5 ноября 2004 г, 6-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2005»

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3-х глав результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Работа иллюстрирована 19 рисунками и 9 таблицами Список цитируемой литературы содержит 240 источников, в том числе 7 на русском и 233 на английском языках

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы. В работе использовали плазму крови 418 больных с верифицированным хроническим вирусным гепатитом В из разных регионов Российской Федерации, в том числе из Карелии - 179 человек, из Санкт-Петербурга - 180 человек, из Якутии - 59 человек

Серологические маркеры. Вирусные антигены HBsAg и HBeAg и антитела к вирусу гепатита В AbHBs, AbHBe, AbHBcorlgM, AbHBcorlgG исследовались методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» III поколения

Морфологическое исследование печени больных из Петрозаводска проводилось с оценкой индекса гистологической активности и склероза по методу Knodell R G (1981) и Desmet V (1994)

Генотипирование ВГВ. Ввиду отсутствия диагностических тест-систем для генотипирования вируса гепатита В нами были отработаны два метода генотипирования ВГВ метод, основанный на полиморфизме длин фрагментов рестрикции амплифицированных участков генома ВГВ (PCR-RFLP) по трем участкам генома ВГВ и ПЦР с типоспецифичными праймерами Учитывая трудоемкость метода RFLP, для скрининга наиболее часто встречающихся генотипов А и D была разработана простая схема генотипирования методом амплификации с типоспецифичными праймерами Для определения основных генотипов вирусов гепатита В, циркулирующих в различных регионах России, отработан алгоритм генодиагностики и генотипирования вируса гепатита В, включающий в себя следующие этапы

1 ПЦР-анализ на обнаружение ДНК ВГВ в исследуемом образце

2 Для выявления ДНК ВГВ использовали тест-систему «АмплиСенс HBV-470S/BKO-770» («ИнтерЛабСервис», ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ, Москва) Вирусные геномы определялись у всех больных в крови и у 280 человек — в ткани печени При этом ДНК ВГВ из плазмы крови выделяли с помощью комплекта реагентов для выделения нуклеиновых кислот «АмплиСенс РИБО-сорб», а из биоптатов печени - «АмплиСенс РИБО-золь-А» («ИнтерЛабСервис», ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ, Москва)

3 В случае получения положительного результата проводилась постановка ПЦР с типоспецифичными праймерами по участкам генов core и preSl ВГВ для определения генотипов А, Д, «ни-А-ни-Д» (Морозов В М, 2003)

4 В случае получения результата генотип «ни-А-ни-D», проводилась постановка ПЦР-RFLP по участку гена S для подтверждения принадлежности вируса к генотипу С Данный участок гена S является, с одной стороны, высоко консервативным в пределах одной генетической

группы, а с другой - имеет незначительную межгрупповую вариабельность (Uy A et al, 1992, Repp R , 1993, Norder H , 1994) Секвенирование проводили методом Сэнгера с использованием коммерческих наборов реагентов ABI PRISM® BigDyeIM Terminator v3 1 (Rosenblum et al, 1997) и оборудования фирмы Applied Biosystems (США) Секвенирование каждой последовательности проводили с прямого и обратного праймеров Секвенирование проводили по нескольким регионам генома ВГВ в пределах промотора гена core, ргесоге/соге-области, pres/s-области с помощью различных праймеров, подобранных как самостоятельно, так и по литературным данным (Liu et al, 2005)

Определение вирусной нагрузки ВГВ проводили с помощью ПЦР-тест-системы с учетом результатов в режиме реального времени «АмплиСенс HBV-FRT» («ИнтерЛабСервис», ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ, Москва), либо методом качественной ПЦР-детекции ДНК ВГВ Для полуколичественной оценки ДНК мишеней (от 1 до 4 баллов) проводили 4 последовательные 10-ти кратные разведения образцов плазмы крови или выделенной из ткани печени тотальной ДНК

Для статистического анализа данных использовался пакет Statistica для Windows, версия 5 Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента, U-тесту Манна-Уитни-Вилкоксона, критериям Фишера или X2 Для корреляционного анализа использовался коэффициент корреляции Спирмена

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Определение генотипа ВГВ у больных в Санкт-Петербурге, Карелии и Якутии

Для генотипирования ВГВ использовался выше представленный алгоритм За период с 2002 по 2006 гг проведено генотипирование ВГВ в плазме крови от 418 больных с хронической формой гепатита В из разных регионов РФ

В результате проведенных исследований установлено, что в Санкт-Петербурге у 173 (96%) больных был обнаружен генотип О, генотип А был выявлен у 7 (4%) больных, генотип С не определялся (рис 1) В Петрозаводске встречаемость генотипа А была выше и составила 20,3% (36 больных), а генотип О встречался у 128 (71,6%) больных Среди больных с генотипом А чаще диагностировался ХГ высокой степени активности и отмечалось более тяжелое течение хронического гепатита, более выраженный некротически-воспалительный синдром, отмечалась тенденция к более раннему формированию цирроза печени по сравнению с генотипом О

Несмотря на то, что ДНК ВГВ выявляли не только в плазме крови, но и в биоптатах печени, у 14 (8%) больных с ХГВ из Петрозаводска генотип определить не удалось, что может быть связано с низкими показателями вирусной нагрузки в исследуемых образцах Следует отметить, что для данной выборки больных по результатам серологических исследований характерна высокая частота встречаемости мутантных форм ВГВ

В отличие от распределения генотипов в Северо-Западном регионе, исследование 59 образцов, полученных из разных улусов (районов) Якутии, показало, что на территории республики отмечается циркуляция ВГВ трех генотипов Э, АиС При этом генотип Б составил 42,4%, А - 25,4%, С - 25,4% случаев В двух образцах сыворотки крови была обнаружена коинфекция генотипами А и О, а в двух других - генотипами А и С (6,8%)

Высокая частота инфицирования одновременно двумя генотипами в Якутии может быть обусловлена высокой эндемичностью этого региона по гепатиту В и, соответственно, высокой вероятностью повторного заражения Географических и этнических различий в распределении генотипов на территории республики Саха Якутия не выявлено

100^ ест-eoiv

40"Уп 20 "Vb DVB

Pue. t. Распределение; генотипов lil iï в CVuim-llcropßypi e. Петро'мводске it Якутии (%).

Выявление мутантных форм вируса гепатита В

lî разных географических регионах р асп рострашл i иостъ мутаитжл: формы инфекции различия. Так в Южной Гвропе более 30%, а в Южной Азии -около 70% ХГВ вызвано мутаптпым штаммом ВГВ (Ltndlh M. cl а!., 2001). В США и Северной Европе отсутствие HBeAg отмечается у 14% бШШШ ХГ' (f lunl С,M. et al.. 2000). В настоящее время в литературе очень Шшо данных о распространенноеги мутантпого ВГВ в России. Прямым способом пыятшедня мутантпого Iïl 'В является дорогостоящий И трудоемким метод ссквсниронапия вирусного генома, который невозможно широко иснольчокать R практической медицине, полому диагностика мутантмой формы ВГВ-инфскцин по ргесоге/еоге-об ласти основывается на выявлении у больных антител к HBcAg при отсутствии IlBeAg, обнаружении ДНК к крови и наличии клтшко-лабораторных и морфологических признаков хронического гепатита (Papatheodoridis O.V., 1 ladzyanIiis S.J., 2001).

Полный спекпр серологических маркеров Iii Ii, а также детекция ДНК ВГВ методами качественной и полуколичсствспной ПЦР н плазме и биоптатах

D А С НИ А ни D «икс

печени были выполнены при обследовании 112 больных ХГВ из клиник Петрозаводска (рис 2)

Из 112 больных с подтвержденной ВГВ-инфекцией были выделены 2 группы I) с наличием классического серологического профиля «дикого» типа ВГВ НВзА§-плюс, НВеАц-плюс, АЬНВе-минус и II) мутантного типа ВГВ-инфекции HBsAg-плк>c, HBeAg-минyc, АЬНВе-плюс Всего больных I и II типов было 58 человек У остальных 54 больных не было всего спектра маркеров, характерных как для «дикого», так и для мутантного типа ВГВ-инфекции у них не обнаруживались HBsAg, НВеА§, у части из них не выявлялись анти-НВе, а имелись только анти-НВсог^О, что не позволяло отнести их к тому или другому типу инфекции, хотя диагноз хронического гепатита подтверждался клиническими и морфологическим данными

112 больных ХГВ

ПЦР (плазма + бпоптат печени), Серологические маркеры, Биохимические показатели, Биопсия печени

I «дикий» тип (14 больных)

HBsAg (+) HBeAg (+) AbHBe (+) ДНК ВГВ (+) в ткани печени и в плазме

II мутантный тип (44 больных)

HBsAg (+)

HBeAg (+)

AbHBe (+)

ДНК ВГВ (+)

100% - в ткани печени

66% - в плазме

мутации - А1762Т и G1764А в промоторе гена core (4 случая), нонсенс-мутация G1896A в ргесоге-области (2 случая)

54 больных

НВ5Аё (-) НВеАё (-) АЬНВсог^О(+)

1 АЬНВе (+) - 36 больных ДНК ВГВ (+)

11% - в ткани печени 5,5% - в плазме

2 или АЬНВе (-) ДНК ВГВ (-)

мутация, приводящая к замене Glyl45Arg S-белка (3 случая)

Рис 2. Схема выявления мутантных форм ВГВ у больных из Петрозаводска.

В первую группу с серологическим профилем «дикого» типа вируса пошли 14 больных (24,1%), а но вторую, с серологическим профилем муталтного типа - 44 больных (75,9%). У всех 14 (100%) больных с «диким» типом выявлялась ДНК ВГИ в плазме крови и биоптатах печени. Во П группе ДИК ВГВ выявлялась в ткани печени - у 44 (100,0%) и в крови - у 29 (65,9%) больных.

Для подтверждения наличия мутации r precore/core области генома ИГВ нами были определены первичные нукледтшкые последовательности фрагментов генома ВГВ 6 мзоляток. полученных от пациентов с серологическим профилем мутант! юго типа. При анализе них последовательностей были выявлены мутации л пух типов: - AI762T и G1764Л в промоторе гена core, приводящие к уменьшению или прекращению синтеза

747 1673 С Т С Т G1' ^ Т G Т GA А С G AG G G АС С Г Т GAG GGA.TA.C Т Т СААЛйЛ С TiiTT TGTTT =vAAOAC T G 1732

? .....С......................................................

A ...........................................................-

S ............................................................

M Villi ИIИ II 1Г[11>МЛ11|)0

Г спя <011?

7 47 1733 GyJV^GAGTTGGGGG AGGAGATT AGATTAATGArCT"TTGTACT AGtoAGGCTfi'fАСОСЛТЛД 3 7 92

1 .............................A, G. . . .........................

2 .............................A..............................

3 .............................A, G............................

4 .............................A.G............................

'b .............................A, G. ...........................

У A 7 17 93 ATTGGT'OT'i^GCACCAGCACCArCCAACrTrTrCACCTCTGCCTAATC^TCTCA'rG'T'ICA 1B52

2 .....................................................Г

S .....................................................T

A ....................................................T

5 .....................................................T

Рис. 3. Выравнивание (alignment) фрагмента иуклеотнднон последовательности гемомя iuu»iHia jYs747 ВГВ, выделенного от больного с хроническим геиачитом В, IIBcAji ■

HiTftTllWlOT^.

I - dbj/A13205l27, 2 gh/AY73BI47, 3 - gb/DQ06f)829, 4 - gb'TJQ060S28. 5 - gb/DQ060827-нгшболее близкие после лов стельности in Gcndiank Стрелки указывают на ;шойную замену в промоторе гена core

HBeAg и усилению репликации вирусного генома (рис 3) (4 изолята), и нонсенс-мутация в1896А в ргесоге-области, которая приводит к синтезу короткого пептида из 28 аминокислот ргесоге/соге-белка предшественника и прекращению трансляции HBeAg (2 изолята)

Среди больных обеих групп наблюдались значительные отличия в клинических, лабораторных и вирусологических показателях Средний возраст и длительность заболевания были почти в 2 раза больше у больных II группы с мутантным типом инфекции Среди больных этой группы чаще диагностировался хронический гепатит высокой активности — у 20,5% и цирроз печени — также у 20,5% больных, в то время как среди больных I группы высокой активности процесса не было ни в одном случае, и цирроз печени выявлялся реже - у 7,1% (Р<0,05) пациентов Другие клинические и лабораторные показатели, такие как выраженность некротически-воспалительных изменений, уровень гамма-глобулинов и степень гистологической активности, свидетельствовали о большей патогенности мутантного вируса

В группе больных (36 человек), у которых не было НВвА§, НВеА§, выявлялись анти-НВе и анти-1 [Всог1цО, диагностика мутаций в ргеБ/в-области генома была затруднена, поскольку ДНК ВГВ выявлялась лишь у 4-х больных (11%), у двух из них - только в биоптате печени Однако нам удалось секвенировать участок гена Б изолятов ВГВ от 3-х больных данной группы Анализ предсказанных аминокислотных последовательностей, полученных для данных изолятов, выявил замену глицина на аргинин в 145 положении Данная мутация приводит к утрате антигенной детерминанты а и затрудняет проведение детекции НВбА£ У больных данной группы с двойной мутантной формой ВГВ-инфекции (HBsAg-минyc, HBeAg-минyc) течение заболевания было тяжелым В результате у 24 % больных этой группы сформировался цирроз печени к середине второй декады течения хронического гепатита

Выявление мутаций в У1УШ0-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В

Длительное течение заболевания ХГВ при различном уровне репликативной активности является условием для селекции лекартвенно-резистентных форм вируса Современные способы лечения хронического гепатита В не дают устойчивого эффекта Как правило, лечение аналогами нуклеозидов и нуклеотидов продолжается неопределенно долго, что может привести к развитию устойчивости возбудителя и отдаленным побочным эффектам Полимераза ВГВ, как и все РНК-зависимые полимеразы, содержит характерный мотив УМОП) (тирозин-метионин-аспарагиновая кислота-аспарагиновая кислота) сайта каталитического расщепления, локализованного внутри субдомена С Мутации, вызывающие замену метионина на валин или изолейцин в 204 положении, приводят к нарушению способности дНТФ-связывающего кармана полимеразы взаимодействовать с нуклеотидами, в том числе и с их аналогами, служащими для терминации синтеза вирусной ДНК и прекращения работы полимеразы

Таблица 1.

Мутации в УМОО-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В

№ сыв-к» Позиции аминокислот и соответствующие им нуклеотидные последовательности в гене ДНК-поличерагы ВГВ

203 204 205 206

726 ТЛТ (Туг) АТв (Ме1) ОАТ (Авр) СЛТ (Авр)

727 ТАТ (Туг) АТС(МеО ОА1 (Авр) вАТ (Авр)

781 ТАТ (Туг) <;п; (Уа1) ОАТ(Авр) САТ (Авр)

1172 ТЛТ (Туг) ЛТТ(Ие) ОАТ(Авр) ОА1 (Авр)

1531 ТЛТ(Туг) вТв (Уа1) ОЛТ(Авр) влт (Авр)

732 ТАТ (Ту г) в! С (Уа1) САТ (Авр) САТ (Авр)

747 ТАТ (Т\г) АТТ(Не) САТ(Авр) вАТ (Авр)

182 ТАТ (Туг) АТТ(Ие) САТ(Авр) вАТ (Авр)

1049 ТАТ (Туг) <;тс; (\а1) ОАТ(Авр) ОЛТ (Авр)

1684 ТЛТ(Туг) СТС (Уа1) ОАТ(Лвр) ОАТ (Лвр)

2165 ТАТ(Т\г) АТС(Ме1) САТ(Аэр) вЛТ (Авр)

Выявление мутаций в УМОО-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В проводили у 11 больных, длительно получавших терапию ламивудином (более 48 недель) Прямое секвенирование фрагментов генома вируса гепатита В выявило 2 типа мутаций

Мутации в УМОО-участке вируса гепатита В были обнаружены у 8 из 11 больных с ХГВ, длительно получавших терапию ламивудином (табл 1) При этом в 5 случаях наблюдалась замена М204У (45,5%), а в трех случаях -М2041 (27,3%)

Выявленные мутации являются доминирующими среди мутаций, определяющих развитие устойчивости к ламивудину (ЫаоЫго Капиуа, 2003)

ВЫВОДЫ

1 В Санкт-Петербурге и Карелии выявлена циркуляция двух генотипов ВГВ А и Э Среди больных ХГВ этих регионов ВГВ был представлен преимущественно генотипом О В Карелии встречаемость генотипа А была выше, чем в Санкт-Петербурге и составила 20,3% и 7%, соответственно

2 В Якутии у больных ХГВ были обнаружены 3 генотипа ВГВ, причем генотип Б составил 42,4%, А — 25,4%, С - 25,4% случаев В двух образцах плазмы крови была обнаружена коинфекция генотипами АиБ,ав двух других - генотипами А и С (6,8%) Высокая частота одновременного инфицирования двумя генотипами в Якутии может быть обусловлена высокой эндемичностью этого региона по гепатиту В и, соответственно, высокой вероятностью повторного заражения

3 Среди больных с генотипом А чаще диагностировался хронический гепатит высокой активности и отмечалось более тяжелое течение хронического гепатита, более выраженный некротически-воспалительный синдром, отмечалась тенденция к более раннему формированию цирроза печени по сравнению с генотипом О

4 Среди больных хроническим гепатитом В в Карелии преобладает HBeAg-негативная форма ВГВ-инфекции, вызываемая мутациями в precore/core-области вируса гепатита В и характеризующаяся тяжелым прогрессирующим течением с частым формированием цирроза печени к концу второго десятилетия течения болезни

5 У больных с HBeAg-негативной формой ВГВ-инфекции выявлены мутации двух типов в промоторе гена core и нонсенс-мутация в ргесоге-области

6 Особенностью диагностики HBV-инфекции при HBsAg-негативной форме ХГВ является редкое обнаружение виремии методом ПЦР Анализ нуклеотидных последовательностей, полученных для 3-х изолятов от больных с HBsAg-негативной формой ХГВ, выявил мутацию, приводящую к замене глицина на аргинин в 145 положении

7 У больных с ХГВ, длительно получавших монотерапию ламивудином, были выявлены мутации, приводящие к замене метионина на валин (45,5%) или изолейцин (27,3%) в 204 положении ДНК-полимеразы, являющиеся доминирующими среди мутаций устойчивости к ламивудину

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1 Грудинин М П , Виноградова Е Н , Писарева М.М , Тарасов К В , Иванюшина В А , Решетникова О Ю , Рыжова Е В , Бехтерева Т А , Романова С Ю , Семенов С Н , Шелухина В Р , Пискарев И Г , Каторгина JI Г , Яковлев А А , Киселев О И Полимеразная цепная реакция как один из компонентов комплексной диагностики вирусных гепатитов // В сб Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции - Санкт-Петербург - 1997 - Т 1 - С 22-32

2 Писарева М.М., Морозов В М , Тарасов К В , Решетникова О Ю , Семенов С Н , Виноградова Е Н, Киселев О И , Грудинин М П Полимеразная цепная реакция как один из компонентов комплексной диагностики гепатита В // Вопросы вирусологии -1999 -№6 -С 284-286

3 Morozov V М, Pisareva М М., Groudinin М Р Homologous recombination between different genotypes of hepatitis В virus//GENE -2000 -V 260 -P 5565

4 Горячева Л Г, Мукомолова А Л, Писарева М.М. Течение вирусных гепатитов В и С у детей при перинатальном инфицировании // Сборник научных трудов, посвященный 100-летию СПб ГПМА — Санкт-Петербург -2005 -С 47-50

5 О П Дуданова, О ИЛхонтова, О И Киселев, М П Грудинин, М.М.Писарева Влияние генотипических и фенотипических свойств вируса гепатита В на течение хронического гепатита//Гепатология -2005 — №3 —С 3-10

6 О П Дуданова, И И Яхонтова, Л Н Вапенкевич, О И Киселев, М П Грудинин, М.М.Писарева Диагностические, клинические и морфологические особенности хронического гепатита В - "дикой" и мутантной" форм // Мед акад журнал - 2006 - Т 6, № 2 - С 86-93

Тезисы докладов

1 Писарева М.М., Морозов В М , Тарасов К В , Решетникова О Ю , Семенов С Н , Виноградова Е Н , Грудинин М П Полимеразная реакция в комплексной диагностике вирусного гепатита В // Тезисы 2-ой Международной конференции, посвященной 75-летию С -Петербургского института им Пастера, "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" - 1998 - Санкт-Петербург -С 93

2 Морозов В М , Писарева М.М., Грудинин М П , Киселев О И Гомологичная рекомбинация между различными генотипами вируса гепатита В // Тезисы конференции «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций» - 2001 -Санкт-Петербург - С 48

3 Писарева М.М., Морозов В М , Бузицкая Ж В , Котив М Я , Горячева Л Г , Грудинин М П, Киселев О И ПЦР-диагностика вируса гепатита В для контроля эффективности противовирусной терапии // Тезисы конференции «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии,

эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекний» - 2001 -Санкт-Петербург - С 32

4 Морозов В М, Писарева М.М, Слепцова С С, Грудинин М П Генотипирование вариантов вируса гепатита В, циркулирующих в Якутии // Тезисы международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» - 2003 - Санкт-Петербург - С 80

5 Дуданова О П , Грудинин М П , Писарева М.М Влияние тканевой вирусной нагрузки на развитие печеночно-клеточного повреждения при хроническом гепатите В // Медицинскии Академический Журнал - 2003 - Т 3 - №3 - С 66

6 М. М. Писарева, В М Морозов, К В Тарасов, В А, Иванюшина, Ж Б Бузицкая, С И Семенов, О П Дуданова, М П Грудинин Генетическое разнообразие вирусов гепатита В, С и О в различных регионах Российской Федерации // Тезисы Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты», Международного мультидисциплинарного семинара «Микробициды для здоровья и репродукции человека Медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» - 2004 - С-Петербург — С 68

7 О П Дуданова, М. М. Писарева, М П Грудинин Генотипическая характеристика хронической НВУ-инфекции в Карелии // Тезисы V Съезда Научного Общества Гастроэнтрологов России ХХХ11 Сессия ЦНИИГ - 2005 -Москва-С 235-236

8 Дуданова О П , Яхонтова О И, Писарева М.М , Грудинин М П Особенности клинического течения хронического гепатита В в зависимости от генотипа НВУ // 7-й Международный Славяно-Балтийский научный форум «Санкт-Петербург-Гастро-2005» -2005 - С М44

9 Шубина М.Э , Валенкевич Л Н , Дуданова О П, Писарева М.М Особенности распространенности генотипов среди больных хроническим вирусным гепатитом В в Республике Карелия // Материалы 7-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург-Гастро-2005» -Гастроэнтерология Санкт-Петербурга -2005 -№1-2 - С М159

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность моему научному руководителю академику Олегу Ивановичу Киселеву за постоянное внимание и помощь в работе, профессору кафедры пропедевтики внутренних болезней Петрозаводского государственного университета д м н Ольге Петровне Дудановой и заведующему инфекционного отделения больницы г Якутска д м н Сергею Иннокентьевичу Семенову за предоставление клинических и лабораторных данных и плодотворное сотрудничество

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Писарева, Мария Михайловна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Молекулярная биология ВГВ.

2.1.1. Структура и организация генома.

2.1.2. Вирусные белки.

2.1.3. Жизненный цикл ВГВ.

2.1.4. Репликация ВГВ.

2.1.5. Серологические маркеры инфекции ВГВ.

2.2. Молекулярные варианты ВГВ.

2.2.1. Генотипы ВГВ.

2.2.2. Сочетанное инфицирование различными генотипами

2.2.3. HBeAg варианты и HBeAg-серонегативность.

2.2.4. HBsAg варианты и уход от иммунного ответа.

2.2.5. Мутанты рге-соге и core гена.

2.2.6. Мутации устойчивости к ламивудину и другим нуклеозидным аналогам.

3. Материалы и методы.

4. Результаты собственных исследований.^

4.1. Генотипирование ВГВ в популяциях больных гепатитом В в Санкт-Петербурге, Петрозаводске и Якутии.

4.2. Выявление мутантных форм вируса гепатита В.

4.3. Выявление мутаций в YMDD-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В.

4.4. Анализ аминокислотных замен.

5. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-биологические особенности вируса гепатита B дикой и мутантной форм в трех регионах Российской Федерации"

Актуальность проблемы

Вирус гепатита В (ВГВ) является одним из самых распространенных гепатотропных вирусов, вызывающих хроническое поражение печени (Балаян М.С. и Михайлов М.И., 1999; Львов Д.К., 2000; Шахгильдян И.В., 2001; Ивашкин В.Т., 2002). Несмотря на программу вакцинации против ВГВ в России распространенность ВГВ-инфекции продолжает неуклонно возрастать. Клинические проявления хронического вирусного гепатита (ХВГ) многообразны и зависят в основном от биологических свойств вируса и особенностей его взаимодействия с иммунной системой хозяина (Oldstone S.etal., 1991).

Антигенная специфичность белковых структур ВГВ определяется генотипической принадлежностью вирусов и возникающими мутациями, которые меняют фенотип вируса и влияют на течение ХВГ (Brunetto M.R. et al., 1999; Chan H.L. et al, 2002; Sumi H. et al., 2003; Norder H, 2004; Hunt C.M. et al., 2004; Baumert T.F. et al., 2005). Вирус гепатита В считается наиболее изученным среди остальных вирусов гепатита. Однако в последнее десятилетие возрос интерес к влиянию генетической вариабельности ВГВ на течение и исход болезни. Генетическая вариабельность проявляется как в возникновении мутаций в вирусном геноме у каждого инфицированного субъекта, так и в существовании различных генотипов ВГВ, свойственных определенным популяциям носителей.

Современная классификация ВГВ включает восемь генетических групп, обозначенных латинскими буквами от А до Н (Schaefer S., 2007). В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что генотип ВГВ может влиять на скорость сероконверсии е-антигена, тяжесть течения болезни, частоту хронизации и вероятность развития гепатокарциномы (Buti М. et al., 2005). Кроме того, ответ на антивирусную терапию среди пациентов с хроническим гепатитом, по крайней мере, частично связан с генотипом ВГВ. Распределение генотипов варьирует в зависимости от географических регионов мира, а информация по молекулярной эпидемиологии вирусов гепатита в Российской Федерации по сравнению с другими странами весьма скудная. Следует отметить, что к настоящему времени отсутствуют диагностические тест-системы для генотипирования вируса гепатита В.

Вопросы распространения мутантных форм ВГВ, генотипов ВГВ, особенности течения ХВГ при разных формах ВГВ-инфекции требуют дальнейшего изучения. Серологическая диагностика не охватывает всего разнообразия форм хронического гепатита В вследствие снижения образования или секреции ВГВ-антигенов из-за появления мутаций в precore/core и pres/s-области генома (Santantonio Т. et al., 1992; Baumert T.F., 1995; Brunetto M.R. et al., 1999; Khan N., 2004).

Противовирусная терапия (ПВТ) при ХВГ имеет малую эффективность, высокую стоимость, вызывает тяжелые побочные эффекты и недостаточно активно внедряется в практическое здравоохранение (Ивашкин В. Т. с соавт., 2003; Радченко В. Г. с соав., 2004; Hadzyannis S. J. et al., 2004; Zeuzeum S. et al., 2005). Как правило, лечение аналогами нуклеозидов и нуклеотидов продолжается неопределенно долго, что может привести к развитию лекарственной устойчивости вируса гепатита В. В настоящее время очень мало известно о том, какие мутации ВГВ приводят к возникновению лекарственной устойчивости в российской популяции пациентов.

Целью работы явилось изучение молекулярно-биологических особенностей вируса гепатита В диких и мутантных форм в трех регионах Российской Федерации.

Задачи исследования

1. Определить распределение различных генотипов ВГВ в Санкт-Петербурге, Карелии и Якутии, выявить зависимость тяжести течения заболевания от генотипа вируса.

2. Определить степень распространенности ргесоге/соге и ргез/в-мутантных форм ВГВ среди обследованных больных. Выявить изменения в геноме вируса гепатита В, приводящие к возникновению мутантной формы.

3. Выявить мутации ВГВ, приводящие к появлению устойчивости к ламивудину у обследованных больных.

Научная новизна исследования

Впервые установлена широкая распространенность среди больных хроническим гепатитом В НВеА§-негативной и НВзА§-негативной форм заболевания, обусловленных ргесоге/соге и ргез/я-мутантными типами вируса.

Впервые обнаружено преимущественное инфицирование больных ХГВ вирусом гепатита В генотипа Б и редкое инфицирование ВГВ генотипа А в Санкт-Петербурге и Карелии. Выявлены особенности клинического течения хронического гепатита в зависимости от генотипа вируса гепатита В.

Практическая значимость

В связи с отсутствием диагностических тест-систем для генотипирования вируса гепатита В, исследование распространения различных генотипов вируса в различных регионах РФ и апробация алгоритма генодиагностики и генотипирования вируса имеет важное практическое значение для предсказания тяжести течения заболевания и результатов противовирусной терапии. Выявление особенностей распространения и роль эндемичности в циркуляции определенных генотипов возможны при изучении этих процессов в географически близких и отдаленных регионах страны.

Положения, выносимые на защиту

1. В трех регионах РФ (Санкт-Петербург, Карелия и Якутия) встречаются генотипы А, Б и С вируса гепатита В. Распределение генотипов различается в зависимости от исследованного региона РФ. Генотипическая принадлежность ВГВ оказывает влияние на выраженность клинических проявлений и тяжесть течения хронического гепатита В.

2. В настоящее время HBeAg-нeгaтивнaя и НВ8А§-негативная формы гепатита В, обусловленные ргесоге/соге- и ргез/Б-мутантными типами вируса, часто встречаются среди больных ХГВ и характеризуются тяжелым прогрессирующим течением заболевания и низкой репликативной активностью ВГВ, что затрудняет его молекулярно-генетическую характеристику.

3. Развитие устойчивости к терапии ламивудином у обследованных больных определяется двумя различными мутациями в так называемом УМОЭ-участке гена ДНК-полимеразы вируса гепатита В, приводящими к замене метионина на валин или изолейцин в 204 положении.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Автором выполнены ПЦР-диагностика, генотипирование вируса гепатита В и секвенирование различных фрагментов генома вируса. Автором проведен сравнительный анализ полученных данных с клиническими и серологическими показателями, а также статистическая обработка результатов. На основании полученных данных разработан и применен алгоритм генотипирования, позволяющий предсказывать течение заболевания и эффективность противовирусной терапии.

Внедрение в практику

Методы генотипирования вируса гепатита В и секвенирования различных участков генома вируса используются для предсказания исхода заболевания и результатов терапии у больных ХГВ в Специализированной клинике ГУ НИИ гриппа РАМН Санкт-Петербурга, отделении ОКБ, поликлиниках г. Петрозаводска, поликлинике КНМЦ СЗО РАМН.

Апробация диссертации

По данным работы опубликовано 15 научных работ, из них - 6 статей. Материалы диссертации были представлены на 2-ой Международной конференции, посвященной 75-летию С.-Петербургского института им. Пастера, "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями", 2-4 сентября 1998 г., ; конференции «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций», 2001, Санкт-Петербург; Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», 4-5 сентября 2003 г., Санкт-Петербург; конференции, посвященной 150-летию со дня рождения П.М.Альбицкого, 9-10 октября 2003 г., С-Петербург; V съезде Научного Общества Гастроэнтерологов России, XXXII сессии ЦНИИ Гастро-энтерологии 3-6 февраля 2005, Москва; Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты»; Международном мультидисциплинарном семинаре «Микробиоциды для здоровья и репродукции человека. Медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» 2-5 ноября 2004 г.; 6-м Международном СлавяноБалтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2005». 9

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4-х глав результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 11 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 238 источников, в том числе 7 на русском и 231 на английском языках.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Писарева, Мария Михайловна

Выводы

1. В Санкт-Петербурге и Карелии выявлена циркуляция двух генотипов ВГВ: А и D. Среди больных ХГВ этих регионов ВГВ был представлен преимущественно генотипом D. В Карелии встречаемость генотипа А была выше, чем в Санкт-Петербурге и составила 20,3% и 7%, соответственно.

2. В Якутии у больных ХГВ были обнаружены 3 генотипа ВГВ, причем генотип D составил 42,4%, А - 25,4%, С - 25,4% случаев. В двух образцах плазмы крови была обнаружена коинфекция генотипами А и D, а в двух других - генотипами А и С (6,8%). Высокая частота одновременного инфицирования двумя генотипами в Якутии может быть обусловлена высокой эндемичностью этого региона по гепатиту В и, соответственно, высокой вероятностью повторного заражения.

3. Среди больных с генотипом А чаще диагностировался хронический гепатит высокой активности и отмечалось более тяжелое течение хронического гепатита, более выраженный некротически-воспалительный синдром, отмечалась тенденция к более раннему формированию цирроза печени по сравнению с генотипом D.

4. Среди больных хроническим гепатитом В в Карелии преобладает HBeAg-негативная форма ВГВ-инфекции, вызываемая мутациями в ргесоге/соге-области вируса гепатита В и характеризующаяся тяжелым прогрессирующим течением с частым формированием цирроза печени к концу второго десятилетия течения болезни.

5. У больных с HBeAg-негативной формой ВГВ-инфекции выявлены мутации двух типов: в промоторе гена core и нонсенс-мутация в ргесоге-области.

6. Особенностью диагностики ВГВ-инфекции при HBsAg-негативной форме ХГВ является редкое обнаружение виремии методом ПЦР. Анализ

86 нуклеотидных последовательностей, полученных для 3-х изолятов от больных с HBsAg-нeгaтивнoй формой ХГВ, выявил мутацию, приводящую к замене глицина на аргинин в 145 положении.

7. У больных с ХГВ, длительно получавших монотерапию ламивудином, были выявлены мутации, приводящие к замене метионина на валин (45,5%) или изолейцин (27,3%) в 204 положении ДНК-полимеразы, являющиеся доминирующими среди мутаций устойчивости к ламивудину.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность моему научному руководителю д.б.н., академику Олегу Ивановичу Киселеву за постоянное внимание и помощь в работе, профессору кафедры пропедевтики внутренних болезней Петрозаводского государственного университета д.м.н. Ольге Петровне Дудановой и заведующему инфекционного отделения больницы г.Якутска д.м.н. Сергею Иннокентьевичу Семенову за предоставление клинических и лабораторных данных и плодотворное сотрудничество.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Писарева, Мария Михайловна, Санкт-Петербург

1. Балаян М.С., Михайлов М.И. // Энциклопедический словарь -вирусные гепатиты. М., 1999.

2. Ивашкин В.Т.(ред.) // Болезни печени и желчевыводящих путей. М.: М-Вести, 2002; 39-58.

3. Львов Д.К. Вирусные гепатиты. // Вопросы вирусологии. — 2002. — № 6. — С. 44-46.

4. Нетесова И.Г. Субтип HBs как одна из характеристик инфекции гепатита В у различных групп населения Западной Сибири. // Автореф. канд. биол. наук., Кольцово, 2002, 19 с.

5. Шахгильдян И.В. Гепатиты В,С и Д: Проблемы диагностики, лечения и профилактики. // Тез. докл. 2001. - С. 28-29.

6. Яшина T.JL, Фаворов М.О., Шахгильдян И.В. и др.//Вопр. вирусол., 1992, №4, с. 194-196.

7. Akarca US, Lok AS. Naturally occurring hepatitis В virus core gene mutations. // Hepatology, 1995, 22(l):50-60.

8. Alexopoulou A, Karayiannis P, Hadziyannis SJ, Aiba N, Thomas HC. Emergence and selection of HBV variants in an anti-HBe positive patient persistently infected with quasi-species. // J. Hepatol., 1997, 26(4):748-753.

9. Arauz-Ruiz P, Norder H, Visona KA, Magnius LO. Molecular epidemiology of hepatitis B virus in Central America reflected in the genetic variability of the small S gene. // J. Infect. Dis., 1997, 176(4):851-858.

10. Arauz-Ruiz P, Norder H, Robertson BH, Magnius LO. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America. // J. Gen. Virol., 2002, 83(Pt 8):2059-2073.

11. Asahina Y, Enomoto N, Ogura Y, Kurosaki M, Sakuma I, Izumi N, Marumo F, Sato C. Sequential changes in full-length genomes of hepatitis B virus accompanyingacute exacerbation of chronic hepatitis B. // J. Hepatol., 1996, 25(6):787-794.

12. Aye TT, Uchida T, Becker SO, et al. Variations of hepatitis B virus precore/core gene sequence in acute and fulminant hepatitis B. Dig. Dis. Sci., 1994,39:1281-7.

13. Banerjee K, Guptan RC, Bisht R, Sarin SK, Khandekar P. Identification of a novel surface mutant of hepatitis B virus in a seronegative chronic liver disease patient. // Virus. Res., 1999, 65(2): 103-109.

14. Barnabas S, Hai T, Andrisani OM. The hepatitis B virus X protein enhances the DNA binding potential and transcription efficacy of bZip transcription factors. //J. Biol. Chem., 1997, 272(33):20684-20690.

15. Baumert TF, Barth H, Blum HE. Genetic variants of hepatitis B virus and their clinical relevance. // Minerva Gastroenterol. Dietol., 2005, 51(1):95-108.

16. Baumert TF, Thimme R, Weisacker F. Pathogenesis of hepatitis B virus infection. // World J. Gastroenterol., 2007, 13(l):82-90.

17. Beasley R, Hwang L, Lin C, Chien C. Hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus: A prospective study of 22707 men in Taiwan. // Lancet, 1981,2:1129-1133.

18. Blumberg B.S., Alter H.J., Visnich S. A "new" antigen in leukemia sera. //JAMA, 1965, 191, 541-546.

19. Bowyer SM, van Staden L, Kew MC, Sim JG. A unique segment of the hepatitis B virus group A genotype identified in isolates from South Africa. // J. Gen. Virol., 1997, 78 (Pt 7): 1719-1729.

20. Bozkaya H, Ayola B, Lok AS. High rate of mutations in the hepatitis B core gene during the immune clearance phase of chronic hepatitis B virus infection. //Hepatology, 1996, 24(l):32-37.

21. Breiner KM, Urban S, Schaller H.Carboxypeptidase D (gpl80), a Golgi-resident protein, functions in the attachment and entry of avian hepatitis B viruses. //J. Virol., 1998, 72(10):8098-8104.

22. Brunetto MR, Stemler M, Bonino F, Schodel F, Oliveri F, Rizzetto M, Verme G, Will H. A new hepatitis B virus strain in patients with severe anti-HBe positive chronic hepatitis B.// J. Hepatol., 1990, 10:258-261.

23. Brunetto MR, Rodriguez UA, Bonino F. Hepatitis B virus mutants. // Intervirology, 1999, 42(2-3):69-80.

24. Bruss V, Ganem D. The role of envelope proteins in hepatitis B virus assembly. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88(3): 1059-1063.

25. Bruss V, Thomssen R. Mapping a region of the large envelope protein required for hepatitis B virion maturation. // J. Virol, 1994, 68(3): 16431650.

26. Bruss V, Lu X, Thomssen R, Gerlich WH. Post-translational alterations in transmembrane topology of the hepatitis B virus large envelope protein. // EMBO J., 1994, 13(10):2273-2279.

27. Bruss V, Vieluf K. Functions of the internal pre-S domain of the large surface protein in hepatitis B virus particle morphogenesis. // J. Virol., 1995, 69(11):6652-6657.

28. Bruss V, Hagelstein J, Gerhardt E, Galle PR. Myristylation of the large surface protein is required for hepatitis B virus in vitro infectivity. // Virology, 1996, 218(2):396-399.

29. Carman WF, Jacyna MR, Hadziyannis S, et al. Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection. // Lancet, 1989, 2:588-91.

30. Chao L. Fitness of RNA virus decreased by Muller's ratchet. // Nature, 1990, 348(6300):454-455.

31. Chao L, Tran TT, Tran TT. The advantage of sex in the RNA virus phi6. // Genetics, 1997, 147(3):953-959.

32. Chisari FV. Rous-Whipple Award Lecture. Viruses, immunity, and cancer: lessons fromhepatitis B. //Am. J. Pathol., 2000, 156(4): 1117-1132.

33. Chong-Jin O, Wei Ning C, Shiuan K, Gek Keow L. Identification of hepatitis B surface antigen variants with alterations outside the "a" determinant in immunized Singapore infants. // J. Infect. Dis., 1999, 179:259-63.

34. Chu CJ, Hussain M, Lok AS. Hepatitis B virus genotype B is associated with earlier HBeAg seroconversion compared with hepatitis B virus genotype C. // Gastroenterology, 2002, 122(7): 1756-1762.

35. Clayton RF, Owsianka A, Patel AH. Evidence for structural differences in the S domain of L in comparison with S protein of hepatitis B virus. //J. Gen. Virol., 2001, 82(Pt 7): 1533-1541.

36. Courouce A.M., Holland P.V., Muller J.Y., Soulier J.P. HBs antigen subtypes. // Bibliotheca haematologica, 1976, 42, 1.

37. Courouce-Pauty A.M., Lamaire J.M., Roux J.F. New hepatitis B surface antigen subtypes inside the ad category. // Vox sanguinis, 1978, 35, 304-308.

38. Cui C, Shi J, Hui L, Xi H, Zhuoma, Quni, Tsedan, Hu G. The dominant hepatitis B virus genotype identified in Tibet is a C/D hybrid. // J. Gen. Virol. 2002, 83(Pt 11):2773-2777.

39. Cullen BR. Nuclear RNA export pathways. // Mol. Cell. Biol., 2000, 20(12):4181-4187.

40. Dane D.S., Cameron C.H., Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australia antigen associated hepatitis. // Lancet, 1970, 2, 695698.

41. Devarbhavi HC, Cohen AJ, Patel R, Wiesner RH, Dickson RC, Ishitani MB. Preliminary results: outcome of liver transplantation for hepatitis B virus varies by hepatitis B virus genotype. // Liver Transpl., 2002, 8(6):550-555.

42. Ding X, Mizokami M, Yao G, Xu B, Onto E, Ueda R, Nakanishi M. Hepatitis B virus genotype distribution among chronic hepatitis B virus carriers in Shanghai, China. // Intervirology, 2001, 44(l):43-47.

43. Eckhardt SG, Milich DR, McLachlan A. Hepatitis B virus core antigen has two nuclear localization sequences in the arginine-rich carboxyl terminus. //J. Virol., 1991, 65(2):575-582.

44. Eble BE, MacRae DR, Lingappa VR, Ganem D. Multiple topogenic sequences determine the transmembrane orientation of the hepatitis B surface antigen. //Mol. Cell. Biol., 1987, 7(10):3591-3601.

45. Feitelson MA, Zhu M, Duan LX, London WT. Hepatitis B x antigen and p53 are associated in vitro and in liver tissues from patients with primary hepatocellular carcinoma. // Oncogene, 1993, 8(5): 1109-1117.

46. Feitelson MA. Biology of disease. Biology of hepatitis B virus variants. // Lab. Invest., 1994, 71:324^19.

47. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. // Evolution, 1985, 39:783-791.

48. Felsenstein J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3.5c, 1993.

49. Franco A, Paroli M, Testa U, Benvenuto R, Peschle C, Balsano F, Barnaba V. Transferrin receptor mediates uptake and presentation of hepatitis B envelope antigen by T lymphocytes. // J. Exp. Med., 1992, 175(5):1195-1205.

50. Friedt M, Gerner P, Lausch E, Trubel H, Zabel B, Wirth S. Mutations in the basic core promotor and the precore region of hepatitis B virus and their selection in children with fulminant and chronic hepatitis B. // Hepatology, 1999, 29(4): 1252-1258.

51. Fujie H, Moriya K, Shintani Y, Yotsuyanagi H, lino S, Koike K. Hepatitis B virus genotypes and hepatocellular carcinoma in Japan. // Gastroenterology, 2001, 120(6): 1564-1565.

52. Ganem D, Varmus HE. The molecular biology of the hepatitis B viruses. // Annu. Rev. Biochem., 1987, 56:651-693.

53. Garcia AD, Ostapchuk P, Hearing P. Functional interaction of nuclear factors EF-C, FINF-4, and RXR alpha with hepatitis B virus enhancer I. // J. Virol., 1993, 67(7):3940-3950.

54. Gerelsaikhan T, Tavis JE, Bruss V. Hepatitis B virus nucleocapsid envelopment does not occur without genomic DNA synthesis. // J. Virol., 1996, 70(7):4269-4274.

55. Gong SS, Jensen AD, Chang CJ, Rogler CE. Double-stranded linear duck hepatitis B virus (DHBV) stably integrates at a higher frequency than wild-type DHBV in LMH chicken hepatoma cells. // J. Virol., 1999, 73(2): 1492-1502.

56. Goodrich DW, Duesberg PH. Retroviral recombination during reverse transcription. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87(6):2052-2056.

57. Gripon P, Le Seyec J, Rumin S, Guguen-Guillouzo C. Myristylation of the hepatitis B virus large surface protein is essential for viral infectivity. //Virology, 1995, 213(2):292-299.

58. Guidotti LG, Matzke B, Schaller H, Chisari FV. High-level hepatitis B virus replication in transgenic mice. // J. Virol., 1995, 69(10):6158-6169.

59. Gunther S, Paulij W, Meisel H, Will H. Analysis of hepatitis B virus populations in an interferon-alpha-treated patient reveals predominant mutations in the C-gene and changing e-antigenicity. // Virology, 1998, 244(1): 146-160.

60. Gunther S, Fischer L, Pult I, Sterneck M, Will H. Naturally occurring variants of hepatitis B virus. //Adv. Virus. Res., 1999, 52:25-137.

61. Guo JT, Pugh JC. Topology of the large envelope protein of duck hepatitis B virus suggests a mechanism for membrane translocation during particle morphogenesis. // J. Virol., 1997, 71(2): 1107-1114.

62. Guo WT, Wang J, Tam G, Yen TS, Ou JS. Leaky transcription termination produces larger and smaller than genome size hepatitis B virus X gene transcripts. // Virology, 1991, 181(2):630-636.

63. Guo W, Chen M, Yen TS, Ou JH. Hepatocyte-specific expression of the hepatitis B virus core promoter depends on both positive and negative regulation. //Mol. Cell. Biol., 1993, 13(l):443-448.

64. Hannoun C, Norder H, Lindh M. An aberrant genotype revealed in recombinant hepatitis B virus strains from Vietnam. // J. Gen. Virol., 2000, 81(Pt 9):2267-2272.

65. Hannoun C, Krogsgaard K, Horal P, Lindh M. Genotype mixtures of hepatitis B virus in patients treated with interferon. // J. Infect. Dis., 2002, 186(6):752-759.

66. He C, Nomura F, Itoga S, Isobe K, Nakai T. Prevalence of vaccine-induced escape mutants of hepatitis B virus in the adult population in China: a prospective study in 176 restaurant employees. // J. Gastroenterol. Hepatol., 2001, 16(12):1373-1377.

67. Heermann KH, Goldmann U, Schwartz W, Seyffarth T, Baumgarten H, Gerlich WH. Large surface proteins of hepatitis B virus containing the pre-s sequence. //J. Virol., 1984, 52(2):396-402.

68. Heijtink RA, van Hattum J, Schalm SW, Masurel N. Co-occurrence of HBsAg and anti-HBs: two consecutive infections or a sign of advanced chronic liver disease? // J. Med. Virol, 1982, 10(2):83-90.

69. Henning L. WinGene/WinPep: User-friendly software for the analysis of aminoacid sequences. BioTechniques 1999, 26,1170-1172

70. Hino O, Tabata S, Hotta Y. Evidence for increased in vitro recombination with insertion of human hepatitisB virus DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88(20):9248-9252.

71. Hu J, Seeger C. Hsp90 is required for the activity of a hepatitis B virus reverse transcriptase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93(3): 10601064.

72. Huang ZM, Yen TS. Role of the hepatitis B virus posttranscriptional regulatory element in export of intronless transcripts. // Mol. Cell. Biol., 1995, 15(7):3864-3869.

73. Ishikawa K, Koyama T, Masuda T. Prevalence of HBY genotypes in asymptomatic carrier residents and their clinical characteristics during long-term follow-up: the relevance to changes in the HBeAg/anti-HBe system. // Hepatol. Res., 2002, 24(1): 1.

74. Junker-Niepmann M, Bartenschlager R, Schaller H. A short cis-acting sequence is required for hepatitis B virus pregenome encapsidation and sufficient for packaging of foreign RNA. // EMBO J., 1990, 9(10):3389-3396.

75. Kao JH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS. Hepatitis B genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B. // Gastroenterology, 2000a, 118(3):554-559.

76. Kao JH, Wu NH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS. Hepatitis B genotypes and the response to interferon therapy. // J. Hepatol., 2000b, 33(6):998-1002.

77. Kao JH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS. Acute exacerbations of chronic hepatitis B are rarely associated with superinfection of hepatitis B virus. // Hepatology, 2001, 34(4 Pt l):817-823.

78. Kao J.H., Chen D.S. Reply on "Hepatitis B virus genotypes and hepatocellular carcinoma in Japan". // Gastroenterology, 2001, 120, 6:1564.

79. Kato H, Orito E, Gish RG, Bzowej N, Newsom M, Sugauchi F, Suzuki S, Ueda R, Miyakawa Y, Mizokami M. Hepatitis B e antigen in sera from individuals infected with hepatitis B virus of genotype G. // Hepatology, 2002b, 35(4):922-929.

80. Kenney JM, von Bonsdorff CH, Nassal M, Fuller SD. Evolutionary conservation in the hepatitis B virus core structure: comparison of human and duck cores. // Structure, 1995, 3(10):1009-1019.

81. Kidd-Ljunggren K, Miyakawa Y, Kidd AH. Genetic variability in hepatitis B viruses. // J. Gen. Virol, 2002, 83(Pt 6): 1267-1280.

82. Kimura M (1980) A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. // J. Mol.Evol., 16:111-120.

83. Kock J, Borst EM, Schlicht HJ. Uptake of duck hepatitis B virus into hepatocytes occurs by endocytosis but does not require passage of the virus through an acidic intracellular compartment. // J. Virol., 1996, 70(9):5827-5831.

84. Kramvis A, Bukofzer S, Kew MC, Song E. Nucleic acid sequence analysis of the precore region of the hepatitis B virus from sera of southern African black adult carriers of the virus. Hepatology 1997;25:235^40.

85. Kramvis A, Bukofzer S, Kew MC, Song E. Nucleic acid sequence analysis of the precore region of the hepatitis B virus from sera of southern African black adult carriers of the virus. // Hepatology, 1997, 25:235-40.

86. Kramvis A, Kew MC. Structure and function of the encapsidation signal of hepadnaviridae. // J. Viral. Hepatitis, 1998, 5:357-67.

87. Sudhir Kumar, Koichiro Tamura, Ingrid B. Jakobsen, and Masatoshi Nei. MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis software, Arizona State University, Tempe, Arizona, USA, 2001.

88. Ladner SK, Miller TJ, Otto MJ, King RW. The hepatitis B virus M539V polymerase variation responsible for 3TC resis-tance also conferscross-resistance to other nucleoside analogues. // Antiviral Chem. Chemother., 1998, 9:65-72.

89. Lai ME, Solinas A, Mazzoleni AP, et al. The role of pre-core hepatitis B virus mutants on the long-term outcome of chronic hepatitis B virus hepatitis. A longitudinal study. // J. Hepatol, 1994, 20:773-81.

90. Lai M.E., Melis A., Massoleni A.P., Balestrieri A. Sequence analysis of hepatitis B virus genome of new mutant ayw subtype isolated in Sardinia. //Nucleic. Acids Res., 1991, 19: 5078.

91. Lai M.E., Massoleni A.P., Melis A., Balestrieri A. 1992. Unpublished. Direct submission to the EMBL/GenBank/DDBJ databases.

92. Lambert C. and Prange R. Dual topology of the hepatitis B virus large envelope protein: determinants influencing post-translational pre-S translocation. // J. Biol. Chem., 2001, 276(25):22265-22272.

93. Lanford RE, Notvall L, Lee H, Beames B. Transcomplementation of nucleotide priming and reverse transcription between independently expressed TP and RT domains of the hepatitis B virus reverse transcriptase. // J. Virol., 1997, 71(4):2996-3004.

94. Le Pogam S, Yuan TT, Sahu GK, Chatterjee S, Shih C. Low-level secretion of human hepatitis B virus virions caused by twoindependent, naturally occurring mutations (P5T and L60V) in the capsid protein. // J. Virol., 2000, 74(19):9099-9105.

95. Le Seyec J, Chouteau P, Cannie I, Guguen-Guillouzo C, Gripon P. Role of the pre-S2 domain of the large envelope protein in hepatitis B virus assembly and infectivity. // J. Virol., 1998, 72(7):5573-5578.

96. Liaw YF, Chien RN, Yeh CT, Tsai SL, Chu CM. Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after emergence of YMDD motif mutation during lamivudine therapy. // Hepatology, 1999, 30(2):567-572.

97. Lien JM, Aldrich CE, Mason WS. Evidence that a capped oligoribonucleotide is the primer for duck hepatitis B virus plus-strand DNA synthesis. //J. Virol, 1986, 57(l):229-236.

98. Lindh M, Andersson AS, Gusdal A. Genotypes, nt 1858 variants, and geographic origin of hepatitis B virus-large-scale analysis using a new genotyping method. // J. Infect. Dis., 1997, 175(6):1285-1293.

99. Lindh M, Gonzalez JE, Norkrans G, Horal P. Genotyping of hepatitis B virus by restriction pattern analysis of a pre-S amplicon. // J. Virol. Methods, 1998, 72(2):163-174.

100. Lindh M, Hannoun C, Dhillon AP, Norkrans G, Horal P. Core promoter mutations and genotypes in relation to viral replication and liver damage in East Asian hepatitis B virus carriers. // J. Infect. Dis., 1999, 179(4):775-782.

101. Lindh M, Horal P, Dhillon AP, Norkrans G. Hepatitis B virus DNA levels, precore mutations, genotypes and histological activity in chronic hepatitis B. // J. Viral. Hepat., 2000, 7(4):258-267.

102. Ling R, Mutimer D, Ahmed M, et al. Selection of mutations in the hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine. //Hepatology, 1996, 24:711-3.

103. Loeb DD, Hirsch RC, Ganem D. Sequence-independent RNA cleavages generate the primers for plus strand DNA synthesis in hepatitis B viruses: implications for other reverse transcribing elements. // EMBO J., 1991, 10(11):3533-3540.

104. Loeb DD, Gulya KJ, Tian R. Sequence identity of the terminal redundancies on the minus-strand DNA template is necessary but not sufficient for the template switch during hepadnavirus plus-strand DNA synthesis. // J. Virol., 1997, 71(1):152-160.

105. Lofiler-Mary H, Dumortier J, Klentsch-Zimmer C, Prange R. Hepatitis B virus assembly is sensitive to changes in the cytosolic S loop of the envelope proteins. // Virology, 2000, 270(2):358-367.

106. Lopez-Cabrera M, Letovsky J, Hu KQ, Siddiqui A. Transcriptional factor C/EBP binds to and transactivates the enhancer element II of the hepatitis B virus. //Virology, 1991, 183(2):825-829.

107. Magnius L.O. and Norder H. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene. // Intervirology, 1995, 38(l-2):24-34.

108. Mahoney FJ. Update on diagnosis, management, and prevention of hepatitis B virus infection. // Clin. Microbiol. Rev., 1999, 12(2):351-366.

109. Mangold CM, Unckell F, Werr M, Streeck RE. Secretion and antigenicity of hepatitis B virus small envelope proteins lacking cysteines in the major antigenic region. // Virology, 1995,211(2):535-543.

110. Mayerat C, Mantegani A, Frei PC. Does hepatitis B virus (HBV) genotype influence the clinical outcome of HBV infection? // J. Viral. Hepat., 1999, 6(4):299-304.

111. Melegari M, Bruno S, Wands JR. Properties of hepatitis B virus pre-S1 deletion mutants.//Virology, 1994, 199:292-300.

112. Melegari M, Scaglioni PP, Wands JR. Hepatitis B virus mutants associated with 3TC and famciclovir administration are replication defective. // Hepatology, 1998, 27(2):628-633.

113. Milich DR, Jones JE, Hughes JL, Price J, Raney AK, McLachlan A. Is a function of the secreted hepatitis B e antigen to induce immunologic tolerance in utero? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87(17):6599-6603.

114. Milich DR, Chen MK, Hughes JL, Jones JE. The secreted hepatitis B precore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid: a mechanism for persistence. // J. Immunol. 1998, 160(4):2013-2021.

115. Miyake Y, Oda T, Li R, Sugiyama K. A comparison of amino acid sequences of hepatitis B virus S gene in 46 children presenting various clinical features for immunoprophylaxis. // Tohoku J. Exp. Med., 1996, 180(3):233-247.

116. Mizokami M, Nakano T, Orito E, Tanaka Y, Sakugawa H, Mukaide M, Robertson BH. Hepatitis B virus genotype assignment using restrictionfragment length polymorphism patterns. 11 FEBS Lett., 1999, 450(1 -2):66-71.

117. Molnar-Kimber KL, Summers JW, Mason WS. Mapping of the cohesive overlap of duck hepatitis B virus DNA and of the site of initiation of reverse transcription. // J. Virol., 1984, 51(1): 181-191.

118. Muller H.J. The relation of recombination to mutational advance. // Mutation Research, 1964, 1:2-9.

119. Musacchio A, Rodriguez EG, Herrera AM, Quintana D, Muzio V. Multivalent DNA-based immunization against hepatitis B virus with plasmids encoding surface and core antigens. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 282(2):442-446

120. Naito H, Hayashi S, Abe K. Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers. // J. Clin. Microbiol., 2001, 39(l):362-364.

121. Nassal M, Rieger A. A bulged region of the hepatitis B virus RNA encapsidation signal contains the replication origin for discontinuous firststrand DNA synthesis. // J. Virol., 1996, 70(5):2764-2773.

122. Nassal M. Hepatitis B virus replication: novel roles for virus-host interections. // Intervirology, 1999, 42:100-116.

123. Neurath AR, Strick N, Sproul P. Search for hepatitis B virus cell receptors reveals binding sites for interleukin 6 on the virus envelope protein. //J. Exp. Med., 1992, 175(2):461-469.

124. Ngui SL, Hallet R, Teo CG. Natural and iatrogenic variation in hepatitis B virus. // Rev. Med. Virol., 1999, 9(3): 183-209.

125. Noguchi A, Hayashi J, Nakashima K, Ikematsu H, Hirata M, Kashiwagi S. Decrease of hepatitis A and B virus infections in the population of Okinawa, Japan. // J. Infect., 1991, 23(3):255-262.

126. Norder H, Hammas B, Magnius LO. Typing of hepatitis B virus genomes by a simplified polymerase chain reaction. // J. Med. Virol., 1990, 31(3):215-221

127. Norder H, Courouce AM, Magnius LO. Molecular basis of hepatitis B virus serotype variations within the four major subtypes. // J. Gen. Virol., 1992a, 73 (Pt 12):3141-3145.

128. Norder H, Courouce AM, Magnius LO. Complete nucleotide sequences of six hepatitis B viral genomes encoding the surface antigen subtypes ayw4, adw4q-, and adrq- and their phylogenetic classification. // Arch. Virol., Suppl. 1993b, 8:189-199.

129. Norder H, Courouce AM, Magnius LO. Complete genomes, phylogenetic relatedness, and structural proteins of six strains of the hepatitis B virus, four of which represent two new genotypes. // Virology, 1994, 198(2):489-503.

130. Ogata N, Zanetti AR, Yu M, Miller RH, Purcell RH. Infectivity and pathogenicity in chimpanzees of a surface gene mutant of hepatitis B virus that emerged in a vaccinated infant. // J. Infect. Dis., 1997, 175:511-23.

131. Harrison TJ, Zuckerman AJ. Hepatitis B virus antibody escape mutants. // Drug News Perspect, 1993, 6:271-3.

132. Okamoto H, Tsuda F, Sakugawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, Mayumi M. Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes. // J. Gen. Virol., 1988, 69 (Pt 10):2575-2583.

133. Oon CJ, Lim GK, Ye Z, et al. Molecular epidemiology of hepatitis B virus vaccine variants in Singapore. //Vaccine, 1995, 13:699-702.

134. Oon CJ, Chen WN. Current aspects of hepatitis B surface antigen mutants in Singapore. // J. Viral. Hepatitis, 1998, 5(Suppl2): 17-23.

135. Ori A, Shaul Y. Hepatitis B virus enhancer binds and is activated by the Hepatocyte nuclear factor 3. // Virology, 1995, 207(1):98-106.

136. Park GT, Yi YW, Choi CY, Rho HM. A negative regulatory element and its binding protein in the upstream of enhancer II of hepatitis B virus DNA.//Cell Biol, 1997, 16(12): 1459-1465.

137. Pineau P, Marchio A, Mattei MG, Kim WH, Youn JK, Tiollais P, Dejean A. Extensive analysis of duplicated-inverted hepatitis B virus integrations inhuman hepatocellular carcinoma. // J. Gen. Virol., 1998, 79 (Pt 3):591-600.

138. Poisson F, Severac A, Hourioux C, Goudeau A, Roingeard P. Both pre-Sl and S domains of hepatitis B virus envelope proteins interact with the core particle. // Virology, 1997, 228(1): 115-120.

139. Pollack JR, Ganem D. An RNA stem-loop structure directs hepatitis B virus genomic RNA encapsidation. // J. Virol., 1993, 67(6):3254-3263.

140. Pollack JR, Ganem D. Site-specific RNA binding by a hepatitis B virus reverse transcriptase initiates two distinct reactions: RNA packaging and DNA synthesis. // J. Virol, 1994, 68(9):5579-5587.

141. Pontisso P, Ruvoletto MG, Tiribelli C, Gerlich WH, Ruol A, Alberti A. The preSl domain of hepatitis B virus and IgA cross-react in their binding to the hepatocyte surface. // J. Gen. Virol, 1992, 73 ( Pt 8):2041-2045.

142. Prange R. and Streck R. Novel transmembrane topology of the hepatitis B virus envelope proteins. // EMBO J, 1995, 14(2):247-256.

143. Proutski O, Sokur, O. Kiselev. Multifunctional software for optimized selection of PCR primers // Final Programme Abstracts of Joint Meeting: Progress in Clinical Virology, 1994, Stockholm, Sweeden, P.7-20.

144. Radziwill G, Tucker W, Schaller H. Mutational analysis of the hepatitis B virus P gene product: domain structure and RNase H activity. // J. Virol, 1990, 64(2):613-620.

145. Rail LB, Standring DN, Laub O, Rutter WJ. Transcription of hepatitis B virus by RNA polymerase II. //Mol. Cell. Biol, 1983, 3(10): 1766-1773.

146. Raney AK, McLachlan A. Characterization of the hepatitis B virus large surface antigen promoter Spl binding site. // Virology, 1995, 208(l):399-404.

147. Raney AK, Johnson JL, Palmer CN, McLachlan A. Members of the nuclear receptor superfamily regulate transcription from the hepatitis B virus nucleocapsid promoter. // J. Virol, 1997, 71(2):1058-1071.

148. Ray S. C, SimPlot for Windows, Vers. 2.5. 1999.

149. Rehermann B, Pasquinelli C, Mosier SM, Chisari FV. Hepatitis B virus (HBV) sequence variation of cytotoxic T lymphocyte epitopes is not common in patients with chronic HBV infection. // J. Clin. Invest, 1995, 96(3): 1527-1534.

150. Rehermann B, Lau D, Hoofnagle JH, Chisari FV. Cytotoxic T lymphocyte responsiveness after resolution of chronic hepatitis B virus infection. //J. Clin. Invest, 1996, 97(7): 1655-1665.

151. Repp R, Rhiel S, Heermann KH, Schaefer S, Keller C, Ndumbe P, Lampert F, Gerlich WH. Genotyping by multiplex polymerase chain reaction for detection of endemic hepatitis B virus transmission. // J. Clin. Microbiol., 1993, 31 (5): 1095-1102.

152. Rieger A, Nassal M. Specific hepatitis B virus minus-strand DNA synthesis requires only the 5' encapsidation signal and the 3'-proximal direct repeat DR1. // J. Virol., 1996, 70(l):585-589.

153. Rigg RJ, Schaller H. Duck hepatitis B virus infection of hepatocytes is not dependent on low pH. // J. Virol., 1992, 66(5):2829-2836.

154. Robertson DL, Hahn BH, Sharp PM (1995) Recombination in AIDS viruses. // J. Mol. Evol., 40:249-259.

155. Salminen MO, Carr JK, Burke DS, McCutchan FE. Identification of breakpoints in intergenotypic recombinants of HIV type 1 by bootscanning. // AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1995, 11(11): 1423-1425.

156. Satrosoewignjo,R.I., Omi,S., Okamoto,H., Mayumi,M., Rustam,M. and Sujudi,X. The complete nucleotide sequence of HBV DNA clone of subtype adw (pMND122) from Menado in Sulawesi Island, Indonesia. // ICMR Ann., 1987, 7, 51-60.

157. Schierup M.H. and Hein J. Consequences of recombination on traditional phylogenetic analysis. // Genetics, 2000, 156:879-891.

158. Shih CH, Li LS, Roychoudhury S, Ho MH. In vitro propagation of human hepatitis B virus in a rat hepatoma cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86(16):6323-6327.

159. Shih JW, Cheung LC, Alter HJ, Lee LM, Gu JR. Strain analysis of hepatitis B virus on the basis of restriction endonuclease analysis of polymerase chain reaction products. // J. Clin. Microbiol., 1991, 29(8): 16401644.

160. Shiraki K. Perinatal transmission of hepatitis B virus and its prevention. // J. Gastroenterol. Hepatol., 2000,15 Suppl:El 1-5.

161. Smith GJ, Donello JE, Luck R, Steger G, Hope TJ. The hepatitis B virus post-transcriptional regulatory element contains two conserved RNA stem-loops which are required for function. // Nucleic Acids Res., 1998, 26(21):4818-4827.

162. Smith J.M. Analizing the mosaic structure of gene. // J. Mol. Evol., 1992, 34:126-129.

163. Staprans S, Loeb DD, Ganem D. Mutations affecting hepadnavirus plus-strand DNA synthesis dissociate primer cleavage from translocation and reveal the origin of linear viral DNA. // J. Virol., 1991, 65(3): 12551262.

164. Stuyver, L., Rossau, R., and Maertens, G. (1996) Line Probe Assays for the detection of HCV and HBV genotypes. // Antiviral Therapy, 1 (Suppl. 3), 53-57.

165. Su H, Yee JK. Regulation of hepatitis B virus gene expression by its two enhancers. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89(7):2708-2712.

166. Sumi H, Yokosuka O, Seki N, Arai M, Imazeki F, Kurihara T, Kanda T, Fukai K,

167. Kato M, Saisho H. Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver disease. // Hepatology, 2003, 37(1): 1926.

168. Summers J, Smith PM, Horwich AL. Hepadnavirus envelope proteins regulate covalently closed circular DNA amplification. // J. Virol., 1990, 64(6):2819-2824.

169. Tavis JE, Perri S, Ganem D. Hepadnavirus reverse transcription initiates within the stem-loop of the RNA packaging signal and employs a novel strand transfer. // J. Virol., 1994, 68(6):3536-3543.

170. Teles SA, Martins RM, Vanderborght B, Stuyver L, Gaspar AM, Yoshida CF. Hepatitis B virus: genotypes and subtypes in Brazilian hemodialysis patients. //Artif. Organs, 1999, 23(12):1074-1078.

171. Thakur V, Guptan RC, Kazim SN, Malhotra V, Sarin SK. Profile, spectrum and significance of HBV genotypes in chronic liver disease patients in the Indian subcontinent. // J. Gastroenterol. Hepatol, 2002, 17(2).T 65-170.

172. Tipples GA, Ma MM, Fischer KP, Bain VG, Kneteman NM, Tyrrell DL. Mutation in HBV RNA-dependent DNA polymerase confers resistance to lamivudine in vivo. // Hepatology, 1996, 24:714-7.

173. Toh H, Hayashida H, Miyata T. Sequence homology between retroviral reverse transcriptase and putative polymerases of hepatitis B virus and cauliflower mosaic virus. //Nature, 1983, 305(5937):827-829.

174. Tong S, Kim K-H, Chante C, Wands J, Li J. Hepatitis B virus e antigen variants. //Int. J. Med. Sci., 2005, 2(l):2-7.

175. Treichel U, Meyer zum Buschenfelde KH, Dienes HP, Gerken G. Receptor-mediated entry of hepatitis B virus particles into liver cells. // Arch. Virol., 1997, 142(3):493-498.

176. Tsubota A, Arase Y, Ren F, Tanaka H, Ikeda K, Kumada H. Genotype may correlate with liver carcinogenesis and tumor characteristics in cirrhotic patients infected with hepatitis B virus subtype adw. // J. Med. Virol., 2001, 65(2):257-265.

177. Urban S, Breiner KM, Fehler F, Klingmuller U, Schaller H. Avian hepatitis B virus infection is initiated by the interaction of a distinct pre-S subdomain with the cellular receptor gpl80. // J. Virol., 1998, 72(10):8089-8097.

178. Uy A, Wunderlich G, Olsen DB, Heermann KH, Gerlich WH, Thomssen R. Genomic variability in the preSl region and determination of routes of transmission of hepatitis B virus. // J. Gen. Virol., 1992, 73 (Pt 11):3005-3009.

179. Van Geyt C.S., Ma M.M., Fisher V.G., et al. A line probe assay for hepatitis B virus genotype. In "Therapies of viral hepatitis" (R.F. Schinazi, J.P. Sommadossi, H. Thomas, eds) International Medical Press, London, UK, 1998, p. 139-145.

180. Wang GH, Seeger C. The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis. // Cell, 1992, 71(4):663-670.

181. Wang GH, Seeger C. Novel mechanism for reverse transcription in hepatitis B viruses. //J. Virol, 1993, 67(11):6507-6512.

182. Wang HD, Trivedi A, Johnson DL. Hepatitis B virus X protein induces RNA polymerase Ill-dependent gene transcription and increases cellular TATA-binding protein by activating the Ras signaling pathway. // Mol. Cell. Biol, 1997, 17(12):6838-6846.

183. Wei Y, Tavis JE, Ganem D. Relationship between viral DNA synthesis and virion envelopment in hepatitis B viruses. // J. Virol, 1996, 70(9):6455-6458.

184. Weiller GF. Phylogenetic profiles: a graphical method for detecting genetic recombinationsin homologous sequences. // Mol. Biol. Evol, 1998, 15(3):326-335.

185. Weinberger KM, Zoulek G, Bauer T, Bo" hm S, Jilg W. A novel deletion mutant of hepatitis B surface antigen. // J. Med. Virol, 1999, 58:105-10.

186. Wilson JN, Nokes DJ, Carman WF. The predicted pattern of emergence of vaccine-resistant hepatitis B: a cause for concern? // Vaccine, 1999, 7:973-8.

187. Wooley DP, Smith RA, Czajak S, Desrosiers RC. Direct demonstration of retroviral recombination in a rhesus monkey. // J. Virol, 1997, 71(12):9650-9653.

188. Wu JY, Zhou ZY, Judd A, Cartwright CA, Robinson WS. The hepatitis B virus-encoded transcriptional trans-activator hbx appears to be a novel protein serine/threonine kinase. // Cell, 1990, 63(4):687-695.

189. Wu TT, Coates L, Aldrich CE, Summers J, Mason WS. In hepatocytes infected with duck hepatitis B virus, the template for viral RNA synthesis is amplified by an intracellular pathway. // Virology, 1990, 175(1):255-261.

190. Wu X, Zhu L, Li ZP, Koshy R, Wang Y. Functional organization of enhancer (ENII) of hepatitis B virus. // Virology, 1992, 191(l):490-494.

191. Yeh CT, Liaw YF, Ou JH. The arginine-rich domain of hepatitis B virus precore and core proteins contains a signal for nuclear transport. // J. Virol., 1990, 64( 12):6141-6147.

192. Yuan TT, Sahu GK, Whitehead WE, Greenberg R, Shih C. The mechanism of an immature secretion phenotype of a highly frequent naturally occurring missense mutation at codon 97 of human hepatitis B virus core antigen. // J. Virol., 1999a, 73(7):5731-5740.

193. Yuan TT, Tai PC, Shih C. Subtype-independent immature secretion and subtype-dependent replication deficiency of a highly frequent, naturally occurring mutation of human hepatitis B virus core antigen. // J. Virol., 1999b, 73(12):10122-10128.

194. Yuan TT, Shih C. A frequent, naturally occurring mutation (P130T) of human hepatitis B virus core antigen is compensatory for immature secretion phenotype of another frequent variant (I97L). // J. Virol, 2000, 74(10):4929-4932.

195. Yuh CH, Ting LP. The genome of hepatitis B virus contains a second enhancer: cooperation of two elements within this enhancer is required for its function. //J. Virol, 1990, 64(9):4281-4287.

196. Yuh CH, Chang YL, Ting LP. Transcriptional regulation of precore and pregenomic RNAs of hepatitis B virus. // J. Virol, 1992, 66(7):4073-4084.

197. Zhang P, Raney AK, McLachlan A. Characterization of the hepatitis B virus X- and nucleocapsid gene transcriptional regulatory elements. // Virology, 1992, 191(1):31-41.

198. Zang WQ, Fieno AM, Grant RA, Yen TS. Identification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase as a cellular protein that binds to the hepatitis B virus posttranscriptional regulatory element. // Virology, 1998, 248(l):46-52.110

199. Zhang X, Zoulim F, Habersetzer F, Xiong S, Trepo C. Analysis of hepatitis B virus genotypes and pre-core region variability during interferon treatment of HBe antigen negative chronic hepatitis B. // J. Med. Virol., 1996, 48(1):8-16.

200. Zhou DX, Yen TS. The hepatitis B virus S promoter comprises A CCAAT motif and two initiation regions. // J. Biol. Chem., 1991, 266(34):23416-23421.

201. Zlotnick A, Cheng N, Conway JF, Booy FP, Steven AC, Stahl SJ, Wingfield PT. Dimorphism of hepatitis B virus capsids is strongly influenced by the C-terminus of the capsid protein. // Biochemistry, 1996, 35(23):7412-7421.

202. Zollner B, Petersen J, Schafer P, Schroter M, Laufs R, Sterneck M, Feucht HH. Subtype-dependent response of hepatitis B virus during the early phase of lamivudine treatment. // Clin. Infect. Dis., 2002, 34(9): 12731277.

Информация о работе

Писарева, Мария Михайловна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2007
ВАК 03.00.06

Диссертация

Молекулярно-биологические особенности вируса гепатита B дикой и мутантной форм в трех регионах Российской Федерации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы