Генетическая вариабельность вируса гепатита В по PreS1/PreS2/S генам у пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией

Забелин, Никита Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическая вариабельность вируса гепатита В по PreS1/PreS2/S генам у пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая вариабельность вируса гепатита В по PreS1/PreS2/S генам у пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией"

На правах рукописи

Забелин Никита Николаевич

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ВИРУСА ГЕПАТИТА В Рге81/РгеБ2/8 ГЕНАМ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ НВ-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ.

03.00.06 - ВИРУСОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2009

003463235

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН и ГУ Научно-исследовательском институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Кузин Станислав Николаевич Самохвалов Евгений Иванович

Стаханова Вера Михайловна Брико Николай Иванович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская Медицинская Академия последипломного образования» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Защита диссертации состоится « » . 2009 года в {¿. часов на

заседании диссертационного совета Д 001.020.01 в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (г.Москва, 123098, ул. Гамалеи, д,16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан

2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

ЕЖБурцева

Актуальность проблемы.

В настоящее время проблема гепатита В (ГВ) сохраняет свою актуальность и является одной из социально-значимых инфекций в Российской Федерации. Несмотря на наличие эффективных средств профилактики гепатита В, таких как активная и пассивная иммунизация, противовирусных препаратов, по данным [J.M. Pawlotsky, 2005] более 350 млн. людей во всем мире хронически инфицированы вирусом гепатита В (ВГВ). Одним из ведущих аспектов проблемы ГВ является генетическая вариабельность возбудителя этого заболевания, которая обусловливает, в ряде случаев, недостаточную эффективность вакцинации, серологической диагностики, а также лечения противовирусными препаратами.

Проблема вариабельности ВГВ становится более значимой для медицинской практики, поскольку частота встречаемости генетических вариантов ВГВ растет, особенно в регионах с высокой заболеваемостью. Принятые и реализуемые национальные и международные программы вакцинопрофилактики ГВ, широкое применение химиотерапевтических средств являются активными селективными факторами, способствующими распространению редко встречающихся и ускользающих вариантов вируса.

Одной из составляющих проблемы генетической вариабельности ВГВ является вариабельность pre-Sl/pre-S2/S генов вируса, кодирующих оболочечные белки вируса. Прошло почти 20 лет с тех пор, как появилось первое сообщение о способности мутантных форм вируса по S-гену ускользать от индуцированного вакциной иммунитета [W.F.Carman et al., 1990]. Последующий период характеризовался накоплением данных о вариантах ВГВ, которые вызывали проблемы в серологической диагностике или лечении инфекции, а также их распространенности в популяции [W.F. Carman, 1997; P.F.Coleman et al., 1999; C.He et al., 2001; M.S.Ho et al., 1998; J.Hou et al., 2001; J.H.Ireland et al., 2000; K.M.Lee et al., 2001; B.Moerman et al., 2004; C.J.Oon et al., 1996; C.J.Oon et al., 1999; L.Roznovsky et al., 2000; S. Seddigh-Tonekaboni et al., 2000]. В России данные об обнаружении различных вариантов ВГВ единичны и недостаточны. В связи с этим представляет интерес изучение распространенности генотипов, субгенотипов и различных вариантов ВГВ среди хронических больных в различных регионах Российской Федерации, характеризующихся различной интенсивностью эпидемического процесса вирусного гепатита В и этническим составом населения.

В настоящее время отсутствуют данные о возможностях иммуноферментных тест-систем (ИФТС), применяемых в Российской Федерации, выявлять HBsAg, принадлежащий различным генотипам и субгенотипам ВГВ, в том числе и известным мутантным формам вируса. Выполнение таких исследований позволит существенно повысить качество серологической диагностики гепатита В.

определению структуры генотипов, субгенотипов ВГВ в различных регионах страны, генетической вариабельности рге-81/рге-82/8 генов у изолятов ВГВ, выделенных у пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией, а также оценки способности современных тест-систем определять НВзА£, принадлежащий различным генотипическим, серотипическим и мутантным формам вируса.

Цель и задачи исследования.

Цель работы - изучение динамики заболеваемости гепатитом В на территории отдельных федеральных округов РФ, генетического разнообразия циркулирующих изолятов ВГВ, а также оценка диагностических возможностей тест-систем для детекции НВбА£.

Для достижения указанных целей были поставлены следующие задачи:

1. Рассчитать многолетние тенденции динамики заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории России, а также Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов за период с 2000 по 2006 годы;

2. Изучить генетическую вариабельность рге-81/рге-82/8 генов вируса гепатита В у лиц с хронической НВ-вирусной инфекцией, а также структуру циркулирующих генотипов на территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов;

3. Охарактеризовать диагностические возможности коммерческих тест-систем для детекции НВзА§.

Научная новизна.

Выявлена значительная территориальная неравномерность по уровню заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В (суммарные показатели) по трем федеральным округам Российской Федерации. В Дальневосточном округе уровень заболеваемости гепатитом В при использовании метода сигмальных отклонений определен как высокий. Наиболее благополучными являются Центральный и Южный федеральные округа, уровень заболеваемости ГВ в которых квалифицирован как низкий и ниже среднего.

Установлены различия в структуре циркулирующих генотипов ВГВ на исследуемых территориях: в Центральном и Южном округе с наибольшей частотой обнаружен генотип Б (87%), тогда как в Дальневосточном округе генотипы А и Ь составляют по 44% и генотип С - 12%.

Впервые на основании широкомасштабных молекулярно-генетических исследований изолятов ВГВ, циркулирующих на различных территориях Российской Федерации, установлено, что в рге-81/рге-82/8 области генома ВГВ, наиболее вариабельными участками оказались область рге-82Л5 промотора у изолятов генотипа О (до 31% нуклеотидных замен), 5'- конец рге-82/Б генов у изолятов генотипа С (до 54%) и 3'- конец 8-гена у изолятов генотипа А (до 28%). При этом область 8-гена, соответствующая главному гидрофильному региону (МНЯ) была менее вариабельной (до 25% нуклеотидных замен у изолятов генотипа А).

Положения, выносимые на защиту.

В результате проведенного эпидемиологического анализа рассчитаны многолетние тенденции заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории Российской Федерации, Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов в период с 2000 по 2006 годы:

а) для совокупного населения установлено:

- выраженное снижение заболеваемости острым гепатитом В и носительства ВГВ (Тснижения=>-5,\%), стабильный уровень заболеваемости хроническим гепатитом В (Т снижения = -1%);

б) для детей до 14 лет установлено:

- выраженное снижение заболеваемости острым, хроническим гепатитом В и носительства ВГВ (Т'снижения = >-5,1%).

Для изученных изолятов ВГВ, циркулирующих на территории трех федеральных округов, показана более высокая генетическая вариабельность областей pre-Sl, pre-S2 генома, по сравнению с участком S-гена, соответствующего главному гидрофильному региону (MHR).

Зафиксированы существенные различия в чувствительности четырех коммерческих тест-систем для детекции HBsAg - при определении HBsAg, принадлежащего генотипам D и А они достигали 44 и 40 раз соответственно.

Различия в диагностических возможностях тест-систем для детекции HBsAg не всегда обусловлены наличием замен в «а»-детерминанте главного гидрофильного региона HBsAg.

Практическая значимость.

Оценка диагностических возможностей четырех тест-систем для детекции HBsAg на примере изученных изолятов ВГВ показала, что тест-системы «Roche Elecsys HBsAg» (основана на хемилюминесцентном методе детекции) и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» (основана на методе флюоресцентно-поляризационном иммунном анализе) являются более чувствительными тестами в отношении генотипических (генотипы А и D) и мутантных форм (М133Т, P120S) HBsAg. Отечественная тест-система - «ДС-ИФЛ-HBsAg» продемонстрировала сравнительно более низкие диагностические возможности при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg.

Выявленные различия в диагностических возможностях разных тестов при детекции HBsAg с установленными генотипами, субтипами и мутантными формами обосновывают необходимость создания экспертных панелей, содержащих образцы с наличием HBsAg различных генотипических, субтиповых и мутантных форм принадлежности.

Внедрение полученных результатов.

Материалы диссертационной работы использованы при разработке приказа Министерства здравоохранения Республики Саха (Якутия) №01-8/4289 от 31.05.2006 г. «Об обследовании беременных на перинатальные инфекции в PC (Я)».

Научные положения, выводы и практические рекомендации, вытекающие из результатов диссертационной работы, используются при

чтении лекций и проведении семинарских занятий на кафедре вирусологии Московской Медицинской академии им. И.М.Сеченова.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на: VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2007 год); XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Гурзуф, 2007 год).

Апробация диссертации состоялась 22 мая 2008 года на заседании Ученого совета отдела вирусологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и указателя литературы, состоящего из 125 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 14 рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена в период с 2005 по 2008 год в лаборатории хронических вирусных инфекций ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН и лаборатории экологии вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Изучение заболеваемости официально регистрируемых форм вирусного гепатита В проводили на основании данных официальной государственной статистики: форма №2 «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях» в период с 2000 по 2006 годы.

С целью изучения молекулярно-генетических характеристик изолятов ВГВ, циркулирующих в различных регионах России, были исследованы 193 образца сыворотки крови, содержащих серологические маркеры ВГВ. Из 124 образцов, с наличием ДНК ВГВ, секвенирование различных участков генома вируса произведено у 84 изолятов (таблица 1).

Сыворотки крови собирали у лиц с хронической НВ-вирусной инфекцией и до исследования хранили при температуре -20°С. 47 изолятов ВГВ были собраны в стационарах г. Москвы (Клиника нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева, профессор, д.м.н. П.Е. Крель; ИКБ №1 г. Москвы, главный врач, профессор, д.м.н. H.A. Малышев), из них у 37 критерием отбора было наличие HBsAg более шести месяцев, а у 10 - наличие IgM ВГД. 15 изолятов ВГВ были выделены у безвозмездных доноров крови в г. Нальчик (Республиканская станция переливания крови, главный врач к.м.н. Р.С.Тленкопачев).

Таблица 1.

Характеристика изучаемых изолятов ВГВ.

территория характеристика группы участок секвенирования количество всего

пациенты с ХГВ pre-Sl/pre-S2/S 30

г. Москва а-детсрминаита 7

пациенты с суперинфекцией ВГВ+ВГО а-детермиианта 10

г. Нальчик хронически инфицированные доноры крови MHR 15 84

г. Череповец пациенты с ХГВ pre-Sl/pre-S2/S 6

Республика Саха (Якутия) лица с ХГВ pre-Sl/pre-S2/S 16

6 изолятов ВГВ выделены у больных с хроническим гепатитом В в г. Череповце (ГКБ №1, к.м.н. И.Л. Кирилова). 16 изолятов ВГВ были выделены в результате скрининга населения на наличие HBsAg в различных районах Республики Саха (Якутия) (ГКБ г. Якутск, д.м.н. С.И. Семенов).

Вирусную ДНК выделяли с помощью набора для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови производства НПФ «Литех» (Россия), согласно инструкции производителя. Индикацию вирусной ДНК проводили методом «гнездовой» ПЦР с помощью двух пар праймеров: S1-1, Sl-2; S2-1, S2-2 [Н. Okamoto et al., 1992] на термоциклере DNA Engine Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Для получения ПЦР-фрагментов, соответствующим рге-Sl/pre-S2/S генам, на матрице ДНК каждого изолята был амплифицирован участок длиной 1562 н.о. с праймерами 2805F (2805-2827) и 1208R (12081192) - 1 раунд и 2817F (2817-2836) и 1197R (1197-1174) - 2 раунд (позиции праймеров указаны для изолята AJ344117). Используемые при этом праймеры были разработаны нами с помощью пакета программ DNASTAR V 5.00 (Lasergene, Inc., США) по выровненным нуклеотидным последовательностям различных изолятов вируса гепатита В (66 изолятов различных генотипов), опубликованных в базе данных DDBJ/EMBL/ GenBank. Секвенирование фрагментов было проведено с использованием праймеров - 2817F, 323R (323-303) и 242F (242-264) и набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, согласно инструкции производителя на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 DNA sequencer (Applied Biosystems, США). Нуклеотидные последовательности анализировали методом Clustal W с помощью программы «Megaling» (DNAStar V 5.00, Lasergen Inc., США).

Сравнительная оценка диагностических возможностей различных тест-систем по обнаружению HBsAg проведена с использованием Отраслевого Стандартного Образца (ОСО) и 31 образца сыворотки крови, содержащих HBsAg. Определяли концентрацию HBsAg в образцах сыворотки крови путем параллельного титрования исследуемых образцов и ОСО. Титрование

образцов выполняли путем разведения в 10 раз до исчезновения положительного сигнала. Сравнивали с данными разведения ОСО, выполненного в соответствии с инструкцией изготовителя. Для определения итоговых значений была разработана специальная компьютерная программа. Использованы тест-системы: «Roche Elecsys HbsAg» (Lot 172 934-03, фирма «Хоффман ля Рош», Швейцария); «Abbot Axsym HbsAg (V2)» - Lot 34153 LU 00 (фирма «Эббот», США); «Cobas Core HbsAg II EIA» (Lot 1717801, фирма «Хоффман ля Рош», Швейцария); и «ДС-ИФЛ-HbsAg» (серия №1, НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород, Россия). Исследования с тремя ИФТС: «Roche Elecsys HbsAg», «Abbot Axsym HbsAg (V2)», «Cobas Core HbsAg II EIA» выполняли на автоматических ИФА-анализаторах: «Elecsys 2010», «Axsym», «Cobas Core II». Сравнительные постановки выполнены в соответствии с инструкциями фирм-разработчиков тест-систем и оборудования в клинико-диагностической лаборатории ИКБ №1 г. Москвы совместно с к.м.н. Л.Е. Кузиной.

Статистическая обработка полученных результатов проведена автором лично с использованием программного обеспечения «Windows ХР», «Excel» (2003).

Для оценки многолетней динамики эпидемического процесса регистрируемых форм ГВ использованы следующие параметры динамического ряда: абсолютный прирост (снижение), темп роста (снижения) при базисном основании, темп роста (снижения) при цепном основании, темп прироста (убыли). Определение многолетней тенденциц в динамике заболеваемости регистрируемых форм ГВ (рост или снижение заболеваемости) проведено методом наименьших квадратов (МНК), в соответствии с рекомендациями И.П.Палтышева, Н.Н.Филатова (2003). Выраженность тенденции оценивали по критериям, предложенным В.Д.Беляковым и др. (1981). Выделение отдельных групп по уровню заболеваемости при анализе суммарного показателя, включающего острый ГВ, хронический ГВ, а также носительство ВГВ рассчитывали методом сигмальных отклонений [И.Л.Шаханина и др., 1990,2003].

Динамика заболеваемости гепатитом В на территории Российской Федерации в период с 2000 по 2006 годы.

Заболеваемость регистрируемыми формами гепатита В в период с, 2000 по 2006 годы претерпела существенные изменения (таблица 2).

В этот период заболеваемость острым гепатитом В (ОГВ) в России среди совокупного населения снизилась в 6,1 раза. Наибольший уровень абсолютного снижения (-15,6 на 100 тысяч населения) и максимальный темп убыли (44,2%) имел место в 2002 году. В последующие годы темп убыли снизился, и в 2006 году зафиксирован самый низкий показатель заболеваемости ОГВ - 7,0 на 100 тысяч населения. Многолетняя (2000-2006 годы) тенденция заболеваемости ОГВ среди совокупного населения характеризуется выраженным снижением - Т снижения =>-5,1%.

В 2001 году отмечен максимальный показатель заболеваемости ХГВ за период наблюдения, при котором темп и показатель абсолютного прироста

Таблица 2.

Параметры динамического ряда, характеризующие заболеваемость

регистрируемыми формами гепатита В совокупного населения России в период с 2000 по 2006 годы.

Годы Показатель заболеваемости на 100000 населения Абсолютный прирост (снижение) Темп роста (снижения) при базисном основании (%) Темп роста (снижения) при цепном основании (%' Темп прироста (убыли) (%)

Острый гепатит В

2000 42,5 - 100 - -

2001 35,3 -7,2 83,1 83,1 -16,9

2002 19,7 -15,6 46,4 55,8 -44Д

2003 13,0 -6,7 30,6 65,9 -34,1

2004 10,4 -2,6 24,5 80,0 -2 0,0

2005 8,6 -1,8 20,2 82,7 -17,3

2006 7,0 -1,6 16,5 81,4 -18,6

Хронический гепатит В

2000 14,2 - 100 - -

2001 16,0 1,8 112,7 112,7 12,7

2002 15,0 -1,0 105,6 93,8 -6,2

2003 14,9 -0,1 104,9 99,3 -0,7

2004 15.5 0,6 109,2 104,0 4,0

2005 13,9 -1,6 97,9 89,7 -10,3

2006 14,0 0,1 98,6 100,7 0,7

Носительство ВГВ

2000 95,5 - 100 - -

2001 89,6 -5,9 93,8 93,8 -6,2

2002 74,1 -15,5 77,6 82,7 -17,3

2003 65,4 -8,7 68,5 88,3 -11,7

2004 61,9 -3,5 64,8 94,6 -5,4

2005 50,5 -11,4 52,9 81,6 -18,4

2006 47,7 -2,8 49,9 94,5 -5,5

имели наибольшие значения +12,7% и 1,8 на 100 тысяч населения соответственно. В последующие (2002-2003) годы уровень заболеваемости ХГВ снизился и ее показатели сопоставимы - 15,0-14,9 на 100 тысяч населения. В 2004 году вновь отмечено повышение уровня заболеваемости ХГВ, однако темп роста (+4,0%) ниже аналогичного показателя 2000-2001 годов. В 2005 году последовало снижение заболеваемости ХГВ до 13,9 на 100 тысяч населения при темпе убыли -10,3%, что является наибольшим значением в анализируемый период. В 2006 году отмечено некоторое повышение заболеваемости ХГВ, составившей 14,0 на 100 тысяч населения.

Вариабельность динамики показателя заболеваемости ХГВ отражена в многолетней тенденции (2000-2006 годы), которая характеризуется стабилизацией заболеваемости ХГВ: Т снижения = -1%.

В период 2000 по 2006 годы показатель носительства ВГВ на территории Российской Федерации снизился в 2 раза с 95,5 (2000 год) до 47,7 на 100 тысяч населения (2006 год). Максимальный показатель абсолютного снижения составил 15,5 на 100 тысяч населения (2002 год). Темп убыли не

превысил -18,4% (максимальное значение, 2005 год). Многолетняя (20002006 годы) тенденция показателей носительства ВГВ характеризуется выраженным снижением - Т снижения =>-5,1%.

По мнению И.Л.Шаханиной и др., (2003) и Л.И.Шляхтенко, (2003), наиболее полно динамику заболеваемости гепатитом В характеризует суммарный (интегративный) показатель, включающий все три регистрируемые формы гепатита В. В период с 2000 по 2006 годы суммарный показатель снизился со 152,4 до 68,7 на 100 тысяч населения (в 2,2 раза). В структуре суммарного показателя заболеваемости ГВ удельный вес ОГВ снизился с 27,9% (2000 год) до 10,2% (2006 год). Доля ХГВ за тот же период времени увеличилась с 9,3% до 20,4%, а удельный вес носительства ВГВ составил, не менее, 62% с увеличением доли до 70,5% (2004 год).

Динамика заболеваемости гепатитом В детей до 14 лет на территории Российской Федерации в период с 2000 по 2006 годы.

С 2000 года имеется устойчивая тенденция снижения уровня регистрируемой заболеваемости ОГВ среди детей до 14 лет (таблица 3).

Таблица 3.

Параметры динамического ряда, характеризующие заболеваемость

регистрируемыми формами гепатита В детей до 14 лет на территории России в период с 2000 по 2006 годы.___

Годы Показатель заболеваемости на 100 тысяч населения Абсолютный прирост (снижение) Темп роста (снижения) при базисном основании (%) Темп роста (снижения) при цепном основании (%) Темп прироста (убылй) (%)

Острый гепатит В

2000 10,0 - 100 - -

2001 9,0 -1,0 90,0 90,0 -10,0

2002 6,1 -2,9 61,0 67,8 -32,2

2003 3,9 -2,2 39,0 63,9 -36,1

2004 2,5 -1,4 25,0 64,1 -35,9

2005 1,9 -0,6 19,0 76,0 -24,0

2006 1,2 -0,7 12,0 63,2 -36,8

Хронический гепатит В

2000 4,6 - 100 - -

2001 4,4 -0,2 95,7 95,7 -4,3

2002 4,0 -0,4 86,9 90,9 -'9,1

2003 3,1 -0,9 67,4 77,5 -22,5

2004 2,7 -0,4 58,7 87,1 -12,9

2005 2,3 -0,4 50,0 85,2 -14,8

2006 1,9 -0,4 41,3 82,6 -17,4

Носительство ВГВ

2000 22,9 - 100 - -

2001 19,6 -3,3 85,6 85,6 -14,4

2002 15,6 -4,0 68,1 79,6 -20,4

2003 11,5 -4,1 50,2 73,7 -26,3

2004 10,8 -0,7 47,2 93,9 -6,1

2005 8,4 -2,4 36,7 77,8 -22,2

2006 7,9 -0,5 34,5 94,0 -6,0

Наиболее интенсивное ее снижение отмечено в 2006 году, с рекордным темпом убыли-36,8%.

В течение анализируемого периода заболеваемость ОГВ снизилась в 8,3 раза и составила 1,2 на 100 тысяч населения (2006 год). Многолетняя (2000-2006 годы) тенденция заболеваемости ОГВ детей до 14 лет характеризуется выраженным снижением (Т снижения= >-5,1%).

Заболеваемость ХГВ детей до 14 лет характеризуется стабильным снижением показателей с максимального уровня, зарегистрированного в 2000 году - 4,6 на 100 тысяч населения. Наибольшее значение темпа убыли (22,5%) отмечено в 2003 году. Многолетняя тенденция заболеваемости ХГВ детей до 14 лет характеризуется выраженным снижением - Т снижения = >-5,1%.

Динамика носительства ВГВ среди детей до 14 лет в 2000-2006 годы характеризуется стабильным и значительным снижением в 2,9 раза с достижением минимального уровня в 2006 году - 7,9 на 100 тысяч населения. Наиболее интенсивное снижение отмечено в 2003 году, когда темп убыли составил -26,3%. Многолетняя (2000-2006 годы) тенденция свидетельствует о наличии выраженного снижения: (Т снижения - >-5,1%).

В период с 2000 по 2006 годы снижение суммарной заболеваемости ГВ в Российской Федерации детей до 14 лет более интенсивное, чем у совокупного населения, и составило (3,4 раза) - с 37,5 до 11,0 на 100 тысяч населения.

Основные тенденции эпидемического процесса гепатита В в Центральном, Южном и Дальневосточном федеральных округах в период с 2000 по 2006 годы.

На территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов зафиксировано снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В (таблица 4).

Таблица 4.

Динамика и характеристика суммарных показателей заболеваемости гепатитом В в Центральном, Южном и Дальневосточном федеральных округах в период с 2000 по 2006 годы (на 100 тысяч населения)._

Федеральные округа

Центральный

Южный

Дальневосточный

2000 г.

2001 г.

2002 г.

2003 г.

2004 г.

2005 г.

118,3(ПС0|107,2(НС>'.84,0(НСУ 71,8(Я)-1,37,5(Цу. 5б,9(Н>-

з2з,4(й<£')[ тж); Шжъ'^то1 Иж) мж)"

2006 г.

' 242,7(П)'} 237,7{В) | 203,7(В)) ,160,6(В)[' 159,4(1!), 125ДВ)Ш0,'2(В)

(С) - средний уровень; (НС) - уровень ниже среднего; (ВС) - выше среднего; (В) -высокий уровень; (Н) - низкий уровень

Стабильное превышение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В в сравнении со среднероссийским отмечено в Дальневосточном

федеральном округе. В Южном федеральном округе суммарный показатель заболеваемости гепатитом В превысил среднероссийский уровень в 2003, 2004 и 2006 годах. В Центральном федеральном округе этот показатель не превысил среднероссийский уровень за весь период наблюдения (2000-2006 годы).

Для количественной оценки территориальной неравномерности заболеваемости ГВ по федеральным округам использовали метод сигмальных отклонений. Этот статистический метод позволяет выделять пять категорий (групп) при количественной характеристике уровня заболеваемости (низкая, ниже средней, средняя, выше средней и высокая) на отдельных территориях в сравнении со средними показателями. Применение данного подхода позволило выявить различия в уровне заболеваемости гепатитом В (суммарный показатель) на территории трех федеральных округов. В Дальневосточном округе зафиксирован стабильно высокий уровень заболеваемости гепатитом В. В Южном округе заболеваемость ГВ была или ниже средней или средней, причем в 2006 году она повысилась до среднего уровня. В Центральном округе наблюдается положительная тенденция, направленная на снижение от ниже среднего до низкого уровня заболеваемости гепатитом В. Таким образом, на территории Центрального и Южного федеральных округов заболеваемость гепатитом В, преимущественно, ниже среднего и средняя. В Дальневосточном округе превышение суммарного показателя заболеваемости ГВ, в сравнении со среднероссийским, соответствует также его высокому уровню распространенности и свидетельствует о том, что данный округ, в сравнении с другими, является эндемичным по гепатиту В.

Молекулярно-генетическая характеристика изолятов ВГВ по рге-81/рге-82/8-генам.

Изучена генетическая вариабельность изолятов ВГВ, циркулирующих на территории г. Москвы, а также Республиках Кабардино-Балкария и Саха (Якутия), характеризующихся различной интенсивностью эпидемического процесса ГВ. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей оболочечных генов 47 изолятов, выделенных у хронически инфицированных пациентов в г. Москве, показывает присутствие трех генотипов ВГВ: генотип 0-41 изолят (87,23%), генотип А - 5 изолятов (10,64%), генотип С - 1 изолят (2,13%). Для 30 изолятов была установлена нуклеотидная последовательность протяженностью 1143 и.о., соответствующая рге-81/рге-82/8 участку генома ВГВ, позволяющая достоверно определить субгенотипы выделенных изолятов, так субгенотип 01 составил 11,54%; субгенотип 02 -19,23%; субгенотип ОЗ - 69,23% в структуре генотипа О. Тогда как, в структуре генотипов А и С были обнаружены только субгенотипы А2 и С2 соответственно.

При сравнении полученных нуклеотидных последовательностей с референтными изолятами соответствующего субгенотипа были установлены нуклеотидные замены в исследуемом участке генома ВГВ. Для области генома ВГВ, соответствующей рге-81/рге-82/8-генам, были изучены

отдельные участки - сайт, кодирующий вход вируса в клетку (2875-2991 и.о.), pre-S2/S промоторный участок (2994-3171 и.о.), 5'- концы pre-S2 и S-генов (3172-154 и 155-455 и.о.), MHR (455-635 н.о.) и 3' - конец S-гена (636835 н.о).

Сравнительный анализ нуклеотидных замен показал, что замены среди изолятов генотипа D, в основном, сосредоточены в промоторном участке рге-S2/S, в 5'- концах pre-S2 и S-генов и в 3'- конце S-гена. У изолятов генотипа С замены, преимущественно, находятся в 5'- концах pre-S2/S-reHOB, в то время как у изолятов генотипа А - 5' концах pre-S2/S-reHOB и в 3'- конце S-гена. Анализ предсказанных аминокислотных последовательностей, в пределах каждого генотипа, показал, что из 388 нуклеотидных замен у изолятов генотипа D только 193 приводили к замене аминокислоты, из 21 нуклеотидной замены у изолятов генотипа А - 14 приводили к замене аминокислоты, у изолята генотипа С - из 15 нуклеотидных замен только 6 приводили к замене аминокислоты.

В ряде работ [M.Blanchet et al., 2007; D.Glebe et al., 2007] приводятся данные о том, что делеции в несколько нуклеотидов в N - конце pre-Sl домена приводят к снижению способности вируса проникать в клетку. Однако данных о влиянии аминокислотных замен на изменение такой способности нет. При изучении данного участка у исследуемых изолятов выявлено, что замены у изолятов 3 (Q18L; A28S; Т40Р; D43G), К (Т40Р) и 26 (F14S) меняют характер аминокислот относительно их гидрофильных или гидрофобных свойств, что может отразиться на стерических взаимодействиях вирусных оболочечных белков с клеточным рецептором. В то время как, замены у изолятов 19 (A28V), 3 (N29D), 30 (D16E) и 333 (D27E), не вызывают изменений гидрофобных и гидрофильных свойств этих аминокислот (рисунок 1).

10 14 16 18 28 40 43 45

Consensus PLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNPNKDTWPDAN Генотип D

г. Москва

Изолят 3 --------------L------------------S------------------------Р—G—

Изолят К ------------------------------------------------------------Р----------

Изолят 26 -------S----------------------------------------------------------------

Изолят 19 ----------------------------------V------------------------------------

Изолят 30 -----------Е----------------------------------------------------------

21 27 56

Consensus PLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPAAN Генотип А

Изолят 333 -----------Е---------------------------------------------------------

Рисунок 1. Аминокислотные замены на участке PreSl белка, взаимодействующего с клеточным рецептором.

Другой функциональный участок оболочечных генов, представляющий интерес с позиций влияния на интенсивность экспрессии HBsAg, это pre-S2/S промоторный участок (2994-3171 и.о.). Он содержит различные регуляторные элементы (NF1, SP1, ССААТ-элемент), участвующие в транскрипции pre-S2 и S белков. Наибольшее значение имеет ССААТ мотив (3104-3108), мутации в котором ведут к нарушению продукции HBsAg и секреции вирионов [N.Molla et al, 2002; S.Sengupta et al., 2007]. У изучаемых изолятов ВГВ, генотип D имеет наиболее вариабельный pre-S2/S промоторный участок (31,4% н.о. замен), по сравнению с генотипами А (9,5%) и С (6,7%). Здесь нужно отметить наличие двух изученных нами изолятов с частично делетированной промоторной областью - изолят 13 (делеция 3000-3038 н.о.) и изолят 5 (делеция 3128-17 н.о.), у которого делеция пролонгирована до 5'- конца pre-S2 гена. А также наличие у изолята 23 двух нуклеотидных мутации в ССААТ элементе ССССТ. Но, несмотря на изменения в этой области у изученных нами изолятов, все они имели | HBsAg в сыворотке крови. !

В рамках этой области находится участок pre-Sl белка (92-113 аа) или i если рассматривать pre-Sl белок в виде трех доменов L, M и S, этот участок располагается на границе L и M доменов - (92-108/1-5 аа) (нумерация аминокислот приведена для генотипа D). Этот участок белка, как полагают, выполняет матриксную функцию при морфогенезе вирионов с последующей их секрецией из клетки [V.Bruss, 1997, 2007]. В этом участке выявлены следующие замены - N103D (4 ¡KB, 31, 2, 13, 3, 23, К, 16, 22); MIT (6) -замена, повреждающая инициирующий кодон для M белка; W3R (26). Как уже упоминалось, у штамма 5 присутствует делеция, захватывающая L-M домены (94-108/1-10 аа), которая почти полностью исключает матриксный участок, что должно приводить к нарушению формирования оболочки вирионов и их секреции.

В N-концевом участке S домена располагается цитозольная петля (3380 аа) (рисунок 2), аминокислотная последовательность которой, как полагают [C.T.M.Mangold et al., 1993; H.Loffler-Mary et al., 2000], необходима для сборки и секреции вирионов и субвирусных частиц.

39 m

5$ »

Рисунок 2. Предположительная топология S белка в мембране эндоплазматического ретикулума [H.Loffler-Mary et al., 2000].

Замены N40S (20, 29); F41L (3); G44E (2, 13); T45N (22); S45A и Р46Н (17) локализуются в участке (40-46 аа) при делеции которого, происходило нарушение секреции зрелых вирионов [H.Loffler-Mary et al., 2000]. Замена T57I (2) находится на участке, где делеция (57-63 аа) приводила к нарушению сборки и секреции субвирусных частиц, а замены (56-59 аа, с T57L) вызывали нарушение секреции зрелых вирионов, а замена S61T (25, 6) находится на участке, где замены (61-64 аа, с S61A) вызывали нарушение сборки и секреции субвирусных частиц [H.Loffler-Mary et al., 2000]. У изолята 5 в 74 позиции S-белка триптофан заменен стоп кодоном (W74Stop), тем самым, прерывая дальнейший синтез HBsAg, но данный изолят выделен из HBsAg-позитивной сыворотки. Преждевременный стоп кодон в S-белке в позициях 61, 69, 94 был обнаружен в ряде работ [M.Devesa et al., 2004; G. Bozdayi et al., 2005; Y.Xu et al., 2003]. При этом, в одних случаях сыворотки крови, из которых выделены подобные изоляты, были позитивны на HBsAg, в других нет. Замена цистеина в 76 позиции, одного из четырех цистеинов в цитозольной петле S-белка, как было показано [С.Т.М. Mangold et al. 1993], не влияет на сборку и секрецию субвирусных частиц. Обнаружена замена C76Y у изолята (23). Замена аргинина в 79 позиции на позитивно заряженную аминокислоту лизин вызывала в эксперименте по обратной генетике прекращение секреции зрелых вирионов [H.Loffler-Mary et al., 2000], в то время как у нас была обнаружена замена R79H (изолят 20), где гистидин также относится к группе полярных аминокислот, однако мутантный геном вируса детектировался в сыворотке крови.

При анализе главного гидрофильного региона (MHR) у исследуемых изолятов, нами были выявлены аминокислотные замены только среди изолятов генотипа D, среди них у изолята 30 выявлена замена Y134N, которая, как полагают, связана с проблемами обнаружения HBsAg в сыворотке крови с помощью иммуноферментных тест-систем [J.M. Echevarría et al., 2006], кроме того, у этого изолята присутствует еще одна замена L109Q. Замены S113T, Р127Т (изоляты 9, 29) встречались в комбинации с другими аминокислотными заменами у изолятов с негативным HBsAg профилем [К.М.Weinberger et al., 2000]. В пределах этого участка имеются еще две аминокислотные замены: изолят 5 - G112R и изолят 22 -L109R, характеризующиеся изменением полярности аминокислотного остатка. Остальные замены в этом регионе не приводили к изменению полярности аминокислотного остатка и не были описаны при HBsAg -негативном статусе: A128V (изоляты 2, 19), V118A (изоляты 13, 5), V118T (изолят 3), G159A (изолят 20), Y134F (изолят 33).

С - концевой участок S домена наряду с N - концевым участком pre-Sl домена является наиболее вариабельным. Были обнаружены три изолята с преждевременными стоп кодонами, изоляты 13, 23 (L216Stop) и 16 (W182Stop), так же изолят 16 имел замену в позиции S174N, встречающуюся у изолятов, выделенных из сывороток крови негативных при детекции на HBsAg [К.М. Weinberger et al., 2000]. В С - концевом участке S домена нами обнаружены аминокислотные замены, которые описаны Weinberger К.М. et

al., (2000) у изолятов ВГВ, выделенных из сывороток с негативным HBsAg статусом: V184A (9, 29, 33, 12, liKB); S207R (5, 9, 29, 33); S207N (31, 3, 10, 24, 25,6); G185E (3); S174N (16).

Все изученные изоляты, были положительны на HBsAg, за исключением изолята К, у которого единственным серологическим маркером был anti-HBc и при этом отсутствовали установленные аминокислотные замены в HBsAg, определяющие подобный серологический статус. Причиной данного явления при хроническом гепатите В могут быть: низкая концентрация HBsAg, не детектируемая современными тест-системами и/или мутации в других регуляторных элементах генома ВГВ [B.Weber, 2005]. По наблюдениям [J.Hou et al., 2001; K.M.Weinberger et al., 2000], только 43%-57% случаев с негативным статусом по HBsAg, но положительным результатом на ДНК ВГВ, объясняются аминокислотными заменами в главном гидрофильном регионе (MHR).

Помимо ранее рассмотренных изолятов, у 7 изолятов ВГВ, выделенных у больных с ХГВ, был секвенирован участок S гена, соответствующий «а»-детерминанте. Изоляты генотипа D характеризовались следующими нуклеотидными заменами: изолят 112 - A506G; С507Т; С533А; С537Т; С562А; изолят 113 - не имел замен; изолят 117 - С619Т; изолят В - A506G; С533А; изолят R - С562А; изолят 115 - С568Т. У изолята Dud генотипа А в сравнении с референтными изолятами этого же генотипа не было ни одной замены.

Нуклеотидные замены приводили к заменам аминокислотных остатков только у изолятов 112 (T118V, Р127Т, A128V) и В (Т118А, Р127Т). Замена Т118А описана [W.F.Carman et al., 1997] у изолята, выделенного из сыворотки, которую исследовали на HBsAg с помощью двух различных ИФА тест систем. В обоих тест-системах величина S/CO (отношение оптической плотности к величине cut off) была сниженной. Подобный результат может быть обусловлен двумя причинами: низкой концентрацией HBsAg и/или измененной структурой иммунодоминантной области HBsAg.

Помимо этого, были изучены 10 изолятов ВГВ, выделенных у больных с суперинфекцией ВГВ+ВГД. Анализируемым участком S гена также была «а»-детерминанта. Анализ нуклеотидных последовательностей изолятов генотипа D показал наличие следующих замен: изолят HBVD3 - A506G; изолят HBVD4 - A506G; С507Т; С537Т; изолят HBVD5 - С512Т; А533С; изолят HBVD6 - A506G; С507Т; С537Т; изолят HBVD7 - A506G; С507Т; С537Т; изолят HBVD10 - А533С; A544G; С568Т; С574А; С598А; С619Т; изолят HBVD11 - A506G; С507Т; С537Т; изолят HBVD12 - А533С; изолят HBVD16 - А533С; С619Т. Изолят генотипа А - HBVD18 не имел замен в этом участке в сравнении с референтными изолятами этого же генотипа.

Выше описанные нуклеотидные замены приводили к аминокислотным заменам у следующих изолятов: HBVD6, HBVD7, HBVDll, HBVD4 (TI 18V, A128V); HBVD 10, HBVD12, HBVD16 (Т127Р); HBVD3 (Т118А); HBVD5 (P120S, Т127Р). Замена P120S, обнаруженная у изолята HBVD5, была описана [C.J.Oon et al., 1999] у вакцинированных против ГВ детей,

рожденных от матерей с вирусоносительством. В работе [J.H. Ireland et al., 2000] были получены данные о существенных различиях диагностических возможностей семи коммерческих тест-систем при детекции рекомбинантного HBsAg с заменами P120S и S143L.

Анализ нуклеотидных последовательностей, соответствующих главному гидрофильному региону (MHR) HBsAg, полученных при детекции ДНК ВГВ из группы хронически инфицированных ГВ доноров г. Нальчика (Республика Кабардино-Балкария) (15 изолятов) показал наличие следующих замен: изолят seq2 - Т493А; А518С; A520G; T641G; изолят seql - A506G; С533А; изолят HBV6 - С499Т; изолят HBV7 - А514С; С562Т; Т580С; С619Т; изолят HBV9 - Т493С; С517Т; А518С; изолят HBV10 - A506G; С533А; изоляты HBV11 и HBV18 не имели на данном участке генома нуклеотидных замен; изолят HBV13 - A506G; С533А; изолят HBV14 - A506G; С533А; изолят HBV15 - A544G; С568Т; С574А; С598А; С619Т; изолят HBV17 -Т493С; С562А; A616G; изолят HBV19 - T493G; изолят HBV6 - С495А; Т552С; T641G; изолят HBV8- G508A. Изменения в аминокислотных последовательностях соответствующего фрагмента S-белка приведены на (рисунок 3). Нуклеотидные замены приводили к аминокислотным заменам только у изолятов seql, HBV10, HBV13, HBV14 (TI 18А, Р127Т); у изолята HBV4 имеются две замены Т114К и М133Т, последняя из которых характеризовалась, как «ускользающая» от детекции HBsAg с помощью ИФА тест-системам [J.Hou et al., 2001]. При определении HBsAg, принадлежащего образцу HBV4, имеющего замену М133Т, показаны различия в диагностических возможностях четырех тест-систем для детекции HBsAg достигающие 40 раз.

Филогенетический анализ полученных нами нуклеотидных последовательностей, исследуемого участка S-гена, показал, что генотип D составляет - 86,7% (13), генотип А -13,3% (2).

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 16 изолятов, выделенных у хронически инфицированных лиц в республике Саха (Якутия), показывает присутствие трех генотипов ВГВ - генотип D - 7 изолятов (43,75%); генотип А - 7 изолятов (43,75%) и генотип С - 2 изолята (12,5%). При изучении изолятов каждого генотипа установлена их субгенотиповая принадлежность - D3 (85,7%), D2 (14,3%). Генотипы А и С были представлены только субгенотипами А2 и С2.

Нуклеотидные последовательности изолятов субгенотипа С2 (55 и 162) оказались идентичными друг другу на участке генома ВГВ, который был изучен, возможно потому, что эти изоляты были выделены у инфицированных лиц, проживающих в одном и том же селе Усть-Алданского района Республики Саха (Якутия), допуская возможность общего источника инфекции. Из приведенных данных видно, что среди изолятов генотипа D большинство замен группируется в pre-S2/S промоторной области, 5'-конце pre-S2 и в 3'- конце S генов, тогда как у изолятов генотипа А большая часть замен сосредоточена в 5'- конце S-гена и участке, соответствующем главному гидрофильному региону (MHR).

Рисунок 3.

Генетическая вариабельность главного гидрофильного региона (MHR) S гена у естественно встречающихся вариантов ВГВ среди доноров крови в г. Нальчике.

consensus: 1 1 1 1 1 11 1 I 1

1 1 2 2 3 3 3 4 5 6

GM LPVCPLI PGSjTTs'GPCjTCTTpAQGy S ¿J, yP S С С CT KP | DGNC T С IP IPSSW AFqKJL

(102-I62aa)

Seq 2 .............................................................

Seq 1 ................A-.......T........-..........................

HBV4 -- -.........К.......К - - ------N - TF........T...............A - Y -

HBV6 -...........-.........-....... -..............................

HBV7 -....................-..........-............................

HBV8 ............T-......К........N -- F------- - T...............A-Y-

HBV9 ............................................................. «

HBV10 -...............A. ----- - -T-..................................

HBV11 ...............-.............................................

HBV13 ................A........т...................................

HBV14 ................A........T - -.................................

HBV15 - -....................................-......................

HBV17 - -............-..............................................

HBV18 - .............-..............................................

HBV19 .............................................................

У изолятов генотипа С замены обнаруживаются, преимущественно, в 5'-конце pre-S2 и в 3'- конце S-генов.

Сравнение полученных аминокислотных последовательностей с референтными штаммами из GenBank в пределах одного генотипа показало, что 111 нуклеотидных замен приводили к 53 аминокислотным заменам у изолятов генотипа D, 36 нуклеотидных замен у генотипа А - к 22 аминокислотным заменам и у изолятов генотипа С 11 нуклеотидных замен приводили к 5 аминокислотным заменам.

Из выявленных аминокислотных замен следует выделить замены T40S (12), расположенную в участке, взаимодействующим с клеточным рецептором, N103D (61п, 81, Y1) - в матриксном домене L белка, участвующем в морфогенезе вирионов. В области цитозольной петли S белка (33-80аа), которая, как полагают [H.Loffler-Mary et al., 2000], участвует в сборке и секреции вирионов и пустых субвирусных частиц, обнаружены следующие замены - T68I (4); F80S (12); S45A, C76R (39); I68T, W74S (176); P67Q (Y2, Yal).

В главном гидрофильном регионе (MHR) S белка были выявлены следующие замены - V118A (4); Q101R, I110L (Y1) и M133I (39). Из них, замены - Q101R и II10L ранее выявлялись из сывороток крови с негативным тестом на HBsAg [К.М. Weinberger et al., 2000], а замена Ml331 была описана в случае получения расходящихся результатов детекции HBsAg разными ИФА тест-системами [J.M.Echevarria et al., 2006].

В С-концевом участке S-белка обнаружены замены, описанные в комбинации с другими заменами при отрицательном тесте на HBsAg [K.M.Weinberger et al., 2000], среди них - S207R (61п); P203R (81); M198I, Y206C, S207N (Yl); V184A (Y2, 55, 162).

Сравнительный анализ диагностических возможностей коммерческих тест-систем для детекции HBsAg с помощью панели сывороток охарактеризованных изолятов ВГВ.

Ввиду отсутствия, в настоящее время, данных о диагностических возможностях иммуноферментных тест-систем, применяемых в Российской Федерации, по выявлению различных генотипов HBsAg, в том числе его мутантных форм, способных ускользать от их детекции, проведено сравнительное исследование четырех тест-систем, основанных на различных принципах детекции HBsAg. Изучены диагностические возможности различных тестов для детекции HBsAg с помощью панели, созданной из ранее охарактеризованных образцов, включающей 15 сывороток крови хронически инфицированных доноров г. Нальчика (Республика Кабардино-Балкария), 10 сывороток крови от пациентов с суперинфекцией ВГВ+ВГД, г. Москва и 6 сывороток крови от больных с хроническим вирусным гепатитом В, г. Москва. У выделенных изолятов ВГВ, изучали нуклеотидные последовательности соответствующие главному гидрофильному региону (MHR) и «а»-детерминанте HBsAg.

В образцах, полученных от инфицированных доноров (г. Нальчик), обращает на себя внимание тот факт, что во всех случаях максимальные

концентрации показаны при использовании наборов «Roche Elecsys HBsAg» (9 случаев из 15) и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» (6 случаев из 15). Схожие результаты при сравнительных исследованиях различных тест систем для детекции HBsAg были получены [B.Weber et al., 2003; B.Moerman et al., 2004; C.M.01inger et al., 2007]. Минимальные значения отмечены в тест-системах «HBsAg II EIA Cobas Core Roche» (6 случаев из 15) и «ДС-ИФА-HBsAg» (9 случаев из 15). В целом же, можно констатировать, что чувствительность первых двух тестов значительно выше, чем у ИФА. При этом в ряде образцов различия в концентрации HBsAg составляли весьма значительные величины, которые нельзя объяснить разницей в чувствительности использованных тестов (таблица 5).

Таблица5.

Результаты определения концентраций НВзАд в образцах доноров крови г. Нальчика (Республика Кабардино-Балкария) с помощью четырех различных серологических тестов. _

№ образца Генотип ВГВ Концентрация HBsAg (в нг/мл) Кратность различий в концентрациях HBsAg

«Roche Elecsys HBsAg» «Abbott Axsym HBsAg (V2)» «HBsAg II EIA Cobas Core Roche» «ДС-ИФА-HBsAg»

Seq 2 D 11081* 8984 1147 5117 9,7

HBV6 D 548 737 194 186 4,0

HBV7 D 20791 15629 1852 471 44,1 .

HBV9 D 4928 5151 2384 1074 4,8

HB Vil D 3125 2427 1118 1557 2,8

HB VI 5 D 660 655 167 241 3,9

HB VI 7 D 1449 1163 546 484 3,0

HBV18 D 4522 4487 912 655 6,9

HBV19 D 9452 10136 458 2834 22,1

Seq 1 D 14602 6657 1080 6014 13,5

HBV10 D 14068 9650 7770 3588 3,9

HBV13 D 3135 1862 1772 1649 1,9

HBV14 D 25233 27947 8541 15069 3,3

HBV 4 А 58990 63481 4784 1577 40,2

HBV8 А 83210 104686 7716 3874 27,0

* - в таблице жирным шрифтом выделены максимальные и минимальные значения определенных концентраций HBsAg.

Так, в образцах №№ HBV4 и HBV8, принадлежащих генотипу А вируса гепатита В, максимальные показатели концентрации HBsAg выявлены в тесте «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» превышающие минимальные, определенные в тесте «ДС-ИФЛ-HBsAg», в 40,2 и 27,0 раза соответственно. Различия в чувствительности, выявленные на этих образцах, могут быть связаны также с заменами в образце № HBV4 Т114К, М133Т,

одна из которых находятся в пределах «а»-детерминанты - М133Т, которая описана как ускользающая от детекции [J.Hou et al., 2001]. Полученные нами данные в отношении более высокой чувствительности тест-системы «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» при обнаружении мутантной формы HBsAg (образец № HBV4) согласуются с данными, полученными [B.Moerman et al., 2004].

Можно также предположить, что такая разница в чувствительности обусловлена принадлежностью данного вируса к генотипу А (серотип ad), относительно редко встречающегося на территории России. По-видимому, основные компоненты тест-системы «ДС-ИФА-HBsAg» (иммуносорбент и конъюгат) подобраны таким образом, чтобы с максимальной чувствительностью выявлять доминирующий в России генотип D (серотип ау) вируса гепатита В.

При изучении панели сывороток, полученных от больных в г. Москва, во всех образцах максимальные концентрации показаны при использовании наборов «Roche Elecsys HBsAg» (7 случаев из 10 - сыворотки крови от пациентов с суперинфекцией ВГВ+ВГД и 3 случая из 6 - сыворотки крови от пациентов с хроническим гепатитом В ) и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» (3 случая из 10 - пациенты с ВГВ+ВГД и 3 случая из 6 - пациенты с хроническим ГВ). Минимальные значения отмечены в тест-системах «HBsAg П El A Cobas Core Roche» (4 случая из 10 - пациенты с ВГВ+ВГД и 5 случаев из 6 - пациенты с хроническим ГВ) и «ДС-ИФА-HBsAg» (6 случаев из 10 и 1 случай из 6, соответственно) (таблицы 6 и 7).

Таблица 6.

Результаты определения концентраций HBsAg в образцах сывороток крови пациентов с суперинфекцией ВГВ+ВГД г. Москва с помощью четырех различных серологических тестов.

№ образца Генотип ВГВ Концентрация HBsAg (в иг/мл) Кратность различий в концентрациях HBsAg

«Roche Elecsys HBsAg» «Abbott Axsym HBsAg (V2)» «HBsAg II EIA Cobas Core Roche» «ДС-ИФА-HBsAg»

HDV7 D 33993 37584* 15322 14566 2,6

HDV10 D 2041 2332 331 1012 7,0

HDV11 D 4138 2659 3703 404 10,2

HDV16 D 3967 3390 1956 823 4,8

HDV18 А 2409 2326 868 1196 2,8

HDV12 D 45652 17623 11248 40780 4,2

HDV3I D 826 870 331 249 3,5

HDV4 D 7339 6115 1944 1745 4,2

HDV5 D 4298 3124 1504 404 10,6

HDV 6 » 10881 9903 3410 5180 3,2

Как и при ранее изученной панели сывороток в целом можно констатировать, что чувствительность первых двух тестов значительно выше,

Таблица 7.

Результаты определения концентраций HBsAg в образцах сывороток крови пациентов с хроническим гепатитом В г.Москва с

помощью четырех различных серологических тестов.

№ образца Генотип ВГВ Концентрация HBsAg (в нг/мл) Кратность различий в концентрациях HBsAg

«Roche Elecsys HBsAg» «Abbott Axsym HBsAg (V2)» «HBsAg II EIA Cobas Core Roche» «ДС-ИФА-HBsAg»

R D 10508 950 341 610 30,8

112 D 376496 169598 121140 121140 3,1

113 D отр 0,32 0,16 отр 0,2

115 D 10871 11831 3703 5599 3,2

117 D 3487 2659 956 1281 3,6

В D 21157 22763 8248 12739 | 2,8

* - в таблицах 6 и 7 жирным шрифтом выделены максимальные и минимальные значения определенных концентраций HBsAg.

чем у ИФА. Образец сыворотки крови № HDV5 показал десятикратное различие в чувствительности четырех тест-систем (max в тест-системе «Roche Elecsys HBsAg» и min в «ДС-ИФА-HBsAg»), Анализ аминокислотной последовательности главного гидрофильного региона (MHR) HBsAg у изолята, выделенного из этой сыворотки, показал наличие замены - P12QS, которая ранее была описана CJ.Oon et al. (1999) и J.H.Ireland et al. (2000) в связи с ускользанием от вакцинального иммунитета и снижением чувствительности тест-систем для детекции HBsAg, соответственно.

Следует отметить, что среди сравниваемых образцов были такие, которые с помощью четырех тест-систем определялись с различной чувстивительностью: №№ HBV7 (44,1) и HBV19 (22,1) в первой панели; № HDV11 (10,2) во второй панели; № R (30,8) в третей панели. Анализ аминокислотной последовательности «а»-детерминанты и MHR HBsAg этих образцов показал, что их последовательности были идентичны некоторым изолятам ВГВ, которые не показывали существенных различий в четырех изучаемых тест-системах. А именно, аминокислотная последовательность MHR изолятов HBV7 и HBV19 идентична аминокислотной последовательности изолятов seq2, HBV6, HBV9, HBV11, HBV15, HBV17, HBV18; аминокислотная последовательность «а»-детерминанты изолята HDV11 идентична HDV6, HDV7, HDV4; а аминокислотная последовательность изолята R идентична последовательности изолятов 113, 115, 117. Подобный результат не является неожиданностью. В ряде работ сообщалось о возможности снижения чувствительности тест-систем для детекции HBsAg при отсутствии аминокислотных замен в пределах «а»-детерминанты и MHR HBsAg [K.M.Weinberger et al., 2000; J.Hou et al., 2001; C.M.01inger et al., 2007]. Одним из более вероятных объяснений является -наличие аминокислотных замен в других участках HBsAg (pre-Sl, pre-S2, N-

и С- концы S- белка), которые могут изменять пространственную структуру иммунодоминантного региона HBsAg.

ВЫВОДЫ.

1. Эпидемиологический анализ многолетней динамики (2000-2006 годы) заболеваемости гепатитом В совокупного населения в Российской Федерации показал наличие выраженных тенденций снижения заболеваемости ОГВ, носительства ГВ (Т сниженш=>-5,1%) и стабилизации заболеваемости ХГВ (Т снижения = -1%.), тогда как, для детей до 14 лет выраженные тенденции снижения заболеваемости отмечаются для всех трех регистрируемых форм ГВ (Т снижения=>-5,\%).

2. Выявлены значительные различия в интенсивности эпидемического процесса гепатита В в отдельных федеральных округах Российской Федерации в период с 2000 по 2006 годы: в Дальневосточном ФО зафиксирована стабильно высокая заболеваемость ГВ (суммарные показатели), в Центральном и Южном - ниже среднего и низкая. Различия между максимальными и минимальными показателями в анализируемый период составляли от 2,1 до 2,5 раз.

3. Показано, что на территории Российской Федерации циркулируют три генотипа ВГВ - А, С, D. На территории Центрального и Южного федеральных округов доминирует генотип D - 87%, удельный вес генотипов А и С составляет 11% и 2% соответственно. На территории Дальневосточного федерального округа генотипы А и D обнаружены в 44% каждый и доля генотипа С составила 12%.

4. Впервые для изолятов ВГВ, циркулирующих в различных регионах Российской Федерации, установлена высокая генетическая вариабельность области pre-S2/S промотора у изолятов генотипа D (до 31% нуклеотидных замен pre-Sl/pre-S2/S участка), 5'- концов pre-S2/S генов у изолятов генотипа С (до 54%) и 3'- конца S-гена у изолятов генотипа А (до 28%) при меньшей вариабельности участка S-гена, соответствующего главному гидрофильному региону HBsAg (до 25% у изолятов генотипа А).

5. Среди изолятов ВГВ, циркулирующих на территории Российской Федерации, гетерогенность генотипа D, представленного тремя субгенотипами (Dl, D2, D3), более выражена, по сравнению с генотипами А и С, представленными только субгенотипами А2 и С2 соответственно.

6. Выявлены существенные различия в диагностических возможностях четырех тест-систем для детекции HBsAg вируса гепатита В, принадлежащего генотипам А и D, а также его мутантных форм (замены Ml 13Т, P120S), которые достигали 40-44 раз.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Забелин H.H., Самохвалов Е.И., Тленкопачев P.C., Кузин С.Н. Генетическая вариабельность главного гидрофильного региона S-гена у естественно встречающихся вариантов вируса гепатита В.// В кн.: «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика». - 2007. -А12. -с.25-26.

2. Садикова Н.В., Зверяева И.К., Кузина Л.Е., Забелин H.H., Кузин С.Н., Зверев В.В. Структура путей передачи вируса у больных острыми формами гепатита В на территории России.// В кн.: «Вирусные гепатиты -эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика». - 2007. - В30. -с.139-140.

3. Садикова Н.В., Кузина JI.E., Зверяева И.К., Забелин H.H., Кузин С.Н. Динамика заболеваемости гепатитом В на территории России в период с 1995 по 2005 годы.// В кн.: «Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика». - 2007. -В31. -с.140-141.

4. Кузина JI.E., Забелин H.H., Брагинский Д.М., Тленкопачев P.C., Николаев В.Л., Садикова Н.В., Зверяева И.К., Варламова И.А., Шутько С.А., Самохвалов Е.И., Кузин С.Н. О влиянии генетической вариабельности S-гена вируса гепатита В на диагностические возможности различных тестов для детекции HBsAg.// В кн.: «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Украина, Гурзуф, 2007. -Н2. -с.166-168.

5. Садикова Н.В., Кузин С.Н., Ершова О.Н., Кириллова И.Л., Забелин H.H., Кузина Л.Е., Зверяева И.К., Зверев В.В. Количественные характеристики эпидемического процесса гепатита В на территории Российской Федерации.// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2008. -№5. - с.4-9.

6. Кузин С.Н., Забелин H.H., Самохвалов Е.И., Семенов С.И., Павлов H.H., Терехова М.В., Зверяева И.К., Кузина Л.Е., Кожевников A.A. Генетическое разнообразие вируса гепатита В на территории Республики Саха (Якутия).// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2008. - №5. - с. 10-15.

Заказ №1039. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш» г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.rn

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Забелин, Никита Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.5.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.11.

1.1. Структура генома ВГВ.11.

1.2. Жизненный цикл вируса ГВ.13.

1.3. Экспрессируемые белки ВГВ.17.

1.4. Генетическая вариабельность ВГВ.19.

1.4.1. Генотипы, субгенотипы, серотипы вируса гепатита В.19.

1.4.2. Мутанты ВГВ.23.

1.5. Серологическая диагностика вирусного гепатита В.31.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.37.

ГЛАВА 3. ДИНАМИКА ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ

ГЕПАТИТОМ В НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ В ПЕРИОД С 2000 ПО 2006 ГОДЫ.44.

3.1. Оценка динамики заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории Российской Федерации в период с 2000 по 2006 годы.44.

3.2. Динамика заболеваемости гепатитом В в Центральном, Южном и Дальневосточном федеральных округах в период с 2000 по 2006 годы.52.

ГЛАВА 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА

ГЕПАТИТА В ПО PreSl/PreS2/S-rEHAM.58.

4.1. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей.60.

4.1.1. Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории г.Москвы.61.

4.1.2. Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории

Республики Кабардино-Балкария (г.Нальчик).78.

4.1.3. Генетическая характеристика штаммов вируса гепатита В, выделенных от пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией г.Череповца.80.

4.1.4. Генетическая характеристика изолятов вируса гепатита В, выделенных от пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией на территории Республики Саха (Якутия).84.

ГЛАВА 5. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ КОММЕРЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ HBsAg С ПОМОЩЬЮ ПАНЕЛИ ОБРАЗЦОВ

ОХАРАКТЕРИЗОВАННЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА В.92.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическая вариабельность вируса гепатита В по PreS1/PreS2/S генам у пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией"

В настоящее время проблема гепатита В (ГВ) сохраняет свою актуальность и является одной из социально-значимых инфекций в Российской Федерации. Несмотря на наличие эффективных средств профилактики гепатита В, таких как активная и пассивная иммунизация, противовирусных препаратов, по данным J.M. Pawlotsky (2005) более 350 млн. людей во всем мире хронически инфицированы вирусом гепатита В (ВГВ). Одним из ведущих аспектов проблемы ГВ является генетическая вариабельность возбудителя этого заболевания, которая обусловливает, в ряде случаев, недостаточную эффективность вакцинации, серологической диагностики, а также лечения противовирусными препаратами.

В настоящее время отсутствуют данные о возможностях иммупоферментных тест-систем (ИФТС), применяемых в Российской Федерации, выявлять HBsAg, принадлежащий различным генотипам и субгенотипам ВГВ, в том числе и известным мутантным формам вируса. Выполнение таких исследований позволит существенно повысить качество серологической диагностики гепатита В.

Изложенное выше послужило основанием для выполнения работы по изучению современных проявлений эпидемического процесса гепатита В на территории Российской Федерации и отдельных федеральных округов, определению структуры генотипов, субгенотипов ВГВ в различных регионах страны, генетической вариабельности pre-Sl/pre-S2/S генов у изолятов ВГВ, выделенных у пациентов с хронической ЫВ-вирусной инфекцией, а также оценки способности современных тест-систем определять HBsAg, принадлежащий различным генотипическим, серотипическим и мутантным формам вируса.

Цель и задачи исследования.

Для достижения указанных целей были поставлены следующие задачи:

1. Рассчитать многолетние тенденции динамики заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории России, а также

Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов за период с 2000 по 2006 годы;

2. Изучить генетическую вариабельность pre-Sl/pre-S2/S генов вируса гепатита В у лиц с хронической НВ-вирусной инфекцией, а также структуру циркулирующих генотипов на территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов;

3. Охарактеризовать диагностические возможности коммерческих тест-систем для детекции HBsAg.

Научная новизна.

Установлены различия в структуре циркулирующих генотипов ВГВ па исследуемых территориях: в Центральном и Южном округе с наибольшей частотой обнаружен генотип D (87%), тогда как в Дальневосточном округе генотипы А и D составляют по 44% и генотип С - 12%.

Впервые на основании широкомасштабных молекулярно-генетических исследований изолятов ВГВ, циркулирующих на различных территориях Российской Федерации, установлено, что в pre-Sl/pre-S2/S области генома ВГВ, наиболее вариабельными участками оказались область pre-S2/S промотора у изолятов генотипа D (до 31% нуклеотидных замен), 5'- конец pre-S2/S генов у изолятов генотипа С (до 54%) и 3'- конец S-гена у изолятов генотипа А (до 28%). При этом область S-гена, соответствующая главному гидрофильному региону (MHR) была менее вариабельной (до 25% нуклеотидных замен у изолятов генотипа А).

Положения, выносимые на защиту.

- выраженное снижение заболеваемости острым гепатитом В и носительства ВГВ ('Тсниэ1сения=>-5,\%), стабильный уровень заболеваемости хроническим гепатитом В (Т снижения — -1%); б) для детей до 14 лет установлено:

- выраженное снижение заболеваемости острым, хроническим гепатитом В и носительства ВГВ (Тснижения — >-5,1%).

Практическая значимость.

ИФЛ-HBsAg» продемонстрировала сравнительно более низкие диагностические возможности при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg.

Внедрение полученных результатов.

Научные положения, выводы и практические рекомендации, вытекающие из результатов диссертационной работы, используются при чтении лекций и проведении семинарских занятий на кафедре вирусологии Московской Медицинской академии им. И.М.Сеченова.

Апробация работы.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и указателя литературы, состоящего из 125 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 14 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Забелин, Никита Николаевич

выводы.

1. Эпидемиологический анализ многолетней динамики (2000-2006 годы) заболеваемости гепатитом В совокупного населения в Российской Федерации показал наличие выраженных тенденций снижения заболеваемости ОГВ, носительства ГВ (Т снижения—>-5,1%) и стабилизации заболеваемости ХГВ (Т снижения = -1%.)3 тогда как, для детей до 14 лет выраженные тенденции снижения заболеваемости отмечаются для всех трех регистрируемых форм ГВ (Т сню1сения->-5,1%).

6. Выявлены существенные различия в диагностических возможностях четырех тест-систем для детекции HBsAg вируса гепатита В, принадлежащего генотипам А и D, а также его мутантных форм (замены М133Т, P120S), которые достигали 40-44 раз.

Заключение

Таким образом, было показано, что из четырех коммерческих тест-систем для детекции HBsAg наибольшие диагностические возможности проявляют тесты «Roche Elecsys HBsAg» и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» как в отношении генотипических (генотипы A, D), серотипических (серотипы ay, ad) различий, так и в отношении мутантных форм HBsAg (мутации М133Т, P120S).

Отечественная тест система «ДС-ИФА-HBsAg» демонстрирует низкие возможности при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg. Это, по-видимому, связано с тем, что в отечественных тестах преимущественно используют моноклональные и/или поликлопальные антитела, направленные на эпитопы HBsAg серотипа ау (генотип D), наиболее распространенного (до 90%) на территории РФ.

Помимо этого, нами получены данные, что не только замены в пределах MHR и «а»-детерминанты HBsAg обеспечивают различия в диагностических возможностях различных тест систем, но возможно и аминокислотные замены в PreSl, PreS2, N-, С- концах S белка, что в разное время и в разных странах было показано рядом авторов [62, 67, 103].

ГЛАВА 6

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Проблема вирусных гепатитов с парентеральным механизмом передачи остается серьезной и актуальной для здравоохранения России. Эпидемиологическая ситуация в отношении НВ-вирусной инфекции в Российской Федерации сохраняя напряженность, претерпевает существенные изменения. В последние шесть лет (2000-2006 годы) отмечается постоянное снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В. Необходимо отметить, что суммарный показатель заболеваемости гепатитом В в 2006 году самый низкий за все время регистрации. Снижению заболеваемости гепатитом В способствовал комплекс широкомасштабных противоэпидемических и профилактических мероприятий, направленных на предупреждение распространения НВ-вирусной инфекции. Основными из приоритетных направлений являются включение в Национальный календарь (2001 год) вакцинации против гепатита В, положившее начало, в масштабах страны, формированию популяции, обладающей протективным иммунитетом, и значительное повышение качества иммуноферментных тест систем, что обусловило более точную диагностику гепатита В. Но, несмотря на это, в разных регионах страны закономерности, характеризующие заболеваемость регистрируемыми формами гепатита В, выражены в различной степени, что обусловлено особенностями регионов России. К особенностям, влияющих на развитие эпидемического процесса гепатита В следует отнести снижение качества оказания медицинской помощи, усиление миграционных потоков, широкое распространение наркомании. Сочетание различных медико-социальных факторов, присущих той или иной территории, приводит к отличиям, иногда весьма существенным, в динамике заболеваемости, структуре путей передачи возбудителя, ,а также в возрастной структуре заболевших гепатитом В.

Целью настоящей работы было проведение сравнительного эпидемиологического анализа заболеваемости гепатитом В на примере трех федеральных округов (Центрального, Южного и Дальневосточного) с одновременным изучением молекулярно-генетических свойств изолятов ВГВ, выделенных на территории указанных округов.

Одной из задач работы являлось проследить динамику и структуру суммарного показателя заболеваемости регистрируемых форм гепатита В на территории Российской Федерации, а также изучить многолетние тенденции, характеризующие динамику заболеваемости гепатитом В на территории Российской Федерации и отдельных федеральных округов среди совокупного населения и детей до 14 лет. Использование суммарного показателя позволяет наиболее полно охарактеризовать динамику заболеваемости гепатитом В. Это подтверждают и исследования И.Л.Шаханиной в соавт. (2003), Л.И.Шляхтенко (2003) [22, 26, 27]. С этой целью был проведен анализ динамики показателей заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В в целом по РФ (20002006 годы) и в Центральном, Южном и Дальневосточном федеральных округах (2000-2006 годы) среди совокупного населения и детей до 14 лет.

Полученные данные позволили дать объективную оценку эпидемиологической ситуации и заболеваемости гепатитом В в трех федеральных округах РФ. В результате выполненной работы выявлены различия в динамике суммарного показателя заболеваемости регистрируемых форм гепатита В, как среди населения в целом, так и у детей до 14 лет.

В многолетней динамике заболеваемость ОГВ в России среди совокупного населения в период 2000 по 2006 годы характеризовалась снижением в 6,1 раза. Наибольший уровень абсолютного снижения (-15,6 на 100 тысяч населения) и максимальный темп убыли (44,2%) имел место в 2002 году. В последующие годы темп убыли снизился и в 2006 году зафиксирован самый низкий показатель заболеваемости ОГВ - 7,0 на 100 тысяч населения. Многолетняя (2000-2006 годы) тенденция заболеваемости ОГВ среди совокупного населения характеризуется выраженным снижением — Т сниэ/сения =>-5,1%.

В 2001 году отмечен максимальный показатель заболеваемости ХГВ среди совокупного населения за период наблюдения, при котором темп и показатель абсолютного прироста имели наибольшие значения +12,7% и 1,8 на 100 тысяч населения соответственно. В последующие (2002-2003) годы уровень заболеваемости ХГВ снизился и ее показатели сопоставимы - 15,0-14,9 на 100 тысяч населения. В 2004 году вновь отмечено повышение уровня заболеваемости ХГВ, однако, темп роста (+4,0%) ниже аналогичного показателя периода 2000-2001 годов. В 2005 году последовало снижение показателя заболеваемости ХГВ до 13,9 на 100 тысяч населения, при темпе убыли -10,3%, что является наибольшим значением в анализируемый период времени. В 2006 году отмечено повышение показателя заболеваемости ХГВ, составившего 14,0 на 100 тысяч населения. Вариабельность динамики показателя заболеваемости ХГВ отражена в многолетней тенденции (2000-2006 годы), которая характеризуется стабилизацией заболеваемости ХГВ: Т снижения = -1%.

В период 2000 по 2006 годы показатель носительства вируса гепатита В на территории Российской Федерации снизился в 2 раза, с 95,5 на 100 тысяч населения (2000 год) до 47,7 на 100 тысяч населения (2006 год). Максимальный показатель абсолютного снижения составил 15,5 на 100 тысяч населения (2002 год). Темп убыли не превысил -18,4% (максимальное значение, 2005 год). Многолетняя (2000-2006 годы) тенденция показателей носительства ВГВ характеризуется выраженным снижением - Т снижения =>-5,1%.

В период с 2000 по 2006 годы суммарный показатель заболеваемости ГВ, включающий все три регистрируемые формы гепатита В, среди совокупного населения снизился с 152,4 до 68,7 на 100 тысяч населения, характеризуясь снижением в 2,2 раза, что свидетельствует о значительном снижении уровня заболеваемости гепатитом В (суммарный показатель) в целом по России. В структуре суммарного показателя заболеваемости гепатитом В среди совокупного населения удельный вес ОГВ снизился с 27,9% (2000 год) до 10,2% (2006 год). Доля ХГВ за тот же период времени увеличилась с 9,3% до 20,4%, а удельный вес вирусоносительства гепатита В составил, не менее, 62% с увеличением доли до 70,5% (2004 год), с последующим снижением до 69,4% (2006). На территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов также зафиксировано снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В, при этом в Дальневосточном округе отмечено стабильное превышение суммарного показателя заболеваемости в сравнении со среднероссийским за весь период наблюдения, тогда как в Южном округе суммарный показатель превысил среднероссийский уровень в 2003, 2004 и 2006 годах.

Необходимо отметить, что многолетняя динамика заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительства гепатита В у детей до 14 лет, в анализируемый период, характеризовалась выраженной тенденцией к снижению. Начиная с 2000 года и до 2006 года, отмечено устойчивое снижение заболеваемости ОГВ детей до 14 лет - показатель 2006 года (1,2 на 100 тысяч населения) ниже в 8,3 раза, чем в 2000 году. Наиболее интенсивное снижение заболеваемости ОГВ отмечено в 2006 году, когда показатель абсолютного снижения составил 0,7 на 100 тысяч населения, а темп убыли - 36,8%. Общая многолетняя динамика заболеваемости ОГВ детей до 14 лет имела выраженную тенденцию снижения -Т снижения—>-5,1 %.

С 2000 года отмечалось стабильное снижение заболеваемости ХГВ с достижением минимального уровня в 2006 году - 1,9 на 100 тысяч населения. Многолетняя динамика заболеваемости ХГВ детей до 14 лет на территории России характеризуется выраженной тенденцией снижения - Ташжения= >-5,1%.

Помимо этого, с 2000 года имело место стабильное снижение вирусоносительства гепатита В с наибольшим расчетным темпом убыли (

26,3%), выявленном в 2003 году. Общее снижение в период с 2000 по 2006 годы уровня вирусоносительства гепатита В составило 2,9 раза - до 7,9 на 100 тысяч населения в 2006 году. Расчет многолетней тенденции свидетельствует о выраженном снижении уровня вирусоносительства гепатита В у детей до 14 лет на территории России - Тснижения= >-5,1%.

В период с 2000 по 2006 годы суммарный показатель заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет снизился в 3,4 раза с 37,5 до 11,0 на 100 тысяч населения, тогда как среди совокупного населения в 2,2 раза, что связано с различиями в многолетних тенденциях заболеваемости. Существенное влияние на более интенсивное снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В, в том числе формированию общей тенденции заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительства гепатита В среди детей до 14 лет, оказала иммунопрофилактика гепатита В [7, 8, 9].

Рассчитанные тенденции многолетней динамики показателей на территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов показали также выраженное снижение заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительсва гепатита В у детей до 14 лет - Тс//ш/сешш=>-5,1%.

Необходимо отметить что, несмотря на снижение заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительства гепатита В у населения в целом и детей до 14 лет, уровень носительства превышает как показатели заболеваемости ОГВ, так и ХГВ. Поэтому, можно констатировать, что ведущую роль, определяющую интенсивность эпидемического процесса гепатита В, как у населения в целом, так и у детей до 14 лет, играет носительство вируса гепатита В, формирующее общие тенденции в динамике заболеваемости ГВ [1, 2, 3, 6, 22, 29].

Важно отметить, что выявленное снижение суммарного показателя, по-видимому, не может быть расценено как существенное снижение интенсивности эпидемического процесса гепатита В среди детей до 14 лет в трех рассматриваемых федеральных округах. С помощью метода сигмальных отклонений выявлена территориальная неравномерность по уровню суммарной заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет в этих федеральных округах. Эффективность использования этого метода в проведении эпидемиологического анализа была показана ранее И.Л.Шаханиной с соавт. (2003) [22]. Так, было установлено, что Дальневосточный округ можно квалифицировать как регион с высоким уровнем заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет. Тогда как в Центральном округе имеет место, преимущественно, низкий уровень заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет, а в Южном округе - уровень ниже среднего. Отсутствие существенных изменений в уровне распространенности суммарного показателя гепатита В среди детей до 14 лет на территории Южного и Дальневосточного федеральных округов обусловлен, по-видимому, недостаточной охватом своевременной вакцинацией, что является сдерживающим фактором дальнейшего снижения заболеваемости гепатитом В.

Изучение молекулярно-генетических характеристик изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории различных регионов Российской Федерации показало, что имеет место циркуляция трех генотипов ВГВ -генотипы А, С, D. На территории Центрального и Южного федеральных округов преимущественным генотипом ВГВ является генотип D - 87,1%, доля генотипа А и С составляет 11,3% и 1,6%, соответственно. Иная ситуация на территории Дальневосточного федерального округа, в Республике Саха (Якутия), где генотипы А и D представлены в равном соотношении по (43,75%) и большее значение по сравнению с Центральным и Южным округами приобретает генотип С, доля которого составила (12,5%). Полученные данные о циркулирующих генотипах и их структуре в целом отражают тенденцию распространения генотипов ВГВ в странах Восточной Европы [48, 111, 119] и на территории центральной и восточной части России [61].

Генотип D на изученных территориях РФ был представлен большим количеством субгенотипов - Dl, D2, D3, по сравнению с генотипами А и С, которые были представлены только субгенотипами А2 и С2, соответственно.

Тем самым, можно констатировать, что гетерогенность генотипа D более выражена по сравнению с генотипами А и С, что также было показано в работе [68]. В структуре генотипа D на территории г. Москвы субгенотипы Dl, D2, D3 составили 11,54%, 19,23%) и 69,23%) соответственно. На территории республики Саха (Якутия) структура генотипа D была следующей — D2 (14,3%), D3 (85,7%). Таким образом, можно говорить, что субгенотип D3 является доминирующим в структуре генотипа D на территории исследованных регионов.

Анализ аминокислотной последовательности главного гидрофильного региона (MHR) HBsAg у изученных изолятов HBV показал наличие следующих аминокислотных замен: Q101R, L109Q, L109R, I110L, G112R, S113T, Т114К, Т118А, V118A, V118T, P120S, Р127Т, A128V, М133Т, M133I, Y134N, Y134F, G159A. Наиболее вариабельными позициями MHR оказались 109, 118, 133 и 134. При этом замена P120S была описана С. J.Oon el al. 1999 [70] у вакцинированных против гепатит В детей, рожденных от матерей с носительством ВГВ. Также замена P120S в комбинации с заменой S143L в работе J.H.Ireland et al. (2000) [107] были введены в рекомбинантный HBsAg и при детекции подобного HBsAg с помощью семи коммерческих иммуноферментных тест-систем были получены расходящиеся результаты, свидетельствующие о влиянии этих замен на иммунодоминантную область HBsAg. Замены Ml331, Y134N и М133Т были описаны в литературе как вызывающие проблемы при детекции HBsAg с помощью различных иммуноферментных тест-систем [37, 50, 103].

В результате сравнительной оценки четырех тест-систем для детекции HBsAg, нами было установлено, что наибольшие диагностические возможности проявляют тесты «Roche Elecsys HBsAg» и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» как в отношении генотипических (генотипы A, D), серотипических (серотипы ay, ad) различий, так и в отношении мутантных форм HBsAg (мутации М133Т, P120S). Отечественная тест-система «ДС-ИФА-HBsAg» продемонстрировала сравнительно более низкую возможность при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg. Это, по-видимому, связано с тем, что в отечественных тестах преимущественно используют моноклональные и/или поликлональные антитела, направленные на эпитопы HBsAg серотипа ау (генотип D), наиболее распространенного (до 90%) на территории РФ.

Выявленные различия в возможностях обнаружения HBsAg этими тест-системами при использовании стандартных образцов ОСО свидетельствуют о необходимости разработки и аттестации независимых экспертных панелей, с целью получения объективной оценки качества иммуноферментных тест систем, применяемых в диагностике НВ-вирусной инфекции на территории Российской Федерации.

Некоторые образцы сывороток давали значительные расхождения в диагностических возможностях четырех тест-систем. При анализе аминокислотной последовательности «а»-детерминанты и MHR HBsAg этих образцов было показано, что их последовательности были идентичны некоторым изолятам ВГВ, которые не проявляли существенных различий в этих четырех изучаемых тест системах. В ряде работ [62, 67, 103] указывалась возможность влияния на детекцию HBsAg изменений генома ВГВ не только в рамках MHR и «а» -детерминанты S гена, но и в PreSl/PreS2 генах, 5'- и 3'-концах S гена.

При анализе нуклеотидных замен на участках генома вируса, соответствующих PreSl/PreS2/S генам, у изолятов ВГВ, выделенных на территории г. Москвы, г. Череповца и Республики Саха (Якутия), было установлено, что нуклеотидные замены в основном сосредоточены в PreS2/S промоторном участке, 5'- концах PreS2/S и в 3'- конце S-гена. Участок S-гена, соответствующий главному гидрофильному региону (MHR) HBsAg у большинства изолятов являлся менее вариабельным по сравнению с другими участками оболочечных генов ВГВ. По данным J.Hou et al. (2001) [101] и K.M.Weinberger et al. (2000) [67] при доказанной виремии ВГВ, только 43%

57% случаев отрицательного результата обнаружения HBsAg, объясняются заменами в главном гидрофильном регионе (MHR). Отрицательные или сниженные результаты детекции HBsAg являются следствием не только структурных изменений иммунодоминантной области HBsAg. Все чаще дискутируются причины, которые приводят к нарушению процессов синтеза вирусных белков, сборки и секреции из клетки зрелых вирионов и субвирусных частиц, изменения в участке оболочки вируса, взаимодействующей с клеточным рецептором, а также интерферирование коинфецирующими вирусами [33, 35, 95, 41, 114, 59, 65, 60].

В задачи нашего исследования входило также изучение PreSl и PreS2 областей генома ВГВ, чтобы оценить, как вариабельность этих участков влияет на HBsAg в свете его детекции иммуноферментными тест-системами. В N-конце PreSl белка располагается участок, который взаимодействует с клеточным рецептором, и при высокой его вариабельности у вируса снижается способность инфицировать гепатоцит [33, 59]. Нами были обнаружены аминокислотные замены в этом участке PreSl белка у ряда изолятов ВГВ — 3 (Q18L; A28S; N29D; Т40Р; D43G), К (Т40Р), 26 (F14S), 19 (A28V), 30 (D16E), 333 (D27E), 12 (T40S). Кроме того, у изолята 13 имелась делеция в PreSl - 5264 аа, в пределах участка необходимого для инициации инфекции, но дистальнее основного участка (9-18 аа), взаимодействующего с рецептором клетки. Однако оценить роль этих замен в процессах связывания вируса с клеточным рецептором и проникновении в клетку в рамках данного исследования не представлялось возможным.

Как уже упоминалось выше, PreS2/S промоторная область у исследованных изолятов ВГВ оказалась наиболее вариабельной по сравнению с другими изученными участками генома ВГВ. Наиболее значимым элементом PreS2/S промотора является ССААТ мотив. У изолята 23 в ССААТ элементе была выявлена двойная мутация — ССССТ, однако сыворотка крови, в которой был выявлен изолят 23, была позитивной на HBsAg, хотя ряд авторов утверждал, что мутации в этом элементе приводят к нарушению продукции HBsAg и секреции вирионов [87, 108].

В пределах Pre-Sl белка (92-113 аа) располагается участок, который как полагают, выполняет матриксную функцию при морфогенезе вирионов с последующей их секрецией из клетки [35, 36]. Следовательно, изменения в этом регионе могут привести к нарушению сборки и секреции вирусных частиц. В этом участке нами были выявлены следующие замены - N103D; М1Т - замена, повреждающая инициирующий кодон для М белка; W3R . Обнаруженная у изолята 5 делеция, захватывает L-M домены (94-108/1-10 аа), которая почти полностью исключает матриксный участок, что должно приводить к нарушению формирования оболочки вирионов и их секреции. В работе M.Melegari et al. (1997) [83] описывается мутантный вирус гепатита В с делецией в L белке (47-107 аа), которая наряду с матриксным участком удаляла и S промотор, в результате синтеза HBsAg и секреции вирионов не происходило. Но в эксперименте при котрансфекции подобного вируса с конструкцией, несущей S-ген, секреция вирионов, несущих делецию, восстанавливалась. Это наблюдение противоречит данным V. Bruss (1997) [36], который показал, что матриксный участок в L домене (92-113 аа) является необходимым для секреции вирионов. В нашем случае, изолят 5, несущий делетированный матриксный участок, выделен из сыворотки, положительной на HBsAg. Возможно, наша ситуация напоминает эксперимент M.Melegari et al. (1997) [83], когда к мутаитному ВГВ с делецией матриксного участка была добавлена конструкция с S-геном ВГВ, экспрессирующая HBsAg и при этом секреция вируса восстанавливалась. Также возможна комплементация делетированного генома ВГВ геномом дикого типа, присутствующего как минорный компонент в вирусной популяции, в результате вирусный геном с делецией использует оболочечные белки генома дикого типа и успешно секретируется.

Цитозольная петля (33-80 аа) S белка, как полагают H.Loffler-Mary et al. (2000) [65] и D.R.Milich et al. (1990) [82], участвует в сборке и секреции вирионов и субвирусных частиц. Нами на этом участке были выявлены следующие аминокислотные замены N40S, F41L, G44E, T45N, S45A, Р46Н, T57I, S61T, P67Q, T68I, W74S, C76Y, C76R, R79H, F80S. Все изоляты ВГВ с аминокислотными заменами в этом участке S-белка были выделены из сывороток крови, в которых определялся HBsAg иммуноферментными тест-системами.

Как было указано выше, к снижению чувствительности ИФА тест систем для детекции HBsAg могут приводить аминокислотные замены не только в иммунодоминантном участке главного гидрофильного региона (MIIR) HBsAg, но и изменения вне этого участка. В этой связи хотелось отдельно остановиться на двух изолятах HBV, обнаруженных нами. Один из них, изолят К (генотип D, субгенотип D3, серотип ayw2) был выделен из сыворотки крови пациента с хроническим гепатитом В. Единственным серологическим маркером вирусного гепатита В был anti-HBc. Молекулярно-генетический анализ PreSl/PreS2/S белков показал наличие следующих аминокислотных замен: PreSl -Т40Р, L74I, N103D; PreS2 - V32A, V35A; S - S204R, Y206H. Как видно в области главного гидрофильного региона и «а»- детерминанты нет пи одной замены. Сравнение с другими изолятами ВГВ того же генотипа показало, что аминокислотные замены V32A, V35A (PreS2) и S204R, Y206H (S) обнаруживаются только у этого изолята. По-видимому, эти аминокислотные замены, расположенные вне «а»- детерминанты, могут изменять ее пространственную структуру, тем самым, препятствуя взаимодействию со специфическими антителами. Другой, изолят 5 (генотип D, субгенотип D2, серотип ayw3) был выделен из сыворотки крови пациента с хроническим гепатитом В. В его сыворотке крови определялись следующие серологические маркеры - HBsAg, anti-HBc (сумм.), anti-HBe, anti-HBc IgM, HBeAg. Анализ предсказанной аминокислотной последовательности PreSl/PreS2/S белков этого изолята показал наличие делеции 94-108 (PreSl/PreS2); W74Stop, G112R, V118A, G185R, L186P, S207R. Изолят 5 имеет две особенности в структуре изученных белков: во-первых, это наличие делеции, которая приводит к удалению матриксного участка PreSl — белка, тем самым по данным [35, 36] должна нарушаться сборка и секреция зрелых вирионов; во-вторых, это наличие стоп кодопа в 74 позиции S белка, который при трансляции с вирусной mRNA (S) должен приводить к прекращению дальнейшего синтеза HBsAg, но как мы видим, сыворотка крови позитивна на HBsAg. В ряде исследований [39, 45, 93] преждевременный стоп код он в S белке в позициях 61, 69, 94 был описан, в одних случаях, сыворотки крови, из которых выделены подобные изоляты были позитивны на HBsAg, в других нет. Одним из возможных объяснений может быть гетерогенность вирусной популяции — наличие квази-видов, которые компенсируют утраченную функцию и/или поврежденную структуру доминантной субпопуляции вируса.

Как было нами показано, изоляты ВГВ, выделенные у разных пациентов, гетерогенны между собой. Помимо этого, каждая вирусная популяция в пределах одного инфицированного организма обладает различной гетерогенностью, степень которой нарастает со временем в процессе хронической НВ-вирусной инфекции, что также было показано в работах Y.-F.Fan et al. (2000) [102] и T.Pollicino et al. (1995) [99]. По-видимому, несмотря на наличие доминирующей субпопуляции вируса, дефектной в структурном и/или функциональном отношении, жизнеспособность общей популяции поддерживается минорным компонентом, например диким типом вируса. Из этого следует, что для диагностических и терапевтическим мероприятий в отношении хронической НВ-вирусной инфекции необходимо изучать всю вирусную популяцию и ее динамику, что позволит объяснить появление атипичного серологического профиля и эффективно контролировать противовирусную терапию.

На примере двух изолятов ВГВ (5) и (К) ясно прослеживается противоречивый характер генетической вариабельности вируса, выражающийся в фенотипическом проявлении наличия или отсутствия HBsAg. Это лишний раз подчеркивает многофакторность проблемы «диагностического ускользания» НВ-вирусной инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Забелин, Никита Николаевич, Москва

1. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор, 3 выпуск. / Под редакцией проф. А.Б. Жебруна.// С-Петербург. 2000. - 256с.

2. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор, 5 выпуск./ Под редакцией проф. А.Б. Жебруна.// С-Петербург 2005. — 158с.

3. Вирусный гепатит В у детей первого года жизни в г.Вологде./ Т.Ю.Курганова, Н.И.Белавина, Г.Л.Макарова и соавт.// В кн.: «Вирусный гепатит В — диагностика, лечение и профилактика (к 40-летию открытия HbsAg)». Москва. - 2004. - с.89-90.

4. Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., Маринкин В.И. Основы математико-статистической обработки данных.// В кн. «Прикладная медицинская статистика». — Санкт-Петербург. 2003. - с. 169-245

5. Исаева О.В. Разработка системы внешней оценки качества лабораторных исследований при диагностике вирусных гепатитов В и С.// Автореф. дисс. канд. биол. наук. Москва. - 2003. - 24 с.

6. Итоги изучения и нерешенные вопросы эпидемиологии и профилактики парентеральных вирусных гепатитов в России./ И.В.Шахигильдян, Г.Г.Онищенко, П.А.Хухлович и соавт.// ЖМЭИ. 1994. - №5. - с.26-31.

7. Мукомолов С.Л., Валькова И.В., Чайка Н.В. Вирусные гепатиты.// Санкт-Петербург. — 1992. — 93 с.

8. Нетесова И.Г., Цой Л.В., Жуков В.А., Ярославцева О.А. Проблемы контроля качества неколичественных методов иммуноферментного анализа.// В кн.: «Вирусные гепатиты эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика». - Москва. - 2007. - с.49-50.

9. Основы ретроспективного анализа инфекционной заболеваемости./ Учебное пособие для врачей эпидемиологов под ред. В.В.Шкарина.// Н.Новгород. 2000. - 315 с.

10. Палтышев И.П., Филатов Н.Н. Изучение распределений показателей заболеваемости всего населения.// В кн.: «Содержание и методика проведения описательного эпидемиологического исследования»-Москва 2003.- с. 10-74.

11. Петрухина М.И., Старостина Н.В. Статистические методы в эпидемиологическом анализе.// Москва. 2003.-93 с.

12. Савилов Е.Д. Применение статистических методов в эпидемиологическом анализе. Москва. - 2004. — с.5-12.

13. Черкасский Б.Л. Эпидемиологический метод: лекция.// Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. 1999.

14. Черкасский Б.Л. Эпидемиологический надзор.// Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. — 2000. 24 с.

15. Шарара А., Хант С., Гамильтон Д. Гепатит С.// Международный журнал медицинской практики. 1997. - №2. - с.35-47.

16. Шаханина И. Л., Кучеровская Т.В., Чернова Т.П. Показания к применению различных статистических методов эпидемиологического анализаи ограничения при оценке динамики эпидемического процесса.// ЖМЭИ. — 1990. №4 - с.49-54.

17. Шаханина И.Л., Кучеровская Т.В., Чернова Т.П. Применение различных статистических методов эпидемиологического анализа при оценке сезонности и территориальной распространения инфекционных болезней.// ЖМЭИ. — 1990. -№5 -с.43-47.

18. Шаханина И.Л., Осипова Л.А., Болотовская Т.П. Инфекционная патология в России. Эпидемиологическая и экономическая значимость.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996. - №1. - с. 15-20.

19. Шаханина И.Л., Радуто О.И., Осипова Л.А., Приказчикова Г.С. Распространенность гепатита В среди населения федеральных округов Российской Федерации.// Эпидемиология и инфекционные болезни. 2003. -№5 - с.7-11.

20. Шаханина И. Л., Саравайская Л.И. Метод картографирования показателей заболеваемости при изучении географического распространения инфекционных болезней.// ЖМЭИ- 1970. №2 - с.140-141.

21. Шаханина И.Л., Чернова Т.П. Некоторые аспекты методологии эпидемиологического надзора.// В кн.: Эпидемиологический надзор за инфекционными болезнями». Москва. - 1987. - с.27-33.

22. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты: эпидемиология, диагностика, профилактика.// Москва. -2003.-383 с.

23. Шляхтенко Л.И. Системный подход к изучению эпидемического процесса гепатитов В и С.// Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2003.4(11)-с. 15-19.

24. Шляхтенко Л.И., Сулягина Л.Г. Эпидемиологический контроль хронических вирусных гепатитов В и С как социально-значимая проблема.// В кн.: «Вирусные гепатиты — проблемы диагностики, лечения и профилактики». -Москва. 2005. - с.395-397.

25. Эпидемиологическая оценка хронического носительства поверхностного антигена вируса гепатита В и других маркеров этой инфекции./ Л.И. Шляхтенко, С.А.Козлов, С.С.Першин и соавт.// ЖМЭИ. 1991. - №8 - с.46-49.

26. Alhababi F., Sallman Т.A., Tong C.Y.W. The significance of anti-HBc only in the clinical virology laboratory // J. Clin. Virol. — 2003. — v.27. p. 162-169.

27. Analysis of HBs antigen negative variant of hepatitis В virus: unique substitutions, Glu 129 to Asp and Gly 145 to Alain the surface antigen gene./ T.Koyanagi, M.Nakamuta, H.Sakai et al.// Med. Sci. Monit 2000. - v.6. - p.l 1651169.

28. Bartholomeusz A., Schaefer S. Hepatitis В virus genotypes: comparison of genotyping methods // Rev. Med. Virol. 2004. - v.14. - p.3-16.

29. Blanchet M., Sureau C. Infectivity determinants of the hepatitis В virus Pre-S domain are confined to the N-terminal 75 amino acid residues // J. Virol. 2007. -v.81. -p.5841-5849.

30. Brunetto M.R., Rodriguez U.A., Bonino F. Hepatitis В virus mutants // Intervirology. 1999. - v.42. - p.69-80.

31. Bruss V. A short linear sequence in the Pre-S domain of the large hepatitis В virus envelope protein required for virion formation // J. Virol. 1997. - v.71. -p.9350-9357.

32. Bruss V. Hepatitis В virus morphogenesis // World J. Gastroenterol. 2007. — v.13. -p.65-73.

33. Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis В virus // J. Viral. Hepat. 1997. - v.4. - p.l 1-20.

34. Carman W.F. Infections associated with medical intervention: hepatitis viruses and HGV // Br. Med. Bull. 1998. - v.54. - p.731-748.

35. Clade analysis and surface antigen polymorphism of hepatitis В vims American genotypes / M.Devesa, C.Rodriguez, G.Leon et al. // J. Med. Virol. — 2004. v.72.-p.377-384.

36. Characterization of unusual escape variants of hepatitis В virus isolated from a hepatitis В surface antigen-negative subject / S.Grethe, M.Monazahian, I.Bohme et al. / J. Virol. 1998. - v.12. - p.7692-7696.

37. Chu C-M., Yen C.-T., Liaw Y.-F. Low-level viremia and intracellular expression of hepatitis В surface antigen (HBsAg) in HBsAg carriers with concurrent hepatitis С vims infection // J.Clin.Microbiol—1998—v.36.-p.2084-86.

38. Cloning and expression of surface antigens from occult chronic hepatitis В vims infections and their recognition by commercial detection assays / D.Jeantet, I.Chemin, B.Mandrand et al. / J. Med. Virol. 2004. - v.73. - p.508-515.

39. Coleman P.F., Jack Chen Y.-C., Mushahwar I.K. Immunoassay detection of hepatitis В surface antigen mutants // J. Med. Virol. 1999. - v.59. - p. 19-24.

40. Complete genome sequence and phylogenetic analysis of hepatitis В vims isolated from Turkish patients with chronic HBV infection / G.Bozdayi, A.R. Turkyilmaz, R.Idilman et al. // J. Med. Virol. 2005. - v.76. - p.476-481.

41. Correlation between anti-HBc titers and HBV DNA in blood units without detectable HBsAg / H.Okamoto, H.Iizuka, K.Ohmura, et al. / Vox. Sang. 1992. -v.63. - p.107-111.

42. Deficiency in virion secretion and decreased stability of the hepatitis В virus immune escape mutant G145R / T.Kalinina, A.Iwanski, H.Will et al. / Hepatology. 2003. - v.38. - p. 1274-1281.

43. Distribution of HBV genotypes, subgenotypes and HBsAg subtypes among chronically infected patients in Serbia / I.Lazarevic, M.Cupic, D.Delic, et al.// Arch. Virol. 2007. - v. 152. - p.2017-2025.

44. The dominant hepatitis В virus genotype identified in Tibet is a C/D hybrid / C.Cui, J.Shi, L.Hui et al.// J. Gen. Virol. 2002. - v.83. - p.2773-2777.

45. Echevarria J.M., Avellon A. Hepatitis В virus genetic diversity // J. Med. Virol. 2006. - v.78. - S36-S42

46. Effect of variation in the common "a" determinant on the antigenicity of hepatitis В surface antigen / S.Seddigh-Tonekaboni, J.A.Waters, S.Jeffers et al. / J. Med. Virol. 2000. - v.60. - p.l 13-121.

47. Emergence of vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus with multiple surface gene mutations in a Korean Child / K.M.Lee, Y.S.Kim, Y.Y.Ko et al. / J. Korean Med. Sci. 2001. - v. 16. -p.359-362.

48. Evaluation of sensitivity for wild type and mutant forms of hepatitis В surface antigen by four commercial HBsAg assays / B.Moerman,V. Moons, H.Sommer et al. / Clin. Lab. 2004. - v.50. - p. 159-162.

49. Evaluation of two new automated assays for hepatitis В virus antigen (HbsAg) detection: IMMULATE HbsAg and IMMULATE 2000 HbsAg / B.Weber, T.Dengler, A.Berger et al. / J. Clin. Microbiol. 2003. - v.41. - p. 13 5-143.

50. Ganem D., Prince A.M. Hepatitis В virus infection natural history and clinical consequences // N.Engl. J. Med. - 2004. - v.350. - p.l 118-1129.

51. Genetic diversity of hepatitis В virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotypes, and HBsAg subtypes / H.Norder, A.M.Courouce, P.Coursaget et al. // Intervirology. 2004. - v.47. - p.289-309.

52. Genetic relatedness of hepatitis В viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen / H.Norder, B.Hammas, S.-D.Lee et al. // J. General Virol. 1993. - v.74. -p.1341-1348.

53. Genomic variability in the PreSl region and determination routes of transmission of hepatitis В virus / A.Uy, G.Wunderlich, D.B.Olsen et al. // J. General Virol. 1992. - v.73. - p.3005-3009.

54. Glebe D., Urban S. Viral and cellular determinants involved in hepadnaviral entry // World J. Gastroenterol. 2007. - v. 13. - p.22-38.

55. HBsAg as the antigen component of circulating immune complexes in HIV-infected patients / M.Stanojevic, S.Zerjav, D.JJevtovic et al. // Biomed & Pharmacother. 2000. - v.54. - p. 163-167.

56. Hepatitis В virus genotype D strains from Estonia share sequence similarity with strains from Serbia and may specify ayw4 / T.Tallo, H.Norder, V.Tefanova et al. // J. Med. Virol. 2004. - v.74. - p.221-227.

57. Hepatitis В virus genotype E surface antigen detection with different immunoassays and diagnostic impact of mutations in the preS/S gene / C.M.Olinger, B.Weber, J.A.Otegbayo et al. // Med. Microbiol. Immunol. 2007. -v.196. - p.247-252.

58. Hepatitis В virus markers in anti-HBc only positive individuals / B.Weber, W.Melchior, R.Gehrke et al. // J. Med. Virol. 2001. - v.64. - p.312-319.

59. Hepatitis В virus S mutants in liver transplant recipients who were reinfected despite hepatitis В immune globulin prophylaxis // M.G.Ghany, B.Ayola, F.G.Villamil et al. Hepatology. 1998. - v.27. - p.213-222.

60. Hepatitis В virus is sensitive to changes in the cytosolic S loop of the envelope proteins / H.Loffler-Mary, J.Dumortier, C.Klentsch-Zimmer et al. // J. Virol. -2000. — v.270. — p.358-367.

61. Hepatitis В virus with antigenically altered hepatitis В surface antigen is selected by high-dose hepatitis В immune globulin after liver transplantation / U.Protzer-Knolle, U.Naumann, R.Bartenschlager et al. // Hepatology. 1998. — v.27. - p.254-263.

62. High level of genetic heterogeneity in S and P genes of genotype D hepatitis В vims / C.Maddalena, C.Giambelli, E.Tanzi et al. // J. Virol. 2007. - v.365. -p.113-124.

63. Identification and chemical synthesis of a host cell receptor binding site on hepatitis В virus / A.R.Neurath, S.B.Kent, N.Strick et al. // Cell. 1986. - v.6. -p.429-436.

64. Identification of hepatitis В surface antigen variants with alterations outside the "a" determinant in immunized Singapore infants / C.J.Oon, C.W.Ning, K.Shiuan et al. // J. Infect. Dis. 1999. - v. 179. - p.259-263.

65. Identification of a novel surface mutant of hepatitis В virus in a seronegative chronic liver disease patient / K.Banerjee, R.C.Guptan, R.Bisht et al. // Virus Res. -1999. v.65. - p.103-109.

66. Improved detection of hepatitis В virus surface antigen by a new rapid automated assay / B.Weber, A.Bayer, P.Kirch et al. // J. Clin. Microbiol. 1999. -v.37. — p.2639-2647.

67. Infectious hepatitis В virus variant defective in pre-S2 protein expression in a chronic carrier / D.Fernholz, P.R.Galle, M.Stemler, et al. // J. Virol. 1993. -v.194. - p.137-148.

68. Intra-familial evidence of horizontal transmission of hepatitis В vims surface antigen mutant G145R / C.J.Oon, W.N.Chen, K.S.Goo et al. // J. Infect. 2000. -v.41. - p.260-264.

69. Is a function of the secreted hepatitis В e antigen to induce immunologic tolerance in utero? / D.R.Milich, J.E.Jones, J.L.Hughes et al. // Proc. Acad. Sci. USA. 1990. - v.87. - p.6599-6603.

70. Karayiannis P. Hepatitis В virus: old, new and future approaches to antiviral treatment // J. Antimicrob. Chemother. 2003. - v.51. - p.761-785.

71. Kato H., Orito E., Gish R.G. Characteristics of hepatitis В virus isolates of genotype G and their phylogenetic differences from the other six genotypes (A through F) // J. Virol. 2002. - v.76. - p.6131-6137.

72. Kidd-Ljunggren K., Miyakawa Y., Kidd A.H. Genetic variability in hepatitis В viruses//J. Gen. Virol. 2002. - v.83. - p. 1267-1280.

73. Klingmuller U., Schaller H. Hepadnavirus infection requires interaction between the viral pre-S domain and a specific hepatocellular receptor // J. Virol. 1993. - v.67. - p.7414-7422.

74. Kramvis A., Kew M., Francois G. Hepatitis В virus genotypes // Vaccine. 2005. - v.23. — p.2409-2423.

75. Leistner C.M., Gruen-Bernhard S., Glebe D. Role of glycosaminoglycans for binding and infection of hepatitis В virus // Cellular Microbiol. — 2008. — v. 10. -p.122-133.

76. Mangold C.T.M., Streeck R.E. Mutational analysis of the cysteine residues in the hepatitis В virus small envelope protein // J. Virol. 1993. - v.73. - p.2052-2057.

77. Melegari M., Scaglioni P.P., Wands J.R. The small envelope protein required for secretion of a naturally occurring hepatitis В virus mutant with Pre-S 1 deleted // J. Virol. 1997. - v.71. - p.5449-5454.

78. Modulation of hepatitis В virus secretion by naturally occurring mutations in the S gene / N.Khan, M.Guarnieri, S.H.Ahn et al. // J. Virol. 2004. - v.78. - p.3262-3270.

79. Molecular epidemiology of hepatitis В virus vaccine variants in Singapore / C.J.Oon, G.K.Lim, Z.Ye et al. / Vaccine. 1995. - v. 13. - p.699-702.

80. Molecular evolution of hepatitis В virus over 25 years / C.Osiowy, E.Giles, Y.Tanaka et al. // J. Virol. -2006. -v.80. p. 10307-10314.

81. Molla N., Kew M., Arbuthnot P. Regulatory elements of hepatitis В virus transcription // J. Viral. Hepatitis. 2002. - v.9. - p.323-331.

82. Mutant hepatitis В viruses: a matter of academic interest only or a problem with far-reaching implications? / G.Francois, M.Kew, P.Van Damme et al. // Vaccine. — 2001. v.19. -p.3799-3815.

83. Nassal M. Hepatitis В virus replication: novel roles for virus-host interaction // Intervirology. 1999. - v.42. - p. 100-116.

84. Natural history of hepatitis В surface antigen mutants in children / C.J.Oon, K.-L.Tan, T.Harrison et al. //Lancet. 1996. - v.348. - p. 1524.

85. A new genotype of hepatitis В virus: complete genome and phylogenetic relatedness / L.Stuyver, S.De Gendt, C.Van Geyt et al. // J. Gen. Virol. 2000. -v.81. -p.67-74.

86. A new intertype recombinant between genotypes С and D of hepatitis В virus identified in China / Z.Wang, Z.Liu, G.Zeng et al. / J. Gen. Virol. 2005. - v.86. -p.985-990.

87. A novel stop codon mutation in HBsAg gene identified in a hepatitis В strain associated with cryptogenic cirrhosis / Xu Yang, Xiao-Peng Tang, Jian-Hua Lei et al. // World J. Gastroenterol. 2003. - v.9. - p.l516-1520.

88. Occult hepatitis В virus infection in chronic liver disease: full-length genome and analysis of mutant surface promoter / V.Chaudhuri, R.Tayal, B.Nayak et al. / Gastroenterology. 2004. - v. 127. - p. 1356-1371.

89. Occult hepatitis В virus infection in patients with chronic hepatitis С liver disease / I.Cacciola, T.Pollicino, G.Squadrito et al. // The New England J. of Medicine. -1999. v.341. — p.22-26.

90. Paran N., Geiger В., Shaul Y. HBV infection of cell culture: evidence for multivalent and cooperative attachment // EMBO J. 2001. - v.20. - p.4443-4453.

91. Patterns of circulating hepatitis В surface antigen variants among vaccinated children born to hepatitis В surface antigen carrier and non-carrier mothers / M.-S.Ho, Y.-C.Mau, C.-F.Lu et al. / J. Biomed. Sci. 1998. - v.5. -p.355-362.

92. Pawlotsky J.-M. The concept of hepatitis В virus mutant escape // J. Clin. Virol. — 2005. v.34. - S125-S129.

93. Point mutation in the S gene of hepatitis В virus for a d/y or w/r subtypic change in two blood donors carrying a surface antigen of compound subtype adyr or adwr / H.Okamoto, M.Imai, F.Tsuda et al. / J. Virol. 1987. - v.61. - p.3030-3034.

94. Pollicino Т., Campo S., Raimondo G. PreS and core gene heterogeneity in hepatitis В virus (HBV) genomes isolated from patients with long-lasting HBV chronic infection // J. Virol. 1995. - v.208. - p.672-677.

95. Presence of hepatitis В surface antigen mutant G145R DNA in the peripheral blood leukocytes of the family members of its horizontal transmission / R.Chakravarty, M.Neogi, S.Roychowdhury et al. // Virus Res. 2000. - v.90. -p.133-141.

96. Prevalence and significance of hepatitis В virus (HBV) Pre-S mutants in serum and liver at different replicative stages of chronic HBV infection / Y.-F.Fan, C.C.Lu, W.C.Chen et al. // J. Hepatol. 2000. - v.33. - p.277-286.

97. Prevalence of naturally occurring surface gene variants of hepatitis В virus nonimmunized surface antigen — negative Chinese carriers / J.Hou, Z.Wang, J.Cheng et al. // J. Hepatol. 2001. - v.34. - p.l027-1034.

98. The prevalence of surface antigen variants of hepatitis В virus in Papua New Guinea, South Africa, and Sardinia / W.F.Carman, F.J.Deursen, L.T.Mimms et al.// J. Hepatol. 1997. - v.26. - p.1658-1666.

99. Prevalence vaccine-induced escape mutants of hepatitis В virus in the adult population in China: a prospective study in 176 restaurant employees / C.He, F.Nomura, S.Itoga et al. // J. Gastroenterol and Hepatol. 2001. - v. 16. - p. 13731377.

100. Pumpens P., Grens E., Nassal M. Molecular epidemiology and immunology of hepatitis В virus infection an update // Intervirology. - 2002. - v.45. - p.218-232.

101. Reactivity of 13 in vitro expressed hepatitis В surface antigen variants in 7 commercial diagnostic assays / J.H.Ireland, B.O'Donnell, A.A.Basuni et al. // J. Hepatol. 2000. - v.31. - p. 1176-1182.

102. Role of surface promoter mutations in hepatitis В surface antigen production and secretion in occult hepatitis В virus infection / S.Sengupta, S.Rehman, H.Durgapal et al. // J. Med. Virol. 2007. - v.19. - p.220-228.

103. The secreted hepatitis В precore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid: a mechanism for persistence / D.R.Milich, M.K.Chen, J.L.Hughes et al. // J. Immunol. 1998.-v. 160.-p.2013-2021.

104. Schaefer S. Hepatitis В virus: significance of genotypes // J. Viral. Hepat. -2005. - v.l2.-p.lll-124.

105. Schaefer S. Hepatitis В virus genotypes in Europe // Hepatol. Res. 2007. v.37. - S20-S26.

106. Seeger C., Mason W.S. Hepatitis В virus biology // Microbiol. Mol. Biol. Rev.-2000.-v.64.-p.51-68.

107. Structural and functional heterogeneity of naturally occurring hepatitis В virus variants / M.R.Burda, S.Gunter, M.Dandri et al. // Antiviral Res. 2001. - v.52. -p.125-138.

108. Suppression of hepatitis В virus expression and replication by hepatitis С virus core protein in HuTI-7 cells / C.-M.Shih, J.S.Lo, T.Miyamura et al. // J. Virol. 1993. - v.67. - p.5823-5832.

109. Survey of hepatitis В surface variant infection in children 15 years after a nationwide vaccination programme in Taiwan / H.Y.Hsu, M.H.Chang, Y.H.Ni et al. // Gut. 2004. - v.53. - p.1499-1503.

110. Transmission of G145R mutant of ITBV to an unrelated contact / V.Thakur, S.N.Kazim, B.C.Guptan et al. // J. Med. Virol. 2005. - v.76. - p.40-46.

111. Unusual hepatitis В surface antigen variation in a child immunized against hepatitis В / L.Roznovsky, T.J.Harrison, Z.-L.Fang et al. // J. Med. Virol. 2000. -v.61. -p.l 1-14.

112. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus / W.F.Carman, A.R.Zanetti, P.Karayiannis et al. // Lancet. 1990. - v.336. - p.325-329.

113. Variability of the PreSl/PreS2/S regions of hepatitis В virus in Hungary / K.N.Szomor, A.Dencs, G.Toth et al. // Arch. Virol. 2007. - v. 152. - p.697-704.

114. Virus taxonomy / C.M.Fanquet, M.A.Mayo, J.Maniloff et al. // Elsevier Academic Press. 2005. - p.373-383.

115. Weber B. Diagnostic impact of the genetic variability of the hepatitis В virus surface antigen gene // J. Med. Virol. 2006. - v.78. - S59-65.

116. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis В virus: clinical and diagnostic impact // J. Clin. Virol. 2005. - v.32. - p. 102-112.

117. Weber B. The isolated anti-HBc reactivity: New developments // J. Lab. Med.- 2002.-v.26.-p.451-458.

118. Weber B. Recent developments in the diagnosis and monitoring of HBV infection and role of the genetic variability of the S gene // Expert. Rev. Mol. Diagn.- 2005. v.5. - p.75-91.

119. Yokosuka O., Arai M. Molecular biology of hepatitis В virus: effect of nucleotide substitutions on the clinical features of chronic hepatitis В // Med. Mol. Morphol. 2006. - v.39. - p.l 13-120.

Информация о работе

Забелин, Никита Николаевич
кандидата медицинских наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Генетическая вариабельность вируса гепатита В по PreS1/PreS2/S генам у пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы