Гибридные белки программируемой иммуноспецифичности

Смирнов, Валерий Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гибридные белки программируемой иммуноспецифичности
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гибридные белки программируемой иммуноспецифичности"

РГВ ОД

1 П *' ''' V, ' ■

Российская Академия Медицинских Наук Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского

На правах рукописи УДК 547. 963. 32.07: 577.217. 3

СМИРНОВ Валерий Дмитриевич

ГИБРИДНЫЕ БЕЛКИ ПРОГРАШИРУЕМОЯ ШШУНОСЖЦИФИЧНОСТИ

03. 00. 03. - Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

МОСКВА 1993.

Работа выполнена в лаборатории химии вирусных нуклеиновых кислот и белков НИИ вирусологии им Д. И. Ивановского РАМН

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор В. В. Мэсянжинов

доктор химических наук К1 Ф. Дрыгин

доктор медицинских наук, профессор В. А. Ананьев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Кафедра вирусологии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова.

Завдта состоится "Х" 1993 г. в часов

на заседании Специализированного Совета Д 001.20.01 при институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМЕ

Автореферат разослан апреля 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат медицинских наук

А. М. Жуковский

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Распространение генноинженерных методов на получение направленно модифицированных белков дает в руки исследователей мощный инструмент изучения структурно-функциональных отношений этого класса соединений и открывает перспективу конструирования белков с программируемыми свойствами как для исследовательских целей, так и для решения задач практической медицины. Все большее распространение получают диагностические и вакцинные субъединичные препараты на основе рекомбинантных генноинженерных белков. Использование методов биоорганической химии расширяет возможности направленного конструирования белков с заданными физико-химическими и иммунологическими свойствами, открывая, в частности, перспективу создания комплексных мульти-функциональных иммуногенов, сочетающих в своем составе наборы различных антигенных детерминант. Первые препараты такого плана, представляющие собой сочетания синтетических пептидов, соответствующих антигенным детерминантам, конъюгированных с различными носителями, уже исследуются в-ряде лабораторий. Нам представляется более перспективным другой подход, основанный на использовании белковых химер с иммуноспецифичностью, заданной введением в определенные положения белковой молекулы чужеродных антигенных детерминант. В свою очередь, развитие этого подхода требует разработки как методов конструирования таких гибридов, так и обеспечения их эффективной экспрессии (в частности, в прокариотах).

Цель и задачи исследования. Целью исследования является разработка методов направленного конструирования гибридных белков программируемой иммуноспецифичности, содержащих короткие участки иммунодоминантных эпитопов, обеспечивающие специфическую антигенность и/или иммуногенность. Такие гибридные белки в перспективе могут быть использованы для диагностики и иммунопрофилактики вирусных заболеваний. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

-Выявить иммунодоминантные участки вирусных белков для включения в состав комплексных иммуногенов;

-Подобрать белки-носители, обеспечивающих как экспонирование введенного участка, так и возможность сочетанного проявления иммуногенных свойств;

-Разработать удобные методы получения синтетических олиго-нуклеотидов, кодирующих иммунодоминантные эпитопы вирусных бел-

- г -

ков, и способы введения этих олигонуклеотидов в экспрессирующие конструкции;

-Сконструировать системы экспрессии гибридных белков с заданной иммуноспецифичностыо;

-Исследовать физико-химические и иммунологические свойства гибридных белков, оценить перспективность полученных соединений как диагностических и иммунопрофилактических препаратов.

Научная новизна работы.

-В работе впервые предложено конструирование гибридных белков направленной иммуноспецифичности, задаваемой введением в ген белка синтетических олигонуклеотидов, кодирующих иммунодоминант-ные участки чужеродных вирусных белков.

-Разработаны методы получения и введения в состав экспрес-сирущего вектора как мономерных, так и олигомерных полинуклео-тидных дуплексов, кодирующих антигенные детерминанты ряда белков вирусов гепатита В и ЕИЧ-1.

-Осуществлено конструирование нескольких серий плазмид, детерминирующих синтез в прокариотических системах гибридных белков с чужеродными антигенными детерминантами.

-Показано, что в полученных гибридных белках введенные антигенные детерминанты располагаются на поверхности частиц, формируемых этими белками, и конформация введенных участков обеспечивает возможность их взаимодействия с соответствующими антителами. Иммунизация животных белками на основе НВсАд, содержащими фрагменты ргеЗ-области НВУ, вызывает продукцию антител как к НВсАд, так и к детерминантам ргеБ.

Практическая ценность работы.

-В ходе работы выявлены иммунологически активные участки рге31- области поверхностного белка ИВУ и НБАд НОУ,что делает возможным создание диагностических препаратов на основе соответствующих синтетических пептидов или гибридных белков, содержащих эти участки.

-Показано, что гибридный белок, кодируемый плазмидой рЕХИЗ, обеспечивает эффективное выявление ВИЧ-положительных сывороток и может быть использован как компонент тест-системы на ВИЧ-1. Использование гибридов . -галактозидазы с эпитопами различных белков ВИЧ позволяет исследовать представительство антител на от-

дельные антигенные детерминанты вируса в сыворотках инфицированных

-Получение капсидоподобных частиц на основе НВсАд с экспонированными антигенными детерминантами ргеБ-облаети или белков ВИЧ открывает перспективу разработки нового поколения иммунопро-филактических средств направленной специфичности.

Основные положения, выносгзлге на защиту.

1. Один из иммунодоминантных участков ргеБ1- области вируса гепатита В локализован между 31 и 35-м аминокислотными остатками белка

2. Область 65-80-й аминокислот белка НБАд содержит иммунодо-минантный эпитоп этого белка.

3. Модификация Н-фосфонатного метода химического синтеза оли-годезоксирибонуклеотидов на носителе, заключающаяся, в использовании пластиковых колонок и минимизации объема реакционной смеси, снижающей расход реактивов, позволяет эффективно проводить синтез олигонуклеотидов с длиной цепи до 55 звеньев в неавтоматизированном режиме.

4. Использование полученных химическим и химико-энзиматичес-ким синтезом олигонуклеотидов, кодирующих антигенные детерминанты вирусных белков, позволяет направленно вводить чужеродные антигенные детерминанты (в виде мономеров или олигомеров) в заданные положения белков-носителей, обеспечивая получение гибридов с заданными антигенными свойствами. Такие гибриды могут быть использованы для дифференциальной диагностики серологических маркеров вирусной инфекции.

5. Гибридные белки на основе НВсАг с введенными в их состав детерминантами других белков могут вызывать образование у лабораторных животных антител как против детерминант носителя, так и против введенных иммунодоминантных участков, что позволяет рассматривать такие белки как потенциально применимые для разработки комплексных мультивалентных иммуногенов, сочетающих в своем составе В- и Т-эпитопы различных белков.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии", Пу-щино-на-Оке, октябрь 1986 г.; Международной конференции "фундаментальные и прикладные вопросы СПИД, вирусных гепатитов и грип-

па", Суздаль, 25-30 сентября 1988г.; IX Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений. Рига, 15-18 мая 1990 г.; Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов, Юрмала, 10-12 апреля 1990 г.; Международном симпозиуме "Вирусные гепатиты" Ростов, 3-8 сент. 1990 г.; I и II Всесоюзных планово-отчетных конференциях "Генная и клеточная инженерия", ноябрь 1990, декабрь 1991 г., Пущино-на-Оке; I Съезде иммунологов России. Новосибирск, 23-25 июня 1992 г.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Два фактора - исследование на молекулярном уровне механизма иммунной защиты организма от вирусной инфекции и стремление к минимизации структур, обеспечивающих эту защиту, - предопределили развитие нового подхода к созданию диагностических и вакцинных препаратов. Основу его составляет химический синтез пептидов, содержащих непрерывные (последовательные, секвенциальные) протективные антигенные детерминанты белковых оболочек вирусов. В последнее десятилетие синтезированы пептиды (от 6 до 40 аминокислотных остатков) из состава различных белков вирусов гриппа, ящура, полиовируса, гепатитов А, В, С, Д, БИЧ-1 и др. Часть из этих пептидов (в свободном виде или в форме конъюгатов с белкам*, -носителями) оказалась применимой для диагностики вирусных инфекций, но еще более важно, что некоторые пептиды проявили высокую иммуногенность, что позволило использовать их как компоненты вакцинных препаратов, например, в борьбе с ящуром. Особенно привлекательной кажется возможность создания таким путем полиантигенных вакцин, содержащих несколько пептидных группировок, каждая из которых обладает свойствами протективной антигенной детерминанты соответствующего возбудителя.

С нашей точки зрения, существенным ограничением в развитии этого подхода является невозможность однозначно задавать определенные точки связывания пептида с носителем, регулируя окружение антигенной детерминанты, и обеспечивать высокую насыщенность носителя гаптенными группировками. Эти недостатки могут быть преодолены включением пептидных антигенных детерминант в состав гибридного белка путем введения в его ген полинуклеотида, кодирующего эти детерминанты. При таком подходе может быть обес-

гечена насыщенность химерного белка различными антигенными детерминантами, многократная их повторяемость в структуре, возмож-юсть встраивать синтезируемый пептид в заранее определенные участки различных белков, регулируя таким образом стерическую ?оступность и конформацию этого пептида, т.е. те факторы, кото-зые, безусловно, влияют на его иммунологические свойства. Кроме того появляется возможность использовать сочетанное воздействие различных эпитопов и их комбинаций . Для получения кодирующих юлинуклеотидов могут быть использованы как выделение выбранных участков из нативной ДНК генноинженерными методами, так и химико -ферментативный синтез; последний предпочтительнее, если задачей является не просто синтез элементов нативной структуры, а получение ее аналогов, имитация или направленная модификация этой структуры.

Первые шаги для реализации этого похода были предприняты *ами в начале 80-х годов. В 1983 г. мы опубликовали работу по (имико-ферментативному синтезу полинуклеотида, кодирующего фрагмент HBsAg, введению его в ген CAT Е.coli и получению в бескле-гочной системе транскрипции-трансляции гибридного белка, проявляющего антигенные свойства фрагмента белка поверхностного антигена вируса гепатита В [В. Д. Смирнов и др., 1983]. Эта работа явилась приоритетной в области конструирования гибридных белков з использованием синтетических олигонуклеотидов, кодирующих заданные участки вирусных белков. Развивая этот подход, мы предприняли работы как по выявлению иммунологически активных участков зирусных белков, так и по разработке методов получения рекомби-яантных ДНК, их экспрессии и исследованию свойств полученных ^ибридов.

1. Выявление имиукодомикантных районов вирусных белков.

В работе широко использован компьютерный анализ вирусных 5елков по программам гидропатичности СГ. Р. Норр, К. R. Woods, 1981; J.Kyte, R.F.Doolittle, 1982], подвижности фрагментов [Р. А. Каг-plus, G. Е. Schulze, 1985], предсказания В-антигенности [G. W. Wei-Ling et al., 1985] и вероятностного расчета вторичной структуры :о. В. Ptitsyn, А. V. Finkeiste in, 1983]. При исследовании потенциально антигенного участка расчет проводился как для целого бел-

- 6 -

ка, так и для отдельных его фрагментов.

Так, при выявлении антигенно активных участков белков ргео-области НВУ (субтип ауч), являющихся наиболее ранними серологическими маркерами инфекции, на основании теоретического анализ? мы предположили наличие антигенной активности в участке 24-41 рге51, обладающем гидрофильным характером и содержащем фрагмент с альфа-спиралью и несколько зон с характерными признаками бета-поворотов:

25 30 35

РЬе-РЬе-Рго-Азр-Н13-61п-Ьеи-Азр-Рго-А1а-РЬе-Агд-А1а-Азп-

40 ------------

Т1тг-А1а-Азп-Рго

Рис. 1. Элементы вторичной структуры пептида 24-41 preSl HBV — область высокой вероятности наличия альфа-спирали

---- область высокой вероятности бета-поворота (расчет

выполнен Е. И. Прокуроновой, МИТХГ).

Химически синтезированный пептид 24-41 в виде конъюгата с бычьим сывороточным альбумином С все синтезы выполнены группой Ю. А. Семилетова в нашей лаборатории и сотрудниками лаборатории акад. РАМН Р. П. Евстигнеевой в МИТХТ) был использован для иммунизации лабораторных животных, вызывавшей индукцию специфических антипептидных антител. Как свободный пептид, так и его конъюгат с BSA взаимодействовали с моноклональными антителами (МКА) 18/7 к preS области, полученными в лаборатории д-ра В. Герлиха [К.-H.Heermann et al., 1984], что позволяет сделать вывод об участии аминокислотной последовательности 24-41 в организации антигенной детерминанты preSl-области. Этот вывод подтверждается анализом взаимодействия конъюгата (полученного с применением глутарового альдегида) пептида 24-41 с сыворотками крови больных гепатитом В с HBs-антигенемией (3-14 день желтушного периода). Е 30 случаях из 42 получен позитивный результат, причем в некоторых анализах превышение сигнала над фоном (р/п) составляло более 30.

Бри общей упорядоченности вторичной структуры исследуемого

гптида его фрагмент, соответствующей участку 30-36 preSl (альфа :пираль), представляется наиболее интересным её элементом. Исс-эдование в твердофазном ИФА конъюгата с BSA пептида 30-36 пока-ало, что он взаимодействует с теш же сыворотками пациентов с иагнозом гепатита В, с которыми реагирует пептид 24-41, а также моноклональными антителами 18/ 7. Дальнейшая минимизация анти-гнно активного участка с использованием метода пептидного ска-ирования CH. M.Geysen et al., 1984, 1985; КХ А. Семилетов и др., 387], позволила провести прямое сопоставление антигенной актив-эсти синтетических гексапептидов в реакции с ЫКА к preSl-облас-и.

Рис. 2. Результаты ИФА пептидов участка 25-41 preSl-области с использованием моноклональных антител 18/7.

41 А 405

25-30

26-31

27-32

28-33

29-34

30-35

31-36

32-37

33-38

34-39

35-40

36-41

FFPDHQLDPAFRANTANP F Р D H Q L PDHQLD D H Q L D P H Q L D P A Q L D P A F L D P A F R D P A F R A P A F R A N A F R A N T F R A N T A R A N T A N A N T A N P

0.005 0.031 0.008 0. 022 0. 041 0. 065 0.166 0.103 0. 041 0.010 0.000 0.023

Этот результат позволяет локализовать одну из секвенциаль-ых антигенных детерминант ргеБ1 области поверхностного белка ЗУ на участке 31-36 аминокислот.

Аналогичное исследование было предпринято для выявления им-мунодоминантных эпитопов нуклеокапеидного белка вируса гепатита дельта (HDAg), являющегося единственным специфическим белком этого вируса. К моменту начала этой работы были опубликованы противоречивые сообщения относительно иммунодоминантных участков HDAg. Так, Вэнгом [J. 6. Vang et al., 1990], исследовавшим антигенную структуру HDAg, базируясь на данных о первичной структуре РНК HDV, полученных Макино [S. M. F. Makino et al., 1987], была обнаружена высокая антигенная активность участков аминокислотной последовательности 156-184 и 197-211, тогда как Бергман [К. F. Bergmann, 1989], используя данные о первичной структуре РНК, полученные в лаборатории Хогтона [К.S.Wang, 1986], наиболее антигенным считала район 52-й -93-й аминокислот. При этом незначительные отличия в первичной структуре HDAg указанных изолятов не позволяют отнести на их счет такое расхождение. Мы предприняли детальное обследование каждой из указанных иммунодоминантных областей с использованием широкого спектра синтетических пептидов различной длины (уместно отметить, что для сохранения анти-генно активной конформации во многих случаях необходим достаточно протяженный участок пептидной цепи, поэтому мы использовали пептиды, содержаще от 10 до 16 аминокислотных остатков).

Проведенный теоретический анализ структуры HDAg показывает, что белок высокогидрофилен и большинство участков, соответствующих бета-поворотам, обычно сопряженных с положением В-эпитопов, расположено в С-концевой части. При выборе участков для исследования мы ориентировались на зоны с повышенной акрофильностью, содержащие бета-повороты, наличие которых предсказывалось не только для целого белка, но и для отдельных пептидных фрагментов Необходимо, однако, принимать во внимание, что в нуклеокапсидном белке ряд участков вовлечен во взаимодействие с геномной РНК, что может существенно ограничивать применимость, используемых расчетов для определения его реальной конформации.

На основании проведенных расчетов были Еыбраны и синтезированы пептиды, соответствующие следующим участкам HDAg:

Таблица 1. Синтетические пептиды из состава HDAg*

Пептид А.-к. послед. Источник дан-

в составе HDAg ных о перв. стр.

SESRKNRGGREE 4- -15 [ К. S. Wang, 1986]

GGREEILEQWAG 11- •23 1»

KIKKLEEDNP 40- -49 [S. M. F. Maki по, 1987]

KDKDGEGAPPA 61- ■71 _ II _

GEGAPPAKRARTDQME 65- ■80 CK. S. Vang, 19861

DAGPRKRPLGGF 82- ■94 [S. M. F. Maki no, 1987]

NPLEGGSRGAPGGGF 153- •167 l»

PSNQGVPESRF 169- ■179 II

TGEGLDIRGSQGFP 182- -195 • Il

PADPPFSPQSC 201- -211 *l

* Пептиды синтезированы в группе Ю. А. Семилетова сотрудниками нашей лаборатории и сотрудником МИТХГ им. M. Е Ломоносова Е. И. Прокуроновой Все синтезированные пептиды - в свободном виде и в форме конъюгатов с BSA - были исследованы в прямом и непрямом вариантах иммуноферментного анализа как с индивидуальными препаратами сывороток крови пациентов, содержащими анти-HD -антитела (титры по ELISA не ниже 1:100 ООО), так и с различными пулами, состоящими из 8-10 анти-НБ-позитивных сывороток крови пациентов с хроническим гепатитом дельта:

Таблица 2. Взаимодействие пептидов из состава HDAg с антипептидными сыворотками кролика и сыворотками пациентов с хроническим гепатитом дельта в твердофазном ИФА.

Антиген Антипепт. Пул 1 Пул 2 Пул 3 Пул 4 антитела

4-15 +++

11-23 nd

40-49 +++

61-71 +•++

65-80 +++

82-94 ++

nd - nd

+++ +++ +++ +++ nd - - -

Таблица 2 (продолжение)

153-167 +++ -

169-179 +++ ++ + - -

182-195 nd - - - nd

201-211 +++ -Поэигивн.

контроль nd +++ ++ +++ +++

Минимальное превышение положительного сигнала над фоном -2,1.

+ соответствует превышению 2,1-3,5

++ —»— 3,5-5,0

+++ —»-.. > 5>0

Позитивный контроль - HDAg из ткани печени пациента с диагнозом гепатит Д

Как следует из данных табл. 2, выраженная положительная реакция (S/N >5) была отмечена только в опытах с пептидом 65-80; положительная - с пептидом 169-179 (в отдельных опытах с индивидуальными сыворотками этот пептид давал выраженную положительную реакцию), что коррелирует с результатами Вэнга. В целом же высокая антигенная активность пептида 65-80 в реакции с различными пулами сывороток позволяет утверждать, что один из антигенно активных районов HDAg располагается между 65-м и 80-м аминокислотными остатками. Пептид 65-80 был успешно использован в клиническом определении анти-HD-антител. В дальнейшем мы показали, что удаление 4-6 N-концевых аминокислотных остатков снижает эффективность взаимодействия пептида с антителами на 20-40 % при сохранении способности к взаимодействию со всеми исследованными сыворотками, что, однако, не позволяет утверждать, что удаленные аминокислоты не являются составной частью антигенной детерминанты. Локализация секвенциальных антигенных детерминант вирусных белков с помощью исследования антигенных свойств синтетических пептидов - прием, широко распространенный в современной вирусологии. В случае HDV, однако, серьезные трудности вызываются гетерогенностью популяции вируса и набора антител в сыворотках отдельных пациентов. Эти обстоятельства могут служить объяснением заметных расхождений в результатах исследования антигенной, активности синтетических пептидов, получаемых в разных лаборатори-

ях. Как уже указывалось, проведенное исследование основывалось на данных о первичной структуре участка РНК HDV,кодирующего район 60-й -80-й аминокислот, опубликованных Вэнгом и Салданой [Saldanha, 1990]. Изолят вируса, исследованный Макино, содержал на этом участке последовательности три аминокислотных замены в положениях 73, 74 и 76 :

65 70 75 80

GEGAPPAKRARTDQME [K.S. Wang, 1986]

GEGAPPAKKLRMDQME С S. M. F. Makino, 1987]

Мы осуществили синтез двух пептидов, соответствующих фрагменту 71-80 приведенных последовательностей, и исследовали их антигенность. Было показано, оба пептида реагируют с одними и теми же сыворотками пациентов с хроническим ГД, хотя пептид, соответствующий последовательности Вэнга, проявлял достоверно более высокую антигенность. Этот результат может указывать на преобладание в исследуемых сыворотках определенного серотипа, но в целом наличие перекрестной антигенной активности у двух декапеп-тидов, отличающихся тремя аминокислотами (причем характер замен не позволяет предполагать сохранения конформации), скорее свидетельствует о сложном характере детерминанты, локализованной в этом районе. Возможно, в участке 65-80 представлен набор иммуно-доминантных эпитопов или антигенность этого участка имеет частично конформационный характер.

2. Химико-энзиматический синтез олигодезоксирнбонуклэотндов и введение синтетических фрагментов в плазыидную ДНК.

Использование химически синтезированных олигонуклеотидов является незаменимым инструментом как конструирования систем экспрессии гетерологичного генетического материала в целом (синтез регуляторных - в том числе промоторных - участков, конструирование зон инициации трансляции, обеспечение фазы трансляции, создание сайтов клонирования), так и наиболее эффективным (а во многих случаях - единственным) способом получения и модификации участков нуклеиновых кислот, кодирующих заданные иммунологически активные фрагменты вирусных белков.

За период с начала выполнения этой работы в практике синтеза олигодезоксирибонуклеотидов произошли существенные изменения. Мы участвовали в' разработке новых подходов, касающихся как фос-фитамидитного, так и гидрофосфорильного методов синтеза.

Б начале 80-х годов наиболее эффективным способом получения олигонуклеотздов с длиной цепи до 16-18 звеньев являлся триэфир-ный метод [R.L. Lets Inger, V. Mahadevan, 1965; J. Stavmski et al., 1977], использующий в качестве синтонов (исходных мономеров) N,5'-0,3'-Р-защиценные нуклеозид-3'-фосфаты и триизопропилбензол-сульфотетразолид в качестве конденсирующего агента. С использованием этого метода в 1982 г. нами был осуществлен синтез в растворе трех серий олигонуклеотидов и энзиматическая сборка синтетических фрагментов ДНК, кодирующих аминокислотные последовательности 95-109 и 135- 151 белка поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg).

95 100 105

PheLeuLeuValLeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeu

<--1—><—3—><—5—><—7—х—9----><--11—>

5' AATTCCTGCTCGTGCTTCTAGATTACCAGGGCATGCTTCCAGTCTGCCCACTCG 3' GGACGAGCACGAAGATCTAATGGTCCCGTACGAAGGTCAGACGGGTGAGCCTAG <- —2—><- —4—>< —6----x —-8—-x—10—X--12—>

EcoRI Xbal SphI BamHI

135 140 (Ser) 150

Phe ProSe rCysCysCysT hrLysProT hrAspG1уAsnCysThrCysIlePro

<----1—><----з-----><-— 5-(TCT)<----7----x-----9----->

AATTCCCGTCTTGTTGCTGCACTAAACCGACTGACGGTAACTGTACCTGCATTCCGG

GGGCAGAACAACGACGTGATTTGGCTGACTQCCATTGACATGGACGTAAGGCCCTAG

<-----2----x-----4---->(AGA)-6—x----8-----x—10—>

EcoRI BamHI

Рис. 3. Аминокислотная структура участков 93-109 и 135-151 HBsAg и синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая эти участки. Структура пептида, приведенная в основной цепи участка 135-151, соответствует су^типу adv, структура, содержащая в положении 143 серин,- субтипам adrl, adr,ayw,ayw3,ayr. Цифрами 1-12 обозначены химически синтезированные олигонуклеотидные сегменты. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции.

Перед ферментативной сборкой полинуклеотидных цепей отдельные олигонуклеотидные сегменты фосфорилировали с использованием Г4-полинуклеотидкиназы. Чтобы иметь возможность следить за эффективностью отдельных этапов процесса лигирования, мы ввели в практику способ "сборки отдельных цепей" [В. Д. Смирнов и др., 1983], в дальнейшем широко использованный в работах многих исследователей. При фосфорилировании одного из олигонуклеотидных сегментов (например, 3,5,7,9 или 11 на рис.3) использовали [/'-32 Р]АТР с низкой удельной активностью (50 Ки/ммоль); олигонуклео-тиды 2,4,6,8,10 и 12 не фосфорилировали. В следующем опыте аналогично собирали вторую цепь. Этот подход позволил избирательно анализировать эффективность сборки каждой цепи. Продукты лигаз-ной реакции выделяли злюцией из 8-12 £-ного денатурирующего ПА-АГ, фосфорилировали [^-32Р]АТР с высокой удельной активностью (1 ООО Ки/ммоль) и анализировали их первичную структуру по методу Максама-Гилберта [А. М. Maxam, W. Gilbert, 1980]. Затем цепи поли-нуклеотида смешивали, подвергали отжигу и использовали для введения в векторную ДНК

В середине 80-х годов, в основном, работами лаборатории М. Карузерса СМ. Н. Caruthers, 1985; L. J. KfcBride, 1986] был осуществлен прорыв в области твердофазного синтеза олигонуклеотидов благодаря разработке фосфитамидитного метода, использующего мягкую активацию тетразолом N,5'-О-защищенных нуклеозид-3'-фосфит-амидитов типа

N_/

сн3 ¿н-сн

X - Р - N

СН-СН, где X = -ОСН, или -О-СНгСНгСМ

ип^

что позволило не только существенно сократить время цикла наращивания цепи, но и повысило эффективность стадий конденсации до 95-98 %, сделав возможным синтез олигонуклеотидов с длиной цепи более 100 оснований. Одновременно эти работы стимулировали исследования по созданию производных нуклеозидов, которые могли бы быть использованы не только для получения нативных фрагментов ДНК, но и ппя синтеза их аналогов с модификациями по межнуклео-

тидной фосфатной группе, которые могут применяться как противоопухолевые агенты [J.Nielsen and М. Н. Caruthers, 1988] или нерас-щепляющиеся антисмысловые олигонуклеотиды [J.S. Coher,, 1991].

Вместе с д-ром Эритья и проф. Карузерсом мы осуществили получение серии О-арилфосфитамидитов и исследовали их потенциальную применимость в олигонуклеотидном синтезе [R. Eritya et al. , 1990]. Нами был разработан способ получения О-арилфосфодиамиди-тов реакцией бис(Ы,М-диэтиламино)хлорфосфина с соответствующими фенолятами:

А1

N-P-N

с^н; | чс2н^

НО-Arу1 ---->

2(a-j)

с2 И.

С,н5

^N-P-f/

ЛН*

O-Aryl 3(a-j)

Схема 1. Получение О-арилфосфитамидитов.

Агу1 = 2,4-динитрофенил (а); пентафторфенил (Ь); пента-хлорфенил (с); 2,4,5- трихлорфенил (с1); 4-нитро-фенил (е); 2-бромфенил (Г); 4-бромфенил (е); фенил (Ь); 2-метилфенил (О; 2,4-диметилфенил и).

Конденсация 0-арил-И,№,М,Ы-гетразгилфосфитдиамидитов З(а-з) с N,5'-0-защищенными дезоксирибонуклеозидами в присутствии тетр-азола приводит к образованию дезоксинуклеозид-З'-О-арилфосфита-мидитов с выходом от 40 до 95 %. Структура соединений подтверждена данными 31Р-ЯМР-спектроскопии.

И'О-тЛк В Н-Те Р'О—Ь-О^В 6 Р/0—^,0 В

+ 1\|_у) —> К|_У| —->

ОН

О P-N

O-Aryl 5(a-j)

Р-O-Aryl 0-

О-ШГг 7(a-j)

Схема 2. Получение дезоксинуклеозид-З'-О-арилфосфитамидитоЕ и их превращение в Р-О-арил-динуклеозидфосфиты. Н-Те = тетразол R' = трет-бутилдиметилсилил

В = тимин; N-бензоиладенин, N-бензоилцитозин; N-изобу-тирилгуанин.

Исследование условий и эффективности конденсации соединений 5(a-j) с З'-О-диметокситритильными производными дезоксирибонукле-эзидов (6) в присутствии тетразола выявило отчетливую зависимость скорости реакции от характера и пространственных параметров заместителей в фенильном ядре: 5i > 5j > 5h > 5е > 5d > 5f.

В условиях твердофазного синтеза более эффективным катализатором оказался 5-(2'-нитрофенил.)-тетразол, с использованием которого эффективность конденсации достигала 80-99 %.

Полученные триэфиры могут быть превращены как в амидные, гак и в Н-фосфонатные производные, что, в свою очередь, открывает пути к синтезу соединений с модификациями по мекнуклеотидному фосфору - фосфотриэфиров, фосфамидов, фосфотиоатов и алкилфосфо-натов.

Фосфитамидитный метод синтеза мы активно использовали сначала в неавтоматизированном варианте, а затем с применением синтезатора Applied Biosystems 380А. Одновременно, в соавторстве с Ю. Е. Худяковым, которому принадлежит идея метода, и сотрудниками лаборатории энзимологии РАМН, наш был разработан метод частичной застройки одноцепочечных участков, генерируемых в ДНК при обработке эндонуклеазами рестрикции, позволяющий избежать неправильной ориентации и регулировать олигомеризацию вводимых в ДНК синтетических дуплексов. Так, с использованием этих подходов был синтезирован набор EcoRI-BamHI адаптеров, кодирующих инициатор-ные триплеты AUG, GUG, UUG и триплет CUG (контроль) для конструирования серии плазмидных векторов pVRG, на которой Ю. Е. Худяковым было проведено исследование влияния структуры инициаторного кодона на эффективность трансляции в Е.coli.

зона реинициации трансляции его 1ас Ъ

АТБ БАА САА . .. ТСА ББА СБТ

ТСА АТТС АТБ АбС'ВбА ТСС СЭД .. ЕсоИ ВашН1

5' ТТСАТ(5А(ЗС6 3' БТАСТСаССТ

ТТССТБАССб ССАСТСбССТ

ттсттоассв

СААСТСвССТ

ттссгадбсв

(ЗСАСТСбССТ

Рис. 4. Структура зоны реинициации трансляции в плазмиде р\те. 5'-концевая зона - Есог1 - РбИ -фрагмент рУ1?41;

3'- —"------ ВаптН1 - Реи -фрагмент рС1_47.

При соединении фрагментов произведена частичная застрой ка сайтов ЕсоИ и ВатН1. Указаны синтетические олиго-нуклеотиды, содержащие различные варианты инициаторных кодонов. Выделены инициирующие и терминирующий кодоны.

Аналогично на основе плазмид рНВ320 [V. Вюйко е1 а1. , 1985], рММ23 [ Е. А. Скрипкин и др., 1987] и рСЬ47 [Ю.Е.Худяков и др. , 1987] с использованием синтетических олигонуклеотидов, содержащих БО-последовательности и инициаторный кодон АТЭ, К С. Не-плюевой, И. В. Макеевой и НЕ. Худяковым сконструированы плазмиды р1?С17, рРС17Н, рСНЬ2411 и р[?С23, содержащие опероноподобные дву- и трицистронные участки, для прокариотической экспрессии гибрида сго(1-7) - НВсАд(4-176).

- 17 -

pCRL2411 I цистрон

cro(l-7) HBcAg(4-176)

II цистр. lacZ

... AAGGAGGTTGT ATG... GAT CCT TAT... A GGA GGT TGA ATTC ATG AGC.. SD SD

pRC23 cro(l-7) HBcAg(l-176) ... AAGGAGGTTGT ATG ... A GGA GGT TGA ATT ATG......

Рис.5. Структура инициаторных зон плаз ми д рСИ-2411 и рЯС23.

Разработка такого способа соединения синтетических олиго-нуклеотидов с ДНК оказалась весьма плодотворной, поскольку позволила осуществлять направленное конструирование как мономерных, так и повторяющихся олигонуклеотидных инсерций, необходимое, например, для мультиплицирования антигенно активных участков. Так, были получены олигонуклеотиды, кодирующие три участка ргеБ-области НВУ (фрагменты 31-36 и 94-105 рге31 и 133-143 ргеБ2, рис. 6), предназначенные для введения в плазмидный вектор по частично застроенным сайтам ВатН1 и ХЪо1.

—GGA ТС_

—CCTAG частично застроенный сайт BamHl

дуплекс полимеризации

газла—

СТС— частично застроенный сайт ХЪо1

—GGAT С

—CCT AG частично застроенный сайт BamHl

АОС

дуплекс-терминатор

юаж—

ТС—

частично застроенный сайт ХЪо1

31 36

Asp Pro Ala Phe Arg Ala 5' CCT GCC TTC CGT GC 3' GA CGG AAG GCA CGA GC BamHl Xhol

Рго А1а Бег

5' (т)сст ест тст

3' • (ЗА СБА АБА

- 18 -100

ТИг Агп Агр 01 п Бег АСТ ААС СвТ САБ ТСТ ТБА ТТ6 БСА СТС АБА

105

СТу Агг Б1п Рго ББТ ССТ САЗ СС ССА БСА БТС ОБА Б(С)

133 140 143

Азр Рго Аге Уа1 Агё 61у Ьеи Туг РЬе Рго А1а 5' ССТ СБТ 6ТТ ССТ ОСТ СТБ ТАС ТТС ССТ 6с 3' БА ОСА САА 6СА ССА БАС АТБ ААБ ББА СБА БС

Рис. 6. Схематическая иллюстрация принципа введения мономерных или полимеризованных дуплексов в различным образом частично застроенные сайты векторной ДНК и структура олигонуклеотидов, кодирующих участки ргеБ-области НВУ. В верхней цепи дуплекса, кодирующего аминокислотную последовательность 94-105, в скобках обозначен нуклеотид, входящий в состав только дуплекса полимеризации; в нижней - только дуплекса-терминатора.

Еш@ одним нововведением, позволившим расширить возможности использования синтетических олигонуклеотидов, явилась предложенная Итакурой С К. Иакига, 1982] ферментативная застройка частичных олигонуклеотидных дуплексов, образуемых потяженными синтетическими олигонуклеотидами, которые перекрываются 3'-концевыми участками. Этот подход был использован нами при синтезе генов натрийуретического пептида человека и крысы [Е. А. Ефимова и др., 1990] и конструировании полного гена нуклеокапсидного белка НБУ (химико-энзиматический синтез и сборка фрагментов выполнены Е. А. Смирновой). Схема его получения предусматривает синтез и субклонирование 4 отдельных модулей и использование 30 специально введенных уникальных сайтов рестриктаз для сборки и направленной модификации гена

Фосфитамидитным методом проведен синтез 16 олигонуклеотидов с длиной цепи до 69 звеньев. Эффективность застройки определяли по подвижности Р-меченных продуктов реакции в 10-12%-ном неде-натурирующем ПААГ до и после обработки соответствующими рестрик-тазами. Полученные сегменты модулей обрабатывали рестриктазами

"внутренних" сайтов и подвергали дотированию в масштабе 200 пмол с целью синтеза полных модулей 1-4. Эффективность лигирования, определяемая по изменению подвижности полученных C32P3 меченных полинуклеотидов в 8%-ном ПААГ, составляла в среднем 30-35%.

Фосфитамидитный метод синтеза в настоящее время доминирует в работах, использующих синтетические олигонуклеотиды. Однако, это доминирующее положение методу обеспечило использование автоматических синтезаторов, позволяющих строго соблюдать очень жесткие требования к безводности реагентов, чистоте растворителей и отсутствию кислорода Использование его в неавтоматизированном варианте серьёзно затруднено. По этой причине в 1989-90 гг. вместе с М. Г. Исагулянц мы разработали общедоступную методику неавтоматизированного твердофазного синтеза олигонуклеотидов в пластиковой колонке с использованием в качестве синтонов.З'-гид-рофосфорильных (Н-фосфонатных) производных нуклеозидов, которые были предложены ранее для автоматизированного синтеза [В. С. Froehler et al. , 1986; P.J. Gareg et al. , 19861. Синтез проводили в масштабе от 0,1 до 1,2 мкмоль на носителе Long Chain Amino CPG-500 с навесками полимера до 15 мг. В качестве колонок использовали 1-мл наконечники к автоматическим пипеткам с фильтром из силиконизированной стекловаты, обеспечивающим высокую скорость протока реагентов через коленку. Реагенты и растворители подавали на колонку шприцами и продавливали током сухого воздуха. Объем реакционной смеси в такой методике минимален (до 60 мкл), что обусловливает малый расход реагентов, а это, в свою очередь, позволяет повысить их концентрацию. Выход в расчете на стадию конденсации, определенный по поглощению диметокситри-тил-катиона при 498 нм, составил 97-98 %; препаративный выход, рассчитанный после выделения олигонуклеотидов,-86-88 %. Сопоставление предложенной методики с методиками, используемыми при синтезе в шприце tЮ.В.Даньков и др., 1988] и в автоматическом режиме на отечественном синтезаторе "Ген-2М" ЕЕПКумарев и др., 1988], показывает, что предложенный нами вариант эффективен, экономичен и позволяет получать протяженные олиго-(поли) нуклео-тиды.

- 20 -

Таблица. 3. Сравнение методик Н- фосфонатного синтеза

Синтез на Синтез Синтез в плас-

Параметр "Ген 2Ы в шприце тик. микрокод.

Длительность цикла, с 70-120 около 300 ' 180-230

Масштаб синтеза, мкмоль 0,15-0,25 0,7-0,8 0,1-1,0

Расход на 1 стадию:

растворителей, мл 5-6,6 3,0 3,0

К-фосфонатов, мкмоль 12 5-7 5

деблокирующей смеси, мл 2,5-3,3 0,6 0,9

Синтезированные олигонук-

леотиды (макс, описанное

число звеньев в цепи) 83 30 55

По этой методике мы синтезировали более 40 олигонуклеоти-дов, содержащих от 12 до 55 звеньев, в том числе соответствующие яетрансдируемым регуляторным областям -Р1 и Ф10- промоторы,различные варианты последовательности Шайна-Дальгарно, фрагменты ДНК, кодирующие зоны инициации трансляции, олигонуклеотиды для сайт-мутагенеза участков, прилегающих к стартовому кодону генов 12 и 23 бактериофага Т4, а также ген сигнального пептида белка OmpA Е. coli. Первичную структуру олигонуклеотидов подтверждали секвенированием по Ыаксаму - Гилберту tA.M.Maxam, W.Gilbert, 1977] с использованием условий модификации, описанных в работе С С. А. Чувпилло и др. , 1983]. Этот же способ синтеза был использован нами в работе по получению мономерных и олигомерных вариантов олигонуклеотидных дуплексов, кодирующих секвенциальные антигенные детерминанты белков ВИЧ-1: LGIVGCSGKLIC (598-609 gp41) [J.J.Wang et al., 1986; M. J. E. Sternberg et al., 1987], GERDRDRSIRL (737-747 gp41) [T.C.Chank et al., 1986; J.W.Guann et al., 1987], EEEQNKSKKKA (105-115 gag) И EALDKIEEEQNKSKKKA (99-115 gag) [P. S. Sarin et al., 1986; V.Krchnak et al., 1987] и YYYRDSRNPL (941-950 pol) [P.H.Naylor et al. ,,1987].

598 609

LGIVGCSGKLIC

<---------------------------> <------------------------>

5' (T)CCA СТА GGC ATT TGG GGT TGC TCT GGA AAA CTC ATT TGC GC 3' GT GAT CCG TAA ACC CCA ACG AGA CCT TTT GAG TAA ACG CGA G(C)

737 747

GERDR DRSIR. <--------------------------------------------------->

5'(T)CCT GGA GAG CGT GAT CGC GAC CGT TCC ATT CGT CTT GC

B' GA CCT CTC GCA СТА GCG CTG GCA AGG TAA GCA GAA CGA GfC) <---------------------------------------------------->

105 115

EEEQNKSKKKA

<---------------------------------------------->

5'(T)CCG GAA GAG GAA CAG AAT AAA TCT AAG AAA AAG GC

3' GC CTT CTC CTT GTC TTA TTT AGA TTC TTT TTC CGA G(C) <----------------------------------------------— >

EAIDKIEEEQNKSK

<----------------------------------------------------------

5'CCG GAA GCA CTC GAC AAG АТС GAA GAG GAA CAG AAT AAA TCT AAG-3' GC CTT CGT GAG CTG TTC TAG CTT CTC CTT GTC TTA TTT AGA TTC-

115

К К A

-AAA AAG GC -TTT TTC CGAGC

941 950

VYYRDSRNPL

с---------------------------------------------->

5' ( T)CCA GTT TAC TAT CGT GAC TCC CGT AAT CCT CTT GC 3' GT CAA ATG ATA GCA CTG AGG GCA TTA GGA GAA CGA G(C)

VYRDSRNPL

<------------------------------------------V,

5'(T)CCA GTT TAT AGA GAC AGC AGA AAT CCA CTT GC (Дуплекс

3' GT CAA ATA TCT CTG TCG TCT TTA GST GAA CGA G(C) "-Y")

<—---------------------> <----------------->

Рис. 8. Первичная структура ДНК-дуплексов, кодирующих последовательности из состава белков ВИЧ-1 и последовательность участка pol- белка с делецией Туг(943). Обозначения аналогичны использованным в рис. 6.

Лигазная сборка и полимеризация цепей были исследованы отдельно для (+) и (-) - цепей дуплексов, подложкой служили неки-нированные (и, следовательно, нелигирующиеся) олигонуклеотиды комплементарной цепи. Для количественного определения эффективности лигирования в 5'-положение олигонуклеотидов вводили [. 3£р] . и после проведения реакции выход продуктов реакции рассчитывали как процент от суммарной радиоактивности всех [32Р]-содержащих полос в ПААГ. Данные по эффективности лигирования и полимеризации приведены в табл. 4.

Таблица 4. Сборка и полимеризация Т4-ДНК-лигазой олигонук-леотидных дуплексов, представленных на рис. 8.

Дуплекс* Цепь Эффективность сборки цепи, Z Эффек. полимеризации % димера % полимера

598-609 (+) 9 7 45

(-) 14 12 70

598-609(t) (-) 91 0 0

737-747 (+) - 40 25

(-) - 60 15

(+) - 8 86

(-) 35 0 55

"-Y" (t) (-) 84 0 ' 0

* Дуплексы обозначены номерами кодируемых аминокислот;

Ш- дуплекс-терминатор. Как видно из таблицы 4, использование при сборке цепей оли-

гонуклеотидов-терминаторов полностью исключает возможность полимеризации введенного фрагмента в процессе лигированид с плазмид-ной ДНК

3. Смете»« экспрессии. Белки-носители и экспрессируюцие

Первые работы, преследующие цель принципиальной демонстрации возможности получения белков с иммуноспецифичностью, задаваемой введением в состав их генов синтетических олигонуклеотидов, кодирующих определенные антигенно активные участки, были выполнены нами в начале 80-х годов с использованием наиболее распространенных (и доступных в то время) прокариотических векторов экспрессии. Так, работа по экспрессии полинунлеотида, кодирующего фрагмент 93-109 НВзА§-, проведена с использованием рВР325, в которой замена ЕсоМ.-ВатН1- фрагмента синтетическим полинуклео-тидом (см. рис.3. ) приводила к образованию единой рамки считывания химерного белка, И-конец которого представлен 72 аминокислотными остатками И-терминальной части хлорамфениколацетилтранс-феразы; далее следуют 17 остатков , соответствующих последовательности 93-109 НВэАг; С-терминальная часть белка кодируется коротким участком ДНК, предшествующим в этой фазе считывания терминирующему кодону в составе плазмидной ДНК С рис. 9) [В. Д. Смирнов и др., 1983].

Рис.9. Структура плазмид рН212 и рСИ). Внизу - структура участка рН312, кодирующего гибридный белок. Заштрихованы зоны синтетических олигонуклеотидов.

плазмиды.

В дальнейшем экспрессия синтетических полинуклеотидов, кодирующих эпитопы HBsAg, изучалась в составе его-lacZ-гибрида, кодируемого сконструированной В. Г. Луниным плазмидой pCRD, полученной на основе pCL47 [MZabeau, К. К. Stanley, 19823. Синтез гибридных белков контролируется правым промотором фага лямбда Изучение экспрессии проводилось в различных штаммах Е. coli. Так, плазмидой pHS12 трансформировали штамм НВ101, a pCRD обеспечивала более эффективную экспрессию в Ms 1857. Трансформанты отбирали на среде с ампициллином; ДНК клонов подвергали физкартированию; короткие фрагменты плазмидных ДНК, в состав которых входили синтетические полинуклеотиды (например, Mspl- или Bsu R1-участки, см. рис. 9), секвенировали, подтверждая заданную ориентацию и фазу считывания. "«

,. hmHl, Jа»! I

MTf^jny

j ßmitttM /

JTHK

ufUl

«/77/> 3. «.?/««•< JW

Ли,»!

f JQHX-wMtMft MTt,JÄtf-

\Лмлгог««аГк£ .

Рис.10. Конструирование рекомбинантных плазмид серии pCSX, определяющих синтез белков типа сго(1-7)-АД X -продукт гена lacIZ, где X = а.-к. 598-609 gp41 (LG); 737-749 gp41(RD); 105-115(ЕЕ) и 99-115(ЕА) gag; 941-950 pol (Р). Структура вводимых синтетических олигонуклеотидов приведена на рис. 8.

В 1987 г. В. С. Нэплюевой и Ю. Е. Худяковым была сконструирована плазмида pCSG197, кодирующая гибрид сго(1-7) - preS HBV --lacIZ, в которой участок preS фланкирован сайтами BamHl и Xhol. Замена этого участка синтетическими дуплексами позволяет экс-прессировать введенную антигенную детерминанту в составе экспонированного N-конца . -галактозидазы. Этот вектор был наш использован для конструирования серии плазмид pCSX, предназначенной для экспрессии антигенных детерминант белков ВИЧ (рис. 10).

Правильное встраивание полинуклеотидов должно сопровождаться сохранением lacZ(+)- фенотипа, что облегчает отбор трансформантов. Для поиска рекомбинантных клонов использовали такие гибридизацию с [32Р]-меченными олигонуклеотидами из состава вводимых в плазмиду. ДНК отобранных клоков проверяли рестриктаз-ным картированием, первичную структуру клонированных последовательностей в составе плазмид определяли по "методу Сенгера на плазмидах" [R. G. Korneluk et al.,1985] (секвенирование выполнено В. Тишковым, МГУ и Г. 1Ьрченко, ВНИИГенетика).

Недостатком использованной конструкции явился низкий уровень синтеза гибридного белка и сложность его очистки. Поэтому на следующем этапе исследования мы применили в качестве вектора плазмиды серии рЕХ [К. К. Stanley, 1983; К. К. Stanley, J. P. Lusio, 1984], ранее использованные рядом исследователей при экспрессии белков ВИЧ и их фрагментов [С.J. Marcus-Secura et al. , 1988; А. Ф. Бобков и др. , 1989; С. Aepinus et al. ,1990; Е. ККазеннова и др. , 1991] и позволяющие обеспечить высокий уровень синтеза и возможность очистки белка за счет эффективного образования им телец включения. Применение способа частичной застройки сайтов после обработки плазмиды рестриктазами позволило использовать для клонирования те же олигонуклеотидные дуплексы, вводя их по сайтам BamHl и SalGl полилинкера рЕХЗ (получение плазмид серии рЕХХ).

Поскольку проводимые нами исследования по созданию рекомбинантных белков с заданной иммуноспецифичностью имеют практической целью не только получение средств серологической диагностики вирусных инфекций, но и конструирование иммуногенных гибридов, необходимо было избрать белок, который при использовании в качестве носителя обеспечивал бы экспонирование введенных чужеродных участков и эффективный иммунный ответ на них. Известно, что сильными иммуногенами могут считаться капсидные белки вирусов и

фагов CD. R. Millich, 1988; G. Siegl, S. M. Lemon, 1990]. Одним из наиболее изученных является белок нуклеокапсида вируса гепатита В человека (core-антиген, HBcAg), состоящий из 183 аминокислотных остатков и образующей в клетке агрегаты из 180 молекул [F. Birnbaum et al. ,1989]. Молекулы кор-антигена собираются в частицы диаметром 27,3 нм, причем морфология рекомбинантных частиц, осаждаемых анти-НВс антителами из бактериальных препаратов, и структура вирусных частиц HBcAg, экстрагированных из инфицированных клеток печени, сходны [В. J. Cohen, 1982]. Как природный, так и генноинженерно полученный HBcAg является сильным иммуноге-ном. Иммунный ответ включает активацию как В-, так и Т-клеток [D.R.Millich, A. McLachlan, 1986] и модулируется моноцитами LS.Р. Е. Sylvan et al., 1987]. Уровень Т-клеточной иммуногенности кор-антигена на 2 порядка превышает иммуногенность частиц, образуемых другим сильным иммуногеном -"поверхностным антигеном вируса гепатита В (HBsAg). Установлена локализация Т-детерминант [D.R. Millich et al.,1987]. Т-клеточный ответ на них МНС-рестри-цирован, однако, гаплотипов, не способных отвечать на HBcAg, не обнаружено, т. е. в широкой популяции Т-клеточный ответ на кор-антиген оказывается не зависящим от вариабельности гаплотипа респондента. Т-хеллерные клетки, специфичные к кор-антигену, помогают В-клеткам в выработке антител против как HBcAg, так и других белков HBV, в частности, HBsAg, т. е. помощь оказывается не только интра-, но и интермолекулярно. HBcAg удовлетворяет и требованиям, предъявляемым к Т- независимым антигенам (высокий молекулярный вес, компактная структура,повторяемость на поверхности молекулы гаптенных группировок), что является существенным моментом в создании на его основе иммунотерапевтических средств против заболеваний, связанных с иммунодефицитным состоянием ( в частности, СПИДа). Наконец, предложены модели пространственной структуры этого белка [Р. Argos, S.D. Fuller, 1988]. Наш (совместно с Ю. П. Кадошниковым, Ю. Е. Худяковым, Т. И. Калининой и И. В. Макеевой)было показано, что как полноразмерный рекомбинант-ный HBcAg, так и его фрагменты 1-174, 1-146, а также гибриды, состоящие из 7 N-концевых аминокислот его- репрессора фага лямбда и участков 3-183, 3- 174 и 3-146 HBcAg сохраняют способность к образованию крупных специфических агрегатов, близких по морфологии к нативным кор-частицам, узнающихся антителами против

HBcAg и обладающих высокой иммуногенностью. Таким образом, было установлено, что первичная структура белка нуклеокапсида вируса гепатита В может подвергаться значительным модификациям без нарушения способности к самосборке. Эти результаты позволили нам считать HBcAg оптимальным носителем для разработки на его основе моно- и мультифункциональных потенциальных иммунотерапевтических и иммунопрофилактических средств.

Компьютерный анализ вторичной структуры позволил предположить, что наиболее удобными участками для введения чужеродных последовательностей являются N-конец и район 70-й -85-й аминокислот HBcAg.

Е. А. Скрипкиным (МГУ) была сконструирована плазмида рММ23, позволяющая использовать для экспрессии гетерологичного генетического материала сильный промотор. Р(г) и зону инициации трансляции его- белка бактериофага лямбда. На основе рММЗЗ, а также любезно предоставленной П. П. Цумпеном плазмиды рНВ320 [V. Bichko et al., 1985], которая содержит, в частности, зону, кодирующую HBcAg, Е Е. Худяковым, В. С. Неплюевой и И. В. Макеевой с использованием синтетических олигонуклеотидов было проведено конструирование векторов рСС1224 f cro(1-7)-НВсAg(3-183)], pCRL2411 С 1-й 1 цистрон: сго(1-7)-HBcAg(3-174)] (см. рис.11.), в которых для обеспечения синтеза практически аутентичного природному HBcAg используется минимальный участок белка-носителя, что сводит к минимуму возможность влияния этого участка на структуру и иммунологические свойства гетерологичного белка, но позволяет добиться достаточно высокого уровня экспрессии. С целью получения конструкции, обеспечивающей синтез HBcAg с собственного инициа-торного кодона, pCRL2411 была модифицирована заменой Pstl-BamHl-фрагмента на участок Pstl-EcoRl плазмиды pVRG и введением синтетического олигонуклеотида, кодирующего первые три аминокислоты HBcAg. Второй цистрон полученной плазмиды pRC23 кодирует HBcAg(1-176), трансляция которого осуществляется по механизму реинициации.

Рис.11. Структура плазмид рСС1224, pCRL2411, pRC23. Структура инициаторных зон приведена на рис. 5.

Эти плазмиды детерминировали достаточно эффективный синтез HBcAg в Е. coli С до 6 % тотального белка; рис. 12).

I 2 5 * 5 6 7

¡зсэ Es —

» -

л.

2ч 2ч 2«

fCC 1224 ¡#В10 pSEL 24)13

Рис. 12. Синтез рекомбинантного HBcAg в клетках Е. coli под контролем плазмид рСС1224 -(1,2); pCRL2411 -(6,7). 2,7 -частично очищенные препараты HBcAg. 3 - маркерные белки. Использование плазмиды pCSG197, кодирующей гибрид его-preS-gal, и олигонуклеотидов, кодирующих фрагменты preS- области HBV (см. рис.6.), позволило провести конструирование векторов серии

рРБ, детерминирующих синтез гибридных белков, содержащих 7 Я-концевых аминокислот белка его, соответствующую антигенную детерминанту и полную последовательность НВсА&, начиная с четвертой аминокислоты (рис.13). Таким образом, в векторах этой серии антигенная детерминанта чужеродного белка встраивается в Ы-конец НВсАдг.

Рис. 13. Структура плазмид рРЗ и pNCS. Заштрихованы зоны, кодируемые синтетическими олигонуклеотидами. Структура вводимых олигонуклеотидов представлена на рис. 6.

Структура плазмид подтверждена рестрикционным анализом, фрагменты, кодирующие антигенные детерминанты, секЕенированы.

Второй участок встраивания -район 70-85-й аминокислот HBcAg.. Этот участок обладает выраженной гидрофилъностыо, высокой конфор-мационной подвижностью и может формировать петлю, расположенную на поверхности белка (результаты наших расчетов согласуются с опубликованной позднее пространственной моделью укладки HBcAg [Р. Argos, S.D. Fuller, 19881). Кроме того, на этом участке обнаруживается значительная гетерогенность аминокислотного состава для разных штаммов HBV, что является характерным признаком антигенной детерминанты и аргументом в пользу представления об экспони-рованности этого участка (действительно, позже было показано [J. Salfeld et al. , 1989), что одна из возможных конформационных детерминант HBcAg включает в себя 74-81 а.-к.). В связи с этим были созданы конструкции, детерминирующие синтез гибридных белков со вставками чужеродных антигенных детерминант в этом районе. На основе плазмид pCRL2411, pPSG и pRC23 И. В. Макеевой и Ю. Е. Худяковым была сконструирована серия плазмид pMCS (см. рис.13), кодирующих HBcAg (1-176), синтезируемый с "собственного" AUG-кодона

pPS

pMCS

за счет реинициадии трансляции и содержащих зону, кодирующую антигенные детерминанты ргеЗ-области в районе 70-85 а. -к. НВсАд.

Наконец, для повышения плотности детерминант, вводимых в НВсАд, создана плазмида рРБ2М31-5,кодирующая гибридный белок , в котором детерминанта, соответствующая 133-143 а.-к. ргеБ- области, расположена на И-конце, а детерминанта, соответствующая 31-36 а.-к., - в районе 70-85 а.-к. НВсАд. (Рис. 14).

Ji.Pl

&.Я1

Xbal/Pstl

Xkl/P,tl

&о»1

Рис.14. Схема конструирования плазмиды pPS2M31-5.

HBcAg как носитель использован также в нескольких сериях плазмид, сконструированных нами совместно с ИГ. Исагулянц для получения в Е. coli гибридов, содержащих фрагменты белков ВИЧ-1. Так плазмиды серии рССХ для экспрессии гибридов типа его-АД ВИЧ-HBcAg(1-183) получали путем объединения фрагмента, кодирующего участок его-АД ВИЧ плазмиды pCSX с фрагментом, кодирующим полноразмерный HBcAg; плазмиды pCRX, в которых HBcAg представлен участком 1-176, - объединением Pstl-Xbal - фрагментов рССХ и PCRL2411 (рис. 15).

р.

№

15. Схемы конструирования плазмид серии рССХ и рСИХ. Обозначение X расшифровано в подписи к рис. 10.

Поскольку одним из факторов, определяющих эффективность экспрессии гетерологичного материала , является использование сильного промотора, представлялось важным наряду с системами экспрессии, использующими термоиндуцируемый промотор Рг, создать конструкции, в которых транскрипция плазмидной ДНК контролируется IPTG- индуцируемым промотором Ф10 бактериофага Т7 [J.J.Dunn, F.W. Studier, 1984]. Системы такого рода также успешно проявили себя при экспрессии белков ВИЧ iL. S.Ehrl ich et al. , 1990]. Для создания экспрессирующей плазмиды мы провели химический синтез олигонуклеотидов (см. рис.16), представляющих основные элементы экспрессии - промотор и зону инициации трансляции, включающую SD -последовательность, спейсерную зону и инициаторный кодон - для экспрессии гибридного белка на основе HBcAg. Схема конструирования приведена на рис. 17.

-17 -10 +1

TT GTCGАСAT АААТ Т ДАТ ACGACTCACTAT AGGGА СAGCTGTATТТААТТATGCTGAGTGATATCCCTTC "дуплекс А"

СПААВБАбеттТАтеААб

АТТССТССААСАТАСТТССТ "дуплекс В"

Рис. 16. Структура синтетических дуплексов, кодирующих промс тор Ф10 и зону инициации трансляции (выделены после довательность и инициаторный кодон.

/ «.-II, Im't l MU •Jttf'JtTf

.a322 i

ДтмиА fiilMtñlB

pBHT7

P,U.

Ib-*'

lall

Util

fCke

к-"'

ТЧМ»--

Рис.17. Схема конструирования pT7(+). Структура рТ7(-).

Поскольку плазмида рТ7С+) содержит неуникальные сайты SalGl и BamHl, она не может рассматриваться как векторная. Объединение SalGl - EcoRl- фрагмента рТ7(+) с вырезаемым теми же рестрикта-зами фрагментом из pBR322 позволило получить вектор рТ7(-), кодирующий гибрид АД БИЧ-HBcAg( 1-176), зкспресскруемьй под контролем Ф10- промотора.

4. Экспрессия в Е. coli и свойства гибридных белков заданной ишуноспецифичносга

Первые работы по введению синтетических олигонуклеотидов , кодирующих антигенно активные участки вирусных белков, были выполнены на модельных системах. На основании анализа гидрофиль-ности и сведений об антигенных свойствах пептидов из состава HBsAg [ L. A. Lerner et al., 1981; А. М. Prince et al., 1982; G. R. dreesmane et al. , 1982] в качестве антигенно активных участков были выбраны фрагменты 95-109 и 133-151 этого белка. Экспрессия плазмиды pHS12 (рис.9) была исследована в сопряженной бесклеточной системе транскрипции-трансляции с использованием [353]-метионина в качестве радиоактивного предшественника белков. Продукт экспрессии должен иметь молекулярную массу около 16,5кД. Радиоавтограмма разделения в ПААГ [35S]-меченных белков подтвердила исчезновение в продуктах трансляции хлорамфениколацетилт-рансферазы и появление белка с массой 16,5 кД. Экспрессия плазмид серии pCRD (рис.9) проведена как в бесклеточной системе, так и непосредственно в Е. coli. Единая рамка считывания фрагмента его, участка HBsAg и lacZ приводит к появлению гибридного белка с массой 120 кД. Уровень экспрессии - около 10 % тотального белка. Было показано, что гибрид, содержащий последовательность 135 -151 субтипа adw HBsAg, осаждается в реакции иммунопреципитации как антителами против yj-галактозидазы, так и антителами против нативного HBsAg (опыты проведены В. Г. Луниным, О. В. Сергиенко и В. Г. Григорьевым, ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ) Таким образом, в 1983 г. нам впервые удалось осуществить экспрессию в прокариотической системе рекомбинантной ДНК, содержащей синтетический олигонуклеотид, кодирующий антигенно активный фрагмент вирусного белка. Последующие работы преследовали цель создания двух типов гибридов - белков на основе ^-галактозидазы для исследования антигенной активности вводимых эпитопов (этот тип белков может быть использован в диагностических целях) и белков на основе HBcAg как потенциально иммуногенных гибридов заданной иммуноспецифичности.

4.1. Антигенная активность гибридов ß галактозидазы с антигенными детерминантами вирусных белков.

Гибриды на основе JS-галактозидазы получили широкое распространение при изучении отдельных участков вирусных антигенов [К. Stanley, 1983; С. J. Marcus-Secura et al. , 1988; E. В. Казеннова, 1989], картировании сайтов узнавания моноклональных антител

СВ. Banapour et al. , 1987] и при создании диагностических препаратов [ G. N. Barber et al. , 1987; MP. Landini e< al. , 1989; E.В.Казеннова и др., 1991]. Ферментативно активная^-галактози-даза представляет собой тетрамер, четвертичная структура которого формируется с участием С- концевых фрагментов. Встраивание дополнительных участков в N-концевую часть молекулы не нарушает ферментативной активности и способствует экспонированию этих участков на поверхности тетрамера СВ. Г. Коробко и др., 1987]. Встраивание в С-конец приводит к разрушению тетрамера и потере ферментативной активности, но введенные участки сохраняют антигенные свойства [К. Stanley, 1983; В. С. Scholl et al. , 1988; j.R. Thole et al., 19883 и устойчивость к действию клеточных про-теаз благодаря эффективному образованию нерастворимых телец включения (что облегчает и очистку гибридных белков).

4.1.1. Включение антигенной детерминанты в N- конец ß- галактозидазы.

Таблица 5 демонстрирует структуру гибридных белков, кодируемых плазмидами на основе pC3G197.

Таблица 5. Гибридные белки на основе ß-галактоэидаэы.

Плазмида, Кодируемая АЛ Структура гибридного белка кодирующая АЛ

pCSLG 4 598-609 gp41 HIV -------------------------

его АД lac IZ

(1-7)

pCSRD 1, 15. 737-749 gp41

pCSEE 20, 52 105-115 pi7

pCSEA 75, 87 99-115 pi7

pCSP 41, 50 941-950 pol

При анализе лизатов Е. col i, трансформированной плазмидами серии рСЗХ, обнаруженная галактозидазная активность была в среднем вдвое ниже, чем у выращенных в тех же условиях клонов, трансформированных исходной pCSG197. Тем не менее, в 12 %-ном ПААГ наблюдали образование белков с молекулярной массой порядка 140 кД, хотя уровень их синтеза не превышал 1 %.. ВИЧ- специфичность гибридных белков исследовали методом прямого ИФА лизатов рекомбинантных клонов с очищенными иммуноглобулинами из сыворо-

ток инфицированных БИЧ-1 и кроличьей сыворотки против .-галакто-зидазы Е.coli (отрицательные контроли - гибрид его-preS-lacIZ и нормальная кроличья сыворотка). Достоверным считали трехкратное превышение сигнала в ИФА над негативными контролями. 3-5-кратное превышение было зарегистрировано для лизатов клеток, трансформированных плазмидами pCSLG, pCSP, pCSEA. Таким образом, под контролем этих плазмид в Е. col i синтезировались гибридные белки, обладающие ВИЧ-специфичностью. Причиной низкого уровня синтеза гибридов не может быть изменение в структуре белка, вносимое небольшими пептидными участками введенных антигенных детерминант, поскольку описаны стабильные гибриды, содержащие до 100 а. -к. на N-конце галактозидазы Ш Р. Broekhuijsen et al., 1987]. Скорее речь может идти об изменениях в структуре 5'-конца м-РНК, затрагивающих зону инициации трансляции, которые сказываются как на прямой инициации (плазмиды pCSX), так и на реинициации.

4.1.2. Включение антигенной детерминанты в С- конец ß- галактозидазы.

Поскольку низкий уровень синтеза гибридных белков ограничивал возможность их детального исследования и использования, было проведено конструирование экспрессирукяцих плазмид на основе вектора рЕХ. В табл.6 приведена структура получен:.-« гибридов.

Таблица 6. Гибридные белки на основе ß-галактозидазы.

Плазмида, Кодируемая АД Структура гибридного белка кодирующая АД

pEXLG 13, 15

pEXRD 28 рЕХЕА 28, 31 рЕХР 1, 22

598-609 gp41 HIV ----

ero

737-749 --"-99-115 р17 941-950 pol --"—

lac ¡2 АД _ _ и ____

Рекомбинантные плазмиды амплифицировали в штамме N4830 при 30 град. , индуцируя экспрессию белков повышением температуры до 42 град. (2 час). Все рекомбинантные клоны N4830/рЕХХ экспресси-ровали белки, по мол. массе равные исходному гибриду его-1ас2; уровень синтеза составил 10-20 % от тотального белка клетки. Белки выделяли и очищали в составе телец включения и исследовали методом обратного ИФА с очищенными иммуноглобулинами из ВИЧ-положительных сывороток (позитивный контроль из набора фирмы Ии

3ont; опыты проведены сотрудниками института вирусологии ü Г. Исагулянц и Е А. Симоновым). Отрицательными конт-олями служили негативные контроли того же набора (иммуноглобулины здоровых цоноров), а также взаимодействие иммуноглобулинов из ВИЧ-положительных сывороток с лизатами Е.coli, трансформированными исходным вектором. Для всех четырех белков, кодируемых плазмидами рЕХХ, обнаружен положительный сигнал (2-3-кратное превышение над отрицательным контролем), что однозначно доказывало наличие в гибридных белках эпитопов ВИЧ специфических антител.

Исследование представительства антител на клонированные детерминанты ВИЧ-1 в сыворотках инфицированных были проведены совместно с сотр. НИИ Вирусных препаратов РАМН JL JL Сухановой. Очищенные гибридные белки исследовали методом обратного ИФА с панелями сывороток ВИЧ-инфицированных лиц и здоровых доноров. Абсолютное большинство (>96 %) сывороток ВИЧ- инфицированных реагировало с гибридами, содержащими участок 598-609 gp41. Эти гибриды и гибриды . -галактозидазы с полноразмерным gp41, предложенные в качестве компонента тест-системы для определения маркеров ВИЧ-1 [JL JL Суханова и др. , 1989], выявляли положительные сыворотки со сравнимой эффективностью (Рис.18). Гибриды, содержащие.участки других ВИЧ-белков, менее эффективны в реакции з сыворотками, хотя демонстрируют достоверно положительный результат (рис.19).

Ш z 1000

35001----

ЕН (а1- (р 41 □ (»1- 598—609 К («1-

Рис. 18. ИФА сывороток ВИЧ- позитивных лиц (+) с применением гибридных белков.

«м>

- п _

55 "г Я; »5

о »■ - -

12 14

■ (ЯЖ»ц.др41)*-д«»г»и|ти

цг

т •

□ (7Д7.74»Ч.др41НИ)1И|11111»11

«С " 2

ои

9 •

■ (М1-«50ы.рМНф1ас|о(Им В I

оА

ой

• ю ним мднм I

|»-1Цц.рИН1 дтчиЧПшч

Рис. 19. ИФА сьшороток ВИЧ-позитивных лиц (четыре графика в верхней части рисунка) и здоровых доноров (четыре нижних графика) с применением гибридных белков.

Представительство в сыворотках инфицированных антител на отдельные эпитопы белков ВИЧ-1 демонстрируется рисунком 20. Ан-

гитела на детерминанты Т-клеток, как, например, на участки 941-950 pol и 737-749 gp41 (эти участки также могут стимулировать образование нейтрализующих антител CD. J.Evans et al. , 1989]), оказались представленными всего в 2-3 % сывороток (рис.20), что соответствует данным американских исследователей по анализу ВИЧ-положительных сывороток в Калифорнии [R. D. Schrier et al., 1988] и, возможно, отражает общую закономерность иммунного ответа на функционально важные для вируса участки белков, в частности, иммунорецессивность эпитопов нейтрализующих антител.

i 3,0

i 2,0

1.0 0,0

GP41

b-gal

E 0,4 с

§ 0,2

0,0

* i

i¡¿ • • — . %

RD b-g

Рис. 20. Представительство антител на антигенные детерминанты отдельных белков ВИЧ-1 в сыворотках инфицированных, исследованное с помощью непрямого ИФА. LG- участок 598-609 gp41; RD - 737-747 gp41; EA- 99 -115 gag; P - 941-950 p34. Для сравнения приведены результаты ИФА с jj-галактозидазой (b-gal) и гибридом cro-jí-галактозидаза- gp41 (GP41).

4.2. Свойства гибридных белков на основе HBcAg.

Как уже упоминалось в предыдущем разделе, задачей настоящей работы явилась, в частности, разработка нового подхода к созданию потенциально иммуногенных препаратов заданной иммунологической направленности. В разработке таких подходов особое внимание уделяется сочетанию в составе одной молекулы (или, по крайней мере, одной частицы) детерминант В- и Т-клеточного ответа CD. R. Mi lieh, A. KfcLachlan, 1986; D.R.Mi lieh, 1988, 1989]. Принцип сочетания пептидов, представляющих собой эпитопы В- и Т-клеток, был успешно использован при конструировании вакцинных препаратов против м?ця рии СF. Borras-Cuesta et al. , 1987; J. A. Londono et ál. , 1990]

рассматривается в работах по иммунопрофилактике ВИЧ-инфекции [В. F. Haynes et al., 1990; P. Chong et al., 19901. В частности, проводятся работы по встраиванию гомологичных и гетерологичных В-эпитопов в состав белка нуклеокапсида HIV (р24) [R. Wagner et al., 1990; H.Flessbach et al., 1990]. Мы предприняли конструирование серии гибридных белков на основе нуклеокапсидного белка HBV, введя в его состав детерминанты preS- области того же вируса или детерминанты белков ВЙЧ-1.

4.2.1. HBcAg с эпигонами preS- области.

Совместно с И.В.Ыакеевой, Ю.Е.Худяковым и Т.К.Калининой нами был получен и исследован ряд вариантов гибридных белков на основе HBcAg, содержащих участки preSl и preS2- областей HBV и различающихся наличием на N-конце короткого фрагмента белка его, размером фрагмента HBcAg и местоположением введенной детерминанты.

Таблица 7. Гибридные белки на основе HBcAg.

Пдазмида, Кодируемая АД кодирующая АД

PPS31-42 31-36 preSl HBV

pPSl-5 pPSlP-30 PPS2-17

pPS?-35

PPSR2-85

PP5R2-20

Структура гибридного белка

-------------------------->

croCl-7) preS HBcAg(4-183)

94-105 —-----

Тримеp(94-105) -----

133-143 preS2 -----"-

------------------------->

cro(1-7) preS HBcAgC4-176) AT6

------------------------->

AA* preS HBcAgC4-183) ATG

------------------------->

AA* preS HBcAgC4-176)

* N-концевая зона белка: Met-Ala-Ala

Электрофорез в ПААГ показал, что после индукции в клетках, трансформированных этими плазмидами, появляются зоны, соответствующие белкам ожидаемой молекулярной массы (21-25 к®. Мэто-дом иммуноблоттинга с кроличьими анти-НВс антителами установлено, что эти зоны содержат антигенно активный НВсАд (рис. 21).

• 2 3(5 (

4га/-НВсДв АТ

к-

5 4 3 г 1

Рис.21, Иммуноблоттинг гибридных белков с анти-НВс-сыворот-ками кроликов.

А: продукты экспрессии плазмид рРБ2-17 (1); рРБ1-5 (2); рМС52-2 (3); рШ31-Б2 (4)-, рР32-35 (6); рРБН2-20 (7); рС1?Ь2411 (8); рРЗЕ?2-85 (9)

В: продукты плазмид рКС31Р-69 (лизат) (1); рМС31-52 (лизат) (2); рМСБ1-52 (очищенный препарат) (3); рР51Р-30 (очищенный препарат) (4); рСИ.24И (очищенный препарат, контроль) (5).

Показано также, что лизаты клеток, трансформированных этими плазмидами, при разведении в 1 ООО - 10 ООО раз взаимодействуют с анти-НВс антителами из сывороток пациентов с гепатитом В. В то же время введение участков ргеБ-области придает белкам способ-

ноеть реагировать с анти-preS антителами. Типичный результат приведен на рис. 22.

Рис. 22. Иммуноблоттинг очищенных препаратов белков, кодируемых плазмидами: pCRL2411 (1), контроль; PPS31-42 С 2); pKCS31-7 (3) с анти-HBcAg сыворотками кроликов CI), моноклональными анти-preSl антителами (II), анти-preSl сыворотками, полученными при иммунизации кроликов пептидом 24-41 (III).

(2325 25

Важно отметить, что гибридные белки проявляли антигенные свойства как HBcAg, так и preS-области HBV не только в денатурирующих условиях, но и в ИФА. Поскольку было показано [В. С. Неплю-ева и др. , 1989; И. В. Макеева и др. , 1990; Т. И. Калинина и др. , 1990], что белки на основе HBcAg сохраняют способность к образованию частиц, по морфологии сходных с нативным HBcAg, это дает основания утверждать, что введенные в N- конец носителя детерминанты preS-области локализованы на поверхности частиц и их кон-формация близка к таковой в составе нативных вирионов. Этот вывод подтвержден и результатами иммуноэлектронной микроскопии очищенных препаратов гибридных белков, кодируемых плазмидами pPS217 и pPS31-42 СЮ. Е Кадошников и др. , 19903.

Для введения детерминант preS- области в центральную часть HBcAg была использована серия плазмид pMCS С рис. 13).. Белки, кодируемые этими плазмидами, синтезируются с собственного AUG-кодона и содержат HBcAg, редуцированный на 7 аминокислот с С-конца. Детерминанты preS введены в область 70-85 а.-к. (табл.8).

Таблица 8. Гибридные белки на основе HBcAg.

Плазмида, Кодируемая АД Структура гибридного белка кодирующая АД

PKCS31-7

pMCSl-52

pMCSlP-69

PKCS2-2

PPS2M31-5

AUG preS

31-36 preSl HBV ------------------------->

AA HB- -cAg(4-176)

94-105 ------- ----"----

тример (94-105) ----"----

133-143 preS2 HBV ----"----

preSS preSl

31-36 preSl и ---------------------------->

133-143 preS2 cro(l-7) HB- -cAgi4-176)

Эти плазмиды также детерминировали синтез в Е. col i гибридных белков ожидаемой молекулярной массы. Продукты экспрессии плазмид pKCSl-52 и pNCS31-7 взаимодействуют в ИФА с человеческими ан-ти-НВс антителами при разведении в 1 ООО и 100 раз, соответственно. В то же время НВс- антигенную активность белков, кодируемых

рКС31Р-69 и рМС32-2 удается выябить только методом иммуноблот-тинга Белки, кодируемые р!С531-7 и рКСБ2-2 взаимодействуют е иммуноблотте с антителами к синтетическим пептидам 24-41 рге31 у 133-143 ргеБ2 (рис.23). Очищенный препарат белка, кодируемогс плазмидой рКС331-7, взаимодействует в ИФА как с человеческими антителами против НВсАд, так и с антителами к пептиду 24-41 илу с моноклональными антителами (МКА) к ргеЗ-области.

; -■ НВсАд-АТ а и ги-рге82-А Т

/ 2 5

Рис. 23. Иммуноблоттинг очищенных препаратов белков,' кодируемых плазмидами рРЗР£-35 (1); рР52-17 (2); рМС£2-2 (3); рС1?Ь2411 (4), контроль, с анти-НВс и анти-рге32 сыворотками кролика, полученными при иммунизации пептидом 133-143.

Антигенность гибридного белка по отношению к этим МКА подтверждается и данными иммуноэлектронной микроскопии.

Таким образом, выявлена возможность введения как в И-конец, гак и в центральный район белка нуклеокапсида НВУ антигенных детерминант ргеЗ-области того же вируса без существенного нарушения структуры и антигенных свойств как носителя, так и введенных детерминант и структуры участков, ответственных за межмолекуляр-:ше взаимодействия, обусловливающие способность НВсА^ формировать мультимолекулярные агрегаты (частицы). Наконец, с использо-занием плазмиды рР32М31-5 получен гибридный белок, содержащий в Ьконце НВсАг участок ргеБ2-, а в центральной зоне -участок ?геБ1 области НВУ. Рис. 24 показывает сохранение антигенных свойств каждого из компонентов гибрида.

еиты- юггы- сятн-

»г»3| Лт Г&йд ЛТ рпбг ЛТ

3 1 11 г к 1 3 _Л

Рис.24. Иммуноблоттинг лизата клеток, содержащих плазмиду рРБ2М31-5 (дорожка 2), с кроличьими анти-НВс, анти-рге31 и анти-ргеБ2 сыворотками. (1) -НВсАд.

Были получены первые сведения об иммуногенности очищенных препаратов белков, кодируемых плазмидами pPSR2-j5, pPSl-5, pPS217 и pMCSl-52 (работа выполнена совместно с сотрудниками лаборатории иммунологии института вирусологии С. 0. Вязовым и Р. П. Павлюченковой). Сыворотки иммунизированных кроликов содержали антитела как против HBcAg (титры от 100 ООО до 500 ООО), так и против соответствующих preS-участков (от 500 до 1 ООО). Последний результат, возможно, является заниженным, поскольку тестирование анти-preS антител проводилось с использованием синтетических пептидов, конформация которых лишь частично воспроизводит натиЕную конформацию этой области в составе вирусной частицы. Поэтому полученные данные мы склонны рассматривать лишь как подтверждение возможности формирования иммунного ответа на различные участки направленно модифицированного HBcAg.

4. 2. 2. HBcAg с эпигопами белков ВИЧ-1.

Результаты, полученные при исследовании гибридов на основе HBc-Ag с детерминантами preS-области HBV, и литературные сведения о конструировании искусственных иммуногенов, сочетающих в своем составе В- и Т-эпитопы ВИЧ (на уровне представляющих эти эпитопы пептидов) [P. Chong et al., 1988; В. F. Haynes et al., 1990], побудили нас исследовать возможность получения гибридных белков, содержащих детерминанты белков ВИЧ-1 в составе белка нуклеокапсида вируса гепатита В. В табл. 9 приведены схематические изображения гибридных белкоЕ, экспрессирующихс'я в клетках Е.coli, трансформированных сконструированными плазмидами.

Таблица 9. Гибридные белки на основе BcAg с детерминантами белков БИЧ-1.

Плазмида, Кодируемая АД Структура гибридного белка кодирующая АД

pCCLG

рССЕА рССР

pCRLG

pCREA pCRP

рТ7Р( +)

pTVP(-)

598-609 gp41 HIV ------------------------->

cro(1-7) АД HBcAg(l-183)

99-115 pl7 —----"----

941-950 p34 pol ----"-----

598-609 gp41 -------------------------->

cro(l-7) АД HBcAg(1-176)

99-115 pl7 ----"----

941-950 p34 pol ----"----

AUG

----"---- -------------------------->

АД HBcAg( 1-176)

Под контролем рекомбинантных плазмид серии рССХ и pCRX в ¡летках Е. coli N4830 при термоиндукции (42 град. , 16час) проду-даруются. белки с молекулярной массой 23 и 22кД, соответственно исходные гибриды cro-HBcAg -22 и 21кД). Уровень синтеза соста->ил от 1 до 10 % тотального клеточного белка. Исследования физи-:о-химических и антигенных свойств белков проведены совместно с отрудниками института вирусологии М. Г. Исагулянц, Т. И. Калининой, 1 А. Семилетовым, Р. П. Павлюченковой. Все белки специфически реа-ировали с иммуноглобулинами из кроличьей сыворотки против ген-шнженерного сго(1-7)-HBcAg(1-176). При иммуноблоттинге лизаты леток, трансформированных рССР или pCRP, взаимодействовали с ывороткрй поотив' пептида 941-950 pol (рис. 25).

(1)(2)(3) (4) (5) (6) (7)

^ 941-950 а.а. p34-HBcAg - HBcAg

(А)

(С)

Рис. 25. (А) Электрофорез в 12,5 Х-ном ДСН/ПААГ лизатов:

(1)- неиндуцированных; (2)- термоиндуцированных клеток Е. coli/pCRP; (3)- cro( 1 - 7) - НВсAg( 1 -176).

(B) Иммуноблоттинг с поликлональной кроличьей сывороткой против пептида 941-950 р34 pol: (4)-его-HBcAg (5)-термоиндуцированные Е. coli/pCRP.

(C) Иммуноблоттинг с кроличьими антителами против рекомбинантного HBcAg: (6)- термоиндуцированные Е. col i pCRP; (7)- его-HBcAg.

Использование плазмид рТ7(+) и рТ7(-) обеспечивает повышение уровня экспрессии в среднем в 1,5 раза. В лизатах клеток BL (DE3), трансформированных рТ7Р(+) или рТ7Р(-) и индуцированных IPTQ, также обнаружены белки с молекулярной массой 21 кД (исходный HBcAg 1-176 имеет массу 20 кД), специфически реагирующие с антителами против HBcAg и пептида 941-950 р34 pol.

Таким образом, получен широкий спектр гибридных белков на основе HBcAg, экспрессирующихся в виде гибридов с коротким фрагментом его или с собственного инициаторного кодона. На примере гибрида HBcAg с участком 941-950 р34 pol продемонстрировано придание белку ВИЧ- специфичности. Поскольку уже установлено, что гибриды такого рода способны к формированию высокоиммуногенных частиц, полученный результат можно рассматривать как первый этап в разработке способа получения на основе нуклеокапсидных белков мультивалентных иммуногенов, несущих и презентирующих иммунной системе различные гегерологичные эпитопы.

- 49 -ВЫВОДИ

1. Методами пептидного синтеза уточнена антигенная структура участка preSl-области поверхностного белка HBV и нуклеокапсидно-го белка вируса гепатита дельта. Полученные сведения о высокой антигенности фрагмента 31-36 preSl явились основанием для введения этого фрагмента в состав конструируемых гибридных белков. Синтетический пептид, соответствующий участку 65-80 аминокислот нуклеокапсидного белка вируса гепатита дельта, может быть использован для выявления анти-HD антител в клинической практике.

2. Исследованы способы получения и применимость в олигонук-леотидном синтезе серии О-арилфосфитамидитов. Показано, что эффективность образования межнуклеотидной связи с их использованием в условиях твердофазного синтеза может достигать 99 %. Продемонстрирована возможность превращения динуклеозидарилфосфитов в фосфамидные, гидрофосфорильные и метил-фосфонатные производные.

3. Предложен ряд методических модификаций гидрофосфорильного (Н-фосфонатного) способа синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, включая разработку методики неавтоматизированного твердофазного синтеза в пластиковой колонке, обеспечивающей возможность получения олигонуклеотидов с длиной цепи до 55 звеньев с препаративным выходом более 80 %, а также модификация метода лигазной сборки олигонуклеотидов, позволяющая оценивать эффективность ли-гирования каждой из цепей дуплекса. С использованием существующих и разработанных методик осуществлен синтез около 100 олигонуклеотидов, в том числе дуплексов, кодирующих антигенные детерминанты HBsAg, preS-области HBV, белков env, gag и pol ВИЧ1, четырех модулей, составляющих ген HDAg, Ф10 промотора фага 17 и ряда детерминант инициации трансляции.

4. Впервые продемонстрирована принципиальная возможность использования химически синтезированных олигонуклеотидов для конструирования В-эпитопов в гибридных белках.

5. Сконструированы:

-экспрессируюшие плазмиды серии pCSX, кодирующие гибридные белки на основе jff-галактозидазы с включением в N-конец белка антигенных детерминант белков ВИЧ-1;

-плазмиды серии рССХ, кодирующие гибридные белки на основе HBcAg с включением в его N-конец антигенных детерминант белков ВИЧ-1;

-плазмиды рТ7(+) и рТ7(-), содержаще синтетический промотор Ф10 бактериофага Т7.

6. С использованием ранее существовавших и сконструированных в ходе настоящей работы плазмид осуществлено введение синтетических олигонуклеотидных фрагментов, кодирующих антигенные детерминанты

-HBsAg в ген хлорамфениколацетилтрансферазы и 5'-концевую часть гена lacIZ;

-участков preSl и preS2- области в 5'-концевой и центральный участки гена HBcAg;

-участков белков gag, pol и env ВИЧ-1 в 5'- и 3'-концевые зоны гена lacIZ и в 5'-концевую зону гена HBcAg.

7. Исследована эффективность экспрессии и антигенность гибридных белков, содержащих чужеродные антигенные детерминанты в составе jg-галактозидазы или HBcAg. Показано, что гибриды на основе _/?-галактозидазы более эффективно экспрессируются под контролем плазмид, кодирующих введенные антигенные детерминанты в С-конце белка-носителя. В реакциях ИФА и иммуноблоттинга полученные гибриды проявляют антигенные свойства как носителя, так и введенных детерминант. Это позволяет использовать белки на основе ß-галактозидазы для выявления антител к соответствующим детерминантам белков вируса гепатита В или ВИЧ-1.

8. Белки на основе HBcAg, содержащие участки preS-области HBV, при введении лабораторным животным индуцируют продукцию антител как против HBcAg, так и против соответствующих участков preS, что позволяет рассматривать такие гибриды как прототипы мультифункциональных комплексных иммуногенов, сочетающих в своем составе заданные участки В- и Т-эпитопов различных вирусных белков.

Список основных публикаций по теме диссертационной работы.

1. Р. П. Евстигнеева, Е. И. Прокуронова, Г. А. Желтухина, В. Д. Смирнов, Ю. А. Семилетов, Ю. Е. Худяков, Т. И. Калинина, ЕГ. Герлих. Синтез и иммунологические свойства пептидного фрагмента 30- 36 preSl -области белка оболочки вируса гепатита Е Докл. АН СССР, 313, No 5, 1135-1138 (1990).

2. Р. IL Евстигнеева, Г. А. Желтухина, Е. И. Прокуронова, В. Д. Сми-

рнов, К1 А. Семилетов, Ю. Е. Худяков, Т. И. Калинина, И.О. Хромов, М.О. Фаворов, Т. Л. Яшина Синтез и иммунологические свойства пептидного фрагмента рге5-области белка оболочки Еируса гепатита В. Биоорганическая химия, 16,N0 1, 34-40 (1990).

3. Е. И. Прокуронова, К К Хлебникова, Г. А. Желтухина, Р. Е Евстигнеева, Ю. А. Семилетов, В. А. Карпова, Т. И. Калинина, Ю. Е. Худяков, Р. П. Павлюченкова, 'К Д. Смирнов. Синтез пептидов рге31- области белка оболочки вируса гепатита В и локализация антигенной детерминанты. Биоорганическая химия, 17, N0 11, 1500-1509 (1991).

4. Ю. А. Семилетов, В. А. Карпова, Е. И. Прокуронова,В. Д. Смирнов, Р. а Павлюченкова, Т. И. Калинина, Ю. Е. Худяков, Г. А; Желтухина, Р. П. Евстигнеева, Синтез и иммунологические свойства пептидов из белков вириона вируса гепатита В. Итоги науки и техники. Сер. Вирусология, ВИНИТИ, т.22, Вирусные гепатиты. Материалы .международного симпозиума. Ростов. 3-8 сентября 1990 г. , стр. 68-69.

5. В. Д. Смирнов, 1й А. Семилетов, В. А. Карпова, Р. П. Павлюченкова, Т. П. Оспельникова, С. 0. Вязов, Е. И. Прокуронова, Г. А. Желтухина, Р. К Евстигнеева, Антигенные свойства пептидных фрагментов НОАд., Итоги науки и техники. Сер. Вирусология, ВИНИТИ, т. 22, Вирусные гепатиты. Материалы международного симпозиума. Ростов. 3-8 сентября 1990 г. , стр. 101-102.

6. Ю. А. Семилетов, В. А. Карпова, В. Д. Смирнов, Р. П. Павлюченкова, С. О. Вязов, Иммунологическое картирование вирусных белков с помощью синтетических пептидов (на модели дельта-антигена), Сборник "Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии", Институт вирусологии РАМН, Москва, 1992. Стр. 40-48.

7. Р. К Евстигнеева, Е. И. Прокуронова, Г. А. Желтухина, В. Д. Смирнов, КХ А. Семилетов, Р. П. Павлюченкова, С. О. Вязов, Применение синтетических пептидов для исследования антигенной структуры белка вируса гепатита дельта, Всесоюзный симпозиум по химии пептидов, Тезисы докладов. Рига, 1990. Стр. 44.

8. Ю. А. Семилетов, Е А. Карпова, Ю.Е. Худяков, Р. П. Павлюченкова, С. 0. Вязов, Е Д. Смирнов, Е. И. Прокуронова, Г. А. Желтухина, Р. П. Евстигнеева, Синтез и антигенная активность пептидов белка нук-леокапсида вируса гепатита дельта Биоорганическая химия, 18, N0 2/ 252-262 (1992).

9. Е А. Карпова, К1 А. Семилетов, Е Д. Смирнов, Р. П. Павлюченко-

ва, С. О. Вязов, Возможности использования синтетических пептидов для диагностики вирусного гепатита дельта. I Съезд иммунологов России. Тезисы докладов. Новосибирск, 1992. Стр. 203-204.

10. Ю. А. Семилетов, В. А. Карпова, В. Д. Смирнов, С. 0. Вязов, Локализация иммунодоминантного сайта в составе антигена вируса гепатита дельта с помощью синтетических пептидов, Биоорганическая химия, 19, No 3, 277-285 (1993).

11. В. Д. Смирнов, 0. В. Сергиенко, Е. А. Скрипкин, А. Г. Дубичев, КГ. Лунин, Е Г. Григорьев, Т.И.Тихоненко, Синтез и экспрессия фрагмента ДНК, кодирующего антигенную детерминанту белка поверхностного антигена вируса гепатита Е Биоорганическая химия, 9, No 10, 1388-1394 (1983).

12. 0. К Сергиенко, В. Г. Лунин, Е Д. Смирнов, Т. И. Тихоненко, Синтез и экспрессия фрагментов ДНК, кодирующих эпитопы поверхностного антигена вируса гепатита В, в клетках Escherichia coli. Молекулярная генетика, 9, 39-42 (1989).

" 13. Yu. Е. Khudyakov, V. S. Neplueva, T. I. Kalinina, V. D. Smirnov, Effect of structure of the initiator codon on translation in E. coli. FEES Letters, 232, No 2 , 359-371 (1988).

14. Ю. E. Худяков, ЕВ.Самошин, Т.И. Калинина, В. Д. Смирнов, Конструирование повторяющихся последовательностей с помощью синтетических олигонуклеотидов. Тезисы Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии", Пущине-на-Оке, 1988, стр. 108.

15. М. Г. Исагулянц, ЕВ.Самошин, И. В.Макеева, В. Д.Смирнов, Эффективный синтез олиго(поли)дезоксирибонуклеотидов Н-фэсфонатным методом в пластиковой микроколонке. Биоорганическая химия, 16,No 7, 933-940 (1990).

16. M. Г. Исагулянц, С. Е Лучин, В. Д. Смирнов, Химический синте; и ферментативная сборка фрагментов ДНК, кодирующих иммунодоми-нантные эпитопы вируса иммунодефицита человека. Химия природных соединений, 3, 393-399 (1990).

17. R. Eritja, V. Smirnov, M. H. Car ut hers, O-Arylphosphoramidi-tes: Synthesis, reactivity and evaluation of their use for solid -phase synthesis of oligonucleotides. Tetrahedron, 46, No 3, 721 -730 (1990).

18. E Д. Смирнов, Полный химико-ферментативный синтез и исследование экспрессии в Е.coli гена белка нуклеокапсидз вируса

епатита дельта. Тезисы докладов I Всесоюзной планово-отчетной юнференции "Генная и клеточная инженерия", ноябрь 1990, Пущиной-Оке, стр.146.

19. Ю. Е. Худяков, Т. И. Калинина, В. С. Неплюева, В. Д. Смирнов, L И. Михайлов, ЕМ Жданов, Рекомбинантная плазмидная ДНК pCCG4, юдирующая синтез гибридного белка, обладающего антигенными !Бойствами внутреннего антигена вируса гепатита В -HBcAg и фер-¡ентативной активностью _/8-галактозидазы. Авторское свидетельство 1о 1490960 от 01.03.1989.

20. R Д. Смирнов, Конструирование и свойства гибридных белков ia основе HBcAg. Новые подходы к созданию антивирусных вакцин и даагностикумов. Тезисы доклада на международной конференции 'Фундаментальные и прикладные вопросы СПИД, вирусных гепатитов и 'риппа", Суздаль, 25-30 сентября 1988, стр. 38-39.

21. Ю. Е. Худяков, Т. И. Калинина, В. С. Неплюева, В. Д. Смирнов, Синтез в Е.coli гибридных белков, содержащих последовательности юверхностного и внутреннего антигенов вируса гепатита В. Мате-зиалы Всесоюзной конференции "Новые направления в биотехнологии", Пущино-на-Оке, октябрь 1986 г., стр. 80-31.

22. Ю. Е. Худяков, Т. И. Калинина, В. С. Неплюева, В. Д. Смирнов, Яспользование минимальных участков гена его фага лямбда для обеспечения транскрипции и трансляции гетерологического генетического материала в Е. coli, Сборник научных трудов "Актуальные вопросы общей и медицинской вирусологии", Москва, 1986, 2тр. 59-62.

23. И. В. Макеева, Т. И. Калинина, В. С. Неплюева, Ю. Е. Худяков, 0. П. Кадошников, Е Д. Смирнов, Конструирование и свойства гибридного оперона, кодирующего HBcAg- вируса гепатита В и бета-галак-гозидазу Escherichia coli. Молекулярная биология, 24, вып. 5, 1339-1350 (1990).

24.В.С. Неплюева, Т. И.Калинина, ЕЕ. Худяков, R Д.Смирнов, Экспрессия в Е. coli гибридных генов, кодирующих полипептиды npeS-(j-галактозидаза. Сборник научных трудов "Молекулярная биология и генетическая инженерия вирусов", Москва, 1989 г., стр. 5-7.

25. Т. И. Калинина, Ю. Е.Худяков, И. В. Макеева, Ю. П. Кадошников, В. Д. Смирнов, Конструирование и свойства рекомбинантных частиц на основе HBcAg и участков белка оболочки вируса гепатита В. Итоги

науки и техники.- Сер. Вирусология, ВИНИТИ, т.22, Вирусные гепг титы. Материалы международного симпозиума. Ростов. 3-8 сентяб] 1990 г., стр. 51-52.

26. Yu. Е. Khudyakov, Т. I. Kalinina, V. S. Neplyueva, Е. V. Sazii Yu. P. Kadoshnikov, S. L. Bogdanova, V. D. Smirnov, The effect of tt structure of the terminal regions of the hepatitis В virus ger С polypeptide on the formation of core antigen (HBcAg) particl« Biomedical Science, 2, 257-265 (1991).

27. M. Isagul iants, V. D. Smirnov, M.Sallberg, U. Ruder B. Vahren, S. Britton, HBcAg core particles, carrying HIV-antigenic determinants. Proceedings of the 3rd Kl/Ch Conference, april 2- 3, 1992, Solbacka, p. 60.

28. M. Isagul iants, U. Ruden, V. D. Smirnov, B. Wahren, Pepti immunogens comprizing HIV-1 B- and heterologeous T-ce] epitopes. 18-th International Congress of Chemotherapy, Stockholm, June 27- July 3, 1993, Accepted.

29. В. Д. Смирнов, M. Г. Исагулянц, Л. Л. Суханова, Т. И. Калинш А. Ф. Бобков, Ю. А. Семилетов, Т. В. Фирсова, Р. Е Павлюченкова, ГиС ридные белки направленной иммуноспецифичности: антигенные дете{ минанты ВИЧ-1 в составе b-Gal и HBcAg. I Съезд иммунологов Рос сии. Тезисы докладов. Новосибирск, 1992. Стр. 446.

30. Ю. Е Кадошников, В. Д. Смирнов, Е Е Грановский, Е. В. Газш Т. И. Калинина, С. М. Клименко, Исследование структуры генноинжене} ных HBs и НВс белков. Итоги науки и техники. Сер. Вирусологи} ВИНИТИ, т. 22, Вирусные гепатиты. Материалы международного симпс зиума. Ростов. 3-8 сентября 1990 г., стр. 50-51.

31. Т. Л Калинина, Ю. Е. Худяков, Р. Е Павлюченкова, И. В. Маке« ва, Ю. Е Кадошников, С. О. Вязов, В. Д. Смирнов, Создание гибридш белков с заданными иммунологическими свойствами на основе бел} нуклеокапсида вируса гепатита В. I Съезд иммунологов России. Те зисы докладов. Новосибирск, 1992. Стр. 197.

32.Т.И. Калинина, ЕЕ. Худяков, И. В.Макеева, Ю.Е Кадошникс Е Д. Смирнов, Конструирование и свойства рекомбинантных част* HBcAg вируса гепатита В, несущих иммунодоминантные зпитопы preS области этого вируса. Материалы I Болгаро-советского симпозиук по вирусным инфекциям, 8-10 октября 1990 г., София, стр. 86-87.

Информация о работе

Смирнов, Валерий Дмитриевич
доктора биологических наук
Москва, 1993
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Гибридные белки программируемой иммуноспецифичности ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гибридные белки программируемой иммуноспецифичности"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гибридные белки программируемой иммуноспецифичности
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология