Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение поверхностного антигена вируса гепатита В и иммуногенности поксвирусных рекомбинантов, экспрессирующих этот антиген

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение поверхностного антигена вируса гепатита В и иммуногенности поксвирусных рекомбинантов, экспрессирующих этот антиген"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ ИМЕНИ Д.И.ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи УДК 578.56 : г578.82Е.51+578.891

ГРИГОРЬЕВА ИРИНА МИХАИЛОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕЖГИГА В И ИММУНОГЕННССТЙ 1ЮКСВИРУСННХ РЕКОМБИНАНГОВ, ОКСШЕОСМРШЩХ ЭТОТ АНТИГЕН.

(03.00.Со - вирусология) •

Автореферат диссертации ка соискание ученой степени-кандидата биологических наук

Москва 1992г.

рчбота выполнена в Институте зтщемиологаи и микробиологи им.Н.Ф.Гамалеи Российской АМН и Инстк.уте биологии гена РАН.

Научные руководители:

' ДОКТОр №?Щ№УШ. Наук, ПрОфеСС-Ор В.Я.ЕеВЛлГИН кандидат биологических наук В Л'. Григорьев

Официальные оппоненты: дог^ор -биологических наук, профессор В.М.Зайдес доктор медицинских наук В.И.'Черное

Ведущая организация - Институт полиомиелита и вирусных энцефалита Российской АМН.

Защита диссертации состоится ^... 1992?. в "/часов на заседания специализированного совета при Институте вирусологии да.Д.Й.Мзаиовского Российской АМН (Москва, 123033, ул.Гамалеи, 16)

зтореферат разослан " ..

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке институте.

Ученый секретарь опешализйроьанного совета

йакдздат медицинских наук А.М.йСуконский

ОБЩ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность про&яеш. Впус гепатита Б (нву) является озбудителем тяжелого инфекционного заболевания, поразащего ече.л> человека. По .оценкам ВОЗ более 300 млн. человек в мире зляются хроническими носителями этого вируса. Зшдемиологаческие энные о распространении этого заб левэния в СССР достаточно эотиворьчивы. Есть сз'едёшя, что в СССР- ежегодно заболевают фусными гепатитами до 1ши. человек, при этом, доля больных шататом В составляет около 133. Особенно ваяна возможность --редачи вируса новорсаденчым от нву-позиткбных матерей. По данным ■гдоИз у 70-80? детей, рожденных в США от матерей-носительниц, >гистрируется наличие нву. Эщцемиологйческке исследования одеможприровали, что возникновение гепатоцеллвдярной карциномы, ного из наиболее распространенных в мире онкологических оолеваний мохет являться следствием нву-носительства. В стоящее время нву . зляется одним из немногих вирусов, участие горых в развитии онкологического заболевания доказано.

В связи с выиеталокенным огромное значение приобретает ?р8ботаа новых вакцин против гепатита В.- нву не способен штибно' размножаться в клеточных культурах,. что- существенно юаняет создание протавогепатитной вакцины.; Сув^стбувдая в ¡тоящее время плазматическая вакцина из ийаз*ы хронических -носителей, наряду с нвсомнвнньми достоинствами имеет, ряд эствеккых недостатков, что и определил-» 4 ^звитее нового раэления - разработки рзкомбинантной про'»©огепат>шой вакцины, настоящее время сконструировано несколько вариантов омбинатяой вакцины против нву, основанных на использовании шей дня синтеза в них вирусного, антигена, , либо на эльзввании з качестве вектора: клуса, зкспреосирувдего белки . Особый интерес представляет возмохнос'ть создания к-инженерной яизой вакцины против гепатита В к" основе одного представителей семейств? иоксвируеов - вируса 'осповзкцина.

Основой для всех существующих вариантов противогепатшноЗ вакщшы сдайт позерхностаь® антиген В1фуса гепатита В (нвгАд) который является , одним из ключевых, антигенов, щщирущж выработку в организме вирус-нейтрализущих антите*. Поэтому особы» интерес представляет .изучение антигенной структуры белков, входяпщг- в "состав поверхностного антигена в частности, соотношение различных знтигенньи. детерминант квэдд. По-вщ'мому, • рекоыбинантаьй протиьигепатшные вакцины следущнх поколений буду! осн.заш чв использовании различных компонентов нвзАд или из отдельных доменов, несущих наиболее •■ существенные антигенные де.ерминанты. .'••'..'•'

Цель и задачи исследования. В задачи проведенного нами исследования входа.

1.Изучение антигенной структуры и соотношения между антигенными детерминантами поверхностного антигена вируса гепатита В.

2.Анализ имадуногекности препаратов нвэдд, полученных из , сыворотки крови человека и рекомбикантного дрожжевого штамма.

3.Сравнительный анализ иммукогенности разных вариантов рекомбинантных вирусов ооповакцины, экспрессирущих нвгдд.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результата проведенной работы нами был впервые разработан комплекс вариантов кммуноферментного. анализа (Ш), позволяющий выявлять дао важнейшие антигенные детерминанты . нвздд (а- . и ргеза-детерминанты), участок связывания г. полиальбумином и их соотношение в природном и рекомбшантаом нвздд, а также антитела к этим детерминантам и к белкам вируса осповакцины.

С домощьэ описанных вариантов ЙФА впервые была обнаружена и иг~чена гетерогенность популяции нвэАд-содержащих частиц . в сыворотках человека по содержаний полизльбумин связывавдих участков.На основании анализа птой гетерогенности предлохена новая

юдель взашГ'Двйстзйя рг^зг-содвргаара.'--- •'' частиц. . нвгдд с ш«м*ризов&ннш сывороточным альбумином '• человека..

Описанные варианта УМ использована для/оценки иммукогенности оксвирусных рекомбинантов, эксьрессирущих нвзАд. в результате равнительного анализа имкуногекноста . семи . вариантов 1

ЭКОМбИНаНТНЬЕ ВИРУСОВ ос-ПОВаКЦИНЫ (РВОВ), ЗКСПрЗССИруЩИХ НЗзАд, отношении антигенных дв^эрмйгтет. нвяАд.':--и., белков вируса яюваюлшы, показано» • что РБОЗ, сконструировэнше на основе ймма V®, более иммуногенны дяя. мышей,.чем РВОВ на основе, штамм*. з1©г; ТК+зарианты РВОВ более иммуногенны, чем пГварианта. ишчив ргезг-области в составе' -гена, . эйспрессируемого комбинатом,, снижает-шдакщт антател к а-детерминанте нв?:Ад, но дуцирует образование антител к рг¿52-детерминанта \HBsAg. При авнешш иммуногенности семи вариантов РВОВ обнаружена корреляция вду накоплением антител к . белкам. Вируса осповащины и юшгешем антител к зкспрессируемому РВОВ нвэАд.

Разработанные варианта иммуноферментного анализа могут быть юльзовэны дая анализе содерзвния- антигенных детерминант в каратах нр-дд5 применяемых для вакцинации, ' а ' также дая ©нительной оценки иммуногенности различных типов рекомбинантной »тивогепататной вакцины. Данные по сравнительной иммуногенности иантов РВОВ» экспрессирущих нв*Ад, могут быть использованы при оре наиболее иммуногеннкх штаммов да вакцинащш.

Основные положения, выносимые на защиту.

I.Разработаны варианты дамунсферментного анаЙЯза, позволящие •гчественно .оценить наиболее важные антигенные детерминанта 1,д (а к р'гс-зг) и участки связывания с ПОЛИЭЛЬбуМИНОМ в гаражах природного и рекомбинантного кбзАо, а такке антитела к

2.Обнаружена к изучена гетерогенность . популяции з-содержащих частиц в сьворотках больных гепатитом В з

отношении активности шлиальбумин связывапцих участков. } основании анализа этой гетерогенности предложена новая MOflej взаимодействия ргезг-содераащих частиц HBsAg с полимеризованш сывороточным альбумином человека.

3.Проведен сравнительный анализ иммуногенности различи вариантов рекомбинантного вируса осповакцины, зкспрессиругащ HBsAg, в результате которого показано, что иммуногеннос рекомбинантных вирус з осшзакцины зависит от птамма ь»;ру< -ве" -opa, от его ТК-фенотша и от размеров встроенного ген: При сравнении иммуногенности семя вариантов рекомбинанткых вирус< ■ осчовакцины обнаружена корреляция между накоплением антител белкам вируса осповакцины и накоплением антител к зкспрессируемо! вирусом HBsAg,

Апробация работы. Материалы диссертации были долохены : конференции "Новые направления биотехнологии" в г.Пущино в 1992г Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совмести „ конференции Отдела структуры и функции. микроорганизмов Институ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН и Лаборатор генетики вирусов Института биологии гена РАН 18 марта IS92r.

Публикации. ПО материала?' диссертационной работы опубликова 3 работа.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит введения, обзора литературы, {экспериментальной части, вкшочащ методический раздел, результата собственных исследований с Осуждением, выводов, а тякке раздела библиографии. Общий объем работы составляет 100 страниц машинописного текст ззишчая 7 рисунков и 10 таблиц и библиографир - 134 чстсчнк отечественной' и зарубежной литературы.

. v

\ 1

СОДЕШНЙЕ РАБОМ..

I.Изучение антигенной структуры чвгдд, содержащего ргезг-область из сывороток больных гепатитом В" :

Ищуноферментай анализ препаратов нвзАди .;'

С помощью пята вариантов" ш'рдофазного иммуноферментного анализа (ИФАэр схематически представленных на , рис.1, были проанализированы количественные соотношения меяду антигенными детерминантами s-домена - a-детерминантоЗ (а-Д) и press-домене -ргвзг-детерминантой (presz-Ji) и участком. связыващим полкмеркзованный сывороточный альбумин человека (phsa-СУ или par-сайт), в частицах поверхностного антигена вируса гепатита В (нэзАдэ яз сьвороток больных с острым гепатитом В.

Тестаруешэ HBsAg-содержазре препараты во всех вариантах ЙФА бь-ш вторым слоем сэндвича. Варианты Шк 1-3 служили да анализа, тотальной попухяши частщ HBsAg, так как антиген адсорбировали на шаншеты за счет ¡»мобилизации нэ них антител против

i-ДеТерМИНаНТЫ hbsag, КОТОраЯ ПрИСуТСТБуеТ ВО ВСеХ "«ЗСПЩЗХ kbsag. Зэрианты ИМ 4 и 5 слушай для характеристаки par-сэйт -зодержапшх субпопуляций частщ антигена, так как в этих системах ШзАд адсорбировали на планшеты за счет его взаимодействия о мобилизованным на них полимэризованньм сывороточным альбумином [еловекз (phsa).

Для выявления а-деТер№ш8нт в в8| ингах Шк I и 4 юпсльзовали меченные пероксвдазой хренз моноклональвыэ мышиные 1нтит&та против а-детершнанта нвзАд (клон 22), предоставленные ¡.Эльдаровьм /Центр "Баоинаерерия" „ Москва/. Для выявления гйзг-детеминант в вариантах ЙФА 2 и 5 использовали монокдонэлъные мишые. антитела против ргезг-детермшант, любезно предоставленные . Bud^owska /Sudkovska С C0SBT. ХЭШ/, И МеЧвКНЫе ПерОКСВДЭЗОЙ репа кроличьи антитела против дащюглобулир^в о мыш. Для

выявления, участков связывания с. полиальбумином в варианте ИФА. использовали рнза и меченные пероксидазой хрене кроличьи антител против рн£а.

ПК

¿1НТМ

' а-Д

! ПК"

ант • мыш^АТ

I ПК

.анг.и ргеБ2-Д

У

анти ■ РНБА

РИВЙ

| НЗзАд } (НР -Ад } [ ИВзйд

ПК

ащи. а-'Д

ПК

анти

мыш.ат

анти ГгеБ2-Д

1 анти анти 1 анти

| а- Д а-Д 1 а-Д

1 •-1 •3

/ \

НВиАд ) ^НВзАд \

РНЗА • | РНЗА '

4

Ркс. I. Схема вариантов 1ФА для выявления антигенных детерминант популящях нвчад,

Варианты 1-3 используются для анализа тотальных популяций нвгдс На планшеты адсорбированы антитела морской свинки лпротг обработанного пепсином нв^ао. В вариантах 4-5 анализируете ^АК-сайт содержаще субпопуляции не^аз . На планшеты адсорбировг полимг'-изеванъцй сывороточный лъбумин человека (ркза). "нвзАд"препараты нэ^Ад; "11К"-пероксвдазньй конъш

Были проанулкзирсваш три сьеоу'м'ки больных с острой ферме гепатита В в оушшнаг пяти вариантах ш.^оферментеого анализа I

^ э

.4

зределено относительное содержание . . а-детерминант, ■ е32-д9'1 ерминант и полиальбумин связыващих участков в 'различных ЩЛЯЦИЯХ частил НВэАд из этих сывороток. \

Чтобы ИСКЛЮЧИТЬ возможное^ ТОГО, ЧТО на частицах НВгАд ^-сайты блокированы альбумином', содержащемся в сыворотках, что эль*ю бы недостоверными, результата Ш.' в вариантах 2,4,5, мы юанализировали сыворотки- в' варианте ИФА 3 , без' 'обработки )рбировакных частиц полиальбумином. ""о всех трех сыворотках ш не 5нзррилИ связанного с частицами нв=Ад полиальбуминз." . .

Чтобы исключить потенциальнув вероятность того, . что на ютицах нвэАд присутствуй1 участки связывания' с полиальбумином, стивность которых определяется . не . наличием. ргезг-доменов,' а жим-либо другим . доменом юлкпеггщца, что пркзехо бы к юднозкзчной интерпретации результатов, : мы определили щурирувдую . активность мококлонзлькых антител . к :&2г-детерминанте- нвзАд, использовании в вариантах ИФА 2 и 5, в }рианте 1ФА 4. Мы обнаружили, ' что, эти ентитела- полностью давляют пожальб^да-связьвающую"; активность . нвзАд-содерхащих !стиц . из сывороток А и В. Таким . образом, 'активность шальбумин связьсавдих участков определяется, тол1 "со наличием в эстицах нвзАд ргегз-доменов.

Сыворотка В была выбрана в качестве стандарта, так она юявляла максимальную активность. во -всех Системах ИФА. Уровень стиеностй .. . а-детерминант, рге'зг-детерминант и хлиальбумин связыващих участков в этойсыворотжз принимали за Ш. Для кэдой сыворотки мы- анализк.уовг)л^ 6 двукратных эзведений начиная с 1/100_в каждом из вариантов ИФА. На основании алибровочных кривых,- построенных по результатам титрования .воротки В, мы определили относительные содержания • (ОС) -детерминант, ргезг-детерминант и пелиальбумин овязыващих ¡астков для анализируемых сызорсдж. В каждом, варианте КФД. ОС «ражсли в % от соответствующей активности сьворотки В в этом шанте КФА. Полученные результата представлены в Таблице I.

- ю

' Таблица I

Относительные содержания (ОС) а-Д. ргез^-Д к рнза-СУ б частицах нвзад из раЗНЬЕ СЫВОрОТОК®.

нв^Ад ¿Тестируемый Вариант Относительное содержание (ОС) адсорбмро- домен №к в сыворотке

ван на - А в с .

антителах

К э-Д 1 67,23* 100% 81

ргеэг-д 2 22, о* 100 У. Зв,0'4

РНЬ-А-СУ 3 19.7% 1 "0 %

РНЗА *-д 4 46.4Х 100°/, 74, ах

рге£2-Д 3 35,3*/. 100% 71,4%

"Зодерааше кавдого домена нвзАд в,каждом варианте ИФА принимали за 100? для сыворотки В.

Для интерпретации втах данных мы ввели '4 константы (К1-К4), представленные в Таблице ?,. Величины констант определяли на с човаккк данных трех независтк экспериментов. Константа К1-КЗ характеризуют свойства тотальной популяции нвзАд, так как все частицы нвзАд содержат а-детерминанты и сорбируется на »мобилизованных на планшетах антителах против обработанного пепсином нв^Ад. Константа 4 характеризует свойства субпо^лядаи ивзАд-содержащих частиц, вдоорбирущихсл на полиальбумине, иммобилизованном на планшетах.

Данные по К1 указывает "а то, что поверхностные плотности ргезг-дэтермшакт з тотальной популяции нвв^д-содержащнх частиц ум-мстся в ряд' сывороток б>оа. Даинь!© по константе К2 свидетельствуют о том, что средние поверхностные плотности полззальбутлш-свяБЫваззэдж учас1.-:оз б таком :«е порядке уменьшаются

. 1 П

ш тотальной популяции нвэАд. Кек следует из 'таблицы 2 сонстаьхы . К1 и К2) средние поверхностные плотности ■е£2-детерминант и участков связывания с полиальбумином ¡злкчаются в тотальных шпулячиях нвэАд-содержащк частиц из юных сывороток. Так как мы не обнаружили прямой корреляции мезду Вк.рхностаыми плотностями рг-детерминант и рак-сэйтов, о чем щетельствует разница в КЗ, полученные наш давдые позволяют ¡эдположить наличие, по крайней :ере в сыворотках. А и С, г6клессй ргезг-детерминэнт, не участвущего в формировании &-сайтов.

Таблица 2

мстанты, характеризующие соотношения между рге^-Д и

РЬКА-СУ В частицах НВгАд из разных сывороток®.;'

^Ад ' ^орбире-!Н на Соотношение относительных содержим сОС) Константа А ; Сыворотка-'в с

пителах

а-Д рг еЭЗ-Д/а-Д К1 0.41 1,00 0.52

РНЗА-СУ/г-Д гС2 0.34 1,00 0,41

РНБА-СУ^ргега-Д КЗ ,0.87 1.00 0.80

ЭА огв^-Д/а-Д К4 0.8? 1,00 0.91

онстанта I (К1) = ОС 2 (ОС в варианте Шк 2)/ ОС I, константа 2

2) = ОС 3/ ОС 1, константа-3 (КЗ) = ОС 3/ ОС 2, константа 4 = ОС ОС 4, Константы К1-КЗ отражают поверхностные плотности а-д, еаз-Д и соотношения мелду рнза-СУ и ргдяз-Д соответственно в тальньк популяциях частиц не. Ад. Константа К4 отражает верхностную плотность рге5г-Д в частицах, адсорбкрс-зашгых на

2А.

Отличие коэффициента K4S отрйзкащбго среднюю относительную поверхностную щютаость press-доменоз в частицах нвзАд, адсорбированных на. планшетах за счет взаимодействия с иммобилизованным phsa, от коэффициента KI по и^^йней мере „ля сывороток А и 0 также свидетельствует о гетерогенности популяций частиц HBsAg в исследованных сыворотках. Значения К4 для трех сывороток значительно ближе дру^ к другу, чем значения KI, что позволяет предположи: что субпопуляции par-сайт содержащих част ц HBsAg более гомогенны в отношении поверхностных плотностей presa-домэнов, чем тотальные популяции антигена.

Для проверга етж предположений мы использовали методы хроматографии.

Хроматографический анализ препаратов нвзад из

сывороток больньк"

Была проведена аффинная хроматография нвчАд-содержащкх сывороток на полшэрвзованном сывороточном эльбушше человека, ковалентао мобилизованном на сорбенте toyopeari hw ?в. нвзАд-содерхащие частица, не связавшиеся с сорбентом, ь^ализировали в вариантах ИМ 7\2,4 и Б. Результаты такого анализа представлены в табл.З. Как видно из таол.З (KÍA вариант I), относительное содеркзнив не связавшихся с полиальбумкном частиц различается в трех тестируемых сыворотках, и увеличивается в ряду сывороток В>С>А от 0,6% до 101. Креме того, при сравнении данных ®А вариантов I и 2 в табл.З видно, что относительная активность preS2-детерминант в этих образцах: ниже, чем относительная активность а-детерминант. Пс -видимому, поверхностная плотность ргезг-детерадшант в не связавшихся о FUSn-Toycpeari частицах ниже, чем в тотальных популяциях нььАд. Наличие во фракциях не .связавшихся с PHSA-Toyopeari частиц антигена, (в случае сывороток А и С)способных к взаимодействию с иммобилизованным на планшетах

полиальс„мином (Табл.3, ИФА варианта 4'; и 5).. может быть обусловлено меньшей аффинностью полиальбумин сйязывайрх участков в определяемых частицах к рнза, иммобилизованному на тоуоРеаг1. по сравнении с аффинностью к рнба, иммобилизованному на планшетах.

Таблица >3.

Относительные содержания а-д, ргеьг-" и рнза-сУ в нес:связавшихся с

Р|,2А-Тоуореаг1 чаСТИЦ8Х НВэАд ИЗ раЗЛИЧНЫХ СЫофОТОК*.

нвэАд Тестеру- Вариант Относительное содержанке в адсорбиро- емый Ш сыворотке.

ван на домен А 3 с

антателах •

к *-Д а-Д 1 10,05« , ■' 0.6У. а. 5'/.

ргезг-^ 2 7.5* .. 0.3« 3,054

РНЗА а-Д ■. 4 1,054 <0,1И 0,3 У.

рге32-Д 5 1.0 У. : <0,1* 0,3 я

'Данные представлены в виде % от содержания соответствующих доменов з исходных сыворотках.

Результаты аффинной хроматографии на РН5А-Тоуореаг1 однозначно свидетельствуют о тем, что популяции частац нв^дд в сызоротках гетерогеши, то есть, по крайней мере в сыворотках А С, содержались частицы, взаимодействущие с рнзл-тоуореаг!, и не взаимодействующие с ним частицы нэ^дд.

Чтобы .определить, соответствует ли обнаруженная нами гетерогенность • гетерогенности морфологических форм частиц, содержащих квгдд, мы разделили по размерам частицы нвэлд из тестированных сывороток с помощью гель-фильтрации на колонке с Тоуоре%г1 ну 75. Полученные фракции анализировали в вариантах РА

I, 2 и 3. Пик нвз Ад-содержала чьитац во всех тестированных сыворотках соответствовал одному и тому же объему элщли Более того, мы не обнаружили существенных различий б поверхностных плотностях ргезг-детерминант и ра~ -сайтов во всех чваАд-содергрчих фракциях для каддой из сывороток,, подвергнутых гель-фильтрации. Эти результаты указывают на то, что гетерогенность популяций частац нваАд в отношении - ргеЗс детержнвнт , и псшальбумин сзязызащих участков, по-видимому некоррелкргзт с гетерогекностьв морфологических форм атих; частиц в популяциях. Скорее зсего, имеет место гетерогенность частиц • одинаковых размеров. Учитывая денные конкурентного ИФА, юноутверхдать, что' рвзличия в активности ' полкальбумин свягывзщих ; участков в тестированных. сыворотках отражают различия в ;; активности ргезг-детерминант в еж сыворотках.

Модель взаимодействия ргезз-ссдераада частиц квзАд

с полиыеризованным сывороточным альбумином человека".

Исходя из того, что статистическое распределение а-детергшаят мазду частицами нвэАд во всез трег сыворотках одинаково , можно предположить следущне модели раснрвдаябиш г^еза-детерьшант к рдзг-сайтов мввд частицами: ,

1) Ве каждой сыыротке присутствует гомогенная популяция частиц НЗэАд <3 0дш8к0вымй ■ , ПОВбрХНОСПШй , плотностями рге22-дотер-шаит и полиальбумин связываниях участков.

2) Кавдая сыворотка содерда по 2 тала чвстац: частиц- чвзАд, содержащие а-детерминанты, рг езг-детерминанты и рак-сэйты, а также частацы, содержащие только а-детерминанта. Исходя из етой модели, количественные различия н активности отдельных доменов нвзАд мехду сызоротками определяется различными седтношешямк двух типов ч; птиц в сыворотках.

3) Каадая сыйоротка содержит гетерогенную популяцию частиц с различима соотношениям« мех,(¡у. . а-детермташггами,

ргезз-детерминантами й рай-сайтами.

Данные анализа частиц, адсорбированных на иммобилизованном на аланшетах палиальбумине, ' позволяет исключить модель I. Если зредаложить, что в каждой сыворотке содержатся гомогенная юпуляция нваАд, поверхностная плотность'- рг е22 -детерминант в готальной популяции частиц не должна отличаться от таковой в зубпопулявди, адсорбироЕтакой на полиальбумине, Однако, данные ИФА 5 хроматсгр&фического анализа опровергает это ¡редположение.

Скорее всего, гетерогенность популяции частая нввАд соответствует модели 3, а не нодели 2, тек как частицы квздд, ке зязбвшиеся с РНЗА-Тоуорэаг 1, - содержали ргезг-двтермйнанты Табл.3, Шк вариант 2).Эт.. данные делают маловероятной модель 2 я оззоляют- предположить, что аффинность рг^гг-ездзржавц г частиц эзаз к полиэльОумкну ззвиеггг от поверхностной плотности': ге2й-детерминант на- этих частицах, т.е. что для высокоаффинной дсорбции частиц ивзав на палиальбумине необходимо одновременное займодэйствие нескольких ргезз-детермккакт с несколькими слекуламд альбумина.

Это положение лжет быть описано еледгщей гипотетической эдеяъю: каадай ргезг-домен частицы ШвАд имеет араяностъ к зцептору на монэмэрной молекуле сывороточного альбумина человека э аффинность взэимодейстбкя мезду отдельным ^вза-доменоч к эцептором к нему на молекуле альбумина низке. В результате эдимаризацаи альбумина образуется полимеркзованньй сывороточный аьб^шн. имещий высокую поверхности}» плотность рецепторов к •®зг-домену. Поэтому частицы нвзАа с высокой шотностьп эза-детермикакт адсорбируется на шлкальбумине в результате оперативного взаимодействия дахду рг*зз-детерминантами и ¡Цепторами для них на полиальбумине. Частицы нвяАд с )30рХН0СТК0Й ПЛОТНОСТЬ® ргеЗ£-Д9ТерМКНгНТ Б38ИМ0ДейСТБУЮТ с

йыиим количеством рецепторов ка полтальбуминз и нмек. менызуз финность к нему.

ч16

»

кругами словами, взвш>дбйотьйе мезду нв^дд и полиальбумиксм ' является результатом кооперативного взаимодействия между индивидуальными рг еэ-детерминантами и рецепторами к ним на индивидуальных молекулах сывороточног- альбумину, вход дих в состав и тиальбумша.

Природа описанной нами гетерогенности популяций нвзАд неясна. Мы считаем, что поверхностная плотность ргезг-детерминант на частицах нвз^ может зависать либо ог штамма инфекционного вируса, либо от фазы инфицирования вирусом гепатита В. В первом случае эта величк 5 можэт служить для туширования инфекционного вируса, а во втором для определения фазы инфицирования. г

Для определения возможности использования наших данных в клинических исследованиях в настоящее время проводится анализ Н05.;д из сывороток хронических носителей нвзАд.

г.йдазг'огенность 'решратов рекомбкнантсого нвзАд и поксвирусных рекомбинантов, зкспрессирущих нвздд.

Для изучения иммуногенкой активности препаратов нвэАд и поксз>фусньс рекомбинантов, сконструированных на основе вируса осповакцины п зкспрессирущих нвздд, бьш использован простой и де^вый подход - иммунизация мыней. Мыши были иммук зированы интраперитокеалько инокуляцией либо десятикратных разведений вируса, либо двукратных разведений препарата очищение?о антигена. Для опенки иммунного от га были разработаны варианты кммуноферменгного анядаа (ИФА), схематически представленные,, на рис.2.

Для выявления антител против антигенов вируса осповакпины (ВОЗ) на планшеты адсорбировали концентрат вкрионоз ВОЗ, штамм м? (ИФА,, вариант I). Наличие в исследуем' препаратах сывороток антител против антигенов ВОЗ выявляли меченными перокевдазой хрена аффично очкщенньш кройиькмк антителами против изогни глобулинов

шш.

Для зыяЕлекия антител против s-белка на планшета (ЙФА, вариант 2) адсорбировали поликлокзльные антитела морской свинки против обработанного пепсшом ' iBsAg, а затем обработанный

U2LJ

1 2 з

Рйо.2 Схема- вариантов иммукоферментного анализа для выявления антител к белкам вируса осповакцины (I), ..-белку (2) и рга->: области HBsAg (3).

phsa - палимэризованньй сывороточный альбумин {вдовека, ПК -пероксидазный конъюгат.

трипсином HBsAg. Наличие антител против s-белка в тестируемых сыворотках определяли с помощью меченых анти-ввдозых антител как описано вьше для антител к ВОВ. ;.

Для определения антател к preS2 фрагменту HBsAg использовали зпециально разработанный зариант конкурентного ИФА (вариант 3). На слашеты адсорбировали полидеризованный сывороточный альбумин ' человека /наг-sson. Ригели ,1979/, а затем, добавляли смесь, содержавшую тестируемые оызоротаи, ргеза-аддерадший .resAg и «ноклональные антатела претив s-белка. Связ^выиеся мышиные

антитела определяли как описано выие. Если исследуемая сыворотка содеркала антитела к preS2 области нвзАд, антиген и связавшиеся с ни?' мышиные антитела удалялись при отмывании, чти регистрировалось

по уровню выявляемого в лунке мьпшного гамма-глобулина.

■. ъ

Сравнительная иммуногенность препаратов рекомбдаангаого f дрожжевого HBsAg и нвзАд из плазмы крови человека.

Было приведено сравнение нммуногенноста препаратов нвзАд, выделенного из сыворотки больных гепатитом В8 и нвздд. экспрьосируемого в дрожжах, в опытах на мышах. Очистку препаратов плазматического и дрс левого нвзАд проводали методами скоростного-центрифугирования и колсночной хроматографии. Для иммунизации -мышей были использованы 6 двукратных разведений препаратов HBsAg,, начиная с 5мкг/мь»чь. Результаты анализа полученных мьшных сывороток в варианте 2 ИФА (рис.2) для выявления антител к- s-белку представлены в табл.4.

1 Таблица 4.

Зависимость образования антител против дрожжевого и плазматического hbsa. от дозы вводимого антигена.

Иммушзирущая д'за (в мкг) Ишушзирущий аффект** 5 2,5 . 1,25 0,625 IDJra

Плазматический HBsAg - 6Л0 6/хО 2Л0 2/10 2,5

Дрокжевой HBsAg ЗЛО 2Л0 1/10 5,0

г)

'числитель - мыши, в сыворотках которых появились антитела к KBsAg* знаменатель - общее количество использоьанных мышей.

На основании полученных данных были рассчитаны по Риду и :нчу иммунизирущие дозы (iD«r0) для препаратоЕ

[азматического и дрожжевого нв*дд. ю£0 для плазматического ьвзас -.азалась равной 2,5мкг/мьшь, а для дрожжевого нв<гАу - 5мкг/мышь. ши рассчитаны титры объединенных сывороток для каждой группы-алей. В обоих случаях наблюдается корреляция между дозсь одкмого антигена и пг^ом образующееся антител. Эффективность ¡мунизации в обоих случаях примерно одинакова, хотя в случае азматического KBsAg несколько ниже, чем в случае дрожжевого sAg. Этот факт ЮЖНО Объяснить другим ЛШВДНЬМ составом и другим исозилированкем HBsAg, получаемого - в дрояжезой системе спрессии. Но в ц&том можно гозорить о том, что аффективность мунизации плазматическим дрожжевым KBsAg примерно составляет 5-5,0мкг/мье'ь.

Иммуногенность рекомбшшнтных вкусов оспозакцины,

зкспрессирущих поверхностный анiиген вируса гепатита В.

Бьиш изучены иммуногенные сзойсгеа различных вариантов комбинантаых вирусоЕ осповащины (РВОВ), зк арессирущих нв=Ад. пользованные в работе варианты РВОВ различались mow собой по ?м характеристикам: вирус-вектор (исходный итэмм ВОВ), пользованный при конструировании РВОВ (штаммы w и ustor), это встройки в шксвирусный геном (Hind ni J или f фрагмент), гроенный ген (s-ген, кодирующий г-полипегпид нвзАд, или presa-s-4, КОДИРУЮЩИЙ ■ М-ПСЛИПеПТИД HBsAg, КОТОрКЙ содержит preS2 пасть) (см. табл.5). Была проведена иммунизация мьгаей четырьмя зледонательными десятакратнь'ми разведениями, начиная с Ю8, •сдым вариантом РВОВ. Для выявления в сыворотках антител претив-» f гигеноз ВОВ, против s-белке и presa-octóacni hbsa& &!ли тользованы одосанные ¡зарюнты ИФЛ (рис.2)..

Таблица 5.

,. Характеристика РВОВ, использованных в работе

РВОВ Исходный вирус Чужеродный Место г-"-; встройки CHBVO «"HindlII Фр.) тк фенотип Относительная продукция HBsAg

W-HB32/J WR s J тк" 2.2

L-HB32'K Lisie s К 1.0

va s , F тк 3.5

L-HB32/F Lister с • тк+ 2.5

V-preS2/J WR preS2-S J тк" , 3.2

W-prel_/F WR preS2-S. F . ■ ^ 2.9

L-preS2/K Usier pi eS?.-S К ' тк" .. .í.S4-

Hincilll j фрагмент генома штамма wr содержит ik ген и идентш'ен Hírdlll к фрагменту геномя штамма Usier.

В табл.6 представлены результаты сравнения ю/мунизирувдей , Таблица 6

Индукция антител к ВОВ и HBsAq у мышей, иммунизированных. РВОВ: Г роль вируса-векторр

РВОВ1'

Антитела к ВОВ

Антитела к нв?Ад

Титр антител при. ' "Титр антител при 1д дозе вируса(БОЕ) дозе вируса (¿0E)

10й.. ю' Юь Юь 10a 10' T0b IO5

W-H332'J L-KB32/K

3,4

7.0

5f-HB3VF. <'4,0 L-HB32/F 6,4-

W-preS2-'J 5.6 L-preSa/K 5,7

6-iO 160 160 <10

320 40 <10 <10

640 640 320 Í60

160 160 <10 <10

640 160 3?0 -320

40 20 40 10

<4.4

6,2

<4,6

4,7

5,0 7,4

320 -160 160

20

но

. 320

160

loO 10

.0

10 10

320 160 16C 20 20 1С

60 40 20 <10 <10 <10

и-рекембинза'л? на основе штамма w?; 1.-р;гксмб;:нзнты на основе

ШТаКЧа Lister.

v EI

I

активности- РВОВ в' 1 зависимости от вируса-вектора. РВОВ, сконструированные на основе штамма wr, при прочих равных условиях были более иммуногенны и в отношении белков ВОВ, и в отношении белков HBsAg, чем варианты, сконструированные на основе ¿'гамма Lister. По-видимому, ато определяется тем фактом, что мьиш более чувствительны к штамму те, который лучше размножается в мышином организм^, чем штамм Lis'эг.

В*, таблице 7 представлены результата сравнения активности PB0L в зависимости от места встройки чужеродного гена в ■ поксвирусньй геном. Как видно ьз таблиц«, РВОВ, содержащие ген, встроенный в Hind ш f фрагмент генома ВОВ,. обладали большей активностью по сравнению с FB0B, содержащим ту жэ 'генно-инженерную, конструкцию в к -ча iii vk фрагменте, как в отношении антигенов ВОВ, так и в отношении HBsAg. По-видимому, с пасенная активность 2-й грушы вариантов связана с повреждением г<: гена тимидинкиназы (tk3, в-который осуществлялась встройка чужеродного гена. Можно полагать, что ТК~ фенотип ведет к снижении репродукции

Таблица 7

Индукция антител к ВОВ и HBsAg у мышей, иммунизированных РВОВ: роль места встройки /

•JT уг;

„.., о>> Антитела к ВОВ : ■ ■ Антител? к нвздд_

х^оа [ т татр антител пбй 1 : 1 Титр англтел при , ■ т£5 дозе вирусе (ЕРЕ) lg 1D дозе вируса (BOB) - 50i I0a I0.v 10<s iq5' ю: юв ics

W- НВЗЙ/J 5,4 640 160 160 <10 <4,4 330 160 160 20

W-HB32/-F <4,6 6ч j 640 320 160 <4,0*320 320 ISO 160

l-НВЗЯ/к 7.0 ЗЙО 40 <10 <10. 0,2 60 20 10 '.0

L-HB3S./F 6,4 ISO 160 <10 <10 4,7 150 20 20 10

W-preSVJ 5,6 540 160 40 20 5,0 160 60 40

W-preS2/"F <4,5 640 320 160 40 <4,3 160 ISO oO 40

J',fC,F - встройка Й- ИЛИ preS2-S="iY;H3 ГфОВеЦеНЭ В HinJIII J, I.' или ь фрагмент генома ВОВ соответотвокно.

''S3.

вируса в организме) мыши, что и отражается на иммунологического ответе.

При сравнении тиунизирущей активности РВОВ 3 зависаете от варианта чужеродного гена (s- pres2-s-rer"4 показаноs что РВОВ, содержаще s-ген, обладали более высокой активностью в отношении HBsAg, по сравнению с РВОВ, содержащими presa-s-ген. Последние обладали сгг -обЕостью индуцировать антитела к presa антигенной детерминанте. В отношении ■ антигенов ВОВ активность РВОВ практически не зависата от варканта встроенного ге а.

МЫ изучили зависимость антительного ответа к нвзАд и ВОВ у мышей от ьэдунизирувдьй дозы РВОВ на основе штамма щ или lister. Активность антител к оелкам ВОВ и s-бвжу определяли по коэффициенту Р/ы, где Р - показатель поглощения W в ША для тестируемой сыворот и, ы- среднее значение А*«г да негативных контрольных сывороток. Полокительиьми считали сыворотки, для которых рун было больше з. ьы показали, что активность сывороток против обоих компонентов и в случае штампа те, и в случае штамма Lister зависела от заражающей дозы вируса.

Бык осроделен коэффициент корреляции мзду- целочисленными значения;« величин р-^я'для сывороток каждой из тестировании мышей в системах анализе антител к балкам ВОВ . и к HBsAg. Этот коэффициент дп зсего пула обследованных сывороток равнялс-я 0,677 к рДЯ рззжчных вариантов РВСВ изменялся от 0,574 до 0,864. Такие значения коэффициента корреляции мездг значение:;' р/н для этих двух видов антител свидетельствуют о том, что, ,в целом» имеется коррел*?цмя в накоплении антител к .белкам ЮВ и антител ¿к

ЭКСПреССИрувМСМу. РВОВ HBsAg.

, 23 i

вывода.

I.Разработан набор из пята вариантов иммунсферментного анализа (ИФА), позволявдий количественно выявлять три участка поверхностного антигена вируса гепатата ' В 'квзАд) а-детерминанту, press-детерминанту и участок, связыващкл полимерьл>ванный сыворо^чный альбумин человека в препаратах ПрИрОДНОГО И реКОМбИНаНТНОГО KBsAg.

2.Обнаружена гетерогенность популяции нввАд-содергар^п частиц 3. сыворотках больных гегатитом В в отношении активности полиальбумин связыващих участков.

3.На сснозании анализа гетерогенности популяции квзАд-содержащих частиц г едлокена новая моде.чь взаимодействия

preS2-СОДвржаЩИХ ЧЭСТИЦ HBsAg С ПОЛИМврИЭОВаНРЬМ СЫВ^ЮТОЧНЫМ

альбумином человека. > ;

4.Разработан ка$ор ■ вариантов Шк для выявления мьспикьа антител к а- и pr-esa-детерминантам HBsAg, а такке к белкам вирз ов осповакцшы. Эта варианта ИФА исполь. :ваны для лабораторной оценки иммукогенности поксвирусяых рекомбикантов, зкспрвсофупрх HSsAg. в опытах на мьнах.

5.На основании сравнительного анализа лккуногеяноста сеук вариантов рекомбинантных вирусов осповакцаны (FB03), ^кспрессир'ущих HBsAg, в ОТНОПЮ.ЧИИ антигенных деттминаят HBsAg я белков вируса осповакцины (ВОВ) показано, что РВОЕ, сконструированные на основе шташа wr, были более ишуюгенш для мьшей, чем РВОВ на основе шташа Lister.

G.Ha основании сравнительного анализа - '..щногенности изученных РВОВ псквзано, что ТК+варианты РВОВ более ¡асмукогенны . да мышей, чем ТК"варианты. ■ :/• V

7.Показано, что наличие preS2 области в составе hbsa^.^7 зкспрессируемого вирусными рекомбинантами, ивдуцируэт обрь^оввние антител к pr ese-детерминанте hbsa<j, но cmrape-r индукцию гтигел л •э-детерминанге. ' "

'о £4

8. При сравнении иммуногенности семи вариантов РВСЗ обнарувенг . корреляция между накоплением антител к белкам БОВ и накоплений ВП1Т8Л К ЭКСПреССИруеЫи<7 РВОВ ШзАд.

ШССК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДЙССЕРГЙЩЙ.

1. Й.М.Григорьева, Е.А.Чудаковэ, Л.М.Пискарэва,' В.Г.Григорьев, 'Г.В.Пашвыкина, Л.Г.Захарова, А.Д.Альтштейн. Вариация соотношения антигенные детерминант рге-зг и а в рекомбинантном и природное поверхностном. антигене вируса гепатита В' (нв^Ад). В: Тезисы докладов конференции " Новые направления биотехнологии", Пущино, 1592/6/7 ;

2. И.М.Григорьева, В.Г.Григорьев. Сравнительная иадуногенность рекомбинактов вируса осповакцины, експрессярущих поверхностный антиген вируса гепятита. В: Тезисы, докладов конференции ".' Новые направления биотехнологии", Пущщо, 1992, с.59.

3. И.М.Григорьева, В.Г.Григорьев, Л.Г.Захарова, В.Я.Щевлягин, А.Д. Альтатойн. ¡1ммуногенн^сть для ».шей рекомбинаятньк вирусов осповчкцины, экспрессирупцих поверхностный антиген вируса гепатита В. - В-'-опкхЛса! ас1ь.1сс. 1992, «I, С.36-40.

иг:

Отпечатан в тилографш НИИЗЫ иы.Н.Ф.Ген&яеи РАШ Заказ 116, тираж 80 Подписан в печать 14.05.1992.