Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рекомбинанты поксвирусов, экспрессирующие поверхностный антиген вируса гепатита В

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинанты поксвирусов, экспрессирующие поверхностный антиген вируса гепатита В"

АКАДЕМИЯ ШК СССР ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи УДК Б77.21:678.2:21:275.3

ПАВШШНА ГАЛИНА ВАОИЬЕВИА

РЕКОМБИНАШУ ШКСВИРУСОВ, ЗКСПРЕССИРУЩИЕ ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕН ВИРУСА ГЕПАТИТА В

03.00.15. - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени к'-ндадвта биологически наук

Москва - 1990

Работе выполнена в группе генетики шрусов лаборатории генетической инженерии отдала молшсулярно-генвтаиеских проблем Института общей генетики им Н.И. Вавилова АН СССР.

Научный руководитель - доктор медицинских наук А.Д. Алмитейн

Официальные ашоншпы:

доктор биологических наук B.C. Народащай доктор биологических наук Н.Г. Еуша

Ведущее учреждение: Инженерный центр (Биотехнология) Института молекулярной биологии АН СССР

Защита диссертации состоится C^f^H KiSft^L I99Q Г. в vf чаосзв на ваоедании Специализированного Ученого Совета Д 002.49.01 при Инотатуге общей генетики им. Н.И. Вавшюаа АН СССР ( 117809, ГШ-1, Москва, ул, Губкина, д.З).

С диссертацией моею ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. H.H. Вавилова АН СССР.

Автореферат разослан " ¿СОЛ ¿'^1^1990 г.

Ученый секретарь специализированного ссшетв

кандидат биологических наук Г.Ы. Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Гепатит В - одна из важнейших вирусных инфекций, порахащих человека. Это заболевание широко распространено во многих районах мира, в том числе - в СССР. В настоящее время показано, что профилактика гепатита В с помощью швктавирсввнвых или суОьеданичвых вакцин высоко аффективна. Однако сущеатаугт больше технологические трудности в получении таких вакцин, тая как вирус гепатита В /hbv/ не размнозается в лабораторных условиях. В результата особое значение при разработке вакцины против гепатита В /и других вирусных гепатитов/ приобретают генно-инженерные подходы. Одним из таких подходов является использование шксвирусдах векторов, акспрессирущих протективные антигены hbv.

Поскольку ВОВ бьш успешно использован для вакцинации против натуральной оспы и полной ликнвдации s той инфекции на Земле, возникла возможность деть втоцу вирусу нонув хизнь, испол^вуя его для создания геннс-ияхзнерных вакцин нового типе (d. р»гас»и.

E.Paoletti, iOea.H. Hacicett вЛ. al., lésa, О. Smith et »1. , 1 ваз,

В.ЙЛерноо, А.Д.Альтнтейн, 1984, 1987). О этой целью в геном ВОВ мосено встраивать года протшпивяых антигенов различных возбудителей я превращать этот нируо в потенциальную вакцину против соотвотствущей инфекции или даже в поливакцину против нескольких инфекций. Ясно, что поксвируснь» рекомбинанты, акспрессиругзрю протэнтивше антигены гепатита В ta пернул очередь погэрхвостша 'лггаген hbv - hbsAq/ - одно из самых актуальных направлений в этой проблеме. Такие рекомбинанты в принципе можно использовать дня приготовления дешевой, технологичной живой вакцины, пригодной для массовой профилактики гепатита В. Все остальные вакцины против гепатита В, созданные в последние года, в основном, предназначены для вакцинации ограниченного, особо угрожаемого контингента населения.

Цель и аадачи исследовании

На основании выше сказанного возникла задача - получить поксвируснш рекомбинанты, вкспрессируццие hbsao и изучить различные аспекты экспрессии втого антигена с целью ее оптимизации /роль вируса-вектора, промотора, места встройки в геном, ТК- фенотип/. Важной- задачей было приготовление рекомОинантов, которые можно быдо бы использовать для производства экспериментальной «ивой оспенно-гепатитной В вакцины, пригодной для испытания на добровольцах. Важной задачей было усиление »моногенности рекомбинантяого hbsAq путем встройки в даксвирусный геном presa-s гена hbv. было показано, что pr»s2-s ашггоп отличается большей юдауногенностью по сравнению с главным апитопсм нввАд детерминантов.

, Научная новизне и практическая ценность работы.

Создана коллекция поксвируснш рекомбинангов, акспрессирупцих нвздд. Коллекция использована для изучения условий экспрессии s- и presa-s генов hbv.

Впервые показано, что ВОВ, штамм wr, является существенно лучшим акспрессором нввао по сравнении со штампом Листер.

Место встройки (ТК ген ВОВ или Шпат f фрагмент) не оказывает большого влияния на экспрессию нваАд, хотя в одном случае подучена значительно больаая экспрессия ив*Ад при встройке s-гена в HindiII f фрагмент ВОВ штаж ЛИВП.

Промоторы И и V обеспечивали сходную по уровню экспрессию наадд; о прсмотором Р, а также в акспрессионноВ системе фага 17, выявлена лишь слабая экспрессия. ТК фенотип поксвирусных рекомОинантов не оказывал существенного влияния на экспрессию

ИВ» Ад.

Получены рекомбинанты штэдыа Листер, вкспрессирупцие fji <*sk-s ген; при атом показано, что presa область гена не ослабляет экспрессию самого s гена. Трансляция при атом, по-видимому, осуществляется как с 1-го ato кодона, инициирующего полицщгпчд с pr *sa областью, так и со 2-го ato.

инициирующего главный полипептад нвтАд. было показано, что небольшие вариации нуклеотмдной последовательности встраиваемого гша могут оказывать заметное влияние на экспрессии.

Сконструированы рексмбинанты, содержащие одновременно s ген в HindiII f фрагменте и pr«sa-s в ТК гене ВОВ. У таких рекомЗинантов наблвдалось угнетение экспрессии второго mis.

Впервые продемонстрирована значительная индукция hbsAq при введении поксиирусных рекомбинантов в ашгантоиснуп полость куриных эмбрионов.

Показана высокая стабильность s- и pr»sa-s генов в составе поксвирусных рекомбинантов при пассажах in vitro, in ovo, in vivo. Показана зависимость индукции антител к HBsAg поксвирусньми рекомЗинантами от экспрессии последнего.

Полученные рекомбинанты используется для разработки нового типа вакцин против гепатите В.

Апробация работы.

i

Основные научаю результаты были доложены на Всесоюзном рабочем совещании по-ДНК - содержащим нирусам (1984 г., Киев, Институт вирусологии и эпидемиологии им. Д. Заболоцкого АН УССР), Международном симпозиуме по ияруснум гепатитам (1966, Москва, Институт вирусологии АМН СССР), на конкурсе работ молодых ученых ГОГеи АН СССР (1966), на vi и vil Всесошных симпозиумах "Молекулярные механизма генетических процессов". (1967 и 1990 гг., Москва, ИОГан АН СССР), V Съезд ВОГИС (1987 г., Москва), Всесотенсз табочее сош^дние по биотехнологии (1968, Пущино).

Диссертация апробирована и рекомендована х защите на совместном семинаре отдала молекулярда-генетических провеем и семинара "Молекулярные и клеточные основы генетических процессов" Институт общей генетики им. Н.Й. Вавилова АН ССОР 19 сентября 1990 года. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Объем ■ структур« работы.

Диссертационная работа состоит на введения, обзора литературы, методического раздала, экспериментальной ' часта, вклшащей результаты собственных исследований, обсуждения полученных данных, 8 также разделе библиографии. Материал диссертации изложен на 138 страницах машинописного текста, включая 21 таблицу и 18 рисунков и библиографию - 170 источников отечественной и зарубежной литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работа описывается получение и изучение поксвирусных 4>екомбинантов, акспрессирупцих я ген нву - продукт которого является главньм протактавным антигеном этого вируса. Наша работа была начата в 1983 году, когда не было еще ни одной публикации ш поксвирусньм рвкомбинантам, вкспрессирущих втот ген. В 1983-1964 годах появились первые работы по экспрессии нвадд рекомбинантами, сделанными на основе высоко нвйрошфулентного штата мг /¡ыьь «ъ »1., 1ввз; р»о1всъ1 »1.. 1вв4. Поскольку перед нами стояла задача создать рекомбинанты, пригодные для имцунизации лвдей, ш использовали в качестве основы рекомбинантов штат ЛИВП - вариант штампа 1л«1вг, широко использовавшегося в СССР и в мире для профилактики натуральной оспы. Шли получены также различные варианты рекомбинантов, отличащиася по свойствам использованного поксвируса, а также по промоторам, под которыми акспрессировался г ген и ш месту встройки в поксвирусный геном. По мере появления данник о ради различных антигенных детерминант в иммунитете при нву инфекции, осуществлялось конструирование рекомбишштов, содержащих варианты э гена с рг»5-1 и рг»£-г областями.

Конструирование векторшх пгаашд

Векторные шшзмвды должны иметь: 1)фланкирущие последовательности фрагмента шксвирусного генома, определящие место

эатройки чужеродного гена: 2)поксвирусный промотор: 3)уникаль-ныэ сайты рестрикции для встраивания чужеродного гена под контроль поксвирусного промотора. Векторные плазмида были нами получены на основе рвк-згг, в которую были проклонированы HlndlXI J (К)и Hindi II F фраГМвНТЫ.

Для клонирования Hindi и f фрагмента была использована ДНК ВОВ штаммов нейровакцины, ЛИВП и wr. дшс обрабатывали Hindi и, проводили электрофорез в 0,7» агарозе, выделяли Hindi и f фрвпиент. Эта шшзмиды были предназначены для встройки чужеродных генов в уникальный в»тш сайт, примыкающий к резидентному промотору /промотор Паолэтга/. Было показано, что в области, примькапцей к промотору у в ДНК штампов ЛИВП и нейровакцины, но не wr, имеется дополнительный ВдюН1 сайт, чрезвычайно затруднящий клонирование чужеродного гена. Таким образом, было обнаружено различие между Hindiи f фрагментами штамма wr, с одной стороны, и штаммов ЛИВП и нейровакцины, с другой. EcoRi-EcoRi участок Hindiи f фрагмента штамма WR, содержащий промотор и несущественную область генома, был проклонирован в EcoRi сайт pBR-эаг. При этом была получена

ШШЗМИДа pFR.

Hindiii к фрагмент генома ВОВ штамм ЛИВП, содержащий ТК ген ВОВ, был клонирован в Hindi и сайт pBR-заз. так как Hindi и к фрагмент штамма ЛИВП соответствует Hindin j фрагменту генома WR, №1 условно применили обозначение HindiII J для любого поксвирусного фрагмента, содержащего ТК ген ВОВ, не зависимо от штата вируса. Плазмида /pj-i 1 г/, содержания функциональный ТК ген ВОВ, бъ'ла отобрана с помощью биологического теста - ш способности превращать вариант ВОВ в ТК+. Эта плазмида была укорочена рестрикцией sali - xhoi с последущим лигированием. . При атом были элиминированы многочисленные сайты рестрикции, которые могли бы мешать встройке чужеродных генов в ТК ген ВОВ. В Ecori сайт pj-xss был проклонирован BamHi -EcoRi фрагмент из pfr, содержащий промотор Пэолетги. В' результате подучена плазмида pJB.

В работе так же была использована векторная плазмида pVAR-is, сконструированная совместно с К.А. Бендукидзе. На

основе руде~1з бьш получен вариант этой плазмида /р^ркша содержащий гш устойчивости ж кпнимицину и сайты рестрикции, отличвщиеся от таковых рУак-ю.

Всего в работе было использовано 5 векторных, плазмид.

Ванотрувравашв интеграционных пияиид.

Над интеграционной шщзмидой понимается конструкция, предназначенная дая встройки чужеродного гена в несущественный участок поксвирусного генома, под контроль поксвируоного промотора, в дополнение ж векторной шаамаде, интеграционная пдаямидп оодершпгг чужеродный ген, подлежащий аксцросски. Источника»« генов нву одужили 3 варианте независимых иволятов -риэ-э (Худяков Б.,1985), рнву-эао ( Грец э.Я.,1968), оба варианта относятся к серотипу »у* и рНву-1эо смиггау, .аовгэ .серотап в нашей работе было сконструировано 15

интеграционных плазмид, позволяющих направлять различные варианты 8 гена нву в различные участки генома, под контроль различных промоторов. Каадая из полученных пдвямцд была иоследовянна методом рестрикционного анализа я показано, что их карты соответствуют задуманной идее конструирования. Правильность конструирования подтверждалась молвкулярно-генетачвским анализом рекомбинвнтов, полученных о вдкющыо втах шизмид.

Получение оаксвирушшх реконбшшггаа, оадаркы«и s тем hbv

С помоицлэ 16 интеграционных шшамид, описанных в предыдущем разделе, бьши получены покснирусяыв рекомОинанти на основе трех поксвирусов - ВОВ жтаиш Листер и we и вирус осш кролика (rpvj . Основные данные о полученных рексмбинантех иредотааланы в таблице I (рекомбюшнты получены совместно с Захаровой Л.Г.). Рекомбинвитнвя область каждого вируса была

в

мрактеривована о помощьп дот-бАот гибридизации (предвари-эдьный анализ), а затем о помощью блот-гибрядизации по |узерну. Выло показано, что во всех случаях рекомбинантнвя Злайть поксвирусного генома отрого апредаляетоя интеграционной

Таблица I

Покавирусныа рексмбинан-ш, содержащие 8 ген кву

13 Рекомбгоант Вирус Интеграционная Ген Про- Ад- ТК Титр

п век- шиэмида мо- рес фено- ВОЕ/

тор тор тип клетка

2 3 4 6 6 7 8 9

Ь-Р-НВЭУК ЛИШ рЛВ-НВЭ г 1» к тх~ юв'в

ЛИШ рУАк-нвза м к не" юв'в

ь-м-нвзг^к-тк+ЛИВП рУАк-нвзг я м к ТК 10е'7

*-м-нвза т —//— Б м 3 тк~ ю7-г

и-м-нвзг^-тк + и» иг —//—//- м 3 ТК ю7'3

к-м-нвзг^д ВР* —//•—//- я м 3 пе- 1а7'3,5

к-м-нвза^^-тк + КРМ —//—/V- м 3 нс* 10е'в

ь-м-нвэ^к лиI рУАЯ-НВЭ я м к тк" 10»'°

Й-М-НВЗ/'К КРМ рУАЙ-НВЭ 5 N 3 тк" 10В'7

ь-м-нтз/чс ЛИШ рУА»-НВ1Э 5 и к тх~ 10е'®

ЛИШ р11-НВЭ>М * к тк" ю«-7

т ри-нвгуз Б ' м к тк" Ю8'7

и-м-НАНВэгис ЛИШ рЗАВ НАУ-Э н к те" 10®'®

и-р-нвэьт ЛИШ -РК-ИВЗ г р г тк* юв'в

Ь-МР-НВЗЕ Т ЛИШ рг- рм-нвзглз 5 р.м т пс* ю7'°

*-рм-нвзг>-р »к —//—//—/•✓- - э Р.М V тк* Ю7'7

у-м-нвзг^ т рр-м-нвзгл 8 м г тк+ Ю7'®

ь-м-Ргвяг/к ЛИШ ррг*зглв-л ргег32-5 М к тк" ю7'°

ь-м-Ргвза^с-тк+ЛИВП ррвйза-я м к пс+ 10е'®

«к —//—//— —/'/'- — м 3 тк~

»-М-Рге32Л1-ТК+ та рРгеЯй^В-Л ргьЗг-Я м 3 тк* ю7-8

ь-Рм-Ргейг/т ЛИШ ррге£г/чз-р —/v- —р. к р тк+

Продолжение таблицы 3

1 2 а 4 В в 7 8 в

аз у-рм-ргвза/т «к —/у———р.м к те+ ю7*в

&4 *г-м-рг»а/м рРг*5савз рг«а- м з те- 1б7,э

-ргвза-а

вв ЛИШ &-ТТ- тт к тк" юв,э

рг»г/га г

во »-Т7-ргв32/м те — ✓✓—/V ргегг- тт л те" ю6,4

13 Все рекомбинанты акспрессируюгт нв*Ав.

• плазмадой, от конструкции которой зависит точка встройки, промотор, направление гена в даксвирусном геноме и особенностью участков генома, непосредственно прияигапцих к чужеродному гшу.

Экспрессии нвтАд похсшрушшш рекшбиканташ

О помощью коллекции рекомйинннтов, описанной в предыдущем разделе, было иаучено влияние различных факторе» конструирования на экспрессию нвалд в клетках, ввраженных этими реюомбинантами (работв по тестированию нвадд была выполнена совместно о Бочаровой Н.Г.(ПЮК им. Л.А. Тврасевича) и о Григорьевы« В.Г. (ИОГен АН СОСР)).

Лин«шк» вксорессш нв«хо в щетках су-1 , наряженных пакошруаныш режомбпшепш ■ распределение нввлд между хжетхжми а культурально* жидкостью

Для определения динамики синтезе нввАд и инфекционного вируса культуру клеток су-1 заражали исследуемьм шфусом из расчета 2-3 БСЕ/КЛ, адсорбцию проводили 19« комнатной

температуре в течение I часа- Все флаконы разделили на две групш: среда первой группы оодержала 50 мкг/мл цигозинарвбиновидв, среда второй группы ингибитора не содержала. На основании полученных данных мы можем заключить, что нвздд появляется черз 6 часов после заражения. Его количество резко нарастает -через 12-24 часа и достигает максимума через 30 часов. Специфический цитопатаческий аффект (ЦГСЭ) появляется через 6-8 часов и достигает максимума через 30 часов. Относительная скорость формирования инфекционного вируса несколько отстает от синтеза нвздд. Как и следовало ожидать. цитозинараОиновид (ДА.) полностью подавляет созревание инфекционного вируса, но оказывает лишь незначительное влияние на синтез нвяАд, контролируемый ранне-поздним (М) или ранним (П) промоторами. Следовательно нвадд, прямо не связан с образованием инфекционного вируса. В многократно повторенных дальнейших опытах было показано, однако, что содержание нв*дд в зараженных клетках достигает своего максимума на в момент наивысшего ЦПЭ, когда все клетки выглядят поражвниьии, а спустя сутки после него. При заражении клеток сч-1 с множественностью 2-3 БОЕ/кл и при тотальном поражении клеточного монослоя' через 48 часов, содержание нвадд продолжало достоверно увеличиваться к 72 часам, когда наблвдалась полная деструкция клеток. На атом основании дальнейшие сравнения рекомбинвнтов в отношении нвхАд проводили заражая клетки су-1 с множественностью 2-3 БОЕ/кл и инкубировали до их полной деструкции (72 часа после заражения).

Шли получены данные о сравнительном распределении нвзлд я инфекционного вируса между клетками и средой. Как это характерно для ортсаок вирусов, зд:$екциониый вирус, в основном, связан с клетками. 3 тоже вре^г, на«Ад через 4В часов после заражения, в основном, находится в жидкой фазе культуры, с клетками остается связанны* около 1/4-1/3 нввАд. Показано, что через 24 часа в клетках содержится столько же или больше антигена го сравнению о культуральной жидкостью. В дальнейшем,, содержание антигена в культуральной жидкости увеличивалось.

№ не отметили заметного влияния рг«£г области на связывание нв&дд с клетками. Исндшннш составляя рехсмбинянт

нвад« которого аодеркак чаоть рте» к вою рг*&г области. нводд, нвдуцированшН агам рекомбинаотом, преимущественно был связан о клеточш* фракцией.

я*

ввягокявм шупйртм нв« а<| , обре нуемого в клетках су-1, ЯЦИИЩН? ""!""1'41|11|Ц1М рДУ^ИнИЛН'! ищ

на>Ав существует в шшвмв крови носителе» в форме круглых шли нитевидных частиц диаметром 23 ям о шктюстью 1,21 г/сМ3. Нами также были получении данные о чаотачновой природе нв»Ад, индуцируемого рвкомбинадавми в зараженных клетках су-1 , Показано, что на»Ад остается в надосадочной жидкости при центрифугировании до 25000д Лц» атом ВОВ полностью осаждается/ к переходит в осадок при цетрифутировании в течение 24 часов при ЮООООо. Это указывает на частнчхсщую природу антигена. нваАд, предварительно сконцетрированаЛ цантрмДугировяниям в градиенте плотности с»сх, мает плотность 1,20-1.21. Показано также,что наличие рг«&а зоны не окааывает существенного влияния на плотность материала.

Экспрессия HBsAg локсвврусншн рехоиЗшшнтами роль места ветровка

Было изучено влияние месте встройки s шов pr»sa-s гене hbv поксвирусный геном на продукцию нваАд. Показано, что а случав там« wr не было существенной разницы в экспрессии гена, зтроенного в ТК ген или mndixi f фрагмент генома покснируоа. цнако, в случае штампа ЛИВП такая разница между двумя зкомбюшнтами найлвдаяась: встройка в та ген приводила ж уществвнному снижении экспрессии s гена.

Экспрессия нввхд поксвирусниш рекомбявантяш рожь промотора

Бьшо проведено сравнение экспрессии s гена на« а« экомбинантами, отличающимися только по промотору. Использовались ^комбинаты в которых ген вкспрессировался под контролем трех 93ЛИЧНЫХ поксвирусных ПрОМОТОрОВ. Видно, ЧТО ЭКСПрвССИЯ HBsAe зкомбинвнтом l-p-нвзис (ранний промотор) былв нв порядок ниже, эм экспрессия рекомбинантов с промоторов Иосса и Виттвка . эследние мовду собой существенно не отличались. ГЬггаясь понизить сспрессию нвшдв, хы использовали конструкцию, в которой pr*sa~s т hbv был взят под контроль промотора фаге Т7. По даням ггературы /Fuerяt »t (a.to87., М.В. Кряжевская,1990/, такс* »мотор в присутствие РИК-полимэразы фага Т7 способен дать зэков повьшениэ экспрессии контролируемого гена. Для изучения того вопроса ш использовали рвхомбинашы w-T7-pr.s2.--j % т-н->iT7/-j ✓у.в. Кряжевская и др.,1990/. Было проведано совместное >ражвние клеток ev-i этими рекомйинантеми /мюхвственность 2-3 Ж/кл/. В качестве контроля использовали культуру клеток, (раженную каждам рекомЗинчнгсм отдельно, а так же м-Presaxj. нам не удалось не только наблвдать увеличение юпрессии HBsAg под контролем промотора Т7, но даже наблвдвлась хлее низкая экспрессия по сравнению с вксцрессией

Экспрессия на«Аа аоковарусныш рекоибшшнтами

рохь вируов-вактора

Для конструирования нашей коллекции рекомбинантов были использованны три варианта поксвирусов: классический лабораторный штамм ВОВ «в, вакцинный штат ВОВ ЛИВП и вируо оспы кролика -rpv. Это дало возможность сравнить влияние вируса-вектора на экспрессии нвзАд. Было проведено оравнение экспрессии hbsAq в клетках cv-i с использованием, одинаковых образом приготовленных, рекомбинонтов, отличающихся только по вирусу-вектору. Неавнишмо от места встройки и варианта s гена (s- или pr*sa-s>, наблюдалось четкое преимущество штата т. как вкспрэссора, да сравнению со штаммом ЛИВП в 1,5-3,5 раза. Рекомбиавнт на основе вируса оспы кролика занимал промежуточное положение. Разница между рекомбинантами, созданными на основе агатов иг и ЛИВП была особенно значительной при проверке экспрессии нв%лд на куриных вмЗрионах. Щзи атом ваблвдалась аффективная экспрессия в амбрионах, зараженных рвкомЗкнантом на основе штамма мг, но не на основе штампа ЛИВП. РекоиЗинант на основе вируса оспы кролика и в атой системе занимал промежуточное положение. В а тих опытах была продемонстрирована зависимость экспрессии на»Ад от биологических свойств вируса-вектора и предложена новая система для накопления нввАд, не использовавшаяся ранее.

Экспрессия HBsAg поксвируснымя рекомбннаэтвши роль источника s гена

Исследуемая коллекция поксвирусных рекомбинантов позволила сравнить образование HBsAg в зависимости от источника s гена. Было щюведено сравнение З1 рекомбинантов созданных на основе штата ЛИВП и отличаицихся только по источнику s гена: Все три варианта s гена имели одинаковую длину нуклеотвдных последовательностей, предшествовавших ato кодону (27 П.О.) и отличались между собой всего лишь несколькими аминокислотами заменами. Поэтому, полученный результат был неожиданным: отмечалась четкая разнице между рекомбинантами l-m-квз/г и

L-M-HB13S-K. у последнаго-вкспрессия почтя в 3 реве вше, чем у первого. Рекомбинант L-м-нвзг/к занимал промежуточное положений и достоверно не отличался от двух крайних рекомбинантов.

Экспрессия нв» Ад поксиирусними ретомбтгентамп влияния presa области

Антигенная детерминанта, кодируемая pr*sa областью, шраат важную роль в протек-лганом аффекта нваАд. Поэтому, одной из важных задач, поставленных в настоящей работе, было конструирование рекомбинантов, содержащих presa область геноме иву. Было получено 3 рекомЗинанта, содержащих presa область hbv под контролем промотора Мосса в Hindiii f и Hindi i i j фрагментах bgb штампов лшп и vr. в>шо проведено сравнение экспрессии hbsag этими рекомбинантами и вкалогичньми им рекомбинантами без ргезг области в культуре клеток су-i. Рекэибинаты, содержащие presa-s ген, акспрессируют как "а", так и рreas детерминанта.

Можно было ожидать, что отдаление ato кодона s гене от промотора примерно на 140 нуклеотедов, должно ояизшъ экспрессии hbsag. было проведено сравнение экспрессии нвхАд натоа рвкомбинантами, содержащими presa-s ген и, несколько ш-другому сконструирована« рекомбинвнтом, полученньм доктором Кутишвой и сотрудниками (Институт вакцин и сывороток, Прага, ЧОФР). Показано, что рекомбинанты, сконструированные в Праге, отличались от наша рекомбинантов по экспрессии нвяАд, которая была заметно снижена в пражских вариантах, а таете со содержании presa антигенной детерминанты на единицу HßsAg: нвсдд, аюспресоируешй пражскими рэкомЭинвнтами содержит в 6-8 раз больше press детерминанты на единицу "А" детерминанты.

При сравнительном изучении ракомбинанта u-м-нднвзг^к , в котором была дополнительно вставлена последовательность около 100 нухлеотвдов, кодирующая антигенную детерминанту белка vpi вирусе гепатита А, было показано резкое снижение (на порядок) аксцрессии нвядд по сравнения о t-м-наза^к сданные не приведены). В экспрессируемом белке ве удалось выявить антигенную детерминанту hav (D.I.-. Куоов). Таким образом.

нуклеотидные последовательности, вставленные моаду атэ кодовом ® гена и промотором, и содержащие дто кодов в одной рамке считывания о атз кодовом s гена, могут оказывать реакое влияние на экспрессию последнего.

Экспрессия нв>«в оожощрутаов рвксмбинантвш, оодвряаярвш дав копив rem (s гея a pr«sa-s ген) в гевшв ВОВ

Представлялось очевидным, что один из возможных способа швшения экспрессии нв>Ад макет занлшаться в том, что ä вкспрессирсвать в геноме ВОВ более чем одну копии s генв Очевидно, что при независимой експрессии двух копий s ген продукция нв«Ад должна удвоиться. С Целью проверки этой идет был получены рекомбинанты, содержащие s ген в Hindi и f фрагменте по, контролем промоторе Носов. Под тем же промотором в Hindin . фрагменте содержался pre£s-s ген. Для конструирования был использованы рекомбинанты l-m.p-нвзйуг, *-м,р-нвза<т - содержащие s ген, дапологгелквая копия presa-s вставлялась в ТК ген < помощью шшзмады рргм/ts-j. Отбор рекомбинантов можно бьш проводить по переходу ТК+ фенотипа, характерному для исходасях вируоа, в ТК" фенотип, характерный для двойные рекомбинантов, i также по появлению в их геноме яуклв&щдной пооледоватвлыюсп preSS области.

Бьш проведен молекулярно-генетический анализ двойных рекомбинантов. Показано, что рекомбйнвты действительно содержат s ген в Hindin f и Hindi ii J фрагментах. После рестрикция ш ваюш видно, что в геноме рокомбиивнта содержится 2 варианта встройки "промотор-ген": s ген 1,3 кь. presz-s - i.b кь. нам практически не удалось повысить продукцию нвадд двойными рекембинвнтами по сравнению с исходники одинарньми рекомбинантами. Есть основания считать, что имело место неодинаковое снижение экспрессии двух встроенных генов, в преимущественно pr*sa-s ген8, встроенного в Hindin к фрагмент.

Стабильность встроенных s- и presa-s генов

При приготовлении .живой рвкомйтшгтой вакцины против гепатита В необходимо провести серив пассажей рекомбинантаого вируса (культура клеток хориоаллннтоиснвя оболочка (ХАО) куриных эмбрионов —> ковш кролике —» кока теленка)(В.И. Зврнос,19в6). Такая втщинв (9 серий) бЬша приготовлемв на Московском предприятии ш гфоизводотву бактерийных препаратов в [986-1987 годах. 3 серии такой вакцины бита проанализированы на шагаю вярионов, утративших способность вхспрессировать нваАд. 3 атой целью вирус тж!ровали методом бляшек под агаром ни слетках cv-i» в изолированных бляшtax опирали вируссодержащий штерты и размножали его в тех хе клетках, вьращеншх в 96 1унчшх платах. После полной специфической дегенерации клеток саздьй клш исследовали на наличие. нв>дв. Все исследованше слоны ( 241) вкшрессировали на«ла и, следовательно, возможная пратв встроенного функционального гена может гафвда-гьоя юнее, чей в 0,5Х случвав. f

Связь между эхспреегаша нвалд я образованием антител к атому антигену у кролик»

Выла изучена способность нескольких рвхомОинантов, »аздичащется по уровню экспрессии hbsaq, ивдуцировать йразоввние антител у кроликов (Черное В.И., Антонова Т.П., ОДИИВП АМН СССР). РекомОинант, отличающийся шгакж уровнем ковресоии нвядд, индуцкразал лишь следовой уровень вшитая к тому антигену у привитых живота. Повышение экспрессии нв*Ад . 20-30 раз вело к индукции антител к нв*дд в значительном игре. ТК фенотип вируса не оказывал существенного влияния на браеование антител у кроликов. Ршомбинвнты, вкслрессирующие ress-s антигенную детерминанту, индуцировали образование у роликов антител как к "а", тек и к pr*sа антагенньм отерминантвм, в отличие от пражских вариантов рекомйинянтов, оторые индуцировали обрааованкв антител только к рг*аа етврминвнте.

Таким образом, в процессе рабены были получены векторные я нтеграциоияые шшзмвды, предназначенные ддя встройки чужеродных

генов вообще или различных вариантов £ гена нву в частности в различные участки поксвирусного генома. Все пяазмиды либо отличаются от описанных в литературе, либо сконструированы нами впервые. С помощыо сконструировать!* в процессе работы интеграционных ояазмвд была получена коллекция покснирусных рекомбинантов, отличаадихся по вирусу-вектору, месту встройки, промотору, источнику и варианту б гена Для каадого рзкомбшанта были получены доказательства встройки соответствующего гена в соответствующий участок вирусного генома с помощью сочетания трех методов - дот-<5лот гибридизации, блот-гибридазации по Саузерну и выявления нвалд в клетках, зараженных рекомбинантньм вирусом, с помощью шцунно-ферментвого анализа. Эта коллекция была использована для изучения проблемы экспрессии нвздд в поксвирусном геноме, в так же для изучения биологических свойств покснирусных рекомбинантов, включая возможность приготовления живой рвкомбинантной вакцины против гепатита В.

Ряд полученных в этой работе рекомбинантов был использован в работах, проводившихся совместно с другими институтами для приготовления экспериментальной живой вакцины против гепатита В, а так же для соададая субьеданичной вакцины на основе на*Ад, индуцированного поксвирусными рекомбинантами. Эти данные практически не рассматриваются в настоящей работе.

выводы

1. Сконструированы интеграционные шшзмвды, предназначенные для встройки з- и ргваг-генов вируса гепатита В' (нв\о в два участка поксвирусного генома под контроль разных поксвирусных промоторов или промотора фага Т7.

2. Получена коллекция поксвирусных рекомбинантов (26 рекомбинантов), различащихся по вирусу-вектору, особенностям встроенного б- и ргезг-з-гена нву, по промотору, контролирующему экспрессию чужеродного гена, по месту его вртройки в покснирусный геном, по ТК фенотипу. Коллекция использована для изучения экспрессии поверхностного антигена снвяАаэ нву в культуре клеток и на куриных вибрионах, в также для'разработки генно-инженерных вакцин нового типа против гепатита В.

3. Впервые выявлена неодинаковая способность разных ортопоксвирусов акспрессировать э- и ргезг-з-ген иву. Показано, что лабораторный штамм вируса осповакцины те является лучшим вкспрессором нваАд, чем вакцинный штат« ЛИВП в культуре клеток н особенно на куриных эмбрионах. Вирус оспы кроликов занимает промежуточное положение.

4. Поквзано, что ранне-поздний покснирусный промотор Иосса из ¡эффективности экспрессии кв&дд близок к позднему промотору Виттекв и существенно превосходит ранний промотор Паолетти. Экшрессиоиная система фага 17, включенная в покснирус, оказалась неэффективной для экспрессии ргвэг-з-гена нау.

5. Место встройки и ТК фанотип не оказывают существенного влияния на вкспрессию нваАд о рге-зг областью и без нее. Минимальные различия в нуклеоткцной последовательности и-гена могут влиять на аффективность «¡го экспрессии в покснируском геномо•

6. Впервые получены рвкомбшдапы на основе штвма ЛИВП,

аклпрвасирущие presa-s-гвн в двух равных участках поксвирусшго генома под контролем сильного промотора Мосса. Рекомбинанты эффективно вкспреосировали нваАд, по-видимому, за счет преимущества инициации транзляции со второго атз кодона конструкции. Лишь часть молекул синтезируемого полипетидв подержала press антигенную детерминанту. У кроликов, привитых одним из рекомбкгаэтш, появились антитела в к "а"- и к presa-пнтигенным дотэр»ошактвм нвсЛд.

7. Впервые подучены даойше рекомбинанты, вкспрессирущие s срн hbv. встроенный в hi г. di и f фрагмент поксшрусного генома, ш rrfss-'s-ген hbv. встроенный в ТК ген того же генома. й>ивлада утетвпдее влияние s пана на вкапрессию presa-s-rera.

8. Показана стабильность экспрессии встроенных генов в поксвирупный геном s- и pr«S2-s-roHOB в процессе пассажей в культуре клеток, на хрриоаалавтксной оболочке куриных эмбрионов,в коле кролика и теленка.

Cmoox орублшговалннх работ по гена даосертацнм

1. Альтпивйн А.Д..Захарове Л.Г., Лопарев Н.В., Пашвыкина Г.В., Городецкий О.И., Черное В.И., Сенневич Т.Г., Антонова Т.П., Авдюпаридаа О.Г. " Получение рекомбщанта вируса осповакцины,; индуцирущего поверхностный антиген вирусе гепатита В, на основе штамма ЛИВП". 1966, ДАН, т.285,ыЗ, стр. 696-699.

2. Захарова Л.Г., Лопарев В.Н., Палшыкинв Г.В.. Кряжовская И.В.. Капелинская Т.В., Пешков A.D., Черное В.И., Альтатейн А.Д., Городецкий О.И. " Клонирование и изучение фрагментов генома вируса осповакцины" в Кн. "Макромолекулы клеток и вирусов", Киев, Наукови думка, 1986г., стр.132-133.

3. Альтатейн А.Д., Анджапаридзе О.Г., Антонова Т.П., Ваеа A.A., Бевдукидза К.А., Городецкий С.И., Захарова Л.Г., Кряжевская М.В.,; Пашвыкина Г.В., Фодор И.И., Черное В.Я. "Рекомбинантная плазмвдная ДНК родег для переноса и экспрессии в геноме вируса осповакцины гена поверхностного антигена вируса гепатита В и штвкм вируса осповакцины, экспрессирунций поверхностный антиген вируса гепатита В". Авторское свидетельство м 1354709, 1996г.

4. Альтатейн А.Д., Авджвпвридзе О.Г., Антонова Т.П., Баев A.A., Байсар Д.И., Бендукидзе К.А., Городецкий С.И., Захврова Л.Г., Кряжевсквя М.В., Пашвыкина Г.В., Фодор И.И., Черное В.И. "Двойные рекомбинааты вируса осповакцины, акспрессирупцие поверхностный антиген вируса гепатита В и тимвдинкиназу вируса простого герпеса". ДАН СССР, 1986, т.289, N 6, стр.1493-1496.

5. Захврова Л.Г., Пашвыкина Г.В., Кряжевская 11.8., Кирибдаанова Т.Х., Гринанко Н.Ф., Пискарева Л.М., Альтштейн А.Д. "Генетическая инженерия покснирусов" в сборнике тезисов v съезда всвссшного обцества генотипов и селекционеров, 1907г.,т.1, стр. 96-97.

6. Пашвыкина Г.В. "Варианты рекомбинантов вируса осповакцины, акспрессирупцие поверхностный антиген шфусв гепатита В" в Кн. "Проблеиа молекулярной и поцуляционной генетики", М., МОШ, I38ßr., стр. 2Б-29.

7. Богомолова Н.В., Жшгаанова Н.В., Малкова И.И., Мукомолов С.Л., Носков Ф.О., йаргрродекая Е.П., Аль-гатейн А.Д., Городецкий О.И., Захарова Л.Г., Пашвыкина Г.В., Пискврева Л.М. "Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита В." Авторское свидетельство N 1531282,1989.

8. Пашвыкина Г.В., Захарова Л.Г., Пискврева Л.М., Чудахова Б.А., Альтштейн А.Д."Оптимизация экспрессии поверхностного пнтигена вируса гепатита В шксвируеньми рекомбинантами" .В кн. "Молекулярные механизмы генетических процессов". И.,1990, стр.252.

9. Пашвыкина Г.В., Захарова Л.Г., Пискврева Л.М., Чудакове е.А. "Поксвирусные рекомбинашы, вкапрессжрупц^а поверхностный внтигвн (нв«Ая) вируса гепатита В chbvd с presa- антигенной дятерминвнтой". В кн. "Молекулярные механизма генетических процессов". М., 1990, стр. 252-253;

ТО. Чвляоов Н.В., Рвхилина Л.Е., Антонова Т.П., Черное в.и., Григорьев В.Г., Чудвкова H.A., Пашвыкина Г.В., Захарова Л,Г., Кутинова Л., Хамщикова Е. "Два рекомбинанта вирусе ООПОВЭКЦИНЫ, вкспресстфувт HBsAg С разньм содержание S и press ИНТИГеННЫХ детерминант". 1990, Acta Viroloflie*. в печати.