Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологическая и вирусологическая характеристика вируса лихорадки долины рифт и создание тест-систем для диагностики этой инфекции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая и вирусологическая характеристика вируса лихорадки долины рифт и создание тест-систем для диагностики этой инфекции"

На правах рукописи

БЕЛОВ АРТЕМ ВЛАДИМИРОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ И ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА ЛИХОРАДКИ ДОЛИНЫ РИФТ И СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭТОЙ ИНФЕКЦИИ

03 00 03 -молекулярная биология 03 00 06 -вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2007

003160888

Работа выполнена в НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

Бутенко Александр Михайлович Забережный Алексей Дмитриевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кандидат биологических наук

Ткаченко Евгений Александрович Прилипов Алексей Геннадьевич

Ведущая организация:

НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН

Защита состоится «Л?» октября 2007 г в 12 00 часов на заседании диссертационного Совета Д.001 020 01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д И. Ивановского РАМН (адрес 123098 Москва, ул Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им Д И. Ивановского РАМН

Автореферат разослан <(Л^у> сентября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Лихорадка долины Рифт (ЛДР) - это зоонозная, особоопасная вирусная инфекция, распространенная во многих странах Африки и Ближнего Востока Вирус ЛДР относится к роду Phlebovirus семейства Bunyaviridae Он обладает выраженной патогенностью для человека и многих видов диких и домашних копытных животных В эндемичных регионах заболеваемость ЛДР регистрируется в виде спорадических случаев, эпидемических вспышек крупных эпидемий и эпизоотии

У человека болезнь в основном проявляется как гриппоподобная лихорадка и в большинстве случаев заканчивается выздоровлением Средний уровень летальности составляет приблизительно 3%, однако развитие отягченных форм заболевания, сопровождающихся геморрагическим синдромом, некрозом печени и менингоэнцефалитами, приводит к резкому увеличению летальности (до 30%) Такие осложненные формы ЛДР наиболее часто наблюдаются во время эпидемий, которым предшествовали эпизоотии среди домашних животных [Niklasson, 1984]

Лихорадка передается через укусы комаров, при контакте с тканями и кровью заболевших животных, а также аэрогенным путем при вдыхании вируссодержащих аэрозолей. По этим причинам, группу наибольшего риска заболевания ЛДР составляют фермеры, ветеринары, пастухи, работники скотобоен и лабораторный персонал, осуществляющий манипуляции с вирусом [Hoogstraal et al, 1979].

Развитие эпизоотий и эпидемий, интервал между которыми составляет несколько лет, связано с выпадением обильных осадков, когда происходит массовое размножение комаров [Lupi and Tynng, 2003]

Крупные эпидемии и эпизоотии были зарегистрированы в ЮАР (1974-75 гг.) Египте (1977-78 гг), Мавритании (1987 г), на Мадагаскаре (1991 г), в Кении (1997 г), в Саудовской Аравии и Йемене (2000-01 гг) [Balkhy and Memish, 2003]. Во время масштабной эпидемии в Египте в 1977-78 годах было зарегистрировано 18000 случаев ЛДР с 600 летальными исходами [Meegan et al, 1979] В Саудовскую Аравию и Йемен, впервые за пределы Африки, вирус распространился, вероятно, с инфицированным домашним скотом из Восточной Африки или был перенесен комарами [Miller et al, 2002]

Лихорадка долины Рифт наносит огромный экономический ущерб сельскому хозяйству, так как обуславливает высокую гибель молодняка, а также приводит к возникновению абортов у 80-100% больных животных [Niklasson, 1984]

Наряду с другими нозологическими формами вирусных геморрагических лихорадок ЛДР относится к категории карантинных инфекций и требует особого внимания к завозу этого заболевания из эндемичных регионов инфицированными лицами Импорт копытных животных также может быть причиной интродукции вируса ЛДР на неэндемичные территории. Наконец,

вирус ЛДР рассматривается (наряду с вирусами других геморрагических лихорадок) в качестве агента высшей категории «А» для применения в биотеррористических целях [Ergonul and Whitehouse, 2007]

В связи с вышеперечисленными обстоятельствами разработка и совершенствование методов специфической диагностики и средств лечения ЛДР на основе всестороннего изучения свойств вируса ЛДР представляются актуальными направлениями для науки и практики, учитывая факт отсутствия отечественных диагностических и лечебных препаратов Цели и задачи исследования

Цели настоящего исследования заключались:

- в проведении филогенетических исследований референтного штамма Entebbe вируса ЛДР,

- в создании отечественных тест-систем на основе совмещенных реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), и иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики ЛДР,

- в изучении действия лекарственных препаратов на цитопатогенную активность вируса ЛДР

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи.

1 Культивировать и идентифицировать штамм Entebbe вируса ЛДР из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов.

2 Определить полную нуклеотидную последовательность гена Gn референтного штамма вируса ЛДР Определить филогенетические связи референтного штамма Entebbe вируса ЛДР с другими штаммами этого вируса на основе анализа нуклеотидных последовательностей участка гена Gn Проанализировать аминокислотные замены в антигенных эпитопах гликопротеина Gn у близких к референтному штаммов;

3. Разработать тест-системы «гнездового» варианта ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для диагностики ЛДР, отработать условия ПЦР на референтном штамме Определить чувствительность и специфичность разработанных тест-систем

4 Сконструировать генно-инженерный положительный контроль для использования в тест-системах ПЦР

5 Разработать тест-систему ИФА для выявления антигена вируса ЛДР, определить ее чувствительность и специфичность Сравнить чувствительность ИФА и ПЦР тест-систем

6 Изучить действие отечественного препарата «рибавирин», синтезированного в Институте биоорганической химии с помощью нового биотехнологического метода, и производных данного препарата на цитопатогенную активность вируса ЛДР.

Научная новизна и практическая значимость

1 Проведены филогенетические исследования референтного штамма Entebbe вируса ЛДР из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов Установлены значимые различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов гликопротеина Gn у двух линий

штамма Entebbe и атгенуированного штамма Smithburn вируса ЛДР, что можно объяснить различиями в условиях культивирования этих штаммов

2 Созданы отечественные тест-системы «гнездового» варианта ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для диагностики ЛДР с использованием оригинальных праймеров Тест-системы для диагностики лихорадки долины Рифт могут быть использованы в диагностических лабораториях и ветеринарных хозяйствах Разработанные тест-системы прошли сертификацию во Всероссийском Государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ВГНКИ) Подготовлены проекты стандартов организации (СТО) и наставления для данных тест-систем.

3 Сконструирован генно-инженерный положительный контроль для использования в тест-системах ПЦР

4 Разработана и охарактеризована тест-система ИФА для выявления антигена вируса ЛДР. Подготовлены компоненты, необходимые для создания тест-систем ИФА для выявления антител классов М и G к вирусу ЛДР.

5. В опытах in vitro на модели вируса ЛДР впервые проведено изучение противовирусной активности отечественного препарата «рибавирин» и его производных, полученных в Институте биоорганической химии при помощи нового биотехнологического метода Отечественный рибавирин, в отличие от тестированных серий его производных, обладал выраженным противовирусным действием

Основные положения, выносимые на защиту

1 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участка гена Gn (736 нуклеотидных оснований) штаммов вируса ЛДР показал, что наиболее близким к штамму Entebbe является штамм Lunyo Показано различие аминокислотных последовательностей антигенных эпитопов гликопротеина Gn у двух линий штамма Entebbe и атгенуированного штамма Smithburn

2. Разработаны чувствительные и специфичные тест-системы ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК вируса ЛДР Чувствительность обоих диагностикумов составила 7 БОЕ

3 Сконструирован генно-инженерный положительный контроль для использования в тест-системах ПЦР, представляющий собой бактериальную плазмиду со вставкой фрагмента гена нуклеокапсидного белка N вируса ЛДР

4 Разработана и охарактеризована высокоспецифичная тест-система ИФА для выявления антигена вируса ЛДР Ее чувствительность составила 2,1х102 БОЕ, то есть оказалась на порядок ниже чувствительности тест-систем ПЦР.

5 Исследована противовирусная активность отечественного препарата «рибавирин», синтезированного с использованием нового биотехнологического метода Показано, что данный препарат эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса ЛДР в культуре клеток Vero Е6 Индекс противовирусной активности рибавирина составил 4,0 ^ЦПД50 при максимальной концентрации препарата (1000 мкг/мл) Наряду с этим,

испытанные серии производных рибавирина не обладали противовирусной активностью в отношении вируса ЛДР

Апробация работы Основные результаты работы были представлены на международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение заболеваний, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21-23 июня 2006 г) и на расширенном пленуме проблемной комиссии «Арбовирусы» и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 17-20 октября 2006 г).

Материалы диссертации были доложены и рассмотрены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им Д И. Ивановского РАМН 13 сентября 2007 г

Публикации

По результатам диссертации опубликовано 2 статьи в центральных научных журналах и 3 тезисов докладов в сборниках конференций.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, 6 глав Собственных исследований, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы (10 отечественных, 97 зарубежных авторов) Объем работы составляет 108 страниц машинописного текста, иллюстрированного 8 таблицами и 11 рисунками,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы исследования. В работе использовали штамм штамм Entebbe вируса ЛДР (изолирован из комаров в Уганде в 1944 году), 8 вирусов рода Phlebovirus Тоскана, Корфу, Арбия, Салехабад, Каримабад, Пунта Topo, неаполитанской, сицилийской москитных лихорадок, а также вирусы семейства Havivmdae (вирусы клещевого энцефалита и Западного Нила) из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им ДИ Ивановского РАМН

В вирусологических исследованиях использовали перевиваемые клеточные культуры Vero Е6 Для получения антигенов, иммуноглобулинов и наработки вируссодержащего материала проводили заражение беспородных новорожденных и взрослых белых мышей

Препараты «рибавирин» и его производные (метилрибавирин и метил-2'-дезоксирибавирин) были синтезированы в Институте биоорганической химии им. М М Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН [Константинова и др., 2002] и любезно предоставлены профессором Г.А. Галеговым (лаборатория противовирусных препаратов НИИ вирусологии им ДИ Ивановского РАМН)

Реакция нейтрализации. Реакцию нейтрализации выполняли микрометодом [Seawnght et al., 1974] в 96-луночных планшетах ("Corning", США) Результаты реакции учитывали в течение 14 дней после заражения клеток, просматривая лунки планшета в инвертированном микроскопе ("Leitz", Германия) За титр антител принимали наибольшее разведение

иммунной асцитной жидкости (ИАЖ), при котором обеспечивалась защита культуры от 100 ЦПД50 вируса ЛДР В ряде опытов определяли индекс нейтрализации вируса с постоянным разведением ИАЖ

Непрямой метод флуоресцирующих антител (МФА). На фиксированные в ацетоне зараженные клетки наносили ИАЖ (специфическую или гетерологичные) и нормальную асцитную жидкость (АЖ) (в качестве контроля), и инкубировали при 37°С в течение 30 мин После отмывки препараты обрабатывали антителами против иммуноглобулинов мыши, меченными фенилизотиацианатом Интенсивность флюоресценции оценивали, просматривая препараты под люминисцентным микроскопом ("Axioskop", США) с водно-иммерсионным объективом.

Метод бляшкообразования. Опыт проводили в 6-луночных планшетах ("Corning", США) В лунку вносили 100 мкл вируссодержащей суспензии, инкубировали в течение часа при 37°С и 5% содержании СОг, периодически покачивая планшету Затем в лунки добавляли 3 мл 1% агарового покрытия. Для приготовления 50 мл агарового покрытия брали 3 мл раствора Эрла, 1,6 мл 8,5% раствора Na2C03, 18 мл раствора Игла, 1,6 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 1,5 мл нейтрального красного и смешивали с 25 мл прокипяченного в течение 30 минут раствора агара (0,7 г агара на 25 мл НгО) В качестве контроля клеток использовали незараженную культуру под тем же покрытием Число бляшек подсчитывали, начиная с третьего дня после заражения в течение 10 дней

Выделение специфических IgG на протеин А-сефарозе. Иммуноглобулины выделяли по методу, предложенному фирмой Sigma На хроматографическую колонку 7x1 см, содержащую сефарозу Ch-4B (Pharmacia, США), ковалентно связанную с протеином А, наносили профильтрованные ИАЖ при рН=7,4 Изменяя рН элюирующего буфера до 3,0, собирали глобулиновую фракцию Для длительного хранения IgG доводили рН раствора с глобулинами до 8,0.

Конъюгирование специфических IgG с пероксидазой хрена. Раствор, содержащий пероксидазу хрена R/Z-3,0 (Sigma, США) в концентрации 4 мг/мл и 0,02 М NaI04, диализовали против 0,001М натрий-ацетатного буфера рН=4,4 в течение 12-14 часов, затем добавляли натрий-карбонатный буфер рН=9,5 до конечной концентрации 0,004 М и IgG в концентрации 2 мг/мл Реакционную смесь инкубировали 2 часа при комнатной температуре, непрерывно перемешивая После этого в реакционную смесь добавляли свежеприготовленный раствор NaBHLt до концентрации 0,4 мг/мл, инкубировали 2 часа при 4 С, непрерывно перемешивая Полученный конъюгат очищали на колонке 1,6x35 см с сефадексом G-200, собирая наиболее высокомолекулярную фракцию Для стабилизации конъюгата добавляли бычий сывороточный альбумин до концентрации 1%, мертиолят (0,02%) или глицерин (50%)

Иммуноферментный анализ для выявления специфического антигена вируса ЛДР. Лунки 96-луночных панелей (Dynatech, Германия) сорбировали мышиными поликлональными антителами против вируса ЛДР,

разведенными карбонатным-бикарбонатным буфером (из расчета 1 мкг белка на лунку) Затем вносили мозговые или печеночные антигены, разведенные в фосфатном буфере (рН=7,2), а после инкубации - мышиные поликлональные антитела против ВЛДР, меченные пероксидазой хрена [Anderson et al, 1980, Olsson and Kaplan, 1980] Проявление реакции осуществляли добавлением в каждую лунку ОД мл субстрат-индикаторного раствора. 0,4 мг/мл ортофенилендиамина в 0,1М цитратно-фосфатном буфере рН=5,0 с добавлением 0,002 мкл/мл 3% перекиси водорода Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП), измеряемой на фотометре (Flow, США) при длине волны 450 нм. В каждом опыте использовали нормальные контрольные антигены. Положительной считали реакцию, когда значение ОП450 исследуемого образца составляло не менее 0,300

Проведение «гнездовой» ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени.

Выделение РНК вируса ЛДР из образцов проводили с использованием «Тризола» (Tnzol Reagent, Life Technology, США) по методике производителя, а также по методу с использованием неорганического сорбента [Гребенникова, 1997]

«Гнездовую» ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени на матрице РНК вируса ЛДР проводили в конечном объеме 25 мкл Реакционная смесь содержала 5 мкл нуклеиновых кислот, по 10 пмоль каждого праймера, 10 пмоль зонда, 0,25 мМ каждого dNTP, 1,25 ед Taq-полимеразы, 25 ед MMLV-ревертазы, 20 ед ингибитора РНКаз, 10 мМ Tris-HCl (рН=9,0), 50 мМ KCl, 0,1% Triton Х-100,1,5 мМ MgCl2

«Гнездовую» ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) ОТ-ПЦР в реальном времени проводили на приборе ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, США)

Последовательности специфических олигонуклеотидов разрабатывали в программе Oligo 4,0 (США) на основе консенсусной последовательности гена нуклеокапсидного белка N референтных штаммов вируса ЛДР, представленных в базе данных GenBank'

Название праймера Последовательность олигонуклеотидов (5'- 3')

Для обнаружения РНК вируса ЛДР методом ОТ-ПЦР, 1-ый раунд

RVF149 GGG AGA AGG ATG CCA AGA AA

RVF535 CGG AGG TTT GGG TTG ATG AC

Для обнаружения РНК вируса ЛДР методом ПЦР, 2-ой раунд

RVF181 GCT СТА ACT CGT GGC AAC AA

RVF383 АСА GGA AGC CAC TCA CTC AA

Для обнаружения РНК вируса ЛДР методом ОТ-ПЦР в реальном времени

RVF200 GCC CAG GAG GAT GAT GAT GAA A

RVF384 GAC AGG AAG CCA CTC ACT CAA GAC

Зонд Probe RVF FAM - СТА TCA CGA GTT GCT GCC GCC CTG - BHQ1

Для проведения 1-го раунда «гнездовой» ОТ-ПЦР использовали следующие температурные режимы: 50°С - 50 минут, 94°С - 5 минут (стадия обратной транскрипции) и 25 циклов амплификации 94°С - 30 сек, 57°С - 30 сек, 72°С - 30 сек Для проведения 2-го раунда использовали те же температурные режимы, за исключением стадии обратной транскрипции

ОТ-ПЦР в реальном времени проводили при следующих режимах 50°С -20 минут, 95°С - 10 минут, затем 40 циклов амплификации 95°С - 15 сек, 61°С - 20 сек, 72°С - 1 мин

Анализ фрагментов ДНК после ПЦР проводили методом электрофореза в агарозном геле. Гели фотографировали и анализировали, используя трансиллюминатор, в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм Результаты ПЦР в реальном времени автоматически выводились на монитор компьютера в виде зависимости интенсивности флуоресценции от числа циклов

Конструирование генно-инженерного контроля для тест-систем ПЦР.

Наработанные в ПЦР фрагменты выделяли из геля с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов (Promega, США) по методике производителя Лигирование ПЦР-фрагмента в плазмидный вектор pGemT-Easy (Promega, США), приготовление и трансформацию электрокомпетентных клеток Escherichia coli проводили по стандартной методике [Маниатис, 1989]. Скрининг клонов проводили методом ПЦР.

Филогенетический анализ. Последовательности олигонуклеотидных праймеров для секвенирования подбирали с помощью программы Oligo 4,0 (США) с использованием нуклеотидных последовательностей различных штаммов вируса ЛДР, размещенных в базе данных GenBank Определение первичной нуклеотидной последовательности осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США). Для построения алайнментов использовали пакет программ DNASTAR V3.12 (Lasergene, США) Построение филогенетического дерева осуществляли на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом в программе MEGA 3.1

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Культивирование и серологическая идентификация штамма Entebbe вируса ЛДР

Штамм Entebbe вируса ЛДР хранился в коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов без использования в каких-либо исследованиях в течение 15 лет Вследствие этого первая задача, поставленная в начале выполнения настоящей работы, заключалась в проверке сохранности его инфекционной активности и дополнительном подтверждении соответствия антигенной характеристики вирусу ЛДР

Содержащаяся в ампуле лиофилизированная суспензия мозга инфицированных новорожденных белых мышей была использована для

внутри мозгового заражения 12 новорожденных белых мышей Ё объеме 0,01 мл. Через 48 часов после заражения у животных наблюдалось развитие характерной для большинства арбовирусных инфекций клинической картины заболевания (истощение, судороги, паралич).

На втором пассаже инкубационный период сократился до 36 часов, т.е. минимального срока, характерного для вируса ЛДР.

Феномен цитопащгедного действия вируса ЛДР был использован нами для постановки реакции нейтрализации штамма Entebbe с гомологичной иммунной асцитной жидкостью (ИЛЖ), приготовленной в лаборатории биологии и индикации арбовируеов в 1990-е годы, и нормальной асцитной жидкостью (АЖ) в качестве контроля. Разведение Специфической и нормальной АЖ в опыте составляло 1:40. Тигр вируса в присутствии нормальной АЖ был 9,5 1»Ш"1Д^/0.1мл. а в присутствии ИАЖ 6,5 1§ЦПД5о/0,1мл, следовательно, индекс нейтрализации гомологичной ИАЖ с вирусом ЛДР равнялся 3,0 IgLin Этот результат подтвердил

принадлежность штамма Entebbe к вирусу ЛДР.

Данные реакции нейтрализации были подтверждены и результатами метода флуоресцирующих антител (МФА) при обследовании культуры клеток Vero Е6, инфицированных вирусом ЛДР. Характерное ярко-зеленое окрашивание цитоплазмы клеток наблюдалось только в случае обработки препаратов гомологичной ИАЖ к вирусу ЛДР. но не ИАЖ к гетсрологичным вирусам (клещевого лнцефалита. крымской геморрагической лихорадки) (Рис. 1).

Клетки, зараженные вирусом ЛДР + сыворотка крови больного крымской геморрагической лихорадкой

Клетки, зараженные вирусом ЛДР + сыворотка крови больного ЛДР

Рис.1. Идентификация штамма Entebbe методом МФА с сывороткой крови больного ЛДР

Свечение отсутствовало также при просмотре нормальных клеток Vero F6. обработанных ИАЖ к вирусу ЛДР.

2. Филогенетический анализ штамма Entebbe вируса ДДР

2.1. Определение полной первичной нуклеотидной последовательности гена Gn штамма Entebbe вируса ДЦР

Выбор гена Gil (сегмент М) в качестве объекта филогенетического анализа был обусловлен тем, что данный ген отвечает за экспрессию поверхностного гликопротеина, с которым связана нейтрализующая активность гомологичных антител Известно, что у многих буньявирусов ген Gn является наиболее вариабельным, поэтому он представляет наибольший интерес для молекулярно-эпидемиологических исследований ЛДР и изучения эволюции возбудителя

Для определения полной первичной нуклеотидной последовательности Gn были подобраны 4 пары олигонуклеотидных праймеров, с помощью которых амплифицировали 4 перекрывающихся фрагмента После секвенирования этих фрагментов была определена полная нуклеотидная последовательность гена Gn

2.2. Построение филогенетического дерева

Для филогенетического анализа были использованы нуклеотидные последовательности участка гена Gn размером 736 нуклеотидных оснований Для исследования были взяты последовательности гена Gn 40 штаммов вируса ЛДР, размещенные в базе данных GenBank и последовательность Gn референтного штамма Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов

Результаты филогенетического анализа показали, что штамм Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов (изолирован из комаров в Уганде в 1944 году) наиболее близок штамму Lunyo (изолирован из комаров в Уганде в 1955 году) (Рис 2) Гомология нуклеотидных последовательностей этих штаммов, несмотря на дистанцию во времени их изоляции, составила 99,5%

Интересен тот факт, что гораздо более существенными оказались различия нуклеотидных последовательностей участка гена Gn у двух линий штамма Entebbe 1) из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов и 2) из Атланты, США Штамм Entebbe из США оказался ближе (гомология - 99%) штамму Smithburn, который представляет собой аттенуированный вариант штамма Entebbe Гомология нуклеотидных последовательностей двух линий штамма Entebbe составила 97,9%

66|Saudi 200010311 SA011322 Kenya 9800523 364-97

CH1 MAU 03 -H2MAU03 - Kenya 83 C21445)

601—2260 74

— MgH824

— MP12

— ZM657

— T-46

- ZC-3349 -ZH-1776 73HB1230

- 1260 70

clone 13

96

T

6174H

Эб 174HB59

65|-ANKS087

¿inga

АЮ104769

-1653 78

i CAR R1622

-HV-B375 —— 22S9 74

99 L

- ArB1976

18 31

iCI

'¡Entebbe |

ЭЗI-Lunyo

- Smrthbum

' Entebbe 33

- Kenya 66

С

- AnD106417

A1D38611

- АЮ38457 . HD47311

¡U-

711OS9

Рис 2 Филогенетические взаимосвязи различных штаммов вируса ЛДР, определенные на основе анализа участка гена Gn размером 736 нуклеотидных оснований Числа обозначают вероятность ветвления в данной позиции Рамкой отмечен штамм Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов Филогенетический анализ проводили на основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MEGA 3 1)

2.3. Определение различий в антигенных детерминантах гликопротеина Gn у близких штаммов вируса ЛДР

Следующей задачей явилось определение различий в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов поверхностного гликопротеина Gn у близких штаммов вируса ЛДР (двух линий штамма Entebbe и аттенуированного штамма Smithburn) В пределах гликопротеина Gn известны 4 антигенных эпитопа Эпитопы I, II и IV являются мишенью для вируснейтрапизующих антител, а с эпитопом III взаимодействуют антитела, не обладающие нейтрализующей активностью Эпитопы I, II и III являются линейными, а эпитоп IV - информационным Эпитопы I и IV частично перекрываются [Keegan and Collett, 1986]

Было показано, что аминокислотные последовательности нейтрализующих эпитопов I и IV гена Gn штамма Smithburn отличаются от последовательностей эпитопов двух линий штамма Entebbe (Рис 3)

OBAHYbNHDGKKASVKCPPKYELTEDCHgCRQMTGASLKKGSYPLQDLFCQS О 180_130 140_ ISO 160

1 QSA EiYLNNDGKMASVKCPPKYELTEjDCNPCRQMTGASlLKKGSYPljQDLFCQ?

2 QSi HYLNNDGKMASVKCPPKYELTE DCNFCRQMTGASLKKGSYPI QDLFCQS

3 QSi HYLNNDGKMASVKCPPKHELTE DCNFCRQMTGAS LK0GSYPIQDLFCQS

j - ly

KTEENIiLPDSFVCFEHKGQYKGTHDSGQIKREIiKSFDI SOCPKX

1 220_22a_ 2 40 250_260

2 KTEENLLPDSFVCFEHKGgYKGTMDSGQSKRjELKSFDISQCPKI KTEENLLPDSFVCFEHKGQYKGTMDSGQIKRpLKSFDISQCPKI KTEENLLPDSFVCFEHKGQYKGTMDSGQIKHELKSFDISQCPKI

II

GEKISSAVACASGVCVTGSOSgSTEXTLKYPGISQSSGGDIGVHKAHpDQ _2Sä_32S_3B0 390_40Q

1 GFKISSAVACASGVCVTGSQSPSTEITLKYPGllSQSSGGDIGVHMAHDDQ

2 GFKISSAVACASGVCVTGSQSPSTEITLKYPGCSQSSGGDIGVHMAHDDQ

3 GFKISSAVACASGVCVTG 3QSPSTEITLKYPG CSQSSGGDIGVHMAHDDQ

III

Рис 3 Аминокислотные последовательности поверхностного гликопротеина Gn близких штаммов вируса ЛДР

1 - штамма Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов, 2 — штамма Entebbe из GenBank, 3 - штамма Smithburn Римскими цифрами обозначены антигенные эпитопы

У штамма Smithburn в эпитопе I тирозин в положении 131 заменен на гистидин, а в эпитопе IV лизин в положении 150 заменен на глутаминовую кислоту Данные замены существенны, так как замещающие аминокислоты обладают противоположным зарядом Вследствие этого конформация

эпитола IV может быть изменена. Вероятно, именно эти замены являются причиной снижения вирулентности штамма Smithburn.

У штамма Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов треонин в положении 246 зменен на изолейцин. Данная замена также существенна, так как изолейцин, в отличие от треонина, является аминокислотой с гидрофобным радикалом. Эпитол Ш идентичен у всех представленных штаммов.

3. Разработка и характеристика тест-систем «гнездовою» варианта ОТ-ПЦР и ОТ-ГГЦР в реальном времени для детекции РНК вируса ЛДР 3.1. Подбор праймерок, оптимизация условий проведения ПЦР

Олигонуклеотидиые праймеры для обеих тест-систем ПЦР были подобраны на oeifose изучения нуклеотидных последовательностей гена нуклеокапсидного белка N следующих штаммов вируса ЛДР: В Egy 93, клона 13, Н Egy 93, Smithburn, MP 12, ZH 548.

Для тест-системы «гнездового» варианта ОТ-ПЦР были подобраны о Л и го ну кл еотид ы со сходными температурами плавления (Тт). Температура плавления в паре прайм еров различалась не более чем на 1°С. Расчетная температура отжига составила 57°С. При подборе пар праймеров особое внимание обращали на то, чтобы последние 3-4 нуклеотида на З'-конце праймера обязательно приходились на консервативную область генома вируса.

Для оптимизации условий ПЦР проводили с использованием значений температур отжига, находящихся в интервале 55-60°С. Существенных различий по результатам ПЦР не обнаружили. Тем не менее, было принято решение использовать расчетную температуру отжига.

Выделение вирусной РНК проводили двумя различными способами: экстракцией с помощью реагента "Тризол" и методом сорбции на неорганическом носителе (НПО «НАРВАК», Россия).

По результатам реакции существенных различий между двумя методами не было выявлено. Интенсивность свечения фрагментов, полученных после второго раунда, одинакова при любом способе выделения РНК (Рис.4).

500 190

Рис. 4. Электрофорез продуктов ПЦР, проведенной из матрице РНК вируса ЛДР, выделенной при помоши двух различных методов

1,2- пробы, в которых РНК была выделена с использованием реагента "Тризол"; 3, 4 - пробы, в которых РНК была выделена с использованием неорганического сорбента; 5 -маркер длины нуклеотидных последовательностей (ДНК рис 19, обработанная рестриктазой Мар I). Справа указана длина фрагментов ДНК (в парах нуклеотидов)

Расчетная температура отжига праймеров для тест-системы ОТ-ПЦР в реальном времени составила около 61°С При выборе оптимальных праймеров обращали внимание на то, чтобы их температуры плавления различались не более чем на 2°С, а Тт зонда была на 10°С выше Тт праймеров Для системы детекции были использованы излучатель флуоресцентного сигнала FAM и гаситель BHQ1

С помощью разработанных тест-систем было проведено определение РНК вируса ЛДР в органах и тканях экспериментально зараженных животных В эксперименте использовали взрослых беспородных белых мышей При внутрибрюшинном заражении этих животных 0,01 мл культуральной жидкости зараженных клеток Vero Е6 с содержанием вируса 4,0 ^ЦПД5о/0,1мл появление клинических признаков заболевания (адинамия, судороги) наблюдали через 36-72 часа после инфицирования Заболевших животных усыпляли эфиром и извлекали их органы и ткани для тестирования методом ПЦР

Результаты тестирования показали, что во всех исследуемых образцах, кроме отрицательных контролей, присутствует РНК вируса ЛДР (Табл. 1) В качестве отрицательных контролей ПЦР использовали деионизованную воду и экстракт мозга незараженных мышей, в качестве положительного контроля - культуральную жидкость клеток Vero Е6, зараженных вирусом ЛДР

Таблица 1

Определение РНК вируса ЛДР в органах и тканях экспериментально _зараженных белых мышей по данным ПЦР

Обследованные материалы Варианты ПЦР

ОТ-ПЦР в реальном времени «гнездовая» ОТ-ПЦР

Сердце + +

Печень + +

Легкие + +

Кровь + +

Мозговая ткань + +

Селезенка + +

Отрицательные контроли

Положительный контроль + +

Проведенное тестирование органов и тканей белых мышей подтвердило данные о висцеротропности и нейротропности вируса ЛДР при экспериментальной инфекции т vivo В результате выполнения этого раздела работы установлено, что разработанные тест-системы ПЦР позволяют выявлять РНК вируса ЛДР в различных органах и тканях инфицированных животных

3.2. Определение специфичности разработанных ПЦР тест-систем с использованием гетерологичных флебовирусов

Специфичность тест-систем ПЦР оценивалась по результатам тестирования родственных вирусов рода Phlebovirus, входящих в антигенный комплекс вирусов москитных лихорадок (Тоскана, Корфу, Арбия, Салехабад, Каримабад, Пунта Topo, сицилийской и неаполитанской москитных лихорадок)

Для наработки вируссодержащего материала проводили внутримозговое заражение мышей-сосунков материалом, содержащим 3,0 ^ЦПД50/0,1 мл вируса На анализ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени брали вируссодержащие суспензии, приготовленные из мозга мышей, инфицированных этими вирусами

Все пробы, содержащие родственные флебовирусы, а также отрицательный контроль (мозговая суспензия незараженной мыши) оказались отрицательными Наряду с этим, при обследовании пробы мозга мышей, инфицированных вирусом ЛДР, был получен положительный сигнал Эти данные указывают на выраженную специфичность разработанных тест-систем

3.3. Определение чувствительности разработанных ПЦР тест-систем

Чувствительность ПЦР тест-систем определяли в сравнении с данными титрования исходной вируссодержащей суспензии по феномену бляшкообразования, регистрируемому в инфицированных клетках Vero Е6 под агаровым покрытием

Задача этого исследования заключалась в определении минимального числа копий геномов вируса ЛДР, выявляемого разработанными ПЦР тест-системами

Опыт проводили в четырех повторностях, титруя вирус ЛДР по феномену бляшкообразования в разведениях от 10"3 до 10"13 Титр вируса в реакции бляшкообразования составил 107 в лунках с разведением вируса 10"7 были обнаружены единичные бляшки В лунках с разведениями вируса ЛДР 10"8 -10"13 бляшки отсутствовали

На анализ методами «гнездовой» ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени были взяты пробы культуральной жидкости с заранее установленным количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) в мл Было показано, что нижний предел чувствительности ОТ-ПЦР в реальном времени составляет 7 БОЕ, что соответствует пробе с содержанием вируса 2,1x102 БОЕ/мл или разведению вируссодержащей мозговой суспензии 10"5 Анализ образца с содержанием вируса 2,1х103 БОЕ/мл также показал наличие положительного сигнала, при этом пороговый цикл реакции был значительно меньшим (Рис 5)

II ¡1 я :з и а 31 з г. з> я

Рис. 5. Определение чувствительности тест-системы для выявления вируса ЛДР методом ОТ-Г1ЦР в реальном времени.

1 - образец, содержащий вирус в количестве 2,1х103 БОЕ/мл, 2 - образец, содержащий вирус в количестве 2,1х102 БОЕ/мл.

Чувствительность тест-системы на основе «гнездовой» ОТ-ПЦР оказалась сходной и также составила 7 БОЕ. В результате тестирования образца, содержащего вирус в количестве 2,1х103 БОЕ/мл, после второй амплификации на электрофоре грамме был выявлен дополнительный фрагмент ДНК, соответствующий фрагменту, полученному после первой амплификации. При анализе образца, содержащего вирус в количестве 2,1x10 БОЕ/мл, после второй амплификации был обнаружен только один специфичный фрагмент ДЖ.

Таким образом, чувствительность обоих методов по результатам наших исследований составила 7 БОЕ. Исходя из того, что одна БОЕ соответствует 1000-3000 копиям РНК ВЛДР [Sail et al., 2001], разработанные тест-системы позволяют обнаружить в образцах 7000-21000 копий вирусных геномов. Чувствительность разработанных нами тест-систем оказалась ниже, чем у зарубежных аналогов [Sail et al., 2001]. Тем не менее, подобная чувствительность вполне соответствует предъявляемым требованиям, так как при ЛДР наблюдается напряженная вирусемия, а концентрация вируса ЛДР в органах и тканях достигает высоких значений.

3.4. Конструирование генно-инженерного контроля для тест-систем

ПЦР

Для получения фрагмента ДНК для клонирования в Escherichia coli использовали праймеры RVF 149 и RVP 535, Фрагмент гена нуклеокапсидного белка N вируса ЛДР размером 408 пар нуклеотидов клонировали в Escherichia coli в составе плазмиды pGEM-T Easy (Promega, США).

Концентрация полученной рекомбинантной плазмиды составила 2,05x10" г/мкл. Количество копий плазмиды рассчитывали, исходя из того, что молярная масса пары оснований ДНК равна 660 г/моль. Тогда 3360 пар

оснований плазмиды составляет 2 217 600 г/моль, а число молекул референтной плазмиды в мкл;

14- 2,05x10'''г/мкл х 6x10" молекул/моль =5,5хЮ10 2 217 600 г/моль

С использованием серии последовательных разведений плазмиды проводили «гнездовую» ПЦР и ПЦР в реальном времени. Положительный сигнал в обеих реакциях был получен при использовании всех разведений плазмиды, кроме 10"10, однако оптимальными для использования полученной рекомбинантной плазмиды являются разведения 10 " - 10"8 (Рис.6).

номер цикла

Рис. 6. Результаты ПЦР в реальном времени на матрице серии последовательных разведений рекомбинантной плазмиды Цифры справа обозначают обратные величины десятичного логарифма разведений плазмиды, что соответствует следующим количествам молекул плазмиды в мкл:

1 - 5,5x109, 2 - 5,5х103, 3 - 5,5х107, 4 - 5,5x30й, 5 - 5,5хЮ5, 6 - 5,5х104, 7 - 5,5х103, 8 - 5,5x102, 9 - 5,5x10*

Таким образом, был получен генно-инженерный положительный контроль, представляющий собой бактериальную плазм иду со вставкой фрагмента гена нуклеокапсидного белка N вируса ДЦР. Оптимальные разведения данной плазмиды для использования в тест-системах - от 102 до 10"а.

4. Разработка и характеристика тест-системы ИФА для выявления антигена вируса ЛДР 4.1. Антигены, иммуноглобулины и конъюга гы

Для получения антигена проводили внутри мозговое заражение новорожденных белых мышей дозой вируса 4,0 ^ЦПД,0. Источником антигенов являлись мозг и печень больных животных. Приготовление

антигенов в обоих случаях проводили методом сахарозо-ацетоновой экстракции с последующей инактивацией вируса 0,01% раствором р-пропиолактона После добавления Р-пропиолактона и инкубации суспензий в течение 7 дней антигены оказались инактивированными клинические признаки заболевания у зараженных новорожденных белых мышей отсутствовали

Специфичные к вирусу ЛДР иммуноглобулины получали из ИАЖ мышей методом аффинной хроматографии при помощи протеин А-сефарозы Для работы были использованы ИАЖ с титром специфических антител не ниже 1 320 Иммуноглобулины к вирусу ЛДР были конъюгированы с пероксидазой хрена

На следующем этапе проводили определение оптимальных рабочих разведений полученных компонентов Иммуноглобулины использовали в четырех концентрациях 10, 20, 30 и 40 мкг/мл Было показано, что реакция проходит одинаково хорошо при любой из указанных концентраций Исходя из этого, в дальнейшем для сорбирования на планшеты использовали иммуноглобулины в концентрации 10 мкг/мл

В результате титрования в ИФА мозгового и печеночного антигенов было установлено, что они имеют различную специфическую активность Печеночный антиген оказался намного активнее (1 102400), чем мозговой (1 400) (Рис 7)

Положительными считали такие пробы, значение оптической плотности (ОП450) которых было не ниже 0,300 Для контроля реакции использовали нормальные глобулины, полученные из АЖ неиммунизированных мышей, а также нормальные антигены, приготовленные из мозга незараженных мышей В лунках планшеты с контрольными глобулинами и антигенами положительные сигналы не отмечались, что свидетельствовало о специфичности выявляемых результатов ИФА

обратные величины -татра антигенов

Рис 7 Кривые титрования печеночного и мозгового антигенов вируса ЛДР методом ИФА

В связи со значительной разницей в активности антигенов, полученных из мозга и печени зараженных мышей, для дальнейших исследований применяли печеночный антиген В качестве рабочего использовали разведение 1-800

Для определения активности конъюгата его титровали в разведениях от 1 50 до 1.6400 (Рис 8)

обратный титр конъюгата

Рис 8 Кривая титрования конъюгата вируса ЛДР методом ИФА

Выбранное рабочее разведение конъюгата при этом составило 1" 1600 При больших разведениях значения оптической плотности в лунках с другими специфическими реагентами резко снижались

4.2. Определение специфичности метода ИФА

Для исследования специфичности метода использовали мозговые суспензии и сахарозо-ацетоновые антигены вирусов рода РЫеЬоУ1гия из группы москитных лихорадок (Кандиру, Арбия, Салехабад, Каримабад, Тоскана, неаполитанской и сицилийской москитных лихорадок), а также сахарозо-ацетоновые антигены вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила (семейство F^avгvгп<¿ae) В качестве отрицательного контроля использовали антиген, полученный из мозга незараженных мышей, в качестве положительного - печеночный антиген вируса ЛДР

Результаты опыта показали отсутствие перекрестной реактивности у иммуноглобулинов к вирусу ЛДР в том случае, когда антигены титровали начиная с разведения 1 100 При разведении антигенов 1 20 в лунках, содержащих антиген вируса неаполитанской москитной лихорадки, регистрировали положительный сигнал (ОП450=0,511). Значения величин оптической плотности для остальных антигенов, кроме антигена ВЛДР, оставались отрицательными

Таким образом, иммуноглобулины к вирусу ЛДР не взаимодействовали с антигенами вирусов москитных лихорадок, клещевого энцефалита, Западного Нила и нормальным антигеном, что свидетельствует о высокой

специфичности метода и компонентов, используемых в реакции. Исключение составил лишь антиген вируса неаполитанской москитной лихорадки, в отношении которого обнаружилась небольшая перекрестная реактивность с антигеном вируса ЛДР

4.3. Определение чувствительности метода ИФА

Для определения чувствительности метода ИФА проводили тестирование мозговой суспензии, которая была использована при титровании вируса ЛДР методом бляшек Реакцию проводили параллельно на планшетах с сорбированным специфическим к вирусу ЛДР иммуноглобулином и контрольным глобулином, полученным из АЖ нормальных, неиммунизированных мышей В качестве положительного контроля использовали печеночный антиген вируса ЛДР, в качестве отрицательного -антиген, полученный из мозга незараженных мышей Титровать антиген и мозговую суспензию начинали с разведения 10'2 и заканчивали разведением Ю-13.

Наличие положительного сигнала было зарегистрировано в тех лунках, которые содержали мозговые суспензии в разведениях 10~2 - 10"4 Антиген в мозговых суспензиях более высоких разведений при помощи данного метода не был выявлен В планшете с сорбированным контрольным глобулином не было обнаружено ни одной положительной пробы.

Из результатов реакции бляшкообразования следует, что в мозговой суспензии в разведении 10"4 содержится 2,1х103 БОЕ/мл. Исходя из того, что в реакции было использовано 100 мкл суспензии, минимальное количество вирусных частиц, которое может быть определено с помощью данного метода, равнялось 2,1х102 БОЕ

Таким образом, чувствительность метода ИФА составила 2,1х102 БОЕ, то есть на порядок отличалась от чувствительности тест-систем ПЦР

Специфические реагенты, приготовленные в процессе разработки ИФА тест-системы для индикации антигена вируса ЛДР (иммуноглобулин, антигены, пероксидазный конъюгат, нормальный глобулин и антиген), являются достаточной основой для конструирования ИФА-диагностикумов, предназначенных для выявления ^М и антител в сыворотках крови людей и животных Возможность их применения зависит только от наличия позитивных контролей 1§М и

5. Изучение действия рибавирина и его производных на цитопатогенную активность вируса ЛДР

Отечественный противовирусный препарат «рибавирин» (1-)3-0-рибофуранозил-[1Н]-1,2,4-триазол-3-карбоксамид), полученный группой исследователей с использованием нового биотехнологического метода [Константинова и др, 2002] был любезно предоставлен д.б н, проф Г А Галеговым (ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН)

Для оценки противовирусного действия рибавирина использовали его концентрации, равные 1000, 500, 250, 125 и 62,5 мкг/мл Разведения рибавирина, приготовленные на поддерживающей среде Игла, добавляли к клеткам Vero Е6, которые после заражения инкубировали в течение часа в СОг-инкубаторе при 37°С и 5% содержании С02. Заражение проводили вируссодержащей мозговой суспензией в разведениях от 10"4 до 10"1

Индекс противовирусной активности рибавирина составил 4 ^ЦПД50 при использовании препарата в максимальной концентрации (1000 мкг/мл) Также было показано, что активность рибавирина существенно зависит от его концентрации При повышении концентрации препарата индекс противовирусной активности увеличивается с 2,0 lgUJI^o (концентрации 62,5,125,250 мкг/мл) до 4,0 ^ЦПДю (концентрация 1000 мкг/мл) (Табл 2)

Таблица 2

Определение эффективности рибавирина в отношении вируса ЛДР в опытах т vitro

Титрование вируса Концентрация рибавирина (мкг/мл)

1000 500 250 125 62,5 Клетки без рибавирина

10"4 + + + + + + + + + + + + + + + + + +

10"5 + + + + + + + + + + + + + + + + + +

10" + + + + + + + + + + + + + + +

10" + + + + + + + + + + + +

10"s + + +

10"9 + + +

10"ш

Незараженные клетки

+ наличие ЦПД, — отсутствие ЦПД

Отсутствие цитопатического действия на клеточной культуре в тех лунках, куда вирус ЛДР не был добавлен, но содержался рибавирин, свидетельствует о том, что препарат не является токсичным для клеток.

Таким образом, было показано, что отечественный препарат «рибавирин», полученный с использованием нового биотехнологического метода, активно подавляет развитие цитопатического действия в культуре клеток Vero Е6

На следующем этапе была поставлена задача выяснить, препятствует ли рибавирин синтезу вирусной РНК Для этого при помощи метода ОТ-ПЦР в реальном времени анализировали пробы культуральной жидкости и клеток, взятые из тех лунок планшеты, в которых рибавирин подавлял развитие цитопатического действия Для того чтобы отделить клетки от поверхности планшеты и отобрать клетки для анализа с максимальной эффективностью, проводили один цикл «замораживания-оттаивания» клеток

Результаты тестирования показали присутствие РНК вируса ЛДР во всех тех лунках, где развитие цитопатического действия было подавлено рибавирином Известно, что рибавирин препятствует образованию кэп-структур на 5'-концах вирусных РНК, что предотвращает трансляцию с данных РНК Возможно, именно подобная дефектная РНК детектируется при помощи разработанных тест-систем ПЦР Несмотря на синтез РНК, формирования полноценных вирионов и выхода их из клеток не происходит, чем и объясняется отсутствие ЦПД на культуре клеток

Для исследования противовирусного действия ГА Галеговым были предоставлены два препарата - производных рибавирина (метилрибавирин и метил-2'-дезоксирибавирин) В опыте использовали такие же, как и в опыте с рибавирином, концентрации препаратов (1000, 500, 250, 125 и 62,5 мкг/мл) Для контроля часть лунок планшеты с зараженным монослоем клеток Vero Е6 инкубировали с рибавирином Точно так же, как и в предыдущем опыте, оставляли контроль клеток (незараженные клетки) и зараженные клетки без добавления препаратов.

Результаты опыта показали, что производные рибавирина не проявляют противовирусной активности даже при максимальной концентрации Наоборот, данные препараты усугубляют цитопатогенное действие вируса ЛДР, усиливая развитие цитопатического действия и дегенерацию монослоя клеток Таким образом, было продемонстрировано отсутствие противовирусной активности у препаратов — производных рибавирина и наличие токсического эффекта данных препаратов в отношении клеток Vero Е6

ВЫВОДЫ

1 В результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка гена Gn (736 нуклеотидных оснований) референтного штамма Entebbe и 40 других африканских изолятов вируса ЛДР было показано, что штамм Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов наиболее близок другому угандийскому штамму Lunyo Показаны значимые различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов поверхностного гликопротеина Gn у близких штаммов вируса ЛДР Smithburn (аттенуированный вариант штамма Entebbe) и двух линий штамма Entebbe из лаборатории биологии и индикации арбовирусов и из Атланты (США)

2 С использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров созданы высокоспецифичные тест-системы «гнездового» варианта ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для детекции РНК вируса ЛДР Их специфическая чувствительность составила 7 БОЕ

3 Для использования в тест-системах ПЦР сконструирован генно-инженерный положительный контроль, представляющий собой плазмиду pGEM-T Easy со вставкой фрагмента гена нуклеокапсидного белка N вируса ЛДР.

4 Разработана и охарактеризована тест-система ИФА для обнаружения антигенов вируса ЛДР, обладающая выраженной специфичностью и чувствительностью, эквивалентной 2,1х102 БОЕ Специфические компоненты, используемые в этой тест-системе, являются основой для создания тест-систем ИФА для выявления антител IgM и IgG к вирусу ЛДР в крови больных людей и животных

5 В опытах in vitro на модели вируса ЛДР установлена выраженная противовирусная активность оригинального отечественного препарата «рибавирин» Индексы его противовирусной активности варьируют от 2,0 lgUriZb (при концентрациях препарата 62,5 - 250 мкг/мл) до 4,0 lglinEfeo (при концентрации 1000 мкг/мл). Тестированные производные рибавирина (метилрибавирин и метил-2'-дезоксирибавирин) не проявляют противовирусной активности даже при максимальной концентрации

Список работ по теме диссертации

1 Belov A.V, Grebenmkova T.V., Khutoretzkaya NV., Zaberezhny A., Butenko A M. Localization of Rift Valley fever virus m different organs and blood of infected mice using developed PCR test // Abstract of 16th ECCMID April 1-4 2006 - Nice, France, 2006. - P1073.

2. Белов А В , Хуторецкая H.B , Гребенникова T В , Скороход М А, Ларичев В Ф, Забережный А Д Разработка тест-систем для выявления вируса ЛДР // Международная научная конференция "Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных" Тез докл - 21-23 июня 2006. — Ульяновск, 2006 - С 28-31.

3 Белов А В , Ларичев В Ф, Галкина И В , Хуторецкая Н В , Бутенко А М, Галегов Г А Определение активности отечественного рибавирина в опытах m vitro на моделях вирусов КГЛ, ЛДР, Тягиня и Дхори // Расширенный пленум проблемной комиссии "Арбовирусы" и научно-практическая конференция "Арбовирусы и арбовирусные инфекции" Тез докл - 17-20 октября 2006. - Астрахань, 2006. - С.219-221.

4 Белов А В , Гребенникова Т В , Забережный А. Д, Бутенко А М, Алипер Т.И Тест-система на основе ПЦР в реальном времени для выявления вируса ЛДР//Ветеринария -2007 -№6 -С 53-55

5 Белов А В., Ларичев В Ф , Галкина И В , Константинова И Д, Музыка И С , Бутенко А М, Галегов Г А Изучение активности отечественного рибавирина в опытах m vitro на моделях вирусов КГЛ, ЛДР, Тягиня и Дхори //Вопросы вирусологии -2008 — №1 -в печати.

Подписано в печать 26 09 2007 г Исполнено 26 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 776 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 уууулу аШогеГега! ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белов, Артем Владимирович

Список сокращений.

Введение.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Эпидемиология ЛДР.

2. Клиника, патогенез ЛДР.

3. Систематическое положение, морфология, молекулярно-биологическая характеристика В ЛДР.

4. Молекулярные аспекты эволюции и филогенетика В ЛДР.

5. Лабораторная диагностика ЛДР.

6. Профилактика и лечение ЛДР.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-биологическая и вирусологическая характеристика вируса лихорадки долины рифт и создание тест-систем для диагностики этой инфекции"

Лихорадка долины Рифт (ЛДР) - это зоонозная, особоопасная вирусная инфекция, распространенная во многих странах Африки и Ближнего Востока. Вирус ЛДР относится к роду Phlebovirus семейства Bunyaviridae. Он обладает выраженной патогенностью для человека и многих видов диких и домашних копытных животных. В эндемичных регионах заболеваемость ЛДР регистрируется в виде спорадических случаев, эпидемических вспышек крупных эпидемий и эпизоотий.

У человека болезнь в основном проявляется как гриппоподобная лихорадка и в большинстве случаев заканчивается выздоровлением. Средний уровень летальности составляет приблизительно 3%, однако развитие отягченных форм заболевания, сопровождающихся геморрагическим синдромом, некрозом печени и менингоэнцефалитами, приводит к резкому увеличению летальности (до 30%). Такие осложненные формы ЛДР наиболее часто наблюдаются во время эпидемий, которым предшествовали эпизоотии среди домашних животных [63].

Лихорадка передается через укусы комаров, при контакте с тканями и кровью заболевших животных, а также аэрогенным путем при вдыхании вируссодержащих аэрозолей. По этим причинам, группу наибольшего риска заболевания ЛДР составляют фермеры, ветеринары, пастухи, работники скотобоен и лабораторный персонал, осуществляющий манипуляции с вирусом [47].

Развитие эпизоотий и эпидемий, интервал между которыми составляет несколько лет, связано с выпадением обильных осадков, когда происходит массовое размножение комаров [55].

Крупные эпидемии и эпизоотии были* зарегистрированы в ЮАР (1974-75 гг.), Египте (1977-78 гг.), Мавритании (1987 г.), на Мадагаскаре (1991 г.), в Кении (1997 г.), в Саудовской Аравии и Йемене (2000-01 гг.) [14]. Во время масштабной эпидемии в Египте в 1977-78 годах было зарегистрировано 18000 случаев ЛДР с 600 летальными исходами [63]. В Саудовскую Аравию и Йемен, впервые за пределы Африки, вирус распространился, вероятно, с инфицированным домашним скотом из Восточной Африки или был перенесен комарами [59].

Лихорадка долины Рифт наносит огромный экономический ущерб сельскому хозяйству, так как обуславливает высокую гибель молодняка, а также приводит к возникновению абортов у 80-100% больных животных [63].

Наряду с другими нозологическими формами вирусных геморрагических лихорадок ЛДР относится к категории карантинных инфекций и требует особого внимания к завозу этого заболевания из эндемичных регионов инфицированными лицами. Импорт копытных животных также может быть причиной интродукции вируса ЛДР на неэндемичные территории. Наконец, вирус ЛДР рассматривается (наряду с вирусами других геморрагических лихорадок) в качестве агента высшей категории «А» для применения в биотеррористических целях [29].

В связи с вышеперечисленными обстоятельствами разработка и совершенствование методов специфической диагностики и средств лечения ЛДР на основе всестороннего изучения свойств вируса ЛДР представляются актуальными направлениями для науки и практики, учитывая факт отсутствия отечественных диагностических и лечебных препаратов.

Цели и задачи исследования

Цели настоящего исследования заключались:

- в проведении филогенетических исследований референтного штамма Entebbe вируса ЛДР;

- в создании отечественных тест-систем на основе совмещенных реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), и иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики ЛДР;

- в изучении действия лекарственных препаратов на цитопатогенную активность вируса ЛДР.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Культивировать и идентифицировать штамм Entebbe вируса ЛДР из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов.

2. Определить полную нуклеотидную последовательность гена Gn референтного штамма вируса ЛДР. Определить филогенетические связи референтного штамма Entebbe вируса ЛДР с другими штаммами этого вируса на основе анализа нуклеотидных последовательностей участка гена Gn. Проанализировать аминокислотные замены в антигенных эпитопах гликопротеина Gn у близких к референтному штаммов;

3. Разработать тест-системы «гнездового» варианта ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для диагностики ЛДР, отработать условия ПЦР на референтном штамме. Определить чувствительность и специфичность разработанных тест-систем.

4. Сконструировать генно-инженерный положительный контроль для использования в тест-системах ПЦР.

5. Разработать тест-систему ИФА для выявления антигена вируса ЛДР, определить ее чувствительность и специфичность. Сравнить чувствительность ИФА и ПЦР тест-систем.

6. Изучить действие отечественного препарата «рибавирин», синтезированного в Институте биоорганической химии с помощью нового биотехнологического метода, и производных данного препарата на цитопатогенную активность вируса ЛДР.

Научная новизна и практическая значимость

1. Проведены филогенетические исследования референтного штамма Entebbe вируса ЛДР из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов. Установлены значимые различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов гликопротеина Gn у двух линий штамма Entebbe и аттенуированного штамма Smithburn вируса ЛДР, что можно объяснить различиями в условиях культивирования этих штаммов.

2. Созданы отечественные тест-системы «гнездового» варианта ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для диагностики ЛДР с использованием оригинальных праймеров. Тест-системы для диагностики лихорадки долины Рифт могут быть использованы в диагностических лабораториях и ветеринарных хозяйствах. Разработанные тест-системы прошли сертификацию во Всероссийском Государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ВГНКИ). Подготовлены проекты стандартов организации (СТО) и наставления для данных тест-систем.

3. Сконструирован генно-инженерный положительный контроль для использования в тест-системах ПЦР.

4. Разработана .и охарактеризована тест-система ИФА для выявления антигена вируса ЛДР. Подготовлены компоненты, необходимые для создания тест-систем ИФА для выявления антител классов М и G к вирусу ЛДР.

5. В опытах in vitro на модели вируса ЛДР впервые проведено изучение противовирусной активности отечественного препарата «рибавирин» и его производных, полученных в Институте биоорганической химии при помощи нового биотехнологического метода. Отечественный рибавирин, в отличие от тестированных серий его производных, обладал выраженным противовирусным действием.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участка гена Gn (736 нуклеотидных оснований) штаммов вируса ЛДР показал, что наиболее близким к штамму Entebbe является штамм Lunyo. Показано различие аминокислотных последовательностей антигенных эпитопов гликопротеина Gn у двух линий штамма Entebbe и аттенуированного штамма Smithburn.

2. Разработаны чувствительные и специфичные тест-системы ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления РНК вируса ЛДР. Чувствительность обоих диагностикумов составила 7 БОЕ.

3. Сконструирован генно-инженерный положительный контроль для использования в тест-системах ПЦР, представляющий собой бактериальную плазмиду со вставкой фрагмента гена нуклеокапсидного белка N вируса ЛДР.

4. Разработана и охарактеризована высокоспецифичная тест-система ИФА для выявления антигена вируса ЛДР. Ее чувствительность составила 2,1хЮ БОЕ, то есть оказалась на порядок ниже чувствительности тест-систем ПЦР.

5. Исследована (противовирусная, активность отечественного препарата «рибавирин», синтезированного с использованием нового биотехнологического метода. Показано, что данный препарат эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса ЛДР в культуре клеток Vero Е6. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 4,0 lglin/ko при максимальной концентрации препарата (1000 мкг/мл). Наряду с этим, испытанные серии производных рибавирина не обладали противовирусной активностью в отношении вируса ЛДР.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение заболеваний, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21-23 июня 2006 г.) и на расширенном пленуме проблемной комиссии «Арбовирусы» и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбовирусные инфекции» (Астрахань, 17-20 октября 2006 г.). •

Материалы диссертации были доложены и рассмотрены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 13 сентября 2007 г.

Публикации

По результатам диссертации опубликовано 2 статьи в центральных научных журналах и 3 тезисов докладов в сборниках конференций.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, 6 глав Собственных исследований, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы (10 отечественных, 97 зарубежных авторов). Объем работы составляет 108 страниц машинописного текста, иллюстрированного 8 таблицами и 11 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Белов, Артем Владимирович

ВЫВОДЫ

1. В результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка гена Gn (736 нуклеотидных оснований) референтного штамма Entebbe и 40 других африканских изолятов вируса ЛДР было показано, что штамм Entebbe из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов наиболее близок другому угандийскому штамму Lunyo. Показаны значимые различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов поверхностного гликопротеина Gn у близких штаммов вируса ЛДР: Smithburn (аттенуированный вариант штамма Entebbe) и двух линий штамма Entebbe: из лаборатории биологии и индикации арбовирусов и из CDC (Атланта, США).

2. С использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров созданы высокоспецифичные тест-системы «гнездового» варианта ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в реальном времени для детекции РНК вируса ЛДР. Их специфическая чувствительность составила 7 БОЕ.

3. Для использования в тест-системах ПЦР сконструирован генно-инженерный положительный контроль, представляющий собой плазмиду pGEM-T Easy со вставкой фрагмента гена нуклеокапсидного белка N вируса ЛДР.

4. Разработана и охарактеризована тест-система ИФА для обнаружения антигенов вируса ЛДР, обладающая выраженной специфичностью и чувствительностью, эквивалентной 2,1x10 БОЕ. Специфические компоненты, используемые в этой тест-системе, являются основой для создания тест-систем ИФА. для'выявления антител IgM и IgG к вирусу ЛДР в крови больных людей и животных.

5. В опытах in vitro на модели вируса ЛДР установлена выраженная противовирусная активность оригинального отечественного препарата «рибавирин». Индексы его противовирусной активности варьируют от 2,0 lgUn^o (при концентрациях препарата 62,5 - 250 мкг/мл) до 4,0 ^ЦПД5о при концентрации 1000 мкг/мл). Тестированные производные рибавирина (метилрибавирин и метил-2'-дезоксирибавирин) не обладают противовирусной активностью даже при максимальной концентрации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белов, Артем Владимирович, Москва

1. Дроздов С.Г. Лихорадка долины Рифт // ЖМЭИ. 1984, №1. - с.3-8.

2. Гребенникова Т.В. Метод ПЦР в диагностике и мониторировании лечения инфекционных заболеваний // Методические указания для студентов медицинского факультета РУДН. М., 2005. - С.21-23.

3. Константинова И.Д., Есипов Р.С., Муравьева Т.И., Таран С.А., Веревкина К.Н., Гуревич А.И., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Способ получения 1-(3-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (Рибавирина). // Патент РФ № 2230118 от 21.08.2002.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 480 с.

5. Методические' рекомендаций по диагностике и профилактике тропических вирусных геморрагических лихорадок. М., 1980, с. 1-20.

6. Общая и частная вирусология // Под. ред. В.М. Жданова и С.Я. Гайдамович. М., Медицина, 1982, 517 с.

7. Руководство по тропическим болезням / Под ред. А.Я. Лысенко. 4-е издание. -М.: Медицина, 1983, 512 с.

8. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина И.В. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998. - 928 с.

9. Яскович Г.А., Яковлева Е.П. Микробиологический синтез виразола иммобилизованными-клетками'//Прикладная биохимия и микробиология. -1999.-Т. 35, №27, С.146-149.

10. An Rift Valley fever epidemic in Southern Mauritania / Jouan A., Le Suenno В., Digoutte J. et al. // Ann. Inst. Pasteur Virol. 1988. - V.139, N.3. -P.307-308.

11. Anderson G.W. and Smith F.J. Immunoelectron microscopy of Rift Valley fever viral morphogenesis in primary rat hepatocytes // Virology. 1987. - V. 161, N.l -P.91-100.

12. Anderson G.W. and Peters C.J. Viral determinants of virulence for Rift Valley fever in rats // Microb. Pathol. 1988. - V.5, N.4. - P.241-250.

13. Balkhy H.H. and Memish Z.A. Rift Valley fever: an uninvited zoonosis in the Arabian peninsula // Int. J. of Antimicrob. Agents. 2003. - V.21. - P.153-157. ' ' ' . " Л '■:>■

14. Becerra S.P., Rose J.A., Hardy M., Baroudy B.M., Anderson C.W. Direct mapping of adeno-associated virus capsid proteins В and C: a possible ACG initiation codon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V.82. - P.7919-7923.

15. Billecocq A., Spiegel M., Vialat P., Kohl A., Weber F., Bouloy M., Haller 0. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription // J. of Virology. 2004. - V.78. - N.l8. -P.9798-9806.

16. Bishop D.U.L. The Senetic Basis for Describing viruses as species // Intervirology. 1985. - N.24. - P.79-93.

17. Bishop D.U.L. and Beaty B.J. Molecular and biochemical studies of the evolution infection and transmission of insect bunyaviruses // Phil. Trans. Roy. Soc. London B. 1988. - V.321, N.1207. - P.463-483.i.\ (i^iil i\ .; i ni i I.

18. Bishop D.H., Gay M.E., Matsuoko Y. Nonviral heterogeneous sequences are present at the 5' ends of one species of snowshoe hare Bunyavirus S complementary RNA //Nucleic Acids Res. 1983. - V.ll, N.18. -P.6409-6418.

19. Bouloy M., Plotch S.J., Krug R.M. Globin mRNAs are primers for the transcription of influenza viral RNA in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1978. V.75, N.10. - P.4886-4890.

20. Broom J.C. and Findlay G.M. Complement fixation in Rift Valley fever // Lancet. 1931. - N.l. - P.609-611.

21. Brown J.L., Dominik J.W., Morrissey R.L. Respiratory infectivity of a recently isolated Egyptian strain of Rift Valley fever virus // Infection and Immunity. 1981. - V33, N.3. - P. 848-852.

22. Bunyaviruses and Bunyaviridae / Porterfield J.S., Casals J., Chumakov M.P., Gaidamovich S.Y. et al.'// Ihtervirology. 1975/76, N.6. - P. 13-24.

23. Bunyaviridae. Bishop D.U.L., Calisher C.U., Casals G.P., Chumakov M.P., Gaidamovich S.Y. // Intervirology. 1980. - V.14. - P.125-143.

24. Bunyaviridae: the viruses and their replication. Shmaljohn C.S., Hooper J.W. / Field's Virology. Philadelphia, 2001. - P.1581-1602.

25. Clarke D.U., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutination-inhibition with arthropod-borne viruses // Ann. J. Trop. Med. Hyg. 1958. -N.7. -P.562-573.

26. Collett M.S. Messenger RNA of the M segment RNA of Rift Valley fever virus // Virology: 1986.- V.l51; -РЛ51-156.

27. Crimean-Congo Hemorrhagic fever. A global perspective / Ed. by Ergonul 0. and Whitehouse C.A. Springer, the Netherlands. - 2007. - P.4.

28. Curran J. and Kolakofsky D. Ribosomal initiation from an ACG codon in the Sendai virus P-C mRNA // EMBO J. 1988. - V.7. -P.245-251.

29. Daubney R., Hudson J.R. and Garuham P.C. Epizootic hepatitis of Rift Valley fever an undescribed virus disease of sheep, cattle and Nan from East Africa // J. of Pathol, and Bacteriol. 1931. - V.34. - P.545-579.

30. Dewey R.A., Semorile L.C., Grau O., Crisci J.V. Cladistic analysis of Tospovirus using molecular characters // Mol. Phylogenet. Evol. 1997. - V.8. -P. 11-32.

31. Digoutte J.P., Present status of an arbovirus infection: yellow fever, its natural history of hemorrhagic fever, Rift Valley fever // Bull. Soc. Pathol. Exot. -1999.-V.92.-P. 343-348.

32. Eisa M. and Obeid H.M. Rift Valley fever in the Sudan // Bull, of An. Health and Product in Africa. -1977. V.24. - P.349-355.

33. Eisa M. and Obeid H.M. Isolation and identification of the virus from a recent epizootic in Kosti District 1973 // Bull, of An. Health and Product in Africa. - 1977. - V.24. - P.343-347.

34. Elliott R.M. The Bunyaviridae. New York, Plenum Press, 1996,1250p.

35. El Mekki, van der Groen. Detection of Rift Valley fever by the fluorescent antibody technique. in .organs-^of.experimentally infected animals // J. Virol. Methods. 1981. -N.3. - P.61-63.

36. Findlay S.U. Rift Valley fever or enzootic hepatitis // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1931. - V.25. - P.229.

37. Gerdes G.H. Rift Valley fever// Vet. Clin. North. Am. Food. Anim. Pract. -2002. V. 18. -1^.549-555.

38. Gerrard S.R. and Nichol S.T. Characterization of the Golgi retention motif of Rift Valley fever virus GN glycoprotein // J. of Virology. 2002. - V.76, N.23. -P.12200-12210.

39. Gerrard S.R. and Nichol S.T. Synthesis, proteolytic processing and complex formation of N-terminally nested precursor protein of Rift Valley fever virus glycoproteins // Virology. 2006. - in press.

40. Gupta K.C. and Patwardhan S. ACG, the initiator codon for Sendai virus protein//J. Biol.1 Chem. 1988. - V.263. -P.8553-8556.

41. Hann S.R., King W., Bentley D.L., Anderson C.W., Eisenman R.N. A non-AUG translation initiation in c-myc exon 1 generates an N-terminally distinct protein whose synthesis is disrupted in Burkitt's lymphomas // Cell. 1988. -V.52. -P.185-195.

42. Hoogstraal H., Meegan J.M., Khalil G.M., Adham F.K. The Rift Valley fever epizootic in Egypt 1977-78. Ecological and entomological studies // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1979. - V.73, N.6. - P.624-629.

43. Ikegami Т., Won S., Peters C.J., Makino S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed)from an incoming anti-viral-sense S RNA segment // J. of Virology. 2005. - V.79, N.18. - P. 12106-12111.

44. Ikegami Т., Peters C.J., Makino S. Rift Valley fever virus nonstructural protein NSs promotes viral RNA replication and transcription in a minigenome system // J. of Virology. 2005. - V.79, N.9. - P.5606-5615.

45. Kashula V.R. Rift Valley fever as a veterinary and medical problem // J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1957.-V.131, N.5. -P.219-221.

46. Keegan К. and Collett M.S. Use of bacterial expression cloning to define the amino acid sequences of antigenic determinants on the G2 glycoprotein of Rift Valley fever virus // J. of Virology. 1986. - V.58, N2. - P.263-270.

47. Kouka Saad El Din, Abdel-Wahab, El Bar L.M. Rift Valley fever virus infections in Egypt pathological and virological bindings in man // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1979. - V.72, N.4. - P.392-396.

48. Legatsas G. and Weiss K.E. Electron microscopic studies on BHK-21 cells infected with Rift Valley fever virus // Arch. Gesamte Virusforsch. 1968. - V.25, N.1.-P.58-64.

49. Le May N., Dubaele S., De Santis L.P., Billecocq A., Bouloy M., Egly J-M. TFIIH transcription factor, a target for the Rift valley hemorrhagic fever virus // Cell. 2004. - V. 116. - P.541-550.

50. Lupi 0., Tyring S.K. Tropical dermatology: viral tropical diseases // J. Am. Acad. Dermatol. 2003. - V.49, N.6. - P.989-1000.

51. Mahy B.W. Zoonoses and hemorrhagic fever // Dev. Biol. Stand. 1998. -V.93. -P.31-36.

52. Matumoto M., Iwrsa S., Endo M. Complement fixation reaction of Rift valley fever virus // Jap. J. Exp. Med. -1950. V.20. - V.20. - P.501-558.

53. Mear S.A., Swanepoel R. and Gelfand M. Rift valley fever encephalitis. A description of a case // Cent. Afr. Med. 1979. - V.25. - P.8-11.

54. Miller B.R., Godsey M.S., Crabtree M.B. et al. Isolation and genetic characterization of RVFV from Aedes vexans arabiensis, Kingdom of Saudi Arabia // Emerg. Inf; Dis.- 2002. V.8-'Ш2. - P. 1492-1494.

55. Mims C.A. and Mason P.J. Rift valley fever in mice. The properties of a hemagglutinin present in infective serum // Brit. J. Exp. Path. 1956. - V.37. -P.423-433.

56. Morbill J.C., Jennings G.B., Caplan H., Turell M.J. Pathogenecity and immunogenecity of a mutagen-attenuated Rift Valley fever virus immunogen in pregnant ewes // J. Vet. Res. 1987. - V.48. - P. 1042-1047.

57. Nabeth P., Kane Y., Abdalahi M.O., Diallo M. et al. Rift Valley fever outbreak, Mauritania, 1998: seroepidemiologic, virologic, entomologic and zoologic investigations. // Emerg. Infect. Dis. 2001. - V.7. - P.1052-1054.

58. Niklasson B. Rift valley fever. Evaluation of a vaccine and development of rapid diagnostic tests. Stockholm, 1984. - 124 p.

59. Niklasson В., Meadors G.F., Peters C.J. Active and passive immunization against Rift Valley fever virus infection in Syrian hamsters // Acta Pathologica, Microbiol, et Immunol. Scandinavica. 1984. - V.92, N.4. - P. 197-200.

60. Niklasson В., Grandien M., Peters C.J., Sargan T.P. Detection of Rift Valley fever virus antigen by Enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol.-1983.-.V.17,N.6.^.1026.1031.

61. Niklasson В., Meegan G.M., Bengtsson B. Antibodies to Rift Valley fever in Swedish soldiers in Egypt and the Sinai Scand // J. Infect. Dis. 1979. - N.l 1. -P.313-318.

62. Patterson J.L., Kolakofsky D // Characterization of La Crosse virus small-genome transcripts // J. Virol. 1984. - V.49, N.3. - P.680-685.

63. Peters C.J. and Anderson G.W. Pathogenesis of Rift Valley fever // Contributions to Epidemiology and Biostatistics. 1981, N.3. - P.21-41.

64. Peters C.J., Jones D., Trotter R., Donaldson J. Experimental Rift Valley fever in rhesus macaques // Arch. Virol. 1988. - V.99, N.l-2. - P.31-34.

65. Peters C.J., Liu C.T., Anderson G.W., Morril J.C., Jahrling P.B. Pathogenesis of viral hemorrhagic fevers: Rift Valley fever and Lassa fever contrasted // Rev. of Inf. Dis. 1989. - V.l 1, Suppl.4. - 743-749.

66. Pini A., Lund L.J., Davies F.A. Detection of Rift Valley fever virus by the fluorescent antibody technique in'brgans' of experimentally infected animals // Res. Vet. Sci. 1970. - V. 11. - P.80.

67. Poelwijk F., Prins M., Goldbach R. Completion of the impatiens necrotic spot virus genome sequence and genetic comparison of the L proteins within the family Bunyaviridae // J. Gen. Virol. 1997. - V.78. - P.543-546.

68. Prats H., Kaghad M., Prats A.C. et al. High molecular mass forms of basic fibroblast grouth factor are initiated by alternative CUG codons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V.86. - P.1836-1840.

69. Randall R., Gibbs C.J., Anlisio C.G., Binn L.N. The development of a formalin-killed Rift Valley fever vaccine for use in man // J. Immunol. 1962. -V.98, N.5.-P.660-671.

70. Rapid detection of Rift Valley fever virus antigen in the serum of infected lambs / C.J. Peters, W.U. Ennis, M.J. Turell // Res. Virol. 1989. - V. 140, N.l. -P.43-46.

71. Rapid diagnosis of Rift Valley fever. A comparison of methods for the direct detection of viral antigen in human sera / J. Meegan, B. Le Guenno, T. Ksiazek // Res. Virol. 1989. - V.140, N.l. - P.59-65.

72. Rift Valley fever, among\domesticv animals in the recent West African outbreak / T.G. Ksiazek, A. Jouan, J.M. Meegan // Res. Virol. 1989. - V.140, N.l. -P.67-77.

73. Rift Valley fever an emerging human and animal problem. World Health Organization. Geneva, 1982. - 1-67 p.

74. Rift Valley fever studies // Egypt Morbidity and Mortality weekly report. -1980. V.28, N.51. - P.617.

75. Rift Valley fever infections in Egypt pathological and virological findings in men / K.S.E. Abdel-Wahab, L.M. El-Baz, E.M. El Tayeb et al. // Trans. R. Soc. Trap. Med. Hyg. 1978. - V.72v-P.392-396.

76. Rossi C.A. and Turell M.J. Characterization of attenuated strains of Rift Valley fever virus // J. Gen. Virol. 1988. - V.69, N.4. - P.817-823.

77. Sail A.A., Zanotto P.M., Sene O.K., Zeller H.G., Digoutte J.P., Thiongane Y., Bouloy M. Genetic reassortment of Rift Valley fever virus in nature // J. of Virology.-1999. V.73,N;10. - P.8196-8200.

78. Sail A.A., Thonnon J., Sene O.K. Single tube and nested RT-PCR for detection of RVFV in human and animal sera // J. Virol. Methods. 2001. - V.91. -P.85-92.

79. Sail A.A., Macondo E.A., Sene O.K., Diagne M. et al. Use of RT-PCR in early diagnosis of Rift Valley fever // Clin, and Diagn. Lab. Immunol. 2002. -V.9, N.3. - P.713-715.

80. Shawky S. Rift Valley fever // Saudi Med. J. 2000. - V.21. - P.1109-1115.

81. Scherer W.F., Eddy G.A., Monath T.P. et al. Laboratory safety for arboviruses and certain other viruses of vertebrates // Am. J. Trop. Med. Hyg. -1980. V.29, N.6.-P.1359-1381.

82. Shimshony A. and Bazzilai R. Rift Valley fever // Adv. Vet. Sci. сотр. Med. New York. 1983. - V.21. - P.347-425.

83. Shirae H., Yokozeki K., Kubota K. Enzymatic production of ribavirin // Agric. Biol. Chem. 1988. - V. 52, N. 1. - P.295-296.

84. Shoemaker Т., Boulianne C., Vincent M.J. et al. Genetic analysis of viruses associated with emergence of RVF in Saudi Arabia and Yemen, 2000-01 // Emerg. Inf. Dis. -2002. V.8, N.12. -P.1415-1420.

85. Shope R.E., Meegan J.M., Peters C.J. Rift Valley fever / Eds T.A. Swartz, M.A. Kligberg, N. Goldblum. Basel, 1981.42-52p.

86. Shope R.E., Peters C.J., Walker J.S. Serological relation between Rift Valley fever virus and virus of phlebotomus fever serogroup // Lancet. 1980. -V.19, N.4. -P.886-887.

87. Shortridge K.F. Hemagglutination of trypsin-modified human erythrocytes by Chagres virus // Arch. Virol. 1976. - V.52. - P.181-186.

88. Sidwell R.W. and Smee D.F. Viruses of the Bunya- and Togaviridae families: potential as bioterrorism agents and means of control // Antiviral. Res. -2003. V.57. -P.101-111.

89. Sidwell R., Huffman H., Barnett B.B., Pifat D.Y. In vitro and in vivo Phlebovirus inhibition by ribavirin // Antimicrob. Agents and Chemotherapy. -1988. V.32, N.3. - P.331-336.

90. Smithburn K.C. Rift Valley fever: the neurotropic adaptation of virus and experimental use of this modified virus as a vaccine // Brit. Exp. Pathol. 1949. -V.30.-P.1-8.

91. Suzich J.A., Collett M.S. Rift Valley fever virus M segment: cell-free transcription and translation of virus-complementary RNA // Virology. 1988. -V.164. -P.478-486.

92. Suzich J.A., Kakach L.T., Collett M.S. Expression strategy of a phlebovirus: biogenesis of proteins from the Rift Valley fever virus M segment // J. Virol. 1990. - V.64. - P.1549rl555.

93. Swanepoel R. Studies on the epidemiology of Rift Valley fever // J. S. Afr. Assoc. 1976. - V.47, N.2. - P.93-94.

94. Swanepoel R., Blackburn N.K., Efstrationsend J.B. Studies of Rift Valley fever in some African murids (Rodentia: Muridae) // J. Hyg. Camb. 1978. -V.80. -P.183-196. ' ' -:

95. Swanepoel R., Manning В., Watt J.C. Fatal Rift Valley fever of man in Rhodesia // Cent. Afr. J. Med. 1979. - V.25. - P.l-7.

96. Virology, second edition / Ed. by Fields B.N., Knipe D.M. et al. New York, Raven Press, 1990,1515 p.

97. Wasmoen T.L., Kakach L.T., Collett M.S. Rift Valley fever virus M segment: cellular localization of M segment-encoded proteins // Virology. 1988. - V.166. - P.275-280.

98. WHO/IZSTe consultation on recent developments in RVF. WHO collaborating centre for research and training in veterinary epidemiology and management. Civitella del Tronto Italy, 14-15 Sept., 1993, p.23.

99. Weiss K.E. Rift Valley fever a review // Bull. epiz. Dis. Afr. 1957. -N.5. -P.432-458.

100. Weiss K.E. Studies on Rift Valley fever passive and active immunity in lambs // Onderstepoort J. Vet. Res. 1962. - V.9, N.l. -P.3-9.

101. Zeller H. and Bouloy M. Infections by viruses of the families Bunyaviridae and Filoviridae // Rev. Sci. Tech. 2000. - V. 19. - P.79-91.1. Благодарности