Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологическая характеристика Дсгр-мутации S. typhimirium и методика ее генетической передачи

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая характеристика Дсгр-мутации S. typhimirium и методика ее генетической передачи"

На правах рукописи

УДК 579.842.14:577.218:57.053.4

Г-' л Ч?

ТЫЙЧУК Сергей Николаевич

1.50ЛЕКУЛЯРН0-БИ0Л0П1ЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА йсгр-МУТАЦИИ ЬурЫтиНют И МЕТОДИКА ЕЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПЕРЕДАЧИ

(Специальность: 03.00.07 - микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова.

Научные руководители: академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор А.А.Воробьев; доктор биологических наук, профессор М.Н.Бойченко.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Г.Лиходед;

Лауреат Государственной премии СССР,

доктор биологических наук, профессор Е.Г.Зезеров.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова

Защита состоится "_" _ 1997г. в _ часов на

заседании диссертационного Совета Д 074.05.10 при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (119881, Москва, ул. Б. Пироговская д.2/6 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (119881, Москва, Зубовский бульвар, 37/1).

Автореферат разослан "_" _ 1997г

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат медицинских наук, доцент

А.Ю.Миронов

Актуальность теми. Актуальность данной темы обусловлена тем, что инфекционные заболевания сохраняют лидирующие места в структуре заболеваемости, и смертности как в мире, так и в РФ. Это делает специфическую активную профилактику инфекционных заболеваний задачей первостепенной важности. Среди перспективных вакцин наибольшее внимание привлекают мультивалентные генно-инженерные векторные вакцины, на основе аттенуированных микроорганизмов-переносчиков гетерогенных антигенов. Получение подобных вакцин осуществляется с помощью методов генной инженерии и выражается в создании системы вектор-хозяин, способной экспрессировать ряд чужеродных протективных антигенов и осуществлять их доставку в различные эффекторные органы иммунной системы. Общепризнанными и наиболее распространенными носителями, для создания таких вакцин, являются аттенуированные штаммы бактерий рода Salmonella, семейства Enterobacteriacea, обладающие рядом определенных преимуществ перед другими видами микроорганизмов.

Кроме того, аттенуированные штаммы сальмонелл могут непосредственно использоваться для профилактики сальмонеллеаа животных, что достоверно снижает заболеваемость сальмонеллезом среди людей, так как животные являются основным источником возбудителей этой инфекции. Садьмонеллез представляет, на сегодняшний день, одну из актуальных проблем современной медицины и ветеринарии, являясь одним из самых распространенных аооантропонозов в развитых странах.

Существует большое разнооборазие как мутаций, приводящих к аттенуации сальмонелл, так и способов их получения. Однако, жесткие требования предъявляемые к векторным вакцинным штаммам резко сужают круг мутаций пригодных для использования. Одним из новых важных требований появившихся с развитием молекулярной биологии стала генетическая характеристика полученных мутаций.

Мутации в цАШ-регуляторной системе соответствуют этим требованиям. Суа и сгр мутации являются двумя независимыми мутациями, находящимися на достаточно большом расстоянии на генетической карте, что исключает возможность их перекрывания вторичными мутациями; мутационные повреждения в генах суа и сгр у сальмонелл приводят к снижению вирулентности бактерий без снижения их имму-ногенных свойств и способности приживаться в макроорганизме, что особенно важно для векторного штамма; подобные мутанты демонстрируют хороший протективный эффект на моделях животных и добровольцах. В связи с этим создание специальных донорных штаммов сальмонелл, несущих детерминированные делеционные суа и сгр мутации, является актуальным для получения методами генетической рекомбинации широкого набора аттенуированных мутантов сальмонелл различных сероваров. Это позволит исключить использование химического и транспозонного мутагенеза, которые применялись для этих целей и приводили к появлению вторичных мутаций и нестабильности генома.

Расшифровка нуклеотидных последовательностей мутаций в данных генах и использование молекулярно-биологических методов для идентификации этих мутаций позволят контролировать передачу данных мутаций при создании штаммов, проводить четкую дифференциацию мутантных вакцинных штаммов от штаммов дикого типа и других типов мутантов со схожим фенотипом, в частности мутантов по генам фос-фотрансферной системы.

Цель настоящего »следования: Получить штамм-донор бсгр-мута-ции серовара БЛурИхшигШт с системой молекулярно-биологической идентификации мутации на основе ПЦР. Отработать оптимальную методику передачи сгр-мутации с использованием трансдукции в штаммы с генотипом суа.

- з -

Основные задачи исследования:

1. Получить штамм-донор сгр-мутации.

2. Охарактеризовать crp-мутацию полученного штамма.

3. Разработать систему идентификации сгр-мутации на основе ПЦР.

4. Отработать методику передачи охарактеризованной 5сгр-мутации с использованием трансдукции в штаммы Salmonella spp. с генотипом суа.

5. Получить двойной суа,сгр-мутант S.typhimurium, и изучить его биологические свойства.

Научная новизна: Работа носит приоритетный характер, так как в ней впервые в мире разработана тест-система на основе ПЦР для молекулярно-биологическай идентификации аттенуирующей бсгр-мута-ции у сальмонелл.

Практическая значимость:

1. Получен штамм S.typhimurium B-5S, с охарактеризованной бсгр мутацией, пригодный для использования в качестве донора этой мутации при получении двойных суа,сгр-мутантов, а также сгр-мутантов других сероваров сальмонелл.

2. Разработана тест-система на основе ПЦР позволяющая контролировать результат передачи вышеозначенной мутации, а также осуществлять мониторинг штаммов, несущих подобную мутацию при их использовании в полевых условиях.

3. Материалы диссертации предполагается использовать при чтении лекций по генетике микроорганизмов на кафедре микробиологии ММА им. И.М.Сеченова.

Апробация материалов диссертации: Материалы диссертации были представлены:

- На 7 съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва-1997г.

- На 8 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и

- 4 -

инфекционным заболеваниям. Лозанна-май, 1997г.

По теме диссертации опубликовано 3 статьи и Z тезисов в отечественной и зарубежной печати.

Апробация диссертации была проведена на научной конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова 26.06.1997г.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, главы материалов и методов, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 28 отечественных и 121 иностранную работу. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и ил-люстррована 7 таблицами, 5 рисунками и 11 фотографиями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

В работе были использованы следующие штаммы сальмонелл: Salmonella typhimurium 415 (суа+,сгр+), дикий тип. Получен из музея культур МНИИВС им. И.И.Мечникова. Salmonella typhimurium В-24 (суа,сгр+), прототроф. Штамм любезно предоставлен проф. Бойченко М.Н. Получен в 1978 г. Штачм защищен авторским свидетельством N 1124586 от 15.07.1984г.; Salmonella typhimurium В-5 (cyaf.crp::Тп10), прототроф. Штамм любезно предоставлен проф. Бойченко М.Н. Получен в 1990г.

Все используемые штаммы по своим морфологическим, культу-ралъным, биохимическим свойствам, антигенной структуре соответствовали свойствам бактерий серовара S.typhimurium.

Выбор для работы сальмонелл серовара typhimurium обусловлен тем, что среди представителей рода Salmonella геном S. typhimurium является наиболее изученным и последовательности нуклеотидов его генов представлены наиболее полно, что было важно для молекуляр-

но-биологической характеристики мутации. Кроме того представители серовара S.typhimurium, до настоящего времени, занимают лидирующие места в этиологической структуре сальмонеллезов в разных регионах России и получение охарактеризованного аттенуированного штамма этого серовара является актуальным.

В работе такие использовался бактериофаг Р22. полученный из музея культур МЭМ им.Н.Ф.Гамалеи.

Для выращивания микроорганизмов использовали: LB - бульон фирмы "Sigma"; LB - агар фирмы "Sigma"; минимальную среду А [Миллер Д. , 1976г.3;

Для селекции и клонирования мутантов использовали базисную среду McConkey фирмы "Difco", с добавлением в качестве селектирующих маркеров Сахаров в конечной концентрации 10 мг/мл и антибиотика стрептомицина в количестве двух минимальных подавляющих концентраций (МПК) для дикого штамма. Вид сахара используемого в качестве селектирующего маркера указан в каждом конкретном эксперименте. Для клонирования также использовался агар Симмонса фирмы "Merk".

Для серотипирования сальмонелл использовали монорецепторные агглютинирующие сыворотки производства Ленинградского НИИ вакцин и сывороток.

Биохимические свойства штаммов определяли с помощью знте-ро-тестов фирмы "Lachema". Знтеро-тесты использовались согласно приложенной инструкции по применению.

Определение кинетики размножения культур в жидкой питательной среде производили по [Миллер Д., 19761.

Получение фаголизатов и определение их титров проводилось методом агаровых слоев, подробно описанным в [Р.Клаус, У.Хейс, 1970].

Трансдукция осуществлялась с помощью бактериофага Р22. За

основу была взята методика, описанная в [Миллер Д., 19763.

Пенициллиновая селекция проводилась по методике описанной в СР.Клаус, У.Хейс, 19703.

Исключение транспозона проводилось по модифицированной методике описанной в работе tMaloy S.R. 813.

Для оценки вирулентных свойств изучаемых культур определяли LDso, после внутрибрюшинного заражения белых беспородных мышей массой 12-14 г. LD50 определяли Ван дер Вардену [Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 19623.

Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) испытуемого антибиотика определяли методом серийных разведений в плотной питательной среде по общепринятой методике [Миллер Д., 19763.

Стабильность фенотипа проверяли путем определения частоты реверсии мутации к дикому фенотипу по восстановлению способности утилизировать цитрат в качестве единственного источника углерода на минимальном цитратном агаре и цитратном агаре Симмонса.

За основу при селекции суа и сгр мутантов была взята схема разработанная проф. Бойченко М.Н. и защищенная авторским свидетельством N 1387415 от 08-12-1987г.

Определение плазмидного профиля проводилось путем электрофореза тотальной ДНК исследуемых бактерий выделенной по методу Kado и Liu в 0.5% агарозном геле.

Для проведения ПЦР использовали реактивы фирмы "Силекс". Реакция проводилась в объеме 50 мкл. Состав реакционной смеси и режимы амплификации приведены при описании конкретных экспериментов. После завершения амплификации, исследуемые образцы подвергались электрофорезу в 81 полиакриламвдном геле и анализировались.

В качестве маркера молекулярного веса использовалась ДНК PUC19 рестрицированная Mspl.

- 7 -

Результаты исследования и их обсуждение

Для осуществления поставленных задач исследования, в качестве донора сгр-мутации был взят штамм S.typhimurium В-5(сгр::Тп10). Штамм обладал типичными для сальмонелл свойствами с особенностями, присущими CRP-фенотипу СБойченко М.Н., Воробьев A.A. 1992].: меньший размер колоний по сравнению с диким фенотипом, замедленное образование сероводорода, потеря способности утилизации в качестве единственного иточника углерода цитрата, мальтозы, сорбита, инозита, повышенная, по сравнению с диким типом, устойчивость к низким дозам стрептомицина, отсутствие реверсии к дикому фенотипу при добавлении экзогенного цАШ> (см. таб.1 и таб.2). Кроме того штамм обладал повышенной устойчивостью к тетрациклину (см. таб.2), что являлось маркером присутствия транспозона ТпЮ.

Транспозон ТпЮ, как и другие мобильные генетические элементы, является фактором генетической нестабильности и причиной возможных вторичных мутаций, а также несет маркер устойчивости к тетрациклину. Присутствие подобных элементов в геноме векторного вакцинного штамма противоречит требованиям ВОЗ предъявляемым к подобным микроорганизмам [Charles I., Dougan G. 19901. В связи с этим, мы исключили транспозон ТпЮ из штамма S.typhimurium В-5, с целью получения донорного штамма не содержащего мобильных генетических элементов и маркеров антибиотикорезистентности. Исключение транспозона из штамма S.typhimurium В-5 (сгр::Тп10) производилось по модифицированной методике описанной в работе [Maloy S.R. 813. У всех клонов, выросших на среде для исключения транспозонов, была исследована способность утилизации цитрата в качестве единственного источника углерода как в отсутствии так и присутствии экзогенного цАШ>. Кроме того, была определена чувствительность к антибиотикам тетрациклину и стрептомицину.

Таблица 1.

БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ

! . .. , / ТРРТ тл7ТТЛ- р\гс:ртрлт 1 с ЛурИтшпит 1 1 1

( X С.О 1 ШШ и О' СО I ГН I 1 1 415 | в-5 *! Б-53 1 ! В-24*! Т-10.1

|цитрат Симмонса 1 -г { - Г | 1

|индол | 1 - | | 1

|сероводород 1 + 1 X 1 х х 1 х 1

¡гидролиз мочевины | 1 - ! 1

|фенилаланиндезаминаза | - 1 - 1 - - ! - |

[реакция Фогес-Проскаузра| - 1 - | - 1 !

Iлизиндекарбоксилаза ! + 1 + | + + | + |

|орнитиндекарбоксилаза | + 1 4- 1 + + [

|аргининдегидролаза ! + 1 + | 4 + ] + |

|глюкоза ] + 1 + ! + + [ + ]

!лактоза | - 1 | - - | |

1маннит | + 1 X 1 х х 1

¡мальтоза | + ) - 1 - - | ~ !

1 сахароза ! - 1 - 1 - - | - 1

1 сорбит ) + 1 - 1 ! 1

|рамноза | + 1 X 1 х х 1 х 1

|трегглоза | •+ 1 X \ X х ! х 1

|целлобиоза | + 1 + 1 + + { + )

I инозит 1 + 1 - 1 - ! 1

|дульцит | + 1 - ! - - ! 1

(адонит | 1 - | - | ]

| малонат Ыа 1 - 1 - | - 1 1

¡цитрат На в присутствии | + 1 - | - + 1 - 1

1цАМФ I | 1 1 1 1 1 I

Примечание:

* - по данным д.б.н. Бойченко М.Н.

+ - проявление признака через 24 часа инкубации при 37°С; х - проявление признака через 48 часов инкубации при 37°С; - - отсутствие проявленияпривнака.

Таблица 2.

УСТОЙЧИВОСТЬ ШТАММОВ К АНТИБИОТИКАМ

1 1 МИНИМАЛЬНАЯ ПОДАВЛЯЮЩАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ | (мкг/мл) 1

i стрептомицина тетрациклина |

LB-агар i IMcConkey-! агар LB-агар i McConkey-! агар |

| S.typhimurium 415 | 20 1 15 5 2.5 |

| S.typhimurium В-5 ! 60 | 50 >40 40 !

| S.typhimurium B-5S| 60 | 50 2.5 2.5 |

| S.typhimurium B~24| >60 j 60 5 2.5 !

I S.typhimurium T-10| i . i >60 | 60 5 i 2.5 | i .. i

Для дальнейшей работы был взят клон обозначенный как S.typ-himurium B-5S (CRP).

Результаты, представленные в таблицах 1 и 2, показывают, что после исключения транспозона штамм S.typhimurium B-5S сохранил CRP-фенотип (штамм не утилизирует цитрат, мальтозу и ряд других Сахаров, обладает повьшеной по сравнению с диким типом устойчивостью к стрептомицину и добавление экзогенного цАМФ не вызывает реверсии к дикому фенотипу). Восстановление чувствительности к тетрациклину свидетельствует об элиминации транспозона ТпЮ.

Штамм агглютинируется 0-4 монорецепторной сывороткой, а его плазмидный профиль совпадет с таковым у S. typhimuriurn В-5.

Для молекулярно-биологической характеристики сгр-мутации в штамме B-5S было проведено сравнительное определение последовательности нуклеотидов сгр-гена у штаммов S.typhimuriurn 415 дикого типа и S.typhimuriurn B-5S (бсгр) дидезокситерминирующим методом по Сенгеру. Это исследование было любезно выполнено к.б.н. Пршш-повым А.Г.

Сравнительное исследование показало наличие делеции 7 пар нуклеотидов (п.н.) и сдвиг рамки считывания в начальном участке сгр-гена мутантного штамма. Делеция находится на расстоянии 15 п.н. от start-кодона. Кроме того, сдвиг рамки считывания, возникший в результате делеции, привел к образованию stop-кодона на расстоянии 81 п.н. от начала гена.

Сравнение последовательности нуклеотидов с обозначениями описанных изменений отображено на рис. 1.

Кроме того, проведенное исследование показало отсутствие транспозона ТпЮ в сгр-гене мутантного штамма, инсерцией которого был изначально получен данный мутант. Возможно, имеющаяся делеция является следствием исключения транспозона.

Для подтверждения данных определения нуклеотидной последовательности сгр-генов S.typhimuriurn B-5S и S.typhimuriurn 415, для упрощения диагностики и характеристики сгр-мутации в других штаммах, полученных с использованием S.typhimuriurn B-5S в качестве донора этой мутации, а также для быстрой идентификации штаммов выделенных из окружающей среды или от животных нами была разработана система диагностики, основанная на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Сравнительное определение последовательности нуклеотидов сгр-гена у сальмонелл дикого и мутангпноэо типа

8.»урЫмшиим 415 (кПй) в.♦урЫмшчим В-58<;Лсгр>

Й0> Й!^

5«-ТТ. ААА. ОСТ. ТАХ. ААС. А<Й. «А. ТМ. <ХХ1. СОС. 5«-ХТ. ААА. ОСТ. ТАТ .ААС. А<Й. ОйА. ТАА. СОЗ. СОС.

з&аир^-саЗит

-ЗЙс'. СТО. СТТ. ССС.ААА. ссс. сла.!ас\ -ATG.GTG.CTT.GQC.AAA,

я^иФ-соЛсп

САС

•РАС. ССС, АСТ .CTT.GMl.TGG> ТТС.ТТС. ТСТ.САТ.ТОС.-АСС'ай'СТС'ТТСААТ'бСГГ'ТСТ'ТОТ'СТС'АТТ'ССС-

дспбидя ? п.н! сдшг рамки считывания

-С^С.АТТ.САТ.МС.ТАС.ССС.ТСА.ААС.АСС.АСС.СГС.АТТ.САС.САС.ССГ.С^А.ААА.ССА.й^А.-- 'АС\'ТТС'АТА'А(Я'АСС'ССГ'СМ'АСА'йСА'ССС'^^'ТТС'АСС'А<Х'СТС'ААА'ААС'С\СААА-

¿Роойш ^__I

«5

-ACG.CIG.TAC.TAC -з1 -,'СОС*ТСГ''АСТ'АС -з4

Рис 1

Позиция прямых и обратных праймеров на схеме сгр-генов сальмонелл дикого и мутантного типов

«о

-10-6 о

15 ¡22

99 126

'"■'"■■""I1"...................1""

1 '

«5 -«--.....-

»4

^.....I.........I.....ЗД».......

I I

""* -Ч-......-1

«4

»0 .

¡"зг.1:

-10-6 О 15

I

' ДИКОГО ТИПА

деления СГр

..............

ЛЕА Е X ИР О ВАННЫЙ

*имммДм*

.........I

#0 - прямой праймер- З'-АГААССССССАТСбТССТТ-З* «1 - прямой праймер - З'-ССбСБСАТВСТССТТббСАА-З' #4 - Обратный праймер- З'-СТАСТАСАБССТТТСТССТТ-З'

«5 - обратный праймер- З'-СТебТСААТСАССеТбСТСТ-З' ГЦС (С

Таблица 3.

ПАРАМЕТРЫ ПРАЙМЕРОВ

1 1 | ПРАЙМЕР| 1 1 1 1 1 | ........! ДЛИНА ! (п.н.)| Тщ* (°С) ОБ** КОНЦЕНТРАЦИЯ РАСТВОРА ПРАЙМЕРА (пМ/мкл) ..........г ОБЪЕМ на 50 мкл 1 РЕАКЦ. СМЕСИ | (мкл) | 1 1 КОНЕЧНАЯ | См*** | (мкМ) |

1 1 1 «0 | 1 | 19 | 58 8.0 42 1 0.5 1 1 0.42 |

1 #1 1 1 | 20 | 66 2.7 13.5 1 1.5 | 1 0.405 |

1 1 1 «4 | 1 | 20 | 56 5.4 27 0.75 | 1 0.405 |

1 1 | #5 ! 1 .............1 20 | | 62 8.0 40 1 0.5 | ...... „ 1 0.40 | I

Примечание:

*Тт - температура отжига

температуру отжига рассчитывали по ориентировочной формуле (4*<3/С+2*А/Т)=Тт(отж.) **СЮ - оптическая плотность ***См - молярная концентрация

Последовательности нуклеотидов праймеров подбирали согласно данным первичной нуклеотидной последовательности с таким расчетом, чтобы зона делеции попадала в амплифицируемый участок гена (см. рис. 2). Для оптимизации реакции было использовано несколько вариантов праймеров:

Прямой праймер: 5'-ATAACCGCGCATGGTGCTT-3* - #0 Прямой праймер: 5'-CCQCGCATGGTGGTTGffiAA-3* - »1 Обратный праймер: 5*-GTAGTACASCGTTTCTGCTT-3' - «4 Обратный праймер: 5'-CTGQTGAATCAGGGTGCTCT-3' - #5 Параметры праймеров указаны в таблице 3. При использовании этих праймеров амплифицируемый участок сгр гена дикого типа будет на семь пар нуклеотидов длиннее аналогичного участка гена мутантного типа, что легко выявляется при электрофорезе в 8% полиакриламидном геле по разнице длины пробега.

За основу была взята стандартная методика ПЦР с использованием коммерческого набора реактивов. Был использован следующий состав реакционной смеси для каждой комбинации праймеров: стандартный ПЦР-буфер, содержащий 25 мМ MgCl2 (10-кратный концентрат)

- 5мкл; смесь дезокситрифосфатов (10 mM dNTP) - 4мкл; Taq-полиме-раза - 2.5 ЕД в 0.5мкд; праймер 1; праймер 2; проба (тотальная ДНК выделенная по методу Kado и Liu) - 2мкл; деионизованная вода

- до 50мкл. Конкретный объем раствора праймеров, вносимый в реакционную смесь, указан в таблице 3.

Для проведения ПЦР использовали следующие режимы: I-режим денатурации: 1 цикл - 94°С - 4мин.; Ii-режим амплификации(30 циклов):

94°С - 1мин.ЗОсек., 55°С - ЗОсек., 72°С - 45сек.; III-режим пролонгации: 1 цикл - 72°С - 5мин.

Для каждой комбинации использовались две матрицы из S.typhimuriurn 415 и S.typhimuriurn B-5S, соответственно.

В результате проведенного исследования мы сделали следующие выеоды: при данных условиях реакции и данном составе реакционной смеси амплификация ДНК происходит; разница в 7 п.н. между продуктами амплификации на матрицах дикого и делеционного типа легко определяется при электрофорезе в 8% полиакриламидном геле; однако, отмечается наличие дополнительных, более тяжелых фрагментов, которые являются продуктами амплификации происходящей вследствие неспецифичной дополнительной посадки обратных праймеров (одинаковый спектр продуктов при использовании различных прямых праймеров); неспецифическое праймирование более выражено у праймера #4 (два дополнительных места посадки и более выраженный выход дополнительных продуктов); для дальнейшей работы целесообразно использовать комбинации праймеров #1-#5 и #0-й5; необходимо оптимизировать параметры ПЦР с целью повышения специфичности реакции при достаточном выходе продукта амплификации.

Оптимизация ПЦР осуществлялась путем подбора праймеров (см. выше), условий проведения реакции и состава реакционной смеси.

Оптимизация условий проведения реакции осуществлялась путем подбора адекватного температурного режима. Отказ от праймера «4 позволил повысить температуру отжига до 58-59°С. Кроме того, с целью повышения длительности "жизни" фермента (Тац-полимеразы), была изменена структура режима амплификации.

В конечном итоге мы остановились на следуюшдх условиях реакции:

1) режим денатурации: 1 цикл - 94°С-4мин.;

2) режим амплификации:

блок I (5 циклов): 94°С-1мин.ЗО сек. - 59°С-45сек. - 72°С-1мин.; блок 11(25 циклов): 94°С-45 сек. - 59°С-30 сек. - 72°С-45сек.;

3) режим пролонгации: 1 цикл - 72°С-5мин.

Оптимизация состава реакционной смеси производилась путем подбора концентрации составляющих и введения дополнительных компонентов, повышающих специфичность реакции.

За основу был взят коммерческий буфер для Тад-полимеразы (100ыМ Трис~НС1 рН 8.3 (20°С), 500мМ КС1 (10-кратный концентрат)) ("Силекс") не содержащий ионов В качестве добавки повышаю-

щей специфичность реакции в состав смеси был введен диметилсуль-фоксид (ДМСО), в конечной концентрации 10%. Кроме того, в реакционную смесь был введен глицерин в качестве добавки повышающей стабильность полимеразы и облегчающей денатурацию ДНК. Однако, комбинация ДМСО и глицерина резко понизила выход продукта, что заставило нас отказаться от последнего.

Оптимальная концентрация ионов Мг2+ подбиралась постановкой серии реакций с использованием стандартного 20мМ раствора МйШг ("Силекс"). Конечная концентрация ионов изменялась от 0.8 до 2.8 мМ/мл с шагом в 0.4 мМ/мл. Наибольший выход аыплификата наблюдался при конечной концентрации МеС12 1.6 мМ/мл.

В качестве материала для исследования, кроме тотальной ДНК клетки, выделенной по методу Лиу и Кадо, с целью упрощения производства анализа, мы также использовали суспензию клеток в концентрации *108-109 ка/мл подвергнутых кипячению. Оптимальное количество матрицы подбиралось путем серийных разведений материала взятого для исследования.

Подбор оптимальной конечной концентрации праймеров, также осуществлялся постановкой ПЦР с кратными разведениями исходных растворов олигонуклеотидов. Для данной концентрации матрицы она составила -0.2мкМ.

После внесенных изменений оптимизированный вариант реакционной смеси имел следующий состав:

- буфер для Taq-полимерааы, не содержащий ионов Mg2+ (10-кратный концентрат) - 5мкл;

- ДМСО (диметилсульфоксид, безводный) - 5мкл;

- смесь дезокситрифосфатов (10 птМ dNTP) - 4мкл;

- 20 mM MgClg - 4мкл;

- Taq-полимераза - 2.5 ЕД в 0.5мкл;

- праймер #0 - О.бмкл;

- праймер #5 - 0.5мкл;

- проба - 1мкл;

- деионизованная вода - до 50мкл.

ЩР-анализ штаммов S.typhimurimi 415 и S.typhimurium B-5S проводился по оптимизированной методике, описанной выше, с комбинацией праймеров #0 - #5. Результаты представлены на фото 1.

фото 1.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА CRP-ГЕНОВ ДИКОГО И МУТАНТНОГО ШТАММОВ 1 2 3 4

1) И 4). pUC19/MspI

2). S.typhimurium B-5S

3). S.typhimiirium 415

Проведенное исследование подтвердило наличие делеции у штамма B-5S (более легкий фрагмент) и отсутствие таковой у дикого

штамма (более тяжелый фрагмент). Кроме того с целью дополнительной идентификации амплификатов, их длина оценивалась путем сравнения с маркером риС19/Мзр1. Длина пробега продуктов амплификации приблизительно соответствовала длине пробега полосы маркера размером 110-111 п.н., что соответствует расчетным данным.

Таким образом, после исключения транспозона и характеристики повреждения в начальном участке сгр-гена методами секвенирования и полимеразной цепной реакции, штамм БЛурЫтшпит В-52 может претендовать на роль донора данной охарактеризованной сгр-мутации для получения двойных суа, сгр-мутантов и сгр-мутантов других се-роваров сальмонелл.

Данная бсгр мутация удовлетворяет требованиям предъявляемым к аттенуирующим мутациям, так как она: - делеционного типа; - вызывает сдвиг рамки считывания и образование стоп-кодона на расто-янии 81 пары оснований от начала гена, что практически полностью прекращает синтез продукта данного гена; - вызывает стойкое снижение вирулентности даже при самостоятельном использовании [Бой-ченко М.Н. 19923; - имеет фенотипические маркеры и систему идентификации позволяющие отличить штамм несущий мутацию от штаммов дикого типа. Кроме того, штамм несущий мутацию в сгр-гене не содержит транспозона ТпЮ, инсерцией которого была получена данная мутация, а также других маркеров устойчивости к антибиотикам.

Разработанная нами методика молекулярно-биологической идентификации полученной бсгр-мутации, основанная на разнице длин амплифицируемых участков сгр-генов мутантного и дикого типов, позволила разработать схему передачи этой мутации методом транс-дукции в штаммы с суа-генотипом.

За основу была взята схема разработанная проф. Бойченко М.Н. (Бойченко М.Н.-1987), в которую нами был внесен ряд изменений.

Модификация схемы связана с некоторым изменением направления

селекции, которое вызвано отсутствием маркера резистентности к тетрациклину. Кроме того мы отказались от пенициллинового обогащения, заменив его на обогащение трансдукционной смеси в среде со стрептомицином и цАМФ. Это позволяет вести более специфичный отбор, так как связано с различием фенотипического проявления мутаций в генах суа и сгр. Одной из фенотипических особенностей суа-мутантов является способность расти на питательных средах, содержащих антибиотик стрептомицин в количестве 2 МПК для родительского штамма дикого типа. Добавление экзогенного цАМФ вызывает реверсию к дикому фенотипу и восстанавливает чувствительность мутанта к стрептомицину. Кроме того, при добавлении экзогенного цАМФ штаммы с суа-генотипом восстанавливаю способность утилизировать ряд Сахаров и, в том числе, мальтозу.

У штаммов, содержащих сгр-мутацию, и также способных расти в присутствии 2МПК стрептомицина, подобное восстановление чувствительности к антибиотику и способности утилизировать сахара в присутствии цАМФ не происходит.

С учетом указанных особенностей селекция двойных суа.бсгр мутантов сальмонелл включала:

- введение затравки в трансдуцирующую смесь, состоящую из 1 МПК стрептомицина для дикого родительского штамма и 1ыМ цАМФ.

- применение среды N1: ЬВ-бульон, содержащий 2 МПК стрептомицина для дикого штамма и 1мМ цАМФ-

- применение среды N2: базисная среда МсСопкеу, содержащая мальтозу в конечной концентрации 10 мг/мл, стрептомицин в количестве 2МПК для дикого штамма и 1мМ цАМФ.

Кроме того, в схему селекции был введен принципиально новый элемент отбора - отбор мутантов на основании генотипа с использованием системы ПЦР-идентификации.

В конечном итоге, отработанная нами схема приняла следующий

вид:

1 этап: Обработка штамма, несущего мутацию в суа-гене, фаголиза-

том Р'22 (бсгр) с введением затравки в трансдуцирующую смесь;

2 этап: Обогащение трансдукционной смеси на среде N1;

3 этап: Рассев обогащенной смеси на селективную среду N2;

4 этап: Отбор мутантов несущих CRP-фенотип

(светлые (сахаронегативные) колонии, выросшие на среде N2, отдельные клоны которых не способны усваивать цитрат в качестве единственного источника углерода на минимальных средах как в присутствии так и отсутствии цАМФ).

5 этап: Отбор мутантов, несущих сгр-генотип штамма-донора, с ис-

пользованием ЩР.

Данная схема позволяет с высокой вероятностью выделять клоны несущие определенную, конкретную мутацию в сгр-гене среди штаммов с суа фенотипом, а также штаммов несущих мутации в фосфотрансфер-ной системе имеющих схожий с CRP фенотип, благодаря наличию высокоспецифичного двухступенчатого отбора сначала по фенотипическим признакам, а затем непосредственно по генотипу.

Процесс передачи 5сгр-мутации из штамма S.typhimuriurn B-5S (суа+,бсгр) в штамм S.typhimuriurn В-24 (суа,сгр+) осуществляли по предложенной схеме.

В процессе селекции было отобрано 4 клона (3,11,16,17), которые обладали CRP-фенотипом (см. таб. 4).

По данным представленным в таблице видно, что исследуемые клоны не усваивали цитрат в качестве единственного источника углерода как в отсутствии, так и в присутствии экзогеннного цАМФ.

Биохимические свойства отобраных клоноь Таблица 4.

1 среда »K м-СП i B-5S j i В-24 i L клоны i i i 1

1 (w.t.)! (CRP)| r (CYA)j о i i ! 11 | 16 i 1 1 I 17 | 1

|мин. глюкововая I + ! + j + | + i ! ! 1 + j + | 1 + !

|мин. цитратная + ! | | - i - ! - i i i

|мин. цитратная + ! 1 + 1 - ! - i - ! - !

1+ цАШ 1 ! 1 1 1

j Симмонса 1. , + 1 1 .....i ............1 - i - 1 - 1 i i .......i - ! ......i

Отобранные клоны были проверены с помощью ЩР на наличие характерной для донорного штамма делеции в начальном участке сгр-гева. Результаты представлены на фото 2.

фото 2.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЦР-ИДЕНТИФИКАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ МУТАНТОВ 123456 7 8

1.риС19/Мзр1

3. 3 1урЬшиг1ит В-24

4. клон 3

5. клон 11

6. клон 16

7. клон 17

8. клон 23

ч. * ^f Wrf* _ , к ^ wv

Делеция в crp-гене, аналогичная делеции донорного штамма (S.typhlmurium B-5S), была обнаружена у двух клонов 11 и 16.

Эти клоны(11 и 16) были еще раз рассеяны до отдельных коло-

ний на среде со стрептомицином и цЛШ, а вновь выросшие колонии были проверены на наличие CRP-фенотипа.

Установлено, что все клоны не усваивали цитрат в качестве единственного источника углерода как в отсутствии, так и в присутствии зкзогеннного цАШ, не усваивали мальтозу на среде МсСоп-key, и росли в присутствии ЗОмкг/мл стрептомицина. Культуральной и биохимической диссоциации отмечено не было.

Для дальнейшей работы был отобран клон, обозначенный как 5.typhimurium Т-10, биологические свойства которого были изучены.

Морфологические и культуральные свойства полученного штамма соответствовали свойствам рода Salmonella с некоторыми особенностями характерными для фенотипического проявления мутаций в цАШ>-регуляторной системе (меньший размер колоний). Биохимические свойства полученного мутанта представлены в таблице 1. Из данных таблицы видно, что мутант обладает типичным для рода Salmonella свойствами с некоторыми особенностями, а именно, S.typhimurium Т-10 не утилизирует цитрат на агаре Симмонса, мальтозу, сорбит, инозит, дульцит, замедленно утилизирует рамнозу, маннит, замедленно продуцирует сероводород. Добавление экзогенного цАМФ не восстаналивает способность штамма утилизировать цитрат в качестве единственного источика углерода. Эти данные также были подтверждены определением кинетики размножения штамма на жидких минимальных питательных средах (см. рис. 3).

Таким образом, биохимические свойства S.typhimurium Т-10 свидетельствуют о налчии CRP-фенотипа характерного для двойных суа, сгр-мутантов. Данный фенотип, также, подтверждается наличием устойчивости штамма к низким дозам стрептомицина, которая сохраняется при добавлении экзогенного цШЗ>. Данные по устойчивости к антибиотикам приведены в таблице 2.

ДИНАМИКА РОСТА БЛурЫтипит Т-10 НА МИНИМАЛЬНЫХ СРЕДАХ

10\6 КОЕ

60

---^-!-!

0:00 1:00 2:00 4:00

время

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ мин.-глокозовая мин.-цитратная

—мин.-цитротная+иАМ'Р

Рис. 3

Низкая МЕЕК тетрациклина свидетельствует об отсутствии транспозона TnlO в геноме данного мутанта.

Штамм агглютинируется диагностической 0-4-рецепторной сывороткой. Плаамидный профиль исследуемого штамма совпадает с таковым штамма-предшественника S.typhimuriurn В-24.

LD50 исследуемого штамма, после внутрибрюшинного заражения белых беспородных мышей массой 12-14 г составила 2.5*10б КОЕ/мл, что более чем на четыре порядка меньше вирулентности, дикого штамма S.typhimuriurn 415. Эти данные свидетельствуют о высокой степени аттенуации полученного мутанта.

Штамм S.typhimuriurn Т-10 обладает высокой стабильностью мутантного генотипа. В трех сериях опытов по определению стабильности генотипа ревертантов к дикому фенотипу выявлено не было.

Таким образом, полученный двойной суа.сгр-мутант S.typhimuriurn НО может рассматриваться как кандидат в векторные и вакцинные штаммы, так как соответствует требованиям предъявляемым к "идеальному" штамму [43,44,1163: имеет две раздельные мутации расположенные на достаточном удалении друг от друга на генетической карте, что с высокой вероятностью предотвращает реверсию к дикому фенотипу; одна из мутаций делеционного типа и охарактери-зованна молекулярнобиологическими методами; штамм обладает высокой степенью аттенуации; разработана тест-система позволяющая идентифицировать мутантный штамм; штамм не несет маркеров антиби-отикорезистентности и мобильных генетических элементов.

Главным недостатком полученного штамма является отсутствие молекулярнобиологической характеристики суа-мутации. Однако после проведения необходимых исследований он может быть устранен.

Для использования данного штамма в качестве вакцины или вектора необходимо провести значительное количество дополнительных исследований по определению протективной активности штамма, вре-

мени его персистенции, стабильности фенотипа при пассажах через чувствительных животных и целого ряда других исследований. В данной работе подобные эксперименты проведены не были, так как не входили в задачу настоящего исследования.

вывода

1. Получен штамм-донор сгр-мутации серовара S.typhimurium.

2. Методом секвенирования установлено, что мутация в сгр-гене полученного штамма S.typhimurium B-5S представляет собой делецию в 7 п.н. в начальном участке гена, приводящую к полной его инактивации.

3. Разработана система ПЦР-идентификации данной бсгр-мутации, основанная на определении разницу длин продуктов амплификации на матрицах дикого и делегированного сгр-гена.

4. Отработана методика получения двойного суа,сгр-мутанта, с использованием в качестве донора мутации 5сгр-мутанта

S.typhimurium B-5S.

5. Получен двойной суа,5сгр-мутант S.typhimurium Т-10, обладающий низкой остаточной вирулентностью.

- 26 -

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Бойченко М.Н., Воробьев А.А., Гусев В.В., Тымчук С.Н./Возможность использования суа.сгр мутантов сальмонелл в качестве векторов рекомбинантной вакцины орального применения/Вестник РАМН-1994, N4, С. 62-63,

2. Бойченко М.Н., Воробьев А.А., Тымчук С.Н./Преспектива получения суа и сгр мутантов сальмонелл для использования в качестве вакцинных штаммов/Вестник РАМН-1995, N10, с. 37-39

3. Тымчук С.Н., Бойченко М.Н., Воробьев А.А./Проблема конструирования брюшнотифозных вакцин/ Журн. микробиол.-199б, N4, с. 86-90

4. Бойченко М.Н., Воробьев А.А., Рыжова С.А., Тымчук С.Н./Создание аттенуированных штаммов S.enteritidis для использования в качестве переносчиков гетерогенных антигенов/Тезисы доклада/ Материалы VIГ съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов - 1997, Москва, с. 203

5. Tymchuk S., Selivanov N., Boitchenko М., Vorobiev A./PCR system for identification of бсгр mutation in Salmonella/ Clinical Microbiology and infection (8th European Congress of Clinical Microbiology and Infection Disease Abstract, Lausanne, Switzerland, May 1997) 1997, v3, sup 2, p.350, N1416

Благодарность.

Благодарим д.б.н. H.А.Селиванова за спонсорскую поддержку; к.б.н. А.Г.Прилипова за выполнение работ по определению первичной последовательности мутантного сгр-гена; к.б.н. Е.И.Самохвалова за искреннюю заинтересованность и полезные советы.