Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение относительных частот некоторых мутаций гена CFTR и анализ гаплотипов сцепленных с ним ДНК-маркерных локусов в популяциях России

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Определение относительных частот некоторых мутаций гена CFTR и анализ гаплотипов сцепленных с ним ДНК-маркерных локусов в популяциях России"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГИШТИЧЕСКИИ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

п Г и лл

На правах рукописи УДК 575.577.2

Петрова Ника Валентиновна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНЫХ ЧАСТОТ НЕКОТОРЫХ МУТАЦИИ ГЕНА сртй И АНАЛИЗ ГАПЛОТИПОВ СЦЕПЛЕННЫХ С НИМ

днк-маркерных локусо& в популяциях россии

(03.00.15 - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории генетической эпидемиологии. Медико-генетического научного центре РАЫН.

Научный руководитель: Член-корреспондент РАЫН, доктор биологических наук, профессор

Е.К.Гинтер

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Р.Ф.Гарькавцева; кандидат биологических наук А.В.Поляков.

Ведущее научное учреждение: Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии ЫЗ 1Ш РФ

заседании Диссертационного совета Д.001.16.01 при Ыедико-гбнетическом научном центре РАЫН (МГНЦ РАМН) (115478, Москва, Москворечье, I).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ыеднно-генетического научного центра РАЫН

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических ноук, профессор

Л.Ф.Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Ыуковисцидоз (MB) - одно из самых распространенных наследственных, аутосомно- рецессивных летальных заболевания с ранне! манифестацией и тяжелым течением. ЫВ характеризуется тянелым хроническим обструктивным поражением легких и нарушением функции желудочно-кишечного тракта, прежде всего недостаточностью ферментов поджелудочной железы (С.В.Рачннсккй с соавт., 1974; Н.И.Капранов, С.В.Рачзшский, 1995; Brook et al., 1988).

Учитывая тяжесть заболевания и высокую стоимость постоянной фармакологической поддержки, а такие социальные проблемы в семьях, имеющих детей больных MB, изучение молекулярных основ этого заболевания и разработка на атой основе как мер профилактики, так и методов лечения, продолжает оставаться актуальной > задачей.

Картирование гена CFTR, обнаружение частой мутации AF508, (Кегеш et al., 1989; Riordan et al., 1989; Rommens et al., 1989) явились поворотными событиями в молекулярных исследованиях MB и позволили выработать метода молекулярной диагностики этого заболевания. К настоящему моменту выявлено более 450 вариантов гена CFTR (травсмембранный регулятор проводимости муковисцидоза), приводящих к заболеванию, но наиболее распространенной в большинстве обследованных популяций является мутация ДТ508, составляя 66% от MB хромосом мировой выборки (OFGAC, 1994). Исследования Консорциума по генетике муховисцидоза (Cyatio Fibrosis Gonetio Analysis Consortium) выявили различия в частотах ЫВ и отдельных мутаций и в степени генетической гетерогенности ЫВ в разных странах.

Б течение последних десяти лет в России также достигнуты значительные успехи в области изучения молекулярно- генетических особенностей ИВ (Иващенко, 1992; Агбангла, 1993; Гимбовская, 1993; Потапова, 1994; Бакай с соавт., 1994); но остается открытым еще широкий круг вопросов: не определены полностью спектр и доля распространенных мутаций, не установлена точно частота заболевания.

Определение спектра распространенных мутаций в гене CFTR у больных России создает возможность для выработки стратегии

пренатальной и равней постнатальной диагностики мутантного гена, а в будущем, возможно, г стратегии лечения.

Изучение распространения мутаций, сходства и различий их спектров в различных популяциях, анализ гаплотипов некоторых полиморфных маркеров, ассоциированных с определенными мутациями в гене cftr, открывает новые возможности для исследования генетической структуры популяций, таких как степень вх генетического сходства - различия, механизмы возникновения генетической подраэделенности отдельных l ^пуляций России по гену муковисцидоэа и другим сцепленным с ним генам.

В настоящей работе представлены результаты молекулярно-генетического анализа генетической гетерогенности муковисцидоэа и эпидемиологии мутаций гена CF1R в Европейской части России.

1.2. Цель и задачи исследования.

Целыз исследования явилось изучение молекулярно-генетических особенностей локуса гена CPTR, а также соседних с ним локусов в норме и у больных муковисцидоэом в популяциях Европейской части России, и разработка на этой основе оптимальной схемы молекулярной диагностики муковисцидоэа. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследование популяционной частоты и относительной частоты мутации AF503 в Европейской части России.

2. Изучение спектра распространенных мутаций в гене OPTR у больных из Европейской части России.

3. Исследование частот аллелей в гаплотипов ввегеивых в внутригенного полиморфных маркеров в выборках нормальных и мутантных хромосом, происходящих от больных и здоровых лиц вэ Европейской части России.

4. Исследование неравновесия по сцеплении между маркерами XV-2o, К1119, J3.11, тетрануклеотидными повторами в 6а интроне гена OPTR (ТТП6) и локусом гена ст.

Б. Разработка оптимальной схемы молекулярной диагностики муковисцидоэа для кителей России.

1.3. Научная новизна работы.

Впервые проведен скрининг новорожденных на наличие мутации ДР500 в г.Ыоскьо и рассчитаны ионулиционяая частота мутации AF508 и вероятная частота муковисцидоэа в Европейской части

России.

Определен спектр в относительные частоты распространенны! мутаций в гене сутн в исследуемой выборка больных из Европейской части России.

Показано, что наиболее частыми в российской популяции, помимо ДР508, являются мутации в 13, 21, 20 и 19 экзонах гена СРТЛ.

Исследование гаплотипов двух внегенных и одного внутригенного полиморфных маркеров в ыутантных не-лр508 хромосомах показало, что с нендентифицированными в исследуемой популяции мутациями в большей степени ассоциирован гашютин, явллхщнйся редким в популяциях Западной Европы

1.4.' Научно-практическая значимость работы.

Точное знание частоты наследственного заболевания имеет большое значение не только в научном плане, но и для практического здравоохранения, так как позволяет осуществлять планирование профилактических, диагностических' и других мероприятий.

Выявление мутаций гена сртй и исследование информативности семей с использованием внегенных и внутригенных полиморфных маркеров гена сути позволяют осуществлять пренатальну» диагностику МВ у плода прямыми и косвенными молекулярно-геветическими методами в семьях, имеющих больного МВ ребенка.

1.5. Положения, выносимые на защиту.

1. Скрининг новорожденных г.Москвы позволил рассчитать популяционную частоту мутации ДР508 (0,0044) в Москве, среднюю частоту мутации ДГ508 в Европейской части России (0,005043) и оценить частоту муковисцидоэа у новорожденных (1/12300). Эта частота существенно ниже, чзм рассчитанная другими методами.

2. Спектр повторяшихся мутаций в гене СРТЯ у больных России существенно отличается от спектров мутаций в популяциях Западной Европы.

3. Проанализированы относительные частоты мутации АР508 и некоторых других распространенных в России (2143с1в1Т, 21841пзА,

196х, Я1282Х, Ы1303К, 0542Х); установлена сравнительно низкая встречаемость мутаций Н334№, 394<1е1ТТ, 1б77йе1ТА и отсутствие мутаций ИЭ47Р, 05510, И553Х, 3732с1е1А в исследованной вцборке больных из Европейской части России.

4. Анализ ассоциация мутаций в гене сгтй с гвплоткпами двух внегенных и одного внутригвиного маркеров выявляет, что с наиболее частым среди МВ не-АР508 хромосом гаплотипом А7 не сцеплена ни одна из 15 исследованных в работе мутаций гена сртн; с ним может быть ассоциирована распространенная в изучаемое популяции, но пока неидентифицированная, мутация.

5. Доля неидентифицированных мутаций в гене срти у больных из России велика, что может быть обусловлено их возможным расположением либо в проыоторной области гена СРТЯ, либо внутри явтронов. Следовательно, для проведения пранатальной диагностики ЫВ у плода необходимо использовать подходящие полиморфные маркерные системы: например, ТТП6, ХУ2о, КЫ19.

6. При анализе 16 мутаций н трех полиморфшх маркеров доля полностью информативных семей высокого риска составляет 84*, 16% семей - частично информативны.

Апробация работы.

Результаты исследования были представлены на 17-ой Европейской конференции по муковисцидозу (Дублин, 1991), на первом (третьем) Российском съезде медицинских генетиков (Москва, 1994), на Научно- практической конференция, посвященной 10-летию Республиканской детской клинической больницы во имя Покрова Пресвятой богородицы (Москва, 1995), на 20-й Европейской конференции по муковисцидозу (Иерусалим, 1996), на мвжлабораторном семинаре Института клинической генетики МГНЦ РАМН (1996).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы.

Работа изложена на 1$$ листах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, глав "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", заключения, выводов в списка цитированной литературы (1Э6 работ). В теките диссертации iZ. рисунков и ДР. таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В качестве материала использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов цельной крови, пятен крови, нанесенных на фильтровальную бумагу, и клеток биоптата хориона. В работе

использован материал от больных MB, обследованных в научно-клиническом отделении муковисцидоза МГНЦ РАНН, их родителей и новорожденных г.Москвы. Выделение ДНК из , лейкоцитов периферической крови и клеток хориона, ДНК- полимеразную реакции, анализ расщепления фрагментов ДНК эндонуклеазгми, электрофорез фрагментов ДНК в поли акрил амидных гелях и визуализацию ДНК при помощи окраски бромистым этидием осуществляли согласно общепринятым методам (Ыаниатис с соавт., 1984; Kunkel et al., 1986; PCR teohnology, 1989). Поиск мутаций в гене CFTR осуществляли согласно: Kerem et al.,- 1989; Ng et al., 1991; Shoshani et al., 1992; Иващенко, 1992; Ivaschenko et al., 1991). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы в фирме "ДнаЧГ. эндонуклеазы.н термостабильная ДНК- полимераза в фирме "Farmentas" (Литва). Часть исследований проводили на база лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней ИАГ им.Д.О.Отта (г.С.-Петербург).. Поиск мутаций методом электрофореза в денатурирующем градиентном геле, определение нуклеотидной последовательности проведены в Центре биогенетики (Брест, Франция), согласно общепринятым методикам (Уегео et al, 1993! Verl Irigue et al., 1995).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ ДОЛИ МУТАЦИИ Afsos СРЕДИ MB ХРОМОСОМ.

Известно, что наибольшая доля мутантных аллелей гена CFTR обусловлена мутацией AF508. Но ее относительная частота варьирует в широких пределах в зависимости от этнической принадлежности больных (от 20 до 90%), так в странах Западной Европы максимальное значение отмечено в Дании (88%) к Великобритании (80%), а минимальное в Италии (52") и Испании (50%). Меньшая относительная доля мутации AF508 наблюдается также и в ряде стран Восточной Европы (Чехия, Словакия, Польша, Болгария-и т.д.) (CFGAC,1994).

Для определения относительной доли мутации AF508 ми проскринировали ДНК 254 больных MB, происходивших, в основном, из•Европейской части России. 82 из них оказались гомозиготами по мутации AF508, 121 - гетерозиготными компаундами по AF508 и другой' мутации MB, 51 имеют обе He-AF508 MB мутации.

Распределение генотипов соответствует ожидаемому со Харди-Вайнбергу (х*- 0,41; р>0,05). Относительная доля мутации ДР508 составила 56% от общего числа ЫВ хромосом, в можно полагать, что эта доля характерна, по крайней мере, для популяции Европейской части России. Значение относительной доли мутвции ДР508, полученное в нашей работе, практически не отличается (Х*~ 1,26; р>0,05) от значения, полученного для Северо- Западного региона России (50*) (.'Шсщенко, 1992).

Значение относительной частоты мутации ДР508 для Россия мало отличается от значений, полученных для стран Восточной Европы, где проживает, з основном, славянское население. Следовательно, можно предполагать, что для всех славян характерна более низкая доля мутации ДР508, чем для стран Северо- Западной Европы.

РАСЧЕТ СРЕДНЕЙ ЧАСТОТЫ МУКОВИСЦИДОЗЛ В ПОПУЛЯЦИЯХ РОССИИ.

В связи с тяжестью клинического течения ЫВ более точное установление частоты заболевания является весьма актуально! задачей. В середине 70-х годов бьил проведены несколько работ по определению частоты МВ в России с использованием разных показателей, в основном, патолого- анатомических. В настояцей работе была сделана попытка определить среднюю частоту КВ в популяции России, используя два молекулярно- генетических показателя: частоту мутации ■ ДООв в популяции и относительную долю МВ хромосом, имеющих мутацию ДР508 (56Х).

Для определения первого показателя проскринировалв образцы крови от 1064 новорожденных (2128 хромосом) 1990 г.р. и 1209 новорожденных (2418 хромосом) 1996 г.р. из Москвы. В первой выборке было обнаружено 8 хромосом с мутацией А?508, т.е. частота мутации в исследуемой выборке хромосом составила 0,0008; во второй выборке обнаружено 12 хромосом с мутацией АУ508. т.е.частота мутации - 0,0049. В г.Санкт- Петербурге (Потапова, 1994) были обследованы 500 новорожденных (1000 хромосом), выявили 8 хромосом с мутацией ЛР508. В этой выборке хромосом частота мутации ДР508 составила 0,008. Различия в частотах мутации ДР508 между тремя выборками статистически недостоверны (Х^= 2,41; р> 0,05); поэтому мы сочли возможным объединение выборок для получения более надежного среднего значения частоты

мутации ДР508 в популяциях России, которое составило 0,005048+ 0,0009617 (при 5%-ои доверительном интервале).

Исходя из того, что относительная, доля ' мутации АР508 составляет 56* от всех МВ хромосом, рассчитанная средняя частота ИВ хромосом в популяциях России (я) равна 0,009015 + 0,0С"269. Отсвда частота МВ в популяциях России (<р) составляет 0,00006127 ♦ 0,0000232 или I/ 12300 новорожденных.

Рассчитанное нами значение (I/ 12300 новорожденных) ниже, чем полученные ранее при использовании других методов, и чем в большинстве стран Западной Европы, но данный результат нельзя считать совершенно неожиданным. Так, одним из объяснений может служить влияние смешения славянских популяций с финнами в ходе формирования русской народности. Частота ЫВ в Финляндии достаточно низка (1/26000), в то же время генетическое влияние финского населения на северные и центральные русские популяции весьма заметно (Алексеева, 1974), в русских популяциях прежних Петербургской, Олонецкой и Архангельской губерний это влияние западных финно- угорских групп, а в русских популяциях Ярославской, .Костромской, Московской и Рязанской губерний и русских Среднего Поволжья - влияние восточных финно- угорских групп.

ИЗУЧЕНИЕ СПЕКТРА РАСПРОСТРАНЕННЫХ МУТАЦИИ ГЕНА сяти У БОЛЬНЫХ МВ ИЗ РОССИИ.

Многочисленные литературные данные показывают сгацифчку в паттерне распространения мутаций гена СРТЯ в различных популяциях, поэтому изучение спектра и частоты мутаций в гене ОРТ!* у больных МВ из России является вахшой практической задачей.

С целью определения частых ЫВ мутаций, характерных для популяции России, было проведено совместное с Центром биогенетикй (Брест* Франция) исследование 58 не-АР508 ЫВ хромосом (38 больных из Центральной России) (Уог11п£ие,1995). Изучались все 27 экзонов гена сртл и области экзон- интронных соединений . методом денатурирующего гель-электрофореза. В результате работы выявлены 17 различных мутаций гена СРТК. Три мутации описаны впервые: две из них, 175<1е1С (экзон I) и 6?4<1е1Т (экзон'5), - мутации сдвига рамки считывания; а третья мутация -

миссенс- мутация в 12 экзоне (057211). Наиболее распространенными в этой выборке оказались мутации И1282Х (5/58), 2143Ле1Т (4/58), 21841пзА (3/53) и 3821 <1е1Т (3/58). Нутации в Ш- II акзонах гена срти (помимо ар508) относительно редки у обследованных больных нэ России (не более 2%), тогда как во многих странах Западное Европы их доля достигает 5-7% всех ЫВ хромосом (СРало, 1994). Наибольшая доля (5,3% от всех ЫВ хромосом) приходится на две мутации в 13 экзоне гена сртн, гизаеи? и 21841паА, в других популяциях чрезвычайно редких. Имеются литературные данные о встречаемости мутации 2143йе1Т в Германии, а мутации 21841пвА -в Болгарии, но с более низкими относительными частотами (1% и 1,2%, соответственно). Относительно частыми мутациями в популяции России являются также мутации в 19 и 20 экзонах гена сгти. Около 25% срти аллелей осталось неидентифицированными в изученной выборке ЫВ хромосом даже после исследования всей кодирующей последовательности гена стая:. Это отличает популяцию России от большинства популяций Западной Европы, 'где более 96% мутантных аллелей обусловлено изменениями последовательности нуклеотидов в экзонах или местах сплайсинга.

Итак, спектр мутаций в гене сртя у больных из России весьма разнообразен, а к распространенным можно отнести мутации б 13, 19 и 20 экзонах.

В дальнейшем расширенную выборку больных, являющихся гетерозиготными компаундами по АР508 и другой мутации или имеющих обе не-ДР508 мутации, обследовали на наличие пятнадцати мутаций в гене ст: 394йе1ТТ (3 экзон); И334Я, Ю47Р, 1154с1е1ТС (7 экзон); Д1507, 1677<1е1ТА (10 экзон); С542Х, 65510, Я553Х (II экзон); 2143<ШТ, 21841паА (13 ЭКЗОН); БПЭбХ, 37Э2йе1А (19 экзон); 1АИ232Х (20 экзон); тзоэк (21 экзон). В исследуемой выборке ЫВ хромосом были обнаружены 9 из 15 мутаций (табл.1).

очевидно, что существуют особенности спектра распространенных мутаций гена СРТй в популяциях России. Наиболее частыми, помимо ДР508, являются мутации в 13 экзоне, кодирующем и-домен, а также в 21, 20 и 19 экзонах, кодирующих второй нуклеотид- связывающий домен (ШР2). Нутации в II экзоне, кодирупцем первый нуклеотид- связывающий домен (МВР1), являщиеся частыми в популяциях стран Западной Европы, у больных из Европейской части России встречаются с относительной

Таблица I.

Относительные частоты сртй мутаций у МВ больных из России.

Число Число Доля в Доля в

изученных хроносои не-Лгзов МВ

Мутации Эк- не-ЛР5ое с мутацией хроиесоиах хромосомах

зон хроиосои <*) (*)

Э94<1е1ТТ э 178 2 1.1 0,5

Й334Я 7 200 2 1,0 0,4

.1б77Ле1ТА 10 242 I 0,4 0,2

13452Х 11 206 7 3,4 1.5

2НЗ«1е1Т 13 177 6 3,4 1.5

21841пзА 13 177 12 6,8 3,0

31196Х 19 157 3 1,9 0,8

W1282X 20 171 6 3,5 1.5

(ИЗОЗК 21 206 12 5,8 . 2,7

Всего идентифицировано 27,3 12,1

Не идентифицировано 72,7 31,9

частотой, не превышающей 1,5-2% от всех МВ хромосом, т.е. существенно реже, чем в Европейских странах.

При прямой идентификации 16, (ДР508 и другие), описанных ранее мутаций удается определить 68,1% всех МВ аллелей исследуемой выборки больных из России. Не менее 31,9% мутантвых аллелей остается неидентифицированными. По-ви, лмому, их следует искать в первую очередь в интронах и промоторе гена СРТй.

ИЗУЧЕНИЕ ЧАСТОТ АЛЛЕЛЕЙ ТРЕХ ВНЕГЕННЫХ И ОДНОГО ВНУ'ГРИГЕННОГО ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРНЫХ ЛОКУСОВ ГЕНА стг В НОРМАЛЬНЫХ И МУТАНТНЫХ ХРОМОСОМАХ ИЗ ПОПУЛЯЦИИ РОССИИ.

Так как доля выявленных мутаций в популяциях России относительно невысока (68,1%), изучение полиморфных локусов, сцепленных с геном орти, и внутригенных полиморфизмов остается весьма, актуальным при молекулярной диагностике заболевания. В связи с этим были изучены три сцепленных с геном СРТЯ локуса.

выявляемых соответствующими пробами ХУ2о(Таа1), КМ19(РеИ) и J3.11 (РаИ) и тетрануклеотидные полиморфные повтори (ОАТТ)п в 6а интроне гена срти (ТТП6).

Как видно из таблицы 2, среди нормальных хромосом, происходящих яз Центральной части России, преобладают хромосомы, имеющие аллели 2 (ХУ2-о), I (КМ19), 7 (ТТП6) и 2 (J3.11). ЦДРФ анализ выявил достоверные отличия в частотах встречаемости рллелей вьегенэых полиморфных маркеров J3.11 (Ра Ш, ХУ2о(Та^1) в

Таблица 2.

Частоты аллелей четырех маркеров гена СРТИ в разных популяциях.

МАРКЕРЫ 33. и хчгс КН19 ТТП6

АЛШИ 1. г 1 г 1 г 7 е

Центр.Россия 0,19 0,81 0,27 0,63 0,68 0,32 0,78 0,22

п = 88 п = 121 п = 196 п » 237

Север.Европа 0,33 0,67 0,49 0,51 0,73 0,27

И34, 179] п = 93 п = 474 п = 474

х1 ■5 09 7,12 0 60

Юсш. Европа 0,38 0,62 0,49 0,51 0,70 0,30 0,81 0,19

[74, 90, 1791 п = 148 п = 251 - П = 224 П я 100

хг 8 85 7. 12 0 09 0,27

Сев.-Зап.Россия 0.41 0,59 0,54 0,46 0,79 0,21 0,80 0,20

И, 5, 11] п - У2 66 158 Г

хг 1 11,52 3 ,1 0 - ,12

выборке нормальных хромосом, происходящих, в основном, из Центральной части России по сравнению с Северо- Западным районом России и популяциями Западной Европы, таких различий не выявлено для локуса КМ19 и внутригенного маркера ТТП6.

По литературным данным известно, что частоты аллелей

сцепленных с геном ОРТИ маркеров в выборке мутантных хромосом отличаются от поцуляционных. Поэтому в данной работе были также исследованы частоты аллелей .четырех маркеров в хромосомах больных ЫВ, которые приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Частоты аллелей четырех маркеров у больных из разных популяций.

MAPKEFH J3.11 хугс КМ19 ТТП6

АЛЛЕЛИ 1 2 1 г 1 г 7 в

Центр.Россия 0,36 п = 0,64 110 0,87 п = 0,13 164 0,23 п = 0,77 291 0,27 п = 0,73 338

Север.Европа 1134, 179J ха 0,54 п = в 0,46 101 i54 0,88 п = 0 0,12 474 ,04 0,19 п = 0 0,81 474.

Шн. Европа [74, 90] х2 0,36 п = 0 0,64 150 00 0,74|о,26 п = 254 1 5,38 0,21|о,79 П = 228 0111 0,Зз|о,67 П = 100 о! 85

Сев.-Зап.Россия М. 5, 11] 0,63 ri = 1 4 0,37 38 ,58 0,78 п = о ... 0,22 36 .8 0,11 п = 5 0,89 47 1 0,34 п = 0 0,66 258 90

По нашим данным у больных МВ из Центрально- Европейской части России преобладают аллели I (ХУ2-с), 2 (КЫ19), 6 (ТТП6) и 2 (J3.11).

Во всех изученных системах наблюдается достоверное различие частот аллелей между группами нормальных и мутантных хромосом (табл.4). Для систем ХУ2о, КМ19 и ТТП6 в •группе мутантных хромосом преобладает аллель, являющийся редким в группе нормальных хромосом. Для системы J3.11 аллель 2 является преобладающим и в группе нормальных, и в группе мутантных хромосом, но частота аллеля I в мутантных хромосомах достоверно

почтя в 2 раза вше по сравнению с нормальными хромосомами (х*» 6,12; р<0,025).

Известно, что существует выраженное неравновесие со сцеплению между локусвми изученных маркеров и локусом гене СРТй. Степень ассоциации аллелей исследованных маркеров с геном ЫВ отражает стандартный коэффициент неравновесия по сцеплению (Дс.^). Его величина максимальна для локуса ТТП6 (-О.В1) ж минимальна для локуса J3.11 (-0,19) (табл.4). Это неудивительно.

Таблица 4.

Распределение частот аллелей маркеров, сцепленных с геном сртя, в нормальных и мутантных хромосомах.

Хромосомы

Ыаркер Аллель Нормальные ЫВ ^сГ

J3.lt 1 0,19 (17) 0,36 (40) 6,12; -0,19

г 0,81 (71) 0,65 (70) р<о,аг5 0.1Э

ХУ2с 1 0,37 (45) 0,87 (142) 73,12; -0,61

г 0,63 (76) 0,13 (22) р<0,001 0,51

КМ19 1 0,68 (134) 0,23 (68) 95,85; 0,45

г 0,32 (62) 0,77 (223) р<0,001 -0,45

ТТП6 8 0,00 (I) 0,00 (0) 142,19; 0,00

7 0,78 (184) 0,27 (92) р<0,001 0,51

в 0,22 (52) 0,73 (246) -0,51

Дд4л- стандартный коэффициент неравновесия по сцеплению.

так как «.ТП6 является внутригенным маркером, а локус ШБ8 (j3.11) самым удаленным от локуса МВ из рассматриваемых в данной работе, и, следовательно, вероятность кроссинговера между локусом 0758 и локусом гена СИЙ выше, чем между локусом гена срти и другими двумя изучаемыми маркерными локусами. Локус КЫ1<? располагается ближе к локусу ЫВ по сравнению с локусом J3.11. что подтверждается и большим значением дstd (0,45).

с целью выяснить, какой вклад в величину неравновесия по

сцеплению вносят разные мутации в гене сртй, были рассмотрены частоты аллелей маркеров отдельно в двух группах мутантных хромосом, несущих мутацию АР508 и имеющих другие мутации гена сртй (табл.5).

Таблица 5.

Распределение частот аллелей полиморфных маркеров гена СРТй в мутантных хромосомах с и без мутации ЛР5оа.

Маркер Аллель | ДР508 не-ДР508 АБ1сГ

ХУ-2о 1 2 0,96 (108) 0.04 (5) -0,62 0,62 0,74 (28) 0,26. (Ю) -0,37 0.37

85,4; р<0,001 14,1; р<0,001

КМ19 1 2 . 0.0 (0) 1,0 (160) 0,72 -0,72 0,54 (46) 0,46 (39) 0,15 -0,15

172,5; р<0,001 4,6; р<0,06

ТТПб 7 6 0.0 (0) 1,0 (182) 0,80 -0,80 0,63 (73) 0,37 (43) 0,16 ' -0,16

248,8; р<0,001 8,3; р<0,01

аз.и 1 2 0,47 (25) 0,53 (28) -0,30 0,30 0,22 (10) 0,78 (36) -0,000 0,003

10,9; р<0,001 0,001; р>0,05

и Дзш рассчитаны для выборок нормальные и ДР508-ЫВ хромосомы; нормальные и не4Р508-ЫВ хромосомы.

В изученной популяции наблвдается абсолютное сцеиление мутантных ЛР508 хромосом с аллелями 2 и 6 маркеров КЫ19 и ТТП6, соответственно, что характерно и для многих популяций Европы и Северной Америки. 96% изученных МВ хромосом с мутацией ДР508 ассоциированы с аллелем I локуса ХУ2с. Согласно величинам

коэффициентов неравновесия со сцеслешш локусы исследованных маркеров располагается' в следующем порядке: xv2o - кы19 -ТГП6;ЛУ508 - ... - J3.11.

Анализ частот встречаемости аллелей ДНК-маркеров показывает достоверное отличие частот аллелей в мутантных хромосомах« обусловленных не-лр5оа мутациями, и в нормальных хромосомах для систем XV2o, КМ19 и ТНП6. Для этих систем наблюдается также и существенное неравновесие со сцеплению между перечисленными локусаки и локусом MB. Величина коэффициента неравновесия по сцеплению между локусом xv-2о и локусом гена cftr вше, чем для сглстеш ш9/ cftr в группе MB хромосом, не имеющих мутации ар508 (табл.5). Это можно объяснить тем, что в изучаемой популяции существует мутация (мутации) в гене cftr, ассоциированная (-ые) с аллелем I (xy2o) даже в большей степени, чем мутация af508, вследствие ее (их) более позднего, по сравнению с мутацией ДР508, возникновения или распространения в исследуемой популяции.

ИЗУЧЕНИЕ ЧАСТОТ ГАПЛОТИПОВ ТРЕХ МАРКЕРОВ В НОРМАЛЬНЫХ И МУТАНТНЫХ ХРОМОСОМАХ.

Принимая во внимание данные литератур! об ассоциации мутации AF508 с гаплотипом В систем ХУ2о и КЫ19 (Kerem ot al., 1989), а также с аллелем 6 системы ТТП6 (Chehab et al., 1991; Caltkhoki et al., 1993), мы'рассмотрели распределение гадлотипов трех маркеров, XV-2о/ Шд/ ТТП6 в группах нормальных и MB хромосом, имеющих мутацию AF508 и имеющих другие мутации в гене cftr (табл.6).

В группе нормальных хромосом наиболее распространенным является гаплотип С7 (37$), наиболее редким В6 (3%), частоты гаплотгаюв А7, В7, D7, Аб и сб практически одинаковые. Гаплотип D6 в исследуемой выборке нормальных хромосом из российской популяции вообще не встретился. Это может быть следствием малого размера выборки, так как в других ранее изученных популяциях он также оказался крайне редким.

Мутация ¿F508 встречается только на хромосомах, имеющих гаплотипы Вб (95%; 99 из 104) и D6 (5%; 5 из 104), причем эти гаплотиш редки в выборке нормальных хромосом (различая в частота/, гаплотипа В6 достоверны; хг= 165,7; р<0,001). Такое же

Ч

Таблица 6.

Частоты гашютипов трех маркеров, ХУ-2о/км19/ТТП6 в нормальных н ив хромосомах.

Гаплотшш Хромосомы

ХУ-2о/КН19/ нормальные мутантные

ТТП6 | 1 АР508 | неА?5оа

А7 (1-1-Г) |0»Х4 | - 0,31

1 | 4,0; р<0,05

В7 (1-2-7) 0,12 | - 0,07

о,2; р>о,оз

С7 (г-1-7) 0,37 | - 0,13

6,3; р<0,025

07 (2-2-7) 0,15 | - 0,13

0,006; р>0,05

АО (1-1-в) 0.07 | - 0,13

• 0,5; р>0,05

ВО (1-2-0) 0,03 | 0,95 0,20

168,7; р<0,001 9,4; р<0,005

СО (2-1-0) 0,12 | - 0,03

1,9; р>о,ов

оо (г-г-о) ^г-г" — 1 0,05

М 99 | 104 38

X* рассчитан для групп нормальные и ДР508-ЫВ хромосомы н

нормальные и неДР508-ЫВ хромосомы.

распределение гашютипов, содержащих мутацию ДР508 найдено я во

многих других популяциях. Часть гашютипа вб - 2-6 (КЫ19/ТТП6) обнаруживает абсолютное сцепление с мутацией АР508 в нашей выборке, что позволяет эффективно использовать анализ гаплотипов для препатальной диагностики. Поскольку этот гаплотип обнаруживает также выраженное неравновесие по сцеплению и в других популяциях Западной Европы, то можно говорить о едином источнике происхождения, но крайней мере, мутации ДР508, в популяциях России и в европейских популяциях.

Распределение гаплотипов маркеров ХУ2о/ КЫ19/ ТТП6 в мутантных хромосомах без мутации Д?508 отличается от распределения этих гаплотипов как в ЛР508-ЫВ хромосомах, так и в нормальных хромосомах (табл.6). В этой группе хромосом встречаются практически все возможные гаплотипы изучаемых маркеров, что говорит о возможном широком разнообразии мутаций в гене СРТ' у больных ЫВ из России. В то же время тот факт, что в груше нормальных хромосом наиболее частым гаплотипоы лвляется 07 (37%), а в группе ЫВ не-АР508 хромосом наиболее частый гаплотип А7 (32%) (различия в частотах достоверны: %г= 6,3; р<0,025 для гаплотипа 07: 4,0; р<0,05 для гаплотипа А7), может указывать на вероятность существования в русской популяции распространенной мутации, ассоциированной с гаплотипом А7, которая пока не идентифицирована. Вторым по частоте в группе ЫВ не АР 503 хромосом является гаплотип вб (20%), тогда как в груше нормальных хромосом он достаточно редок (3%) (х*= 9,4; р<0,005). Гаплотипы С7, 1)7 и а6 встречаются на неДР508-ЫВ хромосомах с частотой 13%, а гаплотипы В7 и сб более редки (7% и 3%.. соответственно).

Ыы попытались определить гаплотипы трех маркеров в .хромосомах, где мутантный аллель был установлен (табл.7).

Ассоциация мутации 0542Х с гаплотипом 1-2-6 (вб) согласуется с литературными данными (Оиррепз ег а1., 1994).

Ыутация N1ЗОЗК в нашей выборке встречается в ЫВ хромосомах с двумя разными гаплотипами трех маркеров Аб (1-1-6) и Вб (1-2-6). Это согласуется с литературными данными (Ьиооие, Нагои1;, 1995).

Мутации в гене с?та, ассоциированные с гаплотипами А7 (12), В7 (I), С7 (5), щ (I), Аб (3), Вб (I), Сб (I), не рдентиф,..цированы. Так как каждый из относительно частых

Таблица 7.

Ассоциация нв-Д?508 мутаций в гене с гашютипами

трех маркеров у больных из Европейской части России.

гаплотип А7 В7 С7 07 АО во со.

число хромосом 12 3 5 5 5 8 I

нутации «12?2Х(2) 21841пвА(3) 196Х(1) тзозк(2) 2143<1е1Т(3) 0542Х(2) N1ЗОЭК(2)

иеидент. мутации 12 I 5 I 3 I I

В скобках указано число хромосом с данной мутацией.'

гаплотипов может быть ассоциировав не с одной мутацией, возможно

предположить существование в русской популяции не менее трех-четырех повторяющихся МБ мутаций, помимо уже идентифицированных, которые ассоциированы с гаплотипами А7, 07 и Аб.

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДНК-ДИАГНОСТИКА МУК0БИСВДД03А.

Осуществление пренатальной ДНК-диагностики возюино двумя способами: прямым, если известны обе мутации, и косвенным, прп использовании идентификации нормальных и мутантных хромосом родителей посредством маркирования их с помощью сцепленных или виутригенных полиморфных маркеров.

В 287 семьях, имеющих больного ЫВ ребенка, был проведен скрининг 16 идентифицируемых. нами мутаций гена СРТН. В 134 случаях (46,7%) определены оба мутантных аллеля: 99 имели генотип йР508/АР508, 30 - дР508/не-ДР503 ( из них у 8 второй аллель - 21841ПЗА, У 5 - 0452Х, у 4 - Я1282Х, У 3 - 2143<1е1Т, у 2 - Ю34№, у 2 - 196Х, у 5 - Ы1303К, у I - 394Лв1ТТ). В 5 семьях генотип был не-йР508/ не-А?508 (394<1е1ТТ/ 3821delT. 2143<1е1Т/ 21941пзА, 3821<1е1Т/ «1282Х, ШЗОЗК/ 21841пзА И Н1303К/ ШЗОЗК).

В 123 случаях был определен только один мутантеый аллель

(42,9%), вторая мутация осталась неидентнвицированной (?): 109 больных имели генотип AF508/ ?, 14 - не-А?508/ ? (из них ве-ЛР5оа мутацией была в 4 случаях - N1303K, в 2 - 2184 ins а, в 2 - 0542Х, В 2 - W1282X, В. 2 - 2143delT, В I - S1196X В В I -1677<1э1ТА ). в остальных 30 семьях (10,4%) оба мутантных аллеля не идентифицированы.

В нашей выборке 100%-ая информативность для проведения пренатальной ДНК-диагностики ЫВ только прямым методом достигнута в 46,7» семей, 50*-ая - в 42,9* семей. В 10,4% семей прямая ДНК-диагностика ЫВ оказалась невозможное. В связи с этим актуальным остается использование полиморфных маркеров как внутригекных, так и внегенных.

С целью оценить возможность использования систем J3.i 1, xv2c, гаи 9 а ТТП6 при пренатальной диагностике ЫВ в исследуемой группе семей высокого риска мы изучили гетерозиготность родитель^ по этим локусам. Она составила 65% для систем XV2o, КМ19 и TTD6 в 43% для системы Y3.11. В таблвцв 8' представлены значения информативности маркерных локусов.

Таблица 8,

Информативность семей по разным маркерам гена CFTR.

Маркер Число полных семей

полностью частично не ВСЕГО

информ. информ. ивформ.

N * N % N %

XV2o [4 28,0 32 64,0, 4 8,0 50

КМ19 23 27,0 49 58,0 13 15,0 85

Y3.11 iPstl) э- 8,0 23 59,0 13 33,0 39

ТТП6 35 34,0 55 54,0 12 12,0 102

Из изученных систем молекулярных маркеров гена CPTR наиболео подходящими для пренатальной диагностики UB у плода

являются системы ТТП6, ХУ2о и КМ19, использование системы Y3.11(Рвк1) наименее эффективно.

Использование каждой маркерной системы отдельно, как видно, недостаточно эффективно, поэтому необходимо проведение молекулярного анализа по нескольким маркерным системам одновременно. В таблице 9 представлены результаты определения информативности в 45 полных семьях (родители и больное 1Ш ребенок) при использовании маркеров хчго, КЫ19 и ТТП6 и анализа иестнадцати мутаций в гене сртл.

Таблица 9.

Информативность для 45 семей высокого риска при совместном использовании прямого и косвенного подходов маркирования мутантных хромосом.

Исследуемые молекулярные маркеры Число ПС 100* инф-тн >лных семей 50* инф-ти 0* инф-ти

ДР508 16 (36*) 23 (51*) 6 (13*)

ТТП6 15 (33*) 27 (60*) 3 (7*)

неД^ОЭ мутации (15) I (2*) II (24*) 33 (74*)

Х72о 14 (31*) 27 (60*) 4 (9*)

КМ19 14 (31*) 23 (51*) 8 (18*)

при сочетании трех маркеров и 16 мутаций 38 (84*) 7 (16*) 0

При сочетании данных со всем изученным маркерным системам доля полностью информативных семей возрастает до 84*, частично информативных сокращается до 16* семей. При частичной информативности проведение пренатальной диагностики МР молекулнрно- генетическими методами такие возможно: при отсутствии мутантпой хромосомы у плода диагноз ЫВ снимается со 100* вероятностью, при наличии мутантной хромосомы вероятность

рождения больного ребенка - 50%. В этом случае целесообразно проведение дополнительного биохимического анализа 'белков вмниотической жидкости во втором триместре беременности.

Таким образом, проведение пренатальвой диагностики ЫВ у плода только молекулярно- генетическими методами результативно, по крайней мере, в 92% обследованных семей высокого риска. В остальных 8% случаев требуется дополнительное биохимическое обследование.

В нашем Центре проведено 15 пренатальных ДНК-Диагностик ЫВ у плоде в первом триместре беременности: II из них прямым обнаружением мутаций гена CFTR, 4 - косвенным методом. В 4 случаях у плодов обнаружены по две копии мутантного гена CFTR, в 7 случаях плоды являлись здоровыми носителями одной копии мутантного гена, и в 3 случаях обе хромосомы плода были нормальнн. В одной семье с 50%-ой информативностью мутантная хромосома у плода не была обнаружена; следовательно, плод должен быть здоров. В случаях, когда плод определялся как больной ЫВ, было предложено прервать беременность, в остальных случаях. ■продолжить.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В данной работе была сделана попытка определить частоту ЫВ в Европейской части России, используя молекулярно- генетические показатели: популяционную частоту мутации AF508 (0,005048), учитывая, что ею обусловлена лишь' часть мутантных хромосом в рассматриваемой популяции (56%). Полученное значение (I/I2300 новорожденных) показывает, что частота ЫВ в российских популяциях может быть существенно ниже, чем ранее предполагалось, а также ниже, чём частоты, полученные для ряда стран Западной Европы. В то же время нельзя не отметить, что для некоторых Европейских популяций также характерна низкая частота мутации АР508 (северные шведы - 1/200, vлитовцы - I/I43) (Wennburg, Kuoincae, 1994) и низкая час'чрта муковисцидоза (Швеция - 1/7700, Финляндия - 1/26000 новорожденных) (Kare et al., 1969; Tsui, 1992). Рассчитанное -намЙ низкое значение частоты ЫВ может являться следствием влияния смешения славянских популяций с финно- угорскими популяциями, в ходе формирования русской народности.

Проблема выявления частых мутаций в гене CFTR помимо мутации ДР50в имеет, по крайней мере, два аспекта. Один их них

чисто технический и связан с размерами выборки хромосом, несущих мутации нв-ДР5оа. Вторая проблема популяционно- генетическая: популяция России генетически дифференцированаk во-первых, из-за широчайшего этнического разнообразия, а, во-вторых, из-за того, что она занимает огромную территорию. В такой ситуации, вероятно, единственно возможным подходом в установлении спектра и относительного úeca так называемых частых мутаций в гена CFTR для популяций России является объединение независимых выборок, обследованных разными авторами и характеризующих разные регионы страны. Такими, практически независимыми, являются выборка больных МБ, обследованные в Институте акуаерства и гинекологии им.Д.О.Отта (г.С.- Петербург) (Иващенко, 1992; Бакай с соавт., 1994) и в нашем . Центре. Первая выборка характеризует, в основном, Северо- Западный и Западный регионы России, а нала выборка - Центрально- Европейскую часть России и Поволжье.

К наиболее распространенным у больных МБ из России можно отнести мутации в 13, 21, 20 и 19 экзонах гена CFTR. Мутации в П зкзоне (кроме iJ54¿X) являются, по-видимому, редкими в русской популяции. Значительная доля мутантных хромосом в . русской популяции обусловлена мутациями, располагающимися, по-видимому, в декодирующей области гена OFTR, в интронах или промоторной области (VeriIngi» et al.,

¿нализ глплотипов сцепленных с геном CFTR маркеров показал, чго большая доля (Э5%) хромосом с мутацией AF508 в исследований популяции ассоциирована с гаплотипем В (XV2o/KM19) , подобная картина наблюдается и в странах Западной Европы, что может говорить о едином источнике гтроиехозденяя мутации AF508 для Европы и Foccvra.

Учитывая, что в настоящее время в России возможна идентификация 65-68* хромосом с мутациями гена CFTR, а вероятная популяционная частота MR существенно ниже, чем в большинстве стран Европы, популяциогашй скрининг на носительство МВ представляемся нецелесообразным. Кроме того, необходимо предварительное обследование семей, кмеодих больного ИВ ребенка, аа предмет поиска информативных для каждой из них молекулярных маркерных систем, что позволяет существенно увеличить число

семей (~92%), для которых возможно проведение преиатальной диагностики ЫВ только молекулярно- генетическими методами.

ВЫВОДЫ.

1. Скрининг новорожденных позволил рассчитать среднюю частоту мутации ДР508 (0,005048) и оценить частоту муковиецидоэв (I/ 12300 новорожденных) в Европейской части России.

2. Проведен скрининг 16 мутаций гена СРТИ, локализующихся в 3, 7, 10, II, 13, 19, 20 и 21 экэонах, в более чем 500 ЫВ хромосомах. Идентифицированы 10 мутаций: 394йв1ТТ (3 экзон); Я334и ( экзон); ДР508, 1б77с1е1ТА (10 экзон); С542Х (II экзон); 2143<1е1Т, 21841пзА (13 ЭК30Н)! БПЭбХ (19 ЭКЗОН); И1282Х (20 экзон); шзозк (21 экзон).

3. Спектр аовторяпцихся мутаций в гене СРТИ у обследованных больных из России имеет свои особенности: относительная частоту

мутации ДР503 составляет 56%; кроме нее, сравнительно частыми из изученных являются мутации 21841паА (13 экзон),' ШЭОЗК (21 экзон), У»1282Х (20 экзон), 214Э<1е1Т (13 ЭКЗОН), 0542Х (II ЭКЗОН) и 51196Х (19 ЭКЗОН).

4. Доля неидентифицированных мутаций составляет более 20% даже при выявлении их высоко чувствительными методами.

5. Анализ частот аллелей и гаплотипов внегенных (ХУ2-о, КЫ19) и внутригенного (ТТП6) маркеров выявляет, что в группе нормальных хромосом наиболее частым гаплотипом является С7 (36%), в группе ДР508 МВ хромосом - гаплотип Вб (95%), а в груше МВ не-ДР508 хромосом - гаплотип А7 (32%), что может указывать на существование в русской популяции распространенной, но пока неидентифицированной, мутации, ассоциированной с гаплотипом А7.

6. При сошостном использовании прямого и косвенного методов маркирования мутантных хромосом доля обследованных семей высокого риска, для которых возможно проведение пренатальной диагностики МВ у плода только молекулярно- генетическими методами, возрастает до 92%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Воронина, О.В., О.Ю. Потапова, B.C. Гайцхокн, Е.В. Богачева, Е.И. Шварц, D.A. Берлин, Т.Е. Гембицкая, Н.В. Петрова, Н.И. Капранов. Ассоциация внутригенного (ГАТТ)-- полиморфизма с различными мутациями в гене муковиецидоза. // Тезисы Национального Пульмонологического Конгресса. - Москва. - I99Q.

2. Воронина, О.В., О.Ю. Потапова, B.C. Гайцхоки, Е.В. Богачева, Е.И. Шварц, Ю.А., Берлин, Т.Е. Гембицкая, Н.В. Петрова, Н.И. Капранов. Идентификация мутаций в гене КФ. // Тезисы конференции ГНГПР "Приоритетные направления генетики". - Москва. - 1993. -Ç.I08.

3. Гинтер, g.К., Н.В. Петрова. Генетика муковиецидоза. // Пульмонология. - 1994. - А 3. - С. 33-37.

4. Зубрицкая, С.П., Е.А. Сироткин, Н.В. Петрова, Е.М. Нестерова, А.И. Базин, H.A. Осплова. Клинико- генетические параллели муковиецидоза в Саратовской области. // Первый (третий) Российский съезд медицинских генетиков. Тезисы докладов. Москва. - 1994. - С.23-24.

5. Капранов, Н.И., H.D. Каширская, Д.Ы. Моин, Н.В. Петрова, О.И. Симонова, З.А. Хафиэова, Л.А. Шабалова. Современные достижения и актульные вопросы в проблеме муковиецидоза. // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 1992. - Н. -С.34-39.

6. Петрова, Н.В., Е.К. Гинтер, Н.И. Капранов, Г.И. Ельчинова. Доля некоторых мутаций гена муковиецидоза и неравновесие по оцеплению между локусом OFTR-гена' и двумя ДНК-маркерными локуспми ь популяциях России. // Генетика. - 1994. - Т.30. -7. - С.974-977.

7. iJrtitskhoki, V.S., O.V. Voronina, O.Y. Potapova, L.7. Klryukhina, Z.A. Khaf izovn, N.V. Petrova, N.I. Kapranov, Т.Е. Gembitskaya, K.I. Sohwarts. Linkage disequilibrium between oyatio fibroaia mutations %nd polymorphic 4-bp repeat within CFTR g'ine. // Bioohemioal Medicine and Metabolio Biology. -1993. - V.50. - P.186-189.

8. Hafizova, Z.A., N.V. Petrova, I.S. Troobnikova, A.K. 'Jglizkih. Sweat electrolytes of CF patienta with re3peot to th-i type of the OF mutations: Prelinimary results. // The Xlth International Oystio Fibrosis Congress, Dublin. - Ireland. -

1992. - ТР.122.

9. Verlingue.C., N.I.Kapranov, B.Keroier, E.K.Ginter, N.V.Petrova, M.P.Audrezet, C.Pereo. Complete soreening of mutations in the coding sequence of the CFTR gene in a sample of CP pktlents from Russia: Identification of three novel alleles. // Human Mutation. - 1995. - V.5. - P.205-209-

10. Хафизова 3.A., Капранов Н.И., Петрова H.B., Ельчинова Г.И., Ферек К., Мерсье Б., Одрезе Ы. Клинический полиморфизм и генетическая гетерогенность муковисцидоза. // Молекулярная диагностика наследственных болезней и медико- генетическое консультирование. М. 1995. Республиканский сборник научных трудов, т.1. МОНИКИ. С.53-63.

II. Петрова Н.В., Капранов Н.И., Гинтер Е.К. Определение частых мутаций гена CFTR у больных муковисцидозом из Центральной России. '' Генетика. - 1996. - Т.32. - H.iO.- •

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Подп. к печати \ Чб Ч'жаз -\ '7 С- Тираж i 00 экз.