Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая нестабильность мутаций у Drosophila Melanogaster, индуцируемых онковирусными ДНК

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая нестабильность мутаций у Drosophila Melanogaster, индуцируемых онковирусными ДНК"

ргв 00

1 мл г? государственный национальный

i на1\ университет им.аль-фараби '

На правах рукописи УДК 575. г?А. 46:595. 773. 4

ГАБИТОВА Лейла Булатовна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ НУТАЦИИ У БКОБОРШЬА МЕЬАНОСАБТЕК, ИНДУЦИРУЕМЫХ ОНКОВИРУС1ШИИ ДНК.

Специальность 03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Алма-Ата 1993

Работа шполнена на кафедре генетики и молекулярной биологии Казахского государственного национального университета имени Аль-фараби и в лаборатории основ развития и старения Института биологии гена РАН (г.Москва).

Научные руководители: - доктор биологических наук,

профессор Р. И. БЕРСИМБАЕВ

- кандидат биологических наук С. Д. НАЕИРОЧКИН

Официальные оппоненты:

- член-корреспондент ран, доктор медицинских наук, профессор • л. и. корочкин

доктор биологических наук

Э. Б. ВСЕВОЛОДОВ

Ведущая организация

- Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН.

Зашита диссертации состоится " /у" имяу^/ ¿¿-1993 г. в " /¿4 " часов на заседании специализированного Совета К. 056. 01. 16 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при КазГНУ им. Аль-фараби по адресу: 460121, г. Алма-Ата, ул. Тимирязева, 46.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета КазГНУ им. Аль-фараби

Автореферат разослан

ж

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Т. И ШАЛАХМЕГОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ '

Актуальность проблемы. В настоящее время изучение генети-18Ской нестабильности является одним цз рэннейших направлений в ^временной генетике, изучение нестабильных мутаций о привлече-шем молекулярно-генэтических подходов |и методов исследования юказало, что в основе явления нестабильности лежат обратимте гроцессы, связанные с транспозициями дискретных, относительно [еболышх фрагментов ДНК - мобильных элементов генома» Особея-юсти структурной,организации генетического материала и хорошая ГО изученность делают Drosophila melanogastar удобным объектом ля изучения проблем генетической нестабильности.

Основным методическим приемом к изучению проблем генетнчес-:ой нестабильности и инсерционного мутагенеза является выявление естабильных мутаций. В этой связи большое значение приобретает оиск и использование эффективных методов направленного иадуци-ования генетической нестабильности. Открытие новых систем не-табнльности, в которых наблюдается высокая частота мутагенеза, вязанного о перемещениями одного или нескольких мобильных вло-энтов, позволяет, во-первых, обогащать ¿список известных науке энов новыми, во-вторых, подойти к рэшенот проблемы, касалцэйся эханизмов и причин транспозиций, как феномена, свойственного зределенной глупце генов, сущоствущих .в генотипе практически обого организма.;Однако, прогресс в.этой области исследований в ючительной мере[ограничен теми трудностями, о которыми сталки-зэтся экспериментатор при создании генетических систем, позво-«щих с высокой частотой получать нестабильные нутации, »смотря на то, что подобные работы ведутся пироккм фронтом, до а пор охарактеризовано не так уз много генетических систем, ■вэчавдих этому требованию (Engels, 1976; Bregliano et al., iat; Btnghaa et al., 19S2; Герасимова, I9SS; Голубовскай и дяевву 1985; Yannopouloo et al., 1987).

Один из аффективных способов получения нестабильных мутаций дрозофилы основан на технике микроингекций ДНК ошсогошшх висов теплокровных шгвогных (кДНК вируса сарком Рауса и ДНК эзовируса обезьян Sa7 )в ранннэ эмбрионы . (Набирочкая, IS84; Озфочгаш и др., IS87; Гезарян и др.„ IS87). Нестоящая работа • ляется продолжением цикла работ, Бшхрзешшх отяш авторами.

з

Актуальность представленной работа определяется рядом обстоятельств. Во-первых, в данной работе охарактеризована система генетической нестабильности, специфически активируемая этими типами онковирусных ДНК. Во-вторых, полученные экспериментальные данные существенно расширяют наши представления о причинах и механизмах транспозиций мобильных элементов в геноме. В-третькх, экспериментальный материал, представленный в датой работе позволяет по-новсму взглянуть на проблему взаимодействия вирусного генома с геномом эунаркотической клетки, которая приводит к ее злокачественной трансформации.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось охарактеризовать систему генетической нестабильности, у Droeophila melanogaster, специфически активируемую двумя типами онковирус-них WIK: кДНК вируса саркомы Рауса (RSY) и ДНК аденовируса обезьян Sa7.

Получение экспериментальных данных, подтверждающих гипотезу, что онковируснне ДНК, введенные методом микроинъвкций в ранние эмбрионы дрозофилы, способны вызывать перемещения мобильных элементов и генома реципиента и явилось основной задачей нашего исследования, в связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) используя генетические метода, охарактеризовать'генетическую нестабильность мутаций в локусе Lobe, специфически индуцируемых инъекциями ретровирусной ДНК в ранние эмбрионы дрозофилы;

2) выявление инсершюнной природа мутаций, индуцированных кДНК BRV, с использованием молекулярно-генотических методов {на Примере локусов white и Adh);

G) • молокулярно-генвгичеекий анализ мутаций в локусах yellow, eoute и singed, индуцируемых микроинъекцяями ДНК Sa7 в ранние эмбрионы дрозофилы;

'4) цитогаквтачоский анализ мутаций Sa7-спектра.

Научная новиг.на работы. В настоящей работе впервые было установлено, что система генетической нестабильности, активируемая онковирусншми ДНК, характеризуется продленным действием. Продемонстрирована способность аденовирусной ДНК индуцировать массовые перемещения мобильных элементов в геноме реципиента. Доказано, что нестабильность мутаций, индуцируемых как кДНК RSY, так и ДНК Sa7, обусловлена инсерциями-эксцизиями мобильных элементов в геноме реципиента.

Так™ обрпэом, впервые били получены прямые экспериментальные доказательства способности онковирусных ДНК индуцировать транспозиции мобильных элементов в генома рощшианта.

Практическая ценность. Полученные результаты позволяют с новой точки зрения рассматривать проблему взаимодействия вирусных последовательностей с геномом эукариотичесхоЯ клетка;, что может иметь важнее значение для раскрытия причин и механизмов транспозиций мобильных элементов и их связи с проблемами канцерогенеза. Результаты экспериментов, представленные в данной работе, свидетельствуют о перспективности дальнейших исследований в этой области.

Апробация работа. Материалы диссертации докладывались на заседании кафедры генетики биологического факультета МГУ (апрель, 1909), кафздры генетики и молекулярной биологии КозГУ (октябрь, 1989: январь, 1090; январь, 1991), на биологической межвузовской конференции молод« ученых и студентов КазГУ (Алма-Ата, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, 2 статьи находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 'обзора литературы, экспериментальной части, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста, содержат 14 рисунков и 8 таблиц. Список цитированной литературы составляет 209 публикаций, из них 154 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использованы мухи мутантных линий Droeophila melanogaetor, полученных после введения онковирусных ДНК ранние эмбрионы: кДНК rsv - лиши, несущие мутации в локусах Lobe (LRoV) и white;ДНК Sa7 - линии, несущие мутации в локусах yellow, eoute И einged.

Мух культивировали в термостате на стандартной питательной среде при температуре 25°С (Какпаков, 1976).

Генетический анализ мутаций в докусе Lobe. Мух гомозиготных мутантных линий ь^37-группы индивидуально скрещивали с мухами линии Су/Тт;D/Sb, несущей запиратели кроссинговора по 2-ой и 3-

г* PÍ3Y

ей хромосомам. В случав рецессивных аллелей L • в Р1 отбирали мух с фаиотипом lobe (переход рецессивного аллоля в доминантный); в случав доминантного аллеля в Р1 отбирает мух с нормальным фенотипом (роверсия мутации к норме, возникновение роцоссивного аллоля). Для того чтобы выяснить, могут ли рецессивные аллели решртировать к норме, мутантных мух скрещивали индивидуально с мухами линии Di (2R)I>+R,Bl/CyO, несущей далецию по лекусу Lobe, и б Р1 отбирали мух с нормальным фенотипом.

Чтобы выяснить характер наследования изменений, обнаруженных в локусэ ЪоЬв, отобранных при генетическом анализе мух скрещивали с мухами линий Cy/Pm;D/ßb и дикой линии Oregon й. Как мутационные регистрировали только те изменения, которые наследовались моногенно.

Предварительно проверяли пенетрантность проявления мутаций Х^-груплы и учитывали эти данные при проведении генетического анализа.

Для того, чтобы учесть влияние хромосом линии Cy/Pm;D/Sb, несущих занирателя кроссинговера, на частоту мутационных переходов в локусе Lobo, аналогичные вкеяерименты были проведены с использованием линии Oregon К.

Молекулярное методы. Все процедуры, связанные с выяснением молекулярной природы мутаций (выделение ДНК из мух, рестрикция геномной ДНК, электрофорез, гибридизация по Саузерну), проводились пс методикам, подробно описанным в литературе (Uaniatio г., Fri+.oh е., Sambrook J., 1982). Фильтры посла гибридизации отмывали в o.lxsso 0,I%sse при 66°0 в течение 4 часов. Радиоактивную котку вводили в гибридазационныэ зонды методом ник-трансляции (Rigby P.w. et al., 1977). Если последовательности, используемые в качестве зонда, были клонированы в ллвзмиде, для ник-•трансляции использовали только вставку геномной ДНК без последовательностей прокариотвческоро вектора. Описание использованных в тех или иных случаях плазмид дается в тексте при изложении собственно экспериментальной части работы.

Вывод о характере структурных перестроек, индуцированных оиковируешмд дни, делался при сопоставлении результатов блот-гябридизация, выполненной с использованием • 3-4 разных рестряктаз.

Цитологические методы, Гибридизацию in oitu проводили на давленных препаратах слюнных желез личинок III возраста: Личинок выращивали но специально приготовлешюм корме, обогащенном дранками, при температуре 18°С. ДНГ< для гибридизации in oitu метили методом ник-трансляции бреши (Bonner and Farduo, 1976). Меченную ДНК растворяли в еодо до концентрации удельной активности Ютю. (мин. )10мкл, денатурировали кипяченном с последующим быстрым охлаждением до -70°С. В смесь для гибридизации добавляли формамкд до концентрации Ь0%. дэкстран сульфат до концентрации IOS и 2X5SC. Гибридизация in situ проводилась по стандартной методике (Pardue, 1968).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Продленная генетическая нестабильность мутаций локуса lobe, индуцированных введением ротровируной кДНК вируса саркомы Рауса.

В результате экспериментов по микрошгьекциям интактного вируса саркомы Рауса и клонированных фрагментов его кДНК в ранние эмбрионы Droaophila melanogaeter, были обнаружены видимые мутации, нарушающие развитие глазо-антегшого диска и приводящие к разной степени редукции фасеточного слоя и дупликациям кутякулярных головных структур-у го,raro [ИахОазян и др., 1983; Набирочкин и др., 1987а, 19876; Набирочкшэ и др., 1989; Набирочкин и др., 19896; Gazaryan et al., 19871. Генетический анализ показал, что дашые мутации являются аллелями локуса Lobe а проявляют генетическую нестабильность, которая в момент их возникновения носила "взрывной" характер. Следует отметить, что "взрывная" нестабильность в линиях lRSV-rpyram была зафиксирована ш сразу, а спустя 5-10 поколений посла обнаружения нутаций. После этого подробный генетический анализ этих линий не проводился, а сами они поддерживались в коллекции а гомозиготном состоянии на лротяжешш нескольких сотен поколений. Представляло интерес выяснить, но изменился ли характер генетической нестабильности мутаций ь^-групш при столь длительном пассировании в культуре.

В настоящей работе был проведен повторный генетический анализ данных мутаций, главной задачей которого было охарактеризовать нестабильность ре це сскных и доминантных аллелей локуса Lobe.

R^íV

Таблица I. Характеристика мутантных линий L -группы, индуцированных введением кДНК RSV в ранние

эмбрионы Droeophila melenogaeter.

Линии Феноташческое проявление характер наследования

lr,ksv(1)m jT,BSV(2) Lr,KSV(ad) Фасеточное поле редуцировано на 30-40%, у 70-803 мух щши1!ироВ0ны вибриссы Фасеточное"поле редуциро--В&НО на 15-20?, кутикулкрнне выросты в измененной части глаза, у 10-152 мух дуплици-ровакн польпа и вибриссы ФасётсчновТюле редуцйро™ вано на 16-203», у 30-S0Í мух дуплицированы антенны, у 10® мух - пальпы, у 70-80Ж мух -вибриссы Рецессивный аллель, наследуется моногенно, педатрянтность 100% Рецессйвный~аллёль7 наследуется моногенно, пенетрантность 73% Рёцёссйвный"*аллельТ наследуется моногенно, пенетрантность 81%

bRSY(er) brsv(1) Фасеточное поле редуцировало полностью, у некоторых мух остается небольшой Цо55») участок фасеточного шля, у ■ГОЯмух далицированы вибриссы Фасеточное п5лв""рёдуциро::~ вэно на 60-70%, у 1035 мух дуплицированы вибриссы ДоминйнтнйЯ аллель, наследуется моногенно, пенетрантность 100Ж Д5шнш1тный~аллель7 наследуется моногенно, пенетрантность 100%

В результате серии скрещиваний был подтвержден доминантный характер мутантного аллели и рецессивность аллеля

Lr,nsv(I)ш 0ГИ аллели характеризуются также полной пеяетрантнос-тыо Для рецессивных аллелей xr,RS^2 ^ и Lr,RSV^a<i' при скрещиваниях с мухами Oregon R в Р2 наблюдали отклонение от ожидаемого расщепления по фенотипам 1:3. Мы предполокили, что причиной отклонений в расщеплениях была изменившаяся пенетрантность этих аллелей Lobe. Для проверки данного предположения была определена пенетрантность Lr,lloV(i>' и Lr,RSV^ad' аллелей в гомозиготных линиях при 25°С. Для аллеля Ir,Rsv^2' пенетрантность оказалось равной 7ЭХ, а для if, BSV(ad) _ в дал^^ем щц проведении генетического анализа мы учитывали характер пенетрантности аллелей Lobe. Все данные статистически обрабатывались с использованием lz-критерия. [Плохшский, 1987] Достоверный интервал в среднем равен 80%. В таблице I представлены основные характерис-§ики мутантных аллелей lobe, индуцированных с'помощью микроинъекций ретровирусной кДНК в ранние эмбрионы дрозофилы.

Таблица 2. Генетическая нестабильность мутаций LPSV-rpymni.

МутвционныЯ переход Частота мутационных событий *, x I0~3

jRSV(er) ,_^ 3,4

Lr,RSy(1)m LHSV(er) jPS7[1) 1,3

Li>,BSV(1)m _^ ь+ 1,0

jT,FSV(2) jHSV(er) ¿RSVd) 1.2

lRSV(2) 1.3

jP.RSV(ad) _^ LHSV(er) jRS7( 1) 1.0

jT,PSY(ad) _^ b+ 1.3

средней при проведении генетического анаятза каждой мутантной пинки группы L для оценки частоты мутационных событий в покусе Lobo просматривали в ?1 примерно по 20 тысяч мух.

Генетический анализ показал, что спустя 100 поколений после возникновения рецессивные и доминантные аллели bRSV по-прежнему зодут себя как нэствбильнне - частота мутационных переходов в шх гораздо выше частоты спонтанного мутагенеза и колеблется от [,0 до 3,4хЮ~3. Вместе с тем "старые" аллаля утратили способность к "взрывной" нестабильности. При генетическом анализе ¡а фиксировали лишь одиночные нугантные перехода, причем, если ipa "взрывной" нестабильности новые мутации н реверсии к норме зозникали болышша "пучками", то сейчас появляются лишь одиночен особи, несущие новые мутантные аллели или реверсии по локусу лЬе (таблица 2).

Таким образом, при длительном пассировании в культуре ал-голей L1^7 не только изменился шх генетической нестабильности, го и произошло смещение в гамэтогеназо времени возникновения му-•ашошшх изменений - с премейотичееккх на мейотическив яла юстмейотическив стадии.

Со временем произошло и определенное изменение общей на-гравленности мутационных переходов: если вначале рецессивные ал-[вли ь^-групш давали при "взрывной" нестабильности доминантна аллели Lobe или рэвертировали к норме, а доминантные аллели ^ оставались стабильными, то спустя 100 поколения характер

изменений рецессивных аллелей х,1-«^7 в целом не изменился, в то время как доминантный аллель Javier) приобрел способность ре-вертировать к норме, но по-прежнему не способен к мутационным пароходам "доминантный аллель —»- рецессивный аллель".

Замечено также, что изменился спектр мутаций, возникающих в данной системе генетической нестабильности. Если раньше, в момент возникновения, при "взрывном" мутагенезе нестабильных рецессивных аллелей Loba фиксировали-мутационные переходы, затрагивающие в основном локус Lobe, а также и другие группы локусов: white, singed, duapy и др.[Casaryan et al., 1987], то на данном этапе исследований мутационные изменения ограничены одним локу-сом Lobe (моыолокусная нестабильность).

Как нам кажется, изменения в характере проявления мутации Ь^-груплы могут быть связаны скорее со сменой при длительном пассировании того, что называется "генетическим фоном", чем с изменениями молекулярной природы самих мутаций, поскольку большинство мутантншс аллелей L все-таки сохранили присущую им • направленность мутационных переходов.

Выявление природы мнсерциожшх элементов, вызвавших мутационные изменегая в локусе lobe, оказалось затруднительным, так как локус Lobo не был проклонирован. Поэтому, способность ротро-варусяой ДНК индуцировать инсерцконшй мутагенез в половых клетках дрозофилы проиллюстрировали эксперименты по молекулярному анализу структурных перестроек в двух других генетических локу-сзх дрозо&ии. часто мутирущих под действием ретровирусной ДНК: white И Adh.

инсеридонная грзрода мутацкй, индуцируемых кДНК RSV.

К числу локусов. часто мутирукдкх под влиянием ретровирус-ной ДНК относится локус white. D трех первичных мутантных jekhm-' ях, полученных после введения кДНК RSV, было зарегистрировано 4 случая возникновения мутаций wRsv. Проведенный блот-анализ мута--шй1 V показал, что все мутации этой грутпш имеют инсерционную природу и вызваны вставками протяженных фрагментов ДНК от I (два случая) до 5 т.п.н. (два случая) (рис. 1). Рестриктная карта ло-куса white Приводится из работы (O'Hare et al., 1983]. ГХлэзмиды, использованные в качество гкбридизационных зондов получены от С.Г. Гворгиевсй (Институт биологии развития РАН).

Другой локус, привлекший наше внимание, - лоху с ,\<ih. Ранее

Рис. 1. Структурные перестройки и локусе white, индуцируемые рптровирусной ДНК.

Oregon R -ggaagg^l___| |

В В RR

pv/(L) pw4(R)

5,0

Р—вгавЕЕСЯ—ивыр,, —.....у , . ^

R Б В R R

5,0

_ШЕ2

В

ДйУ-1

I---f-Г-г

R В В R R

1 ,0

1 „RSV-2

^n^rsv»:

I-i--1-г—"

R Е В R R

1,0

_JE2S5jl_»

в

R

RSV-4

римочание: В - BnmHi, R - EooRi - рестриктазы;

- Bamlir/EooRl - фрагменты локуса white, иепользовачзте в зчество гибрилкзационшх зондов:

- экзоны; —- - инсерция.фрагмента с указанием размера

ило показано, что инъекции ретровирусной кДЗИ приводят к су-ествеиному расширении спектра индивидуальной изменчивости в ак-ивности алкогольдегидрогенаэы - одного из ключевых для дрозофн-а Ферментов [Газарян и др.. 1987]. Поскольку локусы Arth и Lobe эсно сцеплены, мы решили проворить структуру гона Adh у мутан-

nqv

DB L -группы, надонсь, что изменения в этих локусях возникают ^повременно и кокзслвдуются в одной хромосоме.

Эксперименты по блот-гибридизвши показали, что у двух му-мтов L115'-группы из четырех проанализированных - i/>RSV<1>m и iSY(er) _ измеН9Н гои алкогольдегидрогоназы: он несет инсерцию ззмером примерно 5 т.п.н. у обоих мутантов, Плпзмида, р^10 ис-эльзованная в качестве зонда получена от Д.Гольдберга [Goldberg : ai., 1983). В линии )т инсерция мобильного элемента

произошло в 5'-, а в линии х^3^*4)- в З'-область гена Adh. Структурная часть гена. апкотольдогидрогеназы у мутантов не изменено.

Следует отметить, что мутагенез по гену white, как и по ло-куеу Adh, является специфическим для ретровирусной кДНК: ни в одной мутаятной линии, полученной с помощью микроинъекций аденовирусной ДНК, включая и линии с мутациями по второй хромосома, локализованными в непосредственной близости от гена алкогольде-. гидрогеназы, перестроек в этом локусе не обнаружено, а локус white вообще не чувствителен к мутагенному действию аденовирусной ДНК и не мутирует при введении этой ДНК в эмбрионы D.melanogaster [Набирочкин и др., 1987; Cazaryan et al.. 19871.

Как показал дальнеалий анализ, инсерционнно элементы, вызвавшие мутации в локусах white и Adh, представляют собой фрагменты геномной ДНК. Четыре мугентные линии из шести, использованиях нами в данной работе, нэ несут траисгенных последовательностей, а в двух других линиях - iBS't®1') я w^7-1 - хотя и обнаружены последовательности ретровирусной ДНК, но их структура и копийность таковы, что они не могут выполнять роль инсерцион-ных элементов, вызвавших мутации. Можно утверждать, что фрагменты геномной ДНК - инсерцда в локусах white и Adh относятся к категории мобильных элементов D.rcelanogaeter. Клонирование инсер-ции из локуса white, прямо показало, что она представляет собой мобильный злемэнт генома дрозофилы. Молекулярно-генетический анализ мутаций, индуцированных аденовирусной ДНК.

Аденовирусная дик, введенная методом микроинъекций в полярную плазму эмбрионов D.melanogaster, вызывает мутации преимущественно в Х-хромосоые [Набирочкин и др., 1987а]. Спектр мута-•щтй охватывает ряд локусов, которые проклонировэны я, следовательно, поддаются молекулярному исследованию. Эти особенности мутагенного действия аденовирусной ДНК, главным образом, определили выбор мутаций Ба7-спектра для молекулярно-генетического анализа.

Помимо принципиального вопроса о молекулярной природе мутаций, индуцируемых онковирусшми ДНК, нас интересовало, насколько универсален механизм возникновения мутаций в данной системе ге-

логической нестабильности. Поэтому мы проанализировали характер структурных перестроек в трех разных гонетичоских локусах и у мутантов по одному генетическому локусу, возникших при использовании разных линий реципиентов. Для анализа нами били шбршш мутации в локусах yellow, soute и eingod. Kait известно, эти ло-кусы являются наиболее изученными как генетически, так. и молоку-лярно tCampuzano et al., 1935; Geyer et al., 1986; Roüia et al., 1988].

Структурные перестройки в локусе yellow.

Локус yellow является одним из наиболее часто мутирующих под влиянием аденовирусной ЛИК локусов [Casaryan et al., 1987; Газарян и др., 1987]. Основные результаты экспериментов, в которых после вводения аденовирусной ДНК происходили изменения в этом локусе, и характер обнаруженных в локусе yellow при молекулярном анализе перестроек приведены на рис.2.

Как показали эксперименты по блот-гибридизшши, мутация y2,Sa?> полученная после введения ДНК ßa7 в вибрионы линии Oregon H, вызвана инсерциой в регулягорную область гона yellow фрагмента ДНК размером 6,5 т.п.н. Для того, чтобы выяснить, какова природа этого инсерциокного злемента. мн провели эксперименты, в которых ДНК мух линии у2,5®7 гибрндизоваии с последовательностями ДНК аденовируса Sa7 (блот-гибридизация). Оказалось, что в геноме мугантних мух последовательности онковирусной ЛИК отсутствуют. Чтобы окончательно убедиться в том, что отсутствие сигнала на автографах не связано с методическими трудностями блот-гибридизации, ш перегибридизовали то же фильтры с Фрагментом геномной ДНК дрозофилы, а именно: ДНК плазмиды р73В, содержащей 1,6 т.п.н. ВапЛ1- фрагмент протоонкогана o-abl-вго дрозофилы из района 73В (ллазмида получена от Т.Корнберга). Полученные результаты однозпачно свидетельствуют, что последовательности аденовирусной ДНК в геноме иутактннх мух отсутствуют, и, следовательно, инсерциснный злемент, вызвавший изменения в локусе yellow у мутантов y?,Sa7, является фрагментом геномной ДНК.

Для того, чтобы определить характер этого элемента, мы проанализировали структуру локуса yellow у ревортанта y+,Sa7. Оказалось, что реверсия мутации у ' ' к норме происходила за счет точного (в пределах чувствительности блот-гибридизации) вырезания шсорционного элемента, внедрившегося в регуляторную область

Рис. 2. Структурные изменения в локусе yellow, индуцированные аденовирусной ДНК.

N,/

Oregon R

Т i R В

"ТГ

в

"! "Г R S

1—г~ R В

SS в

—Г

Л S

y2,Sa7-2

у2.Ба7-1 _+2,Sa7-1

R В

i i SS

XT*'

Т-Т~ R В

-ТГ

S3

В

„2 1 а£ у во w

R

тт R В

т R В

тг SS

тг

£

"Т

SS в

тт R S

~гт Я S

—г И S

у во w

1 линия

y+BoVG 2 ЛИНИИ

Примечание: рестриктязы: в - ВалШ, s - Saioi, R - EocRI; .юнгам.,. _ структурные участки гона;4^ инсерция геномной ДНК; Xj/ - МДГ А\ - длинный концевой повтор МДГ1. Рестриктная карта локуса yellow приводится из (Campuzano et al., 1985].

<f*

гена. Поскольку в этой мутвнтаой линии последовательности аденовирусной ДНК на обнаруживаются, инсерционный элемент, вызвавший мутацию, судя по его поведению (способность к инсерциям и зксци-зиям), представляет собой мобильный элемент генома D.melanogaster. Однако, чтобы окончательно убедиться в том, что мутационные события, индуцируемые онковкрусными да, действительно могут быть связаны с их способностью вызывать перемещения или структурные парестройки мобильных элементов' в геноме реципиента, мы проанализировали структурные изменения в локусах yellow и scute у мутантов, полученных после инъекций аденовирусной ДНК

Рис. 3. Структурные изменения в локусе soute, индуцированные аденовирусной ДНК.

7

jbsss3essl.

—г Я

2 Т aG

у во w

1

H

п г H й

I

H

y^oV0

я

717

-i—i— H H y2eo+waCI ЛИНИЯ

Примечание: рестриктаза - HindlII;

г.,..... - структурный участок raisiX^ - ?ВДГ4;р? - длинный концевой повтор мдг4: С^Л/- длинный концевой повтор и фрагмент внутренней части мдг4. Рестриктноя карта локуса coûte приводится аз [Campuzano et al., 1985!.

з эмбрионы линии j^bo1*30. в этой ыутантной лшши мутации в ло-*усах yellow и soute вызваны шсерцняш ВДГ4 [Георгиев и др., [986].

Молекулярный анализ показал, что у полученных в результате зведения ДНК Sa7 в эмбрионы у^ео1?»®0 ровертантов у+во1«а0 (два злучая) и у нового мутанта y1ao1wa0 изменения в локусе yellow связаны либо с неполным вырезанием МДГЧ (у обоих ревертантов остаются длинные концевые повторы ЩГ4), либо с иисерцкей в структурную часть гена протяженного фрагмента геномной ДНК. По всей яэроятаосги, этот фрагмент геномной ДНК представляет собой мо-Шъннй элемент генома реципиента, поскольку в лгочш y1eo1waG последовательности вирусной ДНК отсутствуют. 'труктурные перестройки в локусе eoute.

После введения аденовирусной ДНК в эмбрионы линии y2Bo1wa0, гомимо изменений в локусе yellow, были зарегистрированы роворсии [утации во1 к норме. Как показал проведенный аиализ, во всех

Рис. 4. Структурные перестройки в локусах yellow и singed.

Локус yellow

1 w у en ;bw;et

1 г R В

I I

S3

В

~ г R S

1—Г~

R В

~П-Г

SS В

i г" R S

3d.Sa7 + yJ • 'en

т—г В В

вщдш&цця

SS в

Т-Т R S

У+«т+

ИГ

R В

"П—Г

SS в

1—г R 5 1„_w

у вп

^ г

В

И—г~ R S

R

В

y1enW!bw;et

В

-Г"г R S

Локус einged

3d,Sa7 +

г ' ' en

-Г-R

В

К S

R

у1вп+;Ау

^ Г

—»—r~i~ В R S у+вп+/Т4

ПГ"

R

I

В

-I-ГТ-г

В R S R „+__+

т В

^ г

т В

I г R 3

-г-R

утвпт/Р10

у1 snw

Примечание:

рестриктная карта локуса singed приведена из [Roiha et al., 1988]. Рестриктазы: B-BamHI, S-Saioi, R-EooRI.

■Обращенными флажками обозначены две дефектные копии Р-аломонта в обратной ориентации.

Треугольником обозначены вставки геномной ДНК: размером 3.5т.п.н. (yellow) и размером 5 т.п.н. (oinged); ЛАА - плазмида реп9.

случаях возникновение ревертантов связано с перестройками МДГ4: у двух ревертантов в районе локуса eoute остаются длинные концевые повторы, а у третьего - длинные концевые повторы и небольшой фрагмент внутренней части мобильного элемента (рис.3). В качестве зонда для блот-гибридизации использовали ДНК рвкомбинантного фага Л.во14, несущего область локуса eoute, в которой локалмзова-

а мутация во1 fCarr.puzano et al., 1905]. груктурные перестройки в локусе ginned.

После введения ДНК аденовируса Sav в эмбряошх линии 'enw:bw;et, были зарегистрированы реверсии по локусу oingad -,'5,Sa7en+, y1cn+;Av и , Мутация в локусе singed в литш-эцишентв вызвана инсерщюй двух делегированных копий Р-чемента в обратной ориентации [Roiha et al., 1983; Engelu, ?84]. Как показал проведенный Слот-анализ, реверсии по локусу Lnged связаны с точным вырезанием обеих копий дефектного -элемента из мутантного локуса.

Особый интерес представлял случай двойной реверсии y+ent D зтомстве этого ревертанта с высокой частотой возникали суперне-габильше аллели по генетическим локусам Х-хромосомы, характерам для мутагенного спектра аденовирусной ДКК [Нэбирочкин и др., 387]. Мы проанализировали структурные перестройки в локусах allow и singed у двойного ревертанта. В исходной линии мутация ' не связана по-крайней мере с крупными структурными перестрой-ами в локусе yellow, У ревертанта у+вп+ была обнаружена инсер-т 3,5 т.п.н. фрагмента ДНК в рогуляторяую область гена (рис. ). Поскольку этот фрагмент исчезал при обратном мутировании ^—»у1, можно предположить, что он представляет собой мобильный цемент реципиента и каким-то образом компенсирует снижение ровня экспрессии гена yellow у мутантов y1enw (последователь-эсти аденовирусной ДКК в линии у+вп+ не обнаруживаются).

Структурные перестройки в локусе singed у ревертанта yen* эсили более сложный характер, чем у ревертантов y3d,Sa7en+ и 'бп+ ;av. До у него сохранялись обе дефектные копии Р-пемента. Кроме того у этого ревертанта была обнаружена инсерция т.п.н. фрагмента ДНК в локус singed, в непосредственной бли-эсти от Р-злемента - по-видимому, реверсия мутации snw к норме зязана с появлением атой дополнительной инсерции, поскольку при "ратном мутировании y+sn+ —► у1 en" происходило восстановление зходной структуры локуса singed, характерной для мутантов Bnw зис.4). Дальнейший молекулярный анализ показал, что после Р10, эз изменения в фенотипическом проявлении реверсии enw, произош-з вырезание из локуса singed как последовательностей 5 т.п.н. тернии, так и дефектных копий Р-элемента.

Щтогенетаческий анализ мутаций Ба 7- спектра.

Для того, чтобы ответить на вопрос: индуцируются ли неста-<5ильныо мутации в данной системе генетической нестабильности каким-то специфическим семейством мобильных элементов, или же аденовирусная ДНК способна индуцировать транспозиционные взрывы, т.е. транспозиции нескольких семейств мобильных элементов в геноме, мы проанализировали характер распределения мобильных элементов в Х-хромосомах линий, полученных после введения аденовирусной ДНК. Происхождение мутантных линий, использованных для цлтогенетического анализа представлено на рис.5.

Рис. 5. Происхождение мутантных линий, использованных

для

\

цитогене тиче ского анализа.

сз<

1 да

у бп

У

а7 +■ 'вп

у+вп+

+ ** у вп р1 еог

Р7

+ + , * ' у еп рГ оог

сз< У2001«а°

2 + аб у во и -

? 1 оГ

у^о V/ апв

у^оЧ^гАУ

+ 1 аО У во « (3)

у+ео\а(5<1)

с г

у 8п+рГ 01(1 оог

уз

+ аО г * ао те ;1по -

угво+*га0{Лу

Поскольку анализируемых мутантных самцов вели в скрещиваниях с самками со сцепленными Х-хромосомами, т.е. анализируемые X-хромосомы не были затронуты кроссинговером, мы могли сравнивать распределение мобильных элементов у мутантов с их распределением в родительских линиях.

■ В анализ были взяты пять мобильных элементов, представителей четырех классов мобильных элементов дрозофилы: МДГ1 и МДГ2 (ретровирусоподобшэ влвменты),РВ-влемент, Р-элемент и ¿оокеу (ЫКЕ-элемент). *

Результаты локализации ВДГ1 и МДГ2 на политенных хромосомах слюнных желез нестабильных мутантных линий ва7-спектра представлены в таблицах 3 и 4.

Оказалось, что в Х-хромосомах тестируемых, линий, возникших

Таблица 3. Анализ распределения и МДГ2 в Х-хромосоме лиши y2Bo1waG и ее мутантинх производных после инъекций ДШС Sa7.

Линия ВДГ1 МДГ2

1В 4В 19А 20А 4D 5А 12F 17В 19А 2 OA

До Vе я а а га и в a и

я я и и я 19 га я

AoWv а a а в и т я а а a и

r+eoV^tl) а а а и г а т о в

r+eoTwa3^2) a а a а

f во в о в а а а в в п

"5„„+„55., „ г so w ;Av а а a а я a в и

a а в я a а a а

1римечание: в - локализация мобильного элемента; ~ инсерция;

t— эксцизия мобильного элемента из родительского сайта.

госле инъекций ДНК Sa7 в змбрионн y2eo1waG распре деление МДГ1 ютается неизменным для линии-реципиента и всех ее производных. 1ри анализе распределения МДГ2 наблюдаются существенные измоно-®я в локализации этого мобильного элемента у двух производных гинии j^bo1»^0 (см. табл.З).

Анализ другой груши мутаятных линий, полученной в экстари-юнтах, когда в качестве линии-реципиента были использованы эмб-жгонн у1enw;bw;et, показал, что в этой системе генетической не-¡табильности активно перемещаются как копии ВДГ1 так и ОДГ2 'таблица 4). Особенно интересным был случай двойной реверсии по юкусам yollow и singed. Очевидно, что возникновение реверсий юпрововдается активными транспозициями копий МДГ1 и МДГ2 (см. >абл. 4).

Чтобы узнать, перемещаются ли другие мобильные элементы в [виной системе нестабильности, мы сравнили локализацию Р-'Лёмента, РВ-елемента и Jookey у личинок гомозиготных линий -•1enw}bw;et и ее производной у+вп+ (случай двойной реверсии).

Таблица 4. Анализ распределения МДИ и КДГ2 в Х-хромосамах линий и еэ мутантшх производных после инъекция ДНК Ба7.

Линии ВДГ1 МДГ2

а в о 1В 4A.4D.5A 11.В 12С 160.19А„20 в в и О О в в

у4еп+/Р1 а еэ г а п се 13 >Г в в в

+ + - * У сп рХсзог к в и г у у 0 О В В Е

у еп р^зог »г * в в м м ы „ <Г В В ^ р М М сэв

ног- И в » у ¿Г > В И 13 С9

» * в в

У1БП";ЛУ е в а в в а в о в в

¡ТрймйТашо: и 'г~ло1Ш51з¥ция мобильного элемента"; в - инсорция;

— эксцизия мобильного элемента из родительского сайта.

Таблица 5. Распределение Р-элемэнта, рв-элемента и ¿оокеу В Х-хромосомах димй у1еп№;Ъяг;в1 и у+вп+.

Р-элемент элемент Зоокеу

30 4А 5А 7С 80 17А 180 20А

1 И у еп и |э в в

у+еп* Р1-4 в Р>1 4 » » Т » V ¿Г //!) в в а в в и ,

Примечание: и - локализация мобильного элемента; в - инсерция ;

— эксцизия мобильного элемента из родительского сайта

Результаты этих экспериментов представлены в таблице Б. Как видно из таблицы б возникновение двойной реверсии сопровождалось активными перемещениями копий Р-элемента и Зоокеу.

Таким образом было установлено, что в системе генетической нестабильности, индуцируемой аденовирусной ДНК, происходят массовые перемещения мобильных элементов в геноме реципиента.

Заключение

Рассматривая систему нестабильности, актипируемун инъекциями как кДЛК RSV, так и ДНК RSV, мы видам, что мутации, возшптю-ние в этой системе нестабильности нмоют шсерционную природу, а роль ннсерциошшх элементов играют мобильные элементы генома реципиента.

Обращает на себя внимание универсальность основного мвха-тозма возникновения мутаций - абсолютное большинство их имеет шсерционную природу и не связано с возникновением крупных хромосомных перестроек, делеций, точечных изменений ДНК, при этом сарактер мутационных событий, индуцируемых онковирусными ДНК в эазных генетических локусах, не зависит от генотипа лайм реци-шента. Это обстоятельство в какой-то мере отличает данную сис-■ему генетической нестабильности от других подобных систем, изустных в настоящее премя [Сагсршзапо et al., 1985; Hoiha et al., 9B0; Engele and Preoton, 1906; iinnegan and Pawoell, 1986].

По-видимому, онковирусше ДНК ЯВЛЯЮТСЯ ЛИШЬ ШрВИЧНЫМИ ш-[уктораии той цепи молекулярно-генетичэских событий, которая риводат в конечном итоге к возникповешш инсерциснных мутаций и | основе которых лежат транспозиции мобильных элементов в геноме юципиента.

Поскольку эффективность мутагенного действия онковирусной НК по меньшей мере на 2 порядка выше, чем у ДИК иевирусной при-оды (плазмидной, тотальной геномной), мокно считать, что именно собонности структурной организации вирусного генома делают он-овирусные ЛНК мощными и специфическими индукторами системы ге-етической нестабильности Droeophila melancgaoter.

Суммируя приведенные в настоящей работе результаты, можно делать главный и, как нам кажется, в достаточной степени обос-эванный вывод: в основе системы генетической нестабильности, вдуцируемой как ретровирусной, так и аденовирусной ДНК, лежит пособность этих ДНК индуцировать транспозиций мобильных лейцитов в геноме реципиента.

выводи

1. Показано, что спустя длительное время после возникновения му-тантныо аллели локуса Lobe характеризуются перманентной генетической нестабильностью. Со временем произошло изменение характера генетической нестабильности данных мутаций: утрата способности к "взрывномут мутагенезу; изменение спектра мутагенеза (ограниченность мутагенного действия одним генетическим локусом Lobe - монолокусная нестабильность); генетическую нестабильность проявляют как рецессивные, так и доминантные аллели Lobe; произошло смещение во времени мутационных событий - с премейотичес-ких на мейогичасюге или постшйотическиа стадии.

2. Молэкулярш-гештический анализ мутаций, индуцируемых ретровирусной кДНК, на примере локусов white и Adh, показал, что они возникают за счет инсерций в мутирующий локус мобильных элементов генома реципиента. Таким образом доказана способность ретровирусной кДНК индуцировать транспозиции мобильных элементов в геноме реципиента.

3. fia примере локусов yellow, soute и singed было показано, что подавляющее большинство мутационных событий, индуцируемых аденовирусной ДЩ (возникновение мутаций, реверсии мутаций к норме, обратное мутирование, аллельные мутационные переходы), определяется инсерциями-эксцизиями мобильных элементов в геноме реципиента.

4. С помощью шгода гибридизации in situ доказана способность аденовирусной ДШ индуцировать множественные транспозиции мобильных элементов по типу "транспозиционных взрывов".

5. В основе система генетической нестабильности, активируемой онковирусной ДНК, лежит способность этих ДНК индуцировать транспозиции мобильных элементов в геноме реципиента.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Габитова J1.5.. ■ НаСирочкин С.Д., Борсимбаов Р.И. Молекулярно-генетический анализ мутация Sa7-спектра у Drocophila nelanogaotor, индуцированных онковирусными ДШС, на примере г.оку с a yello*: Сб. Теоретические и прикладные исследования по генетике. Алма-Ата. 1990. С.15-21.

2. Габитова Л.Б., Берсимбаев Р.И. Молекулярно-генетический анализ мутаций Sa7-спектра у Drosop/illa molanogaater, вдуиированшх онковирусными ДНК (на примере локуса yellow) // 3 сб.: Теоретические и прикладные исследования по генетике.

. КаэГУ. Алма-Ата. 1990. С.10.

3. Габитова Л.Б., Кабирочкин С.Д., Бегетова Т.В., Газарян i.P. Индукция нестабильных мутаций у Drooophila melanogaetor ■¡икро инъекцией ДНИ оякогенных вирусов в полярную плазму эмбрионов. Продленная генетическая нестабильность мутаций в аокусе Lobe. // Генетика. 1991. Т.27. М. С.617-624,

4. Еабкрочкин с.Д., Габитова Л.Б., Бегетова Т.В., Газврян Я.Г. Индукция нестабильных мутаций у Drocophila meianogf»ster дакроинъекцией ДНК онкогенгаа вирусов в полярную плазму эмбрионов. МалигназируюадЯ эФФокг онковирускых ДШС. // Генетика. [991. Т.27. т. C.7&J-790.

5. Габитова Л.В.,- Небирочкин С.Д., Еерсимбаев Р.И. Генетические к морЗз-фигологическиэ изменения , в локусо Lobo, щдуцировангао с Помощью кякроинъекций ретровирусной ДНК в ранние эмбрионы DroeopKila melanogaeter // Известия АН PK. Алма-Ата. 1992. Дб.

Подписоно к печати 8.02.93г. Заксз 158. Тирая 100. Ротапринт КазНИИЭО АПК.г.Алма-Ата, Сстпоево, 306.