Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клинико-генетическое разнообразие и молекулярная диагностика мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клинико-генетическое разнообразие и молекулярная диагностика мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса"

На правах рукописи <

Адян Тагуи Аветиковна

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА МЫШЕЧНОЙ ДИСТРОФИИ

ЭМЕРИ-ДРЕЙФУСА

03.02.07 - Генетика 14.01.11 - Нервные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

з о СЕН 2015

Москва-2015 005562687

005562687

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр» (ФГБНУ «МГНЦ»).

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович доктор медицинских наук Рудепская Галина Евгеньевна

Официальные оппоненты:

Акуленко Лариса Вениаминовна - доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой медицинской генетики.

Жилина Светлана Сергеевна - кандидат медицинских наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, доцент кафедры неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики.

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Российская медицинская академия последипломного образования" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «26 » октября 2015г. в 11-00 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр» (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1; www.med-gene.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Медико-генетический научный центр» по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан \

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор „■■" Зинченко Реиа Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса (МД ЭД) - генетически гетерогенная группа болезней с триадой типичных симптомов: первичными контрактурами локтевых и голеностопных суставов, возникающими в раннем детстве, медленно прогрессирующей слабостью лопаточно-плечевых и тазово-перонеальных мышц, а также поражением сердца: нарушениями ритма с высоким риском кардиомиопатии (КМП) и фатальных осложнений. Тяжесть и соотношение кардиологической и миопатической составляющих варьируют, в том числе, внутрисемейно, но чаще скелетная миопатия бывает умеренной и даже «мягкой», а состояние и клинический прогноз определяются сердечной патологией. В зависимости от ведущих симптомов и семейного анамнеза больные попадают в поле зрения разных клиницистов — генетиков, неврологов, кардиологов, ортопедов, - иногда недостаточно информированных о МД ЭД, что препятствует своевременной клинической диагностике. В семьях ряда больных имеются случаи внезапной сердечной смерти у лиц молодого и среднего возраста — нераспознанной МД ЭД. Между тем, своевременная кардиологическая помощь (при показаниях -установка электрокардиостимулятора (ЭКС) и др.) резко снижает риск тяжелых осложнений, что делает раннее выявление МД ЭД особенно важным.

В настоящее время известно 7 генетических форм МД ЭД, вызываемых мутациями 6 разных генов и имеющих разные типы наследования: ХР, АД и АР (Bonne G. et al., 2013). Самыми частыми являются «классическая» ХР МД ЭД1 и АД МД ЭД2, связанные с генами эмерина EMD и ламинов А/С LMNA, соответственно. Эти формы составляют около 40% случаев с фенотипом МД ЭД. Значительно менее распространена ХР МД ЭД6, обусловленная мутациями гена FHL1 и составляющая около 10% случаев с ХР наследованием. На долю выделенных в последние годы АД MD ЭД 4, 5, 7 (гены SYNEI, SYNE2, ТМЕМ43) приходится не более 3-5% на каждую (Meinke P. et al., 2011); АР МД ЭД4, связанная, как и МД ЭД2, с геном LMNA, представлена единичными семьями. Таким образом, более чем у 60% больных с клинической картиной МД ЭД не обнаруживаются мутации в известных генах (Bonne G. et al., 2003). С одной стороны, это указывает на существование еще не установленных генетических форм и требует поиска новых генов-кандидатов МД ЭД, с другой стороны -позволяет предположить наличие генокопий.

Молекулярно-генетическая верификация МД ЭД важна не только для подтверждения диагноза у больных и генетической профилактики в семьях (ДНК-диагностика гетерозиготного носительства при ХР формах, пренатальная или предимплантационная ДНК-диагностика), но и для доклинической диагностики у родственников с целью раннего кардиологического наблюдения и лечения. Однако фенотипическое сходство всех генетических форм и большие размеры соответствующих генов затрудняют установление формы и поиск патогенной мутации. Разработка эффективного алгоритма молекулярно-генетической диагностики на основе клинико-генеапогических данных и относительной частоты

отдельных форм МД ЭД может способствовать оптимизации использования дорогостоящих молекулярно-генетических исследований и ускорению процесса МГК.

Различным аспектам МД ЭД посвящено значительное число исследований, включая отечественные. Однако комплексный клинико-молекулярно-генетический анализ больших групп больных/семей с учетом современных данных о генетической гетерогенности болезни в России не проводился, не разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики, не рассматривалась проблема генокопий. Таким образом, проблема МД ЭД требует дальнейшего изучения.

Цель работы

Целью исследования является изучение клинико-молекулярно-генетических характеристик основных генетических форм мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса (типы 1, 2, 6) и оптимизация их молекулярной диагностики с использованием современных методов ДНК-анализа.

Задачи исследования

1. Провести поиск мутаций генов ЬМЫА, ЕКЮ, РНЫ в выборке неродственных больных с клиническими признаками мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, определить доли тестируемых генетических форм в исследованной группе.

2. Проанализировать спектр выявленных мутаций генов ЬМЫА, ЕХЮ,

РНЫ.

3. Проанализировать клинико-генеалогические характеристики верифицированных случаев; провести сравнительный анализ клинических признаков мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса 1 и 2; оценить внутрисемейное клиническое разнообразие в семейных случаях.

4. У больных без мутаций генов ЕМЭ, [.МЫА и провести поиск частых мутаций генов, ответственных за 5 наиболее распространенных типов аутосомно-рецессивных конечностнопоясных мышечных дистрофий, и делеций гена дистрофина (при родословных, согласующихся с аутосомно-рецессивным и Х-сцепленным рецессивным наследованием соответственно); описать выявленные генокопии мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса

5. На основе полученных данных разработать алгоритм молекулярно-генетической диагностики в семьях с фенотипом мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса.

Научная новизна

В результате ДНК-диагностики трех генетических форм МД ЭД (типы 1, 2 и 6) в репрезентативной группе российских семей с клинической картиной МД ЭД установлен вклад этих форм в структуру группы (около 40%), определен спектр мутаций генов ЕМО и ЬМЫА, в том числе не описанных ранее (10 и 7, соответственно); случай МД ЭД 6 (мутация в гене ЕНЬ) - первый в России. При клинико-генеалогическом анализе верифицированных наблюдений выявлен ряд атипичных случаев, расширяющих представления о фенотипе МД ЭД. Впервые

проведен поиск генокопий МД ЭД в круге других МД, обнаружены случаи АР конечностнопоясных (КП) МД, клинически имитирующие МД ЭД.

Научная и практическая значимость

Полученные данные позволяют повысить выявление МД ЭД, оптимизировать ее молекулярно-генетическую диагностику, выбор и последовательность анализа генов (в частности, с учетом наличия генокопий). Ранняя диагностика с ДНК-верификацией дает возможность проводить у больных адекватную профилактику фатальных кардиологических осложнений, современные методы которой имеют различия при разных генетических формах МД ЭД, а в отягощенных семьях - своевременное выявление лиц с доклинической стадией болезни, гетерозиготных носительниц при ХР МД ЭД и бессимптомных носителей мутаций при АД МД ЭД, а также генетическую профилактику путем пренатальной или предимплантационной ДНК-диагностики. Результаты исследования могут быть использованы в практической работе врачей ряда специальностей (генетиков, неврологов, кардиологов, ортопедов, педиатров), лабораторий, проводящих ДНК-диагностику нервно-мышечных и сердечнососудистых болезней, а также в процессе первичного и последипломного образования на кафедрах медицинской генетики и неврологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В выборке 104 больных с фенотипом МД ЭД на долю трех основных генетических форм болезни приходится 38,5%, в том числе, вклад МД ЭД1 (ген ЕМП) составил 16,3%, МД ЭД2 (ген ¿МУЛ)-21,2%, МД ЭД6 (ген РН11) - 1%.

2. В гене ЕМ В отсутствуют частые мутации и «горячие» экзоны. Большинство мутаций (более 80%) обусловливают полное отсутствие белкового продукта. Выявленные мутации гена ЬМЫА сконцентрированы в экзонах 1 и 4 (64,7%). Информативность исследования кодирующих последовательностей и областей экзон-интронных соединений генов ЕМЭ и ЬМЫА методом прямого автоматического секвенирования достигает практически 100% (в связи с отсутствием крупных делеций/дупликаций). Не выявлено зависимости клинической картины от вида и локализации мутации в генах ЕМ О и ЬМЫА.

3. Частоты основных неврологических и кардиологических признаков у больных с мутациями генов ЕМй и ЬМЫА достоверно не различаются, что свидетельствует о невозможности их разграничения только на клиническом уровне. Обе генетические формы характеризуются значительным фенотипическим разнообразием, в том числе, внутрисемейным.

4. Наличие генокопий МД ЭД среди других форм МД частично объясняет наличие большого количества молекулярно не верифицированных случаев МД ЭД.

5. Разработанный алгоритм молекулярно-генетического обследования больных способствует рациональной своевременной ДНК-диагностике у больных МД ЭД и МГК в семьях: доклинической диагностике у лиц группы риска и пренатальной/предимплантационной ДНК-диагностике.

Степень достоверности результатов

Основные положения диссертационной работы основаны на материалах первичной документации и полностью им соответствуют. Результаты, полученные автором вследствие анализа клинико-молекулярно-генетических данных исследованной выборки, свидетельствуют о решении поставленных задач. Высокая степень достоверности и обоснованности выводов, основных научных положений диссертации определяются достаточно большим объемом материала (104 пробанда). Для сравнительного анализа привлечено достаточное количество данных литературы (более 200 источников). Выводы объективно и полноценно отражают результаты проведенных исследований.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: V Международной школе молодых учёных по молекулярной генетике «Непостоянство генома», Звенигород, 2012; II Национальном конгрессе «Кардионеврология», Москва, 2012; конференции European Human Genetics Conference, Париж, 2013; Российской научно-практической конференции с международным участием «Дифференциальный диагноз в клинике нервно-мышечных болезней», Москва, 2014; X Научной конференции «Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины», Томск, 2014; Всероссийской научно-практической конференции «Ежегодные Давиденковские чтения», Санкт-Петербург, 2014; VI Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и системная биология», Звенигород, 2014; конкурсе молодых ученых МГНЦ РАМН, Москва, 2014; Межрегиональной научно-практической конференции «Современные молекулярно-биологические и генетические технологии в медицинской практике», Новосибирск, 2015; VII съезде Российского общества медицинских генетиков, Санкт-Петербург, 2015.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В соответствии с формулой специальности «03.02.07 — Генетика (медицинские науки)», охватывающей проблемы изменчивости и наследственности, закономерности процессов хранения, передачи и реализации генетической информации на молекулярном, клеточном, организменном и популяционном уровнях в области «Генетика человека. Медицинская генетика. Наследственные болезни».

В соответствии с формулой специальности 14.01.11 - «Нервные болезни (медицинские науки)», охватывающей проблемы изучения этиологии и патогенеза, разработки и применения методов диагностики, лечения и профилактики заболеваний нервной системы.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автор непосредственно участвовал в разработке идеи, организации и проведении всех этапов исследования: при формулировании цели и задач, выборе методов исследования, обработке статистического материала, анализе и интерпретации полученных данных, а также в подготовке материалов к

публикациям по диссертационной теме и их написание. Соискателем изучена и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Основная часть экспериментальной работы - составление выборки 104 больных с предварительным диагнозом МД ЭД, выделение и анализ ДНК из образцов крови пациентов, анализ клинико-генеалогических данных, молекулярно-генетическое тестирование 104 больных и их родственников на наличие мутаций в исследуемых генах - проведена автором самостоятельно. Автором лично проведена статистическая обработка результатов исследования, разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики, сформулированы выводы и практические рекомендации. Результаты работы лично представлены на 10 отечественных и международных конференциях.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 15 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста. Диссертация включает: введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, главы результатов собственных исследований и обсуждения, заключение, выводы, практические рекомендации, список использованной литературы. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 14 таблицами. Библиография включает 242 литературных источника, из них 21 отечественный и 221 зарубежный.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал исследования

Поиск мутаций проведен у 104 неродственных больных 4-45 лет (76 мужчин, 28 женщин) - жителей РФ и стран СНГ, в течение ряда лет обращавшихся в лабораторию ДНК-диагностики ФГБНУ «МГНЦ» с предварительным клиническим диагнозом МД ЭД, а также у 10 больных и 14 здоровых родственников. В 2 семьях с МД ЭД1 проведена пренатальная ДНК-диагностика. Большинство больных обследованы клинически лично, при заочной ДНК-диагностике (по присланным образцам крови) клиническая картина анализировалась по медицинским документам.

Клиническая диагностика МД ЭД основывалась на следующих критериях:

• Поражение тазово-перонеальных и плече-лопаточных мышц

• Ранние (первичные) контрактуры голеностопных, локтевых суставов, тугоподвижность позвоночника

• Аритмия или КМП с аритмией

• Начало в детском/юношеском возрасте (кроме врожденных форм)

• Повышенная активность КФК

• Первично мышечный характер поражения при ЭМГ

Наличие всех симптомов не являлось обязательным, достаточным для предварительного диагноза считалось сочетание любых двух из трех первых признаков. В большинстве случаев клинический диагноз МД ЭД устанавливался клиницистами ФГБНУ «МГНЦ», Воронежской МГК, НИКИ педиатрии и других специализированных медицинских учреждений.

Из 104 обследованных у 27 болезнь носила семейный характер (8 семей с ХР сегрегацией, 19 - с АД), 57 человек оказались единственными больными в семьях, остальные 20 случаев с отсутствующими генеалогическим данными условно рассматривались как изолированные.

У больных с неполными клинико-генеалогическими данными и установленным в ходе работы молекулярным диагнозом недостающие сведения получены дополнительно.

Проведен поиск мутаций в трех генах, связанных с МД ЭД: EMD, LMNA, FHL1. Выбор генов и последовательность исследований определялись полом больных и генеалогическими данными: у женщин анализировался ген LMNA; у мужчин в семейных случаях с ХР наследованием - сначала EMD, затем FHL1, с АД наследованием — LMNA, в несемейных случаях - последовательно гены EMD, LMNA, FHL1.

Исследование трех других генов МД ЭД не проводилось: большие размеры генов SYNEI и SYNE2 (147 и 115 экзонов, соответственно) весьма затрудняют их анализ использованным методом прямого автоматического секвенирования; вклад гена ТМЕМ43, судя по единственной публикации, крайне мал.

У больных с МД ЭД не имеющих мутаций EMD, LMNA, FHL1, проведен поиск частых мутаций генов CAPN3, FKRP, SGCA, ANOS и DYSF, ответственных за АР КП МД типов 2А, 21, 2D, 2L и 2В, соответственно (в случае, если родословные не противоречили АР наследованию), и поиск частых делений гена DMD, ответственного за МД Дюшенна/Беккера, у больных с родословными, не противоречащими ХР наследованию.

Выборка 104 больных явилась первичным материалом работы. Основной анализируемый материал составила подгруппа пробандов/семей с молекулярно верифицированным в процессе работы диагнозом (см. «Результаты и обсуждение»).

Контрольную выборку составили 100 образцов (200 хромосом), полученных от необследованных неродственных жителей различных регионов РФ.

Методы исследования

Забор венозной крови проведен с информированного согласия всех 104 пробандов и 10 больных и 14 здоровых их родственников методом венопункции в одноразовые пластиковые пробирки с консервантом. В качестве консерванта использовали 0,5 М раствор ЭДТА в соотношении консервант: кровь-1:10.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью готового набора реактивов для выделения DLAtom™ DNA Prep 100 по протоколу производителя (ООО «Изоген», Россия).

Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия)

с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров. Дизайн праймеров выполнен в лаборатории ДНК-диагностики ФГБНУ «МГНЦ», синтез -в ЗАО «Евроген» (Москва).

Электрофорез: для оценки результата амплификации использовали 7% гель с соотношением акриламида (АА) и бисакриламида (БА) 29:1. Для оценки результатов MLPA, ПДРФ и ПДАФ использовали 10% гель с соотношением АА и БА 19:1. После разделения фрагментов гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,1 мкг/мл в IxTBE) в течение 20 минут, промывали водой. Результаты исследования регистрировались на гель-документирующей системе GelDoc® 2000 в УФ-излучении.

MLPA-реакцию проводили на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) в два этапа. При помощи метода MLPA исследовались частые мутации С.8260А и С.2290Т в гене FKRP, также метод использовался для проведения популяционного анализа контрольной выборки при выявлении не описанных ранее изменений нуклеотидной последовательности.

Метод ПДАФ использовался для анализа мутаций c.550delA и c.598_612dell5 в гене CAPN3, мутаций c.855+ldelG, c.3191_3196dupCGGAGG, c.4872_4876delGCCCGinsCCCC, c.5979dupA, c.5594delG в гене DYS F и частых делеций гена DMD.

Мутации c.l91dupA и C.22720T гена AN05 анализировались методом ПДАФ- и ПДРФ-анализа, соответственно. В одной пробирке проводилась амплификация соответствующих фрагментов гена AN05, содержащих исследуемые мутации. Для мутации С.22720Т подобрана рестриктаза НраН, сайт рестрикции CACGG для которой исчезал в случае наличия данной мутации.

Для уточнения клинического значения выявленных в ходе работы неописанных изменений нуклеотидной последовательности использовались интернет-ресурсы: Mutation Taster, SIFT+Provean и PolyPhen-2, предназначенные для предсказания степени патогенности различных замен.

Определение нуклеотидной последовательности проводили методом прямого секвенирования согласно протоколу фирмы-производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Полученные данные анализировались при помощи программы Chromas 2.4.1.

Для статистического анализа распределения частот признаков, оцениваемых в двух выборках (МД ЭД1 и МД ЭД2), использован коэффициент корреляции Пирсона, характеризующий степень линейной зависимости между переменными. Для сравнения значений КФК в группах пациентов с диагнозом МД ЭД1 и МД ЭД2 рассчитывались средние значения КФК в каждой группе и 95% доверительный интервал.

Результаты и обсуждение Молекулярно-генетический анализ генов EMD, LMNA, FHL1

В сформированной группе 104 неродственных больных с фенотипом МД ЭД проведен анализ генов EMD, LMNA и FHL1, ответственных за три основные формы МД ЭД: 1, 2 и 6, соответственно. В результате исследования молекулярно-генетический диагноз верифицирован у 40 больных (38,5%); вклад трех форм

составил: МД ЭД1 - 16,3%, МД ЭД2 - 21,2% и МД ЭД6 - 1% (рис. 1). В 40 молекулярно подтвержденных случаях МД ЭД 1, 2 и 6 распределились следующим образом: 42,5%, 55,0% и 2,5%. Таким образом, МД ЭД1 и МД ЭД2 обусловливают наибольшее количество случаев МД ЭД с известными генами, что согласуется с литературными данными.

В подгруппе 27 семейных наблюдений доля верифицированных случаев оказалась выше: 63% (17 семей), в том числе 75% при ХР наследовании (6 из 8 семей) и 58% при АД наследовании (11 из 19 семей); соответственно, в 77 изолированных случаях молекулярный диагноз установлен лишь у 30% (23 семьи).

104 пробанда

76 мужчин

EMD (ХР) LMNA (АД) FHL1 (ХР)

17 11 1

больных с больных с больной с

мутациями мутациями мутацией

EMD LMNA FHL1

28 женщин

LMNA (АД)

11

больных с мутациями

LMNA

38,5%

47

молекулярно не верифицированных случаев

17

молекулярно не верифицированных случаев

2 6 39

ХР сегрегация АД сегрегация изолированные

15

изолированные

АД сегрегация

Рисунок 1. Анализов генов EMD, LMNA и FHL1 у 104 неродственных больных с фенотипом МД ЭД

Выявленные мутации генов EMD, LMNA и FHL1 представлены в табл. 1.

Поиск мутаций в гене EMD проведен у 64 больных мужского пола, из них 56 являлись единственными пораженными в семьях, у 8 в семьях прослеживалось ХР наследование. У 17 пробандов найдено 16 различных мутаций, из них 10 обнаружены впервые, 6 описаны ранее. Диагноз МД ЭД1 подтвержден в 12 изолированных случаях и 5 семейных. Структура типов мутаций оказалась следующей: 6 нонсенс-мутаций (37,5%), 4 мутации сайта сплайсинга (25%), из них 3 делеции (18,8%) и одна точковая замена (6,2%), 3 миссенс-мутации (18,8%), 2 инсерции (12,5%) и одна комбинированная перестройка: инсерция/делеция (6,2%). Таким образом, 87,5% выявленных мутаций явились «нуль»-мутациями, обусловливающими полную потерю белка эмерина, что согласуется с данными литературы (Bonne G. et al., 2013).

Таблица 1. Мутации генов EMD, LMNA, FHL1 в 40 семьях

Фенотип 1 Мутация Экзон/ интрон Ссылка

g I Изменение на s уровне и Днк Изменение на уровне белка

МД ЭД1, EMD (группа I) [-1 с.1 A>G о.О 1 (Bione S. et al., 1994)

1-2 |c.9insl2bp+del2bp Сдвиг рамки считывания 1 Выявлена впервые

[-3 |c.8ÓOG р.§ег29* 1 Выявлена впервые

[-4 |c.l02C>G р.Туг34* 2 'Yates J.R. et al., 1999)

1-5 |с.166 167insCCTC Сдвиг рамки считывания 2 Выявлена впервые

1-6 |C.187+1G>A Мутация сайта сплайсинга 21 (Yates J.R. et al., 1999)

1-7 |c.215A>T р.А5р72Уа1 3 Выявлена впервые

1-8 |c.255C>T р.Туг85* 3 Выявлена впервые

1-9 |c.256C>T р.01п86* 3 (Brown С.A. et al., 2011)

1-10 |c.256C>T р.С1п86* 3 (Brown С.A. et al., 2011)

1-11 c.266-34 c.266-|l7dell7bp Мутация сайта сплайсинга 3i Выявлена впервые

1-12 lc.266-1 272del8bp Мутация сайта сплайсинга 4 Выявлена впервые

1-13 |c.428C>T р^егИЗРИе 5 rs 13998316Û

1-14 |c.449+ldelG Мутация сайта сплайсинга 5i Выявлена впервые

1-15 |c.6ü9 610ins8bp Сдвиг рамки считывания 6 Выявлена впервые

1-16 C.6550T р.С1п219* 6 (Wehnert M., Talkop А., 1999)

1-17 c.664C>T рЛ31п222* 6 Выявлена впервые

МД ЭД2, LMNA (группа II) II-1 |c.94A>G р.Ьу83201и 1 (Monges M.S. et al., 2011)

II-2 |c.l05delG Сдвиг рамки считывания 1 Выявлена впервые

II-3 c.l34A>G р.Туг45Суз 1 (Bonne G. et aL 2000)

II-4 |c.l39G>C р.А5р47Ш5 1 Выявлена впервые

II-5 |C.155T>C р.Ьеи52Рго 1 Выявлена впервые

II-6 |c.694G>A р.С1у232Агк 4 Выявлена впервые

II-7 |c.745C>T р.Агк249С1п 4 (Quiiano-Roy S. et al., 2008)

II-8 |c.745C>T р.Агй249С1п 4 (Qui ano-Roy S. et al., 2008)

II-9 |c.745C>T р.Аг(?249С1п 4 (Quijano-Roy S. et al., 2008)

11-10 c.781 783delAAÜ+i |nsl5bp р.261 delLys+ms 15Ьр 4 Выявлена впервые

11-11 |c.781 783delAAG р.26^е1ЬуБ 4 (Felice K.J. et al., 2000)

II-12 'c.781 783delAAG р.26^е1Ьуз 4 (Felice K.J. et al., 2000)

11-13 |c.8ÜÜA>C р.Туг2678ег 4 Выявлена впервые

11-14 |c.8lOG>A 1УЙ4 ds й-А-1 4 (Scharner J. et al., 2011)

II-15 |c.l048G>C р.А1а350Рго 6 Выявлена впервые

11-16 |c,1072C>A р.С1у358Ьу5 6 (Bonne G. et a ., 2000)

II-17" |c.l 130G>A р.Агк377Н1з 6 (Muchir A. et al., 2000)

11-18 |c.l357C>T p.Aгg453Trp 7 (Bonne G. et al., 1999)

11-19 |с.1357С>Т р.Агй453Тгр 7 (Bonne G. et al., 1999)

II-20 |c.l357C>T р.Агк453Тгр 7 (Bonne G. et al., 1999)

11-21 C.15830A р.ТЬг528Ьуз 9 (Raffaele Di Barletta M. et al., 2000)

11-22 c.l583C>G р.ТЬг528Аг£ 9 (Vytopil M. et al., 2003)

МД ЭД6, F HU 1 c.332_688del р.01у111_ТЬг229аеНпз01у 9-10 (Gueneau L. et al., 2009)

Примечание: #Фенотип КП МД1В

Найденные мутации равномерно распределены по всему гену, «горячих» экзонов не выявлено. Дважды встретилась только ранее описанная мутация 2560Т, приводящая к появлению преждевременного стоп-кодона в экзоне 3 гена EMD.

Примечательно, что при секвенировании гена EMD ни у одного из 64 больных не обнаружены полиморфизмы. По всей вероятности, нуклеотидная последовательность гена EMD весьма консервативна, и подавляющее большинство изменений в ней патогенны.

Таким образом, в гене EMD не найдено частых мутаций и «горячих экзонов», что затрудняет ДНК-диагностику, так как требует проведения прямого автоматического секвенирования всей кодирующей последовательности и областей экзон-интронных соединений гена. Однако в связи с небольшим размером гена EMD (6 экзонов) и короткими интронными участками, позволяющими анализировать 1 и 2, 3 и 4, 5 и 6 экзоны совместно (три фрагмента), метод прямого секвенирования является оптимальным для исследования гена EMD, тем более, что он позволяет охватить практически весь спектр мутаций (в связи с отсутствием крупных делеций/дупликаций в гене).

Поиск мутаций в гене LMNA проведен у 84 пробандов (65 изолированных случаев, 19 - с АД сегрегацией заболевания). В 22 случаях (11 изолированных, 11 семейных) найдено 17 различных мутаций, из них 7 обнаружены впервые, 10 описаны ранее. Распределение выявленных мутаций LMNA по типам соотносится с литературными данными о преобладании миссенс-мутаций: в исследуемой выборке на их долю пришлось 76,4%; 2 мутации (11,8%) обусловливали появление преждевременного стоп'-кодона, одна оказалась мутацией сайта сплайсинга (5,9%), одна мутация представляла собой делецию аминокислоты (5,9%) Lys в положении 261, способствующую образованию поврежденного белка. Также в гене LMNA выявлено 11 различных полиморфизмов.

Помимо МД ЭД2, ген LMNA связан с широким кругом других болезней -так называемых ламинопатий, среди которых есть частично перекрывающиеся с МД ЭД2: изолированная АД ДКМП (тип 1С) и АД КП МД, тип 1В.

Большинство описанных при МД ЭД2 мутаций распределены между экзонами 1-9 гена LMNA, являющимися общими для ламинов А и С (83 мутации; 95,4%), лишь две мутации найдены в экзоне 10, одна в экзоне 11 и ни одной в экзоне 12 (по данным базы HGMD). Такое же распределение мутаций по экзонам наблюдается и при других мышечных фенотипах: КП МД 1В и ДКМП.

Все 17 найденных мутаций также локализованы между экзонами 1-9: это экзоны 1, 4, 6, 7, 9, которые распределились по количеству выявленных в них мутаций в следующем порядке (по убыванию): экзон 6 - 17,6%, экзон 9 - 11,8%, экзон 7 — 5,9%. Примечательно, что из 83 мутаций в кодирующей области гена LMNA, описанных при фенотипе МД ЭД, большинство приходятся на экзоны 1, 4, 6, 7, 9, что нетрудно заметить, расположив экзоны в порядке убывания количества описанных мутаций: 1 - 25,3%, 4 - 16,9%, 7 - 13,3%, 6 - 9,6%, 9 - 8,4%, 3 - 7,2%, 2 - 6%, 5 - 6%, 8 - 3,6%, 10 - 2,4%, 11 - 1,2% (рис. 2).

Распределение мутаций гена LMNA по экзонам

I ■ _ я il f Ïii tei™

17 мутаций LMNA {настоящее 83 мутации LMNA (база мутаций HGMD)

исследование)

« экзон 1 к экзон 2 & экзон 3 » экзон 4 ж экзон 5 ш экзон б

■ ЭКЗОН 7 «экзон 8 «экзон 9 «экзон 10 « экзон 11 и экзон 12

Рисунок 2. Распределение мутаций гена LMNA по экзонам: собственные и литературные данные.

Таким образом, информативность исследования экзонов 1, 4, 6, 7, 9 гена LMNA в нашем исследовании составила 100%. Учитывая эти и литературные данные, поиск мутаций LMNA при МД ЭД и других «мышечных фенотипах» целесообразно именно с этих экзонов для экономии времени и финансовых затрат. Кроме того, в перечисленных экзонах также располагались три повторяющиеся мутации, выявленные в ходе работы: с.745С>Т (экзон 4) и с.1357С>Т (экзон 7), встретившиеся трижды (обусловили 13,6% патогенных аллелей каждая) и c.781_783delAAG (экзон 4), встретившаяся дважды (на долю которой пришлось 9% патогенных аллелей). Известно, что мутация с.1357С>Т выявляется у 16% больных АД МД ЭД (Helbling-Leclerc A. et al., 2002) и, по данным базы LOVD, упомянута в литературе 21 раз (наибольшее количество упоминаний). Мутация С.7450Т встречалась в литературе 11 раз, c.781_783delAAG - 4 раза. К числу часто выявляемых мутаций (которые обнаружены и в данной работе, но однократно) также относятся с.1072С>А (экзон 6) - 18 упоминаний, c.ll30G>A (экзон 6)-9 упоминаний, с.1583С>А и c.l583C>G (экзон 9) - по 7 упоминаний.

Доля несемейных случаев МД ЭД2 (предположительно мутаций de novo) в исследованной выборке составила 50%, что несколько ниже, чем по данным литературы: около двух третей случаев (Bonne G. et al., 2000). Неполная пенетрантность мутаций LMNA описана, но наблюдается нечасто (Ura S. et al., 2007). Мы могли оценить пенетрантность мутаций анализом ДНК лишь в немногих случаях, где имелся необходимый семейный биологический материал: ни у одного из обследованных здоровых родственников мутации не обнаружены. Наряду с отсутствием «пропусков поколений» в больших родословных, это позволяет предполагать полную пенетрантность мутаций LMNA.

Поиск мутаций в гене FHL1 проведен у 47 мужчин-пробандов в 44 несемейных и 3 семейных случаях. Мутация найдена в одном из семейных случаев.

Обнаруженная мутация c.332_688del (p.Glyl 1 l_Thr229delinsGly) является крупной делецией, затрагивающей экзоны 9-10 гена. Это одна из всего лишь семи мутаций FHL1, описанных при фенотипе МД ЭД. Интересно отметить, что 6 из 7

ю

5 о

описанных в литературе случаев МД ЭД6 6 являются семейными, как и наше наблюдение. Возможно, это свидетельствует о низкой частоте возникновения мутаций de novo в гене FHL1, но небольшое число наблюдений не позволяет это утверждать. Выявленный случай МД ЭД6 является не только первым и пока единственным в России, но и единственным независимым подтверждением результатов L. Gueneau и соавт., выделивших МД ЭД6 как отдельный генетический вариант и описавших в числе прочих мутацию c.332_688del. Повторное обнаружение этой мутации у нашего больного с тем же фенотипом подтверждает обоснованность выделения МД ЭД6 как самостоятельной клинико-генетической формы.

В гене FHL1, как и в гене EMD, не обнаружено полиморфизмов. Вероятно, большинство изменений нуклеотидной последовательности гена FHL1 весьма критичны для белкового продукта.

Клинические характеристики мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса 1 и 2

Возраст пробандов с МД ЭД1 и МД ЭД2 на момент обследования колебался от 4 до 45 лет, давность болезни - от 3 до 30 лет, но преобладали больные детского и молодого возраста. Из 22 больных с МД ЭД2 11 мужчин и 11 женщин. Клиническая картина анализировалась по 17 признакам. При исследовании учтены возраст начала заболевания, характерная для МД ЭД «триада» клинических симптомов: контрактуры локтевых и голеностопных суставов, тугоподвижность позвоночника; типичная локализация миопатии - плечевая, тазовая, перонеальная; аритмия/КМП с аритмией. Состояние ходьбы характеризовало степень поражения мышц ног. Имплантация ЭКС учтена как условный критерий характера сердечной патологии. Кроме того, анализировались менее типичные признаки: контрактуры других суставов (плечевых, лучезапястных, тазобедренных, коленных), слабость мышц лица и кистей, псевдогипертрофия икроножных мышц.

Клинические характеристики МД ЭД1 и МД ЭД2 у пробандов суммированы в табл. 2.

Как следует из таблицы, МД ЭД1 и МД ЭД 2 клинически сходны, однако выявлены три признака со статически значимыми различиями. Хотя в обеих группах преобладало начало до 5 лет, МД ЭД1 в среднем дебютировала позже за счет подгруппы с началом в 11-20 лет.

Различие в частоте такого редкого для МД ЭД признака, как слабость мышц лица, может быть связано с небольшим объемом выборки.

Некоторые кардиологические отличия между МД ЭД1 и МД ЭД2 описаны. Показано, что при МД ЭД2 выше риск желудочковой тахиаритмии и ДКМП с расширением и дисфункцией левого желудочка (Bonne G. et al., 2013), a при МД ЭД1 чаще наблюдается брадиаритмия (Грознова О.С. и соавт., 2014). Мы не могли провести такое сравнение, требующее количественных данных однотипно проведенных инструментальных исследований, однако достоверное различие между группами МД ЭД1 и МД ЭД2 по частоте имплантации ЭКС, основным показанием для которой является брадиаритмия, косвенно подтверждает данные литературы.

Таблица 2. Основные клинические признаки МД ЭД1 и МД ЭД2 у пробандов

Частота (f, %) Значимость (р)

Признак Группа I Группа II Группа I/

(EMD), п=14 СLMNA), п=22 Группа II

Начало до 5 лет 42,8 45,5 0,875

Начало в 6-10 лет 14,3 36,4 0,15

Начало в 11-20 лет 42,8 13,6 0,048*

Начало позже 20 лет 0 4,5 0,423

Контрактура локтевых суставов 78,6 68,2 0,498

Контрактура голеностопных суставов 92,8 77,3 0,22

Контрактура других суставов 7,1 9,1 0,83

Ригидный позвоночник 64,3 59,1 0,759

Тазовая миопатия 85,7 86,4 0,954

Плечевая миопатия 78,6 90,9 0,296

Перонеальная миопатия 78,6 81,8 0,808

Нарушение походки 71,4 68,2 0,83

Слабость мышц лица 35,7 4,5 0,014"

Слабость мышц кистей 0 18,2 0,091

Псевдогипертрофии икроножных мышц 14,3 9,1 0,621

Аритмия или КМП с аритмией 92,8 86,4 0,54

Имплантация ЭКС 42,8 13,6 0,048"

Примечание: Статистически достоверно различающиеся признаки.

Несмотря на выявленные различия между группами больных, дифференцировать МД ЭД1 и МД ЭД2 по клинической картине невозможно, основные симптомы совпадают.

В целом для обеих форм типичны начало на 1-м (72%), реже - на 2-м десятилетиях (25%), миопатия лопаточно-плечевой (86%), тазовой (86%) и перонеальной локализации (80,5%), первичные контрактуры голеностопных (83%) и локтевых суставов (72%), «ригидность» (тугоподвижность, скованность) шейного отдела или всего позвоночника (61%), относительно нетяжелое течение миопатии — несмотря на частые изменения походки - длительная сохранность самостоятельной ходьбы (72,2%), аритмия/аритмогенная КМП разной тяжести (88,9%).

Характерное поражение сердца имелось у подавляющего большинства пробандов (в частности, у всех старше 10 лет) Большинство больных систематически наблюдались кардиологами и получали лечение, однако даже на фоне лечения трое из пробандов, о ком получены катамнестические данные, умерли от осложнений КМП: с МД ЭД2 - в 21 год и 29 лет, с МД ЭД1 - в 29 лет.

Вместе с тем, у нескольких больных патология сердца отмечалась субклинической и выявлена только при целенаправленном обследовании, в котором важнейшая роль принадлежит холтеровскому мониторированию сердечного ритма.

При ХР МД ЭД у женщин-гетерозиготных носительниц возможны клинические проявления носительства в виде нарушения сердечного ритма. В

нашем исследовании у двух из кардиологически обследованных матерей пробандов с МД ЭД1 найдена атриовентрикулярная блокада I-II степени, у одной - брадикардия, хотя эти нетяжелые проявления могли быть и независимыми.

Связи характера мутаций с фенотипом при обеих генетических формах не отмечено, что согласуется с данными литературы (Rankin J. et al., 2008; Bertrand A.T. et al., 2011).

Клинические характеристики мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса 6

МД ЭД6 диагностирована в украинской семье с 5 больными мужчинами в 4 поколениях (рис. 3).

ci,44t!tUI

Рисунок 3. Родословная семьи с МД ЭД6 (мутация c.332_688del гена ЕНЫ).

Клиническая картина у обследованного 35-летнего пробанда включала проксимальный миопатический синдром («крыловидные» лопатки, подъем рук до горизонтального уровня, миопатическая походка, арефлексия в ногах), тугоподвижность шейного отдела позвоночника (ограничение наклона головы вперед являлось первым симптомом в 14 лет), умеренную контрактуру голеностопных суставов, высокую активность КФК (1550 Ед/л). Со слов, аналогичная картина наблюдалась у умершего дяди, сходные симптомы имеет троюродный брат 40 лет, 21-летнего троюродного племянника пока беспокоит только тугоподвижность шеи. Пробанд наблюдается кардиологом, значимой патологии сердца не находят. Достоверных сведений о состоянии сердца больных родственников и причинах смерти двух умерших нет, но возраст их смерти (35 и 27 лет) может косвенно указывать на жизнеугрожающую аритмию. После исключения МД ЭД1 провели ДНК-диагностику МД ЭД6: у пробанда и двух больных родственников в гене ШЫ найдена описанная ранее мутация c.332_688del (р.С1у11 l_Thr229delinsGly) в гемизиготном состоянии; при обследовании сестры исключено гетерозиготное носительство мутации. По данным литературы, возраст начала МД ЭД6 варьирует, у большинства больных имеется КМП с аритмией (гипертрофическая, а не дилатационная, как при типах 1

и 2); в ряде случаев вовлечены аксиальные мышцы (в нашем наблюдении этого признака нет).

Сравнение показателей КФК у больных мышечной дистрофией Эмери-Дрейфуса 1 и 2 Проведено сравнение исследуемых групп МД ЭД1 (I) и МД ЭД2 (II) по активности КФК (при наличии нескольких показателей учитывался наибольший). Средние значения КФК в сравниваемых группах I и II и 95% доверительный интервал составили 1023,5+477,82 и 791,06±228,13, соответственно. Полученные данные указывают на то, что исследуемые группы не обнаруживают статистически достоверных различий по значениям КФК, так как область доверительного интервала группы II полностью попадает в область доверительного интервала группы I. Графическая иллюстрация представлена на рис. 4, где изображены выборочные средние значения КФК в каждой из групп и 95% доверительные интервалы, характеризующие разброс выборочных значений.

Средние значения КФК в сравниваемых группах

1600

1400

X 1200

В

1000

| 800

ш

5 боо

т 400 200 0

0 12 3

Группы

Рисунок 4. Средние значения КФК при МД ЭД1 (группа I) и МД ЭД2 (группа II).

Значения КФК у подавляющего большинства больных колебались от нормы (не выше 200 Ед/л) до 2-10 кратного увеличения (наибольший уровень КФК составил 2350 Ед/л), соответствует литературным данным.

Известно, что для МД ЭД характерно умеренное повышение активности КФК, однако этот признак не является надежным критерием дифференциальной диагностики различных МД, так как уровень КФК зависит от многих факторов и варьирует на разных стадиях болезни.

Клиническая вариабельность мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса

Несмотря на характерную картину МД ЭД, индивидуальная клиническая вариабельность при всех генетических формах весьма широка. Это относится, в частности, к скелетной миопатии, которая в типичном варианте выражена умеренно или легко, но может быть очень тяжелой, как у двух наших пробандов с МД ЭД2. Нередки внутрисемейные различия, что подтверждает ряд наших

♦ 1023,5

> 791,0625

® Группа I # Группа II

наблюдений. Примеры разного соотношения неврологической, кардиологической и ортопедической составляющих МД ЭД приведены на рис. 5.

1Ж1 1МХ4

С.1390С (р.139Ачр47НЬ) с.105<1еЮ

Тяжелая КМП с аритмией Отсутствие контрактур и мышечной слабости

28

Ранние контрактуры ^^^ Миопатия с 7-8 лет 44

Нетяжелая аритмия

1

Mut

EMD EMD

c.609_610msCGTGCCAT C.65SOT (p.Gla219*)

G-

----m

Преобладает скелетная í-1-j !

миопатия без признаков i——i *

Поражения сердца |_| ЩШ • Умеренные контрактуры . Контрактуры

/ ' Относительно нетяжелая . Миопатия

Mut миопатия . Субклиническая аритмия • Тяжелая КМП

Рисунок 5. Примеры внутрисемейного разнообразия МД ЭД1 и МД ЭД2.

В ряде родословных имелись случаи внезапной «сердечной» смерти в молодом возрасте. Внутрисемейное разнообразие МД ЭД надо учитывать при сборе генеалогических данных в процессе МГК.

Аутосомно-рецессивные конечностнопоясные мышечные дистрофии

как генокопии мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса Значительное число случаев с близким к МД ЭД фенотипом и отсутствием мутаций в трех основных генах явилось причиной поиска генокопий МД ЭД среди других МД. Наличие генокопий представлялось вероятным среди КП МД, которые могут быть сходны с МД ЭД по ряду клинических признаков (возможность раннего начала и первичных контрактур, сходное распределение скелетной миопатии). Для ДНК-тестирования выбраны 5 наиболее распространенных типов АР КП МД. 2А, 21, 2D, 2L, 2В. Поиск частых мутаций в соответствующих генах CAPN3, FKRP, SGCA, AN05, DYSF проведен у 54 больных (39 мужчин, 15 женщин) из исходной выборки, чьи родословные не противоречили АР наследованию. Мутации найдены у 5 больных мужчин: у 4 - в гене CAPN3 (у троих гомозиготность по делеции c.550delA, у одного компаунд-гетерозиготность c.550delA/c.2305C>T), у одного - в гене AN05 (мутация С.22720Т в гетерозиготном состоянии). Недостаточное количество биологического материала в последнем случае не позволило провести поиск

второй мутации во всей кодирующей области гена AN05, включающей 22 экзона, но с учетом характерной клинической картины диагностирована КП МД2Ь. Таким образом, в исходной группе больных с «МД ЭД» 3,8% случаев составила КП МД2А, 1% — КП МД2Ь. Цифры являются минимальными, так проведен поиск только частых мутаций указанных генов. С учетом этих 5 несемейных случаев доля верифицированных случаев в исходной выборке увеличилась до 45 человек (43,3%). Основные симптомы у 5 больных случаев суммированы в табл. 3.

Таблица 3. АР КП МД у больных с предварительным диагнозом МД ЭД

КП МД2А (CAPN3) КП МД2Ь (ANOS)

Наблюдение С-1 С-2 С-3 С-4 А-1

Возраст начала 7лет 9 лет. 6 лет. 13 лет 6 лет

Миопатия ++ + ++ ++ +

Контрактуры: Локтевые + + +/- + +

Голеностопные + + + + +

Ригидный позвоночник - - - - -

Другие суставы - - - + +

КФК (Ед/л) >6 000 7000 545 2400 567

Поражение сердца КМП с Легкая КМП КМП без

аритмиеи без аритмии N аритмии N

Возраст клинического 13 12 л. 17 13 л. 39 л.

диагноза МД ЭД

Возраст молекулярного диагноза КП МД 14 20 л. 36 л. 23 г. 52 г.

Как видно из таблицы, во всех случаях имелась контрактура не только голеностопных суставов (что не является редкостью при КП МД), но и локтевых. У 3 больных с КП МД2А болезнь началась на 1-м десятилетии, что характерно для МД ЭД, тогда как для КП МД2А более типично начало в подростковом возрасте. Вместе с тем, лишь один больной (С-1) имел «классическую» триаду признаков МД ЭД, но и у него активность КФК оказалась атипично высокой; у остальных наряду с симптомами МД ЭД имелись существенные отличия, особенно отсутствие патологии сердца (С-3, А-1) или ее не аритмогенный характер (С-2, С-4). Ни в одном случае не выявлено ригидности позвоночника. В 3 случаях отмечена выраженная миопатия. Активность КФК оказалась типичной для МД ЭД у 2 больных (С-3, А-1), у троих - более высокой.

Наличие среди 59 случаев, оставшихся не верифицированными, двух семейных наблюдений с ХР наследованием послужило основанием для поиска мутаций в гене ОМй, ответственном за МД Дюшенна/Беккера, - несмотря на ее существенные клинические отличия от МД ЭД. У больных мужского пола, чьи родословные не противоречили ХР наследованию (34 изолированных и 2 семейных случая) проведен поиск частых делеций ОМ.О, которые не найдено. Очевидно, существуют ХР МД ЭД с еще неустановленными генами.

Несмотря на небольшое число выявленных случаев КП МД, расширенный подход к ДНК-диагностике МД ЭД, предполагающий при отсутствии мутаций в генах МД ЭД исследование генов других МД, представляется обоснованным и информативным. Такой подход успешно используется лабораторией ДНК-диагностики ФГБНУ «МГНЦ» при разных нервно-мышечных болезнях (Адян Т.А. и соавт., 2014; Рыжкова О.П. и соавт., 2013).

Полученные данные подтверждают необходимость подробного сбора клинико-генеалогического анамнеза у больных с признаками МД ЭД и проведение ДНК-диагностики, не ограниченное лишь генами, связанными с МД ЭД.

Алгоритм молекулярно-генетической диагностики больных с клиническими признаками мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса На основании результатов клинико-генеалогического и молекулярно-генетического анализа, проведенного у больных с фенотипом МД ЭД, разработан алгоритм ДНК-диагностики, определяющий последовательность поиска мутаций генов МД ЭД и ряда других МД (рис. 6). Учитывая отсутствие значимых клинических различий между различными генетическими формами МД ЭД (в частности, самыми распространенными типами 1 и 2), в основу алгоритма положены пол пробандов и семейный анамнез, относительные частоты (по данным литературы и собственного анализа) различных генетических вариантов МД ЭД, наличие «горячих экзонов» гена ЬМЫА.

Предложенный алгоритм позволяет повысить информативность ДНК-диагностики, оптимизировать затраты на дорогостоящие анализы и сократить продолжительность лабораторного этапа МГК.

пробанд

Семейный случай Изолированный случай

АД ХР М Ж

1ША (МД ЭД2; ЕМй (МД ЭД1.) ЕМО (МД ЭД1; ШЛИ (МД ЭД2)

РНИ (МД ЭД6; ШЛ/Д (МД ЭД2)

рни (мд эдв;

Рисунок 4. Алгоритм молекулярно-генетической диагностики МД ЭД.

ВЫВОДЫ

1. Установлен вклад мутаций генов ЕКЮ, ЬМЫА и РНЫ в структуру мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса в РФ. В выборке 104 неродственных больных мутации выявлены у 40 пробандов (38,5%): мутации гена ЕМй (мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса 1) явились причиной заболевания у 17 больных (16,3%); у 22 больных (21,2%) выявлены мутации гена ЬМШ (мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса 2); у одного больного выявлена мутация гена РНЫ (мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса 6) (1%).

2. Анализ спектра мутаций гена ЕМй показал отсутствие частых мутаций и «горячих» экзонов для данного гена. Более 80% мутаций приводят к полному отсутствию белкового продукта, что согласуется с данными литературы.

3. В гене ЬМЫА выявлено накопление мутаций в экзонах 1 и 4: у 6 больных мутации локализовались в экзоне 1 (27,3%), у 9 - в экзоне 4 (41%). Выявлены 3 повторяющиеся мутации: с.745С>Т и с.1357С>Т встретились на трех хромосомах каждая (обусловили по 13,6% патогенных аллелей), мутация с.781_783с1е1ААС встретилась на двух хромосомах (9% патогенных аллелей). Исследование гена ЬМИА целесообразно начинать с анализа экзонов 1,4, 6, 7,9.

4. Наряду с характерной клинической картиной мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса 1 и 2 (преимущественно раннее начало (72%), относительно нетяжелая миопатия (72,2%), ранние контрактуры (88,5%), жизнеугрожающая кардиомиопатия с аритмией (88,9%)) выявлена значительная фенотипическая вариабельность, в том числе внутрисемейная.

5. Сравнительный анализ мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса 1 (ЕМП) и мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса 2 (ЬМЫА) по 17 качественным признакам и активности креатинфосфокиназы показал отсутствие специфического симптомокомплекса, позволяющего проводить дифференциацию этих генетических вариантов только на клиническом уровне.

6. Случаи аутосомно-рецессивных конечностнопоясных мышечных дистрофий (четыре 2А типа (3,8%) и один 2Ь типа (1%)), диагностированные в подгруппе 64 больных с ненайденными мутациями генов мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, свидетельствуют о наличии генокопий, имитирующих мышечную дистрофию Эмери-Дрейфуса, что частично объясняет большое число молекулярно не верифицированных случаев с фенотипом мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса.

7. Предложенный алгоритм молекулярно-генетического обследования больных с фенотипом мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, определяющий последовательность поиска мутаций трех основных генов мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса (ЕКЮ, ЬМЫА, РНЫ) и ряда других мышечных дистрофий (в частности, аутосомно-рецессивных конечностнопоясных мышечных дистрофий), позволяет повысить информативность ДНК-диагностики и последующего медико-генетического консультирования, снизить затраты времени и средств.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Исследование гена ЕМВ оптимально проводить методом прямого автоматического секвенирования, позволяющим охватить практически весь

спектр мутаций в гене; в связи с короткими интронными участками экзоны 1-2, 3-4 и 5-6 целесообразно анализировать совместно, что позволит сократить временные и финансовые затраты.

2. Поиск мутаций в гене LMNA при подозрениии на МД ЭД и другие «мышечные» ламинопатии рекомендуется начинать с экзонов 1, 4, 6,7,9.

3. С учетом клинического разнообразия МД ЭД показания к ДНК-диагностике не должны исчерпываться классическим фенотипом.

4. При ДНК-диагностике МД ЭД целесообразно использовать предложенный алгоритм, включающий анализ генов некоторых других МД.

5. В клинической диагностике МД ЭД и при обследовании членов семей рекомендуется шире использовать холтеровское мониторирование сердечного ритма; больные с МД ЭД помимо наблюдения невролога нуждаются в высококвалифицированной кардиологической помощи.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Адян Т.А., Руденская Г.Е., Дадали ЕЛ., Грознова О.С., Влодавец Д.В., Федотов В.П., Рыжкова О.П., Поляков A.B. Мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса: молекулярно-генетические, фенотипические характеристики и дифференциальная диагностика // Медицинская генетика. - 2014. - №10. - С.18-28

2. Грознова О.С., Руденская Г.Е., Адян Т.А., Харламов Д.А. Поражение сердца при наследственных нервно-мышечных заболеваниях у детей // Российский вестник перинатологии и педиатрии. -2014. - Т. 59. -№ 2. - С. 3542.

3. Грознова О.С., Харламов Д.А., Артемьева С.Б., Руденская Г.Е., Адян Т.А., Рыжкова О.П. Сердечно-сосудистые нарушения у больных с Х-сцепленной мышечной дистрофией Эмери-Дрейфуса // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2014 - №1. - С.66-70

Публикации в других изданиях:

4. Т. Adyan, Е. Dadali, A. Polyakov. Limb-girdle muscular dystrophies with expressed defeats of a myocardium // Europ. J. Hum. Genet. - 2012. - V 20. - Suppl 1. - P. 409

5. Г.Е.Руденская, ЕЛ.Дадали, АЛ.Чухрова, Т.А.Адян, О.П. Рыжкова, А.В.Поляков. Прогрессирующие мышечные дистрофии с жизнеугрожающей аритмией // Сборник статей и тезисов Национального конгресса «Кардионеврология». - 2012. - С.80-84.

6. Адян Т.А., Дадали E.JL, Поляков A.B. Поясноконечностные мышечные дистрофии с выраженной патологией сердца // Материалы V Международной школы молодых учёных по молекулярной генетике «Непостоянство генома». — 2012. — С. 11.

7. Адян Т.А., Руденская Г.Е., Дадали E.JL, Рыжкова О.П., Грознова О.С., Влодавец Д.В., Поляков A.B. Мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса: клинико-

генетическое разнообразие и ДНК-диагностика // Материалы IV Балтийского Конгресса по детской неврологии. 2013.

8. T. Adyan, G. Rudenskaya, Е. Dadali, О. Ryzkova, О. Groznova, А. Polyakov. Clinical and genetic diversity of Emery-Dreifuss muscular dystrophy in Russia // Europ. J. Hum. Genet. - 2013. - V 21. - Suppl 2. - P. 207

9. O. Groznova, G. Rudenskaya, T. Adyan, E. Dadali, O. Ryzkova, A. Polyakov. Progressive muscular dystrophies vvith life-threatening arrhythmias // Europ. J. Hum. Genet. - 2013. - V 21. - Suppl 2. - P. 209

10. T.Adyan, G.Rudenskaya, E.Dadali, O.Ryzkova,O.Groznova, D. Vlodavets, V. Fedotov, A.Polyakov. Phenocopies as a possible cause of molecularly unconfirmed cases of Emery-Dreifuss muscular dystrophy // Europ. J. Hum. - 2014. - V 22.-Suppl l.-P. 444

11. Адян T.A., Руденская Г.Е., Дадали ЕЛ., Рыжков О.П., Грознова О.С., Влодавец Д.В., Поляков А.В. Клинико-молекулярно-генетический анализ Мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Дифференциальный диагноз в клинике нервно-мышечных болезней». - 2014.

12. Адян Т.А., Руденская Г.Е., Дадали ЕЛ., Грознова О.С., Влодавец Д.В., Федотов В.П., Рыжкова О.П., Поляков А.В. Мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса: фенотипические и молекулярно-генетические характеристики // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Давиденковские чтения». - 2014. - С.4-5

13. Адян Т.А., Руденская Г.Е., Дадали ЕЛ., Рыжков О.П., Грознова О.С., Влодавец Д.В., Поляков А.В. Клинико-молекулярно-генетический анализ мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса // Материалы X Научной конференции «Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины». - 2014. -С. 215-216

14. Адян Т.А., Руденская Г.Е., Дадали ЕЛ., Грознова О.С., Влодавец Д.В., Рыжкова О.П., Поляков А.В. Клинико-генетическое многообразие мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса // Материалы VI Международной школы молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и системная биология». - 2014. - С. 11

15. Адян Т.А., Руденская Г.Е., Дадали E.J1., Грознова О.С., Влодавец, О.П.Рыжкова Д.В., Поляков А.В. Мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса: клинико-генетическая гетерогенность и ДНК-диагностика // Медицинская генетика (Материалы VII Съезда Российского Общества Медицинских Генетиков). -2015.-№2.-С. 6

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - аутосомно-доминантное наследование АР - аутосомно-рецессивное наследование ДКМП - дилатационная кардиомиопатия ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота КМП - кардиомиопатия

КП МД - конечностнопоясная мышечная дистрофия КФК - креатинфосфокиназа КМП - кардиомиопатия

ФГБНУ «МГНЦ» - Федеральное Государственное Бюджетное Научное

Учреждение «Медико-Генетический Научный Центр»

МГК - медико-генетическое консультирование

МД -мышечная дистрофия

МД ЭД - мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса

МДД/Б - мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера

ПДАФ - полиморфизм длин амплификационных фрагментов

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ХР - Х-сцепленное рецессивное наследование

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭКС - электрокардиостимулятор

ЭМГ - электромиография

MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (Мультиплексная пробзависимая лигазная реакция)

Аббревиатуры генов и их белковых продуктов, а также сокращения распространенных единиц измерения даны в соответствии с общепринятыми номенклатурами.

Подписано в печать:

07.09.2015

Заказ № 10917 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru