Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ недистрофических миотоний в РФ

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ недистрофических миотоний в РФ"

На правах рукописи

ИВАНОВА ЕВГЕНИЯ АНДРЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕДИСТРОФИЧЕСКИХ

МИОТОНИЙ В РФ

03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

6 ПАЙ 2013

00505984»

Москва-2013

005059848

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

Писарев Владимир Митрофанович, доктор медицинских наук Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, лаборатория генетики стволовых клеток, ведущий научный сотрудник

Мальберг Сергей Александрович, доктор медицинских наук, профессор Центральная детская клиническая больница Федерального медико-биологического агентства России, отделение психоневрологии с центром реабилитации детей с двигательными нарушениями, заведующий

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «27» мая 2013 г. В Ц часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессс

[ченко Рена Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Недистрофические миотонии (НДМ) - группа заболеваний, ведущим симптомом которых является феномен миотонии, они относятся к группе мышечных каналопатий. Миотония составляет симптомокомплекс некоторых наследственных нервно-мышечных патологий (миотоническая дистрофия тип 1 и 2, пароксизмальная миоплегия, синдром Шварца - Джампела) или является ведущим симптомом при миотониях Томсена (МТ) и Беккера (МБ), парамиотонии Эйленбурга (ПЭ), гиперкалиемическом параличе с миотонией (ГиперКП) и калий-зависимой миотонии (КЗМ). Последняя группа заболеваний отличается от вышеприведенных и этипатогенезом, и отсутствием дистрофического паттерна в клинической картине. Отсюда и возникла тенденция разделить все миотонические синдромы на дистрофические (ДМ) и недистрофические (НДМ).

Недистрофические миотонии представляют собой гетерогенную клинически полиморфную группу заболеваний, причиной которых являются мутации в генах ионных каналов хлорного и натриевого - СЬСМ1 и БСША. Фенотипы больных различными формами НДМ перекрываются и варьируют как среди пациентов с определенным типом НДМ, так и внутри одной семьи. На этапе клинического осмотра трудно отличить МТ и МБ между собой. Реже, но, тем не менее, затруднена дифференциальная диагностика ПЭ, ГиперКП и КЗМ друг от друга. Тяжелее всего в спорадических случаях с фенотипом МТ предположить ген, мутации в котором вызывают проявления заболевания. Зачастую, верным шагом диагностики является поиск мутаций в гене СЬСЫ1, но в некоторых случаях этого недостаточно для подтверждения диагноза. Только после молекулярно-генетического анализа гена БСША можно выявить истинную причину заболевания.

Молекулярно-генетический анализ генов ионных каналов всегда представляет собой довольно трудоемкий и длительный процесс. Это обусловлено большим размером анализируемых генов и широким разнообразием мутаций, распределенных, как правило, по всей кодирующей последовательности данных генов. Так и в случае НДМ, причинами заболеваний являются мутации генов, кодирующих хлорные и натриевые ионные каналы скелетных мышц. Спектры мутаций этих генов представлены подавляющим числом миссенс — замен, наряду с относительно небольшим числом других типов мутаций. Это затрудняет ещё и трактовку результатов исследования: не всегда очевиден эффект миссенс - замены для конкретного больного, особенно в изолированных случаях, когда сегрегационный анализ невозможен. По этим причинам молекулярно-генетический анализ генов СЬСИ1 и БСИ4А для пациентов с различными НДМ следует проводить в больших группах пациентов, в которых хорошо представлены различные фенотипы и доступен материал родственников пробанда для проведения сегрегационного анализа. Не менее информативными остаются и описания больших семей с внутрисемейным клиническим полиморфизмом.

Актуальным является проведение подобных исследований для каждой страны, так как в различных регионах наблюдается накопление характерных частых мутаций гена CLCN1 и подтверждается выявление «горячих» экзонов гена SCN4A, что увеличивает эффективность поиска мутаций в каждом из генов.

В связи с тем, что долгое время врожденная миотония не признавалась, как отдельная нозологическая форма и описана сравнительно недавно (1976 год), молекулярно-генетические методы недоступны для внедрения в диагностический процесс, оценка частоты распространенности недистрофических миотоний на данный момент очень приблизительна. Частота миотонии Томсена в Европе ранее оценивалась как 1:23 ООО человек, а миотонии Беккера - 1:50 ООО (Becker P.E., 1977). С появлением и развитием молекулярно-генетических методов стало понятно, что частота миотонии Томсена гораздо более низкая, чем предполагалось ранее. В одних семьях, где ранее предполагался доминантный тип наследования, был установлен псевдодоминантный, и их стали относить к случаям миотонии Беккера; в других -были выявлены мутации в гене, кодирующем натриевые ионные каналы скелетных мышц - их стали причислять к другим формам НДМ. Следовательно, и частота миотонии Беккера должна быть значительно выше, чем её оценивали ранее, но точных данных по этому поводу нет. Самой частой врожденная миотония (ВМ), как ранее назывались миотонии Томсена и Беккера, является в странах Скандинавии -1:10 000 (Sun С. et al. 2001).

Очевидно, что с появлением возможности подтвердить клинический диагноз молекулярно-генетическими методами появилась возможность разработки эффективного алгоритма молекулярно-генетической диагностики на основе частот встречаемости различных форм НДМ с целью оптимизировать использование дорогостоящих молекулярно-генетических методов, уточнить диагностические критерии, по которым можно поставить верный предварительный диагноз и тип наследования миотонии в данной семье.

На сегодняшний день исследований с участием больших групп пациентов с диагнозом недистрофической миотонии в России не проводилось, не разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики миотоний и в русскоязычной литературе упоминания о миотонии довольно скудные. Распространенность оценивается не более 3-5 случаев на 100 000 (Гузеева В.И., 2009). Соответственно, на данном этапе недистрофические миотонии в России являются малоизученными нозологическими формами.

Цель исследования

Создание эффективного алгоритма молекулярно-генетической диагностики для пациентов с различными формами недистрофических миотоний.

Задачи исследования:

1. Провести поиск мутаций генов СЬСКЧ и БСША в выборке неродственных пациентов с недистрофическими миотониями, проживающих на территории РФ, описать спектр выявленных изменений;

2. Выявить особенности спектров мутаций генов СЬСЫ1 и БСИ4А, исследовать возможные причины распространения повторяющихся мутаций генов СЬСЫ1 и БСША-,

3. Определить доли хлорных и натриевых миотоний среди пациентов с недистрофическими миотониями;

4. Определить расчетную частоту встречаемости миотонии Томсена и миотонии Беккера на территории РФ;

5. Разработать эффективный алгоритм молекулярно-генетической диагностики для пациентов с недистрофическими миотониями.

Научная новизна

Впервые в России проведен молекулярно-генетический анализ генов СЬСЫ1 и БСША, задействованных в патогенезе недистрофических миотоний, описан спектр мутаций в них.

В гене С£СМ выявлено 18 ранее неописанных мутаций. Впервые определены частые мутации гена СЬСЫ1 у пациентов РФ (замены р.01у1905ег, с. 1437_1450с1е1, р.А1а493С1и, р.ТЬг550Ме1, р.Туг686* и р.А^894*, составляющие 59% всех хромосом с мутациями) и разработана эффективная система их выявления.

В гене 8СЫ4А выявлено 10 различных миссенс мутаций в гетерозиготном состоянии у 14 пациентов, из которых пять мутаций выявлены впервые. Определены «горячие» экзоны гена 5СЫ4А.

Подсчитаны доли «хлорных» и «натриевых» недистрофических миотоний в структуре миотоний у российских больных, составляющие 82% и 18%, соответственно.

Определена популяционная частота носительства мутации р.А^894* (1,2%) гена СХСЛ7 и рассчитаны ожидаемые частоты миотонии Томсена (1:710) и миотонии Беккера (1:8165) на территории РФ. На основе частот встречаемости хлорных и натриевых миотоний, а также особенностей описанного спектра мутаций генов СЬСЫ1 и БСША разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики для пациентов с НДМ.

Практическая значимость

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики и протоколы ДНК-диагностики различных форм недистрофических миотоний, что сделало возможным проведение прямой и косвенной диагностики НДМ.

Созданы эффективные диагностические системы для выявления наиболее часто встречающихся мутаций в гене CLCN1, ответственном за развитие МТ и МБ, позволяющие оптимизировать и значительно снизить затраты на проведение их молекулярно-генетической диагностики. Результаты проведенного исследования могут быть использованы в практической работе врачей-генетиков и неврологов, работающих в области наследственной патологии нервно - мышечной системы, а также в курсе лекций по клинической генетике на кафедрах генетики медицинских ВУЗов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Информативность поиска мутаций у пациентов с НДМ в генах CLCN1 и SCN4A составляет 95%. Доли «хлорных» и «натриевых» миотоний в выборке российских больных составляют 82% и 18% соответственно.

2. Частыми мутациями в гене CLCN1 являются: замены p.Glyl90Ser, p.Ala493Glu, p.Thr550Met, p.Tyr686*, p.Arg894* и делеция c.l437_1450dell4, которые составляют 59% всех хромосом с мутациями. Разработана эффективная система их детекции. Хотя бы одна из частых мутаций встретилась хотя бы на одной хромосоме в 73% случаев хлорных миотоний и в 60% всех подтвержденных случаев НДМ.

3. Популяционная частота мутации с.2680С>Т (p.Arg894*) в гене CLCN1 составляет 1,2% (95%ДИ = 0,6% - 2%). Причиной высокой популяционной частоты мутации С.26800Т (p.Arg894*) гена CLCN1 является эффект «основателя».

4. Расчетная частота миотонии Беккера и миотонии Томсена на территории РФ равна 1:710 (95%ДИ = 1/5000 - 1/145) и 1:8165 (95%ДИ = 1/31746 - 1/26) соответственно. Доли миотоний Томсена и Беккера в выборке пациентов с НДМ равны 8% и 92% соответственно.

5. Экзоны 12, 13 и 22 гена SCN4A являются «горячими», мутации в них обуславливают 79% случаев натриевых миотоний.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы отражены в 12 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук. Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков 2010; международном семинаре по исследованию наследственных каналопатий в Беатенберге, Швейцария 2010; на II и III Всероссийских конференциях по редким заболеваниям и редко применяемым медицинским технологиям "ДОРОГА ЖИЗНИ" 2011, 2012; на конкурсе молодых ученых в МГНЦ РАМН в 2009 и 2012, на конференциях European Human Genetics Conference 2009, 2010,2011, 2012.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автором проанализированы данные отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации. Автор принимал участие в планировании и осуществил экспериментальную часть работы. Все этапы молекулярно-генетического исследования (выделение ДНК, поиск мутаций в генах С/,СЛ7 и БСЫ4А, разработка системы регистрации частых мутаций гена СЬСЫ1, анализ популяционных выборок, генотипирование по полиморфным маркерам) автором выполнены лично. Автором проведен анализ полученных результатов: статистическая обработка данных, определение частоты гетерозиготного носительства и расчетных частот миотоний Томсена и Беккера, сформулированы выводы.

Публикации

По материалам исследования опубликованы 12 научных работ, среди них 3 статьи опубликованы в журналах, удовлетворяющих требованиям ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 114 страницах машинописного текста; включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы, список использованной литературы. Библиографический указатель включает 80 наименования, из них 5 отечественных и 75 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 19 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили образцы ДНК пробандов из 84 неродственных семей с НДМ (59 - мужчин и 25 - женщин) и 49 их родственников, проживающих на территории РФ (20 семей с аутосомно-доминантным типом наследования, 14 - с аутосомно-рецессивным и 50 спорадических случаев). Возраст пациентов на момент исследования составлял от 1 года до 38 лет. Диагноз «врожденная миотония» всем больным поставлен на основании следующих данных о пациенте: 1) возраст манифестации; 2) активная миотония; 3) миотонические разряды на ЭМГ; 4) гипертрофия мышц; 5) феномен врабатывания; 6) реакция на холод. Все пациенты обследованы или проконсультированы в ФГБУ «МГНЦ» РАМН, МГК городов Воронежа, Екатеринбурга и Хабаровска.

Контрольная выборка образцов ДНК 100 необследованных неродственных человек, проживающих на территории различных регионов РФ, для оценки популяционных частот впервые выявленных мутаций составлена из банка лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ «МГНЦ» РАМН.

Исследование популяционной частоты гетерозиготного носительства мутации C.26800T (p.Arg894*) в гене CLCN1 было проведено с использованием образцов ДНК 500 неродственных человек (326 из них проживают на территории г. Воронежа и Воронежской области и 174 - на территории г. Москвы и Московской области). Данное соотношение в популяционной выборке соблюдено согласно соотношению пациентов с МТ и МБ с выявленной мутацией с. 26800Т (p.Arg894*) гена CLCN1 в исследованной выборке.

Для анализа сцепления микросателлитных маркеров и внутригенных SNP с мутацией p.Arg894* гена CLCN1 было доступно 33 хромосомы с мутацией, выявленные у пробандов. В качестве группы сравнения были использованы образцы ДНК 100 неродственных человек популяции и 9 человек из трёх ядерных семей в качестве дополнительной популяционной выборки.

Образцы крови и ДНК были использованы в работе с информированного согласия исследуемых лиц.

В данной работе игольчатая ЭМГ для пациентов МГК г.Воронежа выполнена врачом функциональной диагностики, неврологом ООО «Диагностика плюс» Курбатовым A.C. на приборе «Нейро-МВП-Микро» (двухканальный портативный компьютерный электронейромиограф) в г.Воронеже.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполнено с помощью готового набора реактивов фирмы DLAtom™ DNA Prep 100 (Isogene Lab.ltd., Россия) по протоколу производителя.

Амплификация всех исследуемых фрагментов ДНК проведена методом ПЦР в 25мкл объема реакционной смеси на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы "ДНК-технология" (Россия) с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров. Дизайн праймеров для ПЦР и проб для лигирования выполнен в лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ «МГНЦ» РАМН, а синтез - в ЗАО«Евроген», Москва.

Результаты амплификации проанализированы с помощью вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (7% гель с соотношением акриламид: бисакриламид - 29:1) с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIORAD в УФ-излучении.

Определение нуклеотидной последовательности фрагментов осуществлено методом прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру (Sanger F. 1977 ), как с прямого, так и с обратного праймеров, на приборе ABI Prism 3130.x/ (Applied Biosystems, США) с использованием протокола фирмы производителя. Анализ результатов секвенирования проведен с помощью программ Chromas и BLAST (http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Популяционное исследование для определения частоты мутации p.Arg894* выполнено с использованием рестрицирующей эндонуклеазы Taql фирмы "Fermentas", Литва.

Для определения популяционных частот ранее неописанных миссенс - мутаций генов CLCN1 и SCN4A и разработки эффективной системы выявления 6 частых мутаций гена CLCN1 использованы системы мультиплексного проба - специфичного лигирования (MLPA) с последующей амплификацией на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия).

Для выявления предполагаемого общего гаплотипа основателя использованы 7 микросателлитных маркеров и 4 внутригенных SNP на хромосоме 7q35, расположенных в области 6,5 млн.п.н. вокруг гена CLCN1. Маркеры выбраны с помощью карт HuRef и Marshfield базы данных NCBI.

При оценке неравновесия по сцеплению для полиморфных маркеров в группе больных использована формула, предложенная Бенгтсоном и Томсоном в 1981г. (Bengsson В.О., Thomson G., 1981): ö= (Pd-PnVG-Pn), где 8 - мера неравновесия по сцеплению, PD - частота ассоциированного аллеля среди хромосом с мутацией, PN -частота того же аллеля среди хромосом популяции.

При сравнении частот аллелей маркеров среди хромосом с мутацией и среди хромосом популяции использован^ 2-тест для двупольной таблицы. Для вычисления средних значений, медиан и стандартных ошибок для количественных параметров ЭМГ а также возраста мутации p.Arg894* гена CLCN1 использованы стандартные математические методы оценки параметров (Животовский JI.A., 1991). Для оценки 95% доверительных интервалов для рассчитанных частот заболеваний использовался пакет программ Statistika 6.0.

Результаты и обсуждение

Выборка пациентов с НДМ, сформированная в лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ «МГНЦ» РАМН согласно вышеуказанным критериям, состояла из 84 неродственных пациентов. Девятерым из них на основании данных клинического осмотра поставлен диагноз парамиотонии Эйленбурга (ПЭ), гиперкалиемического паралича (ГиперКП) или гипокалиемического паралича (ГипоКП). Остальным 75 пациентам поставлен диагноз «врожденная миотония» (ВМ), миотония Томсена (МТ) или миотония Беккера (МБ). Первой группе пациентов первоначально проведен молекулярно-генетический анализ гена SCN4A, а второй группе - молекулярно-генетический анализ гена CLCN1.

Спектр мутаций гена CLCN1

В процессе исследования гена CLCN1 у 67 пробандов выявлено 40 различных мутаций на 118 хромосомах в 24 семейных и 43 спорадических случаях. По первоначально определенному статусу мутации выявлены в 10 случаях с аутосомно-доминантным и 14 случаях - с аутосомно-рецессивным типом наследования. Семь мутаций из 40 представляют собой мутации сайта сплайсинга. Также выявлены четыре делеции и одна комбинированная делеция с инсерцией, приводящие к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона, 4 нонсенс-мутации. Остальные 24 мутаций представлены миссенс-заменами (табл. 1).

Жирным шрифтом в табл. 1 отмечены 18 мутаций (45% всех выявленных мутаций), выявленные нами впервые и неописанные в базах ЬЮМО и БЫР (ncbi.nlm.nih.gov). Три из восемнадцати новых мутаций - замены на стоп-кодон (р.С1п879*, р.Туг686*, р.Аг§626*) в С-терминапьном домене белка СЬС1. Выявлены также новые делеции и мутации сайта сплайсинга.

Остальные неописанные ранее мутации - миссенс-мутации, приводящие к замене аминокислоты в В, С, О, I, 1-.Г связывающем, 0 и С-терминальном доменах белка. Среди впервые выявленных мутаций две замены р.Рго3428ег и с.1592+5С>А обнаружены в гомозиготном состоянии в семьях с кровнородственным браком. Для всех впервые описанных в данном исследовании миссенс-замен проведено популяционное исследование. Данные замены не обнаружены среди 100 необследованных человек популяционной выборки.

В ходе исследования гена С£СЛ7 для 66 пациентов с недистрофическими миотониями из 75 (88%), в результате молекулярно-генетического анализа гена С£СЛ7 диагноз подтвержден. Стоит заметить, что для 15 пациентов вторая мутация с помощью использованных методов не выявлена (5 случаев с АД типом наследования, 2 случая - с АР и 8 спорадических случаев).

Выявленный в ходе данной работы спектр мутаций гена СЬСЫ1 соответствует описанному разнообразию генетических изменений, характерному для генов ионных каналов. Больше половины обнаруженных мутаций представлены миссенс-заменами (60%), остальная часть - мутации сайта сплайсинга, делеции, инсерции и нонсенс-мутации (рис. 1).

Рис.1. Доли различных типов мутаций гена СіСІУЛ описанные по результатам данного исследования (слева от пояснительной надписи) и в литературе (справа).

Частые мутации гена СЪСЛЧ В исследованной выборке пациентов с недистрофическими миотониями выявлены повторяющиеся мутации: замены р.01у1908ег (7 хромосом, 6%), с.1437_145(Ме114 (11 хромосом, 9%), р.А1а493С1и (6 хромосом, 5%), р.ТЪг550Ме! (4 хромосоммы, 3%), р.Туг686* (6 хромосом, 5%) и р.Аг§894* (36 хромосом, 31%) составили 59% всех хромосом с мутациями гена СЬСИ1. Хотя бы одна из частых мутаций встретилась хотя бы на одной хромосоме в 73% случаев хлорных миотоний и в 60% всех подтвержденных случаев НДМ. В выборке российских пациентов 59% всех хромосом с мутацией приходится на частые мутации. Самой частой в выборке является мутация р.А^894*. Она выявлена на 36 хромосомах в семьях с АР и АД типами наследования во всевозможных сочетаниях с другими мутациями, в том числе, у 7 пациентов - в гомозиготном состоянии. Благодаря её локализации в С-терминальном домене для неё не характерен доминант негативный эффект как для мутаций с образованием ранних преждевременных стоп-кодонов.

У 23 пациентов с двумя идентифицированными мутациями выявлено сочетание двух часто встречающихся мутаций, что составляет 45% от всех пациентов с двумя выявленными мутациями и 29% от всех пациентов выборки с подтвержденными НДМ. Так как большинство случаев наследственной миотонии — это спорадические случаи с рецессивным типом наследования (в данной выборке 43 СС - 53% от всех случаев НДМ с выявленными мутациями), эффективное выявление частых мутаций позволяет значительно сократить время и стоимость диагностики для пациента. Информативность выявления шести частых мутаций среди всех пациентов с НДМ -59%. В связи с этим разработана система детекции всех 6 частых мутаций методом МЬРА - анализа с последующей мультиплексной ПЦР (рис. 2).

Рис.2. Система для выявления шести частых мутаций методом МЬРА - анализа.

X - маркер молекулярного веса; 1-6 - обозначение лунок на геле, соответствующим образцам ДНК после МЬРА + мПЦР пациентов со следующими

генотипами: 1 - [р.ТЬг550Ме1] + [р.А^894*]; 2 - [р.Туг686*] + [р.Агё894*]; 3 - [с.1437_1450с1е114] + [р.Аг§894*]; 4 - [р.С1у1908ег] + [р.Агё894*]; 5 - [р.А1а49301и] + [=]; 6 - [=]+[=].

А 1 2 3 4 5 6

...... *-Ц|Г............ П 157 л.н. л

ЦЗПА '

118 п.и. Ши '110

| ; .1 .....

<1 п.и. Ц0Ш Ч.ПЧЧ |Г

— 87П.Н. 84П.Н.

Таблица 1. Спектр мутаций гена СЬСШ, выявленных в ходе исследования.

№ Нуклеотидная замена Изменения на уровне белка Экзон/ |интрон| Домен Тип наследования Число хромосом

1 с. 180+3 А>Т Мутация сайта сплайсинга [81 Ы-терминальный СС 3

2 с.302-1 0>А Мутация сайта сплайсинга [81 Ы-терминалышй СС 1

3 с.383Т>С р.МеЛ28Т11г 3 В АД 1

4 с.501С>0 р.РЬе167Ьеи 4 С СС 1

5 с.547Т>С р.8ег183Рго 4 с АД 1

6 С.562+ЗОТ Мутация сайта сплайсинга 181 с СС 1

7 с.5680Т, с.С5690С р.(31у1908ег 5 Б АД, СС 7

8 с.592С>0 р.Ьеи198Уа1 5 0 АД 1

9 с.6970А р.С1у2338ег 6 Е-Р связывающий СС 1

10 с.795Т>С р.Авр265С1и 7 в СС 1

11 с.803С>Т р.ТЬг268Ме1 7 в АД, АР 3

12 с.8990>А p.Arg300Gln 8 Н-1 связывающий АД, СС 2

13 с.912А>С р.Агг3048ег 8 I СС 1

14 с.9370А р.А1а313ТЬг 8 I СС 1

15 с.1024С>Т р.Рго3428ег 9 1-Л связывающий АР 2

16 с.1238Т>0 р.РЬе413Су8 11 К-Ь связывающий АД, АР, СС 3

17 с. 1261 С>Т p.Arg421Cys 12 Ь СС 3

18 с. 12640 А р.01и422Ьу8 12 Ь СС 1

19 с.1271Т>А р.11е424А$п 12 Ь СС 1

20 с.1290 1291(1е1СА р.А5п430Ьу5Г5*8 12 ь СС 1

21 с.1437 1450<1е114 р.11е47911еГз*25 13 М-Ы связывающий АД, АР, СС И

22 с.1471+Ш>А Мутация сайта сплайсинга [131 N АР 1

23 с.1478С>А р.А1а49301и 14 N АД, АР, СС 6

24 с.14950А р.С1у499Агй 14 N СС 1

25 с.1582+5С>А Мутация сайта сплайсинга [141 N АР 2

26 с.1649С>Т р.ТЬг550Ме1 15 Р АД, АР, СС 4

27 с.1679Т>С р.Ме1560ТЬг 15 АД 1

28 с.1699А>С р.А$п567Ш8 15 0 СС 2

29 с.1720С>А р.С1п574Ьу« 15 0 АД 1

№ Нуклеотидная замена Изменения на уровне белка Экзон/ [интрон] Домен Тип наследования Число хромосом

30 С.1797-10А Мутация сайта сплайсинга [151 О СС 1

31 С.18760Т р.Агй626* 16 С-терминальный СС 2

32 с.1936А>С р.Ме1б4бУа1 17 С-терминальный АД, АР, СС 3

33 С.20580А р.Туг686* 17 С-терминальный АР, СС 6

34 с.2364+2 Т>А Мутация сайта сплайсинга [191 С-терминальный СС 1

35 с.2380 238ЫеЮТ ¡пвА р. Уа1794А^з* 17 20 С-терминальный СС 1

36 С.24370А р.Рго813ТЬг 21 С-терминальный СС 1

37 с.2474 2477<іе1ССТТ р.Рго825Гз*26 21 С-терминальный СС 1

38 с.2635С>Т р.С1п879* 23 С-терминальный СС 1

39 с.2662 2675с1е114 р.Аг8888А5пГ8*19 23* С-терминальный СС 2

40 с.2680С>Т p.Arg894* 23 С-терминальный АР, СС 36

Всего хромосом с мутацией (ями) 118

Примечание: суммарное количество хромосом подсчитано с учетом двух случаев в выборке, когда на одной хромосоме выявлено по две мутации; выделение жирным шрифтом обозначает, что данные изменения выявлены впервые в данном исследовании.

Соотношение МТ и МБ в исследованной выборке

Вопреки бытующему издавна мнению о том, что частота миотонии Томсена с АД типом наследования значительно выше (1:23 ООО), чем миотонии Беккера с АР типом наследования (1:50 ООО), результаты молекулярно-генетических исследований последних 10-15 лет показывают обратное. В данном исследовании общее число подтвержденных случаев АД формы миотонии составило 5 случаев, а АР формы - 61 случай. Соотношение миотоний Томсена и Беккера в результате проведенного молекулярно-генетического анализа гена CLCN1 изменилось по отношению к изначальному (13 и 62) и составило 5 и 61 (8% и 92%). Аналогичные соотношения получили исследователи из Германии (3% и 97%), Северной Скандинавии (7% и 93%) и Нидерландов (6% и 94%) (Meyer-Kleine С., 1995; Sun С., 2001; Trip J., 2008).

Таким образом, на этапе клинического осмотра происходит явная недооценка рецессивных форм миотонии, возможно из-за недостатка информации о родственниках пробанда. Часто данные о родителях и других родственниках записываются со слов пациента. Может быть более существенно, что до широкого внедрения молекулярно-генетических методов, врачи-генетики пытались разделить миотонии Томсена и Беккера только по клиническим признакам. Но из-за того, что в большинстве случаев клиническая картина стертая, миотония выражена слабо, однозначно поставить диагноз, прогнозировать течение заболевания и сегрегацию в семье не представляется возможным. Так как мутации распределены по всей кодирующей последовательности гена CLCN1, и для наследственной миотонии характерна аллельная гетерогенность, остается необходимость в прямом автоматическом секвенировании всего гена. При этом анализируются кодирующие экзоны с прилегающими к ним интронными областями, но упускаются протяженные делеции и дупликации. Хотя выявление более, чем в половине случаев частых мутаций сильно облегчает работу исследователя и ускоряет поиск мутаций для пациента. Для постановки диагноза миотонии Томсена или миотонии Беккера выявление нонсенс мутаций и мутаций со сдвигом рамки считывания при молекулярно-генетическом исследовании гена CLCN1 по-прежнему наиболее информативны. Детекция миссенс замены предполагает проведение популяционного исследования в случае, если она не описана ранее, и молекулярно-генетического анализа родственников пробанда с целью определения ассоциации этой замены с патологическим фенотипом в данной семье. Таким образом, данный подход обеспечивает подтверждение диагноза НДМ молекулярно-генетическими методами и дифференцировку миотоний Томсена и Беккера с определением типа наследования выявленных мутаций в обследуемых семьях.

Популяционное исследование частоты мутации С.26800Т (p.Arg894*) в гене

CLCN1

Особенностью выборки пациентов с миотониями Томсена и Беккера, сформированной в лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ МГНЦ РАМН, является преобладание пациентов из г. Воронежа и Воронежской области. Их число превалировало и среди пациентов с выявленной мутацией с.2680С>Т (p.Arg894*) в гене CLCN1 в гомо- или гетерозиготном состоянии: 17 против 8 из г. Москвы и Московской области, 2 из Екатеринбурга и 1 из Хабаровска (61%, 29%, 7%, 3% соответственно).

Сохранив соотношение наиболее многочисленных групп пациентов, представленных в выборке, сформирована популяционная выборка из 500 необследованных неродственных человек, проживающих на территории г. Воронежа и Воронежской области (326 человек) и г. Москвы и Московской области (174 человека).

Мутация с.2680С>Т (p.Arg894*) представляет собой нонсенс-мутацию. В положении 2680 происходит замена цитозина на тимин. При этом создается сайт рестрикции для эндонуклеазы Taq I (TCGA). При наличии мутации исходный фрагмент ПЦР реакции экзона 23 размером в 461 п.н. режется на два фрагмента 304 п.н. и 157 п.н. (рис.3). Данный способ выявления мутации с.2680С>Т (p.Arg894*) гена CLCN1 используется и другими исследователями для детекции данной мутации у родственников пробандов и в популяционной выборке (Sun С. et al., 2001).

M/N M/NM/N | M/N 461 п.и.

; M/M —щ&шт

304 n.M. ; '

157 nH Рис.3. Система выявления мутации с.2680С>Т (p.Arg894*)

** - Wi- с помощью ПДРФ - анализа.

Генотипы подписаны на дорожках геля.

В результате популяционного исследования аллельная частота мутации с.2680С>Т (p.Arg894*) в гене CLCN1 среди воронежцев (8 гетерозиготных носителей) и москвичей (4 гетерозиготных носителя) оказалась одинаковой и составила 1,2% (95%ДИ = 0,6% - 2%).

В ходе молекулярно-генетического анализа спектра мутаций в гене CLCN1 выявлено 118 хромосом с мутацией. На 36 хромосомах обнаружена мутация с.2680С>Т (p.Arg894*). Аутосомно-рецессивный тип наследования установлен для 61 случая, из них 51 случай с двумя выявленными мутациями и 10 с одной рецессивной мутацией (всего 112 хромосом с рецессивной мутацией). Таким образом, аллельная доля данной мутации среди пациентов с МБ составляет 32% (95%ДИ = 24% - 42%). В

популяции аллельная частота мутации с.2680С>Т (p.Arg894*) составляет 1,2% или 1/42 человека (95%ДИ = 1/84 - 1/25), это 32% всех рецессивных мутаций гена CLCN1. Тогда частота всех носителей рецессивных мутаций в гене CLCN1 равна 1/13 человек (95%ДИ = 1/35 - 1/6). Таким образом, расчетная частота миотонии Беккера на территории РФ оценивается в 1:710 (95%ДИ = 1/5000 - 1/145). Исходя из соотношения пациентов с миотониями Томсена и Беккера в выборке пациентов (8% (95%ДИ = 3% - 17%) и 92% (3% - 19%)) расчетная частота миотонии Томсена -1:8165 (95%ДИ = 1/31746 - 1/26). Суммарная частота хлорных миотонии в РФ равна соответственно 1: 653 человека (95%ДИ = 1/4320 - 1/22).

Изученная выборка может быть смещена в сторону наиболее тяжелых форм заболевания, обусловленных различными мутациями гена CLCN1. В неё могли не попасть, например, пациенты с более мягким течением болезни, обусловленным мутацией с.2680С>Т (p.Arg894*) в гомозиготном состоянии или в сочетании с «мягкими» мутациями.

Для проверки теории о смещенности выборки проверена гипотеза об отклонении соотношений генотипов по мутации с.2680С>Т (p.Arg894*) гена CLCN1 в исследованной выборке от соотношения Харди - Вайнберга (табл.2).

Таблица 2. Рассчитанные и наблюдаемые соотношения численностей генотипов по мутации р.А^894* гена СЬСЫ1.

№ Генотип по мутации p.Arg894* Ожидаемое число иробаидов Наблюдаемое число иробаидов

1 Гомозиготы 5 7

2 Гетерозиготы 26 22

3 Норма 36 38

Всего 67 67

Проведенный анализ показал, что выявленное отклонение численностей генотипов в выборке от соотношения Харди - Вайнберга не является статистически значимым {¿= 0, 98, р = 0,53).

О проведенных популяционных исследованиях в Европе литературных данных нет, поэтому сложно судить, является ли мутация р.А^894* частой только на территории РФ или одинаково высоко распространена по всей Европе.

Анализ неравновесия по сцеплению и выявление гаплотипа «основателя»

Высокая распространенность мутации с.2680С>С (р.А^894*) гена СЬСЯІ может быть обусловлена как преимущественным отбором гетерозиготных носителей,

так и дрейфом генов, в частности эффектом основателя. Для выявления возможного гаплотипа «основателя» хромосом с мутацией р.А^894* гена СЬСИІ выбраны 5 микросателлитных маркеров 0781824, 0782513, 078661, 0783068, 0782511 с высокой гетерозиготностью и известной генетической координатой и 4 внутригенных 8№ (ге940854, ^2272251, ге4489232, ге6464546) и два микросателлитных маркера («57731612, ге 151000993), максимально приближенные к гену СЬСИІ (127,2 т.п.н. и 53,9 т.п.н.).

При выборе аллелей маркеров, составляющих гаплотип основателя, мы учитывали максимальные значения неравновесия по сцеплению по сравнению с другими маркерами и наибольшие частоты аллелей среди хромосом с мутацией по сравнению с контрольными при наименьших значениях р. Сохранная часть гаплотипа основателя представлена пятью аллелями Т-Т-А-1-3 маркеров гб227225 1- гв4489232 -ге6464546 - ге 151000993 - 078661 соответственно (табл. 3).

Таблица 3. Неравновесие по сцеплению аллелей маркеров с мутацией р.А^894* в гене СЬСШ.

МАРКЕР АЛЛЕЛЬ Xі Р 5±90%ДИ

0782513 3 0,67 0,56 0,24±0,067

гэ57731612 2 0,84 0,76 0,82±0,049

гб940854 А 1,5 0,27 0,83±0,055

гэ2272251 Т 6,8 0,007 1

СЬСИІ тй

ге4489232 Т 5 0,025 0,89±0,016

ге6464546 А 4,2 0,031 0,9±0,017

геї51000993 1 17,7 <0,001 0,62±0,028

078661 3 6,8 0,0012 0,32±0,063

0782511 1 1,07 0,3 0,42±0,077

Примечание: р - односторонняя вероятность распределения х2; жирным шрифтом выделены значения р<0,05; 8 - мера неравновесности сцепления аллелей полиморфных маркеров с локусом заболевания; ДИ - доверительный интервал.

Полные гаплотипы хромосом с мутацией удалось выявить не для всех пациентов, в связи с недоступностью биологического материала их родственников. Как видно из физического расстояния маркеров сохранившейся части гаплотипа по отношению к мутации, гаплотип «основателя» размывается довольно давно (табл. 4). Из всех только для маркера 078661 известна генетическая координата, это обстоятельство не позволило рассчитать «возраст мутации».

Таблица 4. Гаплотипы хромосом с мутацией р.А^894* гена СЬСИІ по 5

микро о, <и и. & сателлитным локусам и 6 внутригенным 8ЫР. ^ _ « гч ^ > >»> ГУ, «о £ 5 Я] оо і^і оо й <: о? а Й К § ^ ^ ^ ^ ^ ^ "ч- ^ 3 2 2 ° 2 2 о\ 5Ь О -ч 2 N8661 0783068 0782511

сМ МЬ 149,9 140,01 151,3 141,41 [153,9] 142,92 [154,2] 143,04 [154,2] 143,04 [154,2] 143,05 [154,2] 143,06 [154,3] 143,08 [154,3] 143,1 155,1 143,6 155,1 143,85 156,3 146,55

8 7 1 А Г м т А 1 5 2 13

1 3 8 1 2 2 А А г т м м т т А А 1 1 5 5 2 11 10 10

6 6 2 А т м т А 1 3 12 13

6 4 6 7 2 2 А А т т м м т т А А 1 1 3 3 12 12 1 1

4 з 2 А т м т А / 3 13 1

7 7 7 3 3 3 2 2 2 А А А т т т м м м т т т А А А / 1 1 3 3 3 13 10 10 1 1 1

3/7 3 2 А т м т А 1 5/7 2/3 1

2/9 3/5 2 А/С т м т А 1 3 11/12 1

2/9 3/5 2 А/в т м т А 3 3 11/12 1

1 5 2 Л/О т м т А 1 5 12 12

2/7 3 2 3/9 3 6 2 2 2 А А в т т т м м м т т т А А А 1/6 6 6 3/6 5/7 5 11/13 2/3 9 1/10 1 7

7 5/8 2 А/в т м т А/в 1 4/5 3/12 8/9

4/7 3/8 2/3 А т м т в 4 3/5 12/13 9/12

10 3 2 А т м в АЮ 4 3 12 1

4 3/6 2/3 А/в т м тю А/в 1/3 4/5 2/13 1/13

11 5 2/3 А/в т м т А/в 1 3 10 1

Примечание: Выделенная цветом область представляет собой сохранную часть гаплотипа «основателя», установленная с помощью анализа сцепления; область, выделенная рамкой без цвета - возможный частично сохранившийся гаплотип «основателя»; сМ - генетическая координата по карте Магеїіітеїсі; МЬ - физическая координата на хромосоме в миллионах пар оснований по карте НиЯе£

Спектр мутаций гена 5США

По клиническим критериям диагноз ПЭ, ГиперКП и ГипоКП поставлен девяти пациентам. У них в качестве причины НДМ предполагались мутации гена БСША изначально. В результате молекулярно-генетического анализа гена СЬСШ выявлено 40 различных мутаций у 67 из 75 пациентов. Оставшимся 8 пациентам проведен молекулярно-генетический анализ гена БСША. Также в выборку пациентов, которым проведено прямое автоматическое секвенирование гена БСША вошли пять спорадических случаев и один случай с АД типом наследования в семье, в которых выявлено по одной из частых рецессивных мутаций гена С1СЖ/. Таким образом, всего молекулярно-генетический анализ гена БСША проведен 23 из 84 пациентов с НДМ.

В ходе молекулярно-генетического анализа БСША выявлено 10 различных мутаций в гетерозиготном состоянии у 14 пациентов в 6 спорадических случаях и 8 семьях с АД типом наследования. Пять мутаций выявлены впервые в данном исследовании и не обнаружены среди 200 хромосом популяционной выборки. Мутации р.01у1306А1а и р.ТЬг1313Мс1 встретились по два раза, а мутация р.ТЬг704Ме1 - трижды в выборке. Все выявленные мутации гена БСША являются миссенс - заменами и сосредоточены преимущественно в экзонах 12, 13 и 22 гена БСША (табл.5).

Таким образом, у 14 пациентов из 23 (61%) диагноз «натриевой» миотонии подтвержден. Причем из них 8 пациентов с диагнозами ПЭ (2 человека), ГиперКП (5 человек) и ГипоКП (1 человек) направлены на исследование гена БСША по результатам клинического осмотра, 5 пациентам с диагнозами МТ или «врожденная миотония» первоначально проведен молекулярно-генетический анализ гена СЬСИ1, и мутаций не выявлено. А мутация с.205С>А (р.01у69Ащ) обнаружена у пациента с выявленной рецессивной мутацией с.1437_1450ёе114 в гетерозиготном состоянии в гене сьст.

Внутригенная локализация мутаций, выявленных в гене БСША в данной работе, не отличается от описанных в исследованиях зарубежных авторов. В основном все патологические мутации сконцентрированы в экзонах, кодирующих области белка, формирующие сенсор напряжения натриевого канала. Единственное отличие от литературных данных в том, что часть описанных мутаций сконцентрирована еще и в экзоне 24, чего не отмечается по результатам данного исследования.

Оптимизировать поиск мутаций позволяет их сосредоточение в экзонах 12, 13 и 22. Эти экзоны можно считать «горячими» и начинать поиск мутаций с них. Мутации в этих экзонах обуславливают 79% (11 из 14) случаев «натриевых» миотоний в исследованной выборке пациентов. В основном, это семейные случаи с АД типом наследования (7 из 11) с диагнозами ПЭ и ГиперКП. Остальные 4 - спорадические случаи с первоначальным диагнозом МТ. Несмотря на то, что большинство мутаций сосредоточены в трех экзонах, остается вероятность нахождения генетических изменений и в других участках гена БСША.

Таблица 5. Спектр мутаций гена БСША, выявленных в ходе исследования.

Jft НУКЛЕОТИДНАЯ ЗАМЕНА ИЗМЕНЕНИЯ НА УРОВНЕ БЕЛКА ЭКЗОН ДОМЕН/ СЕГМЕНТ БЕЛКА тип НАСЛЕДОВАНИЯ число ХРОМОСОМ

1 c.205G>A p.Gly69Arg 1 Dl/Sl cc 1

2 c.638G>A p.GIy213Asp 5 D1/S3 СС 1

3 с.2003Т>С p.Leu668Pro 12 D2/S4 сс 1

4 c.2006G>A p.Arg669His 12 D2/S4 АД 1

5 c.2017C>G p.Leu673Val 12 D2/S4 СС 1

6 с.2078Т>С p.Ile693Thr 13 D2/S4-S5 сс 1

7 С.21ПОТ p.Thr704Met 13 D2/S5 АД 3

8 c.3917G>C p.Glyl306Ala 22 ID3-4 АД, СС 2

9 с.3938С>Т p.Thrl313Met 22 ID3-4 АД 2

10 с. 4137G>C p.Glnl379His 23 D4/S1 АД 1

Примечание: жирным шрифтом в таблице отмечены мутации, выявленные в ходе данного исследования впервые, ID - петля между доменами.

Определение долей хлорных и натриевых миотоний в структуре НДМ

В общей структуре НДМ натриевые миотонии представлены меньшей долей. Выборка НДМ, сформированная в лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ МГНЦ РАМН, состоит из 84 неродственных пациентов. Диагнозы «миотония Томсена» и «миотония Беккера» с мутациями в гене CLCN1 подтверждены у 66 пробандов, «парамиотония Эйленбурга», «гиперкалиемический периодический паралич», «гипокалиемический периодический паралич» и «миотония Томсена» с мутациями в гене SCN4A подтверждены у 14 пациентов.

Соотношение «хлорных» и «натриевых» миотоний составляет 82% и 18% соответственно. В сравнении с данными исследователей из Голландии (59% и 41%) соотношение форм миотонии в выборке пациентов РФ сильно смещено в сторону «хлорных» миотоний (Trip J. 2008). Значительно меньше и доля пациентов с первоначальным диагнозом «наследственная миотония» с мутациями в гене SCN4A. В Голландии она составила 20%, а в данной выборке - только 11 %. Возможно причина в более высокой популяционной частоте мутации p.Arg894* гена CLCN1 в России. К сожалению, описания масштабных исследований с последовательным анализом генов CLCN1 и SCN4A для пациентов с НДМ в других странах в литературе не представлены. А по данным, опубликованным голландскими исследователями, частоту хлорных миотоний подсчитать невозможно.

Алгоритм молекулярно-генетической диагностики НДМ

В последнее время в молекулярно-генетической диагностике наметилась тенденция к оптимизации поиска мутаций генов, нахождения удобной и эффективной диагностической стратегии. В основном выявляются частые мутации, «горячие» точки или экзоны, которые покрывают большую долю выявляемых мутаций в гене. Для них разрабатывается наиболее дешевая и быстрая система детекции. В случае

каналопатий и миотоний в частности эта стратегия не всегда эффективна. Среди мутаций гена СЬСЫ1 шесть встречаются наиболее часто (р.О!у 1908ег, с.1437-1450с1е114, р.А1а49301и, р.ТЬг550Ме1, р.Туг686* и р.Аг§894*). В общей сложности они составляют 59% всех хромосом с мутациями. Сочетание двух частых мутаций встретилось в 45% случаев рецессивной формы миотонии, в которых выявлены обе мутации. Для детекции данных мутаций разработана система на основе метода МЬРА - анализа и мультиплексной ПЦР, что удешевляет диагностику более чем в 10 раз по сравнению с прямым автоматическим секвенированием всей кодирующей последовательности гена СЬСЫ1. Для выявления самой распространенной мутации р.Аг§894* также возможно применение ПДРФ - анализа. Но с помощью этих методов лишь для 23 пациентов из 84 (27%) можно было подтвердить диагноз миотонии Беккера. В основном, из-за мягкого течения заболевания или позднего возраста манифестации (когда обследование родителей не представляется возможным), случаи недистрофической миотонии считаются спорадическими. По результатам данного исследования стало понятно, что с помощью клинико-генеалогического метода возможно лишь предположить тип наследования миотонии в данной семье. Для спорадических случаев необходимо подтвердить или опровергнуть наличие рецессивного типа наследования с помощью прямого автоматического секвенирования всей кодирующей последовательности и прилегающих к ней интронных областей. Более того наличие более двух мутаций в двух семьях данного исследования и выявление одной рецессивной мутации тем более обязывает проводить секвенирование всего гена СЬСИ1 а также семейный анализ, чтобы определить положение мутаций на хромосомах и уточнить тип наследования.

Рассчитанная частота рецессивных форм миотонии и экспериментальные данные подтверждают предположение о том, что в первую очередь необходимо исследование гена хлорного канала, а потом уже натриевого. Что касается прямого автоматического секвенирования гена БСША, то на данный момент этот метод еще актуален. Оптимизировать поиск мутаций позволяет концентрирование мутаций в экзонах 12, 13 и 22. Их можно считать «горячими» и начинать поиск с них. Не смотря на то, что большинство мутаций сосредоточены в трех экзонах (79% случаев), остается вероятность нахождения мутаций и в других экзонах гена (21%). Возможно с увеличением выборки натриевых миотоний, можно будет оптимизировать поиск мутаций гена БСША наиболее эффективно.

В результате тандемного молекулярно-генетического анализа генов CL.CN1 и БСИ4А, проведенного на образцах ДНК 84 неродственных пациентов с различными НДМ, нами предложен алгоритм молекулярно - генетической диагностики заболевания (рис. 4).

Рис.4. Алгоритм молекулярио-генетической диагностики НДМ.

ГиперК ГипоК ПЭ КЗМ

1 1 +

"Г

Поиск мутаций в «горячих»

Диагноз ГиперКП, ГипоКП, ПЭ, КЗМ, МТ подтвержден

В случае постановки диагноза НДМ на этапе клинического осмотра устанавливается форма НДМ соответственно типу наследования. В случае хлорных миотоний семьи с АР типом наследования и спорадические случаи с неустановленным типом наследования относят к МБ или ВМ. А в случае семей с АД типом наследования их относят к МТ.

Далее в зависимости от диагноза проводится либо поиск частых мутаций, либо прямое автоматическое секвенирование всего гена СЬСИІ. Если мутации гена СЬС]VI не обнаружены и после анализа всей кодирующей последовательности гена, далее проводится поиск мутаций в гене 5СЫ4А также как для группы натриевых миотоний. Если клиническая картина у пациента соответствует ПЭ, ГиперКП, ГипоКП, КЗМ, то в первую очередь проводится поиск мутаций в «горячих» экзонах гена БСША, затем, в случае отрицательного результата, прямое автоматическое секвенирование всей последовательности данного гена. В результате можно предполагать выявление мутаций у 95% пациентов с НДМ. В оставшиеся 5% скорее всего входят пациенты с мутациями в данных генах, которые не могут быть идентифицированы с помощью использованных в работе методов. Также возможно наличие некоторой доли пациентов с мутациями в других генах со схожим с НДМ фенотипом.

ВЫВОДЫ

1. В результате молекулярно - генетического анализа генов С£СЛ7 и БСІЇ4А, выполненного на 84 образцах ДНК выборки российских больных диагноз различных типов НДМ подтвержден у 80 пациентов. Доли «хлорных» и «натриевых» миотоний в выборке российских больных составляют 82% и 18% соответственно.

2. В исследованной выборке пациентов с хлорными миотониями выявлено 40 различных мутаций гена СЬСИІ. Восемнадцать мутаций (45%) неописаны в базах НЄМО и БЫР. Выявлены частые мутации: замены р.01у1908ег, с.1437_1450с1е1, р.А1а493С1и, р.ТЬг550Ме1:, р.Туг686* и р.А^894*, которые составили 59% всех хромосом с мутациями. Разработана эффективная система детекции частых мутаций на основе метода МЬРА - анализа с последующей мультиплексной ПЦР. Хотя бы одна из частых мутаций встретилась хотя бы на одной хромосоме в 73% случаев хлорных миотоний и в 60% всех подтвержденных случаев НДМ.

3. Определена частота гетерозиготного носительства мутации с.2680С>Т (р.А^894*) в гене аСМ1, которая составила 1,2% (95%ДИ = 0,6% - 2%). Полученные данные сопоставимы с аналогичными в странах Скандинавии (0,87%). Анализ неравновесия по сцеплению аллелей 11 полиморфных маркеров с мутацией с.2680С>Т (р.Аг§894*) гена СЬСЫ1 подтвердил единство происхождения данной мутации в результате эффекта «основателя».

4. Определена расчетная частота миотонии Беккера и миотонии Томсена на территории РФ равная 1:710 (95%ДИ = 1/5000 - 1/145) и 1:8165 (95%ДИ = 1/31746 -1/26) соответственно, что свидетельствует о гиподиагностике хлорных миотоний на

территории РФ вследствие преобладания мягких форм заболевания. Частота МТ и МБ в РФ в разы превосходит расчетную частоту хлорных миотоний в Северной Скандинавии (1:2000 и 1:26570).

5. В результате молекулярно-генетического анализа гена SCN4A выявлено 10 различных миссенс мутаций в гетерозиготном состоянии у 14 пациентов. Пять мутаций выявлены впервые в данном исследовании. Выявленные мутации сконцентрированы в «горячих» экзонах 12, 13 и 22 гена SCN4A (79% случаев).

6. Предложен алгоритм молекулярно-генетической диагностики для пациентов с различными формами НДМ, учитывающий данные клинического осмотра, ЭМГ, тип наследования заболевания в семье, частоты распространенности хлорных и натриевых миотоний и особенности спектра мутаций в генах CLCN1 и SCN4A. Информативность разработанного алгоритма составляет 95%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ:

1. Иванова Е.А., Дадали E.JL, Федотов В.П. с соавт.. Спектр мутаций в гене CLCN1 у пациентов с недистрофическими миотониями Томсена и Беккера // Генетика. 2012. Т. 48. № 9. С. 1113-1123. {Ivanova Е.А., Dadali E.L., Fedotov V.P. et al. The spectrum of CLCN1 gene mutations in patients with nondystrophic Thomsen's and Becker's myotonias // Rus. J. Genetics. 2012. V. 49. № 9. P. 952-961.)

2. Иванова E.A., Поляков A.B.. Недистрофические миотонии: клинико -генетические формы, механизмы этиопатогенеза, ДНК - диагностика // Медицинская генетика. 2012. Т. 11. №6. С. 3 - 10.

3. Руденская Г.Е., Иванова Е.А., Галеева Н.М.. Случай миотонии Беккера с эквинной деформацией стоп // Журнал неврологии и психиатрии им.С.С.Корсакова. 2012. №8. С.70-71.

Публикации в других изданиях:

4. Ivanova Е.А., Fedotov V.P., Kyrbatov S.A., Polyakov A.V. The novel mutation in CLCNI gene resulting in recessive form of the myotonia congenita // European Journal of Human Genetic. 2009. V.17. P. 379.

5. Иванова E.A., Федотов В.П., Курбатов C.A., Поляков A.B.. Молекулярно-генетический анализ причин наследственной миотонии Томсена - Беккера // Медицинская генетика. 2009. Т. 8. №12. С.38.

6. Ivanova E., Fedotov V,, Dadali E., Rudenskaya G., Kurbatov S. Myotonia congenita (MC) in Russia: the two frequent mutations in CLCN1 gene allows to reveal 14% mutant chromosomes of patients with MC // European journal of Human Genetics. 2010. V.18. P. 87-88.

7. Иванова E.A., Федотов В.П., Дадали Е.Л., Руденская Г.Е., Курбатов С.А., Поляков А.В.. Молекулярно-генетический анализ недистрофических миотоний // Медицинская генетика. Материалы VI-го съезда Российского общества медицинских генетиков 2010. С.72.

8. Курбатов С.А., Федотов В.П., Иванова Е.А., Галева Н.М.. Фено-генотипические корреляции наследственных миотонических синдромов // Медицинская генетика. Материалы VI-го съезда Российского общества медицинских генетиков 2010. Стр.99.

9. Kurbatov S. A., Fedotov V. P., Ivanova E. A. Genotype-phenotype correlation in cohort of patients with myotonia congenita and frequent CLCN1 gene mutation Arg894* // European journal of Human Genetics. 2011. V. 19. P.426

10. Kurbatov S.A., Fedotov V.P., Ivanova E.A., Galeeva N.M., Polyakov A.V. Genotype - phenotype correlation in cohort of patients with myotonic syndromes II European journal of Human Genetics. 2012. V.20. P.86.

11. Ivanova E., Fedotov V., Kurbatov S., Dadali E., Rudenskaya G., Polyakov A. Frequent CLCN1 gene mutations in patients from Russian Federation (RF) with non -distrophic Thomsen and Becker myotonias // European journal of Human Genetics. 2012. V. 20. P.321.

12. Федотов В.П., Курбатов C.A., Иванова E.A., Галеева Н.М., Поляков А.В. Клинико - электромиографические критерии диагностики наследственных миотонических синдромов // Нервно - мышечные болезни. 2012. №2. С.53 - 64.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА - акриамид

АД - аутосомно-доминантный

АР — аутосомно-рецессивный

БАА - бисакриламид

ВМ - врожденная миотония

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЭМГ - игольчатая электромиография

КЗМ - калий - зависимая миотония

МБ — миотония Беккера

млн.п.н. - миллион пар нуклеотидов

МТ - миотония Томсена

НатМ - натриевая миотония

НДМ - недистрофическая миотония

МЭКВ/Л - милли-грамм-эквивалент на литр

ПААГ - полиакриамидный гель

ПДАФ - полиморфизм длин амплификационных фрагментов

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭ - парамиотония Эйленбурга

сМ - сантиморганида

СС - спорадический случай

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ФГБУ «МГНЦ» РАМН - Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

CLCN1 - chloride channel 1

HGMD - Human Genetic Mutation Database

MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NCBI - National Center for Biotechnology Information

OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man

SCN4A - sodium channel, voltage-gated, type IV, alpha subunit

SNP - Single Nucleotide Polymorphism

TBE - трис-боратный буфер

Заказ № 129-а/04/2013 Подписано в печать 24.04.2013 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таіі:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Иванова, Евгения Андреевна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ФБГУ «МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР» РАМН

04201356192

Иванова Евгения Андреевна

МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕДИСТРОФИЧЕСКИХ

МИОТОНИЙ В РФ

03.02.07 «Генетика» Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор А.В. Поляков

МОСКВА, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................................................6

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................12

1.1 КЛАССИФИКАЦИЯ НЕДИСТРОФИЧЕСКИХ МИОТОНИЙ..................................................................12

1.2 НЕДИСТРОФИЧЕСКИЕ МИОТОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ПАТОЛОГИЕЙ ХЛОРНОГО ИОННОГО КАНАЛА С1.С-1.........................................................................................................................................14

1.3 НЕДИСТРОФИЧЕСКИЕ МИОТОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ПАТОЛОГИЕЙ НАТРИЕВОГО ИОННОГО КАНАЛА 14эу1.4......................................................................................................................................17

1.4 ДИАГНОСТИКА НДМ.........................................................................................................................19

1.5 СТРОЕНИЕ ХЛОРНОГО КАНАЛА С1.С-1..............................................................................................21

1.6 СТРУКТУРА И СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА 0.041.................................................................................24

1.7 СТРОЕНИЕ НАТРИЕВОГО ИОННОГО КАНАЛА 1ЧАУ1.4.....................................................................28

1.8 СТРУКТУРА И СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА БС144А................................................................................29

II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................................................................35

11.1 МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................................................................................35

11.2 ЭЛЕКТРОМИОГРАФИЯ.....................................................................................................................36

11.3 ЗАБОР ВЕНОЗНОЙ КРОВИ................................................................................................................37

11.4 ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК ИЗ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ.....................................................................37

11.5 ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)....................................................................................37

11.6 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ...................................................................................................................38

11.6 ПРЯМОЕ АВТОМАТИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ..........................................................................38

11.8 ПДРФ-АНАЛИЗ...............................................................................................................................40

11.9 МУЛЬТИПЛЕКСНОЕ ПРОБА-СПЕЦИФИЧНОЕ ЛИГИРОВАНИЕ.....................................................40

11.10 АНАЛИЗ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ..........................................................................................45

11.11 МЕТОДЫ СТАТИСТИКИ..................................................................................................................46

11.12 АНАЛИЗ НЕРАВНОВЕСИЯ ПО СЦЕПЛЕНИЮ..................................................................................46

III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...............................................................................................................49

N1.1 АЛГОРИТМ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................................................................49

111.2 СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА 0.041......................................................................................................52

N1.3 ЧАСТЫЕ МУТАЦИИ ГЕНА С1.С1\11.....................................................................................................62

N1.4 СООТНОШЕНИЕ МТ И МБ В ИССЛЕДОВАННОЙ ВЫБОРКЕ...........................................................65

N1.5 ПОПУЛЯЦИОННОЕ ИССЛЕДОВАНИИЕ ЧАСТОТЫ МУТАЦИИ С.2680С>Т (Р.А1^894*) В ГЕНЕ С1-041......................................................................................................................................................73

111.6 АНАЛИЗ НЕРАВНОВЕСИЯ ПО СЦЕПЛЕНИЮ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГАПЛОТИПА «ОСНОВАТЕЛЯ»........80

111.7 СЛУЧАИ ХЛОРНЫХ МИОТОНИЙ С ОДНОЙ ВЫЯВЛЕННОЙ МУТАЦИЕЙ.......................................87

111.8 СПЕКТР МУТАЦИЙ ГЕНА SCN4A......................................................................................................89

111.9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОЛЕЙ «ХЛОРНЫХ» И «НАТРИЕВЫХ» МИОТОНИЙ В СТРУКТУРЕ НДМ...........96

111.10 АЛГОРИТМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ НДМ........................................97

IV ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................................................................101

V ВЫВОДЫ................................................................................................................................................104

VI СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.............................................................................106

VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................108

У- 5

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АА - акриамид

АД - аутосомно-доминантный

АР - аутосомно-рецессивный

БАА - бисакриламид

ВМ - врожденная миотония

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЭМГ - игольчатая электромиография

КЗМ - калий - зависимая миотония

МБ - миотония Беккера

млн.п.н. - миллион пар нуклеотидов

МТ - миотония Томсена

НатМ - натриевая миотония

НДМ - недистрофическая миотония

МЭКВ/Л - милли-грамм-эквивалент на литр

ПААГ - полиакриамидный гель

ПДАФ - полиморфизм длин амплификационных фрагментов

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭ - парамиотония Эйленбурга

сМ - сантиморганида

СС - спорадический случай

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ФГБУ МГНЦ РАМН - Федеральное государственное бюджетное учреждение Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

CLCN1 - chloride channel 1

HGMD - Human Genetic Mutation Database

MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NCBI - National Center for Biotechnology Information

OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man

SCN4A - sodium channel, voltage-gated, type IV, alpha subunit

SNP - Single Nucleotide Polymorphism

TBE - трис-боратный буфер

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Недистрофические миотонии (НДМ) - группа заболеваний, ведущим симптомом которых является феномен миотонии, они относятся к группе мышечных каналопатий. Миотония составляет симптомокомплекс некоторых наследственных нервно-мышечных патологий (миотоническая дистрофия тип 1 и 2, пароксизмальная миоплегия, синдром Шварца - Джампела) или является ведущим симптомом при миотониях Томсена (МТ) и Беккера (МБ), парамиотонии Эйленбурга (ПЭ), гиперкалиемическом параличе с миотонией (ГиперКП) и калий-зависимой миотонии (КЗМ). Последняя группа заболеваний отличается от вышеприведенных и этипатогенезом, и отсутствием дистрофического паттерна в клинической картине. Отсюда и возникла тенденция разделить все миотонические синдромы на дистрофические (ДМ) и недистрофические (НДМ).

Недистрофические миотонии представляют собой гетерогенную клинически полиморфную группу заболеваний, причиной которых являются мутации в генах ионных каналов хлорного и натриевого - СЬСЫ1 и Б СN4А. Фенотипы больных различными формами НДМ перекрываются и варьируют как среди пациентов с определенным типом НДМ, так и внутри одной семьи. На этапе клинического осмотра трудно отличить МТ и МБ между собой. Реже, но, тем не менее, затруднена дифференциальная диагностика ПЭ, ГиперКП и КЗМ друг от друга. Тяжелее всего в спорадических случаях с фенотипом МТ предположить ген, мутации в котором вызывают проявления заболевания. Зачастую, верным шагом диагностики является поиск мутаций в гене СЬСЫ1, но в некоторых случаях этого недостаточно для подтверждения диагноза. Только после молекулярно-генетического анализа гена 8СИ4А можно выявить истинную причину заболевания.

Молекулярно-генетический анализ генов ионных каналов всегда представляет собой довольно трудоемкий и длительный процесс. Это обусловлено большим размером анализируемых генов и широким разнообразием мутаций, распределенных, как правило, по всей кодирующей последовательности данных

генов. Так и в случае НДМ, причинами заболеваний являются мутации генов, кодирующих хлорные и натриевые ионные каналы скелетных мышц. Спектры мутаций этих генов представлены подавляющим числом миссенс - замен, наряду с относительно небольшим числом других типов мутаций. Это затрудняет ещё и трактовку результатов исследования: не всегда очевиден эффект миссенс - замены для конкретного больного, особенно в изолированных случаях, когда сегрегационный анализ невозможен. По этим причинам молекулярно-генетический анализ генов CLCN1 и SCN4A для пациентов с различными НДМ следует проводить в больших группах пациентов, в которых хорошо представлены различные фенотипы и доступен материал родственников пробанда для проведения сегрегационного анализа. Не менее информативными остаются и описания больших семей с внутрисемейным клиническим полиморфизмом.

Актуальным является проведение подобных исследований для каждой страны, так как в различных регионах наблюдается накопление характерных частых мутаций гена CLCN1 и подтверждается выявление «горячих» экзонов гена SCN4A, что увеличивает эффективность поиска мутаций в каждом из генов.

В связи с тем, что долгое время врожденная миотония не признавалась как отдельная нозологическая форма и описана сравнительно недавно (1976 год), молекулярно-генетические методы недоступны для внедрения в диагностический процесс, оценка частоты распространенности недистрофических миотоний на данный момент очень приблизительна. Частота миотонии Томсена в Европе ранее оценивалась как 1:23 ООО человек, а миотонии Беккера - 1:50 ООО [Becker 1977]. С появлением и развитием молекулярно-генетических методов стало понятно, что частота миотонии Томсена гораздо более низкая, чем предполагалось ранее. В одних семьях, где ранее предполагался доминантный тип наследования, установлен псевдодоминантный, и их стали относить к случаям миотонии Беккера; в других - выявлены мутации в гене, кодирующем натриевые ионные каналы скелетных мышц - их стали причислять к другим формам НДМ. Следовательно, и частота миотонии Беккера должна быть значительно выше, чем её оценивали ранее, но точных данных по этому поводу нет. Самой частой врожденная миотония

(ВМ), как ранее назывались миотонии Томсена и Беккера, является в странах Скандинавии -1:10 ООО [Sun et al. 200J].

Очевидно, что с появлением возможности подтвердить клинический диагноз молекулярно-генетическими методами появилась возможность разработки эффективного алгоритма молекулярно-генетической диагностики на основе частот встречаемости различных форм НДМ с целью оптимизировать использование дорогостоящих молекулярно-генетических методов, уточнить диагностические критерии, по которым можно поставить верный предварительный диагноз и тип наследования миотонии в данной семье.

На сегодняшний день исследований с участием больших групп пациентов с диагнозом недистрофической миотонии в России не проводилось, не разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики миотоний и в русскоязычной литературе упоминания о миотонии довольно скудные. Распространенность оценивается не более 3-5 случаев на 100 ООО [Гузеева 2009]. Соответственно, на данном этапе недистрофические миотонии в России являются малоизученными нозологическими формами.

Цель

Целью настоящего исследования является создание эффективного алгоритма молекулярно-генетической диагностики для пациентов с различными формами недистрофических миотоний.

Задачи

1. Провести поиск мутаций генов СЬСЫ1 и БСША в выборке неродственных пациентов с недистрофическими миотониями, проживающих на территории РФ, описать спектр выявленных изменений;

2. Выявить особенности спектров мутаций генов СЬСЫ1 и БСЫ4А , исследовать возможные причины распространения повторяющихся мутаций генов СЬСЫ! и БСМА-,

3. Определить доли хлорных и натриевых миотоний среди пациентов с недистрофическими миотониями;

4. Определить расчетную частоту встречаемости миотонии Томсена и миотонии Беккера на территории РФ;

5. Разработать эффективный алгоритм молекулярно-генетической диагностики для пациентов с недистрофическими миотониями.

Научная новизна

Впервые в России проведен молекулярно-генетический анализ генов СЬСИ1 и БСША, задействованных в патогенезе не дистрофических миотоний, описан спектр мутаций в них.

В гене СЬСИ1 выявлено 18 ранее неописанных мутаций. Впервые определены частые мутации гена СЬСЫ1 у пациентов РФ (замены р.С1у1908ег, с.1437_145(Ме1, р.А1а493С1и, р.ТЬг550Ме1, р.Туг686* и р.А^894*, составляющие 59% всех хромосом с мутациями) и разработана эффективная система их выявления.

В гене БСИ4А выявлено 10 различных миссенс мутаций в гетерозиготном состоянии у 14 пациентов, из которых пять мутаций выявлены впервые. Определены «горячие» экзоны гена БСША.

Подсчитаны доли «хлорных» и «натриевых» недистрофических миотоний в структуре миотоний у российских больных, составляющие 82% и 18%, соответственно.

Определена популяционная частота носительства мутации р.А^894* (1,2%) гена СЬСЫ1 и рассчитаны ожидаемые частоты миотонии Томсена (1:710) и миотонии Беккера (1:8165) на территории РФ. На основе частот встречаемости хлорных и натриевых миотоний, а также особенностей описанного спектра мутаций генов СЬСЫ1 и БСЫ4А разработан алгоритм молекулярно-генетической диагностики для пациентов с НДМ.

Практическая значимость

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики и протоколы ДНК-диагностики различных форм НДМ, что сделало возможным проведение прямой и косвенной диагностики НДМ. Созданы эффективные диагностические системы для выявления наиболее часто встречающихся мутаций в гене СЬСИ1, ответственном за развитие МТ и МБ, позволяющие оптимизировать и значительно снизить затраты на проведение их молекулярно-генетической диагностики. Результаты проведенного исследования могут быть использованы в практической работе врачей-генетиков и неврологов, работающих в области наследственной патологии нервно - мышечной системы, а также в курсе лекций по клинической генетике на кафедрах генетики медицинских ВУЗов.

Положения, выносимые на защиту

1. Информативность поиска мутаций у пациентов с НДМ в генах CLCN1 и SCN4A составляет 95%. Доли «хлорных» и «натриевых» миотоний в выборке российских больных составляют 82% и 18% соответственно.

2. Частыми мутациями в гене CLCN1 являются: замены p.Glyl90Ser, p.Ala493Glu, p.Thr550Met, p.Tyr686*, p.Arg894* и делеция c,1437_1450dell4, которые составляют 59% всех хромосом с мутациями. Разработана эффективная система их детекции. Хотя бы одна из частых мутаций встретилась хотя бы на одной хромосоме в 73% случаев хлорных миотоний и в 60% всех подтвержденных случаев НДМ.

3. Популяционная частота мутации с.2680С>Т (p.Arg894*) в гене CLCN1 составляет 1,2% (95%ДИ = 0,6% - 2%). Причиной высокой популяционной частоты мутации с.2680С>Т (p.Arg894*) гена CLCN1 является эффект «основателя».

4. Расчетная частота миотонии Беккера и миотонии Томсена на территории РФ равна 1:710 (95%ДИ = 1/5000 - 1/145) и 1:8165 (95%ДИ = 1/31746 - 1/26) соответственно. Доли миотоний Томсена и Беккера в выборке пациентов с НДМ равны 8% и 92% соответственно.

5. Экзоны 12, 13 и 22 гена SCN4A являются «горячими», мутации в них обуславливают 79% случаев натриевых миотоний.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы отражены в 10 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук. Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков 2010; международном семинаре по исследованию наследственных каналопатий в Беатенберге, Швейцария 2010; на II и III Всероссийских конференциях по редким заболеваниям и редко применяемым медицинским технологиям "ДОРОГА ЖИЗНИ" 2011, 2012; на конкурсе молодых ученых в МГНЦ РАМН в 2009 и 2012, на конференциях European Human Genetics Conference 2009, 2010, 2011, 2012.

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ LI КЛАССИФИКАЦИЯ НЕДИСТРОФИЧЕСКИХМИОТОНИЙ

Миотония (myotonia; греч. mys, my[os] - мышца + tonos - напряжение) -состояние повышенного возбуждения поперечнополосатых мышц, которое приводит к их замедленной релаксации после произвольного сокращения или механической стимуляции. Миотония составляет симптомокомплекс некоторых наследственных нервно-мышечных патологий (миотоническая дистрофия тип 1 и 2, пароксизмальная миоплегия, синдром Шварца - Джампела) или является ведущим симптомом при миотониях Томсена (МТ) и Беккера (МБ), парамиотонии Эйленбурга (ПЭ), калий-зависимой миотонии (КЗМ). Последняя группа заболеваний отличается от вышеприведенных и этиопатогенезом, и отсутствием дистрофического паттерна в клинической картине. Отсюда и возникла тенденция разделить все миотонические синдромы на дистрофические (ДМ) и недистрофические (НДМ).

Недистрофические миотонии (НДМ) - группа заболеваний, ведущим симптомом которых является феномен миотонии, они относятся к группе мышечных каналопатий. Каналопатии - обширная группа заболеваний, характеризующаяся патологией ионных каналов различных тканей организма. Ионные каналы скелетных мышц принадлежат к семейству потенциал-зависимых ионных каналов, которые регулируют возбудимость сарколеммы. Мышечные каналопатии характеризуются гипервозбудимостью сарколеммы (миотония), гиповозбудимостью (парезы и параличи) или их сочетанием. Состояние сарколеммы - критерий, с помощью которого можно охарактеризовать и разделить недистрофические миотонии на клинико-генетические формы (рис.1). Приведенная ниже классификация основана на различии в причинах возникновения миотоний, а именно, на том, какие генетические изменения приводят к фенотипу миотонии.

НЕДИСТРОФИЧЕСКИЕ МИОТОНИИ

МИОТОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ МИОТОНИИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ

ПАТОЛОГИЕЙ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ ПАТОЛОГИЕЙ ХЛОРНЫХ КАНАЛОВ

(НАТРИЕВЫЕ МИОТОНИИ) (ХЛ