Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная идентификация генетических мишеней
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярная идентификация генетических мишеней"
На правах рукописи
КУЗНЕЦОВ Борис Борисович
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МИШЕНЕЙ
03 00 03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 3 МАР 2008
003165232
Работа выполнена в Центре «Биоинженерия» РАН
Научный руководитель
академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор,
Скрябин Константин Георгиевич
Официальные оппоненты
доктор биологических наук, профессор
доктор биологических наук, доцент Ведущая организация
Аграновский Алексей Анатольевич
Кочиева Алена Зауровна
ФГУП Г НИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Защита состоится Q-3 2008 г в_часов на заседании совета Д 501 001 76
по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете им M В Ломоносова, по адресу 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им А H Белозерского
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им M В Ломоносова
Автореферат разослан « 231 02. 20081
Ученый секретарь совета, кандидат биологических наук Крашенинников И А
На правах рукописи
КУЗНЕЦОВ Борис Борисович
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МИШЕНЕЙ
03 00 03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Раоом выло тема й Петре ^Ьй.. инженерия» РАН
Научный р* кчвод п и, 1ь.
акллсмиь Р.АСХН докюр биитогичсскях нлуч профессор,
Скрябин Комо днтин I еоргиегшч
Официальные оппоиииьг
юктор &иочопгчес»их ндч-к, профессор
10Я10Р бИОЮ!ичеекмк H-t.ii, ДОЦСН1
Ведущая организация.
\1 ряиовосин Чльксей Лнямыьскич
Кочиева Алена 5ауроина
Ф1 \ Я 1 Н.Ш Гелмики и «.слекшш нромшгдекны* кшхраоргшптюь
За.дша и«юдк'я _»____/008 г в_чз^о5) на мсе ¡¿рам еоас*а Д 5<Н <>01 76
по защите докгорекчч и кандидатских диссерыыш при Мои-овс* ом ! оо, дарлъышом ункверситгго МВ Лом щеюочл по адресу 1199^2, ГСП 2 Мооы?а. Ле:.ннс*ис гмры М1 У, НИИ фя'иго-химичссчо'ч оечхьняи и у А И Бело*ерокою
С ^и^серы'шеа можно о лакомя Пул я Лштиохехе Ьиотог*исе"ого флкульге-а МГ> им М В Ломоносова
Лв-ороф<.раг разосрач с__»_20С8
Ученый сек зе~арь соьегз КаНПИТИ б'ЮЯОГИЧесКИЧ.
К ташенинникой И Л
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы Применение методов молекулярного маркирования объектов исследования позволяет существенно повысить точность и достоверность классификационных построений в биологии Это очень хорошо заметно на примере микробиологических исследований Наряду с классическими биохимическими методами (определение состава жирных кислот, сравнительное исследование профилей экспрессируемых белков и проч ), в последнее время широко применяются методы, основанные на анализе разнообразных ДНК-маркеров Самым типичным молекулярным маркером является ген, кодирующий малую субъединицу рибосомной РНК - 168 рДНК у прокариотических организмов, по в то же время для филогенетических построений у прокариот все чаще используют и альтернативные маркеры на основе последовательностей некоторых функциональных генов, а также фингерпринтинг Методы фингерпринтинга и анализа сходства конкретных последовательностей не исключают, а взаимно дополняют друг друга - методы сравнительного анализа конкретных последовательностей недостаточно достоверно работают на внутривидовом уровне, а методы фингерпринтинга - на межвидовом
При окончательном выборе конкретного молекулярного маркера в качестве инструмента исследования в первую очередь учитываются вопросы доступности технологических ресурсов и стоимости получаемых данных Следует оговориться, что это не всегда возможно Так, например, для описания нового вида прокариот необходимым является проведение анализа первичной нуклеотидной последовательности генов, кодирующих 168 рРНК, и этот молекулярный маркер, согласно решению Международного таксономического комитета, не может быть заменен никаким альтернативным, хотя при окончательном решении вопроса о таксономической принадлежности нового организма в спорных случаях во внимание могут быть приняты и данные геномного фингерпринтинга, и данные по другим альтернативным молекулярным маркерам
Помимо широкого применения в области фундаментальной науки, методы молекулярного маркирования имеют и вполне конкретную практическую востребованность К примеру, известный метод установления отцовства/материнства, основанный на применении ПЦР для одновременного выявления молекулярных маркеров, относящихся к десятку и более генетических локусов Точность этого метода настолько высока, что он используется практически во всем мире Методы экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, широко применяемые в медицинской практике, также основаны на использовании молекулярных маркеров, в данном случае высокоспецифичных но отношению к конкретным мишеням - уникальным участкам геномной ДНК патогенных микроорганизмов определенной штаммовой и видовой принадлежности Не менее актуальной в настоящее время является проблема идентификации конкретных генно-инженерных модификаций в растительном сырье и полученных на его основе продуктах питания Только высокоспецифичные молекулярные
маркеры способны различать абсолютно одинаковые по всем остальным параметрам (в том числе и по уровню экспрессии чужеродного белка) тинии трансгенных растений и только их применение позволяет отделять проверенные на биобезопасность разрешенные линии трансгенных растений от трансформационных событий, не прошедших столь подробную проверку и не допущенных к практическому применению Так, в 2000 год)' в США произошло случайное попадание кормовой кукурузы StarLink в пищевые продукты, а в 2005 году на поля по ошибке была выпущена трансгенная кукуруза несертифицированной линии BtlO вместо разрешенной к применению линии Btll Убытки из-за этих ошибок превысили миллиард долларов (Maciiwam, 2005)
Цель и задачи исследования Целью данной работы являлась разработка и практическое применение системы молекулярных маркеров, позволяющей проводить выявление и идентификацию генетических мишеней разного уровня специфичности, от конкретной нуклеотидной последовательности до генома в целом
Конкретные задачи исследования состояли в следующем
1 Ра ¡работка универсального метода выделения ПЦР-пригодной ДНК
2 Молекулярная идентификация эубактерий при помощи маркера 16S рДНК
3 Разработка праймерной системы для выявления 1енов 16S рДНК у максимально широкого спектра архей
4 Разработка универсальных праймерных систем для выявления функциональных генов rufН и cbbL
5 Разработка метода DIR-ПЦР для интегрального сравнения геномов прокариот и его применение для создания молекулярных маркеров различного уровня специфичности
6 Разработка качественных и количественных методов выявления и идентификации теистически модифицированных источником растительного происхождения
Научная новизна работы Разработан унифицированный подход к выделению ПЦР-пригодной ДНК, на основе которого были предложены методы выделения ДНК из пищевых продуктов разной степени процессированности и из бактериальных сообществ, обитающих в различных типах почв
Разработана система праймеров для выявления генов 16S рДНК у максимально широкого спектра архей и показана ее эффективность на примере молекулярно-экологического исследования микробного сообщества бактериальных обрастаний арагонитовых коралловидных
Разработаны универсальные системы праймеров для выявления функциональных генов mftf и cbbZ. у бактерий различных таксономических групп, в том числе и в составе сообществ Использование генов nifН и cbbL в качестве молекулярных маркеров позволило подтвердить обособленное таксономическое положение бактерий семейства Oscillochlorulaceae
о
Разработан метод DIR-ПЦР для интегрального сравнения геномов прокариот и создания молекулярных маркеров различного уровня специфичности, сцепленных с заданными диагностическими признаками бактерий Практическая значимость работы
Разработаны специфичные ПЦР-маркеры для идентификации
- штаммов A tumefaciens, используемых при трансформации растений, на основе которого предложен метод выявления присутствия этих бактерий в растительном материале,
- бактерий вида X campestris, который может быть использован для проверки семян сельскохозяйственных растений при проведении санитарного контроля,
- штаммов В thuringiemis, обладающих генами cryl, кодирующими токсины против насекомых отряда Lepidoptera
Разработана система молекулярных маркеров, специфичного для вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК), применение которой позволит избежать ложнопочожительного определения ГМИ в продуктах питания
Разработаны и утверждены для практического применения тест-системы для количественного определения содержания ГМИ в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом ПЦР в режиме реального времени для пяти трансформационных событий RR40-3-2, MON8IO, NK603, Т25 и GA21 Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 30 российских и международных конференциях
Пубчикадии По теме диссертации опубликованы 35 статей, 30 материалов конференций, 8 методических рекомендаций, 2 патента
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 172 страницах машинописного текста и включают 51 рис>нок и 12 таблиц Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы», который содержит 35 отечественных и 184 иностранных наименований
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектами исследования являлись образцы различных типов почв, предоставленные Институтом микробиологии им С Н Виноградского РАН
Пробы бактериальных обрастаний, отобранные с коралловидных построек, получены в 45 рейсе НИС «Профессор Водяницкий» при тралении в районе метановых сипов (44°46'680 сш и 31°58'970 вд) на глубине 180-190 м и были предоставлены Институтом микробиологии им С Н Виноградского РАН
Штаммы Oscülochloris trichoides DG-6, Oscillochloris sp R, Oscillochloris sp C6, Oscillochloris sp BM и Oscillochloris sp AI9 были получены из коллекции кафедры микробиологии МГУ им М В Ломоносова
Типовой штамм Desiilfotomaculum kuznetsovu 17т (ВКМ Б-1805, DSM 6115) был предоставлен Институтом микробиологии им С Н Виноградского РАН
Лабораторные штаммы A tumefaciens (ЕНА105, AGLO, LBA4044, GV3101), используемые для агробактериальной трансформации растений в Центре «Биоинженерия» РАН, были получены из коллекции группы трансформации растений Полевые изоляты опухолеобразующих бактериальных штаммов (AI, А6, А22, А38, А42, А44, А46, А47, А67, А94, Al89, А215, А436, 1223, Aî, А64) были получены из котлекции Всероссийского института фитопатологии (Голицыно, Московская область) Все штаммы были проверены на способность образовывать корончатые галлы на ломтиках моркови
В работе были использованы штаммы Bacillus thurmgiensis из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (BKI1M) и коллекции Центра «Биоинженерия» РАН, а также референтные штаммы В thurmgiensis 4Q281, В cereus NCTC 9620, В cereus В-16, В mycoides АТСС 10206 из коллекции Центра «Биоинженерия» РАН
Трансгенная соя RR40-3-2, устойчивая к гербициду глифосату, была получена от фирмы Монсанто Ко (США)
Образцы различных мясных, молочных, кондитерских и других продуктов были поч\чены из различных супермаркетов г Москвы
Выделение ДНК В основе предлагаемого нами унифицированного метода выделения ДНК из бактерий, различных пищевых продуктов и типов почв лежит модифицированная методика щелочной экстракции (Birnboim & Doly, 1979) и Wizard-технологии фирмы Promega (США)
Выбор праймеров. Разработку праймерных систем для выявления генов 16S рДНК у максимально широкого спектра архей, а также функциональных генов nijH и cbbL создавали базы консенсусных последовательностей, которые использовали для поиска в них консервативных участков с помощью программы Consens (Марусина, неопу бликованные данные)
ПНР Для амплификации фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, были использованы разработанные ранее системы праймеров и протоколы проведения реакции (Lane, 1991) Амплификацию фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК широкого спектра архей, проводили с использованием разрабо ганпых нами праймеров (Колганова и др , 2002) A8F 5'-TCCGGTTGATCCTGCCGG-3' A1041R 5-GGCCATGCACCWCCTCTC-3' Объем амллификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав IX буфер ДНК полимеразы (17 мМ (NHO2SO4, 67 мМ Трис-HCl, pH 8 8, 2 мМ MgCl2), по 6 25 нмоль каждого из dNTP, 30-100 нг ДНК-матрицы, по 2 5 пмолъ каждого праймера, 2 5 ед ДНК полимеразы SraarTaq (Диалат ЛТД, Россия)
Температурно-временной профиль был следующим первый цикл - 94°С х 2 мин, 58°С х 2 мин, 72°С х 1 мин, последующие 30 циклов - 94 °С X 30 с, 58°С X 30 с, 72 °С X 1 мин, окончательная полимеризация - 72°С х 7 мин
Для амплификации фрагментов генов, кодирующих 18S рРНК, были использованы разработанные ранее системы праймеров и протоколы проведения реакции (White et al, 1990)
Амплификацию фрагментов генов mffr[ проводили с использованием сконструированных нами праймеров (Марусина и др , 2001) FI 5'-TAYGGIAARGGIGGlATlGGIAARTC-3'
R6 5'-GCCATCATYTCICCIGA -3 Объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав буфер ДНК полимеразы (67мМ Трис-HCl, рН 8,8, 17 мМ (NH4)2S04), 1,5 мМ MgCl2, по 5 нмоль каждого из dNTP, по 6 25 пмоль прямого и обратного праймеров, 20-50 нг ДНК-матрицы, 1,25 ед ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия) Температурно-временной профиль ПЦР первый цикл - 94°С х 3 мин, 50°С х 3 мин, 72°С х 3 мин, последующие 5 циклов - 94°С х 30 с, 50°С х 2 мин, 72°С х 30 с, последние 30 циклов - 94°С х 30 с, 40°С х 30 с, 72°С х 30 с, завершающий цикл - 72°С х 7 мин
Амплификацию фрагментов генов cbbL «красного» типа проводили с использованием сконстр} ироваштых праймеров (Спиридонова и др , 2004) RublrF 5"-GCVACCTGGACSGTSGTVTGG-3\ RublrR 5 -TCGCCYTCS AGCTTGCCSAC-3", RubIr892R 54-TCTTCTGSCGSGTRTAGGTSSMRl GRCC-3" Для пары праймеров RublrF-RublrR объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав буфер ДНК полимеразы (17 мМ (NKthSO^ 67 мМ трис-HCl, рН 8 8, 4 мМ MgCb), по 6 25 нмоль каждого из dNTP, 17 5 нг ДНК-матрицы, по 3 9 пмоль каждого праймера и 1 5 ед ДНК полимеразы BioTaq Температурно-временной профиль ТЩР первый цикл - 94°С \ 3 мин, 66°С х 1 мин, 72°С х 1 мин, последующие 7 циклов -94°С х 30 с, 66°С х 20 с, 72°С х 45 с, последние 28 циклов - 94°С х 30 с, 55°С х 30 с, 72°С х 30 с, завершающий цикл - 72°С х 7 мин Для пары праймеров RubIrF-RubIr892R объем и состав амплификационной смеси был таким же за исключением MgCh концентрация которого составляла 2 мМ Температурно-временной профиль ПЦР первый цикл - 94°С х 3 мин, 60°С х 30 с, 72°С х 30 с, последующие 35 циклов - 94°С х 30 с, 60°С х 30 с, 72°С х 30 с, завершающий цикл - 72°С х 7 мин
ПНР-фингерпринтинг DIR-ПЦР проводили с использованием следующих праймеров (Tsygankova et al, 2004)
KRP2 5'-CAGGAAGAAG-3\ KRP8 5'-GAAGTTCAGG-3' KRP10 5 '-CTTCAAGGTT-3 ' Объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав 1 х буфер полимеразы BioTaq (17 мМ (NH4)S04, 67 мМ трис-HCl, рН 8 8, б мМ MgCl2), по 5 нмоль каждого из четырех дезокситрифосфатов, 50 нг ДНК-матрицы, по 12 5 пмоль каждого праймера и 1 25 ед BioTaq DNA Polymerase ("Диалат ЛТД", Россия) Температурно-временной профиль первичная денатурация - 94°С х 3 мин, последующие 35 циклов -94°С х 30 с, 37°С х 40 с и 72°С х 1 мин, и завершающий цикл - 72°С х 7 мин
Амплификацию целевого фрагмента гена, кодирующего капсидный белок ВМЦК, проводили с использованием разработанных нами праймеров Cf 5" -TG АТСТААС СТСТСТА С CTA G - 3' Cr 5~ -GCGGTTCCATCTTGTATTTCGG-3V
Амплификацию целевых фрагментов гена, кодирующего обратную траскриптазу ВМЦК, проводили с использованием разработанных нами праймеров 3750f 5 -CTTCACTGTTTCGTAGACACGG-34 3864f 5Ч -AGCTCAATCACCATCAGCAAAG-3" 4358r 5 -GTCGCTGAGCTTGATAGAAC.C-3' 4463г 5-GGGCTTGATGACTTTTAGGTCC-3'
Для амплификации целевых фрагментов промотора S35 ВМЦК использовати следующие праймеры (Hubner et al ,2001) 35SF 5~-GCTCCTACAAATGCCATCA-3s
35SR 5" -GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3' Объем амппификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав IX буфер ДНК полимеразы (17 мМ (NH4)2S04, 67 мМ трис-HCl, pH 8 8, 2 мМ MgCl2), по 6 25 нмоль каждого из dNTP, 30-100 нг ДНК-матрицы, по 6 25 нмоль каждого прайчера, 1 5 ед ДНК полимеразы SmarTaq (Диалат ЛТД, Россия)
Температурно-временной профиль ПЦР был следующим первый цикл — 94°С X 3 мин, последующие 30 циклов - 94°С х 30 с, 57 0°С х 30 с, 72°С X 1 мин, окончательная полимеризация - 72°С х 7 мин
Амплификацию целевых фрагментов геномной ДНК трансгенных растений сои, специфичных для конкретного трансформационного события RR40-3-2, проводили с использованием разработанных праймеров
40F 5"- TTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTT-3~ 40R 5~- GATTTGAATTCAGAACCTTGTGCA-3'
Объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав 1 X буфер ДНК полимеразы (17 мМ (NHj)2S04, 67 мМ трис-HCl, pH 8 8, 2 мМ MgCh), по 12 5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы, по 5 нмоль соответствующих праймеров, 1 5 ед ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия)
Температурно-временной профиль ПЦР был следующим 43 цикла - 94°С X 10 с, 55°С х 10 с, 72°С х 20 с, окончательная полимеризация - 72°С X 7 мин
ПЦР РВ с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green проводили на ДНК-амплификаторе ABI 7000 (Applied Biosystems, США) по следующему протоколу
Объем амплификационной смеси составлял 20 мкл и имел следующий состав IX буфер MasterMix из набора реактивов SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, США), 50 нг ДНК-матрицы, по 100 нмоль соответствующих праймеров
Температурно-временной профиль ПЦР быт следующим инкубация 95°С х 10 мин, затем 43 цикла - 95°С х 15 с, 60°С X 1 мин
ПЦР РВ с использованием гибридизационных зондов TaqMan проводили на ДНК-амплификаторе ABI 7000 (Applied Btosystems, США) по следующему протоколу
Последовательности TaqMan зондов R2 5' -FAM-AACCTGTATGTATGATCTTATT-MGB-3', TRI 5' -FAM-TTTGTAGGAGCCACCTTCC-MGB-3', TR2 5' -FAM-TGGC ATTTGTAGG AGCCACC-MGB -3
Объем амплификационной смеси составлял 20 мкл и имел следующий состав IX буфер MasterMix из набора реактивов TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems, США), 80 нг ДНК-матрицы, по 250 нмоль соответствующих праймеров, 250 нмоль TaqMan зонда
Температурно-временной профиль ПЦР был следующим инкубация 56°С х 2 мин, 95°С х 10 мин, затем 43 цикла - 95°С х 15 с, 60°С х 1 мин
Регистрацию данных проводили при помощи программного обеспечения ABI 7000 SDS Software v 1 0, построение стандартной кривой и количественную оценку содержания ГМ проводили при помощи самостоятельно разработанного программного модуля GM-RT, поскольку данные опции в программном обеспечении прибора не представлены Очистка и клонирование ПЦР-фрагментов. Продукты ПЦР очищали с применением набора реактивов «Wizard PCRPreps» (Promega, США) Клонирование выделенных ПЦР-фрагментов проводили с использованием набора реактивов «pGEM-T Easy Vector System» (Promega, США) в компетентных клетках Escherichia coli DH5a Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили при помощи набора реактивов Wizard MimPrep (Promega, США)
Секвенирование ДНК Секвенирование проводили с использованием набора для циклического секвенирования BigDye Terminator v3 1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США) Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе DNA Analyzer 3730 («Applied Biosystems», США) Клонированные фрагменты исследуемых генов секвенировали с универсальных плазмидных праймеров M13F, M13R26, SP6 и Т7 (Sambrook et al, 1989) Прямое секвенирование ПЦР-фрагментов проводили с использованием соответствующих праймеров
Филогенетический аналнз Первичный сравнительный анализ последовательностей проводили с помощью программы NCBI Blast (http //www nebí nlm nih gov/blast) Редактирование проводили с помощью редактора BioEdit
(http //jwbrown mbio ncsu edu/BioEdit/bioedit html) Выравнивание последовательностей осуществляли с помощью программы CLUSTALWvl75 (Thompson et al, 1994) Построение филогенетических деревьев проводили с использованием различных алгоритмов, реализованных в пакетах программ TREECON W (Van de Peer & De Wächter, 1994) hPHYLIP
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1 Разработка способа выделения ДНК
Задачей данного этапа являлась разработка быстрого и универсального метода выделения ДНК из различных источников, в том числе из пищевых продуктов, особенно из имеющих высокое содержанием жиров или углеводов
1.1. Разработка экспресс-метода выделения ДНК из различных пищевых прод\ктов.
В основе метода лежит модифицированная методика щелочной экстракции. Образцы с повышенным содержанием жиров (>20%) подвергали предварительной обработке хлороформом. Предлагаемая методика была проверена на широком круге пищевых мясных, молочных, кондитерских и других продуктов, в состав которых входили пищевые добавки из сои или кукурузы. Выделение ДНК проводилось из продуктов как с повышенным содержанием жиров (>10%), так и с высоким содержанием углеводов (до 80%), а также из продуктов, подвергавшихся сильной механической и термической обработке: пюре, паштеты, мясные консервы.
Поскольку основным критерием для выбора метода выделеття ДНК является пригодность получаемых препаратов ДНК для проведения ПЦР, все полученные препараты были использованы для амплификации фрагмента генов 185 рДНК. длина которого (около 600 п.н.) заведомо больше требуемой для анализа ГМО (Рис. 1).
м 1 ли тг» к- н ¡'- >' I. I? ;■) ?? м
МП г-os il ?■> n nn îï >-* JW« >? >3« к к ®
—** ':.Г'Я" .reiog, ■ - м» .... «ш'-Х
Рис. 1. Амплификация фрагмента генов 18S рДНК на препаратах ДНК, выделенных из различных пищевых продуктов методом щелочной экстракции
M - маркер молекулярной массы ДНК 100 bp (СибЭнзим, Россия) К- - контрольная ПЦР в отсутствие ДНК-магрицы,
Номера дорожек: 1-38 - ПЦР на препаратах ДНК, полученных из различных образцов пищевых продуктов. Стрелками указано положение целевого фрагмента ( ~ 600 пл.).
Результаты, представленные на рисунке, свидетельствуют о том, что ДНК, выделенная предлагаемым методом, пригодна для ПЦР-анализа: целевой фрагмент был получен для всех испытанных образцов. Это является несомненным преимуществом данной методики, так как при выделении ДНК с помощью коммерческих наборов QIAamp DNA Stool Minikit (QIAgene, США ) и Núcleo Spin Food kit (Macherey-Nagel, США) из
таких продуктов как соевые крекеры и гофу удавалось получать ампликоны длиной только 169 п.н. (Peani et al., 2004).
1.2. Разработка экспресс-метода выделения ДНК из бактериальных сообществ.
Для получения фракции бактериальных клеток использовали четыре буфера. Первый буфер (ТЕ) наиболее часто применяют при выделении ДНК из бактериальных клеток. Второй буфер (фосфатный) способствует десорбции клеток с почвенных частиц. Третий и четвертый буферы представляют собой буфер ТЕ с добавлением PVPP и SDS или СТАВ. Почвы с большим количеством органических веществ содержат гумусовые, гетерогенные по своему составу компоненты, основными единицами которых являются ароматические структуры фенольного типа и азотсодержащие соединения. PVPP и СТАВ с равной эффективностью удаляют такие вещества. Этим обусловлено их использование в двух последних буферах.
В дальнейшем выделение ДНК из бактериальных клеток проводили так же, как и для пищевых образцов. Поскольку основным критерием для выбора метода выделения ДНК является пригодность образцов ДНК для проведения ТТЦР, все полученные препараты были использованы для амплификации как полноразмерных (около 1500 п.н.), так и частичных (около 500 п.н.) фрагметов гена 16S рРНК. Возможность получения полноразмерной ПЦР-копии свидетельствует об относительно низкой степени деградации ДНК в исследуемых препаратах.
В результате проведения амплификации было показано, что препараты ДНК, выделенные через стадию получения бактериальных клеток с применением суспензии PVPP в буфере ТЕ, стабильно пригодны для получения как полноразмерного, так и частичного амштификатов гена 16S рРНК (Рис.2).
А) Г>)
Рис.2. Амплификация фрагментов генов №S ртк на препаратах днк, выделенных спосооом j из бактериальных сообществ различных типов почв, а) - полноразмерный амплификат, б) -частичный амплификат.
М - маркер молекулярной массы ДНК (а - 1 kb, 6-100 bp), (СибЭнзим, Россия) К- - контрольная ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы, К+ - контрольная 1ТЦР на ДНК-матрице E.coli. Фигурными скобками и цифрами отмечены ПЦР на препаратах ДНК, выделенных из: Номера дорожек: 1 -суглинистой пахотной почвы (Жирона, Испания); 2 - суглинистой пахотной почвы (Гистель, Бельгия); 3 -супесчаной пахотной почвы (Беллем, Бельгия); 4 -супесчаной аллювиальной почвы (Стелленбош, ЮАР); S -суглинистой пахотной почвы (Пущино, Моск. обл.); 6 - суглинистой лесной почвы (Жирона, Испания); 7 - тундровой, торфяно-глеевой почвы (Воркута); 8 -торфяной почвы (п. Сосвятское, Тверская обл.); 9 - суглинистой лесной почвы (Пущино, Моск. обл.); 10 - суглинистой луговой почвы (Пущино, Моск. обл.).
Таким образом, было подтверждено, что предлагаемый способ выделения ДНК может быть использован для широкого круга почв, существенно различающихся по своим физико-химическим характеристикам.
2. Молекулярная идентификация эубактерий при помощи маркера 16S рДНК. 2.1. Молекулярная идентификация фототрофных бактерии Oscillochloris trichoides.
В 1989 году российскими учеными был выделен в чистую культуру новый
представитель аноксигепных нитчатых фототрофных бактерий (АНФБ) - штамм DG--6, который был описан как неотиповой штамм Oscillochloris trichoides. Нами впервые были получены и секвенированы фрагменты генов 16S рД11К чтого штамма. По результатам анализа комплекса фетютитгических и генетических свойств нами было предложено выделить род Oscillochloris в новое семейство Oscillochloridaceae, которое было утверждено Международным комитетом по систематике микроорганизмов.
Позднее из разных географических зон были выделены еще несколько штаммов, сходных с DG-6 по фенотипическим и физиолого-биохимическим признакам. Сравнительный анализ последовательностей генов 16S рДНК этих штаммов позволил идентифицировать их как Oscillochloris trichoides (Рис. 3).
LChloroflexus aurantiacus J 10FL ™ Chloroflexus aurantiacus .1-10-il Chloroflexus aurantiacus DSM 637 Chloroflexus aurantiacus DSM 636 Chloroflexus sp. 396-i
Бактерия NPE горячих серных источников Chloroflexus aggregans DSM 9486 Chloroflexus aggregans MD-661 'Chloronema gigantewn' Некультивируемая АНФБ AKYH632
АИФЕ
iooJ Oscillochloris sp. A19 Oscillochloris sp. BM
Oscillochloris trichoides DG-6r Oscillochloridaceae, Oscillochloris sd. r Oscillochloris sp. C6
Candidatus 'Chlorothrix halophila' Roseiflexus castenholzxi Heliothrix oregonensis
Рис. 3. Филогенетическое дерево АНФБ, построенное на основе сравнения последовательностей генов 16S рДНК с использованием алгоритма neighbor-joining. Масштаб показывает! эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами! показана достоверность ветвления 100 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 95%). Жирным подчеркнутым шрифтом выделены последовательности, определенные в данном исследовании.
2 2 Разработка системы праймеров для амплификации и секвенирования фрагментов генов 16S рРНЬС у широкого круга архей
Применение ранее разработанной универсальной системы праймеров, соответствующих наиболее консервативным участкам последовательности гена 16S рРНК (Edwards et al, 1989, Lane, 1991), позволяет ачплифнцировать и секвенировать соответствующие гены бактерий Однако, в случае архен применение этой системы праймеров позволяет амплифицировать ДНК ограниченного круга видов Поэтому задачей данного этапа являлась разработка системы олигонуклеотидных праймеров, позво тяющих избирательно амплифицировать и секвенировать гены 16S рРНК архей
После тщательного анализа выровненных последовательностей генов 16S рРНК архей был создан прямой праймер A8F который вместе с универсальным праймером 1492R (Lane, 1991) использовался для избирательной амплификации наиболее длинного фрагмента последовательности, соответствующего почти полному гену 16S рРНК архей Кроме того, был создан набор внутренних прямых и обратных праймеров, позволяющих избирательно амплифицировать и секвенировать короткие фрагменты, соответствующие различным участкам последовательности гена 16S рРНК архей Последовательности всех вновь сконструированных праймеров приведены в Табл. 1
Табл 1 Система олигонуклеотидных праймеров для избирательной амплификации и секвенирования генов 16S рДНК архей
Праймер Последовательность Позиции по номенклатуре E coli
A8F 5'-TCCGGTTGATCCTGCCGG - 3' 8-25
A517R 5 -GGTRTTACCGCGGCGGCTGAC-3' 537-517
A680F 5 -CCSGGRGTAGGGGYGAAATCC-3' 680-699
A680R 5 -GGATTTCRCCCC1 ACYCCSGG-3' 699-680
A800F 5'-GTAGTCCYGGCYGTAAGC-3' 800-817
A800R 5'-GCTTACRGCCRGGACTAC-3' 817-800
A1041F 5'-GAGAGGAGGTGC MGGCC-3 1041-1058
A1041R 5' -GGCC ATGC ACCTCCrcTC-3 1058-1041
Эффективность разработанной нами системы праймеров была проверена в процессе анализа прокариотных сообществ различного происхождения - накопительной культуры сульфатвосстанавчивающих архей из высокотемпературного нефтяного месторождения (Колганова и др, 2002) и природного микробного сообщества бактериальных обрастаний арагонитовых коралловидных построек, обнаруженных в местах выхода метана в Черном море В результате были определены последовательности 168 рДНК для более 40 представителей архей (Турова и др , 2000, РгокоГеуа е( а1, 2000, Зппапкоуа й а1, 2001, Слободкина и др , 2004, РгокоГеуа « а1, 2005)
3. Использование функциональных генов в качестве молекулярных маркеров
3 1 Разработка универсальной системы тшаймеров для амплификации фрагментов генов nifü у бактерий различных таксономических групп
Задачей данного этапа являлась разработка системы праймеров, позволяющей ампчифицировать фрагменты генов ш/Н, кодирующих Fe-белок молибденовой нитрогеназы, у широкого спектра прокариот
Нами был проведен компьютерный анализ всех имевшихся в электронных базах данных последовательностей генов ш/Н Объем выборки составил 150 последовательностей По результатам анализа нами были сконструированы праймеры F1 и R6, последовательности которых приведены в разделе «Материалы и методы» Использование этих праймеров приводит к амплификации участка гена длиной приблизитечьно 450 п н (Марусина и др , 2001)
Проверка разработанной системы праймеров проводилась на препаратах ДНК, выделенных из бактерий, для которых ранее была продемонстрирована способность к азотофиксации и известна первичная структура генов nifH Anabaena sp РСС 7120 и Sinorhizobium meliloti 201 У исследуемых штаммов были выявлены фрагменты ожидаемой длины, последовательности которых были в значительной степени гомологичны (более 95%) генам nifH штаммов соответствующих видов, ранее депонированным в базу данных GenBank Nostot (Anabaena) sp РСС 7120 (AF012326) и Ensifer (Sinorhizobium) meliloti АТСС 9930 (М55229), подтверждая тем самым, что полученные ГЩР-фрагменты соответствуют i енам nifH
Эффективность разработанной нами системы праймеров была проверена на широком круге азотфиксирующих бактерий, относящихся к разшгчным таксономическим группам В результате были опредетены последовательности фрагментов генов nifH для более 50 штаммов бактерий (Марусина и др , 2001, Булыгина и др , 2002, Заварзина и др, 2006, Слободова, 2006, Слободова и др , 2006, Турова и др , 2006, Дорошенко и др , 2007, Sizova et al, 2007)
3 2 Разработка универсальной системы праймеров для амплификации фрагментов генов cbbL у бактерий различных таксономических групп
Задачей данного этапа являлась разработка системы праймеров, позволяющей амплифицировать фрагменты генов cbbL, кодирующих большую субъединицу РБФК формы I, у широкого спектра бактерий
Нами был проведен компьютерный анализ всех имевшихся в электронных базах данных последовательностей генов cbbL Были учтены данные по 40 последовательностям генов cbbL «зеленого типа», и 39 - «красного» типа
По результатам анализа степени консервативности различных районов консенсусной последовательности для генов cbbL «зеленого» типа, были сконструированы праймеры, приведенные в разделе «Материалы и методы» Схема расположения праймеров показана на рисунке 4 Проверка разработанной системы
праймеров проводилась на препаратах ДНК, выделенных из бактерий, для которых ранее была продемонстрирована способность к фиксации СО2 через цикл Кальвина и известна первичная структура генов cfc£>L: A. ferrooxidans TFY, Rh. sphaeruides 2R и SulfobaciUus aciduphilus NAL.
- 800 п.н.
- 800 п.н.
it=1ffl=» ..........................l- l................НИК
Рис. I. Схема расположения праймеров для амплификации фрагментов генов cbbL\ а) «зеленого» типа: б) «красного» типа. Консервативные участки консенсусных последовательностей генов cbbL обоих типов показаны прямоугольниками. Консервативные участки, использованные для конструирования праймеров, покачаны черными прямоугольниками. Стрелками отмечены положение праймеров.
Также проверка эффективности разработанной нами системы праймеров была проведена на широком круге автотрофных бактерий, относящихся к различным таксономическим группам, в результате были определены последовательности фрагментов генов ebbh для более 60 штаммов бактерий (Спиридонова и др., 2004; Турова и др., 2005; Sorokin et al„ 2005; Турова и др., 2006; Tourova et al., 2006; Sorokin et al., 2006 a, b; Дульцева и др., 2006; Дорошенко и др., 2007; Sizova et al., 2007). 4. Разработка метода DIR-ПЦР.
Применение методов геномного фингерпринтинга позволяет существенно удешевить и ускорить процесс сравнения целых геномов и поиск молекулярных маркеров разного уровня специфичности. Разработанные к настоящему моменту методы геномного фингерпринтинга обладают разной степенью точности и степень информативности получаемых с их помощью данных зависят от представленности в геноме нуклеотидных последовательностей, служащих мишенью для праймерных систем. Предлагаемый нами метод отвечает критериям приемлемости, выдвинутым Комитетом в отношении новых методов, основанных на ПЦР-технологиях — воспроизводимость в различных условиях, возможность математической обработки и повышенная информативность.
На основе анализа полных геномов нами с помощью оригинального программного обеспечения были обнаружены последовательности дивергировавших инвертированных повторов (diverged inverted repeats или DIR). На основе таких повторов были сконструированы праймеры для проведения DIR-ПЦР. Поскольку выбранные последовательности равномерно встречаются на протяжении всего генома, использование
их в качестве праймеров приводит к амплификации случайно распределенных его участков, преимущественно высокополиморфных межгенных областей. В результате проводится анализ полиморфизма практически всего генома и, следовательно, повышается разрешающая способность метода. Это является основным отличием эволюционно дивергировавших 01Г{-повторов от ранее предложенных повторяющихся межгенных последовательностей.
4.1. Разработка молекулярного маркера, специфичного для группы галлообразующих бактерий АягоЬаМепит ЫтеТаЫепа.
Задачей данного этапа работы являлась разработка ПЦР-маркера, специфичного для штаммов А%гоЪас1егшт Ште/ас1епх, используемых для трансформации растений, проверка его специфичности внутри группы ЯЫгоЬшт/А^гоЬааег'шт, а также разработкг! метода выявления присутствия этих бактерий в растительном материале.
С использованием разработанных праймеров были получены ДНК-фингерпринты исследуемых штаммов бактерий. Для разработки ЭСАК-праймеров был выбран ПЦР фрагмент ДНК-спектров, полученных с применением праймера КЯРШ, который был общим для всех лабораторных штаммов (Рис. 5).
X 5 й ■гвэ хо ХЖ. Ай АЗ 14 ХС 3.** М
эооо _____1.000
«0«
2 50
Рис. 5. Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов, амплифицированных на препаратах ДНК исследуемых бактерий с использованием праймера КЯРЮ. Стрелкой отмечен общий для лабораторных штаммов фрагмент -700 п.н.
М - маркер молекулярной массы ДНК 1 кЬ (СибЭнзим, Россия), справа указаны размеры основных фрагментов молекулярного маркера; К- - контрольная ПЦР а отсутствие ДНК-матрицы; скобкой отмечена группа лабораторных штаммов А. Ште/ааеп$. Номера дорожек; 1 - Ад., 2 - А64, 3 -ЕНА105, 4 - АСТД 5 - ЬВА4044, 6 - ОУ3101, 7 - А22, 8 - А67. 9 - А189. 10 - А94, 11 - А44,12 -А436, 13 - А38, 14 - А47, 15 - А215, 16 - А46,17 - А6, 18 - А1.
Последовательности разработанных нами ЗСЛЯ-праймеров приведены в разделе «Материалы и методы». Эти праймеры были использованы как основа для разработки метода выявления А. Ште/ас^епя в растительном материале. Результаты проверки специфичности разработанных нами праймеров приведены на рисунке 6.
221 п.н.
Рис. 6. Проверка специфичности разработанных БСАИ-маркеров для детектирования штаммов А. Ште/апепя, используемых при трансформации растений.
Цифрой указана длинна фрагмента; скобкой выделены штаммы А. 1ите/ас1епз, используемые при трансформации.
В результате проведенной работы предложено два варианта метода выявления присутствия А. Шгпе/ас1епх в растительном материале, которые позволят существенно ускорить процесс проведения скрининга первичных растительных трансформантов и повысить его достоверность.
4.2. Разработка молекулярного маркера, специфичного для вида ХапЛотопах сатрехггк.
Бактерии рода ХапЛотопаз поражают, по меньшей мере, 124 однодольных и 268 двудольных видов растений, включая все основные группы растений (Ьеупз е1.а1., 1984). Болезни, вызываемые ксантомонадами, приводят к серьезным экономическим потерям, так как в круг поражаемых ими растений попадают важные сельскохозяйственные культуры: томаты, рис, хлопок, цитрусовые, капуста и многие другие. В связи с этим проблема идентификаци данных патогенов становится все более критичной.
С применением выше описанного подхода нами был разработан специфичный 8САЯ-маркер для выявления бактерий вида X. Сатрезгпз (Tsygaпkova е1 а1., 2004). Этапы этой работы представлены на рисунке 7.
т
А Б
Рис. 7. Разработка молекулярного маркера, специфичного для вида X. сатрешк. А - выявление специфичного фрагмента ЭШ-ПЦР, Б - проверка разработанных 8САК-маркеров. Скобками указаны штаммы видаХ. сатреМга.
Амплификация с предложенными праймерами у всех штаммов X campestris выявила специфическую полосу размером 657 п н У других видов Xanthomonas, а также некоторых представителей патогенных бактерий, включая Pseudomonas sp, Ralstonia solanacearum, Erwima carotovira и Pantoea aglomerance, такая полоса не обнаружена 4 3 Разработка молекулярного маркера для внутривидовой группы бактерий Bacillus thuringiensis, обладающих генами cry!
Характерным признаком бактерий вида В thuringiensis является способность продуцировать комплекс кристаллических белковых токсинов, называемых 8-эндотоксинами или с ^-белками Эти белки проявляют специфичную инсектицидную активность против ряда сельскохозяйственных вредителей и паразитов человека Вследствие высокой специфичности к вредителям, редкости случаев появления приобретенной устойчивости у целевых организмов и безопасности для других групп животных, инсектицидные кристаллические белки являются весьма ценной альтернативой химическим пестицидам (Rowe a Margantis, 1987) Кроме того, клонирование и экспрессия генов, кодирующих 5-эндотоксины (генов cry), в трансгенных растениях или микроорганизмах помогает широко применяется для защиты сельскохозяйственных растений от вредителей (Barton et а!, 1987)
При изоляции новых штаммов инсектопатогенных бактерий важно установить инсектицидную специфичность продуцируемых ими белков Для этой цели, как правило, проводят гибридизацию с зондами для уже известных генов cry в поисках их гомологов (Kronstad a Whiteley, 1986), анализ с использованием моноклональных антител (Hofte et al, 1988) или определение серотипа белковых кристаллов (Kryweinczyk, 1977) К сожалению, эти методы недостаточно точно определяют тип инсектицидной активности, или же слишком дороги и трудоемки /пя повседневного анализа
Задачей данного этапа нашей работы явилось применение метода DIR-ПЦР для поиска маркеров, позволяющих проводить скрининг природных изолятов В thuringiensis, с целью выявления генов cry J Как и в случае с X Campesms работа проводилась по аналогичной схеме выявление специфичного фрагмента с помощью DIR-ПЦР, определение его нуклеотидной последовательности, подбор SCAR-маркеров и оптимизация условий ГГЦР В результате проведенного исследования с помощью разработанного нами метода DIR-ПЦР предложены SCAR-праймеры (F3-R3) для идентификации штаммов В thuringiensis, обладающих генами cryl, кодирующими токсины против насекомых отряда Lepidoptera (Цыганкова и др , 2008)
Суммируя вышеизложенное в данной главе, можно сделать вывод, что разработанный метод DIR-ПЦР может быть применен для эффективного поиска специфических молекулярных маркеров, сцепленных с заданными диагностическими признаками бактерий Следует также отметить, что во всех случаях разработанные маркеры гомологичны участкам бактериального генома, а не плазмид, что повышает надежность таких систем SCAR-праимеров, так как плазмиды могут теряться или трансформироваться между близкородственными штаммами
5. Качественная идентификация ГМИ при помощи молекулярных маркеров, специфичных для вируса мозаики цветной капусты.
Скрининг растительного материала, пищевых продуктов и кормов на наличие трансгенных компонентов обычно проводят с использованием в качестве универсального молекулярного маркера промотора вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) 35Э (НиЬпег е! а!., 2001). Промотор 358 является генетическим элементом, общим для трансгенных конструкций, использованных при создании более 95% всех зарегистрированных в мире трансгенных растений.
С появлением генетически модифицированных растений, относящихся к семейству Крестоцветные, выявился существенный недостаток промотора 358, как молекулярного маркера, а именно - высокий уровень зараженности посевов вирусом ВМЦК. В ряде случаев именно зараженность проверяемого материала этим вирусом явилась причиной ложного выявленння ГМ-компонентов в анализируемых пробах пищевой продукции.
Поэтому задачей данного этапа работы явилась разработка метода проведения массовых скрининговых анализов на факт присутствия ГМИ в пищевых продуктах, позволяющего дифференцировать случаи зараженности исследуемого материала ВМЦК.
На основании анализа известных нуклеотидных последовательностей ВМЦК были сконструированы прайчеры для амплификации фрагментов гена капсидного белка и обратной транскриптазы (см. главу «Материалы и методы»).
Была проведена проверка указанных праймерных систем и условий проведения реакции на препарате ДНК, выделенном из хрена, зараженного ВМЦК, при которой сопоставляли данные, получаемые при разной температуре отжига праймеров (53.0°С, 55.8°С и 58.5°С). Приведенные на рисунке 8 результаты электрофоретического анализа продуктов реакции свидетельствуют о том, что все праймерные системы дают в результате ГГЦР продукты заданной длины, причем эффективность различных праймерных систем различается.
37501:- 37503Е- 3864£- 3864£-435П-Г 4461т- 4350т- 44631-
Рис. 8. Проверка эффективности разработанных праймерных систем при разной температуре отжига праймеров.
М - маркер молекулярной массы ДНК 100 Ьр (СибЭнзим, Россия). Фигурными скобками отмечены различные пары праймеров. Порядок образцов внутри каждой скобки: 53.0°С; 55.8°С; 58.5°С; контрольная ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы. Стрелками отмечены расположение и размер целевых фрагментов.
Применение двух или трех праймерных сиетем, специфичных для различных мишеней, требует постановки удвоенного или утроенного числа реакций и соответствующего количества контрольных реакций. Избежать этого можно посредством мультиплексирования праймерных систем, то есть совмещения в одной реакционной смеси нескольких праймерных систем, специфичных для непересекающихся ампликонов (Оеггтт е! а1., 2004; От$Ы е! а1., 2005). Разработанные праймерные системы были объединены с праймерной системой 358РК, специфичной для промотора 358 (длина ампликона - 195 п.н.), обычно применяемой при измерении количественного содержания ГМИ в пищевой продукции (НиЬпег й а!., 2001), в дуплексные и триплексные праймерные системы, которые были проверены по эффективности и специфичности при мягких (Тотжша 53.0°С) и жестких (Тотжига 58.5°С) условиях проведения реакции..
Для триплексных наборов праймеров были использованы все упомянутые выше праймерные системы, специфичные для генов капсидного белка и обратной трапскриптазы, за исключением праймерной системы 3864М358г (ген обратной транскриптазы), поскольку для нее размер ампликона совпадал с размером ампликона, выбранного для гена капсидного белка. Триплексная праймерная система теоретически должна идентифицировать более широкий спектр штаммов ВМЦК - если за счет естественного полиморфизма нуклеотидных последовательностей одна из праймерных пар перестанет быть специфичной для ампликонов, то вероятность одновременного «отказа» еще одной праймерной пары будет пренебрежимо мала, поскольку, степень полиморфизма выбранных нами генов, согласно СЬепаиН а. Ме1с1тег. 1993, составляет от 4 до 6%. Результаты проверки эффективности триплексных праймерных систем представлены на рисунке 9. Реакции были проведены в трех незавимых повторностях на препарате ДНК хрена, зараженного ВМЦК, при температуре отжига праймеров равной 58°С.
Ж
8«Ш
Рис9. Проверка эффективности триплексных праймерных систем.
М - маркер молекулярной массы ДНК 100 Ьр (СибЭнзим, Россия), слева указаны размеры основных фрагментов молекулярного маркера. Фигурными скобками отмечены различные праймерные системы: 1 - 355РК+0-'-Сг+37501'-4358г; 2 - 358РК+С1'-Сг+3750М463г; 3 - 358РЯ+С1-Сг+38641"-4463г. Порядок образцов внутри каждой скобки: три незавимых повгорности ПЦР на препарате ДНК хрена, зараженного ВМЦК; контрольная ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы.
Таким образом, предложенные нами дуплексные и триплексные праймерные системы, позволяют на практике избежать ложноположительного определения ГМИ в продуктах питания, являющихся результатом зараженности исходного растительного сырья ВМЦК.
6. Количественное определение конк-регных трансформационных событий в продуктах питания.
Трансгенпая соя в 2006 году выращивалась в мире на 58.6 миллионах га (67% всех посевных площадей под биотехнологические культуры), и ее доля в общемировом производстве сои составляла 58% (Brookes a. Barfoot, 2007). Это означает, что более 46% потребляемой в стране сои имеет трансгенное происхождение. На втором месте среди ГМ растений по выращиваемое™ в мире стоит кукуруза - 22% посевных площадей трансгенных растений (19,2 млн га).
Задачей данного этапа работы явилась разработка наборов реактивов для количественного определения трансгенной сои (трансформационное событие RR40-3-2) и четырех наиболее распространенных трансформационных событий трансгенной кукурузы (трансформационные события MON81Ü, NK603, Т25 и GA21) на основе метода ПЦР в режиме реального времени с применением гидролизуемых TaqMan зондов.
На основе анализа нуклеотидной последовательности были сконструированы ампдифицирующие праймеры 40Fn 40R, а также 3 TaqMan зонда (R2, TRI и TR2). Проверка показала, что предложенная нами праймерная система с применением указанных праймеров и протокола проведения 11ЦР практически не дает неспецифичных продуктов и. соответственно, может быть использоваиа для проведения ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов.
Реакции с указанными зондами проводили одновременно при одном протоколе реакции при содержании в реакционной смеси 150 нг ДНК трансгенной сои RR40-3-2. Полученные данные представлены на рисунке 10.
Рис. 10. Кривые амплификации для различных TaqMan зондов.
Так как зонд R2 дает более низкие значения пороговых циклов регистрации О, то при использованном протоколе реакция гибридизация TaqMan зонда, расположенного на
большем удалении от праймера, происходит с большей эффективностью. Нами была проведена оценка чувствительности гграймерной системы 40Р-4(Ж и зонда Я2 для определения трансформационного события 1*1140-3-2 (Рис. 11).
Стандарты
ГМО Станд 1 Станд. 2 Станд 3 Станд. 4 <СТ> 6
"6% Не опр Но опр На опр
0.1% 39,07 38,65 37.75 38,49 0,674309
0.4% 35,54 35.67 35,54 35.58333 0,075056
0.9% 34,45 34,35 34,16 34,32 0,147309
2 0% 33,66 33,44 33,56 33,55333 0.110151
5.0% 32.07 31 .51 31.42 31,66667 0,352184
10% 30,14 29.83 3026 30.07667 У0.221886
НК Не опр Не опр. Не опр.
<сь- vs %ГМО
40
1'С----*--;—.........
Ж 12...............——......,.....—.
0,0 2,0 4,0 6,0 е.о 10,0 '.ГМО
<ct- vs LOG(%rMO)
LO'.iT'.l M'i)
Рис. 11. Оценка чувствительности выбранного TaqMan-зонда.
Таким образом, использование праймерной системы 40F-40R с внутренним гидролизуемым зондом TaqMan R2 для количественного анализа ГМО возможно в диапазоне от 0.1 до 10% примеси ГМО в исследуемом материале.
С применением такого же методологического подхода нами были разработаны лабораторные прототипы ПЦР-диагностикумов для количественного определения в пищевых продуктах еще четырех наиболее распространенных трансформационных событий трансгенной кукурузы (MON8IO, NK603, Т25 и GA21).
Разработанные лабораторные прототипы ПЦР-диагностикумов были представлены на сертификацию в ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и 02 мая 2006 года указанной организацией были утверждены методические рекомендации по применению тест-систем для количественного определения содержания ГМИ в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом ПЦР в режиме реального времени для пяти трансформационных событий RR40-3-2, MQN810, NK603, Т25 и GA2] (Кузнецов и др., 2006а-е).
выводы
1 Разработан унифицированный метод выделения ПЦР-пригодной ДНК, на основе которого были предложены экспресс-методы выделения ДНК из пищевых продуктов разной степени процессированности и из бактериальных сообществ, обитающих в различных типах почв
2 Использование генов, кодирующих 16S рРНК бактерий, в качестве молекулярных маркеров позволило
а) предложить новое семейство бактерий - Oscillochloridaceae,
б) выявить многокопийность генов, кодирующих 16S рРНК, у Desulfotomaculum kuznetsovii 171
3 Разработана система праймеров для выявления генов 16S рДНК у максимально широкого спектра архей На примере микробного сообщества бактериальных обрастаний арагонитовых коралловидных построек показана эффективность разработанной системы праймеров при выявлении генов, кодирующих 16S рРНК, в молекулярно-экологических исследованиях
4 Разработаны универсальные системы праймеров для выявления функциональных генов ш/Н и cbbL у бактерий различных таксономических групп, в том числе и в составе сообществ Использовашге генов mfH и cbbL в качестве молекулярных маркеров позволило подтвердить обособленное положение бактерий семейства Oscillochloridaceae
5 Разработан метод DIR-ПЦР для интегрального сравнения геномов прокариот и создания молекулярных маркеров различного уровня специфичности, сцепленных с заданными диагностическими признаками бактерий На примере бактерий видов В cereus и В subtilis показано, что разрешающая способность разработанного метода DIR-ПЦР позволяет выявлять геномные различия у диссоциантов одного штамма Применение предлагаемого метода позволило
а) разработать специфичный SCAR-маркер для идентификации штаммов A tumefaciens, используемых при трансформации растений, на основе которого предложен метод выявления присутствия этих бактерий в растительном материале,
б) разработать специфичный SCAR-маркер для идентификации бактерий вида X campestris, который может быть использован для проверки семян сельскохозяйственных растений при проведении санитарного контроля,
в) разработать специфичный SCAR-маркер для идентификации штаммов В ihurmgiensis, обладающих генами cryl, кодирующими токсины против насекомых отряда Lepidoptera
6 Разработана система праймеров для выявления комплекса молекулярных маркеров, специфичного дня ВМЦК, применение которой позволит избежать ложноположителытого определения ГМИ в продуктах питания
7 Разработаны и утверждены для практического применения тест-системы для количественного определения содержания ГМИ в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом ПЦР в режиме реального времени для пяти трансформационных событий RR40-3-2, MON8IO, NK603, Т25 и GA21
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:
1 Запороженко Е В , Слободова Н В , Булыгина Е С , Кравченко И К , Кузнецов Б Б. Экспресс-метод выделения ДНК из бактериальных сообществ различных почв // Микробиология -2006 -Т 75 - №1 - С 127-134
2 Турова Т П , Спиридонова Е М , Слободова Н В , Булыгина Е С , Кеппен О И , Кузнецов Б.Б., Ивановский Р Н Филогения аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий семейства Oscillochlondaceae на основании сравнительного анализа генов rrs, cbbL и nifH // Микробиология -2006 -Т 75 - №2 - С 235-244
3 Жарикова Н В , Маркушева Т В , Галкин Е Г , Коробов В В , Журенко Е Ю , Ситдикова Л Р , Колганова Т В , Кузнецов Б Б., Турова Т П Raoultella planticola - новый штамм-деструктор 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты // Прикладная биохимия и микробиология - 2006 - Т 42 - № 3 - С 292-297
4 Слободова Н В , Колганова Т В , Булыгина Е С , Кузнецов Б Б . Турова Т П , Кравченко И К Сравнительная характеристика метанотрофных накопительных культур с помощью серологических и молекулярных методов // Микробиология - 2006 - Т 75 - № 3 - С 397403.
5 Tourova Т Р, Spmdonova Е М, Berg IА , Kuznetsov В В , Sorokin D Yu Occurrence, phylogeny and evolution of nbulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase genes m obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria of the genera Thiomicrospira and Thioalkahmicrobium // Microbiology -2006 -V 152 -№7 -P 2159-2169
6 Спиридонова E M, Кузнецов Б.Б., Пименов H В, Турова Т П Определение филогенетического разнообразия эндосимбионтов моллюска Bathymodiolus azoricus на основании анализа генов 16S рРНК, cbbL иртоА //Микробиология -2006 - Т 75 - №6 - С 798-806
7 Perevalova А А , Svetlichny V А , Kublanov I V , Chernyh N А , Kostrikina N А , Tourova Т Р , Kuznetsov В В , Bonch-Osmolovskaya Е A Desulfurococcus fermentans sp nov , a novel hyperthermophilic archaeon from a Kamchatka hot spring, and emended description of the genus Desulfurococcus // Int J Syst Evol Microbiol - 2005 - V 55 - № 3 - P 995-999
8 Уланова P В , Кузнецов Б Б.. Аксенов А В Технология производства нового белкового препарата // Комбикорма - 2005 - № 2 - С 47
9 Турова Т П, Спиридонова Е М , Берг И А , Кузнецов Б Б . Сорокин Д Ю Филогения генов рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у облигатно автотрофных галоалкалофилъных сероокисляющих бактерий рода Thioalkahvibrio // Микробиология -2005 - Т 74 - № 3 - С 378-386
10 Спиридонова Е М , Берг И А , Колганова Т В , Ивановский Р Н , Кузнецов Б Б . Турова ТП Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у бактерий различных таксономических групп // Микробиология -2004 -Т 73 -№3 - С 377-387
11 Цыганкова С В , Булыгина Е С , Кузнецов Б Б , Хабибулин С С , Дорошенко Е В , Короткое Е В, Эль-Регистан Г И Получение внутрипопуляционных диссоциантов
некоторых бацилл и применение метода DIR-ПЦР для их идентификации // Микробиолог ия -2004 -Т 73 - № 3 - С 398-405
12 Tsygankova SV, Ignatov AN, Boulygina ES, Kuznetsov В В. Korotkov EV Genetic relationships among strains of Xanthumonas campestris pv campestris revealed by novel rep-PCR primers//European Journal of Plant Pathology -2004 -V 110 - №8 -P 845-853
13 Сучков BB, Логинова EH, Кузнецов Б Б. Скрябин КГ Модификация метода выделения и количественного определения ДНК в соевых белковых препаратах // Известия ВУЗов Пищевая биотехнология -2003 -№5-6 - С 109-111
14 Doronina NV, Trotsenko YA, Kuznetzov В В . Tourova TP Emended description of Paracoctus kondratievae II Int J Syst Evol Microbiol -2002 -V 52 -№2 -P 679-682
15 Doronina NV, Trotsenko Yu A , Kuznetsov ВВ., Tourova TP, Salkinoja-Salonen MS Methylobcicterium suomiense sp nov and Methylobacterium lusitanum sp nov, aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic bactena // Int J Syst Evol Microbiol - 2002 - V 52 - № 3 - P 773-776
16 Колганова T В , Кузнецов Б Б , Турова Т П Подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для амплификации и секвенирования генов 16S рРНК архей //Микробиология — 2002 -Т 71 - № 2 - С 283-286
17 Турова Т П, Колганова Т В , Кузнецов Б Б . Пименов Н В Филогенетическое разнообразие архейного компонента бактериальных обрастаний на коралловидных постройках в зонах выхода метана в Черном море // Микробиология - 2002 - Т 71 - № 2 -С 230-236
18 Булыгана Е С , Кузнецов Б Б , Марусина А И Кравченко И К , Быкова С А , Колганова Т В, Гальченко В Ф Изучение нуклеотидныч последовательностей nifН генов у представителей метанотрофных бактерий // Микробиология - 2002 - Т 71 -№4 - С 500508
19 Zavarzma DG, Tourova TP, Kuznetsov В В, Bonch-Osmolovskaya ЕА, Slobodkm A I Thermo\enabulum jerriorganovorum gen nov, sp nov, a novel thermophilic, anaerobic, endospore-formingbacterium//Int J Syst Evol Microbiol -2002 -V 52 -№5 -P 1737-1743
20 Турова T П , Кузнецов Б Б . Новикова Е В , Полтараус А Б , Назина Т Н Гетерогенность Н} клеотидных последовательностей генов 16S рибосомной РНК типового штамма Desidfotomaculum kuznetsoxn II Микробиология -2001 -Т 70 -№6 - С 788-795
21 Doronina N V , Trotsenko Y А , Tourova Т Р , Kuznetsov В В , Leismger Т Albibacter methylovorans gen nov , sp nov, a novel aerobic, facultatively autotrophic and methylotrophic bacterium that utilizes dichloromethane // Int J Syst Evol Microbiol - 2001 - V 51 - № 3 - P 1051-1058
22 Турова T П , Кузнецов Б Б , Доронина Н В , Троценко Ю А Филогенетический анализ аэробных метилотрофных бактерий, использующих дихлорметан // Микробиология - 2001 -1 70 - № 1 - С 92-97
23 Марусина А И , Булыгина Е С , Кузнецов Б Б , Турова Т П , Кравченко И К , Гальченко В Ф Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nijii различных таксономических групп прокариот//Микробиология -2001 - Т 70 - № 1 - С 86-91
24 Турова Т П , Кузнецов Б.Б , Колганова Т В , Бонч-Осмоловская Е А Филогенетическое положение Desulfurococcus amylolyticus // Микробиология - 2000 - Т 69 - № 3 - С 447-448
25 Prokofeva М I, Miroshnichenko М L , Kostrikma N А , Chernyh N А , Kuznetsov В В , Tourova Т Р , Bonch-Osmolovskaya Е A Acidilobus aceticus gen nov , sp nov , a novel anaerobic thermoacidophihc archaeon from continental hot vents in Kamchatka // Int J Syst Evol Microbiol -2000 -V 50 - №6 -P 2001-2008
26 Bryantseva IA , Gorlenko V M, Kompantseva EI, Tourova T P , Kuznetsov В В.. Osipov G A Alkahphihc heliobacterium Heliorestis baculata sp nov and emended description of the genus Hehorestis II Arch Microbiol -2000 -V 174 - № 4 -P 283-291
27 Keppen ОI, Tourova T P, Kuznetsov В В., Ivanovsky R N , Gorlenko V M Proposal of i fam nov on the basis of a phylogenetic analysis of the filamentous anoxygemc phototrophic bacteria, and emended description of Oscillochloris and Oscillochloris trichoides in comparison with further new isolates//Int J Syst Evol Microbiol -2000 -V 50 -№4 -P 1529-1537
28 Doromna N V , Trotsenko Y A , Tourova T P, Kuznetsov B.B , Leisinger T Methylopila helvetica sp nov and Methylobacterium dichlorometlianicum sp nov -novel aerobic facultatively methylotrophic bacteria utilizing dichloromethane // Syst Appl Microbiol - 2000 - V 23 - № 2 -P 210-218
29 Брянцева И A , Горленко В M , Турова Т П , Кузпецов Б Б , Лысенко А М , Быкова С А , Гальченко В Ф, Митютина Л Л, Осипов Г A Heliobacterium sulfidophdum sp nov и Heliobacterium undosum sp nov сульфидокисляющие гелиобактерии из термальных сероводородных источников // Микробиология - 2000 - Г 69 - №3 - С 396-406
30 Zavarzina D G , Zhilina Т N , Tourova Т Р , Kuznetsov ВВ., Kostrikma N А , Bonch-Osmolovskaya Е A Thermanaerovibrio velox sp nov, a new anaerobic, thermophilic, organotrophic bacterium that reduces elemental sulfur, and emended descnption of the genus Thermanaerovibrio II Int J Syst Evol Microbiol -2000 - V 50 - № 3 - P 1287-1295
31 Sorokm DIu, Turova TP, Kuznetsov В В. Bnantseva IA, Gorlenko VM Rosematronobacter thiooxidans gen nov , sp nov , a new alkahphihc aerobic bactenochlorophyll-alpha-containmg bacteria from a soda lake // Mikrobiologna - 2000 - V 69 - № 1 - P 89-97
32 Марусина А И , Булыгина E С , Кузнецов Б Б , Турова Т П, Кравченко И К , Гальченко В Ф Разработка системы олигонуклеотидных праймеров для исследований в области молекулярной экологии азотофиксирующих микроорганизмов // Электронный журнал "Исследовано в России" -2000 -№83 - С 1153-1158
33 Pikuta Е, Lysenko А, Suztna N, Osipov G, Kuznetsov В. Tourova T, Akimenko V, Laurmavichius К Desulfotomaculum alkaliphilum sp nov, a new alkahphihc, moderately thermophilic, sulfate-reducing bacterium // Int J Syst Evol Microbiol - 2000 - V 50 - № 1 - P 25-33
34 Slobodkm AI, Tourova TP, Kuznetsov BB, Kostrikma NA, Chernjh NA, Bonch-Osmolovskaya E A Thermoanaerobacter siderophilus sp nov, a novel dissimilatory Fe(III)-reducing, anaerobic, thermophilic bacterium // Int J Syst Bacterid - 1999 - V 49 - № 4 - P 1471-1478
35 Жилина Т Н , Турова Т ГГ, кузнецов Б Б , Кострикина Н А , Лысенко А М Огета nvaihensis sp nov — новая умеренно галофильная анаэробная бактерия из лагун Сиваша // Микробиология - 1999 -Т 68 -№4 - С 519-527
Методические указания
36 Кузнецов Б Б . Колганова Т В , Малошенко А Л , Братина И В , Воронцова Т В , Потапова Т Н, Авдеенко Т Ф , Терехова С Ю «Количественное определение содержания трансгенной сои RR40-3-2, устойчивой к гербициду глифосату, в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом ПЦР в режиме реального времени с использованием тест-системы «Центр-кит 40-3-2» МР № 02 001-06 Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Москва, 2006 г, 14 с
37 Кузнецов Б Б . Колганова Т В , Малошенко А Л , Братина И В , Воронцова Т В , Потапова Т Н , Авдеенко Т Ф , Терехова С Ю «Количественное определение содержания трансгенной кукурузы GA21, устойчивой к глифосату, в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом ПЦР в режиме реального времени с использованием тест-системы «Центр-кит 21» МР №02 005-06 Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Москва, 2006 г, 14 с
38 Кузнецов Б Б . Колганова Т В , Малошенко А Л , Брагина И В , Воронцова Т В , Потапова Т Н , Авдеенко Т Ф , Терехова С Ю «Количественное определение содержания трансгенной кукурузы MON810, устойчивой к стеблевому мотыльку, в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом ПЦР в режиме реального времени с использованием тест-системы «Центр-кит 810» МР №02 002-06 Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Москва, 2006 г, 14 с
39 Кузнецов Б.Б , Колганова Т В , Малошенко А Л, Брагина И В , Воронцова Т В , Погапова Т Н , Авдеенко Т Ф , Терехова С Ю «Количественное определение содержания трана енной кукурузы NK603, устойчивой к гербициду глифосату, в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом ПЦР в режиме реального времени с использованием тест-системы «Центр-кит 603» МР №02 003-06 Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Москва, 2006 г, 14 с
40 Кузнецов Б Б . Колганова Т В , Малошенко А Л , Брагина И В , Воронцова Т В , Пот апова Т Н , Авдеенко Т Ф , Терехова С Ю «Количественное определение содержания трансгенной кукурузы Т25, устойчивой к гербициду глифосинату, в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом ПЦР в режиме реального времени с использованием тест-системы «Центр-кит 25» МР №02 004-06 Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Москва, 2006 г, 14 с
41 Тутельян В А, Сорокина ЕЮ, Чернышева ОН, Левицкая АБ, Шипулин ГА, Яцышина С Б , Петухов А И, Беляев Е Н , Брагина, И В, Воронцова Т В , Потапова Т Н , Авдеенко Т Ф , Терехова С Ю , Зароченцев М В, Скрябин К Г , Дорохов Д Б , Кузнецов Б Б Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания Методические указания - М Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004 - 31 с
42 Дорохов Д Б , Кузнецов Б Б, Сенченко В Н , Долгов С Д ,Санин С С , Макаров А А , Спиридонов Ю Я , Джавахия В Г, Филиппов А В , Козловский Б Е ,Надыкта В Д , Гончаров В Т, Исмаилов В Я, Угрюмов Е П Оценка биобезопасности генно-пнженерно-модифицированных растений Методические указания -М Минпронауки, 2001 -51 с
43 Тутельян В А , Аксюк И Н , Васильев А В , Воробьева JT С , Высоцкий В Г , Волгарев М Н , Королев А А , Кравченко JI В , Маганова Н В , Мазо В К , Покровская Г Р , Сокольников А А , Сорокина Е Ю , Тышко Н В , Семенов Б Ф , Бритцына М В , Захарова Н С , Онищенко Г Г , Петухов А И , Бочков Н П , Суханов Б П , Скрябин К Г , Кузнецов Б.Б , Асадова Ю Е , Шишкин С С , Рогов И Ф , Кроха Н Г , Гурова Н В , Сучков В В Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников Методические указания - М Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000 - 95 с
Патенты
1 Камионская А М, Кузнецов Б.Б.. Скрябин К Г Рекомбинантная полинуклеотидная последовательность, характеризующая уникальный трансформационный акт между генетической конструкцией, включающей ген cry Illa, и геномной ДНК картофеля сорта Елизавета, ее применение и содержащие эту последовательность клетка, трансгенное растение и его потомство // Патент на изобретение № 2286385 - 2006
2 Камионская А М, Кузнецов Б.Б, Скрябин К Г Рекомбинантная полинуклеотидная последовательность, характеризующая уникальный трансформационный акт между генетической конструкцией, включающей ген cry Illa, и геномной ДНК картофеля сорта Невский, ее применение и содержащие эту последовательность клетка, трансгенное растение и его потомство // Патент на изобретение № 2286386 - 2006
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецов, Борис Борисович
ВВЕДЕНИЕ.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Глава 1. Молекулярное маркирование прокариот.
1.1. Применение гена, кодирующего 16S рРНК, в качестве молекулярного маркера.
1.2. Применение функциональных генов в качестве молекулярных маркеров.
1.3. Методы сравнения полных геномов - ДНК-фингерпринтинг.
Глава 2. Молекулярная идентификация генетически модифицированных растений.
2.1. Правовое регулирование в области биотехнологии генетически-модифицированных организмов.
2.1.1. Обзор законодательства ЕС, касающегося ГМО.
2.1.2. Обзор законодательства Российской Федерации, касающегося ГМО.
2.2. Выбор мишени для идентификации ГМО.
2.3. Методы количественного определения содержания конкретной мишени в ДНК исследуемых образцов.
2.3.1. Конкурентная ПЦР.
2.3.2. ПЦР в присутствии интеркалирующего флуоресцентного красителя.
2.3.3. ПЦР с использованием гибридизационных зондов - молекулярных беконов.
2.3.4. ПЦР с использованием дуплексных гибридизационных зондов.
2.3.5. ПЦР с использованием внутренних гидролизуемых TaqMan зондов.
2.3.6. ПЦР с использованием гибридизационных зондов Scorpion.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Глава 3. Материалы и методы.
3.1. Объекты исследования.
3.2. Выделение ДНК.
3.2.1. Получение препаратов ДНК из биомассы микроорганизмов и растений.
3.2.2. Получение препаратов ДНК из пищевых продуктов.
3.3. ПЦР.
3.3.1. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК.
3.3.2. Амплификация фрагментов генов ni/R.
3.3.3. Амплификация фрагментов генов cbbL «красного» типа.
3.3.4. DIR-ПЦР.
3.3.5. БСАК-ПЦР.
3.3.6. Амплификация фрагмента терминатора гена, кодирующего нопалинсинтетазу (N08) петуньи.
3.3.7. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 18Б рРНК.
3.3.8. Амплификация целевых фрагментов геномной ДНК вируса мозаики цветной капусты.
3.3.9. Амплификация целевых фрагментов геномной ДНК трансгенных растений сои.
3.4. Детектирование продуктов ПЦР.
3.5. Очистка ПЦР-фрагментов.
3.6. Клонирование ПЦР-фрагментов.
3.7. Выделение плазмидной ДНК.
3.8. Секвенирование ДНК.
3.9. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МИШЕНЕЙ ПРОКАРИОТ.
Глава 4. Использование целевых генов прокариот в качестве молекулярных маркеров.
4.1. Использование генов, кодирующих 16Б рРНК, в качестве молекулярных маркеров.
4.1.1. Использование генов, кодирующих 16Б рРНК бактерий, в качестве молекулярных маркеров.
4.1.2. Разработка системы праймеров для амплификации и секвенирования фрагментов генов 168 рРНК у широкого круга архей.
4.2. Комплексная молекулярная идентификация эубактерий при помощи маркеров 16Б рДНК и функциональных генов.
4.2.1. Применение универсальной системы праймеров для амплификации фрагментов генов 16Б рРНК для молекулярной идентификации бактерий рода ОхсШосЫопн.
4.2.2. Применение универсальной системы праймеров для амплификации фрагментов генов п(/Н на примере бактерий рода ОясШосЫопз.
4.2.3. Применение универсальной системы праймеров для амплификации фрагментов генов сЬЬЬ на примере бактерий рода ОзсШосЫопх.
Глава 5. Разработка и использование БЖ-ПЦР в качестве метода интегрального сравнения геномов прокариот для создания молекулярных маркеров различного уровня специфичности.
5.1. Разработка метода БШ-ПЦР.
5.2. Разработка молекулярного маркера, специфичного для группы галлообразующих бактерий Agrobacterium (umefaciens.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МИШЕНЕЙ ЭУКАРИОТ.
Глава 6. Разработка качественных и количественных методов идентификации трансгенных растений.
6.1. Качественная идентификация ГМИ при помощи молекулярных маркеров, специфичных для вируса мозаики цветной капусты.
6.2. Количественное определение конкретных трансформационных событий в продуктах питания.
6.2.1. Выбор ампликона на примере нуклеотидной последовательности трансформационного события RR40-3-2.
6.2.2. Проверка применимости разработанной праймерной системы для проведения ПЦР РВ с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green.
6.2.3. Разработка ПЦР тест-систем для количественного определения трансформационных событий в продуктах питания.
Глава 7. Разработка методов выделения ДНК.
7.1. Разработка экспресс-метода выделения ДНК из различных пищевых продуктов.
ВЫВОДЫ.ИЗ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная идентификация генетических мишеней"
Применение методов молекулярного маркирования объектов исследования позволяет существенно повысить точность и достоверность классификационных построений в биологии. Это очень хорошо заметно на примере микробиологических исследований. Наряду с классическими биохимическими методами (определение состава жирных кислот, сравнительное исследование профилей экспрессируемых белков и проч.), в последнее время широко применяются методы, основанные на анализе разнообразных ДНК-маркеров. Например, таксономию прокариот уже невозможно представить без филогенетического анализа генов рибосомных РНК, а селекционную работу в животноводстве - без ведения молекулярного паспорта родительских особей и их потомства. Из широкого множества методов, предлагаемых современной молекулярной биологией, исследователю остается только выбрать тот, который способен обеспечить необходимую точность ответа на поставленные вопросы. И здесь в первую очередь принимается во внимание разрешающая способность метода. Так, например, методы случайного фингерпринтинга (АР-ПЦР), основанные на применении неспецифичных праймеров, дают информацию о полиморфизме сразу многих генетических локусов одновременно, поэтому такие методы, как ИРЬР- или АРЬР-ПЦР, несмотря на их относительно высокую трудоемкость, до сих пор считаются одними из наиболее перспективных маркерных систем для подробного генетического картирования, в особености, для идентификации индивидуумов. В то же время информация, касающаяся отдельно взятого генетического локуса, при применении указанных методов существенно более ограничена, чем получаемая в результате, к примеру, ББИ-маркирования, которое ориентировано на выявление определенных нуклеотидных последовательностей и предоставляет обширную информацию об ограниченном числе молекулярных мишеней. Такого рода информация, как правило, используется для эволюционных построений и таксономических построений. Самым типичным молекулярным монолокусным маркером является ген, кодирующий малую субъединицу рибосомной РНК - 16Б рДНК у прокариотических организмов, и в то же время для филогенетических построений у прокариот все чаще и чаще используют и альтернативные маркеры, разрабатываемые на основании последовательностей некоторых функциональных генов. Методы фингерпринтинга и анализа сходства конкретных последовательностей не исключают, а взаимно дополняют друг друга - методы сравнительного анализа конкретных последовательностей недостаточно достоверно работают на внутривидовом уровне, а методы фингерпринтинга - на межвидовом.
При окончательном выборе конкретного молекулярного маркера в качестве инструмента исследования в первую очередь принимаются в расчет вопросы доступности технологических ресурсов для его осуществления, а также стоимости получаемых данных. Следует оговориться, что это не всегда возможно. Так, например, для описания нового вида прокариот необходимым является проведение анализа первичной нуклеотидной последовательности генов, кодирующих 168 рРНК, и этот молекулярный маркер, согласно решению Международного таксономического комитета, не может быть заменен никаким альтернативным, хотя при окончательном решении вопроса о таксономической принадлежности нового организма в спорных случаях во внимание могут быть приняты и данные геномного фингерпринтинга, и данные по другим альтернативным молекулярным маркерам.
Помимо широкого применения в области фундаментальной науки, методы молекулярного маркирования имеют и вполне конкретную практическую востребованность. К примеру, известный метод установления отцовства/материнства, основанный на применении ПЦР для одновременного выявления молекулярных маркеров, относящихся к десятку и более генетических локусов. Точность этого метода настолько высока, что он принят для практического использования практически во всем мире. Методы экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, широко применяемые в медицинской практике, также основаны на применении молекулярных маркеров, в данном случае высокоспецифичных по отношению к конкретным мишеням - уникальным участкам геномной ДНК патогенных микроорганизмов определенной штаммовой и видовой принадлежности. Не менее актуальной в настоящее время является проблема идентификации конкретных генно-инженерных модификаций в растительном сырье и полученных на его основе продуктах питания, когда только высокоспецифичные молекулярные маркеры способны различать абсолютно одинаковые по всем остальным параметрам (в том числе и по уровню экспрессии чужеродного белка) линии трансгенных растений и только их применение позволяет отделять проверенные на биобезопасность разрешенные линии трансгенных растений от трансформационных событий, не прошедших столь подробную проверку и не допущенных к практическому применению. Так, в 2000 году в США произошло случайное попадание кормовой кукурузы 81аг1Лпк в пищевые продукты, а в 2005 году на поля по ошибке была выпущена трансгенная кукуруза несертифицированной линии ВиО вместо разрешенной к применению линии Ви 1. Убытки из-за этих ошибок превысили миллиард долларов (МасП\уат, 2005).
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
Целью данной работы являлась разработка и практическое применение системы молекулярных маркеров, позволяющей проводить выявление и идентификацию генетических мишеней разного уровня специфичности, от конкретной нуклеотидной последовательности до генома в целом.
Для достижения поставленных целей решали следующие задачи:
1. ^ Комплексная молекулярная идентификация эубактерий при помощи Маркеров ! 68 рДНКифункциопальных генов?
2. Разработка праймерной системы для выявления генов 16Б рДНК у максимально широкого спектра архей и ее применение для анализа природных сообществ.
3. Разработка метода ОЖ-ПЦР для интегрального сравнения геномов прокариот и его применение для создания молекулярных маркеров различного уровня специфичности.
4. Разработка качественных и количественных методов выявления и идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения.
5. Разработка метода выделения ПЦР-пригодной ДНК из пищевых продуктов с повышенным содержанием жиров и полисахаридов.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кузнецов, Борис Борисович
выводы
1. С использованием в качестве генетических мишеней генов, кодирующих 16S рРНК бактерий была выявлена их многокопийность генов у бактерии Desulfotomaculum kuznetsovii 17 и исследовано влияние мультикопийности указанных генов на точность филогенетического анализа, проводимого на основе их сравнения. . 2. Разработана система праймеров для выявления генов 16S рДНК у максимально широкого спектра архей. На примере микробного сообщества бактериальных обрастаний арагонитовых коралловидных построек показана эффективность разработанной системы праймеров при выявлении генов, кодирующих 16S рРНК, в молекулярно-экологических исследованиях.
3. Комплексный молекулярный анализ, проведенный с использованием в качестве генетических мишеней генов, кодирующих 16S рРНК, а также функциональных генов nijН и cbbL позволил подтвердить обособленное положение группы штаммов Oscillochloris trichoides и предложить новое семейство бактерий - Oscillochloridaceae
4. Разработан метод DIR-ПЦР для интегрального сравнения геномов прокариот и создания молекулярных маркеров различного уровня специфичности, сцепленных с заданными диагностическими признаками бактерий. Применение предлагаемого метода позволило разработать специфичный SCAR-маркер для идентификации группы штаммов A. tumefaciens, используемых при трансформации растений, на основе которого предложен метод выявления присутствия этих бактерий в растительном материале;
5. Разработана система праймеров для выявления комплекса молекулярных маркеров, специфичного для ВМЦК, применение которой позволит избежать ложноположительного определения ГМИ в продуктах питания.
6. Разработан экспресс-метод выделения ДНК из пищевых продуктов разной степени процессированности.
7. Разработаны и утверждены для практического применения тест-системы для количественного определения содержания ГМИ в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом ПЦР в режиме реального времени для пяти трансформационных событий: RR40-3-2, MON8IO, NK603, Т25 и GA21.
Заключение
Разработан экспресс-метод выделения ДНК из различных пищевых продуктов, включая особо богатые жирами шоколад, шоколадные конфеты, паштеты и майонез. Были исследованы 38 образцов разнообразных пищевых продуктов, содержащих сою или кукурузу. Показано, что выделенная из них предлагаемым методом ДНК высокого качества и пригодна для дальнейшего ПЦР-анализа.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецов, Борис Борисович, Москва
1. Берг И. А., Кеппен О. И., Красильникова Е. Н., Уголькова Н. В., Ивановский Р. Н. Углеродный метаболизм аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae И Микробиология. 2005. - Т. 74. - № 3. - С. 305-312.
2. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей nifil генов у представителей метанотрофных бактерий // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 4. - С. 500-508.
3. Дорошенко Е.В., Булыгина Е.С., Спиридонова Е.М., Турова Т.П., Кравченко И.К. Выделение и характеристика азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum из почвы сфагнового болота // Микробиология. 2007. Т. 76. - № 1. - С. 107-115.
4. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.Б., Климанова Е.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus II Микробиология. 2001. - Т. 70. - № 6. - С. 811-819.
5. Захарчук Л. М., Цаплина И. А., Красильникова Е. Н., Богданова Т. И., Каравайко Г. И. Метаболизм углерода у Sulfobacillus thermosulfidooxidans штамм 1269 // Микробиология. -1994.-Т. 63.-С. 573-580.
6. Кеппен О. И., Красильникова Е. Н. Активность ферментов цикла трикарбоновых кислот у Oscillochloris trichoides // Микробиология. 1995. - Т. 64. - № 5. - С. 714-715.
7. Кеппен О.И., Лебедева Н.В., Трошина О.Ю., Родионов Ю.В. Нитрогеназная активность нитчатой фототрофной зеленой бактерии // Микробиология. 1989.- Т. 58.- С. 520-521.
8. Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П. Подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для амплификации и секвенирования генов 16S рРНК архей // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 2. - С. 283-286.
9. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nifН различных таксономических групп прокариот // Микробиология. — 2001. — Т. 70. № 1. — С. 86-91.
10. Спиридонова Е.М., Кузнецов Б.Б., Пименов Н.В., Турова Т.П. Определение филогенетического разнообразия эндосимбионтов моллюска Bathymodiolus azoricus на основании анализа генов 16S рРНК, cbbL иpmoh II Микробиология. 2006. - Т. 75. - №6. -С. 798-806.
11. Турова Т.П. Применение данных ДНК-ДНК гибридизации и анализа генов 16S рРНК для решения таксономических проблем на примере порядка Haloanaerobiales // Микробиология. 2000. - Т. 69. - С. 741-752.
12. Турова Т.П. Мультикопийность рибосомных оперонов прокариот и ее влияние на проведение филогенетического анализа // Микробиология. 2003. - Т. 72. - С. 437-452.
13. Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Колганова Т.В., Бонч-Осмоловская Е.А. Филогенетическое положение Desulfurococcus amylolyticus И Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 3. - С. 447-448.
14. Черных Н. А. Использование полимеразной цепной реакции для детекции гена РБФК в природных образцах // Микробиология. 1995. - Т. 64. - № 6. - С. 792-796
15. Achenbach L.A., Carey J., Madigan M.T. Photosynthetic and phylogenetic primers for detection of anoxygenic phototrophs in natural environments // Appl. Environ. Microbiol. -2001. V. 67. - № 7. - P. 2922-2926
16. Alchenbach L., Woese C. 16S and 23S rRNA-like primers // In: Archaea: a laboratory manual / Robb F.T. et al. (Eds.). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. - Appendix 6.
17. Amann G., Stetter K.O., Llobet-Brossa E., Amann R., Anton J. Direct proof for the presence and expression of two 5% different 16S rRNA genes in individual cells of Haloarcula marismortui II Extremophiles. 2000. - V. 4. - P. 373-376.
18. Barns S.M., Delwiche C.F., Palmer J.D., Pace N.R. Perspectives on archaeal diversity, thermophily and monophyly from environmental rRNA sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996.-V. 93. P.9188-9193.
19. Bassham J. A., Calvin M. The path of carbon in photosynthesis. Englewood Cliffs, NJ: Prentis Hall, 1957. - 104 p.
20. Beja O., Suzuki M.T., Heidelberg J.F., Nelson W.C., Preston C.M., Hamada T., Eisen J.A., Fraser C.M., DeLong E.F. Unsuspected diversity among marine aerobic anoxygenic phototrophs //Nature. 2002. - V. 415. - P. 630-633.
21. Belfort M., Reaban M.E., Coetzee T., Dalgaard J.Z. Prokaryotic introns and inteins: a panoply of form and function // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 3897-3903.
22. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmidDNA//Nucleic Acids Res. 1979. - V. 7. -№ 6. - P. 1513-1523.
23. Bourne D.G., McDonald I.R., Murrel L.C. Comparison of pmoA PCR primer sets as tools for investigating methanotroph diversity in three Danish soils // Appl. Environ. Microbiol. -2001. V. 67. - №. 9. - P. 3802-3809.
24. Braker G., Fesefeldt A., Witzel K.P. Development of PCR primer systems for amplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 3769-3775.
25. Braker G., Tiedje J.M. Nitric oxide reductase (norB) genes from pure cultures and environmental samples // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 3476-3483.
26. Brookes G., Barfoot P. GM crops: the first ten years global socio-economic and environmental impacts. - London: PG Economics Ltd., UK, 2007. - 116 p.
27. Brunk C.F., Avaniss-Aghajani E., Brunk C.A. A computer analysis of primer and probe hybridization potential with bacterial small-subunit rRNA sequences // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 872-879.
28. Brunk C.F., Eis N. Quantitative measure of small-subunit rRNA gene sequences of the kingdom Korarchaeota // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 5064-5066.
29. Bulygina E.S., Galchenko V.F., Govorukhina N.I., Netrusov A.I., Nikitin D.I., Trotsenko Yu.A., Chumakov K.M. Taxonomic studies on methylotrophic bacteria by 5S ribosomal RNA sequencing // J. Gen. Microbiol. 1990. - V. 136. - № 3. - P. 441-446.
30. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. Primer-template interactions during DNA amplification fingerprinting with single arbitrary oligonucleotides // Mol. Gen. Genet. 1992. -V. 235.-P. 157-165.
31. Campbell B.J., Cary S.C. Abundance of reverse tricarboxylic acid cycle genes in free-living microorganisms at deep-sea hydrothermal vents // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - № 10.-P. 6282-6289.
32. Campbell B.J., Stein J.L., Cary S.C. Evidence of chemolithoautotrophy in the bacterial community associated with Alvinella pompejana, a hydrothermal vent polychaete // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - № 9. - P. 5070-5078.
33. Canfield D.E., Raiswell R. The evolution of the sulfur cycle // Am. J. Sci. 1999. - V. 299. -P. 697-723.
34. Carbon P., Ehresmann C., Ehresman B., Ebel J.P. The complete nucleotide sequence of the ribosomal 16S RNA from Escherichia coli. Experimental detailes and cistron heterogenities // Eur. J. Biochem. 1979. - V.100. - P. 399-410.
35. Cavalier-Smith T. The neomuran origin of archaebacteria, the negibacterial root of the universal tree and bacterial megaclassification // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. - V. 52. -№ 1. - P. 7-76.
36. Chenault K.D., Melcher U. The complete nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus isolate BBC // Gene. 1993. - V. 123. - № 2. - P. 255-257.
37. Cilia V., Lafay B., Christen R. Sequence heterogeneities among 16S ribosomal RNA sequences, and their effect on phylogenetic analyses at the species level // Mol. Biol. Evol. -1996. -V. 13. P.451-461.
38. Clemente M.S., Menzo S., Bagnarelli P., Manzin A., Valenza A., Varaldo P.E. Quantitative PCR and RT-PCR in virology // PCR Methods Appl. 1993. - V. 2. - P. 191-196.
39. Cobb B. Optimization of RAPD fingerprinting // In: Fingerprinting methods based on arbitrarily primed PCR / Micheli M. R. a. Bova R. (Eds.). Berlin: Springer-Verlag, 1997. - P. 93-102.
40. Costello A.M., Lidstrom M.E. Molecular characterization of functional and phylogenetic genes from natural populations of methanotrophs in lake sediments // Appl. Environ. Microbiol. -1999. V. 65. - № 11. - P. 5066-5074.
41. Dedysh S.N., Panikov N.S., Tiedje J.V. Acidophilic methanotrophic communities from Sphagnum peat bog // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64.- P. 922-929.
42. De Marais D.J. Evolution. When did photosynthesis emerge on Earth? // Science. 2000. -V. 289 - № 5485. - P. 1703-1705.
43. Dhillon A., Goswami S., Riley M., Teske A., Sogin M. Domain evolution and functional diversification of sulfite reductases // Astrobiology. 2005. - V. 5. - № 1. - P. 18 -29.
44. Dhillon A., Teske A., Dillon J., Stahl D.A., Sogin M.L. Molecular characterization of sulfate-reducing bacteria in the Guaymas Basin // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 2765-2772.
45. Distel D. L., Lee H. K., Cavanaugh C. M. Intracellular coexistence of methano- and thioautotrophic bacteria in a hydrothermal vent mussel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995. V. 92. -№21. -P. 9598-9602.
46. Dryden S.C., Kaplan S. Localization and structural analysis of the ribosomal RNA operons of Rhodobacter sphaeroides II Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. - P. 7267-7277.
47. Edwards U., Rogall T., Bloeker H., Ende M. D., Boeettge E. C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA //Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. - P. 7843-7853.
48. Enwall K., Philippot L., Hallin S. Activity and composition of the denitrifying bacterial community respond differently to long-term fertilization // Appl. Environ. Microbiol. 2005. -V. 71.-№12.-P. 8335-8343.
49. Faloona F., Weiss S., Ferre F., Mullis K. Direct detection of HIV sequences in blood high-gain polymerase chain reaction // 6th International Conference on AIDS. San Francisco (CA). -1990.-Abstract 1019.
50. Farrand S.K., van Berkum P.B., Oger P. Agrobacterium is a definable genus of the family Rhizobiaceae // Int.J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. - V. 53. - P. 1681-1687.
51. Felsenstein J. PHYLIP Phylogenetic Inference Package version 3.2 // Cladistics. - 1989. -V. 5.-P. 164-166.
52. Fishbain S., Dillon J.G., Gough H.L., Stahl D.A. Linkage of high rates of sulfate reduction in Yellowstone hot springs to unique sequence types in the dissimilatory sulfate respiration pathway // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 3663-3667.
53. Flanagan D.A., Gregory L.G., Carter J.P., Karakas-Sen A., Richardson D.J., Spiro S. Detection of genes for periplasmic nitrate reductase in nitrate respiring bacteria and in community DNA // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 177. - P. 263-270.
54. Fogel G.B., Collins C.R., Li J., Brunk C.F. Prokariryotic genome size and SSU rDNA copy number: estimation of microbial relative abundance from a mixed population // Microb. Ecol. -1999.-V. 38.-P. 93-113.
55. Fox G.E, Wisotzkey J.D, Jurtshuk P. Jr. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity // Int. J. Syst. Bacterioh 1992. - V. 42. - P. 166-170.
56. Francis C.A., Roberts K.J., Beman J.M., Santoro A.E., Oakley B.B. Ubiquity and diversity of ammonia-oxidizing archaea in water columns and sediments of the ocean // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - № 41. - P. 14683-14688.
57. Gamier T., Canard B., Cole S.T. Cloning, mapping, and' molecular characterization of the rRNA operons of Clostridium perfringens II J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 5431-5438.
58. Garrity G.M., Holt J.G. Phylum BVI. Chloroflexi phy. nov. // In: Bergey's manual of systematic bacteriology. 2 ed. / Boone D. R. et al. (Eds.). New York, Berlin, Heidelberg: Springer, 2001. - P. 427-446.
59. George M.L.C., Bustamam M., Cruz W.T., Leach J.E., Nelson R.J. Movement of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in southeast Asia detected using PCR-based DNA fingerprinting-// Phytopathology. 1997. - V.87. - P. 302-309.
60. Gibson J.R., Slater E., Xery J., Tompkins D.S., Owen R.J. Use of an amplified-fragment length polymorphism technique to fingerprint and differentiate isolates of Helicobacter pylori II J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36. - P. 2580-2585.
61. Gich F., Garcia-Gil J., Overmann J. Previously unknown and phylogenetically diverse members of the green nonsulfur bacteria are indigenous to freshwater lakes // Arch. Microbiol. -2001.-V. 177.-№ l.-P. 1-10.
62. Giovannoni S.J., Britschgi T.B., Moyer C.L., Faild K.J. Genetic diversity in Sargasso Sea bakterioplankton //Nature. 1990. - V. 345. - P. 60-63.
63. Grant S., Grant W.D., Jones B.E., Cato C., Li. L. Novel archaeal phylotypes from an East African alkaline soltera // Extremophiles. 1999. - V. 3. - P. 139-145.
64. Grayson T.H., Alexander S.M, Cooper L.F., Gilpin M.L. Renibacterium salmoninarum isolates from different sources possess two highly conserved copies of the rRNA operon // Antonie Van Leeuwenhoek. 2000. - V.78. - P. 51-61.
65. Gregory L.G., Bond P.L., Richardson D.J., Spiro S. Characterization of a nitrate-respiring bacterial community using the nitrate reductase gene (narG) as a functional marker // Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 229-237.
66. Gregory L.G., Karakas-Sen A., Richardson D.J., Spiro S. Detection of genes for membrane-bound nitrate reductase in nitrate-respiring bacteria and in community DNA // FEMS Microbiol. Lett. 2000 - V. 183. - P. 275-279.
67. Grobkopf R., Stubner S., Leisak W. Novel euarchael lineages detected on rice roots and in anoxic bulk soil of flooded rice microcosms // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 4983-4989.
68. Gruntzig V., Nold S.C., Zhou J., Tiedje J.M. Pseudomonas stutzeri nitrite reductase gene abundance in environmental samples measured by real-time PCR // Appl. Environ. Microbiol. -2001.-V. 67. -P. 760-768.
69. Gurtler V., Wilson V.A., Mayall B.C. Classification of medically important Clostridia using restiction endonuclease site differences of PCR-amplified 16S rRNA // J. Gen. Microbiol. -1991.-V. 137.-P. 2673-2679.
70. Gut M., Leutenegger C.M., Huder J.B., Pedersen N.C., Lutz H. One-tube fluorogenic reverse transcription-polymerase chain reaction for the quantitation of feline coronaviruses // J. Virol. Methods. 1999. - V. 77. - P. 37-46.
71. Hallin S., Lindgren P.E. PCR detection of genes encoding nitrite reductase in denitrifying bacteria//Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 1652-1657.
72. Hanada S., Takaichi S., Matsuura K., Nakamura K. Roseiflexus castenholzii gen. nov., sp. nov., a thermophilic, filamentous, photosynthetic bacterium that lacks chlorosomes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. - V. 52. - № 1. - P. 187-193.
73. Hansen G., Wright M.S. Recent advances in the transformation of plants // Trends Plant Sci. 1999. - V. 4. - № 6. - P. 226-231.
74. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996 - V. 6. - P. 986-994.
75. Herbers K., Sonnewald U. Production of new/modified proteins in transgenic plants // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. - V. 10. - P. 163-168.
76. Hershberger K.L., Barns S.M., Reysenbach A.L., Dawson S.C., Pace N.R. Crenarchaeota in low temperature terrestrial environment//Nature. 1996. -V. 384. - P. 420.
77. Herter S., Fuchs G., Bacher A., Eisenreich W. A bicyclic autotrophic CO2 fixation pathway in Chloroflexus aurantiacus II J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - № 23. - P. 20277-20283.
78. Hillier W., Babcock G.T. Photosynthetic reaction centers // Plant Physiol. 2001. - V. 125. - № 1. - P. 33-37.
79. Hinnebusch A.G., Klotz L.C., Blanken R.L., Loeblich A.R. 3rd. An evaluation of the phylogenetic position of the dinoflagellate Crypthecodinium cohnii based on 5S rRNA characterization // J. Mol. Evol. -1981. V. 17. - № 6. - P. 334-337.
80. Hinrichs K.U., Hayes J.M., Sylva S.P., Brewer P.G., DeLong E.F. Methane-consuming archaebacteria in marine sediments //Nature. 1999. - V. 398. - P. 802-805.
81. Hollibaugh J.T., Budinoff C., Hollibaugh R.A., Ransom B., Bano N. Sulfide oxidation coupled to arsenate reduction by a diverse microbial community in a soda lake // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72. - № 3. - P. 2043-2049.
82. Holmes A.J., Costello A., Lidstrom M.E., Murrell J.C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 132. - № 3. - P. 203-208.
83. Holmes B., Roberts P. The classification, identification and nomenclature of agrobacteria // J. Appl. Bacteriol. 1981. - V. 50. - P. 443^167.
84. Honeycutt R.J., Sobral B.W., McClelland M. tRNA intergenic spacers reveal polymorphisms diagnostic for Xanthomonas albilineans II Microbiology. 1995. - V. 141. - P. 3229-3239.
85. Honeycutt R., Sobral B.W., McClelland M. Polymerase chain reaction (PCR) detection and quantification using a short PCR product and a synthetic internal positive control // Anal. Biochem. 1997. - V. 248. - P.303-306.
86. Horn M.A., Drake H.L., Schramm A. Nitrous oxide reductase genes (nosZ) of denitrifying microbial populations in soil and the earthworm gut are phylogenetically similar // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72. - № 2. - P. 1019-1026.
87. Hubner P., Waiblinger H.U., Pietsch K., Brodmann P. Validation of PCR methods for quantitation of genetically modified plants in food // J AO AC Int. 2001. -V. 84. - № 6. -P. 1855-1864.
88. Hulton C.S.J., Higgins C.F., Sharp P.M. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escerichia coli, Salmonella typhimurium, and other enterobacteria // Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. - P. 825-834.
89. Ivanovsky R.N., Sintsov N.V., Kondratieva E.N. ATP-linked citrate lyase activity in the green sulfur bacterium Chlorobium limicola forma thiosulfatophilum II Arch. Microbiol. 1980. -V. 128.-№2.-P. 239-241.
90. Islam F.S., Gault A.G., Boothman C., Polya D.A., Charnock J.M., Chatterjee D., Lloyd J.R. < Role of metal-reducing bacteria in arsenic release from Bengal delta sediments // Nature. 2004.-V. 430.-P. 68-71.
91. Jassen P., Maquelin K., Coopman R., Tjerberg I., Bonvet P., Kerstens K., Dijkshoorn L. Discrimination of Acinetobacter genomic species by AFLP fingerprinting // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - P. 1179-1187.
92. Johansen T., Carlson C.R., Kolsto A.R. Variable numbers of rRNA gene operons in Bacillus cereus strains // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V. 136. - P. 325-328.
93. Joulian C., Ramsing N.B., Ingvorsen K. Congruent phylogenies of most common small-subunit rRNA and dissimilatory sulfite reductase gene sequences retrieved from estuarine sediments // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - P. 3314-3318.
94. Kandeler E., Deiglmayr K., Tscherko D., Bru D., Philippot L. Abundance of narG, nirS, nirK, and nosZ genes of denitrifying bacteria during primary successions of a glacier foreland // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72. - № 9. - P. 5957-5962.
95. Kamekura M. Diversity of members of the family Halobacteriaceae II In: Microbiology and Biogeochemistry of Hypersaline Environments. / Oren A. (Ed.). Boca Raton, CRC Press, 1999. -P. 13-25.
96. Karr E.A., Sattley W.M., Jung D.O., Madigan M.T., Achenbach L.A. Remarkable diversity of phototrophic purple bacteria in a permanently frozen Antarctic lake // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 4910-4914.
97. Kato C., Li L., Tamaoka J., Horikoshi K. Molecular analysis of the sediment of the 11000 m deep Mariana Trench // Extremophiles. 1997. - V. 1. - P. 117-123.
98. Keane P. J., Kerr A., New P. B. Crown gall of stone fruit. II. Identification and nomenclature of Agrobacterium isolates // Aust.J. Biol. Sei.- 1970. V. 23. - P. 585-595.
99. Keppen O.I., Baulina O.I., Kondratieva E.N. Oscillochloris trichoides neotype strain DG-6 // Photosynth. Res. 1994. - V. 41. - P. 29-33.
100. Kim J., Nietfeld J., Benson A.K. Octamer-based genome scanning distinguishes a unique subpopulation of E. coli 0157:H7 strains in cattle // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. - V. 96. -P. 13288-13293.
101. Kirshtein J.D., Paerl H.W., Zehr J. Amplification, cloning and sequencing of a nifii segment from aquatic microorganisms and natural communities // Appl. Environ. Microbiol.-1991.-V. 57. P. 2645-2650.
102. Kostman J.R., Edlind T.D., LiPuma J.J., Stull T.L. Molecular epidemiology of Pseudomonas cepacia determined by polymerase chain reaction ribotyping // J. Clin. Microbiol.- 1992.-V. 30.-P. 2084-2087.
103. Kowalchuk G.A., Stephen J.R. Ammonia-oxidizing bacteria: a model for molecular microbial ecology // Annu. Rev. Microbiol. 2001. - V. 55. - P. 485-529.
104. Kuever J., Rainey F.A., Hippe H. Description of Desulfotomaculum sp. Groll as Desulfotomaculum gibsoniae sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - V. 49. - P. 1801-1808.
105. Lane D.J., Stahl D.A., Olsen G.J., Heller D.J., Pace N.R. Phylogenetic analysis of the genera Thiobacillus and Thiomicrospira by 5S rRNA sequences // J. Bacteriol. 1985. - V. 163.- № 1. P. 75-81.
106. Lane D. J. 16S/23S sequencing // In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics / Stackebrandt E. a. Goodfellow M. (Eds.). Chichester: John Wiley & Sons, Ltd., 1991. - P. 115175.
107. Leininger S., Urich T., Schloter M., Schwark L., Qi J., Nicol G.W., Prosser J.I., Schuster S.C., Schleper C. Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils // Nature.- 2006. V. 442. - P. 806-809.
108. Liefting L.W., Andersen M.T., Beever R.E., Gardner R.C., Forster R.S. Sequence heterogeneity in the two 16S rRNA genes of Phormium yellow leaf phytoplasma // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 3133-3139.
109. Line M.A. The enigma of the origin of life and its timing // Microbiology. 2002. - V. 148.- № 1.-P. 21-27.
110. Linton D., Clewley J.P., Burnens A., Owen R.J., Stanley J. An intervening sequence (IVS) in the 16S rRNA gene of the eubacterium Helicobacter canis II Nucleic Acids Res. 1994b. - V. 22.-№ 11.-P. 1954-1958.
111. Losekann T., Knittel K., Nadalig T., Fuchs B., Niemann H., Boetius A., Amann R. Diversity and abundance of aerobic and anaerobic methane oxidizers at the Haakon Mosby Mud Volcano, Barents Sea // Appl. Environ. Microbiol. 2007 (In press)
112. Louws F.G., Rademaker J.L.W., de Bruijn F.G. The three Ds of PCR-based genomic analysis of phytobacteria: diversity, detection and disease diagnosis // Ann. Rev. Phytopathol. -1999.-V. 37.-P. 81-125.
113. Lyamichev V., Brow M.A., Dahlberg J.E. Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases // Science. 1993- V. 260. - P. 778-783.
114. Macalady J., Banfield J. F. Molecular geomicrobiology: genes and geochemical cycling // Earth Planet. Sci. Lett. 2003. - V. 209. - P. 1-17.
115. Macilwain C. US launches probe into sales of unapproved transgenic corn // Nature. 2005.- V. 434. P. 423.
116. Malasarn D., Saltikov C.W., Campbell K.M., Santini J.M., Hering J.G., Newman D.K. arrA is a reliable marker for As(V) respiration // Science. 2004. - V. 306. - P. 455.
117. Abi S.A. MarquesI; Anne Marchaisonll; Louis Gardanll; Régine Samsonll. BOX-PCR-based identification of bacterial species belonging to Pseudomonas syringae P. viridiflava group Genetics and Molecular Biology Genet. Mol. Biol. -2008. V.31(l). - P.678
118. Martinez-Garcia M., Diaz-Valdes M., Wanner G., Ramos-Espla A., Anton J. Microbial community associated with the colonial ascidian Cystodytes dellechiajei II Environ. Microbiol. -2007.-V. 9.-№2.-P. 521-534.
119. Masson L., Erlandson M., Puzstai-Carey M., Brousseau R., Juarez-Perez V., Frutos R. A holistic approach for determining the entomopathogenic potential of Bacillus thuringiensis strains // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 4782-4788.
120. Mayer L.W. Use of plasmid profiles in epidemiologic surveillance of diseases outbreaks and in tracing the transmission of antibiotic resistance // Clin. Microbiol. Rev. 1988. - V. 1. - P. 228-243.
121. McDonald I.R., Hall G.H., Pickup R.W., Murrell J.C. Methane oxidation potential and preliminary analysis of methanotrophs in blanket bog peat using molecular ecology techniques // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. -V. 21. - № 3. - P. 197-211.
122. McDonald I.R., Kenna E.M., Murrell J.C. Detection of methanotrophic bacteria in environmental samples with the PCR // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - № 1. -P. 116-121.
123. McDonald I.R., Murrell J.C. The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs // Appl. Environ. Microbiol. -1997a. V. 63. - № 8. - P. 3218-3224.
124. McDonald I.R., Murrell J.C. The particulate methane monooxygenase gene pmoA and its use as a functional gene probe for methanotrophs // FEMS Microbiol. Lett. 1997b. - V. 156. -P. 205-210.
125. McGregor B.J., Moser D.P., Aim E.W., Nealson K.H., Stahl D.A. Crenarchaeota in Lake Michigan sediment // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 1178-1181.
126. Moreno C., Romero J., Espejo R.T. Polymorphism in repeated 16S rRNA genes is a common property of type strains and environmental isolates of the genus Vibrio II Microbiology. 2002. - V. 148. - P. 1233-1239.
127. Munson M.A., Nedwell D.B., Embley T.M. Phylogenetic diversity of Archaea in sediment samples from a costal salt marsh // Appl. Anviron. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 4729-4733.
128. Murray B.E., Singh K.V., Heath J.D., Sharma B.R., Weinstock G.M. Comparison of genomic DNAs of different enterococcus isolates using restriction endonucleases with infrequent recognition sites // J. Clinic. Microbiol. 1990. - V.28. - P. 2059-2063.
129. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Res. 1980. - V. 8. - P. 4321-4325.
130. Myers L.E., Silva S.V.P.S., Procuniar J.D., Little P.B. Genomic fingerprinting of Haemophilus somnus isolates using a random amplified polymorphic DNA assay // J. Clin. Microbiol. 1993. -V. 31. - P. 512-517.
131. Mygind T., Birkelund S., Christiansen G. DNA sequencing reveals limited heterogeneity in the 16S rRNA gene from the rrnB operon among five Mycoplasma hominis isolates // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. - V. 48. - P. 1067-1071.
132. Mylvaganam S., Dennis P.P. Sequence heterogeneity between the two genes encoding 16S rRNA from the halophilic archaebacterium Haloarcula marismortui // Genetics. 1992. - V. 130. -P. 399-410.
133. Naganuma T., Kato C., Hirayama H., Moriyama N., Hashimoto J., Horikoshi K. Intracellular occurrence of e-proteobacterial 16S rDNA sequences in the vestimentiferan trophosome // Journal of Oceanography. 1997. - V. 53. - P. 193-197.
134. Nakagawa T., Fukui M. Molecular characterization of community structures and sulfur metabolism within microbial streamers in Japanese hot springs // Appl. Environ. Microbiol. -2003. V. 69. - P. 7044—7057.
135. Nakagawa T., Hanada S., Maruyama A., Marumo K., Urabe T., Fukui M. Distribution and diversity of thermophilic sulfate-reducing bacteria within a Cu-Pb-Zn mine (Toyoha, Japan) // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. - V. 41. - P. 199-209.
136. Ninet B., Monod M., Emler S., Pawlowski J., Metral C., Rohner P., Auckenthaler R., Hirschel B. Two different 16S rRNA genes in a mycobacterial strain // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34.-P. 2531-2536.
137. Nisbet E.G., Sleep N.H. The habitat and nature of early life // Nature. 2001. -V. 409. -№6823.-P. 1083-1091.
138. OgasawaraN., Nakai S., Joshikawa H. Systematic sequencing of the 180 kilobase region of the Bacillus subtilis chromosome containing the replication origin // DNA Res. 1994. - V. 1. -P. 1-14.
139. Ohkubo S., Iwasaki H., Hori H., Osawa S. Evolutionary relationship of denitrifying bacteria as deduced from 5S rRNA sequences // J. Biochem. (Tokyo). 1986. - V. 100. - № 5. - P. 12611267.
140. Ohkuma M., Noda S., Usami R., Horikoshi K., Kudo T. Diversity of nitrigen fixation genes in the symbiotic intestinal microflora of the termite Reticulitermes speratus II Appl. Environ. Microbiol. 1996. -V. 62. - P. 2141-2152.
141. Okubo Y., Futamata H., Hiraishi A. Characterization of phototrophic purple nonsulfiir bacteria forming colored microbial mats in a swine wastewater ditch // Appl. Environ. Microbiol.- 2006. V. 72. - № 9. - P. 6225-6233.
142. Olsen G.J., Lane D.J., Giovannoni S.J., Pace N.R., Stahl D.A. Microbial ecology and evolution: a ribosomal RNA approach // Ann. Rev. Microbiol. 1986,- V. 40.- P. 337-365.
143. Oremland R.S, Stolz J.F. The ecology of arsenic // Science. 2003. - V. 300. - P. 939-944.
144. Oren A., Ventosa A., Gutierrez M.C., Kamekura M. Haloarcula quadrata sp. nov., a square, motile archaeon isolated from a brine pool in Sinai (Egypt) // Int. J. Syst. Bacteriol. -1999.-V. 49.-P. 1149-1155.
145. Oz A., Sabehi G., Koblizek M., Massana R., Beja O. Roseobacter-like bacteria in Red and Mediterranean Sea aerobic anoxygenic photosynthetic populations // Appl. Environ. Microbiol. -2005.-V. 71.-P. 344-353.
146. Park Y.H., Hori H., Suzuki K., Osawa S., Komagata K. Phylogenetic analysis of the coryneform bacteria by 5S rRNA sequences // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - № 5. - P. 18011806.
147. Patel B.K., Love C.A., Stackebrandt E. Helix 6 of the 16S rRNA of the bacterium Desulfotomaculum australicum exhibits an unusual structural idiosyncrasy // Nucleic Acids Res.- 1992. V. 20.-P. 5483.
148. Paul J. H., Cazares L., Thurmond J. Amplification of the rbcL gene from dissolved and particulate DNA from aquatic environments // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - № 6. -P. 1963-1966.
149. Peinado M.A., Malkhosyan S., Velazquez A., Perucho M. Isolation and characterization of allelic losses and gains in colorectal tumors by arbitrarily primed polymerase chain reaction // Proc.Natl. Acad. Sei.USA. 1992. - V. 89.-P. 10065-10069.
150. Peterka M, Avgustin G. Ribosomal RNA genes from Prevotella bryantiv. organization and heterogeneity // Folia Microbiol (Praha). 2001. - V.46. - P. 67-70.
151. Pettersson B.L., Bolske G., Thiaucourt F., Uhlen M.5 Johansson K.E. Molecular evolution of Mycoplasma capricolum subsp. capripneamoniae strains, based on polymorphisms in the 16S rRNA genes // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 2350-2358.
152. Pettersson B., Leitner T., Ronaghi M., Bolske G., Uhlen M., Johansson K.E. Phylogeny of the Mycoplasma mycoides cluster as determined by sequence analysis of the 16S rRNA genes from the two rRNA operons //J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 4131-4142.
153. Pichard S. L., Campbell L., Paul J. H. Diversity of the ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase form I gene (rbcL) in natural phytoplankton communities // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - № 9. - P. 3600-3606.
154. Pietsch K., Waihlinger U., Brodmann P., Würz A. Scrreningverfahren zur Identifizierung gentechnisch veraenderter Lebensmittel // Deutsche Lebensmittel RundschauHefit 1977. - V. 2. -P. 35-38.
155. Poh C.L., Yeo C.C., Tay L. Genome fingerprinting by pulsed-field gel electrophoresis and ribotyping to differentiate Pseudomonas aeruginosa serotype 011 strains // Eur. J. Clinic. Microbiol. Infect. Dis. 1992. - V. 11. - P. 817-822.
156. Rainey F.A., Ward-Rainey N.L., Janssen P.H., Hippe E., Stackebrandt E. Clostridium paradoxum DSM 7308T contains multiple 16S rRNA genes with heterogenous intervening sequences // Microbiology. 1996. - V. 142. - P. 2087-2095.
157. Rainey F.A., Ward N.L., Morgan H.W., Toalster R., Stackebrandt E. Phylogenetic analysis of anaerobic thermophilic bacteria: aid for their reclassification // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. -P. 4772-4779.
158. Rich J.J., Heichen R.S., Bottomley P.J., Cromack K., Myrold D.D. Community composition and functioning of denitrifying bacteria from adjacent meadow and forest soils // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - № 10. - P. 5974-5982.
159. Ririe K.M., Rasmussen R.P., Wittwer C.T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction // Anal Biochem. 1997. - V. 245. - P. 154-160.
160. Salzberg S.L., Salzberg A.J., Kerlavage A.R., Tomb J.F. Skewed oligomers and origins of replication // Gene. 1998. - V. 217. - P. 57-67.
161. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
162. Sayada C., Denamur E., Orfila J., Catalan F., Elion J. Rapid genotyping of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein by the polymerase chain reaction // FEMS Microbiol. Lett. 1991.-V. 83.-P. 73-78.
163. Scala D.J., Kerkhof L.J. Nitrous oxide reductase (nosZ) gene-specific PCR primers for detection of denitrifiers and three nosZ genes from marine sediments // FEMS Microbiol. Lett. -1998.-V. 162.-P. 61-68.
164. Scala D.J., Kerkhof L.J. Diversity of nitrous oxide reductase (nosZ) genes in continental shelf sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - P. 1681-1687.
165. Scala D.J., Kerkhof L.J. Horizontal heterogeneity of denitrifying bacterial communities in marine sediments by terminal restriction fragment length polymorphism analysis // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 1980-1986.
166. Schleper C., Holben W., Klenk H.P. Recovery of crenarchaeotal ribosomal DNA sequences from freshwater-lake sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. — P. 321-323.
167. Shimizu T., Ohshima S., Ohtani K., Hoshino K., Honjo K., Hayashi H., Shimizu T. Sequence heterogeneity of the ten rRNA opérons in Clostridium perfringens // Syst. Appl. Microbiol. 2001. - V. 24. - P. 149-156.
168. Siemann S., Schneider K., Drottboomt M., Muller A. The Fe-only nitrogenase and the Mo nitrogenase from Rhodobacter capsulatus II Eur. J. Biochem. 2002.- V. 269. - P. 1650-1661.
169. Smith A.H., Lingas E.O., Rahman M. Contamination of drinking-water by arsenic in Bangladesh: a public health emergency // Bull. World Health Organ. 2000. - V. 78. - № 9. - P. 1093-1103.
170. Smith G.B., Tiedje J.M. Isolation and characterization of a nitrite reductase gene and its use as a probe for denitrifying bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58. - P. 376-384.
171. Sorokin D.Yu., Zhilina T.N., Lysenko A.M., Tourova T.P., Spiridonova E.M. Metabolic versatility of haloalkaliphilic bacteria from soda lakes belonging to the Alkalispirillum-Alkalilimnicola group // Extremophiles. 2006a. - V. 10. - № 3. - P. 213-220.
172. Springer N., Ludwig W., Amann R., Schmidt H. J., Goertz H. D., Schleifer K. H. Occurrence of fragmented 16S rRNA in an obligate bacterial symbiont of Paramecium caudatum // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. - V. 90. - P.9892-9895.
173. Sriprakash K.S, Gardiner D.L. Lack of polymorphism within the rRNA operons of group A streptococci // Mol. Gen. Genet. 1997. - V. 255. - P.125-130.
174. Stachl D.A. Molecular approaches for the measurement of density, diversity and phylogeny // In: Manual of enviromental microbiology / Hurst C.J. (Ed.). Washington DC: American Society for Microbiology, 1997. - P. 102-114.
175. Stahl D.A., Lane D.J., Olsen G.J., Pace N.R. Characterization of Yellowstone hot spring microbial community by 5S rRNA sequences // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 49. -P.1379-1384.
176. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. - V. 44. - P.846-849.
177. Stackebrandt E., Rainey F.A., Ward-Rainey N. Anoxygenic phototrophy across the phylogenetic spectrum: current understanding and future perspectives // Arch. Microbiol. 1996. -V. 166.-№4.-P. 211-223.
178. Stahl D.A., Lane D.J., Olsen G.J., Pace N.R. Characterization of Yellowstone hot spring microbial community by 5S rRNA sequences // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 49. -P.1379-1384.
179. Stern M.J., Ames G.F.L., Smith N.H., Robinson E.C., Higgins C.F. Repetative extragenic palindromic sequences: a major component of the bacterial genome // Cell. 1984. - V. 37. -P. 1015-1026.
180. Stres B., Mahne I., Avgustin G, Tiedje J.M. Nitrous oxide reductase (nosZ) gene fragments differ between native and cultivated Michigan soils // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. -№1.- P. 301-309.
181. Tabita F. R. Microbial ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a different perspective // Photosynth. Res. 1999. - V. 60. - P. 1-28.
182. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization // Nature Biotechnology. 1996. - V. 14. - P. 303-308.
183. Tram C., Simonet M., Nicolas M.-H., Offredo C., Grimont F., Lefevre M., Ageron E., Debure A., Grimont P.A.D. Molecular typing of nosocomial isolates of Legionella pneumophila serogroup 3 // J. Clinic. Microbiol. 1990. - V. 28. - P. 242-245.
184. Tsygankova S.V., Ignatov A.N., Boulygina E.S., Kuznetsov B.B., Korotkov E.V. Genetic relationships among strains of Xanthomonas campestris pv. campestris revealed by novel rep-PCR primers // Eur. J. Plant Pathol. 2004. - V. 110. P. - P. 845-853.
185. Ueda K., Seki T., Kudo T., Yoshida T., Kataoka M. Two distinct mechanisms cause heterogeneity of 16S rRNA // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 78-82.
186. Ueda T., Suga Y., Yahiro N., Matsuguchi T. Remarkable N2:fixing bacterial diversity detected in rice roots by molecular evolutionary analysis of nifH gene sequences // J. Bacteriol. -1995,-V. 177.-P. 1414-1417.
187. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. 1994. - V. 10. - № 5. - P. 569-570.
188. Versalotic J., Koeuth T., Lupski J.R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes // Nucleic Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 6823-6831.
189. Vetriani C., Reysenbach A.L., Dore J. Recovery and phylogenetic analysis of archaeal rRNA sequences from continental shelf sediments // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 161. -P. 83-88.
190. Vetriani C., Jannasch H.W., MacGregor B., Stahl D.A., Reysenbach A.-L. Population structure and phylogenetic chracterization of marine benthic archaea in deep-sea sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - № 10. - P. 4375-4384.
191. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Muiper M., Zabeau M. AFLP: a new concept for DNA fingerprinting // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 21. - P. 4407-4414.
192. Wang G.C., Wang Y. The frequency of chimeric molecules as a consequence of PCR co-amplification of 16S rRNA genes from different bacterial species // Microbiology. 1996. -V. 142.-P. 1107-1114.
193. Wang Y., Zhang Z., Ramanan N. The actinomycete Thermobispora bispora contains two distinct types of transcriptionally active 16S rRNA genes // J.Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 3270-3276.
194. Ward D.M., Weller R., Bateson M.M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in natural community //Nature. 1990. - V. 345. - P. 63-65.
195. Watson G. M. F., Tabita F. R. Microbial ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a molecule for phylogenetic and enzymological investigation // FEMS Microbiol. Lett. 1997. -V. 146.-№ l.-P. 13-22.
196. Watson G. M. F., Yu J. P., Tabita F. R. Unusual ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase of anoxic archaea // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - № 5. - P. 1569-1575.
197. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. 1990.-V. 18.-P. 7213-7218.
198. Welsh J., McClelland M. Genomic fingerprints produced by PCR with consensus tRNA gene primers //Nucleic Acids Res. -1991. -V. 19. P. 861-866.
199. Whitcombe D., Theaker J., Guy S.P., Brown T., Little S. Detection of PCR products using self-probing amplicons and flourescence // Nat. Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 804-807.
200. Widmer F., Shaffer B.T., Porteous L.A., Seidler R.J. Analysis of nz/H gene pool complexity in soil and litter at a Douglas fir forest site in the Oregon Cascade Mountain Range // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 63. - P. 374-380.
201. Whitford M.F., Forster R.J., Beard C.E., Gong J., Teather R.M. Phylogenetic analysis of rumen bacteria by comparative sequence analysis of cloned 16S rRNA genes(ss) // Anaerobe. -1998.-V. 4.-№3.-P. 153-163.
202. Williams J.G-K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res.- 1990.-V. 18.-P. 6531-6535.
203. Wittwer C.T., Herrmann M.G., Moss A.A., Rasmussen R.P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification // Biotechniques. 1997. - V. 22. - P. 130-138.
204. Woese C.R., Gutell R., Gupta R., Noller H.F. Detailed analysis of the higher-order structure of 16S-like ribosomal ribonucleic acids // Microbiol. Rev. 1983.- V. 47,- P. 621-669.
205. Woese C.R. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 1987. - V. 51.- P. 221-271.
206. Woese C.R. The universal ancestor // Proc.Natl. Acad. Sci. 1998. - V. 95. - P. 6854-6859.
207. Wright A.D., Toovey A.F., Pimm C.L. Molecular identification of methanogenic archaea from sheep in Queensland, Australia reveal more uncultured novel archaea // Anaerobe. 2006. -V. 12.-№3.-P. 134-139.
208. Yap W.H, Wang Y. Molecular cloning and comparative sequence analyses of rRNA operons in Streptomyces nodosus ATCC 14899 // Gene. 1999. - V. 232. - P. 77-85.
209. Yap W.H., Zhang Z., Warg Y. Distinct types of rRNA operons exist in the genome of the actinomycete Thermomonospora chromogena and evidence for horizontal transfer of an entire rRNA operon // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 5201-5209.
210. Yoon J.-H., Yim D.K., Goodfellow M., Park Y.-H. Sequence analysis of 16S rRNA genes amplified from two ribosomal RNA gene clusters of Bifidobacterium bifidum II Antonie van Leeuwenhoek. 1999. - V. 75. - P. 329-333.
211. Yutin N., Suzuki M.T., Beja O. Novel primers reveal wider diversity among marine aerobic anoxygenic phototrophs // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. - P. 8958-8962.
212. Zehr J., McReynolds L. Use of degenerate oligonucleotide primers for amplification of the nifH gene from the marine cyanobacterium Trihodesmium thiebautii II Appl. Environ. Microbiol. 1989.-V. 61. - P. 2427-2532.
213. Zumft W.G. Cell biology and molecular basis of denitrification // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. - V. 61. - P. 533-616.7
-
Кузнецов, Борис Борисович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.03
- Поиск фармакологических мишеней для терапии рака молочной железы на основе компьютерного моделирования регуляции клеточного цикла
- Разработка метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов на основе структурного полиморфизма гена отр2
- Разработка идентификации Bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов
- Характеристика новых линий репортерных мышей для изучения экспрессии фактора некроза опухолей in vivo и in vitro
- Субстратная специфичность и цитотоксический эффект глюкозилтрансферазы LGT1 Legionella pneumophila
