Молекулярная характеристика древней ДНК человека и животных из коллекционного материала и археологических находок

Куликов, Евгений Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная характеристика древней ДНК человека и животных из коллекционного материала и археологических находок
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная характеристика древней ДНК человека и животных из коллекционного материала и археологических находок"

На правах рукописи

Куликов Евгений Евгеньевич

Молекулярная характеристика древней ДНК человека и животных из коллекционного материала и археологических находок

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология 03.00.14 - антропология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онкогенеза Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН (зав. лаб. академик Л. Л. Киселев) на базе Межинститутского Кабинета по изучению древней ДНК ИМБ РАН (руководитель к.б.н. А. Б. Полтараус).

Научные руководители: кандидат биологических наук А. Б. Полтараус доктор исторических наук А. П. Бужилова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Д. А. Крамеров доктор биологических наук В. В. Носиков

Ведущая организация: Медико-генетический научный центр РАМН

Защита состоится_2004 г. в часов на заседании Диссертационного совета

Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук

А. М. Крицын

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Разработка методов анализа следовых количеств ДНК с помошью полимеразной цепной реакции (ГЩР) сделала возможным анализ древней ДНК - генетического материала, выделенного из образцов останков живых организмов и их частей значительного срока давности [Kaestle, НогеЬи^, 2002]. Антропологи и археологи и ранее использовали молекулярные характеристики ДНК, полученные для современного населения Земли, с целью описания изменчивости человека и выяснения вопросов антропогенеза, однако лишь анализ палео-ДНК позволил непосредственно ввести параметр времени в эти исследования. Спектр объектов, из которых можно выделить древнюю ДНК, весьма широк - от антропологических и палеонтологических находок до копролитов диких животных. То, что древняя ДНК находится в палеоматериале в следовых количествах, обусловило одну из важнейших проблем при ее исследовании -проблему аутентичности получаемых результатов [Лёсоск et а1., 2001].

Возможность применения в комплексных междисциплинарных исследованиях методов анализа древней ДНК из музейного, коллекционного материала и археологических находок, делает нашу работу актуальной для широкого круга специалистов разных областей науки. Расшифровка генома человека способствовала развитию целого ряда научных направлений в области молекулярной генетики, в частности этногеномики и палеогеномики [Лимборская и др., 2002]. Данные о генофонде уже не существующих популяций человека представляют несомненную научную значимость для изучения биологической истории современных народов, характеристики их генофондов и оценки основных направлений эволюции всего человечества. Исследования древней ДНК животных и растений помогают определить направления эволюции их геномов.

Настоящая работа включала в себя разработку методик выделения и амплификации аутентичных препаратов древней ДНК и непосредственное применение методов исследования древней ДНК человека и животных для решения конкретных научных задач в рамках комплексных исследований.

Цель и задачи исследования

Основной целью данного исследования является применение молекулярно-генетического анализа древней ДНК для решения конкретных научных задач

антропологии, зоологии, археологии и истории. Для достижения поставленной цели надо было решить следующие задачи:

1. Разработать и апробировать на различных образцах системы выделения и амплификации аутентичных последовательностей древней ДНК из биологического материала различной видовой принадлежности и различного срока хранения.

2. Доказать возможность использования музейных антропологических образцов волос человека в качестве источника древней ДНК для молекулярно-генетического анализа. Установить структуру митотипов модельной популяции восточных эвенков, определить генетические расстояния между этой и другими этническими популяциями Азии. Установить уровень внутрипопуляционного нуклеотидного разнообразия гипервариабельного сегмента I митохондриальной ДНК (ГВС1 мтДНК) у восточных эвенков.

3. Провести анализ митотипов и молекулярное типирование пола на древней ДНК взрослых индивидуумов и младенцев, синхронно захороненных на территории погребально-поминального комплекса Березовая Лука (Алтай, Ш-П тыс. до н.э.). Попытаться установить возможную этническую принадлежность погребенных и степень их родства.

4. Провести исследование палео-ДНК недавно описанного вида вымершего копытного животного из Юго-Восточной Азии Pseudonovibos spiralis. Уточнить таксономическое положение данного вида среди прочих копытных путем сравнительного филогенетического анализа первичной последовательности гена 12S pPHK этого вида.

Научная новизна и практическая ценность работы

В первой части работы мы разработали и апробировали методики молекулярно-генетического анализа древней ДНК, выделенной из музейной антропологической коллекции образцов волос восточных эвенков, взятой в качестве модели Впервые охарактеризована структура митохондриального генофонда восточных эвенков, показан высокий уровень внутрипопуляционного нуклеотидного разнообразия, рассчитаны генетические расстояния между восточными эвенками и родственными популяциями Азии. Эта работа является первым молекулярным исследованием популяций человека, основанным на анализе мтДНК, выделенной из коллекционного материала значительного (30 лет) срока хранения.

Во второй части работы мы провели комплексное исследование (анализ митотипов, молекулярное типирование пола) древней ДНК из костных останков взрослых и младенцев, найденных в синхронном захоронении на территории поминально-погребального комплекса эпохи бронзы Березовая Лука (предгорья Алтая, III-II тыс. до н.э.). Нами были получены и анализированы последовательности древней ДНК из костей младенцев высокой давности захоронения. Данные о половой принадлежности погребенных младенцев, существенные для археологов и историков, изучающих данный исторический памятник, не могли быть получены классическими методами физической антропологии. Это исследование, равно как и попытка определения этнической принадлежности погребенных по их митотипам, делает проделанное исследование значимым для историко-археологической интерпретации памятника.

В третьей части работы нами была исследована древняя ДНК недавно описанного вымершего вида копытных животных Pseudonovibos spiralis, выделенная из единственного в нашей стране музейного образца рогов и лобной кости этого вида. Всего в мире насчитывается менее двух десятков таких образцов. Вид был описан лишь на основании необычных по форме рогов, и пока не было найдено целого скелета или черепа представителя этого вида. Необычное сочетание морфологических признаков рогов, разрозненность и недостоверность имеющейся о виде информации делают таксономический статус P. spiralis объектом активной дискуссии зоологов. Наше исследование позволило получить новую информацию о систематическом положении этого вида среди копытных.

Апробация

Материалы диссертации были доложены на Антропологических Чтениях памяти акад. В. П. Алексеева (2001), 6-й международной конференции им. В.А. Энгельгардта (2003), конференциях программы «Геном Человека» (2000, 2001), 6th International Conference on Ancient DNA and Associated Biomolecules (Jerusalem, 2002), Северном Археологическом Конгрессе (Ханты-Мансийск, 2003), юбилейной конференции ИМБ РАН, посвященной 100-летию со дня рождения академика А. А. Баева (2004).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 132 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы (205 наименований). Диссертация содержит 14 рисунков и 12 таблиц.

Благодарности

Автор работы выражает искреннюю признательность своим руководителям: к.б.н. А. Б. Полтараусу, д.и.н. А. П. Бужиловой, а также соавторам и участникам проектов:, к.б.н. И. А. Лебедевой (ИМБ РАН), д.б.н. Н. Б. Петрову (НИИФХБ им. Белозерского, МГУ), д.б.н. Г. В. Кузнецову, д.б.н. М. В. Холодовой (ИПЭиЭ РАН), Ю.А. Серегину (ГосНИИГенетика), к.б.н. В. А. Шереметьевой (МГУ), к.б.н. Н. В. Ивановой (ИМБ РАН), проф. Е. Н. Черных (ИА РАН). За интерес и поддержку работы автор благодарит акад. РАН Т. И. Алексееву, чл.-корр. РАН Н. А. Макарова (ИА РАН), д.б.н. Е. В. Балановскую (МГНЦ РАМН).

Материалы и методы

Подготовка к исследованию древней ДНК

Высокая чувствительность применяемых в исследовании древней ДНК методов обусловила проблему контаминации (загрязнения) исследуемых образцов следами современной ДНК. В этом отношении исследования палео-ДНК человека представляют особую сложность. Для противодействия контаминации исследуемого материала всю работу проводили в специально предназначенном для исследования палео-ДНК стерильном боксе. Выделение и амплификацию древней ДНК и последующий анализ ПЦР-продуктов проводили в раздельных помещениях. Одноразовую лабораторную пластиковую посуду ("TrefT, "QSP") обрабатывали автоклавированием в герметичных емкостях объемом 800 мл с добавкой 10 мкл диэтилпирокарбоната (Serva) при 1 атм в течение 30 минут. Металлический инструмент стерилизовали в сухожаровом шкафу при +200 градусах в течение 2 часов. При работе использовали одноразовые стерильные маски и резиновые перчатки. Непосредственно перед исследованием рабочие поверхности обрабатывали 96% этанолом, металлический инструмент обжигали в пламени горелки. Все использованные в работе реактивы были квалификации «особо чистый» и Molecular Biology Grade. Этанол использовали асептически перегнанный в стеклянном аппарате.

Исследованный биоматериал и отбор проб

Тотальный препарат древней ДНК экстрагировали из плотных тканей изучаемых образцов: стержней волос, зубов, компактного вещества кости, рогового вещества. Для разрушения экзогенной контаминирующей ДНК, потенциально находящейся на образце, перед отбором проб костного и рогового вещества поверхность образца обрабатывали 1% раствором гипохлорита натрия, затем 96% этанолом. Поверхностный слой образца счищали стерильным надфилем, полученную поверхность обжигали на открытом пламени горелки. Измельченный образец ткани получали с глубины не менее 2 мм от поверхности образца при засверливании стерильным стальным сверлом (2.5 мм), собирая стружку в подготовленные стерильные микропробирки с винтовой крышкой. Вместе с отобранными пробами древнего биоматериала в параллель включали несколько (3-5) пустых пластиковых микропробирок для отрицательного контроля при выделении. Для проверки отсутствия загрязнения реактивов при отборе проб моделировали процесс выделения, засверливая пластиковую микропробирку в условиях, сходных с реальным образцом, и проводя получаемую пластиковую стружку через всё исследование. Из каждого образца биоматериала отбирали до 5 проб для последующего параллельного и независимого повторения молекулярного исследования.

Контроль за аутентичностью результатов

Для выявления возможной контаминации современной ДНК исследуемых образцов применяли множественные положительные и отрицательные параллельные контроли на всех стадиях исследования. Все исследованные образцы анализировали путем неоднократных амплификации из независимо выделенных препаратов древней ДНК, и только повторяемые воспроизводимые результаты считались аутентичными. Все методы предотвращения контаминации и контроля за ней полностью соответствовали критериям, общепринятым при исследовании древней ДНК.

Получение препаратов тотальной древней ДНК

Все используемые реактивы и материалы тестировали на отсутствие их загрязнения человеческой ДНК, амплифицируемой используемыми в работе системами. В каждую серию образцов в качестве отрицательных контролей выделения ДНК включали пустые пробирки и пробирки с пластиковой стружкой с этапа забора проб. Полученные препараты древней ДНК хранили в замороженном виде при -20°С.

Выделение древней ДНК из волос

Дня выделения ДНК использовали стержни волос без луковиц. Нарезанные на фрагменты длиной 1 см волосы, промытые последовательно раствором додецилсульфата натрия, дистиллированной водой и 96% этанолом, подсушивали на воздухе. Волосы заливали смесью для экстракции ДНК, состоящей из 0.2% водной суспензии ионообменной смолы Chelex-100 (Bio-Rad), содержащей протеиназу К (20 мкг/мкл, Applied Biosystems). Образцы инкубировали в течение 18 часов при 37°С и непрерывном перемешивании. Протеиназу К инактивировали нагреванием при 90°С в течение 10 минут, лизат центрифугировали и 5 мкл полученного после центрифугирования супернатанта использовали без дополнительной очистки в качестве матрицы для ПЦР.

Выделение древней ДНК из костного и рогового вещества

Полученный при отборе проб измельченный биоматериал (100-200 мг) заливали 500 мкл лизирующего реагента (ЮМ гуанидина тиоцианат, 0.1М Tris-HCl pH 6.4, 0.02М EDTA рН 8.0, Triton Х-100 1.3%). Инкубацию проводили при +65°С и непрерывном перемешивании в течение ночи. После экстрации образцы центрифугировали 5 минут при 13000 g, 500 мкл супернатанта переносили в чистую микропробирку. К аликвоте супернатанта прибавляли 500 мкл лизирующего реагента и 40 мкл 10% суспензии диатомита в деионизованной воде. Пробы инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После центрифугирования проб удаляли супернатант, осадок промывали дважды охлажденным до +4°С промывным раствором (0.1М Tris-HCl pH 6.4, 70% этанол), ресуспендируя и осаждая диатомит центрифугированием. Осадок диатомита со связанной ДНК высушивали. ДНК элюировали двумя аликвотами подогретой до +56°С деионизованной воды. Объединенный элюат использовали непосредственно как матрицу для амплификации древней ДНК.

Количественное определение связывания ДНК с используемым лабораторным пластиком

Незначительные количества ДНК, содержащиеся в палеоматериале, накладывают серьезные ограничения на методы молекулярного исследования. Для определения количества ДНК, адсорбирующейся на полипропиленовых микропробирках, проводили анализ с использованием радиоактивно меченой фосфором-32 ДНК. В качестве модельной ДНК использовали ПЦР-продукт длиной 300 п.н. 50 нг ПЦР-продукта, выделенного из агарозного геля, метили способом случайного праймирования с использованием

фрагмента Кленова и а-32Р-ёСТР. Процент включения изотопной метки составлял около 50%, удельная активность меченого ПЦР-продукта составляла около 2x10' актов распада в минуту на микрограмм ДНК. Инкубировали при комнатной температуре параллель из 10 полипропиленовых микропробирок (Ггей, QSP), в которые вносили 1 нг меченого ПЦР-продукта в 100 мкл деионизованной воды. После инкубации раствор ДНК удаляли, пробирки наполняли жидким сцинтиллятором и считали количество радиоактивной метки, связавшейся за время инкубации с внутренними поверхностями пробирок. Количество ДНК, связываемое при исследованных условиях, составило незначительную величину (порядка 0.005+100% нг).

ПЦР-амплификация древнейДНК

ПЦР проводили под слоем минерального масла, в объеме 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-НС1 (рН 8.3), 17 мМ сульфата аммония, 0.01% ^/у) Tween-20, 2.5 мМ хлорида магния, по 0.2 мМ каждого ёМТР (дезоксирибонуклеотидтрифосфатов), по 5 пмоль каждого из праймеров, 5 мкл препарата древней ДНК и 2.5 ед. ДНК-полимеразы Тад (ЗАО Синтол), свободной от ДНК. Для проведения ПЦР использовали амплификатор ДНК МС2 (ДНК-Технология). Режим термоциклирования для всех использованных систем праймеров подбирали экспериментально.

Амплификация митохондриальной ДНК

Для амплификации фрагмента гипервариабельного сегмента I митохондриальной ДНК (ГВС1 мтДНК) использовали праймеры Ь15'8' (5,-cccaaagctaagattctaat-3,), Н16228 Ь161'0 (5,-ccccatgcttacaagcaagt-3,), Н16410 (5'-gcgggatattgatttcacgg-З,)- Проводили 40 циклов в режиме: начальная денатурация - '5°С, 2 мин; затем в каждом из последующих циклов - денатурация - '4°, 30 с; отжиг праймеров, 30 с (праймеры Ь15'8'-Н16228: 50°, Ь161'0-Н16410: 56°); синтез ДНК (элонгация) - 72°, 2 мин. Ввиду ожидаемого высокого уровня деградации ДНК в образцах, была применена система амплификации всего ГВС1 мтДНК из двух перекрывающихся фрагментов, длиной 23' и 220 п.н. Для синтеза первого продукта применяли праймеры Ь15'8' и Н16228, для синтеза второго продукта - Ь161'0 и Н16410. Величина перекрытия фрагментов составляет 38 п.н.

Разработанная нами система ПЦР-амплификации позволяет реконструировать всю последовательность ГВС1 мтДНК.

Молекулярное шинирование пола

Для выявления наличия в палеоматериале ДНК половой хромосомы Y была применена система амплификации короткого фрагмента альфоидного прицентромерного

повтора хромосомы Y DYZ1. Использовали праймеры DYZ1_2401D (5'-tccattccgttccgttcacatca-З') и DYZ1_2681R (5'-atcaaacggaatggaatggacaacc-3'), фланкирующие

мономер повтора DYZ1. Амплификацию (40 циклов) проводили в режиме: начальная денатурация - 95°С, 2 мин.; затем в каждом из последующих циклов - денатурация - 94°, 30 с; отжиг праймеров - 60°, 30 с; синтез ДНК - 72°, 2 мин. После последнего цикла образцы были инкубированы при 72° в течение 6 мин для финального удлинения.

Для одновременной амплификации последовательностей ДНК Y и X хромосом была применена ПЦР-система, синтезирующая фрагмент уникального ядерного X-Y гомологичного гена амелогенина. Разработанная нами система ПЦР включает два раунда амплификации. На первом раунде амплифицируется фрагмент гена длиной 212/218 (X/Y) п.н., на втором - длиной 106/112 (X/Y) п.н. В первом раунде использовали праймеры PrD (5'-acctcatcctgggcaccctgg-3') и PrR (5'-aggcttgaggccaaccatcag-3'), температура отжига 60°, во втором - BrD (5'-ccctgggctctgtaaagaatagtg-3') и BrR (5'-atcagagcttaaactgggaagctg-3'), температура отжига 56°. Проводили 40 циклов ПЦР в режиме: начальная денатурация -95°С, 2 мин.; затем в каждом из последующих циклов - денатурация - 94°, 30 с; отжиг праймеров - 57°, 30 с; синтез ДНК (элонгация) - 72°, 2 мин. При проведении двух раундов амплификации мтДНК первый раунд включал 40 циклов, температура отжига - 58°, второй раунд включал 35 циклов, температура отжига - 49°.

Амплификация гена 12S pPHK копытных животных

Для амплификации митохондриального гена 12S рРНК на древней ДНК Pseudonovibos spiralis были разработаны специальные системы праймеров. Праймеры на центральную часть гена были разработаны на основе сравнительного анализа консервативных участков этого гена для всех копытных животных, доступных в GeneBank. Используя последовательности ДНК, полученные при секвенировании центральной части гена 12S рРНК, нами были разработаны универсальные праймеры на области этого гена. В результате нескольких амплификации на древней матрице были синтезированы четыре перекрывающихся ПЦР-фрагмента гена 12S рРНК, длиной 150-450 п.н. каждый, перекрывающих совместно около 1000 п.н. последовательности гена. Были разработаны следующие праймеры: mttRNA-Phe389L (S'-ggcactgaaaatgcctagatg-S1), mtl2SrRNA707H (5'-cctgttagcttgggttaaacg-3') (I); mtl2SrRNA670L (5'-cagccaccgcgg[t/c]catac-3'), mtl2SrRNA860H (S'-ggtatctaatcccagtttg^OCII); mtl2SrRNA842L (5'-caaactgggattagatacc-

3'), mtl2SrRNA1015H (5'-ggt[g/a]aggt[t/c]tatcggggttt-3')(III); mtl2SrRNA985L (5'-ctataatcgataaaccccgata-31), mtl2SrRNA1379H (5'-ccaagcacactttccagtatg-3')(IV).

Амплификацию (40 циклов) проводили в режиме: начальная денатурация - 95°С, 2 мин.; затем в каждом из последующих циклов - денатурация - 94°, 30 с; отжиг праймеров: фрагмент I - 53°С, фрагмент II - 53°С, фрагмент Ш - 44°С, фрагмент IV - 44°С 30 с; синтез ДНК - 72°, 2 мин.

Секвенирование ДНК

ПЦР-продукты секвенировали без клонирования с использованием соответствующих геноспецифичных праймеров и набора ABI PRISM dRhodamine Dye Terminator Cycle sequencing kit в соответствии с протоколами фирмы-изготовителя, причем секвенировали обе цепи продуктов ПЦР.

Флуоресцентно меченные продукты амплификации анализировали на автоматическом секвенаторе ДНК ABI373A. Полученные электрофореграммы проверяли на отсутствие ошибок секвенирования и анализировали в программе Lasergene DNA*.

Результаты и обсуждение

Молекулярно-генетическая характеристика популяции восточных эвенков по данным анализа ДНК, выделенной из антропологической коллекции волос

В качестве материала для экстракции ДНК были использованы образцы волос эвенков Восточной Сибири, собранные в 1976 году Сибирской генетико-антропологической экспедицией кафедры антропологии Московского Университета (руководитель к.б.н. В. А. Шереметьева). Все исследованные не являлись родственниками по материнской линии.

Объектом настоящего исследования стали четыре популяции эвенков Восточной Сибири, разбросанные по рекам Алдан, Нюкжа, Зея и Селемджа (4 поселка, 29 индивидуумов). Тунгусо-говорящий народ - эвенки - относятся к алтайской языковой общности, обладают чертами среднесибирского (катангского, по Г.Ф. Дебецу, или саяно-енисейского, по М.Г. Левину) варианта байкальского антропологического типа североазиатской расы, объединяющей их с тюркоязычными и монголоязычными народами [Рогинский, Левин, 1963; Хрисанфова, Перевозчиков, 1998]. Эвенки - таежные охотники и оленеводы, при малой численности — 30000 человек — населяют таежную

полосу на огромной территории протяженностью в три тысячи километров от левобережий Енисеядо побережья Охотского моря

Таблица 1 Митотипы восточных эвенков

Позиции нуклеотидных замен указаны относительно «кембриджской» последовательности ГВС1 мтДНК. В левой колонке указаны номера образцов

Выбор популяции эвенков определялся как большой древностью этноса, так и тем, что эвенки практически не изучены в отношении вариабельности первичных структур их митохондриального генофонда. С помощью разработанной нами системы для выделения древней ДНК из волос были успешно выделены аутентичные препараты ДНК для всех исследуемых индивидуумов. Анализ результатов секвенирования ГВС1 митохондриальной ДНК, выделенной из образцов волос от 29 эвенков, указывает на то, что генетическая структура исследованной популяции восточных эвенков характеризуется высоким уровнем полиморфизма последовательностей исследованного участка мтДНК.

Из 421 секвенированных нуклеотидных позиций полиморфными оказались 51 (12.11%). У 29 индивидуумов было идентифицировано 25 митотипов, из которых 22 в исследованной популяции оказались уникальными (см. таблицу 1). Такая уникальность митотипов четырех малочисленных эвенкийских популяций может быть обусловлена значительной изоляцией этих поселков, рассеянных среди горных вершин Станового хребта и Джагды на территории 200 тыс. км2.

Сопоставление молекулярно-генетических характеристик эвенков Восточной Сибири с этническими популяциями Сибирского [Казаковцева и др., 1998], Тихоокеанского [Kolman et э1, 1996], Центральноазиатского, Восточноазиатского [Деренко, Шилдс, 1997] и Европейского [Oгekhov et э1., 1997] регионов позволяет охарактеризовать их митотипическую структуру как типичную для азиатской расы.

При значительном сходстве распределений вариабельных сайтов в разных доменах ГВС1 и частот их встречаемости в индивидуальных последовательностях геномов эвенков и русских, митотипические различия между ними велики (популяция русских [Oгekhov et э1., 1997] была взята для сравнения в качестве европеоидной). Аналогичная закономерность наблюдается и при сопоставлении распределений попарных нуклеотидных различий в популяциях восточных эвенков, монголов и русских

(рисунок 1).

1«

Рисунок 1. Распределение попарных нуклеотидных различий у эвенков, монголов и русских (Казаковцева и др., 1998; Kolman et al, 1996; Деренко, Шилдс, 1997; Orekhov <Л а1, 1997).

1В

О 2 4 в 8 10 12 14 16 1в 20

Профиль распределения для популяции восточных эвенков сходен с монгольским и существенно отличается от профиля распределения для популяции русских. Типично азиатский характер митотипической структуры эвенков Восточной Сибири вырисовывается и при сопоставлении оценок разнообразия нуклеотидных последовательностей в некоторых этнических популяциях Азии и в популяции русских. Рассчитанная нами величина долговременного нуклеотидного разнообразия E(v) в исследованной популяции составила 12.424, а в географически близких популяциях - от 15.571 (монголы) до 13.771 (корейцы).

Последовательность нуклеотидных замен в ГВС1 митохондриальной ДНК и характер взаимосвязей между митотипами восточных эвенков были пронализированы с использованием метода медианных сетей [Bandelt et al., 1995]. Для идентифицированных 25 митотипов нами была построена упрощенная медианная сеть (рисунок 2).

Медианная сеть для исследованной популяции эвенков имеет в качестве основы структуру звезды с митотипом 17 в положении центрального узла.

Рисунок 2. Упрощенная медианная сеть исследованной популяции восточных эвенков. Узлы сети соответствуют порядковым номерам митотипов. Буквами обозначены кластеры митотипов, соответствующие гаплогруппам [Macaulay et ей, 1998].

Транзиция С-Т в положении 16223, характеризующая митотип 17, относится к наиболее древним мутационным событиям в митохондриальном геноме человека -предполагается, что эта мутация случилась лишь однажды в истории человека. В частности, она определяет гаплогруппу I, широко распространенную у населения Европы и Азии [Richards et al., 2000]. Митохондриальный геном неандертальца также содержит эту замену [Krings et al., 1997].

Звездообразная структура медианной сети эвенков характеризуется малым количеством лучей, равным 5. По характеру ветвления и расположения на медианной сети обнаруженные митотипы эвенков можно выделить в шесть основных кластеров, соответствующих гаплогруппам - A, D, С, В, 2-2а, За. Медианную сеть исследованной популяции эвенков характеризует значительная филогенетическая удаленность митотипов друг от друга и от центрального митотипа. Это свидетельствует об очень высокой степени внутрипопуляционного нуклеотидного разнообразия изучаемой популяции и глубокой древности эвенков, что имеет антрополого-генетическое подтверждение [Rychkov, Sheremetyeva, 1977].

Для оценки степени генетических расхождений между эвенками Восточной Сибири и некоторыми этническими популяциями Азии нами были вычислены генетические расстояния на основе значений межпопуляционной дивергенции нуклеотидных последовательностей ГВС1 митохондриальной ДНК по нашим и литературным данным (табл. 2).

Этнос Генетическое расстояние Источник

Восточные эвенки 0 Собственные данные

Монголы 0,079 Colman et al., 1996

Корейцы 0,122 Деренко, Шилдс, 1997

Алтайцы 0,145 Деренко, Шилдс, 1997

Китайцы 0,153 Деренко, Шилдс, 1997

Айны 0,191 Деренко, Шилдс, 1997

Таблица 2. Генетические расстояния между эвенками и другими популяциями Азии.

Генетические расстояния оказываются минимальными с монголами (0,079), корейцами (0,122) и алтайцами (0,145), что и не удивительно, все они относятся к одной алтайской языковой общности, объединявшей некогда предков эвенков (тунгусов) с

предками монголов, тюрок и корейцев. Максимально удалены айны, по своему языку и культуре они занимают изолированное положение среди окружающих их народов, по антропологическому типу - относятся к айнской (курильской) расе и занимают нейтральное положение среди рас земного шара [Рогинский, Левин, 1963].

Результаты нашей работы доказывают возможность практического использования коллекционных образцов волос в качестве источника ДНК для молекулярно-генетических исследований в популяциях человека.

Характеристика ДНК древнего населения археологического памятника Березовая Лука (Алтай, эпоха бронзы)

Памятник елунинской археологической культуры Березовая Лука (Алтайский край), датируется Ш тыс. до н.э. - началом П тыс. до н.э. (ранняя бронза). Особое место среди полученного археологами материала занимают обнаруженные на поселении погребения младенцев. Захоронения младенцев столь значительной древности и высокой степени сохранности представляют большую редкость. Условия захоронения и степень сохранности образцов указывали на возможность успешного анализа древней ДНК.

Образцы 1 БЛ мог.З 2 БЛ мог.2 3 БЛ МОГ.6 4 БЛ мог.5 5 БЛ мог.1 6 БЛ М0Г.4 7 АБ1 к. 3 ск. 1 8 АБ! к. 3 ск. 2 9 БТ1 к. 2 10 ТВ! м. 1 ск. 1 11 ТВ1 м. 1 ск. 2 12 ТВ1 М.34

Тест на чистоту системы вьделения

Тест на чистоту ПЦР + + + + + + + + + + + +

Амплификация митохондриальной ДНК + + + - • ■ + + - - • -

Определение куклеотидной последовательности мтДНК + + + • - - + + - - ■ -

Тест на наличие X и У хромосом (ген амелогенина, 2 копии, 206/212 н.п.)

Тест на наличие У-хромосомы (ОУг1, 3500 копий, 200 н п ) - - • • - • + - - + - -

Таблица 3. Молекулярно-генетическое исследование древнего населения памятников Березовая Лука (1-6), Айна-Булак-1 (7-8), Булгартаботы-1 (9), Телеутский Взвоз-1 (10-11).

В качестве биологического материала для выделения ДНК были использованы фрагменты берцовых костей скелетов от 12 индивидуумов, обнаруженных на памятниках Березовая Лука, Айна-Булак-1, Булгартаботы-I, Телеутский Взвоз-I (табл. 3). 6 посткраниумов принадлежало младенцам (в возрасте от 0 до 4 месяцев) и б - взрослым людям обоих полов. При использовании системы выделения ДНК, основанной на селективной адсорбции на диатомите, были получены аутентичные препараты древней ДНК для всех индивидуумов.

Для пяти индивидуумов, найденных на поселении Березовая Лука (младенцы -образцы №1, 2, 3) и на памятнике Айна-Булак-I (взрослые - образцы №7 и 8) нами были определены нуклеотидные последовательности ГВС1 мтДНК. Каждый исследованный индивидуум обладает своим уникальным митотипом. Этот факт позволяет исключить возможное предположение археологов о родстве по материнской линии всех исследованных индивидуумов. Митотипы древних обитателей Березовой Луки (табл. 4) были сравнены с наборами последовательностей ГВС1 мтДНК для различных современных популяций - этнических популяций Передней и Средней Азии (N=539) [Richards et al., 1996], монгол (N=103) [Kolman et al., 1996], этнических популяций Средней Азии (N=205) [Comas et al., 1998], алтайцев (N=17) [Shields et al., 1993], кетов и селькупов (N=33) [Kazakovtseva et aL, 1998], коряков, эвенов, якутов (N=88) [Деренко, Шилдс, 1997] и восточных эвенков (N=29) (собств. данные)

Номер митотипа Номер образца Описание Позиция, нуклеотидные замены

1 1 Младенец 16185 С-Т, 16207 A-G, 16223 С-Т, 16260 С-Т

2 2 Младенец 16107 С-Т, 16147 С-Т, 16150 С-Т, 16223 С-Т, 16227 А-С, 16290 С-Т, 16311 Т-С, 16319 G-A

3 3 Младенец 16185 С-Т, 16223 С-Т, 16260 С-Т, 16298 Т-С

4 7 Взрослый мужчина 16129G-A

5 8 Взрослая женщина 16126 Т-С, 16163 A-G, 16186 С-Т, 16189 Т-С, 16294С-Т

Таблица 4. Митотипы древнего населения, оставившего поселение Березовая Лука. Позиции нуклеотидных замен нумеруются относительно «кембриджской» последовательности.

Митотип 1, найденный у индивидуума 1, не был описан ранее в доступных нам источниках. Однако, характеризующая его комбинация нуклеотидных замен (позиции 16185, 16207, 16223, 16260) была наблюдаема только в монголоидных группах. Данная характерная комбинация замен не встречается у анализированных европейских и переднеазиатских этнических популяций.

Следует отметить, что нуклеотидные замены в указанных выше положениях всегда сцеплены с транзицией в положении 16298. В митотипе 1 эта замена отсутствует. Возможно, что данный митотип представляет провариант распространенного у современных монголоидов сочетания, в случае позднейшего возникновения и распространения замены в положении 16298. Не исключено также, что замена 16298 была утеряна у данного индивидуума вторично, тем более что у другого представителя исследуемой группы (митотип 3) эта замена присутствует.

Еще одна замена в положении 16207, характеризующая митотип 1, уникальна и нигде ранее не была обнаружена.

В целом, на основе анализа митотипа 1 можно сделать вывод о принадлежности младенца 1 по материнской линии к монголоидной этнической группе.

Митотип 2, найденный у индивидуума 2, содержит восемь замен относительно «кембриджской» последовательности. Транзиции 16107, 16147, 16150, 16227 относятся к уникальным или крайне редким мутациям, отсутствующим в анализированных группах мирового населения. Остающиеся четыре мутации широко встречаются среди различных этнических групп, но частота их встречаемости выше у представителей азиатской расы. Транзиции 16223, 16290 и 16319 являются тремя из четырех мутаций, характеризующих азиатскую гаплогруппу A [Wallace, Torroni, 1992]. Четвертая характерная мутация (16362), связанная с предыдущими тремя, отсутствует в митотипе 2. Мы можем предположить, что в бронзовом веке существовал вариант азиатской гаплогруппы А без этой замены, а она появилась и получила распространение в более позднее время.

Теоретически возможно и другое объяснение присутствия данного митотипа в группе алтайцев. С одной стороны, гаплогруппа А имеет весьма ограниченное распространение среди современных популяций, населяющих Сибирь [Деренко, Шилдс, 1997]. С другой стороны, сцепленные транзиции в позициях 16223 и 16311 достаточно часто встречаются в европеоидных группах, и существует вариант, содержащий замены 16223,16311 и 16319 (идентифицирован в двух образцах, [Richards et al, 1996]). Поэтому, хотя европейское происхождение митотипа 2 маловероятно, его нельзя исключить полностью.

Следует обратить внимание на очень значительное, применительно к монголоидным группам населения, число нуклеотидных замен в митотипе 2 относительно кембриджской последовательности. В выборке монгол [Kolman et al., 1996] только 3 из 103 индивидуумов имеют по 7 замен в исследованном нами участке мтДНК, и ни один не несет восемь замен. У европеоидов различия с кембриджской последовательностью и того меньше - идентифицировано только 2 образца в выборке из 539 с 6 заменами, и ни одного - с 7 и более [Richards et al., 1996].

Вышесказанное свидетельствует о наибольшей вероятности принадлежности митотипа 2 представителю азиатской расы, однако полностью исключить его европейское происхождение нельзя.

Митотип 3, найденный у индивидуума 3, характеризуется четырьмя нуклеотидными заменами в позициях 16185, 16223, 16260 и 16298. Идентичные последовательности, характерные для монголоидов, были описаны для одного монгола [Kolman et al., 1996] и одного казаха [Comas et al., 1998]. Последовательности, похожие на митотип 3 и отличающиеся от него только одной заменой, были описаны для двух алтайцев [Shields et al., 1993]. Для европейских и переднеазиатских популяций этот митотип не был описан. Наиболее близкий к митотипу 3 вариант ГВС1 мтДНК, описанный для Европы, отличается от него тремя мутациями .Таким образом, митотип 3 можно считать типично азиатским.

Митотип 4, найденный у индивидуума 7 (взрослый мужчина), отличается от «кембриджской» последовательности только одной заменой в позиции 16129. Этот митотип и относится к наиболее часто встречаемой в Европе гаплогруппе Н, и никогда не встречался в азиатских группах. Равномерное распределение этого митотипа и его высокая частота встречаемости среди популяции Европы указывает на его значительный эволюционный возраст.

Митотип 5, найденный у индивидуума 8 (взрослая женщина), содержит комбинацию мутаций в позициях 16126 и 16294, определяющих гаплогруппу 2В. Данная гаплогруппа, подобно гаплогруппе Н, часто встречается в Европе (около 2% от общего числа митотипов).

Гаплогруппа 2В возникла на территории Передней Азии в верхнем палеолите (более 40000 лет назад) и проникла в Европу около 35000 лет назад [Wallace, Torroni, 1992]. Вследствие значительного эволюционного возраста митотипы, принадлежащие к гаплогруппе 2В, распределены в современном населении Европы достаточно равномерно и встречаются со средней частотой около 8%, достигая 10% в популяциях Южной Европы и 15.8% (3 из 19 индивидуумов) в Передней Азии [Richards et al., 1996].

Таким образом, индивидуумы 7 и 8 - взрослые мужчина и женщина - являются носителями типично европейских митотипов, характерных для современного населения Европы.

Погребенные младенцы (индивидуумы 1, 2, 3) являются носителями митотипов азиатской группы, унаследованных со стороны их матерей. Два из трех полученных митотипов (1, 3) являются типичными для монголоидов. Точечные мутации, идентифицированные в митотипе 2, также часто встречаются у современных представителей азиатской расы. Однако, данная комбинация замен встречается с небольшой частотой и у европеоидного населения Сибири.

Результаты проведенного нами анализа митотипов взрослых (образцы 7, 8 из кургана №3 могильника Айна-Булак-I) и младенцев (образцы 1, 2, 3 из могильника Березовая Лука) указывают на отсутствие между этими индивидуумами непосредственного родства по материнской линии. Выявленные нами у взрослых индивидуумов митотипы с наибольшей частотой встречаются у современного населения Европы, в то время как митотипы погребенных младенцев встречаются в современных азиатских группах. Это позволяет говорить о возможной принадлежности погребенных взрослых и младенцев к различным этническим группам.

В неолитический период население бассейна Оби имело тесные генетические связи с монголоидными племенами Восточной Сибири [Воевода и др., 1998]. Елунинская культура предположительно сформировалась в результате взаимодействия мигрантов, принесших с собой традиции бронзовой металлургии и развитое скотоводство, с местным, преимущественно монголоидным субстратом [Кирюшин и др., 1995]. По мнению автора раскопок на Березовой Луке А. А. Тишкина, молекулярные данные говорят в пользу его предположения о наличии взаимодействия пришедших европейских этнических групп и местного азиатского населения в предгорно-равнинной зоне Алтая (Верхнее Приобье) в конце Ш тыс. до н.э.

Для молекулярного типирования пола мы использовали два метода: амплификацию гена амелогенина, и метод специфичной амплификации мономера сателлитного повтора ДНК половой хромосомы Y.

Тест-система, амплифицирующая ген амелогенина, была апробирована ранее на палеоматериале [Faerman et al., 1998], и является в настоящее стандартной системой молекулярного типирования пола при ДНК-индивидуализации личности (CODIS loci set, FBI). Этот метод не позволил выявить в анализируемых образцах ни фрагмента ДНК с X хромосомы, ни фрагмента с Y хромосомы (см. табл. 2). Вероятно, чувствительность

системы детекции ДНК половых хромосом по уникальным генам недостаточна для исследуемого биологического материала.

Система амплификации короткого фрагмента альфоидного прицентромерного повтора хромосомы У ЭУ21 была апробирована в работе Овчинникова с соавторами на средневековом костном материале [ОусЫпшкоу е1 а1., 1998]. Небольшая длина ампликона (305 п.н.) в сочетании с высокой копийностью (около 3000 копий на мужской геном) и уникальной хромосомной специфичностью делают эту систему пригодной для определения наличия хромосомы У в препаратах древней ДНК, характеризующихся высокой степенью деградации. Так как используемая система позволяет определить только наличие хромосомы У в исследуемой пробе, в качестве контроля наличия амплифицируемой ДНК в образце служила параллельная контрольная амплификация фрагмента митохондриальной ДНК близкой длины. Это позволило отличить отсутствие хромосомы У, специфичной для мужского пола, от случаев деградации тотальной ДНК образца, и тем самым исключить ложные отрицательные результаты.

Второй метод ДНК-типирования пола позволил выявить специфичный продукт амплификации последовательностей, локализованных на У хромосоме у двух индивидуумов (табл. 2). Внутренним контролем сохранности ДНК образца служила амплификация фрагмента митохондриальной ДНК. Таким образом, образцы №7 (Айна-Булак-1, курган 3) и №10 (Телеутский Взвоз-1, могила 1) по результатам молекулярно-генетического анализа принадлежат индивидуумам мужского пола. Следует отметить, что для образца №10 не было успешной амплификации митохондриальной ДНК, что может быть связано с его худшей сохранностью.

Специфичная амплификация митохондриальной ДНК была достигнута в ходе анализа образцов № 1, 2, 3, 7 и 8 (табл. 2). Это позволяет считать, что в данных образцах палеоДНК имеет удовлетворительную сохранность для проведения полимеразной цепной реакции. Поэтому, отсутствие сигнала при анализе специфичных для хромосомы У повторов в образцах 1, 2, 3 и 8 указывает на их возможный XX кариотип. Следовательно, костные останки из могил 3, 2 и 6 памятника Березовая Лука, вероятнее всего, принадлежат индивидуумам женского пола.

Половую принадлежность костных останков других детей (образцы № 4, 5,6) и взрослых (образцы №9, И, 12) не удалось определить с помощью проведенных молекулярно-генетических анализов. ДНК, выделенная из этих образцов, не амплифицировалась методом ПЦР, что, вероятно, обусловлено се большой исходной деградацией. Результаты молекулярного типирования пола индивидуумов 7 и 8 (табл. 2)

полностью совпадают с результатами морфометрического определения пола останков, что еще раз подтверждает аутентичность получаемых данных.

Молекулярно-филогенетический анализ древней ДНК нового вида копытных Pseudonovibosspiralis W. P. Peter, A. W. Feiler

В период с 1992 по 1994 год во Вьетнаме были совершены сенсационные открытия трех новых видов парнокопытных млекопитающих, выделенных в самостоятельные роды: Pseudoryx nghetinhensis Vu Van Dung, Phatn Mong Giao, Nguyen Ngoc China, Do Tuoc, Peter Arctander, John MacKinnon, 1993; Megamuntiacus vuquangensis Do Tuoc, Vu Van Dung, Shanthini Dawson, Peter Arctander, John Mackinnon, 1994; и, наконец, Pseudonovibos spiralis Wolfgang P.Peter, Alfred Feiler, 1994. Если относительно двух первых упомянутых выше видов точно известно, что они реально существуют в природе, то третий вид пока еще никто из зоологов не обнаружил ни в натуральном виде, ни в виде скелета или целого черепа. Его описание было дано только на основании необычных по форме рогов, обнаруженных немецкими зоологами в провинциях Южного Вьетнама, граничащих с Камбоджей. Подробный морфологический анализ этого вида, таким образом, оказывается невозможным из-за наличия только фрагментарного биоматериала.

Исследование древней ДНК из образца рогов и фрагмента лобной кости (рисунок 3), принадлежащих этому виду, было проведено для выяснения его таксономического статуса методами молекулярной филогенетики. Ранее Хаммер с соавторами [Hammer et al., 1999] на основе анализа части последовательности митохондриального гена цитохрома b ошибочно поместили P. spiralis в непосредственной близости к представителям подсемейства Caprinae. Однако, надо иметь в виду чрезвычайно высокую консервативность последовательности гена цитохрома b, что в сочетании с малой величиной сравниваемых участков сильно уменьшает число филогенетически

Рисунок 3. Рога и череп вымершего копытного Pseudonovibos spiralis. Стрелками обозначены места отбора проб.

» о»

информативных признаков и снижает достоверность результатов филогенетической реконструкции.

Не исключена была и возможность прямой контаминации исследованного образца продуктами ПЦР, полученными ранее на ДНК других копытных, в частности, Rupicapra sp. [Hassanin, Douzery, 2000], так как в данной лаборатории проводились обширные исследования этой ДНК без обычных для древней ДНК предосторожностей.

Для исследования митохондриальной ДНК были использованы рога с лобной костью P. spiralis. Пробы для выделения древней ДНК были взяты как из двух точек рога, так и из двух точек лобной кости (см. рис. 3). Реконструированные из 4 ПЦР-фрагментов последовательности гена 12S рРНК, полученные из всех проанализированных образцов, оказались идентичными между собой и уникальными. Это подтверждает аутентичность полученных результатов, и позволяет отвергнуть предположение о фабрикации исследованного нами образца рогов и кости из биоматериала домашнего скота, показанной для образца из немецкой коллекции [Hassanin, Douzery, 2000].

Наибольшее сходство последовательности гена 12S рРНК Pseudonovibos spiralis выявлено с последовательностями этого гена у представителей рода копытных Bubalis. Нами была впервые получена и депонирована в международную базу Genebank первичная структура гена 12S рРНК копытного Bubalis bubalis (азиатского водяного буйвола). ДНК для этого анализа была выделена из образца рога этого животного, любезно предоставленного д.б.н. В. В. Сунцовым (ИПЭиЭ РАН, Тропцентр).

Полученные нами последовательности гена митохондриальной 12S рРНК Pseudonovibos spiralis (AF231029), Bubalus bubalis (AF231028), а также последовательности основных линий трибы Bovidae были присоединены к выравниванию полных последовательностей этого гена других копытных [Van de Peer et al., 2000]. Вид Cervus elaphus (AF091707) был использован в качестве внешней группы для укоренения филогенетических деревьев генов 12S рРНК.

Филогенетические деревья последовательностей генов 12S митохондриальных рРНК строили с использованием метода максимального правдоподобия (maximum likelihood) [Felsenstein, 1981]. Предварительный анализ с целью определения параметров, характеризующих гетерогенность скорости эволюции последовательностей по отдельным позициям, был проведен с помощью программы PUZZLE, версия 5.0 [Strimmer, von Haeseler 1996]. В этом анализе была использована модель эволюции последовательностей Хасегавы-Кишино [Hasegawa et al., 1985] и смешанная модель определения гетерогенности позиций по скорости эволюции (1 инвариантная + 4 гамма-категории). Полученные в этом анализе параметры были использованы для построения

филогенетического дерева последовательностей с помощью программы fastDNAml, версия 1.2.2 [Olsen et al., 1994]. Для оценки стабильности получающегося дерева был проведен поиск наилучшего дерева с сохранением набора субоптимальных деревьев с последующей оценкой их отличия от оптимального дерева по критерию Кишино-Хасегава [Kishino and Hasegawa, 1989]. Деревья, не отличающиеся по этому критерию от оптимального дерева, были использованы для построения консенсусного дерева. Результаты нашего анализа последовательностей генов 12S рРНК представлены в виде оптимального филогенетического древа на рис. 4.

Рисунок 4.

Филогенетическое дерево 28 видов семейства Bovidae, построенное на основании анализа

последовательностей генов 12SрРНК методоммаксимального правдоподобия (maximum likelihood). Цифры у узлов дерева представляют процентные доли соответствующих группировок на консенсусном дереве из 320субоптимальных деревьев.

Результаты сравнения последовательностей генов 12S рРНК говорят в пользу близкого родства P. spiralis с группой буйволов. На филогенетическом дереве генов 12S рРНК этот вид представляет собой первое ответвление в линии, ведущей к подтрибе Bubalina. Близкое родство P. spiralis с буйволами подтверждается и другими методами анализа, например, методом максимальной экономии без взвешивания позиций (данные приведены в диссертации), однако в этом случае P. spiralis включается в группу буйволов между африканским буйволом (Syncerus) и азиатскими буйволами (Bubalus). Несмотря на то, что эти альтернативные топологии не различаются по критерию Кишино-Хасегава, предпочтение следует отдать положению P. spiralis в основании подтрибы Bubalina, потому что такая топология дерева получена при использовании более реальной модели эволюции нуклеотидных последовательностей с учетом гетерогенности позиций по

скорости эволюции. В любом случае близкое родство последовательностей гена 12S рРНК этого вида с такими же последовательностями буйволов можно считать надежно установленным, потому что оно подтверждается также анализами с использованием метода четырехкластерного филогенетического картирования [Strimmer, К., von Haeseler, А., 1997], реализованного в программе PUZZLE.

Таким образом, на основании изучения совокупности морфологических признаков рогов и лобной кости, а также результатов филогенетического анализа последовательностей гена 12S рРНК, таксономическое положение рассматриваемого вида на данный момент времени можно представить в следующем виде:

семейство Bovidae Gray, 1821

подсемейство Bovinae Gill, 1872

триба Bovini Simpson, 1945

подтриба Pseudonovibovina Кузнецов и соавт., 2001

род Pseudonovibos Peter, Feiler, 1994.

вид Pseudonovibos spiralis Peter, Feiler, 1994.

Выводы

1. Показана возможность использования антропологических коллекционных образцов волос в качестве источника ДНК для молекулярных исследований. Установлено, что структура митотипов исследованной модельной популяции эвенков типична для азиатской расы. Показан высокий уровень внутрипопуляционного нуклеотидного разнообразия митохондриальной ДНК восточных эвенков, вероятно связанный с глубокой древностью их генофонда.

2. Выделены препараты древней ДНК, пригодные для ПЦР-анализа, из останков людей, найденных в синхронном захоронении на территории комплекса Березовая Лука (Алтай, Ш-П тыс. до н.э.), в том числе из останков младенцев первых месяцев жизни. Анализ митотипов показал возможную принадлежность взрослых исследованных индивидуумов и младенцев к этническим группам различного генеза. Факт уникальности всех обнаруженных при исследовании митотипов позволяет отвергнуть предположение о родстве погребенных по материнской линии.

3. Молекулярное типирование пола 3-х погребенных младенцев и 2-х взрослых индивидуумов из Березовой Луки с высокой вероятностью указывает на женский пол погребенных младенцев. Полученные данные по половой принадлежности взрослых совпадают с данными антропологического исследования.

4. Из музейных образцов рогов и фрагмента лобной кости вымершего вида копытных из Юго-Восточной Азии Pseudonovibos spiralis был выделен аутентичный препарат древней ДНК. Филогенетический анализ последовательности гена 12S рРНК этого животного указывает на принадлежность вида P. spiralis к группе буйволов трибы Bovini.

5. Идентичность первичных структур древней ДНК, полученных из костного и рогового материала P. spiralis, а также их уникальность подтверждают аутентичность исследованных в работе образцов рогов и кости.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. И.А Лебедева, Е.Е. Куликов, Н.В. Иванова, А.Б. Полтараус. Определение нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в стержнях волос при длительных сроках их хранения. // Судебно-Медицинская Экспертиза, 3

(2000), стр. 9-14

2. G. V. Kuznetsov, E. E. Kulikov, N. В. Petrov, N. V. Ivanova, A. L. Lomov, M. V. Kholodova, А В. Poltaraus. The "Lihn Duong" Pseudonovibos spiralis (Mammalia, Artiodactyla) is a new buffalo. // Naturwissenschaften, 88(3) pp. 123-125 (2001)

3. G. V. Kuznetsov, E. E. Kulikov, N. B. Petrov, N. V. Ivanova, A. L. Lomov, M. V. Kholodova, A. B. Poltaraus. Mitochondrial 12s rDNA sequence relationships suggest that the enigmatic bovid "Lihn Duong" Pseudonovibos spiralis is closely related to buffalo. // Molecular Phylogenetics and Evolution, 23(1) pp. 91-94 (2002)

4. Г.В. Кузнецов, Н.Б. Петров, Е.Е. Куликов, Н.В. Иванова, М.В. Холодова, А.А. Ломов, А.Б. Полтараус. Таксономический статус и филогенетические отношения нового вида и рода парнокопытного Pseudonovibos spiralis W.P.Peter, A. Feiler, 1994 (Artiodactyla, Bovidae) // Зоологический журнал, 80(11), стр. 1395-1403

(2001)

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 17.11.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 1140. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова. 2-й учебный корпус, 627 к.

&24Р?s

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Куликов, Евгений Евгеньевич

Оглавление.

Введение.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Обзор литературы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная характеристика древней ДНК человека и животных из коллекционного материала и археологических находок"

Основные ДНК-мишени.9

Выбор образца. Контроль за контаминацией.16Отбор проб. Экстракция древней ДНК.19Амплификация древней ДНК.22Конкретные приложения палеогеномики: молекулярная филогенетика, этногеномика,палеопатология, молекулярная антропология.23Этические аспекты палеогеномных исследований.38Материалы и методы.47Подготовка к исследованию древней ДНК.47Исследованный биоматериал и отбор проб.47Контроль за аутентичностью результатов.48Получение препаратов тотальной древней ДНК.49Выделение древней ДНК из волос.49Выделение древней ДНК из костного и рогового вещества.49Количественное определение связывания ДНК с используемым лабораторнымпластиком.50ПЦР-амплификация древней ДНК.51Амплификация митохондриальной ДНК.51Молекулярное типирование пола.;.52Амплификация гена 12S рРНК копытных животных.53Секвенирование ДНК.54Результаты и обсуждение.55Молекулярно-генетическая характеристика популяции восточных эвенков по данныманализа ДНК, выделенной из антропологической коллекции волос.55Характеристика ДНК древнего населения археологического памятника Березовая Лука(Алтай, эпоха бронзы).66Молекулярно-филогенетический анализ древней ДНК нового вида копытныхPseudonovibos spiralis W. P. Peter, A. W. Feiler.79Выводы.93Благодарности.94Список литературы.95Приложение - Депонированные последовательности ДНК.111ВведениеАктуальность проблемыРазработка методов анализа следовых количеств ДНК с помошью полимеразной цепной реакции (ПЦР) сделала возможным анализ древней ДНК - генетического материала, выделенного из образцов останков живых организмов и их частей значительного срока давности [74]. Антропологи и археологи и ранее использовали молекулярные характеристики ДНК, полученные для современного населения Земли, с целью описания изменчивости человека и выяснения вопросов антропогенеза, однако лишь анализ палео-ДНК позволил непосредственно ввести параметр времени в эти исследования. Спектр объектов, из которых можно выделить древнюю ДНК, весьма широк - от антропологических и палеонтологических находок до копролитов диких животных. То, что древняя ДНК находится в палеоматериале в следовых количествах, обусловило одну из важнейших проблем при ее исследовании - проблему аутентичности получаемых результатов [1].

Возможность применения в комплексных междисциплинарных исследованиях методов анализа древней ДНК из музейного, коллекционного материала и археологических находок, делает нашу работу актуальной для широкого круга специалистов разных областей науки. Расшифровка генома человека способствовала развитию целого ряда научных направлений в области молекулярной генетики, в частности этногеномики и палеогеномики [199]. Данные о генофонде уже не существующих популяций человека представляют несомненную научную значимость для изучения биологической истории современных народов, характеристики их генофондов и оценки основных направлений.эволюции всего человечества. Исследования древней ДНКживотных и растений помогают определить направления эволюции их геномов и определить филогенетические связи древних видов с ныне существующими.

Исследование древней ДНК в рамках задач таких дисциплин, как антропология, археология, зоология возможно как на уровне единичной особи, так и на популяционном уровне. Возможность соотнесения получаемых в исследовании данных с современными данными значительно расширяет возможности применения анализа древней ДНК. Такой важнейший вопрос антропологии, как анализ возможных путей расселения современного человека по планете, в настоящее время решается с активным привлечением данных по анализу древней ДНК человека и культурных видов растений и животных.

ДНК-исследование древних патогенных микроорганизмов активно используется для определения направлений процессов эволюции возбудителей заболеваний человека и животных, а также для анализа особенностей распространения и течения инфекционных заболеваний у древнего населения.

Возможность анализа ДНК, выделенной из биоматериала, накопленного и систематизированного в богатейших зоологических, антропологических и музейных коллекциях, значительно расширяет временные границы ДНК-анализа, одновременно сокращая затраты на сбор материала. Кроме того, такое исследование является зачастую единственным способом получения информации о вымерших видах живых организмов.

Настоящая работа включала в себя апробацию на реальных образцах методик выделения и амплификации аутентичных препаратов древней ДНК, и непосредственное применение методов исследования древней ДНК человека и животных для решения конкретных научных задач в рамках комплексных междисциплинарных исследований.

Цели и задачи исследованияОсновной целью данного исследования является применение молекулярно-генетического анализа древней ДНК для решения конкретных научных задач антропологии, зоологии, археологии и истории. Для достижения поставленной цели надо было решить следующие задачи:1. Разработать и апробировать на различных образцах системы выделения и амплификации аутентичных последовательностей древней ДНК из биологического материала различной видовой принадлежности и различного срока хранения.

3. Провести анализ митотипов и молекулярное типирование пола на древней ДНК взрослых индивидуумов и младенцев, синхронно захороненных на территории погребально-поминального комплекса Березовая Лука (Алтай, III-II тыс. до н.э.). Попытаться установить возможную этническую принадлежность погребенных и степень их родства.

4. Провести исследование палео-ДНК недавно описанного вида вымершего копытного животного из Юго-Восточной Азии Pseudonovibos spiralis. Уточнить таксономическое положение данного вида среди прочихкопытных путем сравнительного филогенетического анализа первичной последовательности гена 12S рРНК этого вида.

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ онкогенеза Института молекулярной биологии РАН (зав. лаб. академик JI. JI. Киселев) на базе Межинститутского Кабинета по изучению древней ДНК ИМБ РАН (руководитель к.б.н. А. Б. Полтараус).

Научная новизна и практическая ценность работыВ первой части работы мы разработали и апробировали методики молекулярно-генетического анализа древней ДНК, выделенной из музейной антропологической коллекции образцов волос восточных эвенков, взятой в качестве модели. Впервые охарактеризована структура митохондриального генофонда восточных эвенков, показан высокий уровень внутрипопуляционного нуклеотидного разнообразия, рассчитаны генетические расстояния между восточными эвенками и родственными популяциями Азии. Эта работа является первым молекулярным исследованием популяций человека, основанным на анализе мтДНК, выделенной из коллекционного материала значительного (30 лет) срока хранения.

Во второй части работы мы провели комплексное исследование (анализ митотипов, молекулярное типирование пола) древней ДНК из костных останков взрослых и младенцев, найденных в синхронном захоронении на территории поминально-погребального комплекса эпохи бронзы Березовая Лука (предгорья Алтая, III-II тыс. до н.э.). Нами были получены и анализированы последовательности древней ДНК из костей младенцев большой давности захоронения. Данные о половой принадлежности погребенных младенцев, существенные для археологов и историков, изучающих данныйисторический памятник, не могли быть получены классическими методами физической антропологии. Это исследование, равно как и попытка определения этнической принадлежности погребенных по их митотипам, делает проделанное исследование значимым для историко-археологической интерпретации памятника.

Обзор литературыВведениеВозможность выделения и анализа ДНК из древних и ископаемых останков имеет сравнительно недолгую историю. Первая последовательность древней ДНК, полученная в лаборатории, принадлежала квагге - вымершему виду семейства зебр [51]. В следующем году была получена и первая последовательность древней ДНК человека [121]. Эти пионерские исследования и открыли новую страницу в изучении молекулярной истории живого. В то время возможности палеогеномных исследований были сильно ограничены высоким уровнем деградации и фрагментации геномной ДНК, последовавших в результате гидролиза и окисления при посмертных изменениях тканей. Настоящую революцию в области палеогеномики, как, впрочем, и в других отраслях молекулярной биологии, произвело открытие полимеразной цепной реакции (ПЦР), сделавшей возможной амплификацию миллионов копий коротких фрагментов ДНК со следовых количеств матрицы in vitro [106, 137]. Только применение ПЦР сделало возможным надежное и воспроизводимое типирование древних генетических маркеров [119].

Ранние исследования древней ДНК были сосредоточены главным образом на биохимии деградации древних нуклеиновых кислот, и в основном подтверждали эндогенную природу извлеченной из древних образцов ДНК [66, 120, 121, 122]. Несмотря на то, что ранние работы указывали на вероятность сохранности интактной ДНК в останках животных возрастом более миллиона лет [38, 183], последующая проверка показала неаутентичность данных, полученных в этих работах, из-за недостаточных мер предосторожности против загрязнения исследуемых образцов экзогенной современной ДНК при работе [185, 178]. Согласно современным представлениям, время жизни ПЦР-амплифицируемой ДНК в древнем образце не превышает 130000 лет, даже в идеальных условиях хранения образца [150, 88], причем эта цифра превышает ранние прогнозы [129,53]. Однако, палеогеномное исследование образцов, находящихся в данных временных рамках, имеет значительный потенциал для расширения знаний науки о эволюции и истории живого.

Основные ДНК-мишениВ контексте исследования древней ДНК имеется два главных источника нуклеиновых кислот: органеллы и ядро клетки. Несмотря на то, что большая часть ДНК находится в ядре, каждая диплоидная клетка содержит всего лишь две копии уникальных ядерных генов. С другой стороны, митохондрии и хлоропласты содержат небольшой процент геномной ДНК клетки, но при этом количество этих органелл исчисляется в клетке сотнями. Каждая из органелл содержит множество копий митохондриальной или хлоропластной ДНК - порядка тысяч копий на клетку. Высокая копийность ДНК органелл в клетке приводит к более высокой вероятности сохранности интактных сегментов ДНК этих органелл по сравнению с ядерной ДНК, и именно благодаря этому факту в настоящее время именно генетические маркеры ДНК органелл составляют предмет большинства палеогеномных исследований. С развитием современных технологий выделения и амплификации ДНК возрастает и количество работ, посвященных анализу древней ядерной ДНК [61, 63, 23]. Это значительно расширяет горизонт гипотез, которые могут быть проверены с помощью палеогеномных исследований, однако и количество неудач в подобных исследованиях на настоящее время относительно велико.

Наиболее часто ядерные генетические маркеры, расположенные на половых хромосомах, используют для геномного определения пола древних индивидуумов (в особенности в случае детских или фрагментированных останков; Раегшап е1 а!., 1998; БсЬииез е1 а!., 1999; СипЪа е1 а!., 2000). Кроме этого приложения, анализ этих маркеров может оказаться полезным при определении материнских (хромосома X) и отцовских (хромосома У) генетических линий, а также для обнаружения генетических заболеваний.

Большое количество ядерных маркеров, вполне пригодных для молекулярного типирования пола на современном материале, оказались непригодными для этой цели на древней ДНК из-за ряда факторов, так что в данный момент фактическими стандартами генов - маркеров хромосомного пола являются диморфный ген амелогенина [96], и различные мультикопийные микросателлиты половых хромосом [144,23].

Аутосомные ядерные маркеры могут быть использованы при установлении отцовства и материнства (в особенности мультикопийные микросателлитные маркеры), и для обнаружения некоторых генетических заболеваний и географически специфичных вариаций генома. Исследования повторяющихся участков различных хромосом человека актуальны для современной судебно-медицинской генетической экспертизы, позволяя устанавливать отцовство и идентифицировать преступников по их генетическому профилю. Так, фрагментированные останки жертв террористического акта в Нью-Йорке 11 сентября 2001 г. были идентифицированы благодаря исследованию профиля хромосомных сателлитов [11].

Митохондриальная ДНК - кольцевая молекула размером в 16569 п. н. - кодирует 13 субъединиц внутримембранного дыхательного комплекса, гены 2 рибосомных и 22 транспортных РНК [2] (рис. 1). В митохондриальном геноме можно выделить два основных участка: кодирующую область мтДНК и некодирующий, или контрольный регион (D-петля, displacement loop), содержащий начало (ориджин) репликации тяжелой цепи мтДНК и начало транскрипции обеих цепей. Этот некодирующий регион является наиболее вариабельным участком митохондриального генома и содержит около 23% вариаций всей молекулы митохондриальной ДНК [56].

Исследование генома митохондрий позволяет проводить анализ материнских линий во времени, так как митохондриальная ДНК передается только от матери к ребенку - матрилинейно и гаплотипически [148], благодаря элиминации митохондрий сперматозоида при оплодотворении. Важно также отметить, что рекомбинации междумолекулами митохондриальной ДНК не происходит. В этой связи митохондриальиый геном может эволюционировать только за счет последовательного накопления мутаций в поколениях.V-N13 1114571Н- А1и I 7025№* Ауз И 8249И/-Мае II8994I+■ А1и I 10028- N1 13704

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Куликов, Евгений Евгеньевич

Выводы

1. Показана возможность использования антропологических коллекционных образцов волос в качестве источника ДНК для молекулярных исследований. Установлено, что структура митотипов исследованной модельной популяции эвенков типична для монголоидной расы. Показан высокий уровень внутрипопуляционного нуклеотидного разнообразия митохондриальной ДНК восточных эвенков, вероятно связанный с глубокой древностью их генофонда.

2. Выделены препараты древней ДНК, пригодные для ПЦР-анализа, из останков людей, найденных в синхронном захоронении на территории комплекса Березовая Лука (Алтай, III-II тыс. до н.э.), в том числе из останков младенцев первых месяцев жизни. Анализ митотипов показал возможную принадлежность взрослых исследованных индивидуумов и младенцев к этническим группам различного генеза. Факт уникальности всех обнаруженных при исследовании митотипов позволяет отвергнуть предположение о родстве погребенных по материнской линии.

Благодарности

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куликов, Евгений Евгеньевич, Москва

1. Adcock G. J., Dennis E. S., Easteal S., Huttley G. A., Jermiin L. S., Peacock W. J., Thome A., Mitochondrial DNA sequences in ancient Australians: implications for modern human origins. // Proc Natl Acad Sci USA 2001. v. 98. p. 537-542.

2. Andrews L., Nelkin D. Whose body is it anyway? Disputes over body tissue in a biotechnology age. // Lancet 1998. v. 351, p. 53-57.

3. Aquadro C. F., Greenberg B. D. Human mitochondrial DNA variation and evolution: analysis of nucleotide sequences from seven individuals. // Genetics 1983. v. 103, p. 287-312.

4. Ashley R. A., Wee A. S. Construction of a simple multi-lead electrode for intraoperative nerve recording. Technical note. // J Neurosurg 1989. v. 70, p. 962-964.

5. Austin J. J., Smith А. В., Thomas R. H. Paleontology in a molecular world: the search for authentic ancient DNA. // Trends Ecol Evol 1997. v. 12, p. 303-306.

6. Bacher R., Suter P. J., Eggenberger P., Ulrich-Bochsler S., Meyer L. Aegerten Die ^ spaetroemischen Anlagen und der Friedhof der Kirche Buerglen. Bern: Staatlicher1.hrmittelverlag. 1990.

7. Bandelt H.-J., Forster P., Sykes B.C., Richards M.B. Mitochondrial portraits of human populations using median networks. // Genetics. 1995. V. 141. P. 743-753.

8. Barker P., Ellis C., Damadio S. (2000) Determination of cultural affiliation of ancient human remains from Spirit Cave, Nevada. Reno: Bureau of Land Management, Nevada State Office. (http://www.nv.blm.gov/cultural/spiritcaveman/SCfinalJuly26.pdf)

9. Bendall K., Sykes B. Length heteroplasmy in the first hypervariable segment of the human mtDNA control region. // Am J Hum Genet 1995. v. 57, p. 248-256.

10. Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M., Jansen C. L., Wertheimvandillen P. M. E., Vandernoordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. // J Clin Microbiol 1990. v. 28, p. 495-503.

11. Braun M., Cook D.C., Pfeiffer S. DNA from Mycobacterium tuberculosis complex identified in North American, pre-Columbian human sceletal remains. // J Archeol Sci 1998 v.25, pp. 271-277.

12. Bray T. The future of the past: archaeologists, Native Americans and repatriation. New York: Garland Publishing, 2001.

13. Brown W. M. Polymorphism of mitochondrial DNA in humans as revealed by restriction endonuclease analysis. // Proc Natl Acad Sci USA 1980. v. 77, p. 3605-3609.

14. Brown W. M., George M., Wilson A. C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. // Proc Acad Natl Sci USA 1979. v. 76, p. 1967-1971.

15. Burger J., Hummel S., Herrmann B. Palaeogenetics and cultural heritage. Species determination and STR-genotyping from ancient DNA in art and artifacts. // Thermochim Acta 2000, 141-146.

16. Cantwell A. -M., Friedlander E., Tramm M. L. Ethics and anthropology: facing future issues in human biology, globalism, and cultural property. New York: New York Academy of Sciences, 2000.

17. Carlyle S. W., Parr R. L., Hayes M. G., O'Rourke D. H. Context of maternal lineages in the Greater Southwest. // Am J Phys Anthropol 2000. v. 113, p. 85-101.

18. Cowgill U. M., Hutchinson G. E. Differential mortality among the sexes in childhood and its possible significance in human evolution. // Proc Natl Acad Sci USA 1963. v. 49, p. 425-429.

19. Dansie A. Early Holocene burials in Nevada: overview of localities, research and legal issues. // Hev Hist Soc Q 1997. v. 40, p. 4-14.

20. Deloria V. Jr. Secularism, civil religion and the religious freedoms of American Indians. In: Mihesuah D. A., ed. Repatriation reader: who owns American Indians remains? Lincoln, NE: University of Nebraska press, 2000. p. 169-179.

21. Dioli M, 1997. Notes on the morphology of the horns of a new artiodactyl mammal from Cambodia: Pseudonovibos spiralis. // J Zool Lond V. 241. P. 527 531.

22. Dioli M., 1995. A clarification about the morphology of the horns of the female kouprey. A new unknown bovid species from Cambodia. // Mammalia. V. 59. P. 663-667.

23. Donoghue H. D., Spigelman M., Zias J., Gernay-Child A. M., Minnikin D. E. Mycobacterium tuberculosis complex in calcified pleura from remains 1400 years old. // Lett Appl Microbiol 1998. v. 27, p. 265-269.

24. Drancourt M., Raoult D. Molecular insights into the history of plague. // Microbes Infect 2002. v. 4, p. 105-109.

25. Eshleman J. A., Smith D. G. Use of DNAse to eliminate contamination in ancient DNA analysis. // Electrophoresis 2001. v. 22, p. 4316-4319.

26. Faerman M., Bar-Gal G. K., Filon D., Greenblatt C. L., Stager L/. Oppenheim A., Smith P. Determining the sex of infanticide victims from the late Roman era through ancient DNA analysis. // J Archaeol Sci 1998. v. 25, p. 861-865.

27. Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences. A maximum likelihood approach. // J Mol Evol 1981. V. 17. P. 368 376.

28. Frichner T. G. A personal statement. // Ann NY Acad Sci 2000. v. 925, p. 78.

29. Garza С. E., Powell S. Ethics and the past: reburial and repatriation in American archaeology. In: Bray Т., ed. The future of the past: archaeologists, Native Americans, and repatriation. New York: Garland Publishing, 2001. p. 37-56.

30. Gerloff U., Schlotterer C., Rassmann K., Rambold I., Hohmann G., Fruth В., Tautz D. Amplification of hypervariable simple sequence repeats (microsatellites) from excremental DNA of wild living bonobos (Pan paniscus). // Mol Ecol l995. v. 4, p. 515518.

31. Gerstenberger J., Hummel S., Schultes Т., Hack В., Herrmann B. Reconstruction of a historical genealogy by means of STR analysis and Y-haplotyping of ancient DNA. // Eur J Hum Genet 1999. v. 7, p. 469-477.

32. Gill P., Ivanov P. L., Kimpton C., Piercy R., Benson N., Tully G., Evett I., Hagelberg E., Sullivan K. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. // Nat Genet 1994. v. 6, p. 130-135.

33. Golenberg E., Giannassi E., Clegg M., Smiley C. J., Durban M., Henderson D., Zurawski G. Chloroplast sequence from a Miocene Magnolia species. // Nature 1990. v. 344, p. 656-658.

34. Gotherstrom A., Fischer C., Linden K., Liden K. X-raying ancient bone: a destructive method in connection with DNA analysis. // Lab Arkeol 1995. v. 8, p. 26-28.

35. Hammer S.E., Suchentrunk F., Tiedemann R., Harte G., Feiler A., 1999. Mitochondrial DNA sequence relationships of the newly described enigmatic Vietnamese Bovid, Pseudonovibos spiralis. // Naturwissenschaften. V.86. P. 279 280.

36. Handt O., Krings M., Ward R. H., Paabo S. The retrieval of ancient human DNA sequences. // Am J Hum Genet 1996. v. 59, p. 368-376.

37. Harrison R. F. Animal mitochondrial DNA as a marker in population and evolutionary biology. // Trends Ecol Evol 1989. v. 4, p. 6-11.

38. Hasegawa, M., Kishino, H., Yano, K. Dating of the human-ape splitting by a molecular clock of mitochondrial DNA. // J Mol Evol 1985. V. 22 P. 160 174.

39. Hassanin A., Douzery E.J.P. Is the newly described Vietnamese bovid Pseudonovibos spiralis a chamois (genus Rupicapra)? //Naturwissenschaften 2000. V. 87 P. 122-124.

40. Hassanin A., Seveau A., Thomas H., Bocherens H., Billiou, D., Nguyen В. X. Evidence from DNA that the mysterious "lihn duong" Pseudonovibos spiralis is not a new bovid. // C. R. Acad. Sci. Ser. Ill 2001. v. 324, p. 71-80.

41. Hattori E.M. The archaeology of Falcon Hill, Winnemucca Lake, Washoe County, Nevada. 1982 Ph.D. Dissertation. Pullman: Department of Anthropology, Washington State University

42. Hauswirth W. W., Laipis P. J. Mitochondrial DNA polymorphism in a maternal lineage of Holstein cows. // Proc Natl Acad Sci USA 1982. v. 79, p. 4686-4690.

43. Hayes M.G, Ancestor descendant relationships in North American Arctic prehistory: ancient DNA evidence from the Aleutian Islands and the eastern Canadian Arctic. // Am J Phys Anthropol 2001 suppl. v.32, p. 78.

44. Higuchi R., Bowman В., Freiberger M., Ryder A. O., Wilson A. C., DNA sequence from the quagga, an extinct member of horse family. // Nature 1984. v. 312, p. 282-284.

45. Hoffman R., 1986. A new locality record for the kouprey from Viet-Nam and an archaeological record from China. // Mammalia. V. 50. P. 391 395.

46. Hofreiter M., Serre D., Poinar H. N., Kuch M., Paabo S. Ancient DNA. // Nat Rev 2001. v. 2, p. 353-359.

47. Horai S., Hayasaka K., Kondo R., Tsugane K., Takahata N. Recent African origin of modern humans revealed by complete sequences of hominoid mitochondrial DNAs. // Proc Natl Acad Sci USA 1995. v. 92, p. 532-536.

48. Horai S., Kondo R., Murayama R., Hayashi S., Koike H., Nakai N. Phylogenetic affiliation of ancient and contemporary humans inferred from mitochondrial DNA. // Philos Trans R Soc 1991 v. 333, pp. 409-417.

49. Hoss M., Jaruga P., Zastawny Т., Dizdaroglu M., Paabo S. DNA damage and DNA sequence retrieval from ancient tissues. // Nucleic Acids Res 1996. v. 24, p. 1304-1307.

50. Hoss M., Paabo S. DNA extraction from Pleistocene bones by a silica-based method. // Nucleic Acids Res 1993. v. 21, p. 3913-3914.

51. Hummel S. Herrmann B. aDNA typing for reconstruction of kinship. // Homo 1996. v.47, p. 215-222.

52. Hummel S., Bramanti В., Finke Т., Herrmann В. Evaluation of morphological sex determination by molecular analyses. // Anthropol Anz 2000. v. 58, p. 9-13.

53. Hummel S., Shultes Т., Bramanti Т., Herrmann B. Ancient DNA profiling by megaplex amplifications. // Electrophoresis 1999. v. 20, p. 1717-1721.

54. Jeffreys A. J., Allen M. J., Hagelberg E., Sonnberg A. Identification of the skeletal remains of Mengele, Josef by DNA analysis. // Forensic Sci Int 1992. v. 56, p. 65-72.

55. Johnson В. H., Olson С. В., Goodman M. Isolation and characterisation of deoxyribonucleic acid from tissue of the woolly mammoth, Mammuthus primigenius. // Comp Biochem Physiol B. 1985. v. 81, p. 1041-1045.Ж?

56. Johnson М. J., Wallace D. С., Ferris S. D. Radiation of human mitochondrial DNA types analyzed by restriction endonuclease cleavage patterns.// J Mol Evol 1983. v. 19, p. 255271.

57. Kaestle F. A., Smith D. G. Ancient native american DNA from Western Nevada: implications for the numic expansion hypothesis. // Am J Phys Anthropol 2001. v. 115, p. 1-12.

58. Kaestle F.A. Molecular analysis of ancient Native American; DNA from Western Nevada. // New Hist Soc Q 1997 v. 40, pp. 85-96.

59. Kaestle F.A. Molecular evidence for prehistoric Native American population movement: the Numic expansion. // Ph.D. dissertation. 1998 Manuscript on file, Dept. of Anthropology, University of California, Davis, С A

60. Kaestle F.A., Smith D. G. Working with ancient DNA: NAGPRA, Kennewick man, and other ancient peoples. // Am J Phys Anthropol Suppl. 2001. v. 32, p. 87.

61. Kaestle, A. F., Horsburgh K. A., Ancient DNA in anthropology: methods, applications and ethics.// Yrbk Phys Anthropol 2002. v. 130. p. 92-130.

62. Kimura В., Brandt S. A., Hardy B. L., Hauswirth W. W. Analysis of DNA from ethnoarchaeological stone scrapers. J Archaeol Sci 2001. v. 28, p. 45-53.

63. Kishino H., Hasegawa M. Evaluation of the maximum likelihood estimate of the evolutionary tree topologies from DNA sequence data, and the branching order in Hominoidea. // J Mol Evol 1989. V. 29. P. 170 179.

64. Kolman С., Sambuughin L., Bermingham E. Mitochondrial DNA analysis of Mongolian populations and implications for the origin of New World founders. // Genetics. 1996. V. 142. P. 1321-1344.

65. Krings M., Capelli C., Tschentscher F., Geisert H., Meyer S., von Haeseler A., Grossschmidt K., Possnert G., Paimovic M., Paabo S. A view of Neanderthal genetic diversity. // Nat Genet 2000, v. 26, pp. 144-146.

66. Krings M., Stone A., Schmitz R.W., Krainitzki H., Stoneking M., Paabo S. Neanderthal DNA sequences and the origin of modern humans. // Cell 1997 v. 90, pp. 19-30.

67. Krings M., Stone A., Schmitz R.W., Krainitzki H., Stoneking M., Paabo S. Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. // Cell. 1997. V. 90. № 1. P. 19-30.

68. Kuznetsov G. V., Kulikov E. E., Petrov N. В., Ivanova N. V., Lomov A. A., Kholodova M. V., Poltaraus A. B. The "Lihn Duong" Pseudonovibos spiralis (Mammalia, Artiodactyla) is a new buffalo. // Naturwissenschaften 2001, v. 88, p. 123-125.

69. Larsen C. S. Bioarchaeology: interpreting behaviour from the human skeleton. ущ! Cambridge: Cambridge University Press, 1997.

70. Lassen C., Hummel S., Herrmann В. Molecular sex identification of stillborn and neonate individuals ("Traufkinder") from the burial site Aegerten. // Anthropol Anz 2000. v. 58, p. 1-8.

71. Launhardt K., Epplen C., Epplen J. Т., Winkler P. Amplification of microsatellites adapted from human of wild Hanuman langurs (Presbytis entellus). // Electrophoresis 1998. v. 19, p. 1356-1361.

72. Lehrman S. (2001). Drawing DNA lines of ethnicity. Geneletter 1 (www.geneletter.com)

73. Loreille O., Orlando L., Patou-Mathis L., Philippe M., Taberlet P., Hanni C., Ancient DNA analysis reveals divergence of the cave bear, Ursus spelaeus, and brown bear, Ursus arctos, lineages. // Curr Biol 2001. v. 11, p. 200-203.

74. Lorenz J. G., Smith D. G. MtDNA variation among Native North Americans: geographic and ethnic distribution of the four founding mtDNA haplogroups. // Am J Phys Anthropol 1996. v. 101, p. 307-323.

75. Lynott M. J., Wylie A. Stewardship: central principle of archaeological ethics. In: Lynott M. J., Wylie A., eds. Ethics in archaeology: challenges for the 1990s. Lawrence, KS: Allen Press, for the Society for American Archaeology. 1995. p. 28-32.

76. Madsen D.B., Rhode D. Across the West: human populations movement and the expansion of the Numa. // 1994 Salt Lake City: University of Utah Press.

77. Makdonald A., Yang L., 1997. Chinese sources suggest early knowledge of the 'unknown' ungulate (Pseudonovibos spiralis) from Vietnam and Cambodia. // J Zool London V. 241. P. 523 526.

78. Malakoff D. (Ed.) Horny dilemma (in "Random Samples"). // Science 2001. v. 291, p. 39.

79. Malhi R. S. Investigating prehistoric population movements in North America with ancient and modern mtDNA. PhD dissertation. Manuscript on file, Dept. Of Anthropology, University of California, Davis, CA.

80. Malhi R.S., Smith D.G. Brief communication: haplogroup X confirmed in prehistoric North America. // Am J Phys Anthropol 2002 v.l 19, pp. 84-86.

81. Mannucci A., Sullivan K.M., Ivanov P.L., Gill P. Forensic application of a rapid and quantitative DNA sex test by amplification of the X-Y homologous gene amelogenin. // Int J Leg Med 1994 v.106, pp. 190-193.

82. Metcalf P., Huntington R. Celebrations of death: the anthropology of mortuary ritual. 2nd ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1991.

83. Moratto M.J. California archaeology. 1984 Orlando, FL: Academic Press, Inc.

84. Morell V. Kennewick man's trial continue. // Science 1998, v. 280, pp. 190-192.

85. Morin P. A., More J. J., Chakraborty R., Jin L., Goodall J., Woodruff D. S. Kin selection, social-structure, gene flow and the evolution of chimpanzees. // Science 1994.Щ v. 265, p. 1193-1201.

86. Morin P. A., More J. J., Woodruff D. S. Identification of chimpanzee subspecies wiht DNA from hair and allele-specific probes. // Proc R Soc Lond Biol. 1992. v. 249, p. 293-297.

87. Mullis К. В., Faloona F. A., Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. // Methods Enzymol 1985. v. 155, p. 335-350.

88. Nadler T. Was ist Pseudonovibos spiralis? // Zool Garten N.F. v. 67, p. 290-292.

89. Naumova O., Rychkov S. Siberian population of the New Stone Age: mtDNA haplotype diversity in the ancient population from the Ust'-Ida I burial ground, dated 4020-3210 ВС by 14C.//Anthrop Anz 1998. v. 1, p. 1-6.

90. Neves W.A., Powell J.F., Ozolins E.G. Extra-continental morphological affinities of Palli Aike, southern Chile. // Interciencia 1999, v. 24, pp. 258-263.

91. Nicholson G. J., Tomiuk J., Czarnetzki A., Bachmann L., Pusch С. M. Detection of bone glue treatment as a major source of contamination in ancient DNA analyses. // Am J Phys Anthropol 2002. v. 118, p. 117-120.

92. O'Rourke D. H., Hayes M. G., Carlyle S. W. Ancient DNA studies in physical anthropology. // Annu Rev Anthropol 2000. v. 29, p. 217-242.

93. O'Rourke D.H., Hayes M.G., Carlyle S.W. Spatial and temporal stability of mtDNA haplogroup frequencies in native North America. // Hum Biol 2000 v. 72, pp. 15-34.

94. Olsen G.J., Matsuda H., Hagstrom R., Overbeek R. fastDNAml: A tool for construction of phylogenetic trees of DNA sequences using maximum likelihood. // Comput Appl Biosci 1994. V.10. P. 41 -48.

95. Orekhov V., Poltaraus A., Zhivotovsky L.A., Spitsyn V., Ivanov P., Yankovsky N. Mitochondrial DNA sequence diversity in Russians. // FEBS Letters. 1999. V. 445. № 1. P. 197-201.

96. Paabo S. Ancient DNA. // Sci Am 1993. v. 269, p. 86-92.

97. Paabo S. Ancient DNA: extraction, characterisation, molecular cloning and enzymatic amplification. // Proc Natl Acad Sci USA 1989. v. 86, p. 1939-1943.

98. Paabo S. Molecular cloning of ancient Egyptian mummy DNA. // Nature 1985. v. 314, p. 644-645.

99. Paabo S. Preservation of DNA in ancient Egyptian mummies. // J Archaeol Sci 1985. v. 12, p. 411-417.

100. Paabo S., Wilson A. C. Miocene DNA sequences: a dream come true? // Curr Biol 1991. v. 1, p. 45-64.

101. Parr R.L., Carlyle S.W., O'Rourke D.H. Ancient DNA analysis of Fremont Amerindians of the Great Salt Lake Wetlands. // 1996 Am J Phys Anthropol 1996, v. 99, pp. 507-518.

102. Pearson M. P. The archaeology of death and burial. College station, TX: Texas A&M University Press, 1999.

103. Peter W., Feiler A., 1994. A new bovid species from Vietnam and Cambodia (Mammalia: Ruminantia). // Zool. Abh. Mus Tierkd. Dresden. V. 48. P. 169 176.

104. Pichler F. В., Dalebout M. L., Baker C. S. Nondestructive DNA extraction from sperm whale teeth and scrimshaw. // Mol Ecol Notes 2001. v. 1, p. 106-109.

105. Pico R. F. Dairy wastes. // J Water Pollut Control Fed 1976. v. 48, p. 1311-1313.

106. Poinar H. N., Hoss M., Bada J. L., Paabo S., Amino acid racemization and the preservation of ancient DNA. // Science 1996. v. 272, p. 864-866.

107. Pyburn K. A. Native American religion versus archaeological science: a pernicious dichotomy revisited. // Sci Eng Ethics 1999. v. 5, p. 355-366.

108. Raoult D., Aboudharam G., Crubezy E., Larrouy G., Ludes В., Drancourt M. Molecular identification by "suicide PCR" of Yersinia pestis as the agent of medieval "Black Death". // Proc Natl Acad Sci USA 2000. v. 97, p. 12800-12803.

109. Reese R.L., Hyman M., Rowe M.W., Derr J.N., Davis S.K. Ancient DNA from Texas pictographs. // J Archaeol Sci 1996 v. 23, pp. 269-277.

110. Rollo F., Asci W., Antonini S., Marota I., Ubaldi M. Molecular ecology of a Neolithic meadow: the DNA of the grass remains from the archeological site of the Tyrolean Iceman. // Experientia 1994. v. 50, p. 576-584.

111. Saiki R. F., Gelfand D. H., Storfei S., Sharf S. J., Higuchi R., Horn G. Т., Mullis К. В., Erlich H. A., Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a termostable DNA polymerase. // Science 1988. v. 239, pp. 487-491.

112. Salo W. L., Aufderheide A. C., Buikstra J., Holcomb T. A. Identification of ^ Mycobacterium tuberculosis DNA in a pre-Columbian mummy. // Proc Natl Acad SciUSA 1994. v. 91, p. 2091-2094.

113. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory guide. 2nd ed., Salem, MA: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

114. Shanks О. C., Bonnichsen R., Vella А. Т., Ream W. Recovery of protein and DNA trapped in stone tool microcracks. // J Archaeol Sci 2001. V. 28, p. 956-972.

115. Shapiro S., Schlesinger E.R., Nesbitt R. E. L. Jr. Infant, prenatal, maternal and childhood mortality in the United States. Cambridge, MA: Harvard University Press. 1968.

116. Shultes Т., Hummel S., Herrmann B. Amplification of Y-chromosomal STRs from ancient skeletal material. // Hum Genet 1999. v. 104, p. 164-166.

117. Smith D.G., Malhi R.S., Eshleman J.A., Kaestle F.A. Report on DNA analyses of theremains of "Kennewick man" from Columbia Park, Washington. // http://ww.cr.nps.gov/aad/kennewick/index.htm

118. Smith P., Kahila G. Identification of infanticide at archaeological sites: a case study from the late Roman early Byzantine periods at Ashkelon, Israel. // Archeol Sci 1992 v. 19, pp. 667-675.

119. Spigelman M. Lepra and ТВ coinfection in ancient populations of Levant. // Proceedings of 6th International Conference on Ancient DNA and Related В iomolecules, Tel-Aviv 2002.

120. Spuhler J. N., Evolution of mitochondrial DNA in monkeys, apes and humans. // Am J Phys Anthropol 1988. v. 31, p. 15-48.

121. St. Hoyme L. E., Iscan M. U. Determination of sex and race: accuracy and assumptions. In: Iscan M. Y., Kennedy D. A. R., eds. Reconstruction of life from the skeleton. New York: Alan R. Liss. 1989. p. 53-93.

122. Stankiewicz B. A., Poinar H. N., Briggs D. E. G., Evershed R. P., Poinar G., Chemical preservation of plants and insects in natural resins. // Proc R Soc Lond Biol. 1998. v. 265, p. 641-647.

123. Steele D.G., Powell J.F. Peopling of the Americas: paleobiological evidence. // Hum Biol 1992 v. 64, pp. 303-336.

124. Stone A.C., Stoneking M. Ancient DNA from a pre-Columbian Amerindian population. // Am J Phys Anthropol 1993, v. 92, pp. 463-471.

125. Stone A.C., Stoneking M. mtDNA analysis of a prehistoric Oneota population: implication for the peopling of the New World. // Am J Hum Genet 1998 v.62, pp. 11531170.

126. Stoneking M. Ancient DNA: how do you know if you have it and what can you do with it? // Am J Hum Genet 1995. v. 57, p. 1259-1262.

127. Strimmer, K., von Haeseler, A. Quartet puzzling: a quartet maximum likelihood method for reconstructing tree topologies. // Mol Biol Evol 1996. V. 13. P. 964 969.

128. Sutton M. Q., Malik M., Ogram A. Experiments on the determination of gender from coprolites by DNA analysis. // J Archaeol Sci 1996. v. 23, p. 263-267.

129. Tallbear K. Genetics, culture and identity in Indian country. Proceedings of the Seventh International Congress on Ethnobiology, Athens, Georgia, October 23-27,2000.

130. Taubenberger J. К., Reid A. H., Frafft A. E., Bijwaard К. E., Fanning T. G. Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish" influenza virus. // Science 1997. v. 275, p. 1793-1796.

131. Taylor G. M., Widdison S., Brown I. N., Young D. A mediaeval case of lepromatous leprosy from 13-14 century Orkney, Scotland. // J Archaeol Sci 2000. v. 27, p. 11331138.

132. Telenius H., Carter N. P., Bebb С. E., Nordenskjold M., Ponder B. A., Tunnacliffe A. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. // Genomics 1992. v. 13, p. 718-725.

133. Thomas D. H., The skull wars: Kennewick man, archaeology and the battle for Native American identity. New York: Basic Books, 2000.

134. Thomas H., Seveau A., Hassanin A. The enigmatic new Indochinese bovid, Pseudonovibos spiralis: an extraordinary forgery. // С R Acad Sci Ser III 1993. v. 324, p. 81-86.

135. Thornton R. Tribal membership requirements and the demography of "old" and "new" Native Americans. // Popul Res Policy Rev 1997. v. 16, p. 33-42.

136. Timm R. M., Brandt J. H. Pseudonovibos spiralis (Artiodactyla: Bovidae): new information on this enigmatic South-east Asian ox. // J Zool (Lond) 2001. v. 253, p. 157166.

137. Torroni A., Huoponen K., Francalacci P., Petrozzi M., Morelli R., Scozzari R. Classification of European mtDNAs fro an analysis of three European populations. // Genetics. 1996. V. 144. P. 1835-1850.

138. Torroni A., Schurr T. G., Cabell M. F., Brown M. D., Neel J. V., Larsen M., Smith D. G., Vullo С. M., Wallace D. C. Asian affinities and continental radiation of the four founding Native American mtDNAs. // Amer J Hum Genet 1993. v. 53, p. 563-590.

139. Tsosie R. Indigenous rights and archaeology. In: Swidler N., Dongoske K., Anton R., Downer A., eds. Native Americans and archaeologists: stepping stones to common ground. Walnut Creek, CA: Altamira Press, 1997. p. 64-76.

140. Turner T. R. Ethical concerns in biological anthropology: introduction to the symposium. // Am J Phys Anthropol Suppl. 2001. v. 32, p. 152.

141. Tuross N. The biochemistry of ancient DNA in bone. // Experientia 1994. v. 50, p. 530535.

142. Tuross N., Kolman C. J. Potential for DNA testing of the human remains from Columbia Park, Kennewick, Washington. Report to the Department of Justice and Department of Interior. National Parks Service Press, 2000.

143. Van de Peer Y., De Rijk P., Wuyts J., Winkelmans Т., De Wachter, R. The European Small Subunit Ribosomal RNA database. //Nucleic Acids Res 2000. V. 28. P. 175 176.

144. Vigilant L., Pennington R., Harpending H., Kocher T. D., Wilson A. C. Mitochondrial DNA sequences in single hairs from a Soutern African population. // Proc Nat Acad Sci USA 1989. v. 86, p. 9350-9354.

145. Wallace D. C. Mitotic segregation of mitochondrial DNAs in human cell hybrids and expression of chloramphenicol resistance. // Somat Cell Mol Genet 1986. v. 12, p. 41-49.

146. Wallace D. C. Structure and evolution of organelle genomes. // Microbiol Rev 1982. v. 46, p. 208-240.

147. Wallace D. C., Lott M. Т., Brown M. D. Report of the Committee on human mitochondrial DNA. Human Gene mapping 1995: a compendium. N. Y., John Hopkins University press, 1995. p. 910-954.

148. Wallace D., Torroni A. American Indian prehistory as written in the mitochondrial DNA: a review. // Human Biology. 1992. V. 64. № 3. PP. 403-416.

149. Wang H.-L., Yan Z.-Y., Jin D.-Y. Reanalysis of published Dna sequence amplified from Cretaceous dinosaur egg fossil. // Mol Biol Evol 1997. v. 14, p. 589-591.

150. Ward R. H., Frazier B. L., Dew K., Paabo S. Extensive mitochondrial diversity within a single Amerindian tribe. // Proc Natl Acad Sci USA 1991. v. 88, p. 8720-8724.

151. Weijer C., Goldsand G., Emanuel E. J. Protecting communities in research: current guidelines and limits of extrapolation. //Nat Genet 1999. v. 23, p. 275-280.

152. Weiss К. M. On systematic bias in skeletal sexing. // Am J Phys Anthropol 1972. v. 37, p. 239-250.

153. Whitfield J. Locking Horns. // Nature 2002. v. 415, p. 956.

154. Woodward S. R., Weyand N. J., Bunnell M. DNA sequence from Cretaceous period bone fragments. // Science 1994; v. 266, p. 1229-1232.

155. Young D. L., Huyen Y., Allard M. W., Testing the validity of the cytochrome В sequence from Cretaceous period bone fragments as dinosaur DNA. // Cladistics 1995. v. 11, p. 199-209.

156. Yousten A. A., Rippere К. E. DNA similarity analysis of a putative ancient bacterial isolate obtained from amber. // FEMS Microbiol Lett 1997. v. 152, p. 345-347.

157. Zimmermann L. Usurping Native American voice. In: Bray Т., ed. The future of the past: archaeologists, Native Americans, and repatriation. New York: Garland Publishing, 2001. p. 91-106.

158. Zischler H., Geisert H., von Haeseler A., Paabo S. A nuclear "fossil" of the mitochondrial D-loop and the origin of modern humans. // Nature 1995. v. 378, p. 489492.

159. Алексеев В.П. Историческая антропология и этногенез. М.: Наука, 1989. 350 с.

160. Балановская Е. В., Балановский О. П. Геногеография Восточной ; Европы и своеобразие русского генофонда. Тезисы Международной конференции «Женщины в фундаментальной науке: итоги и перспективы междисциплинарных исследований». СПб, 2000. с. 81-82.

161. Балановский О. П., Балановская Е. В., Бужилова А. П., Дерябин В. Е., Долинова В.A., Спицын В. А. Геногеография русского народа: данные генетики и антропологии. Научная конференция памяти Грегора Менделя. М., 2001. с. 7-8.

162. Балановский О. П., Дерябин В. Е., Долинова Н. А., Нурбаев С. Д., Балановская Е.B. Генофонд народов Восточной Европы по данным генетики и антропологии. II съезд ВОГиС, тезисы докладов. СПб, 2000. т. 2, с. 312-313.

163. Деренко М.В., Шилдс Дж.Ф. Разнообразие нуклеотидных последовательностей митохондриальной ДНК в трех группах коренного населения Северной Азии. //Щ- Молекулярная Биология. 1997. Т. 31. № 5. С. 784-789.

164. Заяц М. В., Иванов П. JI. Опыт использования волос в качестве объекта исследования в судебно-медицинской молекулярно-генетической экспертизе. // Судебно-Медицинская Экспертиза 1997. т. 40, с. 17-24.

165. Казаковцева М.А., Воевода М.И., Осипова Л.П. Полиморфизм митохондриальной ДНК у северных селькупов // Генетика. 1998. Т. 34. № 3. С. 416-22.

166. Кирюшин Ю.Ф., Гальченко А.В., ТишкинА.А. Результаты анализа остеологического материала из поселения Березовая Лука // Сохранение и изучение культурного наследия Алтайского края. Барнаул, 1995. Вып. V. Ч. II.

167. Лимборская С. А., Хуснутдинова Э. К., Балановская Е. В. Этногеномика и геногеография народов восточной Европы. М., Наука, 261 с.

168. Малярчук Б. А, Митохондриальный портрет восточных славян. // Генетика 1997. т. 33, №1, с. 101-105.

169. Рогинский Я.Я., Левин М.Г. Основы антропологии. Изд. 2-е. М., Высшая школа, 1963. 488 С.

170. Соколов И.И., 1953. Опыт естественной классификации полорогих (Bovidae). // Тр. Зоол. Ин-та АН СССР. Т.14. С. 5 -295.

171. Хрисанфова М. В., Перевозчиков И. В. Основы антропологии. М., Изд-во МГУ, 1998. 320 с.

172. Хуснутдинова Э. К. Молекулярная этногенетика народов Волго-Уральского региона. Уфа, 1999. 237 с.

173. Хуснутдинова Э. К., Хидиятова И. М., Викторова Т. В., Фатхлисламова Р. И. Рестрикционный полиморфизм главной некодирующей области митохондриальной ДНК в популяциях Волго-Уральского региона. // Генетика 1999в. т. 35, №5, с. 695-702.

Информация о работе

Куликов, Евгений Евгеньевич
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Молекулярная характеристика древней ДНК человека и животных из коллекционного материала и археологических находок - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы