Молекулярная детекция представителей гипертермофильных архей и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы

Слободкина, Галина Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярная детекция представителей гипертермофильных архей и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная детекция представителей гипертермофильных архей и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы"

На правахрукописи

СЛОБОДКИНА Галина Борисовна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ГИПЕРТЕРМОФИЛЬНЫХ АРХЕЙ И ХАРАКТЕРИСТИКА АРХЕЙНОЙ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

Специальность 03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2005

Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Бонч-Осмоловская Е.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Плакунов В.К.

кандидат биологических наук Акимов В.Н.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В.А.Энгельгардта РАН.

Защита диссертации состоится 30 мая 2005 года В /У часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312, Москва, пр. 60-летия Октября, д.7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Автореферат разослан

¿■9 ¿7/7/3 ¿71/)

2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^/^¡^¡-Ллсл.м.ф^^..., Никитин Л.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современные гидротермальные системы можно рассматривать как аналог древних биоценозов Земли. Таким образом, изучение термофильных прокариот является важным как для понимания эволюции микроорганизмов и их метаболических путей, так и для понимания эволюции биосферы в целом. Гипертермофильные микробные сообщества образуются микроорганизмами крайне разнообразными как филогенетически, так и функционально. Исключительная устойчивость их биополимеров к высоким температурам делает их перспективными объектами, как для фундаментальных исследований, так и в связи с возможностью применения в различных областях биотехнологии. Подавляющее большинство гипертермофильных организмов составляют археи, среди которых самым многочисленным является род ТЪегтососсш. Род ТИетососсш входит в семе йкегтжжав&ар с т в а ЕигуагсЬаео1а. Количество валидно описанных видов этого семейства составляет, очевидно, лишь небольшую часть обитающих в природе. В связи с этим молекулярная детекция ТЪегтососсасеае может способствовать дальнейшим поискам новых штаммов. Отличительной особенностью этой группы микроорганизмов является то, что генетическое разнообразие термококков значительно шире, чем это можно было бы предположить на основе их высококонсервативной ^ рРНК. Степень ДНК-ДНК гибридизации различных видов обычно невысока (15-40%) даже в тех случаях, когда сходство генов ^ рРНК составляет 98-99%. Это разнообразие дает основания ожидать у представителей этого рода наличия новых, пока неизвестных физиологических и метаболических свойств.

Биотехнологический потенциал гипертермофильных архей в большой степени связан с наличием у них термостабильных ферментов, среди которых наиболее широко используемыми и коммерчески успешными являются термостабильные ДНК-полимеразы. Основным преимуществом ДНК-полимераз архей перед термостабильными бактериальными полимеразами можно считать более высокую термостабильность и точность копирования. Все коммерчески используемые архейные ДНК-полимеразы получены из представителей семейства ТЪегтососсасеае,

рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Постоянное увеличение числа сиквенсов рРНК в базах данных приводит к необходимости создания все новых праймеров, причем к специфичности праймеров, используемых для детекции и идентификации определенного организма в окружающей среде, предъявляют более высокие требования.

В связи с вышеизложенным, молекулярная детекция гипертермофильных архей в различных экосистемах представляет научный и практический интерес. Наиболее перспективным способом решения этой задачи представляется сочетание традиционных методов культивирования с современными молекулярно-экологическими методами.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась молекулярная детекция гипертермофильных архей с помощью олигонуклеотидных праймеров, специфичных к генам ^ рРНК, а также оценка биотехнологического потенциала коллекции гипертермофильных архей.

Для достижения этой цели следовало решить следующие задачи.

1. Разработать метод молекулярной детекции микроорганизмов семейства ТТгегтососсасеае и провести идентификацию новых гипертермофильных изолятов.

2. Провести ПЦР-детекцию архей в гипертермофильных накопительных культурах и образцах из природных и антропогенных местообитаний.

3. Провести скрининг коллекции термофильных архей лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ им. С.Н. Виноградского РАН на наличие термостабильных ДНК-полимераз.

4. В случае обнаружения термостабильной ДНК-полимеразы детально исследовать ее свойства с точки зрения возможного применения в биотехнологии.

Научная новизна работы. Впервые разработаны и синтезированы высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры для ПЦР-детекции гипертермофильных архей семейства Доказанная высокая специфичность праймеров позволяет

делать выводы о наличии представителей семейства в накопительных

культурах и природных образцах непосредственно по результатам амплификации.

Впервые в системе анаэробной биологической очистки культуральными и молекулярно-экологическими методами обнаружены гипертермофильные археи. В антропогенном местообитании с нейтральным значением рН впервые обнаружен культивируемый представитель царства Результаты исследований расширяют

список мест обитания филогенетической группы а также физиологической

группы гипертермофильных микроорганизмов.

Из штамма Ткегтососси5 sp. Sh1 AM выделена и очищена термостабильная ДНК-полимераза, не содержащая интеинов. Показано, что выделенная ДНК-полимераза обладает

такими важными с биотехнологической точки зрения свойствами как высокая термостабильность и точность копирования. Выделен и клонирован ген архейной ДНК-полимеразы и получен штамм-продуцент рекомбинантного белка.

Практическая значимость работы. Предложен простой, быстрый, надежный и чувствительный метод обнаружения пшертермофильных архей семейства Thermococcaceae, основанный на ПЦР-амплификации генов 16S рРНК с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров.

Выделена и очищена архейная термостабильная ДНК-полимераза. Ген, кодирующий эту полимеразу, клонирован и экспрессирован в клетках Е. coli. Полученный фермент может найти широкое применение в молекулярной биологии, генетике, молекулярной диагностике.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конгрессах "Extremophiles'2002" и "Extremophiles'2000", а также на международной конференции "Workshop on Enzymology, Molecular biology and Biochemistry of Thermophiles", 2000.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ (3 статьи и 3 тезисов).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, результаты исследования и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы (251 наименование). Материалы изложены на 118 страницах машинописного текста и включают 15 рисунков и 13 таблиц.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность к.б.н. Черных Н.А., к.б.н. Лебединскому А.В., к.б.н. Мирошниченко М.Л., к.б.н. Кострикиной НА., к.б.н. Туровой Т.П. за помощь на определенных этапах работы. Часть работы, связанная с выделением и клонированием ДНК-полимеразы, проводилась совместно с центром "Биоинженерия" РАН, сотрудникам которого автор выражает свою благодарность, особенно к.б.н. Лопатину С.А. и к.б.н. Эльдарову МА., практически осуществлявшему научное руководство этой частью работы.

Особую благодарность автор выражает научному руководителю д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской за предложенную тему, обсуждение результатов, ценные советы и замечания и общее научное руководство, а также к.б.н. Слободкину А.И. за постоянное внимание и помощь в работе и при подготовке рукописи диссертации.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили пробы из наземных, мелководных и глубоководных гидротерм, а также проба сброженного ила метантенка, обрабатывающего осадки муниципальных сточных вод в термофильном режиме; ассоциации и накопительные культуры, полученные из этих систем; чистые культуры гипертермофильных и термофильных микроорганизмов, полученные из Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) или из коллекции культур лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Культивирование микроорганизмов проводили на средах двух типов: морской (А) и пресной (В). Среда А имела следующий минеральный состав (на 1 л дистиллированной

воды): 0,34 г КС1; 4,0 г МдС12 х 6 Н20; 3,5 г х 7 Н20; 0,25 г 0,14 г СаС12 х 2

Среда В имела следующий минеральный состав (на 1 л дистиллированной воды): по 0,33 г каждой из солей N1^0, КС1, К^С12х6Н20, СаС12, КН2РС>4; 2 Г N811003. Обе среды содержали 1 мл раствора микроэлементов et э!., 1997); 1 мл раствора витаминов (ЭДэНп et э!., 1963); 0,2 г дрожжевого экстракта, 10 г пептона, 10 г серы. Среды готовили анаэробно, в качестве восстановителя вносили 1 г/л Ха28х9Н20, разливали в пробирки Хангейта под газовой смесью Ы2:С02 (80:20) и стерилизовали автоклавированием при 2 атм в течение 1-2 часов. В зависимости от целей исследования, в некоторых случаях использовали различные модификации вышеописанных сред. рН среды составлял 5,5 для представителей рода 1Ъегт0рГ01еи! и 3,5 для термоацидофильных изолятов; во всех остальных случаях рН среды был 6,5. Культивирование термоацидофилов проводили при 80°С, остальных штаммов - при 85°С.

Лабораторные микрокосмы были получены путем внесения 20 см3 фрагмента гидротермальной постройки в сывороточные бутыли объемом 500 мл, содержащие 250 мл среды А. В двух анаэробных микрокосмах газовая фаза представляла смесь С02:Н2 (90:10), в двух других - воздух и водород (90:10). В качестве субстратов в обеих средах использовали смесь пептона, дрожжевого экстракта, мясного экстракта, хитина. Культивирование проводили при 28°С или 82°С. Отбор проб проводили непосредственно после засева, через одни, трое и 18 суток.

Наблюдения и подсчет клеток проводили с помощью светового фазово-контрастного микроскопа (ЛОМО АУ-12, Россия). Трансмиссионная электронная микроскопия была выполнена на электронном микроскопе ЛМ-100С.

Для оценки численности представителей семейства Тиегтососсасеае с помощью ПЦР, готовили серии 10-ти кратных разведений ДНК, выделенной из каждой пробы, в ТЕ буфере,

и 1 мкл из каждого разведения использовали для ПЦР. Все анализы проводили в двух повторностях.

ПЦР-праймеры. Праймеры, специфичные к генам 16S рРНК семейства Thermococcaceae (Рис.1) были подобраны с помощью компьютерной программы "ProbeDesigner" (Lebedinsky et al., 1998). Для проверки ихспецифичности были использованы новые архейные праймеры

Arch 338F 5'-GGCCCTAYGGGGYGCASCAGGC-3' и Arch 1381R S'-GCGGTGTGTGCAAGGRGCAGGG-З

также подобранные при помощи программы "ProbeDesigner".

Праймеры, использованные для детекции прокариот в природных и антропогенном образцах и накопительных культурах, представлены в таблицах 3, и 4.

Вырожденные олигонуклеотидные ПЦР-праймеры для клонирования ДНК-полимеразы Sh1AM (Табл. 7) были созданы при помощи компьютерной программы MultAlin (Corpet, 1988).

Определение полимеразной активности. Полимеразную активность в клеточных лизатах и препаратах ДНК-полимераз определяли методом ник-трансляции (Hjorleifsdottir et al., 1997) с использованием меченого 33Р-дАТФ или 3Н-дТТФ.

Образцы белковых фракций, полученных на различных стадиях очистки ДНК-полимеразы, разделяли в 8%-ном ДЦС-Na-nAAT по стандартной методике (Laemmli, 1970). Определение ЦНК-полимеразной активности в геле осуществляли в соответствии с опубликованным методом (Angerer et al., 1998).

Выделение, очистка и характеристика ДНК-полимеразы. Для выделения и очистки ДНК-полимеразы штамм ThermococcuS sp. ShlAM выращивали в бутылях или в лабораторном ферментере Biostat E, ("Brawn", ФРГ) объемом 5 л в течение 2 суток в условиях, описанных в разделе "Культивирование микроорганизмов". Клетки разрушали ультразвуком (33 мА, 22 кГц) 2 раза по 60 с. Остатки клеточных стенок отделяли центрифугированием (12000 g, 40 мин) при 4°С. Супернатант диализировали (2x500 мл) против буфера А (40 мМ трис-HCl, рН 7,5; 0,1 мМ ЭДТА; 0,7 мМ ДТТ), содержащего 10% глицерина, в течение 16 ч. Очистку полученного раствора проводили в несколько стадий: 1) методом ионообменной хроматографии с ДЭАЭ-сефацелем, 2) аффинной хроматографией на фосфоцеллюлозе Р-11, 3) хроматографией на двухнитевой ДНК-целлюлозе. Для стабилизации фермента к очищенному препарату добавляли бычий сывороточный альбумин ("Boehringer Mannheim", ФРГ) в концентрации 50 мкг/мл.

Определение 3'-5' экзонуклеазной активности базировалось на способности смеси индивидуальных нуклеотидов специфически ингибировать этот фермент. Определение

точности копирования ДНК-полимеразы проводили двумя методами: с использованием теста на частоту «прямых» мутаций на гетеродуплексной ДНК-матрице с «брешью», полученной путем отжига ЕсоШШтсПЛ фрагмента ДНК репликативной формы М13тр18 и однонитевой ДНК M13mpl8 (Bebenek and Kunkel, 1995) и модифицированного ПЦР-теста (Cline et al., 1996).

Молекулярно-биологические методы. Выделение геномной ДНК вели по методу Мармура (Marmur, 1961). Выделение и очистку плазмидной и фаговой ДНК, а также ПЦР-продуктов проводили с использованием специальных наборов реактивов ("Promega", США) согласно инструкциям фирмы-изготовителя. ПЦР-амплификацию, гель-электрофорез, рестрикцию ДНК, клонирование и трансформацию штаммов E.coli JM109 и E.coli BL21(DE3) проводили согласно общепринятым методикам (Ausubel et al., 1997; Маниатис и др., 1984). Условия проведения ПЦР подбирали в зависимости от конкретных задач исследования. Нуклеотидные последовательности продуктов амплификации определяли методом ферментативного секвенирования на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems DNA Sequencer 373A, используя стандартный протокол и набор реактивов "Fluorescent dye Cycle Sequencing kit" ("Perkin-Elmer", США). Сравнение нуклеотидных последовательностей проводили при помощи программы Clustal X.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ПЦР-детекция гипертермофильных архей семейства 1.1. Специфичность праймеров

Для ПЦР-детекции гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae при помощи программы "ProbeDesigner" были созданы олигонуклеотидные праймеры TcPcl73F-TcPc589R (Рис. 1). Филогенетическая обособленность семейства Thermococcaceae сделала возможным дизайн довольно длинных (30 нуклеотидов) праймеров с низким уровнем вырожденности, что позволило значительно повысить температуру их отжига, и тем самым существенно снизить риск неспецифических реакций.

Для оптимизации условий проведения ПЦР со специфичными праймерами TcPcl73F-ТсРс5 89R использовали ДНК типового штамма и ДНК микроорганизмов,

выбранных в качестве отрицательных контролей (Табл. 1). Наиболее адекватные отрицательные контроли были подобраны в электронном виде таким образом, чтобы 16S рРНК этих организмов имела максимальное сродство к праймерам. Для прямого праймера

это - Archaeoglobus fulgidus и Acidianus infernus, для обратного - Acidilobus aceticus, для пары праймеров - Archaeoglobus fulgidus. Температуру отжига праймеров меняли от 65°С до 75°С. Единственный продукт ПЦР ожидаемого размера (приблизительно 400 п.н.) был получен в реакции с ДНК ThermOCOCCUS celer при всех испытываемых температурах кроме 75°С, при которой не происходило отжига праймеров. Продуктов ПЦР в реакциях с ДНК отрицательных контролей не происходило во всем диапазоне исследуемых температур.

Primer ТсРс 173F,

Valid ТсРс species, 90%, +, 3'->5'

96 relatives, 90%, +, 3'->5'

Archaea, 85%, +, 3'->5'

Primer ТсРс 589R,

Valid ТсРс species, 95%, -, 5'->3'

96 relatives, 95%, -, 5'->3'

Archaea, 90%, -, 5'->3'

Bacteria, 90%, -, 5'->3'

TCCCCCATAGGYCTGRGGTACTGGAAGGTC I I I I I ! I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I AGGGGGTATCCRGACYCCATGACCTTCCAG AGGGGGTATCCGGACYCCATGACCTTCCAG ADGRSSTATYBNVWNHHNHvGACCTTrCba

CGGGCATTCAGGGACCGCTTTAGRGTGCCG 11 I ! ! ! I I ! II I I I I I I I I I I I I I I I I I ! I GCCCGTAAGTCCCTGGCGAAATCYCACGGC GCCCGTAAGTCCCTGGCGAAATCYCACGGC yYBdDYMAGTYYBYBSkKAAAKYYNNNNGC hHNdDYRMGYYdkNBGtKAAADBYYNBRGC

5'->3'

3'->5'

Рис. 1. Нуклеотидные последовательности праймеров ТсРс 173F и ТсРс 589R.

Для дальнейшего тестирования специфичности праймеров в качестве положительных контролей была использована ДНК типовых штаммов ряда представителей семейства ДНК типовых штаммов представителей других таксонов гипертермофильных архей, а также термофильных бактерий использовали в качестве отрицательных контролей. Единственный продукт амплификации, размер которого соответствовал ожидаемому (приблизительно 400 пар нуклеотидов), был получен только в реакциях с микроорганизмами семейства во всех остальных случаях

образования каких- либо продуктов ПЦР не наблюдалось.

Специфичность праймеров дополнительно проверяли в опытах, где пару TcPcl73F-TcPc589R разбивали и каждый из них соединяли с одним из архейных праймеров с образованием пар Arch338F-TcPc589R и TcPcl73F-Archl389R, "полуспецифичных" к семейству Thermococcaceae. В этих случаях в качестве матрицы использовали ДНК чистых культур T. celer, A. fulgidus, A. infernus, A. aceticus (Табл. 1). Продукты амплификации ожидаемого размера (приблизительно 250 и 1200 пар нуклеотидов, соответственно) были получены только с ДНК во всех остальных случаях образования

продуктов не наблюдалось. Следовательно, каждый из -специфичных

праймеров обеспечивает надежный дискриминирующий эффект.

Таблица 1. Проверка специфичности праймеров TcPcl73F и TcPc589R.

Микроорганизм Результаты амплификации с разными праймерами и температурами отжига®

ТсРс173 F-TcPc5 89R Arch338F-TcPc589R TcPcl73F-Archl381R Arch338F-Archl381R

65°С 72°С 75°С 72°С 74°С 74°C

Archaeoglobus fulgidus - - - - - +

Acidianus infernus и.о. - - - - +

Acidilobus acelicus - - - - - +

Thermococcus celer + + - + + +

" + " - получен единственный продукт ПЦР ожидаемого размера,"-" - отсутствие продуктов ПЦР.

1.2. Чувствительность метода

Рис. 2. Чувствительность метода обнаружения микроорганизмов семейства Ткегтососсасеае при помощи ПЦР-амплификации с праймерами ТсРсШБ и ТсРс589& Количество циклов

амплификации 25 (А) и 30 (В). Дорожки: 1-маркер молекулярной массы ДНК, 2- 300 нг ДНК, 3- 30 нгДНК, 4- 3 нгДНК, 5- 300 пкг ДНК, б- ЗОпкг ДНК, 7- 3 пкг ДНК, 8- 300 фтг ДНК, 9- реакция без ДНК (отрицательный контроль).

При 25 циклах амплификации для образования видимого сигнала ПЦР в прокрашенном бромистым этидием агарозном геле

потребовалось 30 пкг геномной ДНК Thermococcus celer (Рис. 2А). Если предположить, что размер генома микроорганизмов семейства

составляет в среднем 1,8x10' пар оснований и, следовательно, одна клетка содержит примерно 1,9 фтг ДНК, то это количество ДНК соответствует 1,6x104 клеток. При 30 циклах амплификации для образования видимого сигнала ПЦР в геле потребовалось 3 пкг геномной ДНК (Рис. 2В). Таким образом, увеличение числа циклов амплификации с 25 до 30 повышало чувствительность до 1,6x103 клеток, что соответствует результатам, опубликованным ранее в работах, где использовали ПЦР амплификацию генов 16S рРНК (Degrange et al., 1995; Loffler et al., 2000; Houfet al., 2000).

1.3. Идентификация чистых культур микроорганизмов

Одной из целей создания праймеров ТсРс 173F - ТсРс 589R была быстрая идентификация членов среди изолятов, морфологически сходных с

представителями этого семейства. ПЦР со специфичными праймерами позволила нам отнести к семейству ТИегтососсасеае 7 из 9 протестированных чистых культур, выделенных и хранящихся в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (Табл. 2).

Таблица 2. Идентификация чистых культур микроорганизмов с помощью ПЦР с ТИегтососсасеае-специфичными праймерами TcPcl73F и TcPc589R.

Штамм Место отбора Условия культивирования Результат

пробы ПЦРа

Среда Донор электронов Акцептор электронов

8Ы531 Глубоководная гидротерма Восточно- Пептон Ре(Ш) +

515 н2 в0 +

АМ4 Тихоокеанское Поднятие СО не доб. +

АМ8 Пептон +

БВбИ Нефтяное месторождение Северное море Морская Пептон не доб. +

БМ402 Морской мелководный гидротермальный осадок Курильские острова Пептон Ре(Ш) +

ЭМ4022 Пептон Ре(Ш) +

204 Горячий источник Камчатка Пресная Пептон в"

313 Горячий источник Курильские острова Пептон Б"

" + " - получен единственный продукт ПЦР ожидаемого размера, "-" - отсутствие продуктов ПЦР.

Все штаммы представляли собой гипертермофильные микроорганизмы с клетками коккоидной формы. Некоторые из них были выделены и культивировались в необычных для этого семейства условиях. В трех случаях (штаммы SN531, SM4022 и SM402) акцептором электронов являлась не сера, а окисное железо; использованная среда не была предварительно восстановлена. Два других штамма (515 и АМ-4) использовали неорганические источники энергии, Н2 и СО соответственно. Способность штамма АМ-4 к росту за счет анаэробного окисления СО с образованием водорода из воды можно считать новой фенотипической чертой представителей семейства Thermococcaeae. Идентификаци. штамма SB611, выделенного из нефтяной скважины Северного моря как представителя Thermococcaceae можно считать дополнительным доказательством присутствия организмов этой группы в пластовых водах нефтяных месторождений (Stetter et al., 1993).

Попытка обнаружить Thermococcaceae среди организмов, выделенных из наземных гидротерм Кунашира и Камчатки (штаммы 204 и 313) основывалась на обнаружении организмов этой группы в наземных гидротермах Новой Зеландии (Ronimus et al., 1997; Gonzales et al., 1999). Несмотря на фенотипическое сходство, наши штаммы не оказались членами семейства Thermococcaceae", таким образом, ареал пресноводных Thermococcaceae по-прежнему ограничивается Новой Зеландией.

1.4. Детекция представителей Thermococcaceae в природных образцах и накопительных

культурах

Разработанный метод был использован для поиска представителей Thermococcaceae в различных экосистемах, в том числе в таких, условия в которых не характерны для местообитаний большинства известных представителей этого семейства, например, из антропогенного и природных образцов с низкой соленостью, относительно низкими значениями рН и температуры (Табл.3). В наших экспериментах представители Thermococcaceae были детектированы только в глубоководных и мелководной гидротермах -традиционных местах выделения этих микроорганизмов. После внесения материала проб 530 и 402 в питательную среду, селективную для роста термококков, и инкубации в течение 24 ч при 82°С Thermococcaceae были обнаружены в обеих накопительных культурах (Рис. 3), таким образом, отсутствие продукта амплификации ДНК, выделенной из пробы 530, очевидно, объясняется тем, что содержание Thermococcaceae в ней ниже предела чувствительности метода (103 -104 клеток/мл).

Таблица 3. Детекция Thermococcaceae в природных образцах с помощью ПЦР с ТИегтососсасеае-специфичными праймерами TcPcl73F и TcPc589R.

Проба Место отбора пробы Результаты ПЦР с праймерами'

Uni515F-Unil492R TcPcl73F-TcPc589R

402 Морской мелководный гидротермальный осадок, Курильские острова, Т 86оС, рН 7,5 + +

530 Фрагмент глубоководной гидротермальной постройки, Восточно-Тихоокеанское Поднятие + -

523 Фрагмент глубоководной гидротермальной постройки, Восточно-Тихоокеанское Поднятие + +

4714 Донный осадок из глубоководной гидротермы, район Гуаймас, Калифорнийский залив + +

$01 Горячий источник, Узон, Камчатка, Т 75°С, рН 4,0 + -

803 Ручей Термофильный, долина Гейзеров, Камчатка, Т61оС,рН 6,5 + -

805 Горячий источник, Узон, Камчатка, Т 82оС, рН 5,5 + -

К4 Сброженный ил из метантенка Курьяновской станции аэрации, г. Москва, Т 52,6°С, рН 7,0 + -

" + " - получен единственный продукт ПЦР ожидаемого размера,"-" - отсутствие продуктов ПЦР.

Рис. 3. Детекция в

¡природных образцах и

накопительных культурах.

Дорожки: 1 и 6- маркер молекулярной массы ДНК, 2- проба 402, 3- проба 530, 4- Thermococcus celer (положительный контроль), 5-реакция без ДНК (отрицательный контроль), 7- накопительная культура, полученная из пробы 402, 8- накопительная культура, полученная из пробы 530.

Определение чувствительности метода позволило использовать его не только для детекции, но и для приблизительной оценки численности и мониторинга

динамики роста этих микроорганизмов в 4 лабораторных микрокосмах, моделирующих условия в различных участках морской глубоководной гидротермы. Динамика роста

Рис. 4. Динамика роста микроорганизмов семейства ТИегтососсасеае в

лабораторных микрокосмах.

1-90%С02+10%Н2, 28°С,

2- 90% воздух +10% Н2, 28°С,

3-90%С02+10%Н2, 82°,

4-90% воздух+10% Н2, 82"С.

Непосредственно после засева не были обнаружены ни в одном

микрокосме. В микрокосмах, инкубированных при 28°С, не

детектировались в течение всего эксперимента (Рис.4,1,2). При культивировании в анаэробных условиях при 82°С численность оцененная с помощью ПЦР,

достигает максимума уже через сутки после инокуляции (Рис.4, 3), в то время как в микрокосме с воздушной газовой фазой Тъегтососсасеае были впервые детектированы на третьи сутки инкубации (Рис. 4,4). Очевидно, к этому времени в микрокосме образовались зоны с достаточно низким для развития ТЪегтососсасеае окислительно-восстановительным потенциалом. Через 18 дней культивирования численность ТЪегтососсасеае снизилась лишь незначительно.

Таким образом, предложенный метод обнаружения микроорганизмов семейства ТИегтососсасеае, основанный на ПЦР-амплификации генов ^ рРНК со специфичными олигонуклеотидными праймерами TcPcl73F и TcPc589R, позволяет проводить быструю и достоверную идентификацию новых изолятов, скрининг природных образцов и накопительных культур, а также оценивать численность и динамику роста этих микроорганизмов.

в этих культурах представлена на рис. 4.

2. ПЦР-детекция архей в гипертермофильных накопительных культурах, полученных из метантенка, работающего в термофильном режиме

Антропогенные местообитания с микробиологической точки зрения не менее разнообразны, чем природные экосистемы. Несмотря на то, что микрофлора систем биологической очистки, в том числе и термофильных метантенков, исследуется как культуральными (Калюжный и др., 1991), так и молекулярно-экологическими методами (8ей;исЫ е1 а1., 1998), случаи обнаружения в них культивируемых гипертермофильных микроорганизмов или нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК гипертермофильных прокариот не были известны. В связи с этим нами была проведена детекция архей в гипертермофильных накопительных культурах, полученных из сброженного ила метантенка, обрабатывающего осадки муниципальных сточных вод в термофильном режиме (50°С).

Из пробы сброженного осадка из метантенка была получена устойчивая накопительная культура гипертермофильных микроорганизмов (КР4), растущих при 82°С. Эта ассоциация гипертермофильных микроорганизмов состояла из численно доминирующих кокков правильной формы, 2-5 мкм в диаметре, встречающихся либо в виде отдельных клеток, либо их пар, а также небольшого количества бесспоровых палочек (не более 2% от количества кокков) (рис. 5).

2.1. Получение культуры гипертермофильных микроорганизмов

Рис. 5 Электронные фотографии культуры КР4. (Негативное окрашивание ФВК).

КР4 растет в диапазоне температур от 47°С до 98°С с оптимумом при 82°С. Роста не наблюдалось при 40°С и выше 98°С. Оптимальным для роста являлся рН 7,4-7,6 (измерен при 80 °С); при рН ниже 6,5 и выше 8,5 не наблюдалось роста ни кокков, ни палочек. КР4 растет только в анаэробных условиях, но не требует присутствия восстанавливающих агентов в среде. Культуральными методами разделить отдельные компоненты КР4 не удалось. Можно предположить, что данная культура представляет собой устойчивую ассоциацию нескольких микроорганизмов, основанную на симбиотических отношениях.

2.2. ПЦР-анализ накопительной культуры КР4

На разных этапах очистки накопительной культуры КР4 из нее выделяли общую геномную ДНК и проводили ПЦР-анализ с праймерами, специфичными к генам ^ рРНК архей, кренархеот, Ткегтососсасеае, а также

с универсальными (Табл. 4). В исходной пробе сброженного ила сигнал ПЦР был получен с универсальными и архейными праймерами. В накопительной культуре после трёх последовательных пересевов на среде, содержащей аморфный оксид Ре(Ш), был также получен сигнал с кренархеотными праймерами Сгеп7Р-Сгеп518К, который устойчиво сохранялся и после пяти пересевов на среде без железа, и в культуре КР4. Таким образом, ПЦР-анализ подтверждал постоянное присутствие представителей СгепагскаеоШ в накопительных культурах.

Секвенирование генов ^ рРНК общей геномной ДНК, выделенной из накопительной культуры КР4 (884 нуклеотидов), выявило, что архейный компонент представлен единственной нуклеотидной последовательностью, имеющей 99,9% гомологию с геном Ш рРНК 8и1/ор(юЬососси5 гИНри Род 5и1/оркоЬососси5 относится к семейству Ое5и!/игососсасеае и представлен единственным видом, X который был выделен из

горячего щелочного источника в Исландии (Неше1 et а1., 1997); других сообщений об обнаружении где-либо представителей этого рода нет. Несмотря на морфологическое сходство и практически полное совпадение генов ^ рРНК, кокковидный компонент культуры КР4 имеет ряд физиологических отличий от типового штамма 8. (Табл. 5).

Таблица 4. ПЦР-анализ гипертермофильных накопительных культур, полученных из антропогенного биотопа К4.

Праймер Специфичность, ссылка Приблизительный размер продукта амплификации (п.н.)

Проба К4 Накопительная культура

После Зх пересевов на среде с Fe(III) После 5 пересевов КР4

Uni515F Unil492R Ген 16S pPHK прокариот, (Reysenbach and Расе, 1995) 1000 1000 1000 1000

Arch2F Arch 958R Ген 16S pPHK архей, (Reysenbach and Расе, 1995) 1000 1000 1000 1000

Cren7F Cren518R Ген 16S рРНК кренархеот, (Перевалова и др., 2003) 500 500 500

TcPcl73F TcPc589R Ген 16S рРНК семейства Thermococcaceae, (Slobodkina et al., 2002)

Размер продуктов амплификации выражен в количестве пар нуклеотидов; "-" означает отсутствие продуктов амплификации.

Таблица 5. Дифференцирующие свойства архейного компонента КР4 и Sulfophobococcus zilligii.

Характеристики роста Архейный компонент КР4 Sulfophobococcus zilligii

Т роста (тт-тах-орО 47-98-82°С 70-97-87°С

Наличие восстанавливающего агента вереде не требует требует

Влияние на рост 8° не влияет ингибирует

Рост на пептоне + -

Рост на дрожжевом экстракте - +

Устойчивость к антибиотикам (100 мкг/мл): рифампицин хлорамфеникол стрептомицин иеомицин канамицин н.о. не ингибирует рост

не ингибирует рост в первом пересеве

н.о.

О выделении представителей из антропогенных биотопов или об

обнаружении в них нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК кренархеот есть лишь единичные сообщения (81ейег, 1996; Ооёоп е1 а1., 1997). Сообщений об обнаружении культивируемых представителей царства в антропогенных местообитаниях с

нейтральным значением рН до сих пор не было. Таким образом, результаты наших исследований расширяют список мест обитания филогенетической группы а

также физиологической группы гипертермофильных микроорганизмов. Вероятно, ПЦР-анализ не выявил представителей непосредственно в сброженном осадке

метантенка, поскольку численность их в нем была ниже предела чувствительности метода (103-104клеток/мл). Однако можно предположить, что обнаруженный нами культивируемый Би^орЬоЪососсиа Бр. с нижней температурой роста 47°С может развиваться в данной экосистеме как в общей толще осадка, так и в локальных зонах перегрева. Таким образом, гипертермофильные кренархеоты являются частью анаэробного микробного сообщества, разлагающего муниципальные органические отходы.

3. Выделение и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы

Сегодняшняя молекулярная биология немыслима без использования термостабильных ферментов, в первую очередь без термостабильных ДНК-полимераз. По сравнению с бактериальными, ДНК-полимеразы архей обладают рядом преимуществ. Нашей задачей был поиск новых архейных термостабильных полимераз в коллекции гипертермофильных микроорганизмов.

3.1. Скрининг коллекции гипертермофильных архей на наличие термостабильных ДНК-

полимераз

30 штаммов гипертермофильных архей, относящихся к родам

и были проверены на наличие термостабильных

ДНК-полимераз. Результаты скрининга показали, что остаточная полимеразная активность после инкубации препарата при 95°С в течение 30-120 мин заметно варьировала. У пяти штаммов 60-100% активности сохранялось после прогрева препаратов при 95°С в течение 120 мин (Табл. 6). Среди них было по одному представителю родов ТИегторШеи5 (штамм 208), АсШоЬш (штамм 1919) и ТЪегтосоССШ (штамм 8Ь1ЛМ); два штамма принадлежали к роду Оеви^гососсш (313 и 2601). Для дальнейшей работы были выбраны 3 штамма: ТНегтососсш Бр. 8ЫЛМ, ТИегтососсш Бр. Е6 и Ое$и1/игососси$ ату1о1у1кт 313.

Таблица 8. Штаммы гипертермофильных архей, использованные для поиска термостабильной полимеразы.

Микроорганизм Штамм Источник выделения Включение ^Н (Ю* имп./мин) после инкубации препарата при 95°С в течение (мин) Остаточная активность (95оС, 120 мин), %

0 30 60 90 120

ТИегтососсш рас^сия РЗ Залив Пленти, Новая Зеландия 17,3 3,0 2,8 2,7 16

Р4 15,3 4,2 2,6 1,0 1,7 11

ТЬегтососст ШогаШ 1614 Район Гуаймас 8,2 3,0 1,6 2,8 2,7 33

Бухта Матупи, Новая Гвинея 30,6 3,9 1,9 1,8 2,0 6

ТИегтососсиз ¡¡еиеп К-15 О. Янкича, Курильские острова 94,6 5,0 4,2 3,8 3,6 4

К-3 11,1 4,9 2,4 0 0 0

К1В 45,7 5,0 5,0 4,7 5,2 И

ТИегтососсш хр. К-17 125,3 5,6: 4,3 5,8 2,8 2

БЫ А О. Шикатан, Курильские острова 33,3 8,1 4,8 4,8 4,2 13

ЭЫАМ 17,2 9,2 7,1 9,1 10,4 60

БЫВ 48,9 10,0 4,2 6,2 4,6 9

2705 О. Кунашир, Курильские острова 38,1 24,3 8,1 4,4 3,3 9

Е-1 30,4 27,5 14,6 8,0 5,5 18

Е-4 44,8 37,3 19,6 13,1 11,1 25

Е-6 15,2 8,9 6,0 5,6 7,0 46

2104 116,2 4,1 3,5 4,0 2,6 2

Е-3 20,7 9,9 7,3 7,9 5,9 28

МЗ-6 Бухта Матупи, Новая Гвинея 19,0 7,1 2,6 23 1,9 10

Оехи1/игососси8 атуШуИсиз 313 Камчатка 15,0 14,9 14,5 13,2 11,5 90

г-533 20,9 3,3 4,4 0 0 0

204 9,6 10,5 11,1 0 0 0

2601 О. Кунашир, Курильские острова 11,4 11,5 7,9 9,9 10,0 88

РезиЦигососсш ¿¡р. 19 4,8 4,0 4,0 2,2 1,5 31

603 Камчатка 8,5 11,3 10,6 0 0 0

ТЪегторго1еш зр. 142 Камчатка 7,0 9,5 7,0 10,8 0 0

X 6,8 4,3 6,8 9,25 3,0 44

208 12,3 11,0 11,0 13,5 8,5 70

ЛсШИоЬия асеНсиз 1919 5,0 3,0 3,0 3,2 5,0 100

1920 4,3 3,6 2,5 0 0 0

1904 5,0 5,0 2,0 0 0 0

Таблица 7. ПЦР праймеры, использованные для анализа структуры и клонирования ДНК-полимеразы из ТИегтососсш ф. 8И1ЛМ.

Праймер Позиция пoTgo Позиция по ТН Нуклеотидная последовательность (5'-3)

Т8о1 1 291 ATGAT(A,C,T)(C,T)TNGA(C,T)ACNGA(C,T)TA(C,T)AT(C,T,A>AC

68(Ж 2029 5100 0С(Т,А,0)АС(А,0)Т0К0СЫСС(А,Т,С)Ата0С(Т,С)ТТ(А,0)ТА

21И 1450 1737 0А(Т,С)ТАТА0(А,0)СААА(0,АХА,0)0С(Т,0)АТ(Т,А)ААА(Т,С)Т(С,0)(Т,С)Т(Т,А)0СААА

211*. 1450 1737 ТТГ0С(А,Т)А(А,СХС,0)А(А,0)ТТТ(А,Т)АТ(А,С)0С(Т,СХТ,С)ТТТ0(Т,С)СТАТА(А,а)ТС

22Я 1540 3432 ССССА(Т,0)ССА0ТААСССТ(Т,С)ТСА0САСАСТССТТ

23Я 1597 3498 ТА(А,0)А0(Л,0)АС(Т,С)ТТААА(Т,0)СС(А,0)ААС'ГГТ'1'С(Т,С)'1С

24 Р 1633 4704 АСТСА(Т,СУаО(Т,С)(Т,С)'1(Т,С)ТАТСС(А,С)АС(А,'Г)А'Г(А,С)СС(А,С)00

24Я 1633 4704 СС(Т,0)0О(Т,О)АТ(Т,А)ОТ(Т,0)ССАТА(А,0)А(А,О)(А,О)СС(А,О)ТСАОТ

25Р 1849 4920 АОАОАТТООАОТОА(А,0)АТ(Т,А)ОС(А,Т)АА(А,0)СС(А,0)АСТСА

25 Я 1849 4920 ТОАОТ(Т,С)ТС(Т,С)ТТ(Т,А)СС(Т,А)АТ(Т,С)ТСАСТССААТСТСТ

26К 2233 5304 СТСТАТССААА(Т,С)(С,0)С(Т,С)ТС(С,С)А(А,0)ТАТССТАА0ТАС

27Я 2260 5331 (Т,С)ТС(А,0)ТАКССМАС(А,0)ТС(Т,С)ТС(Т,С)ГШС0(А,С)ТА

БЖа 2291 5362 АСССА(Т,0Х}(А,С)А{Т,0)(Т,С)ТА(А,0)0СС0(А,С)(Т,С)ТТ0Т(Г,С)ТТа

$0Ш 2284 5355 (Т,С)ТА(А,С)СССС(А,0)(Т,С)ТТ0Т(Т,С)ТТ0(А,Т)(С,аКТ,С)ТТТ0

БО^с 2296 5367 ТША0ССАЫ(С,О)(С,А,Т)К(Т,С)(С,Т)КАС^СМ(С,АХ'Г,С)(Т,С)ТО

47ьея СТСААССТСААОСАОАССТСОААСГТТ

ИБЫЛ АТОАТЛСТООАСЛСТОЛТТАСЛТААС

ястн ОСТАССТСТТОАОССАТОСАТСТААОССООТТТ

Яс47 СТОТАТССАААСОССТСОАОТАТССТААОТА

СБЫЛ АААООАСОАТТТААСОТАТСАААОСТСАААА

3.2. In situ характеристика отобранных архейных термостабильных полимераз

Определение полимеразной активности в полиакриламидном геле (in situ анализ) в препаратах, полученных из клеток, отобранных из представителей Archaea, показал наличие в них белковых фракций, обладающих полимеразной активностью (Рис. 6). Только у одного из исследуемых штаммов (ThermococcUS sp. ShlAM) был обнаружен активный белок, молекулярная масса которого была равна приблизительно 100 кДа. В препаратах ThermococcUS sp. E6 и Desulfitrococcus amylolyticus 313 также были обнаружены белковые фракции, обладающие полимеразной активностью, однако их молекулярная масса была ниже (приблизительно 75-80 кДа). Полимераза с более высоким молекулярным весом с большей вероятностью обладает ассоциированной 3'-5' экзонуклеазной активностью, обеспечивающей корректирующую способность; таким образом, для выделения и очистки термостабильной ДНК-полимеразы был отобран штамм ThermococcUS sp. ShlAM.

Рис. 6. Характеристика in situ термостабильных ДНК-полимераз гипертермофильных архей.

Электрофореграмма в 8%-ном ДЦС-Na-nAAr: 1 - Thermococcus sp. ShlAM, 2 - Thermococcus sp. E6, 3 - Desulfurococcus amylolticus 313, 4 - полимераза I Е. coli (109 кДа), фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli (76 кДА) ("MBI Fermentas," Литва).

3.3. Выделение, очистка и характеристика ДНК-полимеразы из штамма ТЪегтОСОССШ

зр. 8ЫЛМ

Из 10 г сырой биомассы изолята 8Ь1ЛМ было получено 11 мг фермента с удельной активностью 3600 ед./мг белка. Примененная многостадийная схема очистки позволила повысить удельную активность фермента в 1500 раз по сравнению с исходной при сохранении термостабильности. Остаточная активность препарата после 120 мин инкубации при 95°С составляла около 50% от исходной; после 180 мин - 27,5%. Молекулярная масса

фермента - 90-100 кДа. Выделенная полимераза была способна к ПЦР-амплификации небольших фрагментов ДНК и обладала ассоциированной 3'-5' экзонуклеазной активностью. С присутствием этой активности связана повышенная точность копирования, которая является важным преимуществом термостабильных архейных ДНК-полимераз. Частота ошибок, допускаемых полимеразой Sh1AM при достройке цепи ДНК, была по крайней мере в 2 раза ниже, чем у 7о§-полимеразы. По основным физико-химическим и энзиматическим свойствам полимераза Sh1AM соответствует известным ДНК-полимеразам семейства В.

4. Клонирование гена ДНК-полимеразы из штамма ТИегтососсш sp. ShlAM

Для клонирования гена ДНК-полимеразы из штамма ShlAM были созданы вырожденные олигонуклеотидные ПЦР-праймеры на основе известных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей архейных ДНК-полимераз (Табл.7). Кодирующие последовательности известных генов ДНК-полимераз архей часто прерываются необычными нитронами, которые удаляются на белковом уровне, а не на уровне мРНК, т.е. эти интроны кодируют так называемые "самосплайсирующиеся" белки-интеины. Это обстоятельство учитывалось при исследовании структуры гена полимеразы ShlAM. На рис.7 схематически показано положение праймеров на карте гена Vent ДНК-полимеразы (Perler et al., 1992), выделенной из Thermococcus litoralis. Заштрихованные области соответствуют положению интеинов в Vent ДНК-полимеразе.

Рис. 7. Схема расположения праймеров для клонирования полимеразы ShlAM на карте гена Vent ДНК-полимеразы (Perler et al., 1992).

Исследование структуры гена полимеразы ShlAM с помощью ПЦР-амплификации с различными комбинациями праймеров (Табл.8) показало, что полимераза ShlAM не содержит интеинов, что отличает ее от большинства известных архейных полимераз. Использование праймеров StR а, Ь, с ни в одной из комбинаций с другими праймерами не позволило получить продукт амплификации.

Фрагмент максимальной длины, размером около 2200 п.н., был получен с помощью пары праймеров Tgol-26R. Этот фрагмент был клонирован в вектор pT-Adv, и была частично определена нуклеотидная последовательность вставки.

Для выделения фрагмента ДНК, соответствующего проксимальной С-концевой кодирующей области гена полимеразы ShlAM и установления его нуклеотидной последовательности был использован метод "инвертированной ПЦР" (Garces and Gavin, 2001). Единственный продукт амплификации размером около 900 п.н. был выделен и клонирован в вектор pT-Adv; была определена его нуклеотидная последовательность. На основании определенных нуклеотидных последовательностей были синтезированы праймеры NShlA и RCTli, точно соответствующие 5'- и 3'- концевым областям гена полимеразы ShlAM.

С полученными праймерами NShlA- RCTli удалось синтезировать полноразмерный ген ДНК-полимеразы ShlAM. Единственный продукт амплификации размером 2320 п.н. выделили из геля и секвенировали с использованием праймеров NShlA, RCTli, 47seq. Сравнение нуклеотидной последовательности полноразмерного гена ДНК-полимеразы ShlM с нуклеотидными последовательностями известных архейных полимераз семейства В показало, что наиболее близкая нуклеотидная последовательность принадлежит гену Vent ДНК-полимеразы. Уровень гомологии между ними составил 95%.

5. Экспрессия гена ДНК-полимеразы из Themococcus sp. ShlAM

Полноразмерный ген был клонирован в вектор pETD и полученная рекомбинантная плазмида была использована для трансформации клеток E. coli BL2l. Экспрессия гена в данной конструкции находится под контролем промотора РНК-полимеразы фага Т4. Экспрессию рекомбинантного гена полимеразы индуцировали ИПТГ и контролировали путем измерения ДНК-полимеразной активности в прогретых (70°С, 30 мин) грубых клеточных лизатах индивидуальных клонов. Из 30 проанализированных клонов 5 показали наивысший уровень экспрессии. В таблице 9 приведены данные по измерению полимеразной активности для "положительных" и нескольких "отрицательных" клонов. Клоны 5,6,8,9,ll были признаны содержащими клонированный ген полимеразы ShlAM с верной нуклеотидной последовательностью и в правильной ориентации. Клеточные экстракты из отобранных клонов использовали для определения термостабильности ДНК-полимеразы. Для этого образцы лизатов прогревали 60 мин при 95°С и затем определяли полимеразную активность. В экстракте одного из клонов сохранялось 60% исходной полимеразной

активности. Отобранный клон был обозначен как ВЬ21Я)ЕЗ/рЕТОРОЬ_8Н1АМ и был признан штаммом-продуцентом рекомбинантной ДНК-полимеразы РОЬ_8И1ЛМ.

Таблица 8. Приблизительный размер продуктов амплификации ДНК ТЬегтососсш эр. БЫАМ со специфичными праймерами (п.н.).

Праймер Тво1 21Р 24Р 25Б

2Ш 1400 п<1 иЗ П<1

22К - ш! па П(1

2311 1600 200 П(1 п<1

24Я 1600 200 па па

2511 1800 400 П(1 ш!

26Я 2200 800 - 400

27Я - - - 400

680Я 2000 600 - 200

вШ - - - -

- - - -

БШл - - - -

"-" - отсутствие продуктов амплификации ожидаемого размера

Таблица 9. Определение ИПТГ-индуцируемой ДНК-полимеразной

активности в прогретых лизатах рекомбинантных клонов.

Включение

• Клоны радиоактивной метки,

ИПТГ- ИПТГ +

Вектор без 1 1

вставки

1 2 40

3 3 5

4 5 8

5 10 75

6 11 80

7 3 7

8 15 85

9 14 84

10 4 4

11 16 90

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярная детекция гипертермофильных архей в различных экосистемах представляет научный и практический интерес. Количество сиквенсов рРНК в базах данных постоянно растет, делая необходимым создание все новых праймеров. Основным качеством, которым должны обладать праймеры, используемые для детекции определенных микроорганизмов, является высокая специфичность. Нами был разработан метод обнаружения гипертермофильных архей семейства ТЪегтососсасеае, основанный на ПЦР-амшшфикации генов ^ рРНК с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Выбор этой группы микроорганизмов был связан с тем, что семейство представляет собой филогенетически обособленную и самую многочисленную группу гипертермофильных архей, отличающуюся поразительным генетическим разнообразием, дающим основания ожидать у представителей этого семейства наличия новых физиологических и метаболических свойств. Кроме того, с биотехнологической точки зрения это одна из самых перспективных групп микроорганизмов. Разработанный нами метод был успешно применен для идентификации чистых культур микроорганизмов, детекции в природных образцах и

накопительных культурах, а также для оценки численности и динамики роста в лабораторных микрокосмах. Как и природные, антропогенные биотопы интенсивно исследуются культуральными так и молекулярно-биологическими методами, однако о выделении из них представителей СгепагсИасоШ или об обнаружении нуклеотидных последовательностей генов ^ рРНК кренархеот есть лишь единичные сообщения. В связи с этим нами был проведен ПЦР-анализ гипертермофильных накопительных культур, полученных из сброженного ила метантенка, обрабатывающего осадки муниципальных сточных вод в термофильном режиме (50°С), который выявил наличие в них представителей царства Получена устойчивая

ассоциация гипертермофильных микроорганизмов (КР4), состоящая из численно доминирующих кокков и минорного количества бесспоровых палочек. Единственным архейным компонентом культуры является микроорганизм, близкородственный БиУоркоЬосоССШ хНИ%Н, и принадлежащий к царству СгепагсИйео1а. Это первое сообщение об обнаружении гипертермофильных архей в системах биологической очистки. Это также первое сообщение об обнаружении в антропогенных местообитаниях с нейтральным значением рН культивируемого представителя царства

Биотехнологический потенциал гипертермофильных архей связан прежде всего с устойчивостью их ферментов к высоким температурам. В нашей работе 30 штаммов

гипертермофильных архей были проверены на наличие в них термостабильных ДНК-полимераз. Из штамма ТЬегтососсш Бр. 8Ь1ЛМ ДНК-полимераза была вьделена и очищена. Было показано, что очищенная ДНК-полимераза сохраняет высокую термостабильность, а также обладает 3'-5'экзонуклеазной активностью, обеспечивающей корректирующую способность. Для клонирования гена выделенной полимеразы, молекулярно-биологическими методами было проведено исследование структуры гена и выявлено отсутствие нуклеотидных последовательностей, кодирующих интеины, что отличает данный ген от генов большинства известных архейных ДНК-полимераз. Был синтезирован полноразмерный ген ДНК-полимеразы 8ЫЛМ, определена его нуклеотидная последовательность и получен штамм-продуцент рекомбинантной ДНК-полимеразы

ВЬ21Я)ЕЗ/рЕТОРОЬ_8Н 1АМ.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод обнаружения гипертермофильных архей семейства Пегтососсасеае, основанный на ПЦР-амплификации генов 168 рРНК с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров.

2. При помощи разработанного метода проведена идентификация чистых культур микроорганизмов и детекция в природных образцах и накопительных культурах. Впервые с применением культуральных и молекулярно-биологических методов гипертермофильные археи обнаружены в системах анаэробной биологической очистки.

3. Проведен скрининг коллекции гипертермофильных архей на наличие термостабильных ДНК-полимераз. ДНК-полимераза из штамма ТЪегтоСОССШ ф. 8Ь1ЛМ выделена и охарактеризована. Клонирован ген выделенной термостабильной ДНК-полимеразы и получена экспрессия рекомбинантного белка в клетках Е.еоЫ.

4. Показано, что ДНК-полимераза 8Ь1ЛМ обладает такими важными с биотехнологической точки зрения свойствами как высокая термостабильность и точность копирования.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Slobodkin A.I., Subbotina I.V., Bonch-Osmolovskaya EA Lebedinsky A.V. 2004. PCR-based identification of hyperthermophilic Archaea of the family Themococcaceae. Appl. Environ. Microbiol. 70:5701-5703.

2. Слободкина Г.Б., Слободкин А.И., Турова Т.П., Кострикина Н.А., Бонч-Осмоловская Е.А 2004. Обнаружение культивируемой гипертермофильной археи рода Sulfophobococcus в метантенке, работающем в термофильном режиме. Микробиология. 73:716-720.

3. Г.Б. Слободкина, Н.А Черных, СА Лопатин, Г.Е. Ильина, А.В. Банникова, В. Анкенбауэр, М.А Эльдаров, В.П. Варламов, Е.А Бонч-Осмоловская. 2005. Выделение и характеристика термостабильной ДНК-полимеразы гипертермофильной археи Sh1AM. Прикладная биохимия и микробиология. 1:40-47.

4. Lebedinsky A.V., Slobodkina G.B., Chemyh N.A., Bonch-Osmaolovskaya EA, Schleper CM. 2000. Nested PCR as a method for monitoring Crenarchaeota in mixed cultutes. Abstr. Int. Workshop on Enzymology, Molecular biology and Biochemistry of Thermophiles. 6-12 August 2000, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. Book ofAbstr., p 27.

5. Lebedinsky A.V., Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya EA, Schleper CM. 2000. Obtaining of a mixed culture containing psychrotrophic Crenarchaeota using nested PCR as a method for monitoring. Abstr. 3th Int. Congress on Extremophiles'2000. 3-7 September, Hamburg, Germany. Book ofAbstr. P27, p.95

6. Slobodkina G.B., Subbotina I.V., Lebedinsky A.V., Slobodkin A.I., Bonch-Osmolovskaya E.A., Chernyh N.A. 2002. PCR-based detection and identification of hyperthermophilic Archaea of the family Abstr. 4th Int. Congress on Extremophiles'2002. 22-26 September, 2002, Naples, Italy. Book ofAbstr. P47, p.181.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от01.12.99 г. Подписано к печати 22.04.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл.1,75. Тираж 100 экз. Заказ 237. Тел. 9 39- 3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова^ 2-й учебный корпус, 627 к. ^ ^ Ь **

|г Г- >

| 5 ? т !

1 ? *

ътшпт^К'' 700

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Слободкина, Галина Борисовна

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гипертермофильные микроорганизмы

1.1. Места обитания гипертермофилов

1.2. Физиологические свойства гипертермофилов

1.3. Филогения и таксономия гипертермофилов

2. Род Thermococcus

2.1. Таксономия и места обитания

2.2. Генотипическое разнообразие

2.3. Феногипические свойства

3. Возможности промышленного использования ферментов гипертермофилов 26 3.1 Термостабильные ДНК-полимеразы

4. Молекулярные методы в микробной экологии

4.1. Роль молекулы 16S рРНК в современной таксономии и филогении

4.2. ПЦР-клонирование-секвенирование - основная магистраль молекулярного анализа микробных сообществ

4.2.1. ПЦР со специфичными праймерами

4.3. Электрофорез в денатурирующем градиентном геле

4.4. In situ гибридизация

4.5. Недостатки методов микробной молекулярной экологии 35 4.6 Сочетание методов классической и молекулярной микробной экологии

РЕЗЮМЕ

II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ПЦР-детекция гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae

1.1.Специфичность праймеров TcPcl73F-TcPc589R

1.2. Чувстви тельность метода

1.3. Идентификация чистых культур микроорганизмов

1.4. Детекция представителей Thermococcaceae в природных образцах и накопительных культурах

2. ПЦР-детекция архей в гипертермофильной накопительной культуре, полученной из метантенка, работающего в термофильном режиме

2.1. Получение культуры гипертермофильных микроорганизмов

2.2. ПЦР-анализ накопительных культур

2.3. Амплификация и сиквенс архейных генов 168 рРНК

2.4. Физиологические характеристики роста КР

3. Выделение и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы 72 3.1. Скрининг коллекции гипертермофильных архей на наличие термостабильных

ДНК-полимераз

3.2.1п Ми характеристика отобранных архейных термостабильных полимераз

3.3. Выделение и очистка ДНК-полимеразы из штамма

ТИегтососсш эр БЫАМ

3.4. Молекулярная масса и термостабильность очищенной ДНК-полимеразы

3.5. Способность к ПЦР-амплификации ДНК

3.6. Характеристика 3'-5'экзонуклеазной активности

3.7. Определение частоты ошибок выделенной ДНК-полимеразы

4. Клонирование гена ДНК-полимеразы из штамма Ткегтососсш эр. БЫ АМ

5. Экспрессия гена ДНК-полимеразы из Ткегтососст эр. вЫАМ 88 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94 ВЫВОДЫ 96 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярная детекция представителей гипертермофильных архей и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы"

Гипертермофильными называют микроорганизмы с оптимумом роста при температурах выше 80°С (Stetter, 1996а). В отличие от обычных термофилов, они, как правило, не растут при температурах ниже 60°С. За последние 30 лет интерес к гипертермофильным микроорганизмам в научном сообществе постоянно растет. Современные гидротермальные системы можно рассматривать как аналог древних биоценозов Земли. Таким образом, изучение термофильных прокариот является важным как для понимания эволюции микроорганизмов и их метаболических путей, так и для понимания эволюции биосферы в целом. В термальных экосистемах гипертермофильные микроорганизмы могут выполнять функции первичных продуцентов и/или деструкторов органического вещества (Huber et al., 2000). Гипотеза о существовании горячей подземной биосферы, с суммарным количеством биомассы, превосходящим наземную (Gold, 1992), предполагает активное участие термофильных микроорганизмов в современных биогеохимических процессах. Кроме того, исключительная устойчивость их биополимеров к высоким температурам делает их перспективными объектами, как для фундаментальных исследований, так и в связи с возможностью применения в различных областях биотехнологии (Vielle and Zeikus, 2001). Подавляющее большинство гипертермофильных организмов составляют археи (Stetter, 1996а). Предметом рассмотрения данной работы являются гипертермофильные археи, в основном относящиеся к семейству Thermococcaceae и роду Thermococcus.

Род Thermococcus входит в порядок Thermococcales царства Euryarchaeota. Род представляет собой филогенетически обособленную и самую многочисленную группу гипертермофильных архей, причем количество описанных видов составляет, очевидно, лишь небольшую часть обитающих в природе. В связи с этим дальнейшие поиски новых штаммов могут проходить как экстенсивно - путем исследования новых экосистем по всему миру, так и интенсивно - за счет выделения новых видов из уже известных местообитаний. Генетическое разнообразие термококков значительно шире, чем это можно было бы предположить на основе их высоко консервативного гена 16S рРНК. Это разнообразие дает основания ожидать у представителей этого рода наличия новых, пока неизвестных физиологических и метаболических свойств. Кроме того, с биотехнологической точки зрения это одна из самых перспективных групп микроорганизмов.

Биотехнологический потенциал гинертермофильных архей в большой степени связан с наличием у них термостабильных ферментов, среди которых наиболее широко используемыми и коммерчески успешными являются термостабильные ДНК-полимеразы. Основным преимуществом ДНК-полимераз архей перед термостабильными бактериальными полимеразами можно считать более высокую термостабильность и точность копирования. Все коммерчески используемые архейные ДНК-полимеразы получены из представителей семейства Ткегтососсасеае.

В последние два десятилетия в микробной экологии широко используются методы молекулярной биологии. Главное преимущество и причина широкого использования молекулярных методов, основанных на анализе нуклеотидных последовательностей 168 рРНК, заключается в возможности изучения филогенетического состава микробного сообщества без предварительных стадий культивирования. Ключевым этапом практически всех молекулярно-экологических исследований является амплификация участков генов 16Б рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Постоянное увеличение числа сиквенсов рРНК в базах данных приводит к необходимости создания все новых праймеров, причем к специфичности праймеров, используемых для детекции и идентификации определенного организма в окружающей среде, предъявляют более высокие требования.

В связи с вышеизложенным, детекция гипертермофильных архей в различных экосистемах представляет научный и практический интерес. Наиболее перспективным способом решения этой задачи представляется сочетание традиционных методов культивирования с современными молекулярно-экологическими методами.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась молекулярная детекция гипертермофильных архей с помощью олигонуклеотидных праймеров, специфичных к генам 168 рРНК, а также оценка биотехнологического потенциала коллекции гипертермофильных архей.

Для достижения этой цели следовало решить следующие задачи.

1. Разработать метод молекулярной детекции микроорганизмов семейства Ткегтососсасеае и провести идентификацию новых гипертермофильных изолятов.

4. В случае обнаружения термостабильной ДНК-полимеразы детально исследовать ее свойства с точки зрения возможного применения в биотехнологии. ( Научная новизна работы. Впервые разработаны и синтезированы высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры для ПЦР-детекции гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae. Доказанная высокая специфичность праймеров позволяет делать выводы о наличии представителей семейства Thermococcaceae в накопительных культурах и природных образцах непосредственно по результатам амплификации.

Впервые в системе анаэробной биологической очистки культуральными и молекулярно-экологическими методами обнаружены гипертермофильные архей. В антропогенном местообитании с нейтральным значением pH обнаружен культивируемый представитель царства Crenarchaeota. Результаты исследования расширяют представление о составе микробных сообществ, участвующих в процессе анаэробного разложения органических веществ в системах биологической очистки сточных вод и увеличивают список мест обитания филогенетической группы Crenarchaeota, а также физиологической группы гипертермофильных микроорганизмов.

По результатам скрининга коллекции термофильных архей определен штамм, обладающий ДНК-полимеразой с наиболее перспективными свойствами. Из штамма Thermococcus sp. ShlAM выделена и очищена термостабильная ДНК-полимераза, не содержащая интеинов. Показано, что выделенная ДНК-полимераза обладает такими важными с биотехнологической точки зрения свойствами как высокая термостабильность и точность копирования. Выделен и клонирован ген архейной ДНК-полимеразы и получен штамм-продуцент рекомбинантного белка.

Практическая значимость работы. Предложен простой, быстрый, надежный и чувствительный метод обнаружения гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae, основанный на ПЦР-амплификации генов 16S рРНК с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров.

Выделена и очищена новая архейная термостабильная ДНК-полимераза. Ген, кодирующий эту полимеразу, клонирован и экспрессирован в клетках Е. coli. Полученный фермент может найти широкое применение в молекулярной биологии, генетике, молекулярной диагностике.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конгрессах "Extremophiles'2002" H"Extremophiles'2000", а также на международной конференции "Workshop on Enzymology, Molecular biology and Biochemistry of Thermophiles", 2000.

Автор выражает искреннюю признательность к.б.н. Черных H.A., к.б.н. Лебединскому A.B., к.б.н. Мирошниченко M.JL, к.б.н. Кострикиной H.A., к.б.н. Туровой Т.П. за помощь на определенных этапах работы. Часть работы, связанная с выделением и клонированием ДНК-полимеразы, проводилась совместно с центром "Биоинженерия" РАН, сотрудникам которого автор выражает свою благодарность, особенно к.б.н. Лопатину С. А. и к.б.н. Эльдарову М.А., практически осуществлявшему научное руководство этой частью работы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Slobodkin A.I., Subbotina I.V., Bonch-Osmolovskaya Е.А. Lebedinsky A.V. 2004. PCR-based identification of hyperthermophilic Archaea of the family Thermococcaceae. Appl. Environ. Microbiol. 70:5701-5703.

2. Слободкина Г.Б., Слободкин А.И., Турова Т.П., Кострикина H.A., Бонч-Осмоловская Е.А. 2004. Обнаружение культивируемой гипертермофильной археи рода Sulfophobococcus в метантенке, работающем в термофильном режиме. Микробиология. 73:716-720.

3. Г.Б. Слободкина, H.A. Черных, С.А. Лопатин, Г.Е. Ильина, A.B. Банникова, В. Анкенбауэр, М.А. Эльдаров, В.П. Варламов, Е.А. Бонч-Осмоловская. 2005. Выделение и характеристика термостабильной ДНК-полимеразы гипертермофильной археи Thermococcus litoralis Shi AM. Прикладная биохимия и микробиология. 1:40-47.

4. Lebedinsky A.V., Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Schleper С.M. 2000. Nested PCR as a method for monitoring Crenarchaeota in mixed cultutes. Abstr. Int. Workshop on Enzymology, Molecular biology and Biochemistry of

Thermophiles. 6-12 August 2000, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. Book of Abstr., p 27.

5. Lebedinsky A.V., Slobodkina G.B., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Schleper C.M. 2000. Obtaining of a mixed culture containing psychrotrophic Crenarchaeota using nested PCR as a method for monitoring. Abstr. 3th Int. Congress on Extremophiles'2000. 3-7 September, Hamburg, Germany. Book of Abstr. P27, p.95

6. Slobodkina G.B., Subbotina I.V., Lebedinsky A.V., Slobodkin A.I., Bonch-Osmolovskaya E.A., Chernyh N.A. 2002. PCR-based detection and identification of hyperthermophilic Archaea of the family Thermococcaceae. Abstr. 4th Int. Congress on Extremophiles' 2002. 22-26 September, 2002, Naples, Italy. Book of Abstr. P47, p. 181.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Слободкина, Галина Борисовна

выводы

1. Разработан метод обнаружения гипертермофильных архей семейства Thermococcaceae, основанный на ПЦР-амплификации генов 16S рРНК с помощью высокоспецифичных олигонуклеогидных праймеров.

2. При помощи разработанного метода проведена идентификация чистых культур микроорганизмов и детекция Thermococcaceae в природных образцах и накопительных культурах. Впервые с применением культуральных и молекулярно-биологических методов гипертермофильные археи обнаружены в системах анаэробной биологической очистки.

3. Проведен скрининг коллекции гипертермофильных архей на наличие термостабильных ДНК-полимераз. ДНК-полимераза из штамма Thermococcus sp. Shl AM выделена и охарактеризована. Клонирован ген выделенной термостабильной ДНК-полимеразы и получена экспрессия рекомбинантного белка в клетках E.coli.

4. Показано, что ДНК-полимераза Shl AM обладает такими важными с биотехнологической точки зрения свойствами как высокая термостабильность и точность копирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярная детекция гипертермофильных архей в различных экосистемах представляет научный и практический интерес. Основным этапом практически всех молекулярно-экологических исследований является амплификация участков генов 16Б рРНК с помощью полимеразной цепной реакции. Количество сиквенсов рРНК в базах данных все время растет, делая необходимым создание все новых праймеров. Основным качеством, которым должны обладать праймеры, используемые для детекции определенных микроорганизмов, является высокая специфичность. Нами был разработан метод обнаружения гипертермофильных архей семейства ТИегтососсасеае, относящихся к царству Еигуагскаео1а, основанный на ПЦР-амплификации генов 168 рРНК с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Выбор этой группы микроорганизмов был связан с тем, что семейство ТИегтососсасеае, представляет собой филогенетически обособленную и самую многочисленную группу гипертермофильных архей. Эту группу микроорганизмов отличает поразительное генетическое разнообразие, дающее основания ожидать у представителей этого семейства наличия новых физиологических и метаболических свойств. Кроме того, с биотехнологической точки зрения это одна из самых перспективных групп микроорганизмов. Разработанный нами метод был успешно применен для идентификации чистых культур микроорганизмов, детекции Ткегтососсасеае в природных образцах и накопительных культурах, а также для оценки численности и динамики роста Ткегтососсасеае в лабораторных микрокосмах.

Методы, основанные на ПЦР-амплификации генов 16Э рРНК, можно использовать и для детекции более крупных таксонов микроорганизмов, таких как, например, царство или домен. В результате клонирования и секвенирования продуктов ПЦР, полученных с помощью Агскаеа-специфичных праймеров, в различных природных низкотемпературных экосистемах были обнаружены нуклеотидные последовательности генов 16Э рРНК, филогенетически относящиеся к царству СгепагскаеоШ, все известные культивируемые представители которого являются термофильными или гипертермофильными организмами. В то же время о выделении представителей Сгепагскаео1а из антропогенных биотопов или об обнаружении в них нуклеотидных последовательностей генов 16Э рРНК кренархеот есть лишь единичные сообщения.

В связи с этим нами был проведен ПЦР-анализ гипертермофильных накопительных культур, полученных из сброженного ила метантенка, обрабатывающего осадки муниципальных сточных вод в термофильном режиме (50°С), который выявил наличие в них представителей царства Crenarchaeola. Получена устойчивая ассоциация гипертермофильных микроорганизмов (КР4), состоящая из численно доминирующих кокков и минорного количества бесспоровых палочек. Единственным архейным компонентом культуры является микроорганизм, близкородственный Sulfophobococcus zilligii, и принадлежащий к царству Crenarchaeola. Это первое сообщение об обнаружении гипертермофильных архей в системах биологической очистки. Это также первое сообщение об обнаружении в антропогенных местообитаниях с нейтральным значением рН культивируемого представителя царства Crenarchacota.

Биотехнологический потенциал гипертермофильных архей связан прежде всего с с устойчивостью их ферментов к высоким температурам. Сегодняшняя молекулярная биология немыслима без использования термостабильных ферментов, в первую очередь без термостабильных ДНК-полимераз. Наряду с наиболее известной из термофильных ДНК-полимераз - Га^-полимеразой, имеющей бактериальное происхождение, в различных прикладных и фундаментальных исследованиях все чаще используют ДНК-полимеразы архей, которые обладают такими преимуществами, как повышенные термостабильность, точность копирования, определяемая наличием ассоциированной 3'-5'экзонуклеазной активности, способность к амплификации длинных фрагментов ДНК.

В нашей работе 30 штаммов гипертермофильных архей были проверены на наличие в них термостабильных полимераз. Из штамма Thermococcus sp. ShlAM, обладающего ферментом с наиболее перспективными свойствами, была выделена и охарактеризована ДНК-полимераза. Молекулярная масса фермента - 90-100 кДа. Очищенная ДНК-полимераза сохраняла 50% исходной активности после инкубации при 95°С в течение 120 мин. Выделенная полимераза обладала ассоциированной 3'-5'экзонуклеазной активностью. Частота ошибок, допускаемых полимеразой при достройке цепи ДНК, была, по крайней мере, в 2 раза ниже, чем у Гад-полимеразы. По основным физико-химическим и энзиматическим свойствам новая полимераза соответствует известным ДНК-полимеразам семейства В. Для клонирования гена выделенной полимеразы молекулярно-биологическими методами было проведено исследование структуры гена и выявлено отсутствие нуклеотидных последовательностей, кодирующих интеины, что отличает данный ген от генов большинства известных ДНК-полимераз. Был синтезирован полноразмерный ген ДНК-полимеразы ShlAM, определена его нуклеотидная последовательность и получен штамм-продуцент рекомбинантной ДНК-полимеразы BL21 /DE3/pETDPOLSH 1АМ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Слободкина, Галина Борисовна, Москва

1. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л. 1994. Влияние молекулярного водорода и элементной серы на метаболизм экстремально-термофильных архебактерий p. Thermococcus. Микробиология. 63:777-782.

2. Данилевич В.Н., Гришин Е.В. 2002. Новый подход для выделения геномной ДНК из дрожжей и грибов: получение ДНК-содержащих клеточных оболочек и их прямое использование в ПЦР. Биоорг. Химия. 28:156-167.

3. Каледин A.C., Слюсаренко А.Г., Городецкий С.И. 1980. Выделение и свойства ДНК-полимеразы из экстремально-термофильной бактерии Thermus aquaticus YT1. Биохимия. 45:644-651.

4. Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П. 2002. Подбор и тестирование олигонуклеотидных праймеров для амплификации и секвенирования генов 16S рРНК архей. Микробиология. 71:283-286.

5. Калюжный C.B., Данилович Д.А., Ножевникова А.Н. 1991. Анаэробная биологическая очистка сточных вод. Итоги науки и техники. Серия Биотехнология Т.29. М.: ВИНИТИ.

6. Крайнов С.Р., Швец В.М. 1992. Гидрогеохимия. М.:Недра.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: методы генетической инженерии. Пер. с англ. М.: Мир, 1984.

8. Мирошниченко M.JI. 2004. Термофильные микробные сообщества глубоководных гидротерм. Микробиология. 73:5-18.

9. Перевалова A.A., Лебединский A.B., Бонч-Осмоловская Е.А., Черных H.A. 2003. Детекция гипертермофильных архей рода Desulfurococcus путем гибридизации с олигонуклеотидными зондами. Микробиология. 72:383-389.

10. Перельман А.И. 1975. Геохимия ландшафтов. М.:Высш. школа.

11. Пушева М.А., Слободкин А.И., Бонч-Осмоловская Е.А. 1991. Исследование гидрогеназной активности экстремально термофильной архебактерии Thermococcus Stetten. Микробиология. 60:5-11.

12. Слободкин А.И., Заварзина Д.Г., Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская Е.А. 1999. Диссимиляционное восстановление неорганических акцепторов электронов термофильными анаэробными прокариотами. Микробиология. 68:600-622.

13. Чалов С.Е., Воронина О.Л., Сергиенко О.В., Лунин В.Г. 2002. Термостабильная ДНК-полимераза из archaeon Archaeoglobus fulgidus. Доклады Академии наук. 382:707-710.

14. Чалов С.Е., Воронина О.Л., Сергиенко О.В., Лунин В.Г. 2003. Термостабильная ДНК-полимераза из термофильного микроорганизма archaeon Archaeoglobus fulgidus VC16 и ее свойства. Биохимия. 68:366-375.

15. Шварцев С.Л. 1996. Общая гидрогеология. М.:Недра.

16. Щенникова А.В., Краев А.С., Позмогова Г.Е., Скрябин К.Г. 1996. Клонирование ДНК-зондов для обнаружения и идентификации патогенных грибов Verticillium dahlias и Verticillium tricorplis. Молекулярная биология. 30:1268-1273.

17. Abreu С., Jurgens G., De Marco P., Saano A., Bordalo A.A. 2001. Crenarchaeota and Euryarchaeota in temperate estuarine sediments. J. Appl. Microbiol. 90:713-718.

18. Amann R.I. 1995. Fluorescently labeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes in the study of microbial ecology. Mol. Ecol. 4:543-554.

19. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K-H. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59:143-169.

20. Andronopoulou E., Vorgias C.E. 2003. Purification and characterization of a new hyperthermostable allosamidin-insensitive and denaturation-resistant chitinase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus chitonophagus. . Extremophiles. 7:43-53.

21. Andronopoulou E., Vorgias C.E. 2004. Multiple components and induction mechanism of the chitinolytic system of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus chitonophagus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65:694-702.

22. Angerer В., Ebenbichler С., Schimtz-Agheguian G., Laue F., Ankenbauer W., Svetlichny V., Bonch-Osmolovskya E. Европейский Патент. 1998. № EP0834570.

23. Ashkin A., Dziedzic J.M., Yamane T. 1987. Optical trapping and manipulation of single cells using infrared laser beams. Nature. 339:769-771.

24. Atomi H., Matsumi R., Imanaka T. 2004. Reverse gyrase is not a prerequisite for hyperthermophilic life. J. Bacteriol. 186:4829-4833.

25. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R. E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. 1997. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York.

26. Bebenek K., Kunkel T.A. 1995. Analyzing fidelity of DNA polymerases. Methods Enzymol. 262:217-232.

27. Beffa Т., Blanc M., Lyon P.-F., Vogt G., Marchiani M., Fisher J.L., Aragno M. 1996. Isolation of Thermus strains from hot composts (60 to 80°C). Appl. Environ. Microbiol. 62:1723-1727.

28. Beffa Т., Blanc M., Aragno M. 1996. Obligately and facultatively autotrophic, sulfur -and hydrogen-oxidizing thermophilic bacteria isolated from hot composts. Arch. Microbiol. 165:34-40.

29. Benbouzid-Rollet N., Lopez-Garcia P., Watrin L., Erauso G., Prieur D., Forterre P. 1997. Isolation of new plasmids from hyperthermophilic Archaea of the order Thermococcales. Res. Microbiol. 148:767-775.

30. Benson L.M., Null A.P., Muddiman D.C. 2003. Advantages of Thermococcus kodakaraenis (KOD) DNA polymerase for PCR-mass spectrometry based analyses. J Am Soc Mass Spectrom. 14:601-604.

31. Blarney J.M., Chiong M., Smith E.T. 2001. Purification and characterization of an iron-nickel hydrogenase from Thermococcus celer. J. Biol. Inorg. Chem. 6:517-522.

32. Blochl E„ Rachel R., Burggraf S., Hafenbradl D., Jannasch H.W., Stetter K.O. 1997. Pyrolobus fumarii gen.n. and sp. n. represents a naw group of archaea, extending the upper temperature limit for life to 113°C. Extremophiles 1:14-21.

33. Bohlke K., Pisani F.M., Vorgias C.E., Frey В., Sobek H., Rossi M., Antranikian G. 2000. PCR performance of the B-type polymerase from the hyperthermophilic euryarchaeon

34. Thermococctis aggregans improved by mutations in the Y-GG/A motif. Nucleic Acids Res. 28:3910-3917.

35. Bok J.D., Yemool D.A., Eveleigh D.E. 1998. Purification, characterization and molecular analysis of thermostable cellulases CelA and CelB from Thermotoga neapolitana. Appl. Environ. Microbiol. 64:4774-4784.

36. Bonch-Osmolovskaya E.A., Stetter K.O. 1991. Interspecies hydrogen transfer in cocultures of thermophilic archaea. Syst.Appl. Microbiol. 14:205-208.

37. Bonch-Osmolovskaya E.A., Miroshnichenko M.L., KostrrikinaN.A., ChernychN.A., Zavarzin G.A. 1990. Thermoproteus uzoniensis sp. nov., a new extremely thermophilic archaebacterium from Kamchatka continental hot springs. Arch. Microbiol. 154:556-559.

38. Braithwaite D.K., Ito J. 1993. Compilation, alignment, and phylogenetic relationships of DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 21:787-802.

39. Britschgi T.B., Giovannoni S.J. 1991. Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplancton population by rRNA gene cloning and sequencing. Appl. Environ. Microbiol. 57:1707-1713.

40. Brock T.D., Freeze H. 1969. Thermus aquaticus gen.n. and sp. n. nonsporulating extreme thermophile. J. Bacteriol. 98:289-297.

41. Brock T.D., Brock K.M., Belly R.T., Weiss R.L. 1972. Sulfolobus a new genus of sulfur oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch. Microbiol. 84:54-68.

42. Bronnenmeier K., Kern A., Liebl W., Staudenbauer W.L. 1995. Purification of Thermotoga marilima enzymes for the degradation of cellulosic materials. Appl. Environ. Microbiol. 61:1399-1407.

43. Brown S.H., Kelly R.M. 1993. Characterization of amylolytic enzymes, having both a-1,4 and a-1,6 hydrolytic activity, from the thermophilic archaea Pyrococcus furiosus and Thermococcus liioralis. Appl. Environ. Microbiol. 59:2614-2621.

44. Bult C.J., White O., Olsen G.J., Zhou L., Fleischmann R.D., Sutton G.G., Blake,J.A., FitzGerald L.M., Clayton R.A., Gocayne J.D., Kerlavage A.R., Dougherty B.A., Tomb,J.F., Adams M.D., Reich C.I., Overbeek R., Kirkness E.F., Weinstock K.G.,

45. Burggraf S., Jannasch H.W., Nicolaus B., Stetter K.O. 1990. Archaeoglobus profundus sp. nov., represents a new species within the sulfate-reducing archaebacteria. Syst. Appl. Microbiol. 13:24-28.

46. Canganella F., Andrade C.M., Antranikian G. 1994. Characterization of amylolytic and pullulitic enzymes from thermophilic archaea and from a new Fervidobacterum species. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:239-245.

47. Crump B.C., Baross J. A. 2000. Archaeaplancton in the Colambia river, its estuary and the adjacent coastal ocean, USA. FEMS Mocrobiol. Ecol. 31:231-239.

48. Cherry R.D., Desbruyeres M., Heyraud M., Nolan C. 1992. High levels of natural radioactivity in hydrothermal vent polychaetes. CR Acad. Sei. Paris, Ser III, 21-26.

49. Chung Y.C., Kobayashi T., Kanai H., Akiba T., Kudo T. 1995. Purification and properties of extracellular amylase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus profundus DT5432. Appl. Environ. Microbiol. 61:1502-1506.

50. Cann I.K., and Ishino Y. 1999. Archaeal DNA Replication: identifying the pieces to solve a puzzle. Genetics. 152:1249-1267.

51. Cann I.K., Ishino S., Nomura N., Sako Y„ Ishino Y. 1999. Two family B DNA polymerases from Aeropyrum per nix, an aerobic hyperthermophilic crenarchaeota. J.Bacteriol. 181:5984-5992.

52. Chien A., Edgar D. B., Trela J. M. 1976. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aqualicus. J. Bacteriol. 127:1550-1557.

53. Cline J., Braman J.C., Hogrefe I I.H. 1996. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 24:3546-3451.

54. Cole S.T., Girons l.S. 1994. Bacterial genomics. FEMS Microbiol. Rev. 14:139-160.

55. Corpet F. 1988. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res. 16:10881-10890.

56. Dabrowski S., Kur J. 1998. Cloning and expression in Escherichia coli of the recombinant DNA polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei. Protein Expr. Purif. 14: 131-138.

57. Datukishvili N., Pokholok D., Lottspeich F., Prangishvili D., Rechinsky V. 1996. The DNA polymerase encoding gene from a thermoacidophilic archaeon Sulfolobus acidocaldarius. Gene 177:271-273.

58. Degrange V., Bardin R. 1995. Detection and counting of Nitrobacter populations in soil by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 61:2093-2098.

59. DeLong E.F. 1992. Archaea in coastal marine environments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:5685-5689.

60. DeLong E.F., Wickman G.S., Pace N.R. 1989. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identificationof single microbial cells. Science 243:1360-1363.

61. Dietrich J, Schmitt P, Zieger M, Preve B, Rolland JL, Chaabihi H, Gueguen Y. 2002. PCR performance of the highly thermostable proof-reading B-type DNA polymerase from Pyrococcus abyssi. FEMS Microbiol Lett. 217:89-94.

62. Dirmeier R., Keller M., liafenbradl D., Braun F.J., Rachel R., Burggraf S. Stetter K.O. 1998. Thermococcus acidaminovorans sp. nov., a new hyperthermophilic alkalophilic archaeon growing on amino acids. Extremophiles. 2:109-114.

63. Diruggiero J., Dunn D., Maeder D.L., Holley-Shanks R., Chatard J., Horlacher R., Robb F.T., Boos W., Weiss R.B. 2000. Evidence of recent lateral gene transfer among hyperthermophilic archaea. Mol. Microbiol. 38:684-693.

64. Dong G., Vielle C., Zeikus G.J. 1997. Cloning, sequencing and expression of the gene encoding amylopullulanase from Pyrococcus furiosus and biochemical characterization of the recombinanat enzyme. Appl. Environ. Microbiol. 63:3577-3584.

65. Edgell D.R. and Doolittle W.F. 1997. Archaea and the origins. of DNA replication proteins. Cell. 89:995-998.

66. Edgell D.R., Malik S.-B., Doolittle W.F. 1997.Gene duplications in evolution of archaeal family B DNA polymerases. J.Bacterid. 179:2632-2640.

67. Edwards U., Rogall T., Blocker H., Emde M., Bottger E.C. 1989. Isolation and direct complete nucleotide determinationof entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 17:7843-7853.

68. Fey A., Chin K.J., Conrad R. 2001. Thermophilic methanogenes in rice field soil. Environ. Microbiol. 3:395-303.

69. Fiala G., Stetter K.O. 1986. Pyrococcus furiosus sp. nov. represents a novel genus of marine heterotrophic archaebacteria growing optimally at 100°C. Arch. Microbiol. 145:56-61.

70. Fischer F., Zillig W., Stetter K.O., Schreiber G. 1983. Chemolithoautotrophic metabolism of anaerobic extremely thermophilic archaebacteria. Nature 301:511-513.

71. Forterre P. 2002. A hot story from comparative genomics: reverse gyrase is the only hyperthermophile-specific protein. Trends in Genetics. 18:236-238.

72. Fuchs T., Huber H., Teiner K., Burggraf S., Stetter K.O. 1995. Metallosphaeraprunae sp. nov., a novel metal-mobilizing, thermoacidophilic Archaeum, isolated from a uranium-mine in Germany. Syst. Appl. Microb. 18:550-556.

73. Fuhrman J.A., Comeau D.E., Hagstrom A., Chan A.M. 1988. Extraction from natural planctonic microorganisms of DNA suitable ffor molecular biology studies. Appl. Environ. Microbiol. 54:1426-1429.

74. Furrelly V., Rainey F.A., Stackebrandt E. 1995. Effect of genome size and rRNA gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl. Environ. Microbiol. 61:2798-2801.

75. Gantelet II., Duchiron. F. 1999. A new pullulanase from a hyperthermophilic archaeon for starch hydrolysis. Biotechnol. Lett. 21:71-75.

76. Garces J.A., Gavin R.H. 2001. Using an inverse PCR strategy to clone large, contiguous genomic DNA fragments. Methods Mol. Biol. 161:3-8.

77. Garrity G.M. 2001. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Bergey's Manual Trust, Michigan State University, East Lansing, MI.

78. Gueguen Y., Rolland J.-L., Lecompte O., Azam Ph., Le Romancer G., Flament D., Raffm J.-P., Dietrich J. 2001. Characterization of two DNA polymerases from the hyperthermophilic euryarchaeon Pyrococcus abyssi. Eur. J. Biochem. 268:5961-5969.

79. Giovannoni S.J., Britschgi T.B.,Moyer C.L., Field K.G. 1990. Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplanclon. Nature. 345:60-63.

80. Giovannoni S.J., DeLong E.F., Olsen G.J., PaceN.R. 1988. Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial cells. J. Bacterol. 170:720-726.

81. Glockner F.O., Amann R.L, Alfreider A., Pernthaler J., Psenner R., Trebesius K., Schleifer K-H. 1996. An in situ hybridization protocol for detection and identification of planctonic bacteria. Syst. Appl. Microbiol. 19:403-406.

82. Godon J.-J., Zumstein E., Dabert P., Habouzit F., Moletta R. 1997. Molecular microbial diversity of an anaerobic digestor as determined by small-subunit rRNA sequence analysis. Appl. Environ. Microbiol. 63:2802-2813.

83. Gold T. 1992. The deep, hot biosphere. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 89:6045-6049.

84. Gonzalez J.M., Kato C., Horikoshi K. 1995. Thermococcuspeptonophilus sp. nov,, a fast-growing, extremely thermophilic archaebacterium isolated from deep-sea hydrothermal vent. Arch. Microbiol. 164:159-164.

85. Gonzalez J.M., Sheckells D., Viebahn M., Krupatkina D., Borges K.M., Robb F.T. 1999. Thermococcus waiotapuensis sp. nov., an extremely thermophilic archaeon isolated from a freshwater hot spring. Arch. Microbiol. 172:95-101.

86. Goodman M. 1982. Macromolecular sequences in systematic and evolutionary biology. New York: Plenum Publishing Corp.

87. Grant S., Grant W.D., Jones B.E., Kato C., Li L. 1999. Novel archaeal phylotypes from an East African alkaline saltern. Extremophiles. 3:139-145.

88. Grote R., Li L., Tamaoka J., Kato C., Horikoshi K., Antranikian G. 1999. Thermococcus siculi sp. nov., a novel hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent at the Mid-Okinawa Trough. Extremophiles. 3:55-62.

89. Grzybovska B., Szweda P., Synowiecki J. 2004 Clonong of the thermostable alpha-amylase gene from Pyrococcus woesei in Escherichia coli: isolation and some properties of the enzyme. Mol. Biotechnol. 26:101-110.

90. Gutell R.R., Larsen N„ Woese C.R. 1994. Lessons from an evolving rRNA: 16S and 23S rRNA structures from a comparative perspective. Miocrobiol. Rev. 58:10-26.

91. Hall G.H. 1986. Nitrification in Lakes. In: Prosser J.I.(ed) Nitrification. IRL press, Oxford, 127-156.

92. Harmsen H.J.M., Prieur D., Jeanthon C. 1997. Distribution of microorganisms in deep-sea hydrothermal vents chimneys investigated by whole cell hybridization and enrichments of thermophilic subpopulations. Appl. Environ. Microbiol. 63:2876-2883.

93. Head I.M., Saunders J.R., Pickup R.W. 1998. Microbial evolution, diversity and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms. Microb Ecol. 35:1-21.

94. Hicks P.M., Kelly R.M. 1999. Thermophilic microorganisms, 2536-2552. In M.C.Flickinger and S.W.Drew (ed.), Encyclopedia of bioprocess technology: fermentation,biocatalysis, and bioseparation. JohnWiley &Sons. Inc., New York, N.Y.

95. Hjorleifsdottir S., Ritterbusch W., Petursdottir S.K., Kristjansson J.K. 1997. Thermostabilities of DNA ligases and DNA polymerases from four genera of thermophilic eubacteria. Biotechnol. Lett. 19:147-150.

96. Hodges R.A., Perler F.B., Noren C.J., Jack W.E. 1992. Protein splicing removes intervening sequences in an archaea DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 20:61536157.

97. Holden J.F. Summit M., Baross J.A. 1998. Thermophilic and hyperthermophilic microorganisms in 3-30°C hydrolhermal fluids following a deep-sea volcanic eraption. FEMS Mocrobiol. Ecol. 25:33-41.

98. Holden J.F., Takai K., Summit M., Bolton S., Zyskowski J., Baross J.A. 2001. Diversity among three novel groups of hyperthermophilic deep-sea thermococcus species from three sites in the northeastern Pacific Ocean. . FEMS Mocrobiol. Ecol. 36:51-60.

99. Hopfner K.P., Eichinger A., Engh R.A., Laue F., Ankenbauer W., Huber R., Angerer B. 1999. Crystal structure of a thermostable type B DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius. Proc Natl Acad Sci USA. 96:3600-3605.

100. Huber J., David A., Butterfield D.A., Baross J.A. 2002. Temporal Changes in Archaeal Diversity and Chemistry in a Mid-Ocean Ridge Subseafloor Habitat. Appl. Envir. Microbiol. 68: 1585-1594.

101. Huber R., Kurr M., Jannasch H.W., Stetter K.O. 1989. A novel group of abyssal methanogenic archaebacteria (Methanopyrus) growing at 110°C. Nature 342:833-834.

102. Huber R., Staffers P., Cheminee J.L., Richnow H.H., Stetter K.O. 1990. Hyperthermophilic archaebacteria within the crater and open-sea plume of erupting Macdonald Seamount. Nature. 345:179-182.

103. Huber R., Burggaf S., Mayer T., Barns S.M., RoBnagel P., Stetter K.O. 1995. Isolation of a hyperthermophilic archaeum predicted by in situ RNA analysis. Nature. 376:57-58.

104. Huber R., Huber H., Stetter K.O. 2000. Towards the ecology of hyperthermophiles: biotopes, new isolation strategies and novel metabolic properties. FEMS Microbiol. Rev. 24:615-623.

105. Huber R., Sacher M., Vollmann A.„ Huber H., Rose D. 2000. Respiration of arsenate and selenate by hyperthermophilic archaea. Syst. Appl. Microbiol. 23:305-314.

106. Ishii M., Miyake T., Satoh T., Sugiyama H., Oshima Y., Kodama T., Igarashi Y. 1996. Autotrphic carbon dioxide fixation in Acidianus brierleyi. Arch. Microbiol. 166:368371.

107. Iwai T., Kurosawa N., Itoh Y.H., Kimura N., Horiuchi T. 2000. Sequence analysis of three family B DNA polymerases from the thermoacidophilic crenarchaeon

108. Sulfurisphaera ohwakuensis. DNA Res. 7:243-251.

109. Jeanthon C. Molecular ecology of hydrothermal vent microbial communities. 2000. Antonie van Leewenhoek. 77:117-133.

110. Jolivet E., L'Haridon S., Corre E., Forterre P., Prieur D. 2003. Thermococcus gammalolerans sp. nov., a hyperthermophilic archaeon from a deep-sea hydrothermal vent that resists ionizing radiation. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53:847-851.

111. Jones B.E., Grant W.D., Duckworth A.W., Owenson G.G. 1998. Microbial diversity of soda lakes. Extremophiles. 2:191-200.

112. Jürgens G., Saano A. 1999. Diversity of soil Archaea in boreal forest before and after clear-cutting and prescribed burning. FEMS Mocrobiol. Ecol. 29:205-213.

113. Kahler M., Antranikian G. 2000. Cloning and charaterization of a family B DNA polymerase from the hyperthermophilic crenarchaeon Pyrobaculum islandicum. J.Bacteriol. 182:655-663.

114. Kandier O. 1993. The early diversification of life. In: Early life on Earth. Nobel Symposium 84 (Bengtson S., ed.) 152-162. Columbia U.P., New York.

115. Kane P.M., Yamashiro C.T., Wolczyk D.F., Neff N., Goebl M., Stevens T.H. 1990. Protein splicing converts the yeast TFP1 gene product to the 69-kD subunit of the vacuolar H(+)-adenosine triphosphatase. Science. 250:651-657.

116. Kashefi K., Lovely D. 2003. Extending the upper temperature limit for life. Science. 301:934.

117. Keller M., Braun F.J., Dirmeier R., Hafenbradl D., Burggraf S., Stetter K.O. 1995. Thermococcus alcaliphilus sp. nov., a new hyperthermophilic archaeum growing on polysulfide at alkaline pH. Arch. Microbiol. 164:390-395.

118. Kobayashi T., Kwak Y.S., Akiba T., Kudo T., Horikoshi K. 1994. Thermococcus profundus sp. nov., a new hyperthermophilic archaeon isolated from deep-sea hydrothermal vent. Syst. Appl. Microbiol. 17:232-236.

119. Koch R., Spreinat A., Lemke K., Antranikian G. 1991. Purification and properties of a hyperthermoactive a-amylase from the archaeobacterium Pyrococcus woesei. Arch. Microbiol. 155:572-578.

120. Kornberg A. and Baker D., DNA replication, 2nd ed. Freeman and Company, 1992, New York, N.Y.

121. Caldococcus I it oralis " Z-1301 as Thermococcus I it oralis Z-1301. Extremophiles. 3:239-245.

122. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature. 227:680-685.

123. Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki R.K., Myambo K., Gelfand D.H. 1989 Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J. Biol. Chem. 264:6427-6437.

124. L'Haridon S., Reysenbach A.-L., Glenat P., Prieur D., Jeanthon C. 1995. Hot subterranean biosphere in continental oil reservoir. Nature. 337:223-224.

125. Lin C.K., Hung C.L., Hsu SC., Tsai C.C., Tsen H.Y. 2004. An improved PCR primer pair based on 16S rDNA for the specific detection of Salmonella serovars in food samples. J Food Prot. 67:1335-1343.

126. Loffler F.E., Qing S„ Jieran L., Tiedje J. M. 2000. 16S rRNA gene-based detection of tetrachloroethene-dechlorinating Desulfuromonas and Dehalococcoides species. Appl. Environ. Microbiol. 66:1369-1374.

127. MacGregor B.J., Moser D.P., Aim E.W., Nealson K.H., Stahl D.A. 1997. Crenarchaeota in Lake Michigan sediment. Appl. Environ. Microbiol. 63:1178-1181.

128. Madrid V.M., Taylor G.T., Scranton M.I., Chistiserdov A.Y. 2001. Phylogenetic diversity of bacterial and archaeal communities in the anoxic zone of Cariaco Basin. Appl. Environ. Microbiol. 67:1663-1674.

129. Manz W., Amann R.I., Ludwig W„ Wagner M., Schleifer K-H. 1992. Phylogenetic oligonucleotide probes for major subclasses of the proteobacteria: problems and solutions. Syst. Appl. Microbiol. 15:593-600.

130. Marteinsson V.T., Reysenbach A.-L., Birrien J.L., Prieur D. 1999b. A stress protein is induced in the deep-sea baropholic hyperthermophile Thermococcus barophilus when grown under atmospheric pressure. Extremophiles. 3:277-282.

131. Masaaki M., Yoshifumi I., Naeem R., Toshihiro H., Tadayuki I. 1994. Purification and characterization of a thermostable thiol protease from a newly isolated hyperthermophilic Pyrococcus sp. Appl. Environ. Microbiol. 60:4559-4566.

132. Mathur E.J., Adams M.W., Callen W.N., Cline J.M. 1991. The DNA-polymerase gene from the hyperthermophilic marine archaebacterium, Pyrococcus furiosus, shows sequence homology with a-like DNA polymerases. Nucleic. Acids Res. 19:6952.

133. Matsuki T., Watanabe K., Tanaka R., Fukuda M., Oyaizu H. 1999. Distribution of bifidobacteria! species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene targeted species-specific primers. Appl. Environ. Microbiol. 65:4506-4512.

134. Mikula M., Dzwonek A., Jagusztyn-Krynika K., Ostrowski J. 2003 Quantitative detection for low levels of Helicobacter pylori infection in experimentally infectad mice by real-time PCR. J. Microbiol. Methods. 55:351-359.

135. Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A., Neuner A., Kostrikina N.A., Alekseev V.A. 1989. Thermococcus stetteri sp. nov., a new extremely thermophilic marine sulfur-metabolizing archaebacterium. Syst.Appl.Microbiol. 12:257-262.

136. More M., Herrick J.B., Silva M.O., Chiorse W.C., Madsen E.J. 1994. Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60:1572-1580.

137. Muyzer G., de Waal E.C., Uitterlinden A.G. 1993. Profiling of complex microbial population by denaturating gradient gel electrophoresis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S r RNA. Appl. Environ. Microbiol. 59: 659-700.

138. Nakano S., Kobayashi T., Funabiki K., Matsumura A., Nagao Y., Yamada T. 2004. PCR detection of Bacillus and Staphylococcus in various foods. J Food Prot. 67:12711277.

139. Neuner A., Jannasch H.W., Belkin S., Stetter K.O. 1990. Thermococcus litoralis sp. nov.: a new species of extremely thermophilic marine archaebacteria. Arch. Microbiol. 153:205-207.

140. Niehaus F., Frey B., Antranikian G. 1997. Cloning and characterisation of a thermostable alpha-DNA polymerase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus sp. TY. Gene. 204:153-158.

141. Niehaus F., Bertodo C., Kahler M., Antranikian G. 1999. Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51:711-729.

142. Olsen G.J., Lane D.J., Giovannoni S.J., Pace N.R. 1986. Microbial ecology and evolution: a ribosomal RNA approach. Ann. Rev. Microbiol. 40:337-365.

143. Perler F.B., Davis E.O., Dean G.E., Gimble .F.S., Jack W.E., Neff N„ Noren C.J., Thorner J., Belfort M. 1994. Protein splicing elements: inteins and exteins—a definition of terms and recommended nomenclature. Nucl. Acids Res. 22: 1125-1127.

144. Perler F., Kumar S., Kong H 1996. Thermostable DNA polymerases. Adv. Protein Chem.48:377-435.

145. Perler F.B., Olsen G.J., Adam E. 1997. Compilation and analysis of intein sequences. Nucl. Acids Res. 25:1087-1093.

146. Pisani F.M., De Martino C., Rossi M. 1992. A DNA polymerase fron the archaeon Sulfolobus solfalaricus shows sequence similarity to family B DNA polymerases. Nucl. Acids Res. 20:2711-2716.

147. Prangishvili D., Klenk H.-P., 1993. Nucleotide sequence of the gene for a 74kDa DNA polymerase from the archaeon Sulfolobus solfataricus. Nucleic Acids Res. 21:2768.

148. Rakhely G, .Zhou Z.H., Adams M.W., Kovacs K.L. 1999. Boichemical and molecular characterization of the NiFe. hydrogenase from hyperthermophilic archaeon, Thermococcus litoralis. Eur. J. Biochem. 266:1158-1165.

149. Rappe M.S., Connon S.A., Vergin K.L., Giovannoni S. 2002. Cultivation of the ubiquitous SARI 1 marine bacterioplancton clade. Nature. 418:630-633.

150. Reysenbach A.-L., Giver L.J., Wickham G.S., Pace N.R. 1992. Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 66:3798-3806.

151. Reysenbach A.L., Longnecker K., Kirshtein J. 2000. Novel bacterial and archaeal lineages from an in situ growth chamber deployed at a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent. Appl. Environ. Microbiol. 66:3798-3806.

152. Rochelle P.A., Fry J.C., Parkes R.J., Weightman A.J. 1992. DNA extraction for 16S rRNA gene analysis to determine genetic diversity in deep sediment communities. FEMS Microbiol. Lett. 100:59-66.

153. Ronimus R.S., Morgan H.W. 2001. The biochemical properties and phylogenies of phosphofructokinases from extremophiles. Extremophiles. 5:357-373.

154. Ruttersmith L.D., Daniel R.M. 1991. Thermostable cellobiohydrolase from the thermophilic eubacterium Thermotoga sp. Strain FjSS3-B.l. Biochem. J. 277:887-890.

155. Saiki, R. K„ Gelfand, D. IL, Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. and Erlich, H. A. 1988. Primer-directed enzymatic amplificationof DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239:487-491.

156. Sako Y., Nomura N., Uchida A., Ishida Y., Morii H., Koga Y., Hoaki T., Maruyama T. 1996. Aeropyrum pernix gen. nov., sp. nov., a novel aerobic hyperthermophilic archaeon growing at temperatures up to 100°C. Int. J. Syst. Bacteriol. 46:1070-1077.

157. Salazar 0., Gonzalez I., Genilloud O. 2002. New genus-specific primers for the PCR identification of new isolates of the genera Nocardiopsis and Saccharothrix. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52:1411-1421

158. Schleper C., Holben W., Klenk H.-P. 1997. Recovery of crenarchaeotal ribosomal DNA sequences from freshwater-lake sediments. Applied and environmental microbiology 63:321-323.

159. Schrenk M.O., Kelley D.S., Delaney J.R., Baross J.A. 2003. Incidence and diversity of microorganisms within the walls of an active deep-sea sulfide chimney. Appl. Environ. Microbiol. 69:3580-3592.

160. Sekiguchi Y., Kamagata Y., Syutsubo K., Ohashi A., Harada H., Nakamura K. 1998. Phylogenese diversity of mesophilic and thermophilic granular sludges determined by 16S rRNA gene analysis. Microbiology. 144:2655-2665.

161. Selig M., Xavier K.B., Schönheit P. 1997. Comparative analtsis of Emden-Meyerhof and Entner-Dudoroff glycolytic pathways in hyperthermophilic archaea and bacterium Thermologa. Arch. Microbiol. 164:217-232.

162. Serour E., Antranikian G., 2002. Novel thermoactive glucoamylases from the thermoacidophilic Arcaea Thermoplasma acidophilum, Piccophilus torridus and Picrophilus o.shimue. Antonie van Leeuwenhoek 81:73-83.

163. Slobodkin A.I., Campbell B„ Cary S.C., Bonch-Osmolovskaya E.A., Jeanthon C. 2001. Evidence for the presence of thermophilic Fe(III)-reducing microorganisms in deep-sea hydrothermal vents at 13°N (East Pacific Rise). FEMS Microbiol. Ecol. 36:235-243.

164. Stackebrandt E., Woese C. 1981. The evolution of prokaryots. In Molecular and cellular aspects of microbial evolution. Carlise M.J., Collins J.R., Moseley B.E.B, (eds). Chichester, United Kingdom: John Wiley&Sons Ltd., 205-248.

165. Stahl D.A., Lane D.J., Olsen G.J., Pace N.R. 1984. Analysis of hydrothermal vent-associated symbionts by ribosomal RNA sequences. Science. 224:409-411.

166. Stahl D.A., Lane D.J., Olsen G.J., Pace N.R. 1985. Characterization of a Yellowstone hot spring microbial community by 5S ribosomal RNA sequences. Appl. Environ. Microbiol. 49:1379-1384.

167. Stetter K.O. 1982. Ultrathin mycelia-forming organisms from submarine volcanic areas having an optimum growth temperature of 105°C. Nature 300:258-260.

168. Stetter K.O., Huber R., Blochl E., Kurr M., Eden R.D., Fiedler M„ Cash H., Vance I. 1993. Hypcrthermophilic archaea are thriving in deep North Sea and Alaskan oil reservoirs. Nature. 300:743-745.

169. Stetter K.O. 1996a. Hyperthermophilic procaryotes. FEMS Microbiol. Rev. 18:149158.

170. Stetter K.O. 1996b. Hyperthermophiles in the history of life. Ciba Found. Symp. 202:110.

171. Stetter K.O. 1999. Extremophiles and their adaptation to hot environments. FEB Lett. 452:22-25.

172. Stein J.L., Marsh T.L., Wu K.Y., Shizuya H., DeLong E.F. 1996. Characterization of uncultivated prokaryots isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment grom a planctonic marine Archeon. J. Bacteriol. 178:591-599.

173. Summit M., Baross J.A. 2001. A novel microbial habitat in the mid-ocean ridge subseafloor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:2158-2153.

174. Sunna A., Puis J., Antranikian G. 1996. Purification and characterization of two thermostable endo-1,4-p-D-xylanascs from Thermotoga thermarum. Biotechnol. Appl. Biochem. 24:177-185.

175. Takagi M., Nisioka M., Kakihara H., Kitabayashi M., Inoue H. 1997 . Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. Strain KOD1 and its application to PCR. Appl. Environ. Microbiol. 63:4504-4510.

176. Takahata Y., Nishijima M., Maruyama T. 2000. Distribution and physiological characteristics of hyperthermophiles in the Kubuki oil reservoir in Niigata, Japan. Appl. Environ. Microbiol. 66:73-79.

177. Takahata Y., Hoaki T., Maruyama T. 2001. Starvation survivability of Thermococcus strains isolated from Japanese oil reservoirs. Arch. Microbiol. 176:264-270.

178. Takai K., Horikoshi K. 1999. Genetic Diversity of Archaea in Deep-Sea Hydrothermal Vent Environments. Genetics 152:1285-1297.

179. Takai K., Sugai A., Itoh T., Horikoshi K. 2000. Paleococcus ferrophilus gen. nov., sp. nov., a barophilic, hyperthermophilic archaeon from deep-sea hydrothermal vent chimney. Inl.J. Syst. Evol. Microbiol. 68: 1994-2007.

180. Takai K., Komatsu T., Inagaki F., Horikoshi K. 2001. Distribution of Archaea in a black smoker chimney structure. Appl. Environ. Microbiol. 67:3618-3629.

181. Takai K., Moser D.P., DeFlaun M., Onstott T.C., Fredrickson J.K. 2003. Archaeal diversity waters from deep South African gold mines. Appl. Environ. Microbiol. 67:5750-5760.

182. Tor J., Lovley D. R. 2001. Anaerobic degradation of aromatic compounds coupled to Fe(III) by Ferroglobus plcicidus. Environ. Microbiol. 3:281-287.

183. Tor J.M., Kashefi K., Lovley D.R. 2001. Acetate oxidation coupled to Fe(III) reduction in hyperthermophilic microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67:13631365.

184. Trevors J.T., Van Elsas J.D. (eds.) Nucleic acids in environment. Methods and applications. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 1995.

185. Tsai Y.-L., Olson B.H. 1991. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 57:1070-1074.

186. Tsujibo H., Minoura K., Miyamoto K., Endo H., Moriwaki M., Inamori Y. 1993. Purification and properties of a thermostable chitinase from Streptomices thermoviolaceus OPC-520. Appl. Environ. Microbiol. 59:620-622.

187. Uemori T., Ishino Y., Toh H., Asada K., Kato I. 1993. Organization and nucleotide sequence of the DNA polymerase gene from the archaeon Pyrococcus furiosus. Nucleic Acids Res. 21:259-265

188. Uemori T., Ishino Y., Doi H., Kato I. 1995. The hyperthermophilic archaeon Pyrodictium occullum has two a-like DNA polymerase. J.Bacteriol. 177:2164-2177.

189. Uemori T., Sato Y., Kato I., Doi H., Ishino Y. 1997. A novel DNA polymerase in hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus furiosus: gene cloning, expression, and characterization. Genes Cells. 2:499-512.

190. Uhl A.M., Daniel R.M. 1999. The first describtion of an archaeal hemicellulase: the xylanase from Thermococcus zilligii strain AN1. Extremophiles. 3:263-267.

191. Vielle C., Zeikus G.J. 2001. Hyperthermophilic enzymes: sourses, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol. And Mol. Biol. Rev. 65:1-43.

192. Ward D.M., Weller R., Bateson M.M. 1990. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community. Nature. 345:63-65.

193. Ward D.M., Bateson M.M., Weller R., Ruff-Roberts A.L. 1991. Ribosomal RNA analysis of microorganisms as they occur in nature. Adv. Microbiol. Ecol. 38:219-286.

194. Weller R., Ward D.M. 1989. Selective recovery of 16S rRNA sequences from natural microbial communities in the form of cDNA. Appl. Environ. Microbiol. 55:1818-1822.

195. Woese C.R., Fox G.E., 1977. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:4576-4579.

196. Woese C.R., Weisburg W.G., Paster B.J., Hahn C.M., Tanner R.S., Kreig N.R., Koops H.-P., Harms I L, Stackebrandl E. 1984. The phylogeny of purple bacteria: the beta subdivision. Syst. Appl. Microbiol. 5:327-336.

197. Woese C.R., Weisburg W.G., Hahn C.M., Paster B.J., Zablen L.B., Lewis B.J., Macke T.J., Ludwig W., Stackebrandt E. 1985. The phylogeny of purple bacteria: the gamma subdivision. Syst. Appl. Microbiol. 6:25-33.

198. Woese C.R., Kandier O., Wheelis M.L. 1990. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaca, Bacteria, and Eucarya. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87:4576-4579.

199. Wolin E.A., Wolin M.J., Wolfe R.S. 1963. Formation of methane by bacterial extracts. J. Biol. Chem. 238:2882-2886.

200. Xavier K.B., Peist R., Kossmann M., Boos W., Santos H. 1999. Maltose metabolism in the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus litoralis: purification and characterization of key enzymes. J. Bacteriol. 181:3358-3367.

201. Zeikus J.G., Wolfe R.S. 1972. Methunobacterium thermoautotrophicus a sp. nov., an anaerobic, autotrophic, extreme thermophile. J. Bacteriol. 109: 707-715.

202. Zillig W., Holtz I., Janekovic D., Schafer W., Reiter W.D. 1983.The archaebacterium Thermococcus celer represents a novel genus within the thermophilic branch of the archaebacleria. Syst. Appl. Microbiol. 4:88-94.

203. Zillig W., Holz I., Klenk H.P., Trent J., Wunderl S., Janekovic D. Imsel E. Haas B. 1987. Pyrococcus woesei, sp. nov., an ultra-thermophilic marine archaebacterium, representing a novel order, Thermococcules. Syst.Appl.Microbiol. 9: 62-70.

Информация о работе

Слободкина, Галина Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молекулярная детекция представителей гипертермофильных архей и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Молекулярная детекция представителей гипертермофильных архей и характеристика архейной термостабильной ДНК-полимеразы - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы